WO2011027286A2 - Método de preservación de espermatozoides de abalón para la industria acuícola - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method of cryopreservation of sperm from abalone, in particular of green abalone Haliotis discus hannai and red H. rufescens.
- the invention seeks to optimize and innovate in technological alternatives using improved genetic material.
- the method of the invention is directed in particular to the cryopreservation of sperm from abalone from specimens with highly valuable characteristics (CAV) for commercial production crops.
- CAV highly valuable characteristics
- the technique allows cryopreservation, for long periods of time, of sperm that carry genes that express certain characteristics, such as growth rates, coloration, etc.
- characters such as increased motility, survival and fertilization rate can be selected, which ensure successful batches.
- Cryopreservation protocols comprise, on the one hand, the selection of cryoprotectants and cryopreservatives, their concentration, optimal transition temperatures, and freezing and thawing times.
- the technology allows preserving doses of sperm to fertilize at any time that is required, especially when the number of breeders are limiting since in general not all spawning-induced breeders respond.
- the method of the present invention facilitates the work of larval culture in hatcheries by independent production of the natural reproductive cycle of males.
- the most frequently used method to measure motility is a direct visual evaluation under a microscope with the help of a Neubauer camera.
- compositions for cryogenic preservation of sperm comprising at least one cryoprotectant, selected from sugar, raffinose, lactose, trehalose, melibious, melecytic, manotriose, stachy, dextran, hydroxy-ethyl starch, sucrose, maltitol, lactitol, glycerol, polyalcohols and others selected from the group of polyethylene glycol, DMSO, ethylene glycol, propylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, glycerol and polyethylene oxide; at least one membrane protector (egg yolk) and at least one free radical scavenger (reducing agent) does not combine the cryoprotectants in the manner in which it is made in the present invention, and where the combination of the cryoprotectant, selected from sugar, raffinose, lactose, trehalose, melibious, melecytic, manotriose, stachy, dextran, hydroxy-ethyl
- abalone production depends largely on the genetic material of the parents.
- the reproduction of abalones is cumbersome and requires, when done with natural methods, synchronize males and females to achieve a successful fertilization.
- the quality of the specimens obtained through the synchronization of the parents is not always homogeneous and therefore, the quality of these abalones will have great variability, even obtaining products that do not meet the standards required in the different markets. Having a stock of sperm selected from parents with desirable characteristics allows the fertilization process to become independent from the synchronization of the parents.
- Cryopreservation allows, in addition to becoming independent from the synchronization of the parents, to select the biological material of specimens with desirable characteristics for production, such as larger size, better color, etc., that is, highly valuable characteristics (CAV).
- the method of the present invention solves the problem of the technique related to the synchronization of male and female abalone, while allowing to provide a stock of biological material from specimens with highly valuable characteristics, in order to ensure a homogeneous production of quality.
- the method of the present invention provides means to cryopreserve sperm from abalone, more preferably from two species of abalone; green abalone and red abalone, for fertilization on an industrial scale.
- the method of the invention has optimized the different stages of the process.
- abalone gametes can be obtained in any manner known in the art, in particular, the preferred mode in the present invention is through the induction of specimens with hydrogen peroxide (H 2 0 2 ) and Tris 2M, or by inducing the specimens due to darkness and drying conditions; in particular, the spawning method that considers the use of Tris 2M and H 2 0 2 is well known in the art (Hydrogen peroxide induces spawning in mollusks, with activation of prostaglandin endoperoxide synthetase DE Morse, H Duncan, N Hooker, and A Morse.
- seawater is in sterile conditions using any state-of-the-art method to obtain said condition, such as using 0.22 ⁇ microfiltration membranes , or later using ultraviolet light.
- the properly labeled straws were introduced in a cryopreservation chamber Brand Planner Model Kryo 560-16. Once the camera is charged, it He ran the corresponding program until it reached the temperature of -40 Q C.
