DE102009038520B4 - Method and device for cell sample diagnostics - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Zellprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass a) wenigstens ein Ausschnitt der Zellprobe oder Zellkultur über einen vorgebbaren Messzeitraum videomikroskopisch erfasst wird, b) wenigstens eine Zelle (1) der Zellprobe oder Zellkultur im erfassten Videosignal über wenigstens einen Teil des Messzeitraums individualisiert wird, c) wenigstens eine Eigenschaft (21–23) der wenigstens einen individualisierten Zelle (1) mit ihrer zeitlichen Veränderung erfasst wird, wobei eine erfasste Eigenschaft (21–23) eine Zellform, ein Zellumfang, eine Zellfläche, eine Anzahl oder Größe von Zellausläufern, ein Verhältnis von Größen von Zellausläufern, eine Lokalisation des Zellkerns im Zellplasma, ein Größenverhältnis von Zellkern zu Plasma, ein Verhältnis von Zelloberfläche zu Zellausläufern, ein Bewegungsmuster mit einer Bewegungsrichtung und einer Bewegungsgeschwindigkeit oder eine Anzahl von Zellteilungen oder Zellverschmelzungen ist, d) die mit ihrer zeitlichen Veränderung erfasste Eigenschaft (21–23) der individualisierten Zelle (1) mit wenigstens einem Vergleichswert bezüglich der erfassten Eigenschaft (21–23) verglichen wird und...Method for cell sample diagnosis on a cell sample or cell culture, characterized in that a) at least a section of the cell sample or cell culture is recorded by video microscopy over a predeterminable measurement period, b) at least one cell (1) of the cell sample or cell culture in the recorded video signal over at least part of the Measurement period is individualized, c) at least one property (21-23) of the at least one individualized cell (1) is recorded with its change over time, with a recorded property (21-23) a cell shape, a cell circumference, a cell area, a number or Size of cell extensions, a ratio of sizes of cell extensions, a location of the cell nucleus in the cell plasma, a size ratio of cell nucleus to plasma, a ratio of cell surface to cell extensions, a movement pattern with a direction of movement and a movement speed or a number of cell divisions or cell fusions n is, d) the property (21-23) of the individualized cell (1) recorded with its change over time is compared with at least one comparison value with respect to the recorded property (21-23) and ...
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zellprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur sowie eine Vorrichtung zur Zellprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur.The invention relates to a method for cell sample diagnostics on a cell sample or cell culture and to a device for cell sample diagnostics on a cell sample or cell culture.
Die vorliegende Erfindung findet ihre Anwendung insbesondere bei der Untersuchung der Auswirkungen von neuen Medikamenten, potentiell toxischen Stoffen und anderen Substraten auf lebende Zellen, insbesondere menschliche oder tierische Zellen. Dies stellt ein Hauptaufgabengebiet der Verträglichkeitstestungen neuer Wirkstoffe dar. Solche Untersuchungen erfolgen zunächst an im Labor isolierten und gezüchteten Zellkulturen, an denen die Verträglichkeit solcher Substanzen getestet wird, bevor sie am Menschen oder am Tier selbst erfolgen. Entsprechende Untersuchungen, d. h. Verfahren zur Zellprobendiagnostik an Zellproben oder Zellkulturen, sind bekannt.The present invention finds particular application in the study of the effects of new drugs, potentially toxic and other substrates on living cells, particularly human or animal cells. This represents a major field of activity of the compatibility tests of new active ingredients. Such studies are first carried out on cell cultures isolated and cultivated in the laboratory, at which the compatibility of such substances is tested before they take place on humans or on the animals themselves. Corresponding investigations, d. H. Methods for cell sample diagnostics on cell samples or cell cultures are known.
Bei bekannten Verfahren zur Zellprobendiagnostik werden gezüchtete Zellen mit dem zu untersuchenden Stoff inkubiert und es wird beobachtet, welche Auswirkungen die Stoffe auf die Vitalität der Zellen haben. Untersucht wird dabei das Verhalten von Zellen nach Zugabe von Testreagenzien, die die Vitalität, die Stoffwechselleistungen oder einzelne Funktionen der Zellen insgesamt beurteilen lassen. Anstelle oder zusätzlich zu der Zugabe von zu untersuchenden Stoffen können auch beispielsweise physische oder physikalische Reize angewandt werden, wie beispielsweise die Anlegung elektromagnetischer Wechselfelder, eine Steuerung von Lichtintensität oder Temperatur und dergleichen, was jeweils entweder für die gesamte Zellprobe oder Zellkultur oder lokal begrenzt erfolgen kann.In known methods for cell sample diagnostics, cultured cells are incubated with the substance to be investigated and it is observed what effects the substances have on the vitality of the cells. The study investigates the behavior of cells after the addition of test reagents, which allow to assess the vitality, metabolic performance or individual functions of the cells as a whole. Instead of or in addition to the addition of substances to be examined, it is also possible, for example, to use physical or physical stimuli, such as the application of alternating electromagnetic fields, control of light intensity or temperature, and the like, either for the entire cell sample or cell culture or locally ,
In einer bekannten Klasse von Verfahren zur Zellprobendiagnostik werden durch Zugabe von Farbstoffen lebendige und tote Zellen voneinander differenziert. Diese Farbstoffe bzw. Änderungen von Farbtönen werden üblicherweise in der Zellsuspension insgesamt gemessen. Es können jedoch auch einzelne Zellen fluoreszenzoptisch oder mikroskopisch untersucht werden. Abgestorbene Zellen können auch ohne Farbzusätze in einigen Fällen lichtmikroskopisch erkannt werden.In a known class of methods for cell sample diagnostics, living and dead cells are differentiated by the addition of dyes. These colorants or changes in hues are usually measured in the cell suspension as a whole. However, individual cells can also be examined by fluorescence optics or microscopy. Dead cells can also be detected by light microscopy without color additives in some cases.
Die Messung von Stoffwechselleistungen von Zellen erfolgt in der Regel durch die Zugabe von Substraten, die durch die Zellen umgesetzt werden. Die Stoffwechselleistung wird in diesem Fall indirekt über das Ausmaß der Umsetzung der zugegebenen Substrate gemessen. Konzentrationsänderungen von Testsubstanzen in der gesamten Zellsuspension geben Aufschluss über die Aktivität der Zellen. Außerdem sind bei speziellen Fragestellungen Messungen von elektrischen Potentialen auf Zelloberflächen möglich, die indirekt Aufschluss über den Zustand der Zellen in der Kultur geben.Metabolic performance of cells is typically measured by the addition of substrates that are translated by the cells. Metabolic performance in this case is measured indirectly by the extent of reaction of the added substrates. Concentration changes of test substances in the whole cell suspension provide information about the activity of the cells. In addition, measurements of electrical potentials on cell surfaces are possible for specific questions that indirectly provide information about the state of the cells in the culture.
