WO2011012119A1 - Method and device for detecting the motion and adsorption of cells and particles on cell, tissue, and implant layers in the simulation of flow conditions - Google Patents

Method and device for detecting the motion and adsorption of cells and particles on cell, tissue, and implant layers in the simulation of flow conditions Download PDF

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WO2011012119A1
WO2011012119A1 PCT/DE2010/000900 DE2010000900W WO2011012119A1 WO 2011012119 A1 WO2011012119 A1 WO 2011012119A1 DE 2010000900 W DE2010000900 W DE 2010000900W WO 2011012119 A1 WO2011012119 A1 WO 2011012119A1
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cells
particles
cell
tissue
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PCT/DE2010/000900
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Sandy Mosig
Knut Rennert
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Universitätsklinikum Jena
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for detecting movement and attachment processes of cells and particles at cell, tissue and implant layers in the simulation of flow conditions.
  • Such movement and attachment processes of the cells and particles are important for the study of cell and tissue physiology and effects caused by drugs, pathogens or other agents and the behavior of these cells and particles as they flow through the Influence organism.
  • the simulation devices should be able to simulate the flow conditions occurring in the body as realistically as possible in order to
  • TM Bocan Animal Mode of Atherosclerosis and Interpretation of Drug Intervention Studies, Curr Pharm Des 4, 1998, 37-52, AC McMahon, L. Critharides and HC Lowe Cardiovasc Haematol Disord 5, 2005, 433-440, JC Russell and S. Proctor: Small Animal Mode of Cardiovascular Disease: Tools for the Study of the Role of Metabolic Syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis, Cardiovasc Pathol 15, 2006, 318-330).
  • the microscope with condenser is directed to a focal plane above the interaction surface and can only look at this plane.
  • the observation is, however, restricted exclusively to this defined level, so that the cells are persecuted in their movement does not continuously in real time "can. In the considered level, it is only possible to detect the cells essentially as a static size of individual measurements.
  • the deliberately chosen flow rate in the flow chamber in DE 100 19 833 C2 allows the adjustment of flow and pressure conditions only to a very limited extent due to the device.
  • laminar flow conditions can not be built up and evaluated at the interaction surface.
  • Single observations of cells are not spatially resolvable due to the high dynamics of the cell movement.
  • this device only reproduces the flow conditions of the bloodstream and can thus observe cells that move in this simulated bloodstream and possibly hang on the wall and attach. Cells, however, which migrate through this wall and thus can be found below the interaction surface, can not be detected and evaluated and are thus not accessible to the investigation. However, such a statement is of great interest for the analysis of, for example, drug delivery for pharmaceuticals.
  • Endothelial cells Single cell layers of endothelial cells cultured in commercially available cell culture inserts. Before the start of the experiment, the endothelial cells are incubated with the substances to be tested by placing them directly on the cells. Subsequently, the substances are washed away and the actual attempt is started. The flow of the medium is generated via a syringe pump. Adhesion and transmigration are observed by a phase-contrast microscope placed at a perpendicular angle above the interaction surface. Endothelial cells need time to adapt to flow conditions.
  • Endothelial cells grown under static conditions have a different physiology than cells produced under the influence of flow conditions (eg BJT Butcher, AM Penrod, AJ Garcia and RM Nerem: Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments, Arterioscler Thromb Vase Biol 24, 2004, 1429-1434).
  • flow conditions eg BJT Butcher, AM Penrod, AJ Garcia and RM Nerem: Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments, Arterioscler Thromb Vase Biol 24, 2004, 1429-1434).
  • the devices provide no requirement to attract the cells under flow conditions. There is thus no possibility for longer cultivation of endothelial cells under flow conditions and the results are only very limited comparable with the in vivo situation.
  • transmigrated cells are collected in a container. When penetrating the interaction surface, however, transmigrated cells remain attached to their underside, which are ignored in the evaluation. Gravity is not enough to cause all transmigrated cells to fall down in order to be completely quantitatively evaluated. Thus, adhesion and migration processes are only inaccurately detectable.
  • transmigrant cells can not be detected and analyzed after adhesion.
  • the cell examination is given only on the said monocell layer.
  • the pressure and flow conditions in the capillary system can only be influenced to a limited extent. Even with this method, no long-term studies are possible.
  • transmigrating cells also escape elimination of the observation and the subsequent evaluation in this device as well. Again, only monolayers are used for investigation. Real-time analysis of cell observation is also not possible. The adjustment and adjustment of temperature and pH are not given. The cell layer can be incubated with the substances to be tested only from the apical side before starting the experiment. No dynamic perfusion is possible during the experiment.
  • the disadvantages of the animal experiments are, in particular, that the animals are killed during or at the end of the experiments and that a reproducible local effect of pathogens, drugs and other agents on disease patterns at defined points of the body even when using inbred strains, due to the individual Differences of the individual animals used, are very difficult to reproduce. This leads to the necessity of carrying out a large number of individual experiments in order to compensate for this disadvantage by using statistical aids.
  • the individual observation of flowing and accumulating cells in standardisable examination devices causes great difficulties due to the one-level visual observability and the high dynamics of the cell movement, so that the evaluation essentially amounts to the acquisition of statistical quantities ,
  • the invention is therefore based on the task of more accurately and completely detecting the movement and attachment processes of cells and particles in the simulation of flow conditions.
  • the movement and attachment processes should be able to be simulated and evaluated under conditions that are much closer to the pressure and flow behavior in the organism to be replanted or the body's own vessel, even for long-term investigations.
  • the adhesion and migration behavior of the cells and particles should also be able to be detected as completely as possible and with high evaluation accuracy.
  • Implant layer optically recorded and evaluated in the entire at least one interaction zone (and not only by view from above).
  • Detection is preferably carried out by several
  • Interaction zone in an area not only above, but also within and possibly below the same visually spatially resolved and fully monitored.
  • This monitoring may also be accompanied by spectroscopic detection of the movement and attachment of the cells and particles, including the zone of interaction with their cell, tissue and implant layers themselves, in that a spectroscopy unit is coupled to at least one of said observation beam paths.
  • Cells and particles transmigrating through the cell, tissue and implant layer of this at least one interaction zone which can be optically traced and possibly analyzed spectrometrically, are collected in at least one perfusion chamber below the interaction zone and can thus be fed to a further evaluation.
  • the flow conditions of the flow medium for the flow through the interaction zone for example by adjusting the pH, temperature, oxygen saturation and nutrient supply for the cells and particles, specially adjusted, for example by a metered control.
  • the invention allows an individual adaptation of physiological or even pathological flow conditions for the cells to be examined over desired periods of time.
  • this system allows the freely controllable addition of various substances not only from the apical but also from the basolateral side of the cell / tissue or implant layer. This is important because z. B. subcellular bioactive substances, such as modified LDL, have a strong influence on the interaction of leukocytes with the entire tissue association.
  • the study of the effects of various drugs, biologically active molecules, chemical noxae and microbiological organisms, such as bacteria, parasites and fungi is not limited only to the interaction of cells in the flow medium with the apical cells of the vascular wall, but also allowed an investigation of the vascular wall transmigrating and / or tissue differentiating cells.
  • the perfusion chambers integrated in the invention and the cell traps contained therein it is possible to absorb completely migrated cells vigorously and to make subsequent analytical and / or functional examinations accessible.
  • the invention has a freely controllable control of the environmental parameters pH value, temperature, amount of oxygen and nutrient addition, which physiological conditions can be adjusted or by the adjustable environmental parameters related pathological events, such as alkalosis, acidosis, nutrient restriction, hypoxia standardized and close to the in vivo situation can be analyzed.
  • Diseases such as cancer and sepsis, whose spread through blood flow, can be studied much more accurately, thoroughly and comprehensively with this invention than with previous in vitro methods.
  • the invention makes it possible to replicate the metastasis of tumor cells in a cost-efficient, standardized manner and without the use of animal models.
  • physiological conditions can be simulated to obtain a comprehensive picture of the spread of tumor cells in vivo.
  • Fig. 1 chamber body with three below the interaction zone
  • Fig. 2 frontal view of the chamber body with indicated supervisory Lens and Tubussystem
  • Fig. 3 lateral view of the chamber body in the longitudinal axis with indicated supervisory and lateral objective
  • Tube systems including fluorescence unit
  • FIG. 4 shows a lateral view of the chamber body in the longitudinal axis with indicated objective lens and tube systems and lateral Raman microscope and laser.
  • FIG. 5 schematic representation of the liquid circulations
  • Fig. 1 shows a chamber body 1 with three interaction zones 2, 3, 4, each consisting of a human body replicated cell, tissue and implant layer.
  • the chamber body 1 has an inflow 5, via which a flow medium 6 with the cells to be examined and particles (indicated by arrow) is introduced into the chamber body 1, so that the cells and particles of the inflowing flow medium 6 successively the interaction zones 2, 3, 4, under which three perfusion chambers 7, 8, 9 arranged are, flow through and come into contact with the respective cell, tissue and implant layer.
  • the flow medium exits via a drain 10 again.
  • the chamber body is heated by an integrated heating / cooling water channel system 11.
  • the interaction of the cells and particles of the flow medium with the interaction zones 2, 3, 4 can be observed by a microscope system 12 arranged laterally or on the side (see Fig. 2).
  • a microscope system 12 both stereomicroscope systems and confocal laser scanning microscopes or other microscope and spectroscopy systems can be used in a conventional manner.
  • the observation of the interaction zones 2, 3, 4 by the microscope system 12 is effected by interchangeable glass or quartz inserts 13, 14, 15 provided in the chamber body 1 and assigned to the interaction zones 2, 3, 4.
  • the microscope system 12 (means not shown in the drawing for reasons of clarity, for example rail-like guide elements known per se for transversal position change and also pivoting or rotation elements known per se for changing the angular position, via the side of the chamber body 1 with the glass body). or quartz inserts 13, 14, 15.
  • the microscope system 12 can monitor and evaluate the adhesion, migration and differentiation of the cells and particles of the flow medium and the cell, tissue and implant layers of the interaction zones 2, 3, 4 in real time.
  • FIG. 3 shows two microscope systems 12 which observe the interaction zones 2, 3, 4 of the chamber body 1, both in the direction of supervision and as well as laterally (observation beam path 36).
  • the two microscope systems 12 are each coupled via a camera port 16 or 17 to a computer system 18 (see FIG.
  • tissue and implant layers of the interaction zones 2, 3, 4 and / or the perfusion chambers 7, 8, 9, these areas are stimulated by a suitable and fluorescent dyes Light source 19 irradiated.
  • tissue and implant layers of the interaction zones 2, 3, 4 and / or the perfusion chambers 7, 8, 9, spectroscopy measurements can also be carried out.
  • the optical excitation by a laser 20 see Fig .. 4).
  • the measurement of the spectra is carried out by a detector 21, which can be integrated into the system, for example in the form of a known Raman microscope.
  • the detector 21 is coupled to a transducer system 22 for signal digitization, which is also in communication with the computer system 18 for data evaluation.
  • a cell reservoir 23 is used, which is coupled to a heatable / coolable medium reservoir 24 (see schematic illustration FIG.
  • a control of pH value and pO 2 value can be effected by gassing systems which may be integrated in the medium reservoir 24 or also in the cell reservoir 23 (not shown explicitly in the drawing for reasons of clarity).
  • An addition of substances into the flow medium can take place through a substance application valve 25.
  • FIG. 5 shows this medium circuit 26, in which also a sensor chamber 27 with sensor elements for detecting the cell culture parameters, such as pH values, temperature and Nutrient supply, is arranged for the existing in the flow medium 5 cells and particles.
  • the said cell culture parameters are controlled in the medium circuit 26 and, for example, as mentioned above, can be controlled in an application-specific manner via the abovementioned fumigation systems of the medium reservoir 24 or of the cell reservoir 23.
  • perfusion chambers 30, 31, 32 are arranged (see also perfusion chambers 7, 8, 9 in Fig. 1) are attached to the same (corresponding to the three said interaction zones), to each of which a reservoir 33, 34, 35 for additionally introduced into the medium circuit 26 test substances and other applications is connected.

Abstract

The aim was to detect the motion processes and adsorption processes of cells and particles in the simulation of flow conditions completely and more precisely. According to the invention, the motion and adsorption of the cells and particles in the at least one interaction zone (2, 3, 4) are completely, optically monitored and evaluated, transmigrating cells and particles are captured (7, 8, 9) for inspection and evaluation, and in particular for long-term examinations, the culture conditions of the flow medium for the flow through the interaction zone (2, 3, 4) are controlled, for example, by adjusting the pH-value, the temperature, and the nutrient supply for the cells and particles. The invention is used, for example, to test pharmaceuticals, pathogens, and other active ingredients.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Erfassung der Bewegung und Anlagerung von Zellen und Partikeln an Zell-, Gewebe- und Implantatschichten bei der Simulation von Flussbedingungen  Method and device for detecting the movement and attachment of cells and particles to cell, tissue and implant layers in the simulation of flow conditions
Beschreibung description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, um Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge von Zellen und Partikeln an Zell-, Gewebe- und Implantatschichten bei der Simulation von Flussbedingungen zu erfassen. Solche Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge der Zellen und Partikel, insbesondere von Blutzellen, sind bedeutsam für die Untersuchung der Zell- und Gewebephysiologie und von Effekten, welche durch Pharmaka, Pathogene oder sonstige Wirkstoffe hervorgerufen werden und das Verhalten dieser Zellen und Partikel bei ihrem Durchfluss durch den Organismus beeinflussen.  The invention relates to a method and a device for detecting movement and attachment processes of cells and particles at cell, tissue and implant layers in the simulation of flow conditions. Such movement and attachment processes of the cells and particles, in particular of blood cells, are important for the study of cell and tissue physiology and effects caused by drugs, pathogens or other agents and the behavior of these cells and particles as they flow through the Influence organism.
Zur Bestimmung von Haupt- und Nebenwirkungen dieser Pharmaka, verschiedener Pathogene und sonstiger Wirkstoffe auf den besagtenTo determine the main and side effects of these drugs, various pathogens and other agents on the said
Organismus wird deshalb deren Einfluss auf das Anlagerungs-,Organism will therefore have its influence on the attachment,
Durchwanderungs- und Differenzierungs-Verhalten, einschließlich sonstiger medizinisch oder biologisch relevanter Verhaltens- undMigration and differentiation behavior, including other medically or biologically relevant behavior and behavioral patterns
Reaktionsweisen, von Suspensions- und adhärenten Zellen an Zell- und Gewebeoberflächen unter Flussbedingungen inReactions of suspension and adherent cells on cell and tissue surfaces under flow conditions in
Simulationsvorrichtungen außerhalb des Organismus verstärkt untersucht. Simulation devices outside of the organism increasingly examined.
Die Simulationsvorrichtungen sollen dabei die im Körper erfolgenden Flussbedingungen möglichst naturgetreu nachbilden können, umThe simulation devices should be able to simulate the flow conditions occurring in the body as realistically as possible in order to
Organismus- und geweberelevante Aussagen treffen zu können. Mit diesen Simulationsverfahren sollen insbesondere Versuche an Tieren substituiert oder zumindest eingeschränkt werden, die zwar lebensnahOrganism and tissue-relevant statements to be able to meet. With these simulation methods in particular experiments on animals are to be substituted or at least restricted, which, while true to life
Analysen im komplexen System des Organismus unter Berücksichtigung vieler physiologisch relevanter Parameter ermöglichen, die aber ethisch umstritten sind, häufig keine Akzeptanz finden und dadurch immer mehr in Kritik geraten. Darüber hinaus ist bei den Tiermodellen eine Echtzeitbeobachtung des Krankheitsentstehens und des Krankheitsverlaufs nur eingeschränkt möglich. Zudem ist es häufig erforderlich, die behandelten Tiere nach Ablauf des Versuchs zu töten. Dadurch wird auch immer nur eine Momentaufnahme des Krankheitsverlaufs ermöglicht. Aufgrund der individuellen Unterschiede, wie sie auch bei Inzuchttieren auftreten, ist es so gut wie unmöglich, selbst bei einer Vielzahl von Untersuchungen und getöteten Versuchstieren einen repräsentativen Krankheits verlauf zu rekonstruieren. Des Weiteren ist die Übertragbarkeit der beim Tiermodell gewonnenen Erkenntnisse auf dem Menschen meist fraglich (T. M. Bocan: Animal modeis of atherosclerosis and Interpretation of drug intervention studies, Curr Pharm Des 4, 1998, 37-52; A. C. McMahon, L. Kritharides and H. C. Lowe: Animal modeis of atherosclerosis progression: current concepts, Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 5, 2005, 433-440; J. C. Russell and S. Proctor: Small animal modeis of cardio vascular disease: tools for the study of the roles of metabolic Syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc Pathol 15, 2006, 318-330). Analyzes in the complex system of the organism allow for many physiologically relevant parameters, but ethically are controversial, often find no acceptance and thus more and more come under criticism. Moreover, in animal models, real-time observation of disease development and disease progression is limited. In addition, it is often necessary to kill the treated animals at the end of the experiment. As a result, only a snapshot of the course of the disease is made possible. Due to the individual differences that occur in inbred animals, it is almost impossible to reconstruct a representative course of disease even in a large number of examinations and killed experimental animals. Furthermore, the transmissibility of the knowledge obtained in the animal model is usually questionable in humans (TM Bocan: Animal Mode of Atherosclerosis and Interpretation of Drug Intervention Studies, Curr Pharm Des 4, 1998, 37-52, AC McMahon, L. Critharides and HC Lowe Cardiovasc Haematol Disord 5, 2005, 433-440, JC Russell and S. Proctor: Small Animal Mode of Cardiovascular Disease: Tools for the Study of the Role of Metabolic Syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis, Cardiovasc Pathol 15, 2006, 318-330).
Zur Simulation der im Organismus gegebenen Flussbedingungen ist ein Strömungsmodell zur Untersuchung der Anlagerungsprozesse von Zellen bekannt (DE 100 19 833 C2), bei dem ein Endrohr in einem Winkel größer 0° auf eine Interaktionsfläche weist. Durch diese Versuchsanordnung entstehen in diesem Strömungsmodell turbulente Strömungen. Mittels einer Beobachtungseinheit, bestehend aus einem parallel zum Endrohr angebrachten Mikroskop mit Kondensor, werden die Zell-Anlagerungsprozesse im Flussmedium an die Interaktionsfläche beobachtet. To simulate the flow conditions given in the organism, a flow model for the investigation of the attachment processes of cells is known (DE 100 19 833 C2), in which an end tube points at an angle greater than 0 ° to an interaction surface. Through this experimental arrangement, turbulent flows are created in this flow model. By means of an observation unit, consisting of a mounted parallel to the tailpipe microscope with condenser, the cell attachment processes are observed in the flow medium to the interaction surface.
Das Mikroskop mit Kondensor ist auf eine Fokusebene oberhalb der Interaktionsfläche gerichtet und kann auch nur diese Ebene betrachten. Die Beobachtung ist aber ausschließlich auf diese definierte Ebene beschränkt, so dass die Zellen in ihrer Bewegung nicht kontinuierlich in Echtzeit verfolgt werden "können. In der betrachteten Ebene ist es lediglich möglich, die Zellen im Wesentlichen als statische Größe von Einzelmessungen zu erfassen. The microscope with condenser is directed to a focal plane above the interaction surface and can only look at this plane. The observation is, however, restricted exclusively to this defined level, so that the cells are persecuted in their movement does not continuously in real time "can. In the considered level, it is only possible to detect the cells essentially as a static size of individual measurements.
Die in der DE 100 19 833 C2 bewusst gewählte Flussrate in der Strömungskammer lässt vorrichtungsbedingt die Einstellung von Strömungs- und Druckverhältnissen nur sehr eingeschränkt zu, insbesondere lassen sich keine laminaren Strömungsverhältnisse an der Interaktionsfläche aufbauen und auswerten. Einzelbeobachtungen von Zellen sind aufgrund der hohen Dynamik der Zellbewegung räumlich nicht auflösbar.  The deliberately chosen flow rate in the flow chamber in DE 100 19 833 C2 allows the adjustment of flow and pressure conditions only to a very limited extent due to the device. In particular, laminar flow conditions can not be built up and evaluated at the interaction surface. Single observations of cells are not spatially resolvable due to the high dynamics of the cell movement.
Außerdem bildet diese Vorrichtung ausschließlich die Flussbedingungen der Blutbahn nach und kann damit Zellen beobachten, die sich in dieser simulierten Blutbahn bewegen und ggf. an der Wandung hängen bleiben und anlagern. Zellen hingegen, welche diese Wandung durchwandern und damit unterhalb der Interaktionsfläche zu finden sind, können nicht erfasst und ausgewertet werden und sind damit der Untersuchung nicht zugänglich. Eine solche Aussage ist aber zur Analyse beispielsweise eines Wirkstofftransportes für Pharmaka von großem Interesse. In addition, this device only reproduces the flow conditions of the bloodstream and can thus observe cells that move in this simulated bloodstream and possibly hang on the wall and attach. Cells, however, which migrate through this wall and thus can be found below the interaction surface, can not be detected and evaluated and are thus not accessible to the investigation. However, such a statement is of great interest for the analysis of, for example, drug delivery for pharmaceuticals.
Darüber hinaus können, insbesondere für Langzeituntersuchungen, wichtige Umfeldparameter, wie Sterilität, pH- Wert etc., um der Physiologie des nachzubildenden Organismus zu entsprechen, nicht gehalten werden. Morphologische Anpassungen von Zellen an die angelegten Flussbedingungen benötigen mehrere Tage. Somit ist eine Berücksichtigung der direkten Auswirkungen des Flusses auf die Morphologie und Physiologie der Zellen nicht gegeben. Des Weiteren bietet die Vorrichtung keine Möglichkeit, mehrschichtige Zellverbände zu untersuchen. Ferner erlaubt die Vorrichtung nicht das mehrmalige Untersuchen von Partikeln und Zellen. In addition, important environmental parameters, such as sterility, pH etc., in order to correspond to the physiology of the organism to be reproduced, can not be maintained, especially for long-term investigations. Morphological adaptations of cells to the applied flow conditions take several days. Thus, a consideration of the direct effects of flow on the morphology and physiology of the cells is not given. Furthermore, the device offers no possibility to investigate multilayer cell aggregates. Furthermore, the device does not allow the repeated examination of particles and cells.
Es ist auch bekannt, Adhäsions- und Migrationsprozesse von T-Zellen unter Flussbedingungen in einem System zu detektieren. (z. B.It is also known to detect adhesion and migration processes of T cells under flow conditions in a system. (eg
G. Cinamon and R. Alon: A real time in vitro assay for studying leukocyte transendothelial migration under physiological flow conditions, J Immunol Methods 273(1-2), 2003, 53-62; T. Schreiber,G. Cinamon and R. Alon: A real time in vitro assay for studying leukocyte transendothelial migration under physiological flow conditions, J. Immunol. Methods 273 (1-2), 2003, 53-62; T. Schreiber,
V. Shinder et al.: Shear flow-dependent integration of apical and subendothelial chemokines in T-cell transmigration: implications for locomotion and the multistep paradigm, Blood 109(4), 2007, 1381-V. Shinder et al .: Shear flow-dependent integration of apical and subendothelial chemokines into T-cell transmigration: implications for locomotion and the multistep paradigm, Blood 109 (4), 2007, 1381-
1386). 1386).
In beiden Einrichtungen werden nach dem gleichen Prinzip In both facilities will follow the same principle
Einzelzellschichten aus Endothelzellen in handelsüblichen Zellkultureinsätzen kultiviert. Vor Versuchsbeginn werden die Endothelzellen mit den zu testenden Substanzen inkubiert, indem diese direkt auf die Zellen gegeben werden. Anschließend werden die Substanzen weggewaschen und der eigentliche Versuch gestartet. Der Fluss des Mediums wird über eine Spritzen-Pumpe erzeugt. Adhäsion und Transmigration werden durch ein im senkrechten Winkel über der Interaktionsfläche angebrachtes Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Endotheliale Zellen benötigen Zeit, sich an Flussbedingungen anzupassen. Unter statischen Bedingungen gewachsene endotheliale Zellen weisen eine andere Physiologie auf als Zellen, die unter dem Einfluss von Strömungsverhältnissen entstehen (z. B. J. T. Butcher, A. M. Penrod, A. J. Garcia and R. M. Nerem: Unique morphology and focal adhesion development of valvulär endothelial cells in static and fluid flow environments, Arterioscler Thromb Vase Biol 24, 2004, 1429- 1434). Single cell layers of endothelial cells cultured in commercially available cell culture inserts. Before the start of the experiment, the endothelial cells are incubated with the substances to be tested by placing them directly on the cells. Subsequently, the substances are washed away and the actual attempt is started. The flow of the medium is generated via a syringe pump. Adhesion and transmigration are observed by a phase-contrast microscope placed at a perpendicular angle above the interaction surface. Endothelial cells need time to adapt to flow conditions. Endothelial cells grown under static conditions have a different physiology than cells produced under the influence of flow conditions (eg BJT Butcher, AM Penrod, AJ Garcia and RM Nerem: Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments, Arterioscler Thromb Vase Biol 24, 2004, 1429-1434).
Die Vorrichtungen bieten keine Voraussetzung, die Zellen unter Flussbedingungen anzuziehen. Damit ist auch keine Möglichkeit zur längeren Kultivierung von Endothelzellen unter Flussbedingungen gegeben und die Ergebnisse sind nur sehr eingeschränkt mit der in vivo Situation vergleichbar. The devices provide no requirement to attract the cells under flow conditions. There is thus no possibility for longer cultivation of endothelial cells under flow conditions and the results are only very limited comparable with the in vivo situation.
Die transmigrierten Zellen werden in einem Behälter aufgefangen. Beim Durchdringen der Interaktionsfläche bleiben jedoch transmigrierte Zelle an deren Unterseite anhaften, die bei der Auswertung unberücksichtigt bleiben. Die Gravitation reicht nicht aus, dass alle transmigrierten Zellen nach unten fallen, um quantitativ vollständig ausgewertet werden zu können. Damit sind Adhäsions- und Migrationsprozesse nur ungenau erfassbar. The transmigrated cells are collected in a container. When penetrating the interaction surface, however, transmigrated cells remain attached to their underside, which are ignored in the evaluation. Gravity is not enough to cause all transmigrated cells to fall down in order to be completely quantitatively evaluated. Thus, adhesion and migration processes are only inaccurately detectable.
Außerdem ermöglicht keine der Vorrichtungen die mehrmalige Untersuchung der Zellen und Partikel in ihrem Fluss durch die Interaktionszone. Auch können Zellen und Partikel in der Interaktionszone nur auf der apikalen Seite vor Versuchsbeginn mit den zu testenden Substanzen inkubiert werden. Bekannt ist weiterhin ein System zur Beobachtung von Adhäsions- und Migrationsprozessen mittels eines Kapillarsystems. Tumorzellen werden in dieses Kapillarsystem eingesetzt und über eine Monozellschicht geleitet. Adhäsionsvorgänge werden dabei ebenfalls aufsichtig durch ein Mikroskop auf der Interaktionsfläche beobachtet. Hierzu wird eine handelsübliche 48-Loch-Zellkultuφlatte genutzt (C. Dong, M. J. Slattery et al.: In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic Protrusion, locomotion, and extravasation, Ann Biomed Eng 30(3), 2002, 344-55). In addition, none of the devices allows for multiple studies of the cells and particles in their flow through the interaction zone. In addition, cells and particles in the interaction zone can only be incubated with the substances to be tested on the apical side before the start of the experiment. Also known is a system for monitoring adhesion and migration processes by means of a capillary system. Tumor cells are inserted into this capillary system and passed over a monocell layer. Adhesion processes are also monitored by a microscope on the interaction surface. For this, a commercial 48-well Zellcultuπlatte is used (C. Dong, MJ Slattery et al .: In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation, Ann Biomed Eng 30 (3), 2002, 344-55 ).
Auch hier können transmigrierende Zellen nach Adhäsion nicht erfasst und analysiert werden. Außerdem ist die Zelluntersuchung nur auf der besagten Monozellschicht gegeben. Again, transmigrant cells can not be detected and analyzed after adhesion. In addition, the cell examination is given only on the said monocell layer.
Die Druck- und Strömungsverhältnisse im Kapillarsystem sind nur eingeschränkt beeinflussbar. Auch bei dieser Methode sind keine Langzeituntersuchungen möglich.  The pressure and flow conditions in the capillary system can only be influenced to a limited extent. Even with this method, no long-term studies are possible.
In weiteren Publikationen (J. J. Chiu, D. L. Wang et al.: Effects of disturbed flow on endothelial cells, J Biomech Eng 120(1), 1998, 2-8 und J. J. Chiu, C. N. Chen et al.: Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells, J Biomech 36(12), 2003, 1883-95) beschreiben die Autoren ein ähnliches System wie oben von Cinamon und Alon (2003) sowie von Schreiber und Shinder et al. (2007) erwähnt. Das System ist um die Möglichkeit der Detektion von Fluoreszenzen ergänzt. Es besteht aus einem inversen Fluoreszenzmikroskop, das aufsichtig auf eine Flusskammer, bestehend aus einem Kanal, zeigt. An die Flusskammer ist ein Pumpensystem angeschlossen. In other publications (JJ Chiu, DL Wang et al .: Effects of disturbed flow on endothelial cells, J Biomech Eng 120 (1), 1998, 2-8 and JJ Chiu, CN Chen et al .: Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells, J Biomech 36 (12), 2003, 1883-95), the authors describe a similar system as described above by Cinamon and Alon (2003) and by Schreiber and Shinder et al. (2007). The system is supplemented by the possibility of detecting fluorescence. It consists of an inverted fluorescence microscope, which points to a flow chamber consisting of a channel. To the flow chamber, a pump system is connected.
Zusätzlich zu den bereits oben genannten Nachteilen sind keine Möglichkeiten zur Perfusion unterhalb der Interaktionsfläche gegeben. Auch hier ist insbesondere eine längere Kultivierung von Zellen unter Flussbedingungen ausgeschlossen, Möglichkeiten zur Einstellung und Anpassung für Temperatur und pH-Wert bestehen nicht. Transmigrierende Zellen können nicht erfasst werden und sind auch einer späteren Auswertung nicht zugänglich. In der Patentfamilie zu CA 2 503 203 Al wird ein Kammersystem mit mehreren Kammern beschrieben, wobei mindestens die erste Kammer durch einen Kanal mit einer zweiten Kammer verbunden ist. Durch diesen Kanal strömt eine Flüssigkeit über eine Zellschicht aus Endothelzellen. Es existiert eine Beobachtungseinheit zur Detektion von Zelladhäsion und Zellmigration. In addition to the disadvantages already mentioned above, there are no possibilities for perfusion below the interaction surface. Here, too, in particular a prolonged cultivation of cells under flow conditions is excluded, possibilities for adjustment and adjustment for temperature and pH do not exist. Transmigrating cells can not be detected and are not accessible for later evaluation. In the patent family to CA 2 503 203 A1 a chamber system with several chambers is described, wherein at least the first chamber is connected by a channel to a second chamber. Through this channel, a liquid flows through a cell layer of endothelial cells. There is an observation unit for the detection of cell adhesion and cell migration.
Wie auch schon in vorgenannten Systemen beschrieben (vgl. Cinamon und Alon, 2003 sowie Schreiber und Shinder et al., 2007), entziehen sich auch bei dieser Vorrichtung transmigrierende Zellen nach Adhäsion der Beobachtung und der nachfolgenden Auswertung. Es werden auch hier lediglich Monozellschichten zur Untersuchung genutzt. Echtzeitanalysen der Zellbeobachtung sind ebenfalls nicht möglich. Die Einstellung und Anpassung von Temperatur und pH-Wert sind nicht gegeben. Die Zellschicht kann vor Versuchsbeginn nur von der apikalen Seite mit den zu testenden Substanzen inkubiert werden. Es ist keine dynamische Perfusion während des Versuchs möglich.  As already described in the abovementioned systems (compare Cinamon and Alon, 2003 as well as Schreiber and Shinder et al., 2007), transmigrating cells also escape elimination of the observation and the subsequent evaluation in this device as well. Again, only monolayers are used for investigation. Real-time analysis of cell observation is also not possible. The adjustment and adjustment of temperature and pH are not given. The cell layer can be incubated with the substances to be tested only from the apical side before starting the experiment. No dynamic perfusion is possible during the experiment.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die bekannten Methoden zur Simulation und Analyse von Bewegungs- und Anlagerungsvorgängen der Zellen und Partikeln an Zell- und Gewebeschichten, die dem lebenden Organismus nahe kommen, unzulänglich sind. Adhäsions- und Migrationsprozesse von Zellen unter Flussbedingungen sind, sofern überhaupt möglich, nur sehr eingeschränkt und mit fehlerbehafteter quantitativer Beurteilung möglich. Langzeituntersuchungen unter den zuvor genannten Bedingungen, die insbesondere für Analysen von Pharmaka und sonstigen Wirkstoffen wichtig sind, bleiben einer solchen Auswertung weitgehend verschlossen bzw. zeigen wenig Relevanz auf die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den lebenden Organismus, so dass trotz aller Simulationsmethoden Tierversuche bei aller ethischer Problematik noch immer eine wichtige Bedeutung, insbesondere für die Biologie, Medizin und Pharmaforschung aufweisen. Die Nachteile der Tierversuche bestehen insbesondere darin, dass die Tiere während oder am Ende der Versuche getötet werden und dass eine reproduzierbare lokale Wirkung von Pathogenen, Pharmaka und anderen Wirkstoffen auf Krankheitsverläufe an definierten Stellen des Körpers selbst bei der Verwendung von Inzuchtstämmen, aufgrund der individuellen Unterschiede der einzelnen verwendeten Tiere, nur sehr schwer reproduzierbar sind. Dies führt zu der Notwendigkeit der Durchführung von einer Vielzahl von Einzelexperimenten, um diesen Nachteil unter Nutzung statistischer Hilfsmittel auszugleichen. Doch selbst die Einzelbeobachtung von fließenden und sich anlagernden Zellen in standardisierbaren Untersuchungsvorrichtungen, wie sie derzeit bekannt ist, bereitet aufgrund der auf eine Ebene determinierten visuellen Beobachtbarkeit und der hohen Dynamik der Zellbewegung größte Schwierigkeiten, so dass die Auswertung im Wesentlichen auf die Erfassung statistischer Größen hinausläuft. In summary, the known methods for the simulation and analysis of movement and attachment processes of the cells and particles to cell and tissue layers, which are close to the living organism, are inadequate. Adhesion and migration processes of cells under flow conditions are, if at all possible, only very limited and possible with erroneous quantitative assessment. Long-term studies under the aforementioned conditions, which are particularly important for analyzes of pharmaceuticals and other active substances, remain largely closed to such an evaluation or show little relevance to the transferability of the results to the living organism, so that in spite of all simulation methods animal experiments for all ethical problems still have an important importance, especially for biology, medicine and drug research. The disadvantages of the animal experiments are, in particular, that the animals are killed during or at the end of the experiments and that a reproducible local effect of pathogens, drugs and other agents on disease patterns at defined points of the body even when using inbred strains, due to the individual Differences of the individual animals used, are very difficult to reproduce. This leads to the necessity of carrying out a large number of individual experiments in order to compensate for this disadvantage by using statistical aids. However, even the individual observation of flowing and accumulating cells in standardisable examination devices, as currently known, causes great difficulties due to the one-level visual observability and the high dynamics of the cell movement, so that the evaluation essentially amounts to the acquisition of statistical quantities ,
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge von Zellen und Partikeln bei der Simulation von Flussbedingungen genauer und vollständig zu erfassen. The invention is therefore based on the task of more accurately and completely detecting the movement and attachment processes of cells and particles in the simulation of flow conditions.
Einerseits sollen die Bewegungs- und Anlagerungsvorgänge unter Bedingungen simuliert und ausgewertet werden können, die dem Druck- und Strömungsverhalten im nachzubildenden Organismus bzw. körpereigenen Gefäß auch für Langzeituntersuchungen wesentlich näher kommen. Andererseits soll dabei ebenfalls das Adhäsions- und Migrationsverhalten der Zellen und Partikel möglichst vollständig und mit hoher Auswertegenauigkeit erfasst werden können. On the one hand, the movement and attachment processes should be able to be simulated and evaluated under conditions that are much closer to the pressure and flow behavior in the organism to be replanted or the body's own vessel, even for long-term investigations. On the other hand, the adhesion and migration behavior of the cells and particles should also be able to be detected as completely as possible and with high evaluation accuracy.
Mit der Erfindung wird die Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel, einschließlich deren Migration durch die Zell-, Gewebe- undWith the invention, the movement and attachment of the cells and particles, including their migration through the cell, tissue and
Implantatschicht, in der gesamten zumindest einen Interaktionszone (und nicht nur durch Blick von oben) optisch erfasst und ausgewertet. DieImplant layer, optically recorded and evaluated in the entire at least one interaction zone (and not only by view from above). The
Erfassung erfolgt vorzugsweise durch mehrereDetection is preferably carried out by several
Beobachtungsstrahlengänge, beispielsweise durch zwei Stereomikroskopie-Systeme, räumlich visuell, so dass dieObservation beam paths, for example, by two stereomicroscopy systems, spatially visually, so that the
Interaktionszone in einem Bereich nicht nur oberhalb, sondern auch innerhalb und ggf. unterhalb derselben visuell räumlich aufgelöst und vollständig überwacht wird. Mit dieser Überwachung kann auch gleichzeitig eine spektroskopische Erfassung der Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel, einschließlich der Interaktionszone mit ihren Zell-, Gewebe- und Implantatschichten selbst, verbunden sein, indem an wenigstens einen der besagten Beobachtungsstrahlengänge eine Spektroskopieeinheit gekoppelt ist. Interaction zone in an area not only above, but also within and possibly below the same visually spatially resolved and fully monitored. This monitoring may also be accompanied by spectroscopic detection of the movement and attachment of the cells and particles, including the zone of interaction with their cell, tissue and implant layers themselves, in that a spectroscopy unit is coupled to at least one of said observation beam paths.
Durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht dieser zumindest einen Interaktionszone transmigrierende Zellen und Partikel, welche auf diese Weise optisch verfolgt und dabei gegebenenfalls spektrometrisch analysiert werden können, werden in wenigstens einer Perfusionskammer unterhalb der Interaktionszone aufgefangen und sind somit einer weiteren Auswertung zufuhrbar. Insbesondere für Langzeituntersuchungen werden die Flussbedingungen des Flussmediums für das Durchströmen der Interaktionszone, beispielsweise durch Einstellung des pH- Wertes, der Temperatur, der Sauerstoffsättigung und der NährstoffVersorgung für die Zellen und Partikel, speziell eingestellt, beispielsweise durch eine dosierbare Regelung.  Cells and particles transmigrating through the cell, tissue and implant layer of this at least one interaction zone, which can be optically traced and possibly analyzed spectrometrically, are collected in at least one perfusion chamber below the interaction zone and can thus be fed to a further evaluation. In particular, for long-term studies, the flow conditions of the flow medium for the flow through the interaction zone, for example by adjusting the pH, temperature, oxygen saturation and nutrient supply for the cells and particles, specially adjusted, for example by a metered control.
Mit der hier beschriebenen Erfindung wird die Möglichkeit geschaffen, Bewegungs-, Adhäsions- und Transmigrationsprozesse von Zellen unter Flussbedingungen, wie sie z. B. in Blut- und Lymphgefäßen eines lebenden Organismus vorliegen, nahezu naturgetreu nachzubilden, diese Vorgänge räumlich als auch zeitlich aufzulösen und gewünschte Zielzellen nach der Untersuchung vital zu isolieren und somit diese Zellen/Partikel für anschließende Untersuchungen nutzbar zu machen. Weiterhin können Zellen/Partikel unter naturnahen Bedingungen kontakt- und markierungsfrei spektrometrisch analysiert werden. Die Erfindung integriert Komponenten der Zell- und Gewebekultur und der optischen Bildaufhahme- und -Verarbeitung und ist daher vielseitig einsetzbar. With the invention described herein, the possibility is created, movement, adhesion and Transmigrationsprozesse of cells under flow conditions, as z. B. present in blood and lymph vessels of a living organism, to replicate almost lifelike, these processes spatially and temporally dissolve and isolate desired target cells vital after the study and thus to make these cells / particles for subsequent studies available. Furthermore, cells / particles under near-natural conditions can be analyzed spectrometrically without contact and label. The invention integrates components of cell and tissue culture and optical image acquisition and processing and is therefore versatile.
Untersuchungen an Zellen des Blutes und der Blutgefäße werden häufig unter statischen Bedingungen durchgeführt. Dies entspricht jedoch nicht der Situation in einem lebenden Organismus, in dem diese Zellen verschiedenen Flussbedingungen ausgesetzt sind. Die Zellen adaptieren sich an den Fluss und weisen unter fließenden Bedingungen abweichende zellphysiologische Eigenschaften gegenüber statischen Bedingungen auf. Untersuchungen von an den Fluss adaptierten Zellen geben somit genauere Auskunft über das Verhalten und die Eigenschaften von Zellen in und am Blutgefäß in vivo. Die Erfindung erlaubt Untersuchungen dieser Art unter verschiedenen Typen von Strömungsbedingungen (turbulent, laminar, pulsierend) und erlaubt darüber hinaus die Regulation wichtiger physiologischer Parameter wie hydrostatischer Druck, Flussgeschwindigkeiten, Zell/Partikel- konzentration im Flussmedium, pH- Wert und Sauerstoffsättigung. Es ist möglich, ganze Gewebeschichten entweder in der Zellkultur vorzuzüchten und in die Erfindung zu integrieren oder das Zusammenwachsen des Gewebes schon unter Flussbedingungen im System durchzuführen. Dazu gestattet die Erfindung eine individuelle Anpassung von physiologischen bzw. auch pathologischen Flussbedingungen für die zu untersuchenden Zellen über gewünschte Zeiträume. So erlaubt dieses System zum einen, die frei regelbare Zugabe verschiedener Substanzen nicht nur von der apikalen sondern auch von der basolateralen Seite der Zell-/Gewebe- bzw. Implantatschicht. Dies ist von Bedeutung, da z. B. subzellulär gelegene bioaktive Stoffe, wie beispielsweise modifizierte LDL, einen starken Einfluss auf die Interaktion von Leukozyten mit dem gesamten Gewebeverband haben. Zudem ist mit dieser Erfindung die Untersuchung der Effekte verschiedener Pharmaka, biologisch wirksamer Moleküle, chemischer Noxen und mikrobiologischer Organismen, wie Bakterien, Parasiten und Pilzen, nicht nur auf die Interaktion von Zellen im Flussmedium mit den apikal gelegenen Zellen der Gefaßwand beschränkt, sondern erlaubt ebenso eine Untersuchung der die Gefäßwand transmigrierenden und/oder im Gewebe differenzierenden Zellen. Mittels der in der Erfindung integrierten Perfusionskammern und den darin enthaltenen Zellfallen, ist es möglich, vollständig migrierte Zellen vital aufzufangen und anschließenden analytischen und/oder funktionellen Untersuchungen zugänglich zu machen. Weiterhin verfugt die Erfindung über eine frei regelbare Kontrolle der Umweltparameter pH- Wert, Temperatur, Sauerstoffmenge und Nährstoffzugabe, womit physiologische Bedingungen eingestellt werden können bzw. durch die einstellbaren Umweltparameter bedingte pathologische Ereignisse, wie Alkalose, Azidose, Nährstoffrestriktion, Hypoxie standardisiert und nah an der in vivo-Situation analysiert werden können. Krankheiten, wie Krebs und Sepsis, deren Ausbreitung durch den Blutfluss erfolgen, können mit dieser Erfindung sehr viel genauer, gründlicher und umfassender als mit bisherigen in vitro Methoden untersucht werden. Durch die Erfindung ist es möglich, die Metastasierung von Tumorzellen kosteneffizient, standardisiert und ohne Einsatz von Tiermodellen nachzustellen. Hierbei können physiologische Bedingungen simuliert werden, um ein umfassendes Bild über die Ausbreitung von Tumorzellen in vivo zu erhalten. Es ist möglich durch den Einsatz verschiedener Gewebeverbände, verschiedene Gewebebereiche des Körpers nachzuahmen und somit die Metastasierung von bestimmten Tumoren in definierten Geweben zu simulieren. Zudem ist es möglich, die Untersuchungen über lange Zeiträume durchzuführen und mit ein- oder mehrmaligem Mediumumlauf innerhalb des Systems zu arbeiten. Hierdurch wird die Möglichkeit geschaffen langfristig ablaufende pathophysiologische Vorgänge, wie beispielweise das Entstehen atherosklerotischer Läsionen, in Echtzeit zu erfassen. Ferner ist es möglich die Wirkung von pharmakologisch wirksamen Substanzen, Partikel oder Zellen beim Ablauf pathophysiologischer Vorgänge in Echtzeit zu dokumentieren. Hierdurch können Untersuchungen zur Entwicklung von Interventionstherapien effektiver ausgestaltet werden, da Wirkstoffkonzentrationen dynamisch verändert werden können und die Auswirkung auf pathophysiologische Vorgänge direkt beobachtet werden können. Diese Möglichkeiten eröffnen beispielsweise bei der Untersuchung von atherosklerotischen Läsionen, damit verbundenen inflammatorischen Reaktionen und der Wirkung pharmakologisch wirksamer Substanzen neue Möglichkeiten, da Zellen humanen Ursprungs eingesetzt werden können und auf die Nutzung von Tiermodellen verzichtet werden kann. Hierdurch können für die Krankheitsentstehung beim Menschen relevante Vorgänge besser untersucht werden. Die Vorzüge der Erfindung kommen in ähnlicher Weise auch bei der Untersuchung anderer krankheitsrelevanter Vorgänge (z. B. bei Sepsis, Krebs, Autoimmunkrankheiten usw.) am und im Gewebe zu tragen. Zu den Vorteilen der Erfindung zählt weiterhin die Möglichkeit, die Adhäsion und Transmigration von Zellen sowohl aufsichtig als auch seitlich auf und im Gewebe zu erfassen. Um dies zu erreichen, kommen Stereomikroskope zum Einsatz, die in der Lage sind, auch Fluoreszenzsignale zu detektieren. Durch den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die im langwelligen Infrarotbereich emittieren, ist es möglich, Zellbewegungen auch innerhalb von Geweben zu erfassen. Durch das Einbringen von horizontalen transparenten Zwischenschichten in zu untersuchende Gewebe ist es weiterhin möglich, auch Zellbewegungen im Graufeld mittels Phasenkontrast zu erfassen. Die Erfindung soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Kammerkörpers als Ausfuhrungsbeispiel in unterschiedlichen Ansichten näher erläutert werden. Examinations of cells of the blood and blood vessels are often performed under static conditions. However, this does not correspond to the situation in a living organism in which these cells are exposed to different flow conditions. The cells adapt to the flow and, under flowing conditions, have different cell physiological properties compared to static conditions. Investigation of flow-adapted cells thus provides more accurate information on the behavior and properties of cells in and on the blood vessel in vivo. The invention allows investigations of this type under various types of flow conditions (turbulent, laminar, pulsatile) and also allows the regulation of important physiological parameters such as hydrostatic pressure, flow velocities, cell / particle concentration in the flow medium, pH and oxygen saturation. It is possible either to pre-culture whole tissue layers in the cell culture and to integrate them into the invention or to carry out the growing together of the tissue under flow conditions in the system. For this purpose, the invention allows an individual adaptation of physiological or even pathological flow conditions for the cells to be examined over desired periods of time. On the one hand, this system allows the freely controllable addition of various substances not only from the apical but also from the basolateral side of the cell / tissue or implant layer. This is important because z. B. subcellular bioactive substances, such as modified LDL, have a strong influence on the interaction of leukocytes with the entire tissue association. In addition, with this invention, the study of the effects of various drugs, biologically active molecules, chemical noxae and microbiological organisms, such as bacteria, parasites and fungi, is not limited only to the interaction of cells in the flow medium with the apical cells of the vascular wall, but also allowed an investigation of the vascular wall transmigrating and / or tissue differentiating cells. By means of the perfusion chambers integrated in the invention and the cell traps contained therein, it is possible to absorb completely migrated cells vigorously and to make subsequent analytical and / or functional examinations accessible. Furthermore, the invention has a freely controllable control of the environmental parameters pH value, temperature, amount of oxygen and nutrient addition, which physiological conditions can be adjusted or by the adjustable environmental parameters related pathological events, such as alkalosis, acidosis, nutrient restriction, hypoxia standardized and close to the in vivo situation can be analyzed. Diseases such as cancer and sepsis, whose spread through blood flow, can be studied much more accurately, thoroughly and comprehensively with this invention than with previous in vitro methods. The invention makes it possible to replicate the metastasis of tumor cells in a cost-efficient, standardized manner and without the use of animal models. Here, physiological conditions can be simulated to obtain a comprehensive picture of the spread of tumor cells in vivo. Through the use of different tissue associations, it is possible to imitate different tissue areas of the body and thus to simulate the metastasis of certain tumors in defined tissues. In addition, it is possible to carry out the investigations over long periods of time and to work with single or multiple medium circulation within the system. This creates the opportunity to record long-term pathophysiological processes, such as the emergence of atherosclerotic lesions, in real time. Furthermore, it is possible to document the effect of pharmacologically active substances, particles or cells in the course of pathophysiological processes in real time. As a result, studies on the development of interventional therapies can be designed more effectively, as drug concentrations can be changed dynamically and the impact on pathophysiological processes can be directly observed. These possibilities, for example, open up new possibilities in the investigation of atherosclerotic lesions, associated inflammatory reactions and the action of pharmacologically active substances, since cells of human origin can be used and the use of animal models can be dispensed with. As a result, processes relevant to the pathogenesis in humans can be better investigated. Similarly, the benefits of the invention also apply to the study of other disease-related events (eg, sepsis, cancer, autoimmune diseases, etc.) on and in the tissue. Another advantage of the invention is the ability to detect the adhesion and transmigration of cells both in the eye and on the side and in the tissue. To this, too reach stereomicroscopes are used, which are able to detect fluorescence signals. Through the use of fluorescent dyes that emit in the long-wave infrared range, it is possible to detect cell movements also within tissues. By introducing horizontal transparent intermediate layers into tissue to be examined, it is also possible to detect cell movements in the gray field by means of phase contrast. The invention will be explained below with reference to a chamber body shown in the drawing as an exemplary embodiment in different views.
Es zeigen: Show it:
Fig. 1 : Kammerkörper mit drei unterhalb der Interaktionszone  Fig. 1: chamber body with three below the interaction zone
angeordneten Perfusionskammern in geschnittener  arranged perfusion chambers in cut
schematischer Seitenansicht  schematic side view
Fig. 2: frontale Ansicht des Kammerkörpers mit angedeutetem aufsichtigem Objektiv- und Tubussystem  Fig. 2: frontal view of the chamber body with indicated supervisory Lens and Tubussystem
Fig. 3: seitliche Ansicht des Kammerkörpers in der Längsachse mit angedeuteten aufsichtigen und seitlichen Objektiv- und Fig. 3: lateral view of the chamber body in the longitudinal axis with indicated supervisory and lateral objective and
Tubussystemen inklusive Fluoreszenzeinheit Tube systems including fluorescence unit
Fig. 4: seitliche Ansicht des Kammerkörpers in der Längsachse mit angedeuteten aufsichtigen Objektiv- und Tubussystemen und seitliche angeordnetem Ramanmikroskop und Laser Fig. 5: schematische Darstellung der Flüssigkeitsumläufe  4 shows a lateral view of the chamber body in the longitudinal axis with indicated objective lens and tube systems and lateral Raman microscope and laser. FIG. 5: schematic representation of the liquid circulations
Fig. 1 zeigt einen Kammerkörper 1 mit drei Interaktionszonen 2, 3, 4, bestehend jeweils aus einer dem menschlichen Körper nachgebildeten Zell-, Gewebe- und Implantatschicht. Der Kammerkörper 1 weist einen Zufluss 5 auf, über welchen ein Flussmedium 6 mit den zu untersuchenden Zellen und Partikel (angedeutet durch Pfeildarstellung) in den Kammerkörper 1 eingeleitet wird, so dass die Zellen und Partikel des einströmenden Flussmediums 6 nacheinander die Interaktionszonen 2, 3, 4, unter welchen drei Perfusionskammern 7, 8, 9 angeordnet sind, durchströmen und mit der jeweiligen Zell-, Gewebe- und Implantatschicht in Kontakt treten. Nach Durchströmen des Kammerkörpers 1 mit den Interaktionszonen 2, 3, 4 tritt das Flussmedium über einen Abfluss 10 wieder aus. Der Kammerkörper wird über ein integriertes Heiz-/Kühlwasserkanalsystem 11 temperiert. Fig. 1 shows a chamber body 1 with three interaction zones 2, 3, 4, each consisting of a human body replicated cell, tissue and implant layer. The chamber body 1 has an inflow 5, via which a flow medium 6 with the cells to be examined and particles (indicated by arrow) is introduced into the chamber body 1, so that the cells and particles of the inflowing flow medium 6 successively the interaction zones 2, 3, 4, under which three perfusion chambers 7, 8, 9 arranged are, flow through and come into contact with the respective cell, tissue and implant layer. After flowing through the chamber body 1 with the interaction zones 2, 3, 4, the flow medium exits via a drain 10 again. The chamber body is heated by an integrated heating / cooling water channel system 11.
Die Interaktion der Zellen und Partikel des Flussmediums mit den Interaktionszonen 2, 3, 4 kann durch ein seitlich bzw. aufsichtig angeordnetes Mikroskopsystem 12 beobachtet werden (vgl. Fig. 2). Als Mikroskopsystem 12 können in an sich bekannter Weise sowohl Stereomikroskopsysteme als auch konfokale Laserscanning Mikroskope oder andere Mikroskop- und Spektroskopiesysteme zum Einsatz kommen. Die Beobachtung der Interaktionszonen 2, 3, 4 durch das Mikroskopsystem 12 erfolgt durch im Kammerkörper 1 vorgesehenen und den Interaktionszonen 2, 3, 4 zugeordnete austauschbare Glas- oder Quarzeinsätze 13, 14, 15. Zur vollständigen Beobachtung der Gesamtheit aller Interaktionszonen 2, 3, 4 ist das Mikroskopsystem 12 über (aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellte Mittel, beispielsweise an sich bekannte schienenartige Führungselemente zur transversalen Positionsveränderung und ebenfalls an sich bekannte Schwenk- bzw. Rotationselemente zur Veränderung der Winkellage, über die Seite des Kammerkörpers 1 mit den Glas- oder Quarzeinsätzen 13, 14, 15 verfahrbar. Durch das Mikroskopsystem 12 kann die Adhäsion, Migration und Differenzierung der Zellen und Partikel des Flussmediums sowie der Zell-, Gewebe- und Implantatschichten der Interaktionszonen 2, 3, 4 in Echtzeit beobachtet und ausgewertet werden. The interaction of the cells and particles of the flow medium with the interaction zones 2, 3, 4 can be observed by a microscope system 12 arranged laterally or on the side (see Fig. 2). As a microscope system 12, both stereomicroscope systems and confocal laser scanning microscopes or other microscope and spectroscopy systems can be used in a conventional manner. The observation of the interaction zones 2, 3, 4 by the microscope system 12 is effected by interchangeable glass or quartz inserts 13, 14, 15 provided in the chamber body 1 and assigned to the interaction zones 2, 3, 4. For complete observation of the entirety of all interaction zones 2, 3, 4 is the microscope system 12 (means not shown in the drawing for reasons of clarity, for example rail-like guide elements known per se for transversal position change and also pivoting or rotation elements known per se for changing the angular position, via the side of the chamber body 1 with the glass body). or quartz inserts 13, 14, 15. The microscope system 12 can monitor and evaluate the adhesion, migration and differentiation of the cells and particles of the flow medium and the cell, tissue and implant layers of the interaction zones 2, 3, 4 in real time.
In Fig. 3 sind zwei Mikroskopsysteme 12 dargestellt, welche die Interaktionszonen 2, 3, 4 des Kammerkörpers 1 sowohl aufsichtig und als auch seitlich (Beobachtungsstrahlengang 36) beobachten. Die beiden aus Übersichtsgründen getrennt dargestellten Mikroskopsysteme 12 können beispielsweise durch separate und vorzugsweise in rechtwinkliger Lage zueinander angeordnete Mikroskopsysteme oder auch durch ein einziges Mikroskopsystem mit entsprechenden Beobachtungsstrahlengängen (mit aufsichtigem Strahlengang 37 und seitlichem Strahlengang 36 an den Kammerkörpers 1 angreifend) realisiert werden. FIG. 3 shows two microscope systems 12 which observe the interaction zones 2, 3, 4 of the chamber body 1, both in the direction of supervision and as well as laterally (observation beam path 36). The two microscope systems 12 shown separately for reasons of clarity, for example, by separate and preferably in a right angle to each other arranged microscope systems or by a single microscope system with corresponding observation beam paths (with supervisory beam path 37 and lateral beam path 36 to the chamber body 1 attacking) realized.
Zur Auswertung und Dokumentation der durch die getrennt dargestellten Mikroskopsysteme 12 detektierten Signale, sind die beiden Mikroskopsysteme 12 jeweils über einen Kameraport 16 bzw. 17 mit einem Computersystem 18 gekoppelt (vgl. Fig. 3).  For evaluation and documentation of the signals detected by the microscope systems 12 shown separately, the two microscope systems 12 are each coupled via a camera port 16 or 17 to a computer system 18 (see FIG.
Für die Detektion von Fluoreszenzsignalen an Zellen und Partikeln des Flussmediums und/oder an den besagten Zell-, Gewebe- und Implantatschichten der Interaktionszonen 2, 3, 4 und/oder der Perfusionskammern 7, 8, 9 werden diese Bereiche durch eine geeignete und Fluoreszenzfarbstoffe anregende Lichtquelle 19 bestrahlt. For the detection of fluorescence signals on cells and particles of the flow medium and / or on the said cell, tissue and implant layers of the interaction zones 2, 3, 4 and / or the perfusion chambers 7, 8, 9, these areas are stimulated by a suitable and fluorescent dyes Light source 19 irradiated.
Zur Detektion von metabolischen Vorgängen an Zellen und Partikeln des Flussmediums und/oder an den besagten Zell-, Gewebe- und Implantatschichten der Interaktionszonen 2, 3, 4 und/oder der Perfusionskammern 7, 8, 9 können ferner Spektroskopiemessungen durchgeführt werden. Hierfür erfolgt die optische Anregung durch einen Laser 20 (vgl. Fig. 4). For the detection of metabolic processes on cells and particles of the flow medium and / or on the said cell, tissue and implant layers of the interaction zones 2, 3, 4 and / or the perfusion chambers 7, 8, 9, spectroscopy measurements can also be carried out. For this purpose, the optical excitation by a laser 20 (see Fig .. 4).
Die Messung der Spektren erfolgt durch einen Detektor 21, der beispielsweise in Form eines an sich bekannten Ramanmikroskops in das System integriert werden kann. Der Detektor 21 ist zur Signaldigitalisierung an ein Wandlersystem 22 gekoppelt, der ebenfalls mit dem Computersystem 18 zur Datenauswertung in Verbindung steht. Zum Einbringen von Zellen oder Partikeln in das Flussmedium dient ein Zellreservoir 23, das an ein beheiz-/ kühlbares Mediumreservoir 24 gekoppelt ist (vgl. schematische Darstellung Fig. 5). Eine Steuerung von pH- Wert und pO2-Wert kann durch Begasungsanlagen erfolgen, die im Mediumreservoir 24 oder auch im Zellreservoir 23 integriert sein können (aus Übersichtsgründen nicht explizit in der Zeichnung dargestellt). Eine Zugabe von Substanzen in das Flussmedium kann durch ein Substanzapplikationsventil 25 erfolgen. Das Zellreservoir 23, das Mediumreservoir 24 und das Substanzapplikationsventil 25 sind in einen Mediumkreislauf 26 eingebunden. Fig. 5 zeigt diesen Mediumkreis- lauf 26, in welchem auch eine Sensorkammer 27 mit Sensorelementen zur Erfassung der Zellkulturparameter, wie pH- Werte, Temperatur und NährstoffVersorgung, für die im Flussmedium 5 vorhandenen Zellen und Partikel angeordnet ist. Auf diese Weise werden die besagten Zellkulturparameter im Mediumkreislauf 26 kontrolliert und können beispielsweise, wie vorgenannt, über die erwähnten Begasungsanlagen des Mediumreservoirs 24 oder des Zellreservoir 23 anwendungsspezifisch gesteuert werden. The measurement of the spectra is carried out by a detector 21, which can be integrated into the system, for example in the form of a known Raman microscope. The detector 21 is coupled to a transducer system 22 for signal digitization, which is also in communication with the computer system 18 for data evaluation. For introducing cells or particles into the flow medium, a cell reservoir 23 is used, which is coupled to a heatable / coolable medium reservoir 24 (see schematic illustration FIG. A control of pH value and pO 2 value can be effected by gassing systems which may be integrated in the medium reservoir 24 or also in the cell reservoir 23 (not shown explicitly in the drawing for reasons of clarity). An addition of substances into the flow medium can take place through a substance application valve 25. The cell reservoir 23, the medium reservoir 24 and the substance application valve 25 are integrated into a medium circuit 26. FIG. 5 shows this medium circuit 26, in which also a sensor chamber 27 with sensor elements for detecting the cell culture parameters, such as pH values, temperature and Nutrient supply, is arranged for the existing in the flow medium 5 cells and particles. In this way, the said cell culture parameters are controlled in the medium circuit 26 and, for example, as mentioned above, can be controlled in an application-specific manner via the abovementioned fumigation systems of the medium reservoir 24 or of the cell reservoir 23.
Die Temperierung des Kammerkörpers 1 erfolgt über einen Heizungs- /Kühlungskreislauf28. An welchen ein temperierbares Heizwasserreservoir 29 angeschlossen ist, das den Heizungs- /Kühlungskreislauf 28 speist.  The temperature of the chamber body 1 via a heating / Kühlungskreislauf28. To which a temperature-controlled Heizwasserreservoir 29 is connected, which feeds the heating / cooling circuit 28.
Unterhalb des Kammerkörpers 1 sind an demselben (entsprechend den drei besagten Interaktionszonen) drei Perfusionskammern 30, 31, 32 angeordnet (vgl. auch Perfusionskammern 7, 8, 9 in Fig. 1) angebracht, an die jeweils ein Vorratsbehälter 33, 34, 35 für zusätzlich in den Mediumkreislauf 26 einzubringende Testubstanzen und sonstige Applikationen angeschlossen ist. Below the chamber body 1, three perfusion chambers 30, 31, 32 are arranged (see also perfusion chambers 7, 8, 9 in Fig. 1) are attached to the same (corresponding to the three said interaction zones), to each of which a reservoir 33, 34, 35 for additionally introduced into the medium circuit 26 test substances and other applications is connected.
Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen List of used reference numbers
1 Kammerkörper 1 chamber body
2, 3, 4 Interaktionszone  2, 3, 4 interaction zone
5 Zufluss  5 inflow
6 einströmendes Flussmedium  6 incoming flow medium
7, 8, 9 Perfusionskammer  7, 8, 9 perfusion chamber
10 Abfluss  10 outflow
11 Heiz-/Kühlwasserkanalsystem  11 heating / cooling water duct system
12 Mikroskopsystem  12 microscope system
13, 14, 15 - Glas- oder Quarzeinsatz im Kammerkörper 1 13, 14, 15 - Glass or quartz insert in the chamber body 1
16, 17 Kameraport 16, 17 camera port
18 Computersystem  18 computer system
19 Lichtquelle  19 light source
20 Laser  20 lasers
21 Detektor  21 detector
22 Wandlersystem  22 converter system
23 Zellreservoir  23 cell reservoir
24 Mediumreservoir  24 medium reservoir
25 Substanzapplikationsventil  25 substance application valve
26 Mediumkreislauf  26 medium circuit
27 Sensorkammer  27 sensor chamber
28 Heizungs-/Kühlungskreislauf  28 heating / cooling circuit
29 Heizwasserreservoir  29 heating water reservoir
30, 31, 32 - Perfusionskammer  30, 31, 32 - perfusion chamber
33, 34, 35 - Vorratsbehälter  33, 34, 35 - Reservoir
36, 37 Beobachtungsstrahlengang  36, 37 observation beam path

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Erfassung der Bewegung und Anlagerung von Zellen und Partikeln an Zell-, Gewebe- und Implantatschichten bei der Simulation von Flussbedingungen, bei dem die Zellen und Partikel in einem Flussmedium durch zumindest eine Interaktionszone imA method for detecting the movement and attachment of cells and particles to cell, tissue and implant layers in the simulation of flow conditions, wherein the cells and particles in a flow medium through at least one interaction zone in the flow medium
Bereich der ggf. durch Trägermaterialien stabilisierten Zell-, Gewebe- und Implantatschicht geleitet werden sowie die Bewegungs- und Anlagerungsprozesse in laminaren, turbulenten und pulsierenden Strömungen visuell durch Aufsicht auf die zumindest eine Interaktionszone erfasst werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel, einschließlich deren Migration durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht, in der gesamten zumindest einen Interaktionszone optisch erfasst und ausgewertet werden, dass durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht transmigrierendeArea of possibly stabilized by support materials cell, tissue and implant layer are passed and the movement and attachment processes in laminar, turbulent and pulsating flows are visually detected by supervision of the at least one interaction zone, characterized in that the movement and attachment of the cells and particles, including their migration through the cell, tissue and implant layer, are optically detected and evaluated throughout the at least one interaction zone that transmigrate through the cell, tissue and implant layer
Zellen und Partikel in wenigstens einer Perfusionskammer vorzugsweise unterhalb der zumindest einen Interaktionszone aufgefangen werden und dass die Flussbedingungen des Flussmediums außerhalb und innerhalb der zumindest einen Interaktionszone, insbesondere für Langzeituntersuchungen, durchCells and particles are collected in at least one perfusion chamber preferably below the at least one interaction zone and that the flow conditions of the flow medium outside and within the at least one interaction zone, in particular for long-term studies, by
Einstellung der Zellkulturparameter, wie pH- Werte, Temperatur und NährstoffVersorgung für die Zellen und Partikel, gesteuert werden. Adjustment of cell culture parameters, such as pH, temperature and nutrient supply to the cells and particles, are controlled.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel in getrennten und von mehreren Seiten auf den Bereich der zumindest einen Interaktionszone gerichteten Beobachtungsstrahlengängen erfasst wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that the movement and attachment of the cells and particles is detected in separate and directed from several sides to the region of the at least one interaction zone observation beam paths.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Erfassung der Bewegung und Anlagerung der Zellen und Partikel durch wenigstens einen Beobachtungsstrahlengang erfolgt. 3. The method according to claim 1, characterized in that the optical detection of the movement and attachment of the cells and particles is carried out by at least one observation beam path.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussbedingungen sowie die Umweltbedingungen, wie Einstellung des pH-Wertes, Sauerstoffsättigung, der Temperatur und der Nährstoffversorgung für die Zellen und Partikel, einstellbar geregelt werden. 4. The method according to claim 1, characterized in that the flow conditions and the environmental conditions, such as adjustment of the pH, oxygen saturation, the temperature and the nutrient supply for the cells and particles, are controlled adjustable.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem die zumindest eine Interaktionszone durchströmenden Flussmedium Wirksubstanzen und/oder biologisch wirksame Partikel, insbesondere mikrobiologischen Ursprungs, wie Bakterien, Sporen,5. The method according to claim 1, characterized in that the flow medium flowing through the at least one interaction zone active substances and / or biologically active particles, in particular of microbiological origin, such as bacteria, spores,
Pilze und Parasiten, in abgetöteter und/oder vitaler Form, und/oder biologisch nicht wirksame Partikel, wie Mikrobeads, zugegeben werden. Fungi and parasites, in killed and / or vital form, and / or non-biologically active particles, such as microbeads.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht transmigrierenden sowie in der wenigstens einen Perfusionskammer aufgefangenen Zellen und Partikel einer separaten zusätzlichen Analyse unterzogen werden. 6. The method according to claim 1, characterized in that the transmigrating through the cell, tissue and implant layer and in the at least one perfusion chamber trapped cells and particles are subjected to a separate additional analysis.
7. Vorrichtung zur Erfassung der Bewegung und Anlagerung von Zellen und Partikeln an Zell-, Gewebe- und Implantatschichten bei der Simulation von Flussbedingungen, bei dem die Zellen und Partikel in einem Flussmedium durch zumindest eine Interaktionszone im Bereich der ggf. durch Trägermaterialien stabilisierten Zell-, Gewebe- und Implantatschicht geleitet werden sowie die Bewegungs- und Anlagerungsprozesse in laminaren, turbulenten und pulsierenden Strömungen visuell durch Aufsicht auf die zumindest eine Interaktionszone erfasst werden, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikroskopieeinrichtung (12) mit mindestens einem Beobachtungsstrahlengang (36, 37) zur optischen Erfassung der Zellen und Partikel nicht nur oberhalb, sondern auch innerhalb und außerhalb, vorzugsweise unterhalb, der zumindest einen Interaktionszone (2, 3, 4), einschließlich der Erfassung der Migration der Zellen und Partikel durch deren Zell-, Gewebe- und Implantatschicht, vorgesehen ist, dass in und/oder an der Vorrichtung Sensor- und Steuerungselemente (28) angeordnet sind, durch die insbesondere für Langzeituntersuchungen die Zellkulturparameter zumindest eines Medienkreislaufs (26) der Vorrichtung, beispielsweise pH-Wert, Sauerstoffsättigung,7. A device for detecting the movement and attachment of cells and particles to cell, tissue and implant layers in the simulation of flow conditions, in which the cells and particles in a flow medium through at least one interaction zone in the region of the optionally stabilized by support materials cell , Tissue and implant layer are passed and the movement and attachment processes in laminar, turbulent and pulsating flows are visually detected by supervision of the at least one interaction zone, characterized in that a microscopy device (12) with at least one observation beam path (36, 37) for optical detection of the cells and particles not only above, but also inside and outside, preferably below, the at least one interaction zone (2, 3, 4), including detecting the migration of cells and particles through their cell, tissue and Implant layer, it is provided that sensor and control elements (28) are arranged in and / or on the device, through which the cell culture parameters of at least one medium circuit (26) of the device, for example pH value, oxygen saturation,
Temperatur und NährstoffVersorgung der Zellen und Partikel, gesteuert und einstellbar geregelt werden können, und dass vorzugsweise unterhalb der zumindest einenTemperature and nutrient supply of the cells and particles, controlled and adjustable can be regulated, and that preferably below the at least one
Interaktionszone (2, 3, 4) wenigstens eine Perfusions- kammer (7, 8, 9, 30, 31, 32) zur Einbringung von Testsubstanzen in die zumindest eine Interaktionszone (2, 3, 4) sowie zur Anreicherung von durch die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht transmigrierenden Zellen und Partikeln vorgesehen ist. Interaction zone (2, 3, 4) at least one perfusion chamber (7, 8, 9, 30, 31, 32) for introducing test substances into the at least one interaction zone (2, 3, 4) and for enrichment by the cell , Tissue and implant layer transmigrating cells and particles is provided.
8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroskopieeinrichtung (12) zusätzlich zu dem aufsichtig auf die zumindest eine Interaktionszone gerichteten Beobachtungsstrahlengang einen im Wesentlichen seitlich auf dieselbe Interaktionszone gerichteten Beobachtungsstrahlengang (36) aufweist. 8. The device according to claim 7, characterized in that the microscopy device (12) in addition to the directionally directed to the at least one interaction zone observation beam path has a substantially laterally directed to the same interaction zone observation beam path (36).
9. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur Mikroskopieeinrichtung (12) eine Spektroskopieeinheit (20, 21) zur Erfassung und Auswertung der Zellen und Partikel, einschließlich der Analyse der zumindest einen9. The device according to claim 7, characterized in that in addition to the microscopy device (12) has a spectroscopy unit (20, 21) for detecting and evaluating the cells and particles, including the analysis of at least one
Interaktionszone (2, 3, 4) selbst, vorgesehen ist. Interaction zone (2, 3, 4) itself, is provided.
10. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der wenigstens einen Perfusionskammer (7, 8, 9, 30, 31, 32) Mittel, beispielsweise Strömungskanäle, zum Erzeugen einer10. The device according to claim 7, characterized in that in the at least one perfusion chamber (7, 8, 9, 30, 31, 32) means, for example flow channels, for generating a
Medienverwirbelung vorgesehen sind, so dass sich transmigrierende Zellen und Partikel des Flussmediums (6) von der Unterseite der durchdrungenen Zell-, Gewebe- und Implantatschichten lösen und in der wenigstens einen Perfusionskammer (7, 8, 9, 30, 31, 32) aufgefangen werden. Are provided media Verwirbelung so that transmigrating cells and particles of the flow medium (6) from the underside of the penetrated cell, tissue and implant layers loose and in the at least one perfusion chamber (7, 8, 9, 30, 31, 32) are collected ,
11. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der wenigstens einen Perfusionskammer (7, 8, 9, 30, 31, 32) Mittel, beispielsweise ein oder mehrere Zellsiebe, zum Auffangen der transmigrierenden Zellen und Partikel vorgesehen sind. 11. The device according to claim 7, characterized in that in the at least one perfusion chamber (7, 8, 9, 30, 31, 32) means, for example one or more cell sieves, are provided for collecting the transmigrierenden cells and particles.
12. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht der zumindest einen Interaktionszone (2, 3, 4) durch eine oder mehrere für die Beobachtungsstrahlengänge optisch durchlässige Trägerschichten, beispielsweise bakterielle Nanocellulose, stabilisiert ist. 12. The device according to claim 7, characterized in that the cell, tissue and implant layer of the at least one interaction zone (2, 3, 4) by one or more optically transparent to the observation beam paths carrier layers, such as bacterial nanocellulose, stabilized.
13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zell-, Gewebe- und Implantatschicht der zumindest einen Interaktionszone (2, 3, 4) aus mehreren Einzelzellschichten besteht, die jeweils sandwichartig durch eine für die Beobachtungsstrahlengänge (36, 37) optisch durchlässige Trägerschicht, beispielsweise bakterielle Nanocellulose, getrennt sind. 13. The device according to claim 12, characterized in that the cell, tissue and implant layer of at least one interaction zone (2, 3, 4) consists of a plurality of individual cell layers, each sandwiched by a for the observation beam paths (36, 37) optically transparent Support layer, such as bacterial nanocellulose, are separated.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass insbesondere für langfristige Wirkstofftestungen14. The device according to claim 7, characterized in that in particular for long-term drug tests
Reservoirs (23, 24) für Zellen, Partikel und erforderliche Nährmedien vorgesehen sind. Reservoirs (23, 24) are provided for cells, particles and required culture media.
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen innerhalb des15. The device according to claim 7, characterized in that means for exciting fluorescent dyes within the
Kammerkörpers (1) vorgesehen sind, beispielsweise eine Lichtquelle, über welche Anregungslicht mittels Lichtleitkabel seitlich an den Kammerkörper (1) herangeführt ist. Chamber body (1) are provided, for example, a light source, via which excitation light by means of light guide cable laterally to the chamber body (1) is introduced.
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