- the freezing program used was as detailed below:
- Each straw was thawed exposing it for 3 sec. at room temperature, they were then immersed in a thermoregulated bath at 50 Q C for 7 seconds. Then both ends of the straw were cut to release its contents and deposit it in a Petri dish, where 0.2 ml_ of microfiltered sea water was added and kept for 5 minutes in order to stop the effect of the cryoprotectant and allow activation of sperm.
- Petri capsules of 3.5 cm in diameter with 2ml_ of fresh oocytes were used, stirring for 2 minutes.
- the fertilized oocytes were placed in 95 mm diameter crystallizers with 100 mL of microfiltrated seawater, which was replaced after 15-20 minutes. They are allowed to develop until the larval veliger state and the percentage of larvae obtained with the cryopreserved sperm is determined.
- the count was carried out in four quadrants diagonally in the Neubauer chamber, also verifying the movement of the sperm.
- the data were recorded and transformed to a percentage.
- Example 3 Preservation of green abalone sperm Haliotis discus hannai.
- the percentage of fertilization obtained for green abalone was 24.2 ⁇ 5%.
- Example 4 Evaluation of sperm motility of red abalone gametes, subjected to the method of the present invention.
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Abstract
La presente invención se relaciona con un método de preservación de espermatozoides de abalones, en particular de abalón verde Haliotis discus hannai y rojo H. rufescens, que comprende mezclar los espermatozoides con un crioprotectante que comprende propilenglicol, sacarosa y yema de huevo; congelar los espermatozoides con el crioprotectante hasta una temperatura de alrededor de - 40°C y almacenarlos en nitrógeno líquido. El método también comprende el descongelamiento de las muestras de espermatozoide.
Description
MÉTODO DE PRESERVACIÓN DE ESPERMATOZOIDES DE ABALÓN PARA LA
INDUSTRIA ACUÍCOLA
La presente invención se relaciona con un método de criopreservación de espermatozoides de abalones, en particular de abalón verde Haliotis discus hannai y rojo H. rufescens. La invención busca optimizar e innovar en alternativas tecnológicas utilizando material genético mejorado. El método de la invención está dirigido en particular a la criopreservación de espermatozoides de abalones provenientes de ejemplares con características altamente valiosas (CAV) para los cultivos de producción comercial.
La técnica permite criopreservar, por largos periodos de tiempo, espermatozoides portadores de genes que expresen determinadas características, tales como tasas de crecimiento, coloración, etc. En los espermatozoides de abalones con CAV se pueden seleccionar caracteres como la mayor motilidad, supervivencia y tasa de fecundación, que aseguran lotes exitosos.
Los protocolos de criopreservación comprenden por una parte la selección de crioprotectores y criopreservantes, la concentración de estos, temperaturas óptimas de transición y tiempos de congelación y descongelación.
La tecnología permite preservar dosis de espermatozoides para realizar fecundaciones en cualquier momento que se requiera, especialmente cuando el número de reproductores son limitantes ya que en general no todos los reproductores inducidos al desove responden. El método de la presente invención facilita el trabajo del cultivo larvario en los hatcheries al independizar la producción del ciclo reproductivo natural de los machos. Arte Previo
En peces existen más de 200 estudios sobre criopreservación de espermatozoides. Los más relevantes se sintetizan en el trabajo de Rana, K.1995. Cryopreservation of fish spermatozoa, en: Methods in molecular biology:
Cryopreservation and freeze-drying protocols. Eds. J.G.Day, M.R y McLellan. Vol. 38, pp 151 -165.
En Invertebrados marinos se han publicado cerca de 30 estudios de criopreservación de espermatozoides dentro de éstos citamos los siguientes que se refieren específicamente a abalones.
Gwo, J., C.Chen &H, Cheng. 2002. Semen cryopreservation of small abalone (Haliotis diversicolor supertexa). Theriogenology, 58: 1563-1578.