Mit Ausnahme der lichtmikroskopischen Diagnostik von toten Zellen beruhen alle messtechnisch bisher verwendeten Verfahren auf der Zugabe von Testsubstanzen oder der Einbringung von Testvorrichtungen in die Zellkultur, zusätzlich zur Einbringung der zu untersuchenden Wirkstoffe bzw. Schadstoffe. Diese Testsubstanzen, meistens Farbstoffe oder radioaktiv markierte Testsubstanzen, greifen selbst mit in die Testumgebung ein und sind oft selbst toxisch, so dass sie die ermittelten Testergebnisse in erheblichem Maße verändern können. Die Testergebnisse beruhen daher nicht alleine auf der Reaktion der Zellen auf die untersuchenden Wirk- bzw. Schadstoffe. Es ist oft nicht bekannt, inwieweit die Applikation der Untersuchungsreagenzien die eigentliche Interpretation der Ergebnisse verändert.With the exception of the light microscopic diagnosis of dead cells, all methods previously used in metrology are based on the addition of test substances or the introduction of test devices into the cell culture, in addition to the introduction of the active substances or pollutants to be investigated. These test substances, mostly dyes or radioactively labeled test substances, are themselves involved in the test environment and are often themselves toxic, so that they can considerably alter the test results determined. The test results are therefore not based solely on the reaction of the cells to the investigating active or pollutants. It is often unknown to what extent the application of the investigational reagents changes the actual interpretation of the results.
Weiterhin ist bei bekannten Verfahren meist nur ein einzelner Test mit einer Zellprobe gleichzeitig möglich. Langzeitbeobachtungen mit einer wiederholten Applikation von Testsubstanzen und Farbstoffen sind hingegen oft nicht möglich.Furthermore, in known methods usually only a single test with a cell sample is possible at the same time. However, long-term observations with repeated application of test substances and dyes are often not possible.
Mit bekannten Testverfahren, insbesondere bei der Messung von Farbumschlägen in der gesamten Zellkultur oder dem gelösten Überstand, ist die Ortsauflösung häufig nicht ausreichend, um Zellschädigungen im Einzelnen zu begutachten.With known test methods, in particular in the measurement of color changes in the entire cell culture or the dissolved supernatant, the spatial resolution is often not sufficient to assess cell damage in detail.
Viele Testverfahren beruhen auf der Messung der Freisetzung von intrazellulären Enzymen und Eiweißen. Diese Freisetzung erfolgt mit der Auflösung der Zellmembran, also zu einem sehr späten Zeitpunkt, wenn die Zelle bereits komplett abgestorben ist und die Integrität der Zellwand aufgehoben ist.Many test methods are based on measuring the release of intracellular enzymes and proteins. This release takes place with the dissolution of the cell membrane, ie at a very late time, when the cell is already completely dead and the integrity of the cell wall is abolished.
Bei der Verwendung von Zellkulturgemischen ist eine Zuordnung von bei Zelltod freigesetzten Substanzen zu den einzelnen Zellarten aufgrund der fehlenden Ortsauflösung dieser Tests nicht möglich. Dadurch bedingt sind lediglich Aussagen zur gesamten Zellkultur möglich.When cell culture mixtures are used, it is not possible to assign substances released in cell death to the individual cell types because of the lack of spatial resolution of these tests. As a result, only statements about the entire cell culture are possible.
Eine gewisse Differenzierung ist über färberische Verfahren zum Nachweis des Zelluntergangs prinzipiell auch mit einer entsprechenden Ortsauflösung unter dem Mikroskop möglich. Jedoch zeigen unterschiedliche Zellarten häufig auch ein unterschiedliches färberisches Verhalten, so dass eine sichere Interpretation der Ergebnisse nicht immer möglich ist.A certain differentiation is possible by dyeing methods for the detection of cell death in principle also with a corresponding spatial resolution under the microscope. However, different cell types often show a different color behavior, so that a secure interpretation of the results is not always possible.
In C. Bonneton et al., Cell Motility and the Cytoskeleton 43: 288–295 (1999) wird ein Experiment beschrieben, bei dem Tumorzellen mittels einer Zeitrafferaufnahme videomikroskopisch aufgenommen wurden. Die Analyse der Zellteilungen und der Migrationsgeschwindigkeit von Tumorzellen unter Stimulation in verschiedenen Phasen ihres Zellzyklus erfolgte von Hand, mittels eines Skizzenpapiers, auf das die Positionen der Tumorzellen zu verschiedenen Zeitpunkten aufgetragen wurden. Dabei wurde auch erfasst, in welcher Phase ihres Zellzyklus sich die Tumorzellen jeweils befanden.In C. Bonneton et al., Cell Motility and the Cytoskeleton 43: 288-295 (1999), an experiment is described in which tumor cells were recorded by means of a time-lapse video recording. The analysis of cell divisions and The rate of migration of tumor cells stimulated at different stages of their cell cycle was done by hand, using a sketch paper to which the positions of the tumor cells were applied at different times. It was also recorded in which phase of their cell cycle the tumor cells were each.
In B. Mccullough et al., Toxicol. Pathol. 32 (Suppl. 2): 49–58, 2004, ist ein System beschrieben, mit dem in der toxikologischen Pathologie über ein oder mehrere Intranets und das Internet Pathologen an verschiedenen Standorten gemeinsam auf digitale mikroskopische Bilder zugreifen und miteinander interagieren können. Außerdem wird eine durchsuchbare Datenbank für digitale pathologische Bilder vorgestellt.In B. McCullough et al., Toxicol. Pathol. 32 (Suppl. 2): 49-58, 2004, describes a system in which toxicology pathologists, through one or more intranets and the Internet, can access and interact with digital microscopic images at different locations. In addition, a searchable database for digital pathological images is presented.
Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit der eine Zellprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur ermöglicht wird, mit denen eine schnelle, genaue und schadensspezifische sowie zelltypenspezifische ortsaufgelöste Analyse möglich ist.In contrast, the invention has for its object to provide a method and an apparatus that allows a cell sample diagnostics on a cell sample or cell culture, with which a fast, accurate and damage-specific and cell-type specific spatially resolved analysis is possible.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Zellprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur, das dadurch weitergebildet ist, dass
- a) wenigstens ein Ausschnitt der Zellprobe oder Zellkultur über einen vorgebbaren Messzeitraum videomikroskopisch erfasst wird,
- b) wenigstens eine Zelle der Zellprobe oder Zellkultur im erfassten Videosignal über wenigstens einen Teil des Messzeitraums individualisiert wird,
- c) wenigstens eine Eigenschaft der wenigstens einen individualisierten Zelle mit ihrer zeitlichen Veränderung erfasst wird, wobei eine erfasste Eigenschaft eine Zellform, ein Zellumfang, eine Zellfläche, eine Anzahl oder Größe von Zellausläufern, ein Verhältnis von Größen von Zellausläufern, eine Lokalisation des Zellkerns im Zellplasma, ein Größenverhältnis von Zellkern zu Plasma, ein Verhältnis von Zelloberfläche zu Zellausläufern, ein Bewegungsmuster mit einer Bewegungsrichtung und einer Bewegungsgeschwindigkeit oder eine Anzahl von Zellteilungen oder Zellverschmelzungen ist,
- d) die mit ihrer zeitlichen Veränderung erfasste Eigenschaft der individualisierten Zelle mit wenigstens einem Vergleichswert bezüglich der erfassten Eigenschaft verglichen wird und
- e) aus der Übereinstimmung oder Abweichung der erfassten Eigenschaft der individualisierten Zelle mit oder von dem Vergleichswert der Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustand der Zelle und dessen zeitliche Veränderung bestimmt wird.
- a) at least a section of the cell sample or cell culture is recorded videomicroscopically over a predefinable measurement period,
- b) at least one cell of the cell sample or cell culture in the detected video signal is individualized over at least a part of the measurement period,
- c) at least one property of the at least one individualized cell is detected with its temporal change, wherein a detected property is a cell shape, a cell circumference, a cell area, a number or size of cell spurs, a ratio of sizes of cell spurs, a localization of the cell nucleus in the cell plasma , a cell-to-plasma size ratio, a cell surface area to cell distance ratio, a motion pattern with a direction of motion and a velocity of movement, or a number of cell divisions or cell fusions,
- d) the property of the individualized cell detected with its temporal change is compared with at least one comparison value with respect to the detected property, and
- e) from the coincidence or deviation of the detected property of the individualized cell with or from the comparison value of the functional, vitality and / or damage state of the cell and its temporal change is determined.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Beobachtung, dass sich tierische und menschliche Zellen bei Änderung ihrer Umgebung nach speziellen Verhaltensmustern verhalten und bewegen. Neben für den Zelluntergang charakteristischen Veränderungen der Zellform sind für bestimmte Schädigungsmuster etwa spezifische Veränderungen der Bewegungen bzw. Bewegungs- oder Verhaltensmuster der Zellen nachzuweisen. Diese Änderungen der Verhaltensmuster werden mit dem Videosignal erfasst und bezüglich ihrer zeitlichen Veränderung oder Veränderlichkeit ausgewertet. In einzelnen Eigenschaften sind diese zeitlichen Veränderungen und die Dynamik dieser Veränderungen sehr charakteristisch und signifikant, so dass eine geringe Anzahl von individualisierten Zellen bereits ausreicht, unter Umständen bereits auch eine einzelne individualisierte Zelle.The method according to the invention is based on the observation that animal and human cells behave and move as their environment changes according to specific behavioral patterns. In addition to changes in the cell shape characteristic of cell death, specific changes in the movements or movement or behavior patterns of the cells can be detected for specific damage patterns. These changes in behavioral patterns are captured by the video signal and evaluated for their temporal change or variability. In individual properties, these temporal changes and the dynamics of these changes are very characteristic and significant, so that a small number of individualized cells is already sufficient, even a single individualized cell may already be sufficient.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden tierische oder humane Zellen oder andere Zellen auf einer Glasplatte, in einer Petrischale oder in einer Speziallösung, beispielsweise einer speziellen Nährlösung gehalten. Geeignete Probenträger sind beispielsweise auch Knochenersatzstoffe oder andere Trägermaterialien, die beispielsweise für Biokompatibilitätstests eingesetzt werden. Typische Zelltypen, die in dieser Weise untersucht werden, sind beispielsweise Bindegewebszellen, Leberzellen, Bauchfellzellen, Blutzellen oder Nervenzellen, wobei die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht auf diese Zelltypen beschränkt ist.For the method according to the invention, animal or human cells or other cells are kept on a glass plate, in a Petri dish or in a special solution, for example a special nutrient solution. Suitable sample carriers are, for example, bone substitutes or other carrier materials which are used, for example, for biocompatibility tests. Typical cell types which are investigated in this way are, for example, connective tissue cells, liver cells, peritoneal cells, blood cells or nerve cells, the applicability of the method according to the invention not being limited to these cell types.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der optischen Erfassung von Zellen in wenigstens einem Ausschnitt der Zellprobe bzw. Zellkultur, die eine Kultur von Einzelzellen oder ein Zellenteppich bzw. Zellrasen oder eine mehrdimensionale Rekonstruktion von Zellhaufen oder Zellen auf Trägermaterialien sein kann. Die Erfassung erfolgt beispielsweise im optisch sichtbaren Bereich über Grauwertanalysen oder über Farbnuancen. Neben der Lichtmikroskopie sind auch die Phasenkontrastmikroskopie, die Fluoreszenzmikroskopie sowie auch die Laser-Raster-Mikroskopie zur Anwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Die Laser-Raster-Mikroskopie bietet insbesondere die vorteilhafte Möglichkeit, dreidimensionale Aufnahmen auszuwerten.The method according to the invention is based on the optical detection of cells in at least one section of the cell sample or cell culture, which may be a culture of single cells or a cell carpet or a multi-dimensional reconstruction of cell clusters or cells on carrier materials. The detection takes place, for example, in the optically visible range via gray value analyzes or via color shades. In addition to light microscopy, phase contrast microscopy, fluorescence microscopy and laser scanning microscopy are also suitable for use with the method according to the invention. In particular, laser scanning microscopy offers the advantageous possibility of evaluating three-dimensional images.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann alleine durchgeführt werden oder mit herkömmlichen Verfahren, die oft noch parallel durchgeführt werden, verglichen werden. Es ermöglicht den u. a. auch direkten Vergleich der Auswirkungen verschiedener Wirkstoffkonzentrationen und die Bewertung der Reaktionen der Zelle darauf.The process according to the invention can be carried out alone or compared with conventional processes, which are often carried out in parallel. It allows the u. a. also direct comparison of the effects of different drug concentrations and the evaluation of the reactions of the cell to it.
Eine erfindungsgemäß erfasste Eigenschaft ist eine Zellform, ein Zellumfang, eine Zellfläche, eine Anzahl oder Größe von Zellausläufern, ein Verhältnis von Größen von Zellausläufern, eine Lokalisation des Zellkerns im Zellplasma, ein Größenverhältnis von Zellkern zu Plasma, ein Verhältnis von Zelloberfläche zu Zellausläufern, ein Bewegungsmuster mit einer Bewegungsrichtung und einer Bewegungsgeschwindigkeit oder eine Anzahl von Zellteilungen oder Zellverschmelzungen. Bei Kontakt mit Reiz-, Wirk- oder Schadstoffen sind diese Größen charakteristisch veränderlich.A property encompassed by the present invention is a cell shape, cell circumference, cell area, number or size of cell spurs, ratio of sizes of cell spurs, cell nucleus location in cell plasma, cell nucleus to plasma size ratio, cell surface area ratio to cell spurs, a motion pattern with a direction of movement and a velocity of movement, or a number of cell divisions or cell mergers. Upon contact with irritants, active substances or pollutants, these variables are characteristically variable.