Salinas L, C. Paniagua, A.Jenkins, T. Tiersch. 2005. Cryopreservation of sperm of red abalone. Journal of Shellfisheries Research 24(2): 415-420 El trabajo de Salinas et al (2005) es el único que se refiere a una de las especies consideradas en esta patente (abalón rojo). De ambos estudios señalados anteriormente ninguno de ellos ha escalado a un nivel productivo, siendo los resultados aplicables sólo a pequeñas escalas. Este punto es de vital importancia, ya que el desarrollo de un método de criopreservación a escala productiva, requiere de una mayor investigación y desarrollo de los resultados obtenidos en la etapa de laboratorio, y en general, varias etapas del método desarrollado a nivel de laboratorio requieren de un ajuste no trivial para ser aplicables a nivel industrial. Además, Salinas et al (2005) evalúan las propiedades de los crioprotectantes: dimetil sulfóxido (DMSO), propilenglicol (PG) y glicerol sin ningún aditivo (como yema de huevo). De dicho estudio, sólo coincide el crioprotector propilenglicol con de la presente invención, sin embargo las concentraciones usadas en los crioprotectores tampoco coinciden con la presente invención. El programa de congelamiento que Salinas et al (2005) divulgan tampoco es similar al programa de congelamiento descrito en la presente invención. Los siguientes estudios, realizados en ostras y ostiones, determinan la movilidad espermática sin distinguir si este movimiento es lento o rápido o cual es su velocidad de desplazamiento. Ninguno de ellos basa la adecuación de las concentraciones y tiempo de equilibrio del crioprotector en parámetros espermáticos antes y después de la congelación-descongelación como la distancia que se
desplazan y la velocidad con que se desplazan como lo hace el método de la presente invención.
Faure C, Devauchelle N. & J. Girard. 1994. lonic factors affecting motility, respiration and fertilization rate of the sperm of the bivalve Pectén maximus (L). J. Comp. Physiol., 164: 444 - 450.
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El método usado más frecuentemente para medir la motilidad, es una evaluación visual directa bajo microscopio con ayuda de una cámara Neubauer.
Dong, Q., Ch. Huang, B. Eudeline, & T. Tiersch. 2005c. Systematic factor optimization for cryopreservation of shipped sperm samples of diploid pacific oyster Crassostrea gigas. Cryobiology, 51 , 176-197.
Existen tres patentes relacionadas con la invención, Patente US NQ US6054317, Patente GB NQ WO9806255, y Patente GB NQ W09101636. Ninguna de estas patentes tiene relación con abalones de las especies consideradas en el presente estudio. El resumen titulado "Protocols for haliotis rufescens egg cryopreservation and in vitro fertilization, year 2", correspondiente al segundo año de un proyecto estudiantil bajo el programa de "California State Science Fair", publicado en el año 2007 describe la criopreservación de ovocitos de abalón rojo con un crioprotectante que contiene sólo PG en comparación con otro crioprotectante que sólo contiene DMSO. Los resultados que se muestran son bastante limitados en cuanto al tiempo del estudio y de las condiciones de operación, por lo que no puede compararse con la presente invención, aparte de estar dirigido a la conservación de ovocitos.
Y la solicitud de patente WO2007146344A, solicitada en el año 2007 que divulga una composición para preservación criogénica de esperma, que comprende por lo menos un crioprotectante, seleccionado entre azúcar, rafinosa, lactosa, trehalosa, melibiosa, melecitosa, manotriosa, estaquiosa, dextrano, hidroxi-etil almidón, sucrosa, maltitol, lactitol, glicerol, polialcoholes y otros seleccionado del grupo de polietilenglicol, DMSO, etilen glicol, propilenglicol, polivinil pirrolidona, glicerol y óxido de polietileno; por lo menos un protector de membranas (yema de huevo) y por lo menos un depurador de radicales libres (agente reductor) no combina los agentes crioprotectantes de la manera en que se hace en la presente invención, y donde la combinación de la presente invención ha demostrado ser superior a lo descrito en los ejemplos de la solicitud de patente WO2007146344A.