In einer vorteilhaften Ausbildung ist eine erfasste Eigenschaft ein Bewegungsmuster mit Ortsveränderungen, wobei Interaktionen zwischen Nachbarzellen erfasst werden, insbesondere zwischen verschiedenen Zellen desselben Typs und/oder zwischen Zellen verschiedenen Typs und/oder Spezies, oder wobei das Verhältnis von Eigenbewegung der wenigstens einen individualisierten Zelle zu Zellkollektivbewegungen erfasst wird. Beispielsweise ist eine charakteristische Reaktion auf einen lokalen Stimulus eine Bewegung der Zelle von einem Schädigungsreiz weg oder auf einen Lockstoff zu. Auch kompliziertere Reaktionsmuster treten bei der Ortsveränderung von Zellen bzw. der Veränderung ihrer Interaktionen auf.In an advantageous embodiment, a detected property is a movement pattern with changes in location, in which interactions between neighboring cells are detected, in particular between different cells of the same type and / or between cells of different types and / or species, or where the ratio of self-movement of the at least one individualized cell Cell Collective movements is detected. For example, a characteristic response to a local stimulus is movement of the cell away from a damage stimulus or to an attractant. Even more complicated reaction patterns occur in the change of location of cells or the change of their interactions.
Die genannten Parameter sind typische Parameter der Zellerscheinungsform und des Bewegungs- und Aktivitätsmusters der Zellen, die auf den Zusatz von Stoffen oder physikalischen Reizen reagieren. So kann sich eine Zelle, die geschädigt wird, entweder ausbreiten oder zusammenziehen, der Zellkern kann seine Form oder Größe verändern, die Aktivität der Ausläufer und die Anzahl und das Ausmaß der Ausläufer können sich verringern oder vergrößern, die Anzahl der Zellkontakte, Verschiebung von Nachbarzellen, Durchdringung von Zellansammlungen oder Nachbarzellen, Zellverschmelzungen, Abstoßungen, Zellteilungen oder Auflösungen kann sich vergrößern oder verkleinern, geschädigte individualisierte Zellen können sich entgegen Zellkollektivbewegungen bewegen usw. Es gibt eine Vielzahl möglicher Veränderungen dieser Parameter, die für den jeweiligen Zelltyp und für das jeweilige Schädigungsbild charakteristisch sind.The parameters mentioned are typical parameters of the cell appearance and of the movement and activity pattern of the cells, which react to the addition of substances or physical stimuli. Thus, a cell that is damaged may either expand or contract, the nucleus may change shape or size, the activity of the foothills, and the number and extent of the foothills may decrease or increase, the number of cell contacts, displacement of neighboring cells Penetration of cell aggregates or neighboring cells, cell fusions, rejections, cell divisions or resolutions can increase or decrease, damaged individualized cells can move against cell collective movements, etc. There are a variety of possible changes in these parameters, which are characteristic for the respective cell type and for the respective damage pattern are.
Die erfindungsgemäße Analyse der individualisierten Zelle bzw. Zellen beruht auf einer, insbesondere dynamischen, Vermessung der Zellform und deren Veränderungen. Dazu ist in einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass die videomikroskopische Erkennung von Eigenschaften der individualisierten Zelle anhand von Einzelaufnahmen des Videosignals, insbesondere automatisch, geschieht, wobei zu jeder Einzelaufnahme des Videosignals eine oder mehrere der folgenden Schritte kumulativ ausgeführt werden:
- a) Detektion der Zellwand und insbesondere Berechnung des Flächeninhalts der Zelle, sowie insbesondere Bestimmung der Position der Zelle im erfassten Ausschnitt,
- b) Detektion des Zellkerns und der Zellkerngrenze und insbesondere Berechnung des Flächeninhalts des Zellkerns, der Kern-Plasma-Relation und/oder der Orientierung des Zellkerns in der Zelle,
- c) Detektieren von Zellorganellen und/oder Einschlüssen und Bestimmung ihrer Position relativ zum Zellkern und der Zellwand.
- a) detection of the cell wall and in particular calculation of the surface area of the cell, and in particular determination of the position of the cell in the captured section,
- b) detection of the cell nucleus and the cell nucleus boundary and in particular calculation of the surface area of the cell nucleus, the nuclear-plasma relation and / or the orientation of the cell nucleus in the cell,
- c) Detecting cell organelles and / or inclusions and determining their position relative to the cell nucleus and the cell wall.
Unter kumulativer Ausführung wird in diesem Zusammenhang verstanden, dass wenigstens der Verfahrensschritt a), oder die Verfahrensschritte a) und b) oder die Verfahrensschritte a), b) und c) ausgeführt werden.Cumulative execution in this context means that at least the process step a), or the process steps a) and b) or the process steps a), b) and c) are performed.
Die genannten Schritte betreffen die Erkennung der geometrischen Verhältnisse der Zelle im Einzelbild des Videosignals, deren Veränderung in der Abfolge der Einzelbilder untersucht wird. So erlaubt die Detektion der Zellwand gleichzeitig auch die Ermittlung von Zellausläufern und die Berechnung eines geeignet berechneten Zellausläufer-Indexes, insbesondere in Relation zur Oberfläche der Zelle. Aus den gewonnenen geometrischen Daten der Zelle und des Zellkerns sowie der Zellorganellen lassen sich wesentliche Eigenschaften ableiten.The steps mentioned relate to the detection of the geometric relationships of the cell in the individual image of the video signal, whose change in the sequence of the individual images is examined. Thus, the detection of the cell wall at the same time also allows the determination of Zellausläufern and the calculation of a suitably calculated Zellausläufer index, especially in relation to the surface of the cell. From the obtained geometric data of the cell and the cell nucleus as well as the cell organelles essential properties can be derived.
Zur Detektion der Zellwand bzw. des Zellkerns gehört insbesondere auch die Detektion des Ortes, an dem sich die Zelle bzw. der Zellkern befindet, so dass auch eine Absolutbewegung der gesamten Zelle oder des Zellkerns von einer Einzelaufnahme zur nächsten nachverfolgt werden kann.The detection of the cell wall or of the cell nucleus also includes, in particular, the detection of the location at which the cell or the nucleus is located, so that an absolute movement of the entire cell or of the cell nucleus can also be tracked from one single exposure to the next.
Vorzugsweise ist eine erfasste Eigenschaft eine Zeit, eine Zeitspanne, eine Frequenz oder eine Häufigkeit, in der oder mit der sich eine erfasste Eigenschaft ändert. Damit wird die Dynamik der Änderungen besonders gut erkennbar. Die Dynamik der Änderungen der erfassten Eigenschaften bildet einen wichtigen Bestandteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.Preferably, a detected property is a time, a period of time, a frequency, or a frequency in which or at which a detected property changes. This makes the dynamics of the changes particularly clear. The dynamics of the changes in the detected properties forms an important part of the method according to the invention.
Vorzugsweise sind die Vergleichswerte Momentaufnahmen von erfassten Eigenschaften oder zeitliche Entwicklungen von erfassten Eigenschaften aufgrund bekannter Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustände und/oder deren Änderungen. So kann untersucht werden, ob das Ausmaß und/oder Schnelligkeit einer gemessenen Änderung von erfassten Eigenschaften einem bekannten Schädigungszustand entspricht, oder ob sich die Änderung innerhalb der normalen Bandbreite von vitalen bzw. gesunden Zellen befindet. Dabei wird die Variabilität der Eigenschaften bei gesunden oder bei geschädigten Zellen berücksichtigt.The comparison values are preferably snapshots of acquired properties or temporal developments of detected properties on the basis of known functional, vitality and / or damage states and / or their changes. Thus it can be examined whether the extent and / or rapidity of a measured change of detected characteristics corresponds to a known damage condition, or whether the change is within the normal range of vital cells. The variability of the properties in healthy or damaged cells is taken into account.
Bevorzugterweise wird die Erfassung von Eigenschaften und deren Vergleich mit Vergleichswerten für mehrere, insbesondere einen Zellverband bildende, individualisierte Zellen vorgenommen, wobei vorzugsweise zwischen 5 und 500 Zellen, besonders bevorzugt zwischen 10 und 100 Zellen untersucht werden. Die Untersuchung erfolgt insbesondere stichprobenhaft. Die Untersuchung einer Vielzahl von Zellen erlaubt eine Verbesserung der statistischen Datenbasis und daher eine Verbesserung der Aussagekraft der Untersuchung.Preferably, the detection of properties and their comparison with comparison values is carried out for a plurality of individualized cells, in particular a cell grouping, wherein preferably between 5 and 500 cells, particularly preferably between 10 and 100 cells are examined. The investigation is carried out in particular on a random basis. Examination of a large number of cells makes it possible to improve the statistical data base and therefore to improve the informative value of the examination.
Insbesondere zusätzlich zur Untersuchung von Monokulturen kann auch die Untersuchung von Kulturgemischen mit verschiedenen Zellarten erfolgen, wobei die hohe Ortsauflösung bzgl. des Zelltyps und der Interaktionen der einzelnen verschiedenen Zellen besonders vorteilhaft ist. Dazu ist vorzugsweise die Zellprobe oder Zellkultur eine Mischkultur aus wenigstens zwei unterschiedlichen Zelltypen oder Zellarten. Auch drei bis fünf verschiedene Zellarten können auf diese Weise untersucht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei nach oben theoretisch nicht begrenzt. Die Leistungsfähigkeit der verwendeten videomikroskopischen Vorrichtung und die Rechenkapazität der zur Analyse eingesetzten Datenverarbeitungsanlagen setzen der Anzahl verschiedener gleichzeitig zu untersuchender Zellen und insbesondere Zelltypen allerdings eine obere Grenze. Eine Untersuchung anhand von Kulturgemischen kann in der Praxis etwa auch auf eine Untersuchung von zunächst nur einem Zelltyp folgen.In particular, in addition to the study of monocultures, the study of culture mixtures with different types of cells can also be carried out, the high spatial resolution with respect to the cell type and the interactions of the individual different cells being particularly advantageous. For this purpose, preferably the cell sample or cell culture is a mixed culture of at least two different cell types or cell types. Also, three to five different cell types can be examined in this way. The inventive method is theoretically not limited to the top. However, the performance of the video-microscopic device used and the computing capacity of the data processing systems used for the analysis place an upper limit on the number of different cells to be investigated simultaneously, and in particular cell types. An investigation based on culture mixtures can in practice also be followed by an examination of initially only one cell type.
Vorzugsweise findet die videomikroskopische Erfassung statt, während die Zellkultur inkubiert wird, insbesondere mit einer chemischen oder pharmakologischen Substanz und/oder unter Einwirkung eines oder mehrerer physikalischer Reize.Preferably, the videomicroscopic detection takes place while the cell culture is incubated, in particular with a chemical or pharmacological substance and / or under the action of one or more physical stimuli.
Vorzugsweise stammt der Vergleichswert von einer Zelle desselben Zelltyps, dessen Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustand bekannt ist. Alternativ oder zusätzlich dazu stammt der Vergleichswert von derselben Zelle oder einer Zelle desselben Zelltyps aus dem erfassten Ausschnitt zu einem früheren Zeitpunkt innerhalb des Messzeitraums. Die beiden Alternativen können bei mehreren erfassten Eigenschaften auch gemischt werden. Die zunächst genannte Alternative ist besonders bei bekannten Zelltypen vorteilhaft, für die Referenzwerte bekannt sind. Die letztgenannte Alternative ist vorteilhaft, da so auch relative Veränderungen bei der Beobachtung von Zellen während der Inkubation mit bisher unbekannten Wirkstoffen erfasst werden können, die für Aussagen zur Beurteilung der Wirkung von eingebrachten Stoffen unter Umständen ausreichen. Außerdem kann so die Dynamik bei bisher unbekannten Zellen untersucht werden, etwa bei der Beschreibung des Wachstums von Tumorzellen eines Patienten und Charakterisierung der Auswirkungen verschiedener Medikamente auf diese Zellen. Da es sich um patientenspezifische Tumorzellen handelt, sind in der Regel keine Vergleichsdaten für diese spezielle Zellreihe vorhanden, die Auswirkungen von Stoffen auf diese Zellen, sind jedoch von Bedeutung.The comparison value preferably originates from a cell of the same cell type whose functional, vitality and / or damage state is known. Alternatively or additionally, the comparison value from the same cell or a cell of the same cell type originates from the captured segment earlier in the measurement period. The two alternatives can also be mixed with several recorded properties. The first mentioned alternative is particularly advantageous for known cell types for which reference values are known. The latter alternative is advantageous because it also allows for detecting relative changes in the observation of cells during incubation with previously unknown drugs, which may be sufficient for statements to assess the effect of incorporated substances. In addition, the dynamics of previously unknown cells can be investigated, such as the description of the growth of tumor cells of a patient and characterization of the effects of various drugs on these cells. Since these are patient-specific tumor cells, there are usually no comparative data for this particular cell line, but the effects of substances on these cells are important.