Lo que señala la patente anteriormente mencionada, es que permite una mejor sobrevivencia espermática sólo de espermatozoides criopreservados de mamíferos (especialmente roedores y bovinos) aun cuando señala que puede ser utilizado en otros animales como felinos, caballares, aves y peces de acuarios, pero en ningún caso es utilizados en invertebrados y menos en invertebrados marinos como lo que propone la presente invención. Los porcentajes obtenidos en vertebrados, según lo que señala la patente mencionada, son mayores a los reportados en la presente invención, sin embargo la composición de las membranas plasmáticas de invertebrados marinos son diferentes de aquellas que presentan los vertebrados. Por lo cual los porcentajes de motilidad y fecundación obtenidos con ambos tipos de espermatozoides criopreservados no son comparables.
La producción de abalones depende en gran medida del material genético de los padres. La reproducción de abalones es engorrosa y requiere, cuando se realiza con métodos naturales, sincronizar a machos y hembras para lograr una fecundación exitosa.
La calidad de los ejemplares obtenidos por medio de la sincronización de los padres no siempre es homogénea y por ende, la calidad de estos abalones tendrá gran variabilidad, llegando incluso a obtener productos que no cumplen con los estándares requeridos en los distintos mercados.
Contar con un stock de esperma seleccionado de padres con características deseables, permite independizar el proceso de fecundación de la sincronización de los padres.
La criopreservación permite además de independizarse de la sincronización de los padres, seleccionar el material biológico de especímenes con características deseables para la producción, como puede ser mayor tamaño, mejor color, etc., es decir, características altamente valiosas (CAV).
El método de la presente invención soluciona el problema de la técnica relativo a la sincronización de machos y hembra abalones, a la vez que permite proveer un stock de material biológico proveniente de especímenes con características altamente valiosas, de manera de asegurar una producción homogénea y de calidad.
En particular, el método de la presente invención proporciona medios para criopreservar espermatozoides de abalones, más preferentemente de dos especies de abalones; abalón verde y abalón rojo, para realizar fecundaciones en una escala industrial. El método de la invención ha optimizado las diferentes etapas propias del proceso.
El método cuenta con 6 etapas principales, que se describen a continuación. a) Proporcionar espermatozoides a conservar: los gametos de abalón pueden obtenerse de cualquier manera conocida en el arte, en particular, el modo preferido en la presente invención es a través de la inducción de ejemplares con peróxido de hidrógeno (H202) y Tris 2M, o bien mediante la inducción de los ejemplares por condiciones de oscuridad y desecación; en particular, el método de desove que considera el uso de Tris 2M y H202 es bien conocido en el arte (Hydrogen peroxide induces spawning in mollusks, with activation of prostaglandin endoperoxide synthetase DE Morse, H Duncan, N Hooker, y A Morse. Science 15 Abril 1977 196: 298-300), una vez obtenidos los espermatozoides por cualquiera de los métodos considerados en el arte, se realiza un conteo de los mismos usando un método de análisis de imágenes y
obteniendo al menos dos parámetros de motilidad a fin de mantener un control de calidad; b) Proporcionar una solución crioprotectante apropiada, en particular, que contenga propilenglicol en una concentración entre 3 y 7 M, sacarosa entre un 3 y 6 % (volumen/volumen) y yema de huevo entre un 8 y 12%
(volumen/volumen); c) Agregar en una cápsula de Petri un volumen de espermatozoides obtenidos igual al volumen de la solución crioprotectante del punto anterior mezclando suavemente; d) Cargar en una pajuela de 0,5 mL un volumen de entre 30 y 80 μΙ_ de agua de mar microfiltrada, luego un volumen de entre 30 y 80 μΙ_ de aire, luego un volumen de entre 100 y 500 μΙ_ de la solución con espermatozoides del punto anterior, luego un volumen de entre 30 y 80 μΙ_ de aire, y finalmente un volumen de entre 30 y 80 μΙ_ de agua de mar microfiltrada. La pajuela es sellada, usando alcohol polivinílico (PVA). Se utilizó un período de equilibrio de entre 5 y 15 minutos; e) Congelar las muestras usando cualquier técnica del arte, de modo preferente una cámara de congelamiento programable, usando una temperatura inicial de entre 5,5°C y 6,5°C, y se bajar la temperatura hasta -S' usando una tasa de congelación entre -5,5 y -4,5 <C/min; continuar bajando la temperatura hasta entre -38 y -42 <C usando una tasa de congelación de entre -17 a - 19<C/min, una vez alcanzada la temperatura de entre -38 °C y -42 <C sumergir en nitrógeno líquido y almacenar en nitrógeno líquido hasta su uso; f) Descongelar los espermatozoides para su uso retirando las pajuelas desde el almacenaje en nitrógeno líquido exponiéndola entre 1 y 5 segundos a temperatura ambiente, sumergirlas inmediatamente en un baño termorregulado a una temperatura entre 45 y 55 ^ por un tiempo de entre 5 y 10 segundos, depositar el contenido de la pajuela en un recipiente apropiado
y agregar entre 0,5 y 1 ,0 mL de agua de mar microfiltrada para detener el efecto crioprotector.
En todos los pasos del método en que está involucrada el agua de mar, debe entenderse que el agua de mar está en condiciones estériles usando cualquier método del estado del arte para obtener dicha condición, como por ejemplo usando membranas de microfiltración de 0,22 μηι, o posteriormente usando luz ultravioleta.
Los hatcheries productores de abalón realizan fecundaciones utilizando reproductores acondicionados, los que son inducidos al desove. Los resultados dependen de ciclo reproductivo y del acondicionamiento de los reproductores. Las ventajas que tiene esta invención es poder tener los espermatozoides almacenados, con un aseguramiento de calidad que permitan realizar desoves planificados de acuerdo a la demanda, y donde los espermatozoides almacenados provienen de especímenes con características altamente valoradas.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN Ejemplo 1 : Preservación de espermatozoides de Abalón rojo, Haliotis rufescens a) Obtención de espermatozoides
Los gametos de abalón fueron obtenidos mediante la inducción a la liberación gamética de ejemplares maduros. La inducción de los ejemplares se llevo a cabo con peróxido de hidrógeno (H202) y Tris 2M, tal como es conocido en el arte (Hydrogen peroxide induces spawning in mollusks, with activation of prostaglandin endoperoxide synthetase DE Morse, H Duncan, N Hooker, y A Morse. Science 15 Abril 1977 196: 298-300) b) Solución Crioprotectante y su concentración Se utilizó la siguiente solución crioprotectante:
Propilenglicol (PG 6M), 5% sacarosa (p/v), 10% de yema de huevo (v/v).
Una vez preparada la solución se procedió a centrifugar a 1 .000 rpm durante 10 minutos, luego se separó el sobrenadante y se almacenó a 6QC hasta su posterior uso. c) Mezcla de espermatozoides con solución crioprotectante En una cápsula Petri, se colocaron 2 ml_ de los espermatozoides obtenidos y se les agregó 2ml_ de la solución crioprotectante, obteniéndose así una molaridad de 3M en cada muestra. Una vez puestos los espermatozoides en la cápsula de Petri en contacto con el crioprotector, se procedió al llenado de pajuelas (0,5ml_) previamente rotuladas según el crioprotector y la molaridad correspondiente. Esta mezcla se mantiene durante 10min. (Tiempo de equilibrio) antes de iniciar la congelación. d) Modo de cargar pajuelas con solución de espermatozoides- crioprotectante
Las pajuelas se llenaron con ayuda de una micropipeta automática según el siguiente procedimiento:
1 Q Se succiona agua de mar (0,05ml_ aprox.)
2Q Se succiona la misma cantidad de aire (0,05ml_ aprox.)
3Q Se succiona la solución espermática (0,3ml_ aprox.)
4Q Se repite el paso 2 y posteriormente el 1 5Q Finalmente se sella la pajuela con polivinil-alcohol (PVA)
e) Congelamiento de las muestras
Las pajuelas debidamente rotuladas fueron introducidas en una cámara de criopreservación Marca Planner Modelo Kryo 560-16. Una vez cargada la cámara, se
hizo correr el programa correspondiente hasta llegar a la temperatura de -40QC. El programa de congelación usado fue el que se detalla a continuación:
1 .-Temperatura inicial: 6QC
2.- Desde 6QC hasta -5QC a una tasa de -5QC/min. 3.- Desde -5QC hasta -40QC a una tasa de -18QC/min.
4. - Se mantienen las pajuelas durante 5 min en esas condiciones
5. - Se extraen las pajuelas y se sumergen en nitrógeno líquido
Después de sumergirlas en nitrógeno líquido, se procedió al almacenamiento en un termo marca MVE modelo XC 32-8 (Fig. 3). Las muestras se mantuvieron a - 196QC hasta su descongelación. f) Descongelamiento
Se descongeló cada pajuela exponiéndola por 3 seg. a temperatura ambiente, luego fueron sumergidas en un baño termorregulado a 50QC por 7 segundos. Después se cortaron ambos extremos de la pajuela para liberar su contenido y depositarlo en una cápsula Petri, donde se adicionó 0,2 ml_ de agua de mar microfiltrada y se mantuvieron por 5 minutos con la finalidad de detener el efecto del crioprotector y permitir la activación de los espermatozoides.
Ejemplo 2: Fecundación con espermatozoides criopreservados
Antes del inicio del proceso de criopreservación, los ovocitos frescos obtenidos por desove fueron inseminados con espermatozoides frescos para determinar el porcentaje de fecundación control. Para esta determinación en un vaso precipitado se mezcló 50ml_ de ovocitos con 3ml_ de espermatozoides frescos.
Para establecer los porcentajes de fecundación con espermatozoides congelados-descongelados se utilizaron cápsulas Petri de 3,5 cm de diámetro con 2ml_ de ovocitos frescos, agitándose por 2 minutos.
Tanto para la fecundación control como la experimental, después de 15 minutos post-inseminados, los ovocitos fecundados fueron colocados en cristalizadores de 95 mm de diámetro con 100 mL de agua de mar microfiltrada, la cual se recambió después de 15-20 minutos. Se dejan desarrollándose hasta el estado larva veliger y se determina el porcentaje de larvas obtenidas con los espermatozoides criopreservados.
Evaluación visual directa al microscopio
El conteo se realizó en cuatro cuadrantes de forma diagonal en la cámara de Neubauer, verificando además el movimiento de los espermatozoides. Los datos fueron registrados y transformados a porcentaje.
Evaluación mediante el análisis de imágenes
Una vez montada la muestra en el microscopio, se grabaron 4 videos de 5 segundos cada uno, que correspondían a un cuadrante de evaluación del protocolo de conteo en la cámara Neubauer anteriormente descrito. Los videos fueron tomados con una cámara digital (Canon PowerShot A620) y guardados en formato digital para su posterior análisis mediante un software de análisis de imágenes. Con este programa se determinó el número de espermatozoides, su velocidad de desplazamiento y la distancia recorrida por segundo. La fecundación mencionada se realizó, tanto con espermatozoides frescos como con espermatozoides sometidos al método de criopreservación y que fueron mantenidos almacenados por un período de 2 a 10 días. El porcentaje de fecundación alcanzado con espermatozoides frescos varió entre 87 y 97%, mientras que el porcentaje de fecundación utilizando los espermatozoides criopreservados es de 40 ± 7,2%.
Al analizar la fragmentación de ADN usando la técnica de ensayo cometa, se obtuvo un 35% de fragmentación para espermatozoides frescos y un 36 a 40% para los espermatozoides criopreservados.
Ejemplo 3: Preservación de espermatozoides de abalón verde Haliotis discus hannai.
En el caso del abalón verde se siguieron los mismos pasos del Ejemplo 1 para abalón rojo, cambiando solamente la concentración de propilenglicol en la solución crioprotectante, donde la concentración fue de 3M.
El porcentaje de fecundación obtenido para abalón verde fue de 24,2 ± 5%.
Ejemplo 4: Evaluación de la motilidad espermática de gametos de abalón rojo, sometidos al método de la presente invención.
Muestras por triplicado de los espermatozoides conservados del Ejemplo 1 y Ejemplo 3 fueron evaluados para determinar la motilidad espermática después de someterlos a la descongelación.
Para abalón rojo se obtuvo un porcentaje de motilidad espermática promedio de 93 ± 4% y para abalón verde de 87 ± 6% y los porcentajes de fecundación con espermatozoides criopreservados de 40 ± 7,2% en abalón rojo y de 20,2 ± 5% para abalón verde. Estos resultados demuestran la superioridad del método de la presente invención, frente a métodos o crioprotectantes anteriormente descritos.
Claims
1 . Método para preservación de espermatozoides de abalón, CARACTERIZADO porque comprende los siguientes pasos:
a. proporcionar espermatozoides de abalón a criopreservar;
b. proporcionar una solución crioprotectante que comprende propilenglicol, sacarosa y yema de huevo;
c. agregar a un volumen de los espermatozoides de la etapa (a) un volumen igual de la solución crioprotectante del punto anterior mezclando suavemente;
d. cargar en una pajuela apropiada con un volumen de entre 30 y 80 μΙ_ de agua de mar microfiltrada, luego un volumen de entre 30 y 80 μΙ_ de aire, luego un volumen de entre 100 y 500 μΙ_ de la solución con espermatozoides del punto anterior, luego un volumen de entre 30 y 80 μΙ_ de aire, y finalmente un volumen de entre 30 y 80 μΙ_ de agua de mar microfiltrada, la pajuela es sellada, y se deja un período de equilibrio de entre 5 y 15 minutos;
e. congelar las muestras hasta una temperatura de -40^ y almacenarlas en nitrógeno líquido;
f. descongelar los espermatozoides para su uso retirando las pajuelas desde el almacenaje en nitrógeno líquido.
2. Método para preservación de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la solución crioprotectante comprende entre 3 y 7 M de propilenglicol, entre un 3 y 6 % en peso/volumen de sacarosa, y entre un 8 y 12% en volumen/volumen de yema de huevo.
3. Método para preservación de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque para la congelación se usa una cámara de congelamiento programable, usando una temperatura inicial de entre 5,5°C y 6,5°C, bajando la temperatura hasta entre -5,5 °C y 4,5^ usando una tasa de congelación de entre -5,5 y -4,5 <C/min; continuar bajando la temperatura hasta entre -38 y -42<C usando una tasa de congelación de entre -17 a -19<C/min, una vez alcanzada la temperatura de entre -38 °C y -42 <Ό sumergir en nitrógeno líquido y almacenar en nitrógeno líquido hasta su uso.
4. Método para preservación de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque para el descongelamiento la pajuela se expone entre 1 y 5 segundos a temperatura ambiente, se sumergen inmediatamente en un baño termorregulado a una temperatura entre 45 y 55^ por un tiempo de entre 5 y 10 segundos, depositar el contenido de la pajuela en un recipiente apropiado y agregar entre 10 y 40 μΙ_ de agua de mar microfiltrada para detener el efecto crioprotector.
5. Método de preservación de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADO porque el abalón es Haliotis rufescens.
6. Método de preservación de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADO porque el abalón es Haliotis discus hannai.
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Legal Events
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Ref document number: P201290012 Country of ref document: ES |
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| NENP | Non-entry into the national phase |
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| WWE | Wipo information: entry into national phase |
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| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
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