Ferner vorzugsweise werden Positiv- und/oder Negativ-Kontrollen der Zellprobe oder Zellkultur, insbesondere gleichzeitig, inkubiert und videomikroskopisch erfasst und wird die wenigstens eine erfasste Eigenschaft auch für wenigstens eine individualisierte Zelle der Kontrolle erfasst und als Vergleichswert verwendet. Damit ist ein direkter Vergleich zwischen den erfassten Werten und Vergleichswerten möglich, da die Vergleichswerte bezüglich desselben Zelltyps oder derselben Zellkulturmischung unter denselben Rahmenbedingungen gewonnen werden, wie die erfassten Werte der schad- oder wirkstoffstoffbelasteten Zellkulturen.Furthermore, preferably positive and / or negative controls of the cell sample or cell culture, in particular simultaneously, are incubated and recorded by video-microscopy and the at least one detected property is also recorded for at least one individualized cell of the control and used as comparison value. This makes a direct comparison between the recorded values and comparison values possible, since the comparison values for the same cell type or the same cell culture mixture are obtained under the same conditions as the recorded values of the cell cultures contaminated with harmful substances or active substances.
In einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Verfahren unter Standardkulturbedingungen durchgeführt. Dabei werden insbesondere Umgebungsfaktoren, insbesondere Temperatur, Kohlendioxidgehalt oder Licht verändert.In an advantageous development of the method according to the invention, the method is carried out under standard culture conditions. In particular environmental factors, in particular temperature, carbon dioxide content or light are changed.
Die technische Umsetzung des neuen Messverfahrens erfolgt durch videomikroskopische Aufzeichnung des Zellwachstums und der Zellbewegung unter Zellkulturbedingungen. Die zu untersuchenden Zellen werden mit der Testsubstanz inkubiert und über einen Zeitraum von meist vier bis zwölf Stunden beobachtet. Der Zeitraum kann auch kürzer oder länger sein. Die Zellveränderungen werden in einem, insbesondere digitalen, Videofilm bzw. Videosignal aus einer Abfolge von Einzelbildern aufgezeichnet. Diese Abfolge von Einzelbildern aus dem Videosignal stellt die Datenbasis für die folgende Datenanalyse dar. Vorzugsweise wird die videomikroskopische Erfassung mit einer Bildwiederholungsrate von 0,01 Hz bis 1 Hz, insbesondere zwischen 0,05 Hz bis 0,2 Hz, insbesondere von 0,1 Hz, vorgenommen. Dies entspricht einem Abstand zwischen den Einzelbildern von 1 bis 100 s, insbesondere 5 bis 20 s, insbesondere 10 s. Diese Intervalle sind an die typischen Geschwindigkeiten und Änderungszeiten der untersuchten Zellkulturen bzw. Zellproben anzupassen, die je nach Zelltyp unterschiedlich ausfallen können. In wenigen Fällen ist eine Bildwiederholungsrate von mehr als 1 Hz notwendig.The technical implementation of the new measurement method is carried out by videomicroscopic recording of cell growth and cell movement under cell culture conditions. The cells to be examined are incubated with the test substance and observed over a period of usually four to twelve hours. The period can be shorter or longer. The cell changes are recorded in a, in particular digital, video film or video signal from a sequence of individual images. This sequence of individual images from the video signal represents the data basis for the following data analysis. Preferably, the video-microscopic acquisition is performed with a refresh rate of 0.01 Hz to 1 Hz, in particular between 0.05 Hz to 0.2 Hz, in particular of 0.1 Hz, made. This corresponds to a spacing between the individual images of 1 to 100 s, in particular 5 to 20 s, in particular 10 s. These intervals are to be adapted to the typical speeds and change times of the cell cultures or cell samples investigated, which may vary depending on the cell type. In a few cases, a refresh rate of more than 1 Hz is necessary.
Die Bildwiederholungsrate kann vorzugsweise auch variabel sein, wodurch beispielsweise nach der Zugabe eines Wirkstoffs zunächst mit einer vergleichsweise hohen Bildwiederholungsrate aufgenommen wird, um die unmittelbare Reaktion detailscharf aufzunehmen, während im Laufe des Untersuchungszeitraums die Abstände zwischen Einzelbildern größer werden, wenn die Aktivität der untersuchten Zellen nachlässt. Hiermit ist eine Reduktion der zu verarbeitenden Datenmengen erreichbar, ohne die Genauigkeit der Analyse zu verschlechtern.The image repetition rate can preferably also be variable, whereby, for example, after the addition of an active substance, it is first recorded at a comparatively high image repetition rate in order to record the immediate reaction in detail, while the intervals between individual images increase as the activity of the examined cells decreases in the course of the examination period , This achieves a reduction in the amount of data to be processed without degrading the accuracy of the analysis.
Bei der Datenanalyse wird auf eine umfangreiche Datenbank mit Zellbewegungsdaten zurückgegriffen, in denen Vergleichsdaten bzw. Referenzdaten gespeichert sind, die bei Untersuchungen unter fest definierten Umgebungsbedingungen mit bekannten toxischen Agenzien erlangt wurden. Diese Datenbank enthält neben Bewegungsdaten von Einzelzellen auch Daten zu Zell-Zell-Interaktionen und zu Wechselwirkungen mit physikalischen Strukturen oder Reizen in Kombination mit bekannten Wirkstoffen. Daten für Zellkulturen mit einem bis zu drei Zelltypen oder auch mehr Zelltypen sind in der Datenbank hinterlegt. Durch einen computergestützten Vergleich der neu gewonnenen Daten mit den Ergebnissen aus der Datenbank und/oder einer Positiv- oder Negativprobe sind Aussagen in Bezug auf die Wirkung und Toxizität verschiedener Wirkstoffe möglich.The data analysis is based on an extensive database of cell movement data in which comparative data or reference data obtained during investigations under well-defined environmental conditions with known toxic agents are stored. In addition to single-cell movement data, this database also contains data on cell-cell interactions and interactions with physical structures or stimuli in combination with known drugs. Data for cell cultures with one to three cell types or even more cell types are stored in the database. By computer-aided comparison of the new data with the results from the database and / or a positive or negative sample statements with respect to the effects and toxicity of different drugs are possible.
Das erfindungsgemäße Verfahren kommt ohne zusätzliche Reagenzien aus, die eine Verfälschung der Testumgebung bewirken würden und die Interpretation der Messwerte erschweren können. Das Testsystem weist durch die Beobachtung von Einzelzellen, auch einer Mehrzahl von Einzelzellen, eine hohe Ortsauflösung auf. Schädigungsmuster können einzelnen Zellen und Zellsubpopulationen zugeordnet werden und lassen damit eine höhere Spezifität bei der Interpretation der Untersuchungsergebnisse zu. Auch Untersuchungen mit mehr als zwei oder drei Zellpopulationen sind möglich. Zellschädigungen im Zusammenhang mit strukturellen Besonderheiten sind möglich, spezifische Reaktionen auf mechanische Zellschädigungen lassen sich sensitiver als bisher nachweisen.The method according to the invention requires no additional reagents which would cause a falsification of the test environment and make the interpretation of the measured values difficult. The test system has by the observation of single cells, even a plurality of single cells, a high spatial resolution. Damage patterns can be assigned to individual cells and cell subpopulations and thus allow a higher specificity in the interpretation of the test results. Even studies with more than two or three cell populations are possible. Cell damage in connection with structural peculiarities is possible, specific reactions to mechanical cell damage can be detected more sensitively than before.
Das erfindungsgemäße Verfahren reagiert bereits frühzeitig auf Veränderungen des Zellverhaltens und ist damit sensibler als vergleichbare mikroskopische Untersuchungsverfahren. Breit angelegte Screening-Untersuchungen, z. B. in der pharmakologischen Wirkstoffforschung, sind damit mit einem auch deutlich niedrigeren Zeitfaktor möglich. Durch das Fehlen chemischer Reagenzien werden die laufenden Kosten bei den Untersuchungen minimiert. Langzeitbeobachtungen sind ohne Probleme möglich, der Aufwand für die vorzuhaltenden Zellmengen wird minimiert.The method according to the invention reacts early to changes in cell behavior and is thus more sensitive than comparable microscopic examination methods. Broad-based screening studies, eg. As in the pharmacological drug discovery, are thus possible with a much lower time factor. The lack of chemical reagents minimizes the running costs of testing. Long-term observations are possible without problems, the effort for the cell quantities to be kept is minimized.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur Zellkulturen mit vereinzelten Zellen untersucht werden, sondern auch mit Zellen, die in Zellteppichen bzw. Zellrasen vorhanden sind. Auch in Zellrasen herrscht eine rege Bewegung, da einzelne, bewegliche Zellen die benachbarten Zellen durchdringen können, d. h. sich zwischen zwei benachbarten Zellen hindurchzwängen können. Auch in dieser Umgebung ist eine Individualisierung und Verfolgung der einzelnen Zellen von Einzelbild zu Einzelbild des Videosignals möglich.With the method according to the invention not only cell cultures with isolated cells can be examined, but also with cells that are present in cell carpets or cell lawns. Even in cell turf, there is a lively movement, as individual, mobile cells can penetrate the neighboring cells, d. H. can squeeze between two adjacent cells. Individualization and tracking of the individual cells from frame to frame of the video signal is also possible in this environment.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auch gelöst durch ein Computerprogrammprodukt mit Programmcodemitteln, bei deren Ausführung in einer Datenverarbeitungsanlage die Schritte eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt werden oder ausführbar sind. Ebenfalls wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch einen Datenträger mit einem darauf gespeicherten oder geschriebenen erfindungsgemäßen Computerprogrammprodukt.The object underlying the invention is also achieved by a computer program product with program code means, in the execution of which in a data processing system the steps of a method according to the invention described above are executed or can be carried out. Also, the object underlying the invention is achieved by a data carrier with a computer program product stored or written on it.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auch durch eine Vorrichtung zur Zellprobendiagnostik an einer Zellprobe oder Zellkultur gelöst, die eine Videomikroskopievorrichtung umfasst, die ausgebildet ist, um eine, insbesondere digitale, Videoaufnahme der inkubierten Zellprobe oder Zellkultur zu machen, wobei die Auflösung der Videomikroskopievorrichtung ausreicht, um einzelne Zellen der Zellprobe oder Zellkultur zu individualisieren, wobei die Vorrichtung eine Auswertevorrichtung umfasst, die ausgebildet ist, aus der Videoaufnahme wenigstens eine Zelle zu individualisieren, wenigstens eine Eigenschaft der individualisierten Zelle sowie deren zeitliche Änderung zu erfassen und mit einem Vergleichswert zu vergleichen wobei eine erfasste Eigenschaft (
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise eingerichtet, das erfindungsgemäße Verfahren wie oben beschrieben durchzuführen.The device according to the invention is preferably set up to carry out the method according to the invention as described above.
Vorzugsweise hat die Auswertevorrichtung Zugriff auf eine Datenbank mit Vergleichswerten, in der Vergleichsdaten bezüglich der erfassten Eigenschaften für eine oder mehrere Zelltypen oder Zellarten mit bekanntem Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustand hinterlegt sind. Außerdem ist vorzugsweise in der Datenbank zusätzlich hinterlegt, durch welche Stoffe oder physikalischen Reize der Funktions-, Vitalitäts- und/oder Schädigungszustand verursacht wurde, dem die Vergleichsdaten entsprechen.The evaluation device preferably has access to a database with comparison values, in which comparison data regarding the recorded properties for one or more cell types or cell types with known functional, vitality and / or damage status are stored. In addition, it is preferably additionally deposited in the database by which substances or physical stimuli the functional, vitality and / or damage state was caused, to which the comparative data correspond.
Damit ist auch eine Vorrichtung geschaffen, mit der erfindungsgemäß besser als mit derzeit gebräuchlichen Untersuchungsmethoden und -vorrichtungen die Beurteilung von Zellfunktionen, Zellvitalität und Schädigungszuständen möglich ist. Durch die Beobachtung von Zellbewegungen und Formveränderungen über die Zeit umgeht das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung die Unzulänglichkeiten der bekannten Verfahren und Vorrichtungen. Insbesondere können Zellen mit Hilfe der videomikroskopischen Beobachtung über variable Zeiträume beobachtet werden und Bewegungen oder Formveränderungen der Zellen aufgezeichnet werden. Einzelne Umgebungsfaktoren wie Temperatur, Kohlendioxidgehalt oder Licht und beliebige weitere physikalische Umweltgrößen sind dabei kontrolliert veränderbar. Unter konstanten physikalischen Umweltfaktoren können die Auswirkungen von zu untersuchenden chemischen Wirkstoffen oder speziellen physikalischen Reizen aufgezeichnet und untersucht werden.Thus, a device is provided with the present invention, the evaluation of cell functions, cell vitality and damage states is better than currently used with conventional examination methods and devices possible. By observing cell movements and changes in shape over time, the method and apparatus of the invention avoids the shortcomings of the known methods and devices. In particular, cells can help with observed by video-microscopic observation over variable time periods and movements or changes in shape of the cells are recorded. Individual environmental factors such as temperature, carbon dioxide content or light and any other physical environmental variables can be changed in a controlled manner. Under constant physical environmental factors, the effects of chemical agents to be investigated or specific physical stimuli can be recorded and investigated.
Die Untersuchungen werden an der vitalen Zellkultur durchgeführt und es werden keine zusätzlichen Testreagenzien verwendet, die die Ergebnisse durch ihre Eigenwirkung bzw. Nebenwirkungen verfälschen könnten. Die erfassten Daten können sowohl für einzelne Zellen als auch für Zellverbände erhoben und ausgewertet werden als auch bei der Untersuchung von Zellverbänden Formveränderungen als Reaktion auf Nachbarzellen und deren Bewegungsverhalten analysiert werden. Da auch die Kollektivanalysen immer auf dem Niveau der einzelnen Zelle erfolgen, ist eine besonders hohe Ortsauflösung auch bei den Kollektivanalysen gegeben. Dies gilt auch für die Untersuchung von Mischkulturen.The tests are carried out on the vital cell culture and no additional test reagents are used which could falsify the results by their own action or side effects. The collected data can be collected and evaluated both for single cells and for cell aggregates as well as for the analysis of cell formations changes in shape as a reaction to neighboring cells and their movement behavior can be analyzed. Since the collective analyzes are always carried out at the level of the individual cell, a particularly high spatial resolution is also given in the collective analyzes. This also applies to the study of mixed cultures.
Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, wobei bezüglich aller im Text nicht näher erläuterten erfindungsgemäßen Einzelheiten ausdrücklich auf die Zeichnungen verwiesen wird. Es zeigen:The invention will be described below without limiting the general inventive idea by means of embodiments with reference to the drawings, reference being expressly made to the drawings with respect to all in the text unspecified details of the invention. Show it:
In den folgenden Figuren sind jeweils gleiche oder gleichartige Elemente bzw. entsprechende Teile mit denselben Bezugsziffern versehen, so dass von einer entsprechenden erneuten Vorstellung abgesehen wird.In the following figures, identical or similar elements or corresponding parts are provided with the same reference numerals, so that a corresponding renewed idea is dispensed with.
In
In
Für die Erkennung, welche Verbindungslinien eine lokale maximale oder minimale Länge aufweisen, sind mehrere verschiedene Verfahren anwendbar, die zu im Einzelnen leicht verschiedenen Ergebnissen kommen können. In der zeitlichen Verfolgung sind sie aber im Wesentlichen gleichwertig und kommt es vor allem darauf an, dass jeweils konsistent angewendet werden. So können die Linien vom Mittelpunkt des Zellkerns
Die in
Eine zur dargestellten Methode alternative Methode besteht etwa in der Fourier-Analyse der Zellwand
Um den Aufwand der notwendigen Analyse zu begrenzen, kann vorgesehen sein, dass nur eine Anzahl der signifikantesten Ausläufer
In
Eine entsprechende Analyse kann für eine Vielzahl von individualisierten Zellen
Bei den meisten Zelltypen ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich in dem untersuchten Ausschnitt Zellen befinden, die über die Beobachtungsdauer hinweg im beobachteten Ausschnitt verbleiben, relativ groß. Es ist möglich, solche Zellen auszuwählen, die im Ausschnitt verbleiben, oder die Analyse so anzupassen, dass berücksichtigt wird, dass einige untersuchte Zellen sich aus dem Ausschnitt herausbewegen und andere Zellen an deren Stelle neu in die Untersuchung aufgenommen werden.For most cell types, the likelihood of cells in the slice being examined remaining in the observed slice throughout the observation period is relatively large. It is possible to select those cells that remain in the clipping, or to adapt the analysis to take into account that some examined cells move out of the clipping and other cells in their place are newly included in the examination.
In
Auf der vertikalen Achse sind zwei verschiedene Einheiten dargestellt. Zum einen handelt es sich um einen Index, der für die drei erfindungsgemäß erfassten und ermittelten Eigenschaften
Bei der mit
Aus der mit Rauten markierten LDH-Kurve
Die mit den Bezugszeichen
Der mit dem Bezugszeichen
Der mit dem Bezugszeichen
Deutlich erkennbar ist, dass bereits zu Beginn der Messung der Index
Der mit dem Bezugszeichen
Der dritte Index, Bezugszeichen
Aus
In
Die Datenverarbeitungsanlage
Weiterhin ist dargestellt, dass über ein Signal- und Steuerweg
Es ist auch dargestellt, dass die Auswertevorrichtung
Einige oder alle dieser genannten Vorrichtungen können auch in einer einzigen Datenverarbeitungsanlage zusammengefasst sein oder jeweils auf verschiedene Datenverarbeitungsanlagen oder andere geeignete elektronische Anlagen verteilt sein, die ein Netzwerk bilden.Some or all of these mentioned devices can also be combined in a single data processing system or distributed in each case to different data processing systems or other suitable electronic systems which form a network.
Alle genannten Merkmale, auch die den Zeichnungen allein zu entnehmenden sowie auch einzelne Merkmale, die in Kombination mit anderen Merkmalen offenbart sind, werden allein und in Kombination als erfindungswesentlich angesehen. Erfindungsgemäße Ausführungsformen können durch einzelne Merkmale oder eine Kombination mehrerer Merkmale erfüllt sein.All mentioned features, including the drawings alone to be taken as well as individual features that are disclosed in combination with other features are considered alone and in combination as essential to the invention. Embodiments of the invention may be accomplished by individual features or a combination of several features.
BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS
- 11
- Zellecell
- 22
- Zellwandcell wall
- 33
- Zellkernnucleus
- 44
- ZellkerngrenzeNucleus border
- 55
- Organelleorganelle
- 66
- Einschlussinclusion
- 77
- Verbindungslinie mit lokal maximaler LängeConnection line with locally maximum length
- 7'7 '
- Punkt auf der ZellwandPoint on the cell wall
- 7''7 ''
- Punkt auf dem ZellkernPoint on the nucleus
- 88th
- Verbindungslinie mit lokal minimaler LängeConnecting line with locally minimum length
- 8'8th'
- Punkt auf der ZellwandPoint on the cell wall
- 8''8th''
- Punkt auf dem ZellkernPoint on the nucleus
- 99
- Zellausläufercell processes
- 2020
- LDH-KonzentrationLDH concentration
- 2121
-
Index 1
Index 1 - 2222
-
Index 2
Index 2 - 2323
-
Index 3
Index 3 - 4040
- Vorrichtung zur ZellprobendiagnostikDevice for cell sample diagnostics
- 4141
- ZellprobenbehälterCell sample container
- 4242
- Inkubatorincubator
- 4343
- Videomikroskopvideo microscope
- 4444
- DatenverarbeitungsanlageData processing system
- 4545
- Steuerleitungcontrol line
- 4646
- Signal- und SteuerleitungSignal and control line
- 4747
- Auswertevorrichtungevaluation
- 4848
- DatenbankDatabase
- 4949
- Steuervorrichtungcontrol device
- 5050
- Anzeige- und BedienvorrichtungDisplay and operating device
- 51–5351-53
- Signal- und SteuerwegeSignal and control paths
- 5454
- Daten- und SteuerleitungData and control line
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BONNETON,C., u.a.: Relationship between cell migration and cell cycle during the initation of epithelial to fibroblastoid transition. Cell Motil. Cytoskeleton (1999) 43 (4) 288-295 * |
MCCULLOUGH,B., u.a.: Digital microscopy imaging and new approaches in toxicologic pathology. Toxicol. Pathol. (2004), 32 Suppl 2:49-58 * |
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---|---|---|---|
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Effective date: 20121006 |
|
R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |