WO2011007815A1 - 免疫調節作用を有する乳を産生する食餌のスクリーニング法 - Google Patents

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孝広 落谷
展慶 小坂
一則 関根
和泉　裕久
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a diet that produces milk having an immunomodulatory action, and is useful in the food and feed fields.
  • Living body immunity functions by nature as a “defense” against attacks from outside. For example, defense against infection or removal of cancer cells is “protection”, and in this case, enhancement of immunity effectively acts. On the other hand, an excessive reaction due to immunity, that is, “enhancement” may adversely affect the living body. Examples include allergic reactions, autoimmune diseases, chronic inflammation and the like. In this case, it is known that symptom improvement is observed by suppressing the production of inflammatory cytokines such as IL-6, TNF- ⁇ , and IL-1.
  • microRNA microRNA
  • miRNA After miRNA is transcribed from the genome, it is cleaved twice and becomes about 22 base untranslated small RNA. As its function, it is known to bind to the 3 ′ untranslated region of the target mRNA in a complementary manner and suppress the translation of the target mRNA.
  • One type of miRNA controls various functions of cells by inhibiting translation of multiple mRNAs in the cell. In particular, there have been many reports on the occurrence and progression of cancer, and the relationship between miRNA and disease has attracted attention.
  • miR-181 has been reported to be involved in immune development such as B cell development and T cell activation (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Non-Patent Documents 1 and 4 are involved in immune development through activation of the innate immune system (Non-Patent Documents 1 and 4) and differentiation / function control of T cells and B cells (Non-Patent Documents 1 and 5). It is known to be involved in anti-allergy and anti-inflammation through Th1 / Th2 balance control (Non-patent Documents 1 and 6) and maintenance of the function of regulatory T cells that suppress excessive immune responses (Non-patent Document 7). Yes.
  • MiR-17 and miR-92 are involved in immune development by controlling the differentiation and development of B cells and T cells in cooperation (Non-Patent Documents 1, 8, and 9).
  • Non-patent Document 12 miR-223 suppresses neutrophil proliferation / activation (Non-Patent Documents 1 and 10), miR-150 suppresses B cell differentiation (Non-Patent Documents 1 and 11), let -7i is known to be involved in defense against infection by controlling TLR4 expression in bile duct cells (Non-patent Document 12).
  • MiR-125 is known to be involved in anti-inflammatory by suppressing the production of TNF- ⁇ (Non-Patent Documents 1 and 13).
  • Non-Patent Documents 1 and 14 are involved in infection defense by negatively controlling the innate immune system (Non-Patent Documents 1 and 14), and is also involved in anti-allergy by controlling Th1 / Th2 balance (Non-Patent Documents). 15) is known.
  • Non-patent Document 16 miRNA that works intracellularly as a translation control molecule exists in a lipid bilayer called exosome and is secreted extracellularly. Since it was confirmed that the secreted miRNA was taken up by other cells, the existence of cell-cell interaction via miRNA was suggested. On the other hand, exosomes are known to exist in various human body fluids. In particular, the presence of miRNA has already been reported in human plasma and serum, suggesting the possibility of being used as a biomarker in prostate cancer and uterine cancer (Non-patent Document 17).
  • Physiological fluids containing exosomes include saliva, urine, amniotic fluid and breast milk in addition to plasma and serum (Non-patent Document 17).
  • breast milk is a bodily fluid made at a specific time for mammals, and is responsible for the movement of substances between the mother and the individual. In addition to feeding the child, breast milk provides the child with immunity acquired by the mother.
  • Non-patent Document 19 Secreted IgA, lactoferrin, lysozyme, cytokines, etc. are present in breast milk, and are considered to protect the infant from infection and promote the immune development of the infant.
  • Breast milk contains antibacterial IgA, lactoferrin, glycoproteins and glycolipids, as well as cytokines that control immune cells.
  • the subjects analyzed in previous studies are mainly for proteins contained in breast milk. Although there are reports on nucleic acids, studies on nucleic acids with specific sequences have not been reported. Absent.
  • Non-patent Document 20 It is also known that the development of mammary cells regulated by the expression of cyclooxygenase-2 is controlled by miR-101a (Non-patent Document 20). However, it does not suggest that miRNA is present in milk.
  • RNAs are present in microvesicles derived from bovine milk (Patent Document 21), and raw milk of cows having different lactation periods, commercially available liquid milk or micro milk in powdered milk It has been reported that RNA has been identified (Patent Document 22).
  • An object of the present invention is to provide a method for screening a diet that produces milk having an immunomodulating action, a novel food having an immunomodulating action, and a method for producing the same.
  • the present invention increases or decreases the abundance of microRNA in milk using as an index the correlation between the microRNA profile in the milk of a mammal and the diet ingested by the mammal or a substance contained in the diet.
  • the present invention provides a method for screening a diet or substance that produces breast milk having an immunomodulatory action, which comprises identifying the diet or substance to be caused.
  • the immunoregulatory effect is an immunopotentiating effect, and if the abundance of the microRNA is increased, the diet or substance is determined to produce breast milk having an immunopotentiating effect. Yes.
  • the method compares the microRNA profile contained in each milk before and after the intake of the diet, and if the abundance of at least one kind of microRNA is higher after the intake than before the intake, the diet is microscopic in the milk. It is a preferred embodiment that it is determined to increase the abundance of RNA.
  • the microRNA profile in milk is compared with the microRNA profile in serum or plasma, and the abundance of microRNA contained in any of milk, serum, or plasma is It is a preferred embodiment that it is determined that the abundance of microRNA in milk is increased if the intake of food is 1.2 times higher in milk than in serum or plasma.
  • the immunoregulatory effect is an immunosuppressive effect and the abundance of the microRNA decreases, it is determined that the diet or substance produces breast milk having an immunosuppressive effect. Is another aspect.
  • the method compares the microRNA profiles contained in each milk before and after the intake of the diet, and if the abundance of at least one kind of microRNA is low after intake compared to before intake, the diet is microscopic in milk. It is a preferred embodiment that it is determined that the abundance of RNA is reduced.
  • the method compares a microRNA profile in milk with a microRNA profile in serum or plasma, and the abundance of microRNA contained in any of milk, serum or plasma is greater than that of the diet. It is a preferred embodiment that it is determined that the abundance of microRNA in milk is reduced if the intake lowers 0.8 times or less in serum than in serum or plasma.
  • the mammal is preferably a human.
  • the microRNA profile is miR-10, miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19, miR-20, miR-21, miR-22, miR-23.
  • the microRNA profile is miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19, miR-20, miR-21, miR-23, miR-24, miR-26. , MiR-27, miR-29, miR-30, miR-33, miR-34, miR-92, miR-93, miR-99, miR-100, miR-101, miR-106, miR-107, miR -125, miR-130, miR-140, miR-141, miR-143, miR-146, miR-155, miR-181, miR-185, miR-186, miR-192, miR-193, miR-195 , MiR-200, miR-205, miR-210, miR-218, miR-219, miR-221, miR-222, miR-223, miR-301, miR-322, miR-340, miR-361, miR -370, miR-429, miR-455, miR-466,
  • the microRNA profile is miR-15, miR-16, miR-19, miR-21, miR-23, miR-24, miR-26, miR-27, miR-30, miR-34. , MiR-99, miR-106, miR-107, miR-125, miR-130, miR-140, miR-181, miR-193, miR-210, miR-222, miR-223, miR-361, miR -370, miR-429, miR-500, miR-532, let-7d, and the amount of microRNA selected from the group consisting of let-7i is a preferred embodiment.
  • the present invention also provides a step of feeding a mammal (excluding humans) a diet or substance identified as increasing or decreasing the abundance of microRNA in the milk of the mammal by the screening method, and A method for producing milk or a dairy product having an immunomodulatory action is provided.
  • the method is characterized in that the immunomodulating action is an immune enhancing action, and the diet or substance has been identified to increase the abundance of the microRNA.
  • the method has one aspect in which the immunomodulating action is an immunosuppressive action, and the diet or substance has been identified as reducing the abundance of the microRNA.
  • the present invention also provides a composition for oral intake having an immunopotentiating action, wherein microRNA is added to the composition base for oral intake.
  • the microRNA is miR-10, miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19, miR-20, miR-21, miR-22, miR. -23, miR-24, miR-25, miR-26, miR-27, miR-28, miR-29, miR-30, miR-31, miR-33, miR-34, miR-92, miR-93 , MiR-96, miR-98, miR-99, miR-100, miR-101, miR-103, miR-106, miR-107, miR-125, miR-126, miR-128, miR-129, miR -130, miR-133, miR-134, miR-139, miR-140, miR-141, miR-143, miR-146, miR-148, miR-151, miR-152, miR-155, miR-181 , MiR-182, miR-183, miR-184, miR-
  • the microRNA is miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19, miR-20, miR-21, miR-23, miR-24. , MiR-26, miR-27, miR-29, miR-30, miR-33, miR-34, miR-92, miR-93, miR-99, miR-100, miR-101, miR-106, miR -107, miR-125, miR-130, miR-140, miR-141, miR-143, miR-146, miR-155, miR-181, miR-185, miR-186, miR-192, miR-193 , MiR-195, miR-200, miR-205, miR-210, miR-218, miR-219, miR-221, miR-222, miR-223, miR-301, miR-322, miR-340, miR -361, miR-370, miR-429, miR-455,
  • the microRNA is miR-15, miR-16, miR-19, miR-21, miR-23, miR-24, miR-26, miR-27, miR-30.
  • MiR-34, miR-99, miR-106, miR-107, miR-125, miR-130, miR-140, miR-181, miR-193, miR-210, miR-222, miR-223, miR -361, miR-370, miR-429, miR-500, miR-532, let-7d, and let-7i are selected as a preferred embodiment.
  • the composition for oral intake is preferably a food for infants or a food for infants.
  • the infant food or infant food is preferably an infant formula or infant formula.
  • the result of the detection of miRNA in human breast milk by microarray analysis is shown.
  • a comparison of miR-181a levels in breast milk during the first 6 months from birth and during the following 6 months is shown.
  • hsa represents a human and cel represents a nematode (Caenorhabditis elegans) (the same applies to the following figures).
  • a comparison of miR-155, miR-17, and miR-92 levels in breast milk during the first 6 months from birth and in subsequent 6 months is shown.
  • a comparison of immune-related miRNA levels in human breast milk and serum is shown.
  • a comparison of miRNA levels before and after freezing and thawing is shown.
  • a comparison of miRNA levels before and after storage at low pH (pH 1) is shown.
  • a comparison of the levels of RNase-treated and untreated miRNA is shown.
  • the method of the present invention provides a diet or substance that increases or decreases the abundance of miRNA in milk by correlating the miRNA profile in the milk of the mammal with a diet ingested by the mammal or a substance contained in the diet.
  • a method for screening a diet or substance that produces breast milk having an immunomodulatory action is provided.
  • the immunomodulating action is an immunopotentiating action, and if the abundance of the microRNA is increased, the diet or substance is determined to produce breast milk having an immunopotentiating action. Yes.
  • the present invention also provides that the immunoregulatory effect is an immunosuppressive effect, and that if the abundance of the microRNA is reduced, the diet or substance is determined to produce breast milk having an immunosuppressive effect. It is as an aspect.
  • the present invention provides a new finding that miRNA is contained in milk, that this miRNA can be stably present even under acidic conditions in the stomach, and that breast milk immunizes the infant who took it.
  • This is based on the idea that an immunomodulatory action can be expected by oral administration of miRNA from the fact that it promotes (for example, Breastfeed. Med, 2 (4): 195-204, 2007).
  • the miRNA profile in milk is based on the prediction that it will be affected by the diet, to identify the diet that can increase or decrease the abundance of miRNA in milk or the active ingredients contained in it. I came up with it.
  • the immunomodulatory action defined by the screening method of the present invention, milk or dairy product, etc. is an action that enhances an immunostimulatory action that functions for the purpose of “protection” against an attack from the outside (immunity enhancing action), and Excessive reactions due to immunity, ie, “enhancement”, can be exemplified by allergic reactions that adversely affect the living body, immunosuppressive effects that function in a suppressive manner against autoimmune diseases, chronic inflammation, and the like.
  • immunosuppressive action and “immunosuppressive action” are relative terms, and when the animal ingests the food or substance, compared to the immunostimulatory action normally possessed by the milk of a mammal. If the action is enhanced, the breast milk has an immune enhancing action, and if it is reduced, the breast milk has an immunosuppressive action. In addition, if the action is enhanced after ingestion, the breast milk of the animal has an immunopotentiating action, and if it is reduced, the mammal has an immunosuppressive action. .
  • the correlation between the miRNA profile in the milk of a mammal and the diet ingested by the mammal or a substance contained in the diet can be examined, for example, as follows.
  • Milk is collected from a mammal ingested and the miRNA profile in the milk is examined.
  • Mammals are not particularly limited, and examples include humans, cows, goats, sheep, pigs, monkeys, dogs, cats, rats, mice, hamsters, guinea pigs and the like. Preferred are humans and cows.
  • the miRNA profile consists of miRNA types and their abundance.
  • miRNA may be one kind or two or more kinds.
  • the type of miRNA is not particularly limited as long as it is present in milk, but miR-10, miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19, miR-20, miR-21 , MiR-22, miR-23, miR-24, miR-25, miR-26, miR-27, miR-28, miR-29, miR-30, miR-31, miR-33, miR-34, miR -92, miR-93, miR-96, miR-98, miR-99, miR-100, miR-101, miR-103, miR-106, miR-107, miR-125, miR-126, miR-128 , MiR-129, miR-130, miR-133, miR-134, miR-139, miR-140, miR-141, miR-143, miR-146, miR-148
  • miR-15 miR-16, miR-17, miR-18, miR-19, miR-20, miR-21, miR-23, miR-24, miR-26, miR- 27, miR-29, miR-30, miR-33, miR-34, miR-92, miR-93, miR-99, miR-100, miR-101, miR-106, miR-107, miR-125, miR-130, miR-140, miR-141, miR-143, miR-146, miR-155, miR-181, miR-185, miR-186, miR-192, miR-193, miR-195, miR- 200, miR-205, miR-210, miR-218, miR-219, miR-221, miR-222, miR-223, miR-301, miR-322, miR-340, miR-361, miR-370, miR-429, miR-455, miR-466, miR-497, miR-500
  • miRNAs that have been reported to have immunomodulatory effects
  • miRNAs that have been confirmed to exist in both rat and bovine colostrum
  • miRNAs that have increased abundance in the colostrum of rats administered bifidobacteria.
  • miRNAs described above miR-15, miR-16, miR-19, miR-21, miR-23, miR-24, miR-26, miR-27, miR-30, miR- 34, miR-99, miR-106, miR-107, miR-125, miR-130, miR-140, miR-181, miR-193, miR-210, miR-222, miR-223, miR-361, miR-370, miR-429, miR-500, miR-532, let-7d, and let-7i.
  • miRNAs whose presence has been confirmed in both rat and bovine colostrum.
  • miRNAs have subtypes, for example, miR-181, miR-92, miR-125, miR-146 etc. are miR-181a, miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-92a, miR-92b, miR-125a, miR-125a-3P, miR-125a-5P, miR-125b, miR-146a, miR-146b, miR-146b-3P, and miR-146b-5P Up to four subtypes are known. Other miRNAs may have a plurality of subtypes, but any subtype may be used in the present invention. Examples of the subtype include those whose presence in milk was confirmed in Examples described later (see Examples 1, 3, 4, and 5).
  • the nucleotide sequences of human miR-155 precursor hsa-mir-155 (MI0000681) and its active site hsa-miR-155 (MIMAT0009241) are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the numbers in parentheses are the accession numbers of the miRNA database (miRBase :: Sequences, http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml) (hereinafter the same).
  • the base sequences of bovine miR-155 precursor hsa-miR-155 (MI0009752) and its active site bta-miR-155 (MIMAT0000646) are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • the base sequences of human miR-181a precursor hsa-mir-181a-1 (MI0000289), hsa-mir-181a-2 (MI0000269) and its active site hsa-miR-181a (MIMAT0000256) are shown in SEQ ID NO: 5, Shown in 6 and 7.
  • the base sequences of human miR-181b precursor hsa-mir-181b-1 (MI0000270), hsa-mir-181b-2 (MI0000683) and its active site hsa-miR-181b (MIMAT0000257) are shown in SEQ ID NO: 8, 9 and 10.
  • bovine miR-181a precursor bta-mir-181a MI0004757
  • bta-mir-181a-1 MI0010484
  • its active site bta-miR-181a MIMAT0003543
  • SEQ ID NOs: 11 12
  • FIG. The base sequences of bovine miR-181b precursor bta-mir-181b-1 (MI0010485), bta-mir-181b-2 (MI0005013), and its active site bta-miR-181b (MIMAT0003793) are represented by SEQ ID NO: 14, Shown in 15 and 16.
  • the nucleotide sequences of human miR-223 precursor hsa-mir-223 (MI0000300) and its active site hsa-miR-223 (MIMAT0000280) are shown in SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively.
  • the base sequences of bovine miR-223 precursor bta-mir-223 (MI0009782) and its active site bta-miR-223 (MIMAT0009270) are shown in SEQ ID NOs: 19 and 20, respectively.
  • the base sequences of human miR-17 precursor hsa-mir-17 (MI0000071) and its active site hsa-miR-17 (MIMAT0000070) (also referred to as hsa-miR-17-5p) are represented by SEQ ID NO: 21 and 22 shows.
  • the base sequences of bovine miR-17 precursor bta-mir-17 (MI0005031) and its active site bta-miR-17-5p (MIMAT0003815) and bta-miR-17-3p (MIMAT0003816) are respectively represented by SEQ ID NO: 23, 24 and 25.
  • the base sequences of human miR-92a precursor hsa-mir-92a-1 (MI0000093), hsa-mir-92a-2 (MI0000094), and its active site hsa-miR-92a (MIMAT0000092) are represented by SEQ ID NO: 26, 27 and 28.
  • the nucleotide sequences of human miR-92b precursor hsa-mir-92b (MI0003560) and its active site hsa-miR-92b (MIMAT0003218) are shown in SEQ ID NOs: 29 and 30, respectively.
  • nucleotide sequences of bovine miR-92 precursor bta-mir-92 (MI0005024) and its active site bta-miR-92 (MIMAT0003808) are shown in SEQ ID NOs: 31 and 32, respectively.
  • the nucleotide sequences of bovine miR-92a precursor bta-mir-92a (MI0009905) and its active site bta-miR-92a (MIMAT0009383) are shown in SEQ ID NOs: 33 and 34, respectively.
  • bovine miR-92b precursor bta-mir-92b MI0009906
  • its active site bta-miR-92b MIMAT0009384
  • the nucleotide sequences of human let-7i precursor hsa-let-7i (MI0000434) and its active site hsa-let-7i (MIMAT0000415) are shown in SEQ ID NOs: 37 and 38, respectively.
  • the base sequences of bovine let-7i precursor bta-let-7i (MI0005065) and its active site bta-let-7i (MIMAT0003851) are shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively.
  • the nucleotide sequences of human miR-125a precursor hsa-mir-125a (MI0000469), its active site hsa-miR-125a-5p (MIMAT0000443), and hsa-miR-125a-3p (MIMAT0004602) are respectively represented by SEQ ID NO: 41 , 42 and 43.
  • the base sequences of human miR-125b precursor hsa-mir-125b-1 (MI0000446), hsa-mir-125b-2 (MI0000470), and the active site hsa-miR-125b (MIMAT0000423) are represented by SEQ ID NO: 44, 45 and 46.
  • bovine miR-125a precursor bta-mir-125a MI0004752
  • its active site bta-miR-125a MIMAT0003538
  • SEQ ID NOs: 47 and 48 respectively.
  • the base sequences of bovine miR-125b precursor bta-mir-125b-1 (MI0004753), bta-mir-125b-2 (MI0005457), and its active site bta-miR-125b (MIMAT0003539) are represented by SEQ ID NO: 49, 50 and 51.
  • the nucleotide sequences of human miR-146a precursor hsa-mir-146a (MI0000477) and its active site hsa-miR-146a (MIMAT0000449) are shown in SEQ ID NOs: 52 and 53, respectively.
  • Human miR-146b precursor hsa-mir-146b (MI0003129) and its active site hsa-miR-146b-5p (MIMAT0002809) (also referred to as hsa-miR-146b), and hsa-miR-146b-3p The base sequences of MIMAT0004766) are shown in SEQ ID NOs: 54, 55 and 56, respectively.
  • bovine miR-146a precursor bta-mir-146a MI0009746
  • its active site bta-miR-146a MIMAT0009236
  • SEQ ID NOs: 57 and 58 The base sequences of bovine miR-146a precursor bta-mir-146a (MI0009746) and its active site bta-miR-146a (MIMAT0009236) are shown in SEQ ID NOs: 57 and 58, respectively.
  • the nucleotide sequences of bovine miR-146b precursor bta-mir-146b (MI0009745) and its active site bta-miR-146b (MIMAT0009235) are shown in SEQ ID NOs: 59 and 60, respectively.
  • the nucleotide sequences of human miR-150 precursor hsa-mir-150 (MI0000479) and its active site hsa-miR-150 (MIMAT0000451) are shown in SEQ ID NOs: 61 and 62, respectively.
  • the nucleotide sequences of bovine miR-150 precursor bta-mir-150 (MI0005058) and its active site bta-miR-150 (MIMAT0003845) are shown in SEQ ID NOs: 63 and 64, respectively.
  • miRNAs confirmed to exist in rat or bovine milk, and miRNAs of other animals corresponding to those miRNAs are shown in Tables 1 to 10.
  • the miRNA is not limited to those having the above-described sequences, and may be one or several nucleotide substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as long as it can control the miRNA function, that is, target gene expression. Etc. may be included. Specific examples include RNA having a base sequence having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the above sequence.
  • the amount of miRNA present may be an absolute amount or a relative amount.
  • the relative amount may be a relative amount with respect to the average abundance in the animal, or may be a relative amount of the abundance after ingestion with respect to the abundance before intake of food.
  • a method usually used for measuring the amount of miRNA can be employed, and examples thereof include quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR).
  • the miRNA amount can also be measured by a microarray method.
  • a method usually used for miRNA extraction can be employed, and a commercially available miRNA isolation kit can also be used.
  • the abundance of miRNA in milk can also be indirectly measured by measuring the expression level of miRNA in breast cells.
  • the correlation between the miRNA profile in the milk of the mammal and the food ingested by the mammal or a substance contained in the food is examined.
  • the correlation between the miRNA profile in the milk of a mammal and the diet ingested by the mammal or the substance contained in the diet refers to the correlation between the miRNA profile and the presence or absence or amount of the substance. For example, if the abundance of one or more miRNAs in milk is higher or lower when the substance is ingested than when the animal does not ingest the substance, the substance and miRNA profile are: Each has a positive or negative correlation. In addition, if the intake of a substance does not affect the miRNA profile, the substance and the miRNA profile do not correlate.
  • the miRNA profiles contained in each milk before and after the intake of the diet are compared, and at least one, preferably two or more, more preferably five or more miRNAs after intake compared to before intake. If the abundance is high, it is determined that the diet increases the abundance of miRNA in milk.
  • the miRNA profiles contained in each milk before and after the intake of the diet are compared, and the abundance of at least one, preferably two or more, more preferably five or more miRNAs after intake is lower than before intake.
  • the diet is determined to reduce the abundance of miRNA in milk.
  • measurement of the miRNA profile before food intake is not essential, and the abundance of food and miRNA can also be determined by comparing the miRNA profile after food intake with the average miRNA profile of the target mammal previously measured. The correlation with can be investigated.
  • the miRNA profile in milk is compared with the miRNA profile in serum or plasma, and the abundance of miRNA contained in both milk and serum or plasma is determined by ingestion of the diet. If it is higher in milk than in serum or plasma, it is determined to increase the amount of miRNA present in milk.
  • the degree to which the amount of miRNA present in milk is higher than that in serum or plasma is, for example, 1.2 times or more, preferably 2 times or more, more preferably 5 times or more, and even more preferably 10 times or more.
  • the miRNA profile in milk is compared with the miRNA profile in serum or plasma, and the abundance of miRNA contained in any of milk, serum or plasma is increased in serum or If it is lower in milk than in plasma, it is determined to reduce the amount of miRNA present in milk.
  • the degree of miRNA abundance reduction in milk compared to serum or plasma is, for example, 0.8 times or less, preferably 0.5 times or less, more preferably 0.2 times or less, and even more preferably 0.8. 1 time or less.
  • the diet may be a single substance or a composition as long as it can be taken orally. Moreover, before or after ingestion of food, it may be before or after the intake of a single meal, or may be before or after the intake of a plurality of meals. In addition, multiple intakes of food may be multiple intakes of the same diet, or two or more types of intake of food.
  • Food intake may be performed systematically or freely. In the latter case, in humans, the correlation between the miRNA profile in the diet and milk can be examined by listening to the content of the ingested diet.
  • the diet may be a normal diet, or a diet obtained by adding a test substance to a normal diet. There are no particular restrictions on the amount of food intake, the time of intake, the number of intakes, and the like.
  • a diet that increases the abundance of miRNA in milk is selected, a substance that increases the abundance of miRNA in milk contained in the diet can be identified in the same manner as described above.
  • a diet that reduces the abundance of miRNA in milk is selected, a substance that reduces the abundance of miRNA in milk contained in the diet can be identified in the same manner as described above.
  • a diet that increases or decreases the abundance of miRNA in milk can be designed. That is, a diet that increases the abundance of miRNA in milk or a substance contained in it is suitable for the production of milk having an immunopotentiating effect, and a diet that reduces the abundance of miRNA in milk or a substance contained in it. It is considered unsuitable for the production of milk having an immunopotentiating action.
  • a diet that reduces the abundance of miRNA in milk or a substance contained therein is suitable for the production of milk having an immunosuppressive effect
  • a diet that increases the abundance of miRNA in milk or a substance contained therein is It is considered unsuitable for the production of milk having an immunosuppressive action.
  • a diet or substance that produces breast milk having an immunomodulating action or a diet or substance that is inappropriate for the production of breast milk having an immunomodulating action can be screened.
  • the presence of various miRNAs was confirmed in rat and bovine colostrum. This supports the idea of the present invention that an immunomodulatory action can be expected by oral administration of miRNA.
  • Bifidobacterium Bifidobacterium longum
  • the abundance of 52 types of miRNAs increased.
  • Bifidobacteria have a probiotic function, and are particularly known to have an immunomodulatory action. Therefore, the fact that the abundance of miRNA in milk was increased by administration of bifidobacteria also supports that miRNA in milk is involved in immune regulation.
  • the increase in the amount of miRNA present in milk by bifidobacteria administration that is, the correlation between the bifidobacteria and the miRNA profile, indicates that the screening method of the present invention can be carried out.
  • miRNAs whose abundance in milk was not changed by administration of bifidobacteria, but the possibility that the abundance of these miRNAs is increased by other diets or substances contained therein is not denied.
  • Probiotic functions of bifidobacteria include respiratory tract infection, acute infectious diarrhea, antibacterial drug-related diarrhea, Clostridium difficile-related diarrhea, necrotizing enterocolitis, traveler diarrhea, and Helicobacter pylori infection Prevention or remission of diseases etc. is known (The Jounal of Nutirition, 2010 Mar; 140 (3): 698S-712S. Epub 2010 Jan 27.). It is suggested that miRNAs whose abundance in milk is increased by administration of bifidobacteria exhibit not only immune regulation but also functions similar to the above-mentioned probiotic functions in animals that ingest them.
  • Milk having an immunopotentiating action or an immunopotentiating action is obtained by feeding a mammal a diet or substance that increases the abundance of miRNA in milk selected as described above and collecting milk from the animal. Increased milk is obtained. In addition, by reducing or avoiding the intake of mammals by a diet or substance that reduces the abundance of miRNA in milk selected as described above, the immune enhancement effect of milk is increased, or Decline can be prevented.
  • intake of a diet or substance that increases the abundance of miRNA in milk may be combined.
  • milk having an immunosuppressive effect or immune enhancement is obtained by feeding a mammal a diet or substance that reduces the abundance of miRNA in milk selected as described above and collecting milk from the animal. Milk with reduced action is obtained.
  • the immunosuppressive action of milk is increased or the immunopotentiating action is enhanced.
  • the intake of a diet or substance that reduces the abundance of miRNA in milk and the reduction or avoidance of the intake of a diet or substance that enhances the abundance of miRNA in milk may be combined.
  • a milk product having an immunomodulatory action can be produced by processing the milk having an immunomodulatory action obtained as described above.
  • the dairy product is not particularly limited as long as miRNA can exist while maintaining its function, and examples thereof include processed milk, prepared milk, milk beverage, prepared milk powder, fermented milk, cream, butter, cheese, and ice cream.
  • dairy products dairy products for infants or infants are preferred.
  • miRNAs particularly miRNAs known to be involved in immune enhancement such as immune development, antiallergy, anti-inflammation, infection protection, etc. are present in milk.
  • breast milk has an immune enhancing effect on infants who take it. Therefore, it is reasonably expected that miRNAs involved in immune regulation can regulate the immunity of animals such as humans taken orally. Since miRNA is a substance that regulates the expression of various genes, the significance of transferring such regulatory molecules from the mother to the infant is considered to be very significant, especially for infants with an underdeveloped immune mechanism.
  • Another embodiment of the present invention is a composition for oral intake having an immunopotentiating action, in which miRNA is added to the composition base for oral intake.
  • the miRNA includes miR-10, miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19, miR-20, miR-21, miR-22, miR-23, miR-24, miR -25, miR-26, miR-27, miR-28, miR-29, miR-30, miR-31, miR-33, miR-34, miR-92, miR-93, miR-96, miR-98 , MiR-99, miR-100, miR-101, miR-103, miR-106, miR-107, miR-125, miR-126, miR-128, miR-129, miR-130, miR-133, miR -134, miR-139, miR-140, miR-141, miR-143, miR-146, miR-148, miR-151, miR-152, miR-155, miR-181, miR-182, miR-183 , MiR-184, miR-185, miR-186, mi
  • miRNA may be one kind or any two or more kinds.
  • the composition base for oral ingestion is not particularly limited as long as it can be taken orally administered and can be present while miRNA remains functioning, and includes foods, beverages, pharmaceutical bases, feeds, etc. It is done.
  • Foods include beverages regardless of properties. Examples of food include adult food, infant food, infant food, and the like.
  • Examples of adult foods include liquid foods such as enteral nutrients and concentrated liquid foods, and nutritional supplements.
  • infant foods or infant foods include formulas such as formulas for infants, formulas for low birth weight infants, follow-up formulas, formulas for allergic diseases, lactose-free milk, inborn errors of metabolism. And the like, or these powdered milk), powder added to breast milk or prepared milk powder, baby food, and the like.
  • formula milk is a food produced by using milk or dairy products as the main ingredient and added with nutrients necessary for infants and infants, and is mainly used as a substitute for breast milk in the infancy. In the early childhood, it is used as a food that plays a complementary role in breast milk replacement or nutrition intake, and for the purpose of contributing to nutrition intake suitable for infants with certain congenital or acquired diseases.
  • the food to be manufactured is exemplified.
  • MiRNA is relatively resistant to freezing and thawing, low pH, acidic conditions such as pH 1 and RNases such as RNase A and RNase T, and is suitable as an active ingredient added to foods.
  • the stability at low pH suggests that miRNA molecules are resistant to the infant's gastric environment and can be absorbed by the intestinal tract, one of the baby's major immune organs. Can have an effect.
  • storage, freezing and thawing of breast milk do not denature the miRNA, which is nutritionally important for low birth weight infants and hospitalized infants who are usually fed cryopreserved breast milk.
  • the resistance to RNase suggests that miRNAs may be present in complexes such as exosomes and microvesicles in breast milk.
  • breast milk-derived exosomes increase the number of Foxp3 + CD4 + CD25 + regulatory T cells. If immune-related miRNA is contained in breast milk exosomes, it may contribute to an increase in Foxp3 + CD4 + CD25 + regulatory T cells in the infant gastrointestinal tract. This is because immune-related miRNAs detected in breast milk such as miR-181a and miR-181b are highly expressed and are involved in T cell differentiation. Furthermore, miR-181 and miR-155 that were abundantly contained in breast milk were known to induce B cell differentiation, and miR-150 that suppresses B cell differentiation was hardly found in breast milk. Thus, miRNA in breast milk may induce B cell differentiation.
  • the content of miRNA in the composition is not particularly limited and may be appropriately selected, but in total, for example, 10 to 10,000 ng / ml, preferably 20 to 10,000 ng / ml, more preferably 50 to 10, 000 ng / ml.
  • the total amount of miRNA intake is, for example, 5 ⁇ g to 120 mg / day, preferably 10 ⁇ g to 120 mg / day, more preferably 25 ⁇ g to 120 mg / day.
  • miRNA can be obtained by preparing a partial double-stranded RNA that is a precursor (pri-miRNA) and cleaving it with a Dicer enzyme.
  • a commercially available Dicer enzyme can be used.
  • the double-stranded RNA can be prepared, for example, by an RNA polymerase reaction using a double-stranded DNA having a complementary sequence as a template.
  • Double-stranded DNA can be prepared by amplifying by PCR using a mammalian chromosomal DNA as a template and a primer designed to amplify the miRNA sequence.
  • MiRNA is obtained by cleaving the double-stranded RNA obtained as described above with a Dicer enzyme or the like.
  • MiRNA can also be produced by chemical synthesis. That is, miRNA is obtained by synthesizing a sense strand and an antisense strand and annealing them. Alternatively, a double-stranded RNA that produces a target miRNA by a mammalian endogenous Dicer enzyme may be added to the composition for oral consumption.
  • composition for oral intake of the present invention is a medicine
  • it can be produced by combining miRNA with a pharmaceutically acceptable pharmaceutical carrier for oral administration.
  • the pharmaceutical preparation form is not particularly limited, and examples thereof include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, syrups and the like.
  • additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, surfactants, and the like that are commonly used in ordinary pharmaceuticals can be used as oral formulation carriers. .
  • miRNA may be used in combination with other drugs having an immunomodulating action.
  • the amount of miRNA contained in the medicine is not particularly limited and may be appropriately selected. In total, for example, 2 ⁇ g / kg to 2 mg / kg, preferably 4 ⁇ g / kg to 2 mg / kg, more preferably 10 ⁇ g / kg to 2 mg / kg.
  • the composition for ingestion is a food
  • it can be used for various purposes such as utilizing an immune enhancing action.
  • uses such as foods suitable for people with reduced resistance, foods and drinks useful for reducing / removing risk factors for various diseases caused by reduced immunity.
  • the food and drink of the present invention can be sold as a food or the like with a label indicating that it is used for immune regulation.
  • the “display” means all acts for informing the consumer of the use, and if it is a display that can recall and analogize the use, the purpose of the display, the content of the display, the display Regardless of the target object / medium, etc., all fall under the “display” of the present invention. However, it is preferable to display in such an expression that the consumer can directly recognize the application.
  • the act of describing the above-mentioned use in the product relating to the food of the present invention or the packaging of the product the thing describing the above-mentioned use in the packaging of the product or the product, transferred, and exhibited for delivery, transfer or delivery , Importing, displaying advertisements related to products, price lists or transaction documents for display or distribution, or describing the above uses in information containing these contents by electromagnetic (Internet etc.) methods
  • the act to provide etc. can be illustrated.
  • the display is preferably a display approved by the government or the like (for example, a display which is approved based on various systems determined by the government and is performed in a mode based on such approval). Display on advertising materials at sales sites such as catalogs, pamphlets, and POPs, and other documents is preferable.
  • indications such as health foods, functional foods, enteral nutrition foods, special-purpose foods, nutritional functional foods, quasi-drugs, and other indications approved by the Ministry of Health, Labor and Welfare, for example, , Foods for specified health use, and labeling approved under a similar system.
  • Examples of the latter can include a display as a food for specified health use, a display as a condition specific food for specified health use, a display that affects the structure and function of the body, a display for reducing disease risk, etc.
  • the display can be listed as a typical example.
  • Example 1 Analysis of miRNA in breast milk Human breast milk is centrifuged at 2,000 xg for 10 minutes to remove cells and large residues, and the supernatant other than lipids on the surface layer is further removed at 12,000 x g for 30 minutes. Cell debris and small debris were removed by centrifugation. Total RNA was extracted from the supernatant using mirVana miRNA isolation kit according to the manufacturer's protocol. RNA extraction from serum was performed in the same manner as breast milk.
  • MiRNA was detected using a microarray analysis system (made by Agilent). The expression level of miRNA was analyzed using GeneSpring GX11.0 (manufactured by Agilent). The result is shown in FIG. As a result, miR-181a, miR-181b, miR-155, miR-125b, miR-146b, miR-223, and let-7i were remarkably detected. MiR-150 controlling T cells and B cells could not be detected. Moreover, a plurality of organ-specific miRNAs such as miR-122 (liver), miR-216, miR-217 (pancreas), miR-142-5p, miR-142-3p (hematopoietic cells) were hardly detected. A small amount of miR-124 (brain) was detected.
  • FIG. 3 shows the results of the same analysis for miR-155, miR-17, and miR-92a.
  • cel-miR-39 (synthesized by Qiagen), a synthetic miRNA of Caenorhabditis elegans, was denatured and added to the sample (total amount)
  • the amount of miRNA was shown as a relative amount to cel-miR-39 (so that the oligonucleotide was 25 fmol per 5 ml) (the same applies to the following experiments).
  • the profile of miRNA in breast milk is different from that in serum.
  • miR-223 a miRNA that regulates granulocytes, is most highly present in normal human serum and plasma, but the expression level in breast milk was very low compared to serum.
  • miR-146b which is not abundant in serum, was abundant in breast milk.
  • miR-181 and miR-155 which were abundant in breast milk, were similar to the expression level in serum. It is interesting that multiple immunity-related miRNAs were highly expressed in breast milk 6 months after parturition before the intake of weaning food.
  • miRNA is a “genetic material” that can be transferred from mother to child. It is calculated that approximately 0.15 pg / L / day (1.3 x 10 7 copies / L / day) of miR-181 is taken by an infant via breast milk.
  • miRNA profiles were similar between breast milk of different mothers.
  • the primers used in TaqMan qRT-PCR were the following Assay IDs manufactured by Applied Biosystems. ⁇ MiR-181a: 000480 ⁇ MiR-21: 000397 ⁇ Cel-miR-39: 000200 miRNA has been shown to be relatively stable to freeze-thaw, low pH, and RNase.
  • Bifidobacterium longum BB536 ATCC BAA-999
  • RNA sample 100 ng was detected using a microarray analysis system (manufactured by Agilent) according to a conventional method. The results were analyzed using GeneSpring GX11.0 (manufactured by Agilent).
  • microRNAs When the microarray data was subjected to statistical analysis using GeneSpring® GX11.0, the total number of microRNAs whose expression was confirmed in the detected test group and control group was 155. These microRNAs are as follows. In addition, miR-150 was not detected.
  • miRNA whose expression was confirmed in the test group and the control group: 155 species] miR-16, miR-17-5p, miR-18 (miR-18a), miR-19 (miR-19b), miR-20 (miR-20a), miR-21, miR-23 (miR-23a), miR-27 (miR-27a, miR-27b), miR-29 (miR-29a, miR-29b, miR-29c, miR-29c *), miR-30 (miR-30a, miR-30c, miR-30d) , MiR-30e *), miR-33, miR-34b, miR-92a, miR-93, miR-100, miR-101 (miR-101a, miR-101b), miR-106b, miR-130b, miR- 140 *, miR-141, miR-143, miR-146a, miR-185, miR-186, miR-192, miR-193, miR-16
  • miR-16 miR-17-5p, miR-18 (miR-18a), miR-19 (miR-19b), miR-20 (miR-20a), miR-21, miR-23 (miR-23a), miR-27 (miR-27a, miR-27b), miR-29 (miR-29a, miR-29b, miR-29c, miR-29c *), miR-30 (miR-30a, miR-30c, miR-30d) , MiR-30e *), miR-33, miR-34b, miR-92a, miR-93, miR-100, miR-101 (miR-101a, miR-101b), miR-106b, miR-130b, miR- 140 *, miR-141, miR-143, miR-146a, miR-185, miR-186, miR-192
  • Example 4 Detection of microRNA expressed in rat colostrum Three rats of the F344 strain on the 14th day of pregnancy were purchased. All purchased rats were born on the 21st day of pregnancy, and milked under ether anesthesia on the second day after delivery to collect colostrum. Each colostrum sample was centrifuged twice at 1,200 ⁇ g and 4 ° C. for 10 minutes to remove the fat layer and cell debris. Subsequently, centrifugation was performed at 21,500 ⁇ g, 4 ° C. for 40 minutes, and further under the same conditions for 1 hour to obtain whey after removing the casein portion. Total RNA was obtained from the obtained whey sample using miRNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • RNA sample 100 ng was subjected to a microarray (manufactured by Agilent) experiment according to a conventional method.
  • the results of the microarray experiment were analyzed using GeneSpring GX11.0 (manufactured by Agilent).
  • microRNAs As a result, in addition to the 155 types of microRNAs confirmed in Example 3, four types of microRNAs (miR-193 *, miR-409-3p, miR-664, miR-877) are expressed. Was confirmed.
  • Example 5 Detection of microRNA expressed in bovine colostrum From 5 Holstein cows, milk samples from day 1 to day 3 were prepared as colostrum samples. In addition, milk samples from the 8th day to the 8th month after delivery were prepared as regular milk samples. The milk (colostrum, normal milk) sample was centrifuged twice at 1,200 ⁇ g and 4 ° C. for 10 minutes to remove the fat layer and cell debris. Subsequently, centrifugation was performed at 21,500 ⁇ g, 4 ° C. for 40 minutes, and further under the same conditions for 1 hour to obtain whey after removing the casein portion.
  • RNA was obtained from the obtained whey sample using miRNeasy Mini Kit (Qiagen). Using 20 ng of the obtained RNA sample, it was subjected to a microarray (manufactured by Agilent) experiment according to a conventional method. The results of the microarray experiment were analyzed using GeneSpring GX11.0 (manufactured by Agilent).
  • a total of 102 types of miRNA expression were confirmed from the colostrum sample and the normal milk sample.
  • 49 types were confirmed to be expressed only in colostrum.
  • the 49 types of microRNAs whose expression was confirmed only in the colostrum sample are shown below.
  • let-7d let-7i, miR-15a, miR-15b, miR-16b, miR-17-3p, miR-19b, miR-21, miR-23b-3p, miR-24-3p, miR-26b, miR-27b, miR-30a-5p, miR-30c, miR-30f, miR-34a, miR-99a, miR-106, miR-106b, miR-107, miR-125b, miR-126, miR-129- 3p, miR-130a, miR-130b, miR-140, miR-155, miR-181b, miR-184, miR-193a-3p, miR-193a-5p, miR-196a, miR-210, miR-222, miR-223, miR-338, miR-361, miR-362-5p, miR-370, miR-429, miR-452, miR-486, miR-210, miR-222, miR-223, miR-338, miR
  • the present invention it is possible to screen a diet or a component contained therein that produces milk having an immunomodulatory action.
  • the present invention also provides a method for producing a dairy product having an immunomodulatory action.
  • the composition for oral intake of the present invention has an immune enhancing action and is particularly useful for infants.

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Abstract

免疫調節作用を有する乳を産生する食品のスクリーニング法、及び免疫調節作用を有する新規な食品並びにその製造方法を提供する。哺乳動物の乳中のマイクロＲＮＡプロファイルと、該哺乳動物が摂取した食餌又は該食餌に含まれる物質との相関を指標として、乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加又は低下させる食餌又は物質を同定することにより、免疫調節作用を有する母乳を産生する食餌又は物質をスクリーニングする。

Description

免疫調節作用を有する乳を産生する食餌のスクリーニング法
　本発明は、免疫調節作用を有する乳を産生する食餌のスクリーニング法に関するものであり、食品、飼料分野等において有用である。
　生体の免疫は、生来は外来からの攻撃に対して「防御」の目的で機能する。例えば、感染防御や癌細胞の除去が『防御』であり、この場合は免疫の増強が有効に作用している。
　一方で、免疫による過剰反応、すなわち『亢進』が生体に悪影響を及ぼす場合もある。この例としては、アレルギー反応や自己免疫疾患、慢性炎症等が挙げられる。この場合、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１等の炎症性サイトカインの産生を抑制することによって、症状の改善がみられることが知られている。
　そして、このような外来からの攻撃に対して「防御」の目的で機能する免疫増強作用や、過剰な免疫反応によるアレルギー反応や自己免疫疾患、慢性炎症等に対して抑制的に機能する免疫抑制作用は、マイクロＲＮＡ（以下、「miRNA」とも記載する。）の制御を受けることが明らかになってきている。
　miRNAは、ゲノムから転写された後、二度の切断を受け、約22ベースの非翻訳小分子RNAとなる。その機能として、標的mRNAの3'非翻訳領域に配列相補的に結合し、その標的mRNAの翻訳を抑制することが知られている。１種類のmiRNAが、細胞内における複数のmRNAの翻訳を阻害することにより、細胞の様々な機能を制御する。特にがんの発生や進展に関わる報告が多数なされており、miRNAと疾患との関わりが注目されている。
　例えば、miR-181については、Ｂ細胞の発達、及びＴ細胞の活性化等、免疫発達に関与することが報告されている（非特許文献１～３）。
　miR-155については、自然免疫系の活性化（非特許文献１、４）、及び、Ｔ細胞及びＢ細胞の分化・機能制御（非特許文献１、５）を通じて免疫発達に関与し、また、Th1/Th2バランス制御（非特許文献１、６）、及び、過剰な免疫反応を抑制する制御性T細胞の機能維持（非特許文献７）を通じて抗アレルギー、抗炎症に関与することが知られている。
　miR-17及びmiR-92は協調して、Ｂ細胞及びＴ細胞の分化・発達を制御することによって（非特許文献１、８、９）、免疫発達に関与する。
　miR-223は、好中球の増殖・活性化を抑制することによって（非特許文献１、１０）、miR-150は、Ｂ細胞分化を抑制することによって（非特許文献１、１１）、let-7iは、胆管細胞のTLR4発現を制御することによって（非特許文献１２）、それぞれ感染防御に関与することが知られている。
　miR-125は、TNF-αの産生を抑制することによって、抗炎症に関与することが知られている（非特許文献１、１３）。
　miR-146は、自然免疫系を負に制御することによって感染防御に関与し（非特許文献１、１４）、また、Th1/Th2バランスを制御することによって抗アレルギーに関与すること（非特許文献１５）が、知られている。
　最近、翻訳制御分子として細胞内で働くmiRNAが、エクソソームと呼ばれる脂質二重膜内に存在し、細胞外に分泌されることが報告された（非特許文献１６）。分泌されたmiRNAは、他の細胞に取り込まれることも確認されたことから、miRNAを介した細胞間相互作用の存在が提示された。一方エクソソームは、様々なヒトの体液中に存在することが知られている。特に人の血漿や血清中ではmiRNAの存在がすでに報告されており、前立腺がんや子宮がんにおけるバイオマーカーとして用いられる可能性が示唆されている（非特許文献１７）。
　エクソソームが存在する体液には、血漿や血清の他に、唾液、尿、羊水そして母乳がある（非特許文献１７）。この中で母乳は、哺乳動物にとって特定の時期に作られる体液であり、母体から子供という個体間における物質の移動を担っている。また母乳は、子供に対する栄養補給の他に、母体が獲得した免疫物質を子供に与えている。
　母乳中には分泌型IgA、ラクトフェリン、リゾチーム、サイトカインなどが存在し、乳児を感染から守るとともに、乳児の免疫発達を促していると考えられている（非特許文献１９）。実際、母乳で育った子供は、そうでない子供に比べて、気管支や腸管における感染のリスクが低いことが知られている。母乳には抗菌作用を示すIgAやラクトフェリン、糖蛋白質や糖脂質などが存在する他、免疫細胞を制御するサイトカインなども含まれている。しかし、これまでの研究で解析されていた対象は、主に母乳中に含まれている蛋白質に対するものであり、核酸に係る報告はあるものの、特定の配列を有する核酸に関わる研究は報告されていない。
　また、シクロオキシゲナーゼ－２の発現により調節される乳腺細胞の発達が、miR-101aにより制御されることが知られている（非特許文献２０）。しかし、miRNAが乳中に存在することを示唆するものではない。
　尚、本願優先日後に、ウシ乳由来の微小胞（microvesicle）にマイクロＲＮＡが存在していること（特許文献２１）、及び、授乳期の異なるウシの生乳、市販の液乳又は粉乳中のマイクロＲＮＡが同定されたこと（特許文献２２）が報告されている。
Lindsay, M. A., Trends Immunol, 29: 343-351, 2008 Li, Qi-Jing et al., Cell, 129: 147-161, 2007 Chen, Chang-Zheng et al., Science, 303: 83-86, 2004 O'Connel, R. M. et al., PNAS, 104(5): 1604-1609, 2007 Vigorito, E. et al., Immunity, 27: 847-859, 2007 Rodriguez, A. et al., Science, 316: 608-611, 2007 Kohlhaas, S. et al., J. Immunol., 182: 2578-2582, 2009 Koralov, S. B. et al., Cell, 132: 860-874, 2008 Xiao, C. et al., Nat. Immunol., 9: 405-414, 2008 Jonathan, B. et al., Nature, 451: 1125-1129, 2008 Zhou, B. et al., PNAS, 104(17): 7080-7085, 2007 Chen, Xian-Ming et al., J. Biol. Chem., 282(39): 28929-28938, 2007 Tili, E. et al., J. Immunol., 179: 5082-5089, 2007 Taganov, K. D. et al., PNAS, 103(33): 12481-12486, 2006 Monticelli, S. et al., Genome Biol., 6, R71, 2005 Valadi, H. et al., Nat. Cell Biol., 9: 654-659, 2007 Gilad, S. et al., PLoS One, 3(9): e3148, 2008 Admyre, C. J. Immunol., 179: 1969-1978, 2007 Goldman, A. S., Breastfeed. Med., 2(4): 195-204, 2007 Tanaka, T. et al., Differentiation, 77: 181-187, 2009 Hata, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 396(2): 528-533, 2010 Chen, X. et al., Cell Research, (2010):1-10
　本発明は、免疫調節作用を有する乳を産生する食餌のスクリーニング法、及び免疫調節作用を有する新規な食品並びにその製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、母乳が乳児の免疫系成熟に影響を及ぼすことに着目して研究を進めた結果、母乳に免疫関連miRNAが高発現していることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、哺乳動物の乳中のマイクロＲＮＡプロファイルと、該哺乳動物が摂取した食餌又は該食餌に含まれる物質との相関を指標として、乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加又は減少させる食餌又は物質を同定することを含む、免疫調節作用を有する母乳を産生する食餌又は物質のスクリーニング方法を提供する。
　前記方法は、前記免疫調節作用が免疫増強作用であって、前記マイクロＲＮＡの存在量が増加すれば、前記食餌又は物質は免疫増強作用を有する母乳を産生させると判定されることを一態様としている。
　前記方法は、前記食餌の摂取前後の各々の乳中に含まれるマイクロＲＮＡプロファイルを比較し、摂取前に比べて摂取後に少なくとも一種のマイクロＲＮＡの存在量が高ければ、前記食餌は乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加させると判定されることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、乳中のマイクロＲＮＡプロファイルと、血清中又は血漿中のマイクロＲＮＡプロファイルとを比較し、乳中と血清中又は血漿中のいずれにも含まれるマイクロＲＮＡの存在量が、前記食餌の摂取により血清中又は血漿中よりも乳中の方が１．２倍以上高まれば、乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加させると判定されることを好ましい態様としている。
　また、本発明の方法は、前記免疫調節作用が免疫抑制作用であって、前記マイクロＲＮＡの存在量が低下すれば、前記食餌又は物質は免疫抑制作用を有する母乳を産生させると判定されることを他の態様としている。
　前記方法は、前記食餌の摂取前後の各々の乳中に含まれるマイクロＲＮＡプロファイルを比較し、摂取前に比べて摂取後に少なくとも一種のマイクロＲＮＡの存在量が低ければ、前記食餌は乳中のマイクロＲＮＡの存在量を低下させると判定されることを好ましい態様としている。
　前記方法は、乳中のマイクロＲＮＡプロファイルと、血清中又は血漿中のマイクロＲＮＡプロファイルとを比較し、乳中と血清中又は血漿中のいずれにも含まれるマイクロＲＮＡの存在量が、前記食餌の摂取により血清中又は血漿中よりも乳中の方が０．８倍以下低下すれば、乳中のマイクロＲＮＡの存在量を低下させると判定されることを好ましい態様としている。
　また前記方法は、前記哺乳動物がヒトであることを好ましい態様としている。
　また前記方法は、前記マイクロＲＮＡプロファイルが、miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、le-7e、let-7f、及び、let-7iからなる群から選ばれるマイクロＲＮＡの存在量であることを好ましい態様としている。
　また前記方法は、前記マイクロＲＮＡプロファイルが、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30 、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d、及び、let-7iからなる群から選ばれるマイクロＲＮＡの存在量であることを好ましい態様としている。
　また前記方法は、前記マイクロＲＮＡプロファイルが、miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d、及び、let-7iからなる群から選ばれるマイクロＲＮＡの存在量であることを好ましい態様としている。
　また本発明は、前記スクリーニング方法により哺乳動物の乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加又は低下させると同定された食餌又は物質を、哺乳動物（ヒトを除く）に摂取させる工程、及び、同動物の乳を採取する工程を含む、免疫調節作用を有する乳又は乳製品の製造方法を提供する。
　前記方法は、前記免疫調節作用が免疫増強作用であって、かつ、前記食餌又は物質は前記マイクロＲＮＡの存在量を増加させると同定されたものであることを一態様としている。
　また前記方法は、前記免疫調節作用が免疫抑制作用であって、かつ、前記食餌又は物質は前記マイクロＲＮＡの存在量を低下させると同定されたものであることを一態様としている。
　本発明はまた、マイクロＲＮＡが経口摂取用組成物基剤に添加された、免疫増強作用を有する経口摂取用組成物を提供する。
　前記経口摂取用組成物は、前記マイクロＲＮＡが、miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、le-7e、let-7f、及び、let-7iからなる群から選ばれることを好ましい態様としている。
　また、前記経口摂取用組成物は、前記マイクロＲＮＡが、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30 、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d、及び、let-7iからなる群から選ばれることを好ましい態様としている。
　また、前記経口摂取用組成物は、前記マイクロＲＮＡが、miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d、及び、let-7iからなる群から選ばれることを好ましい態様としている。
　また前記経口摂取用組成物は、乳児用食品又は幼児用食品であることを好ましい態様としている。
　また前記乳児用食品又は幼児用食品は、乳児用調製乳又は幼児用調製乳であることを好ましい態様としている。
マイクロアレイ解析によるヒト母乳中のmiRNAの検出の結果を示す。 出生から最初の６ヶ月間、及びその後の６ヶ月間の母乳中のmiR-181aのレベルの比較を示す。hsaはヒトを、celは線虫（Caenorhabditis elegans）を表す（以下の図でも同様）。 出生から最初の６ヶ月間、及びその後の６ヶ月間の母乳中のmiR-155、miR-17、及びmiR-92のレベルの比較を示す。 ヒトの母乳及び血清中の免疫関連miRNAレベルの比較を示す。 凍結融解前後のmiRNAのレベルの比較を示す。 低pH（pH 1）で保存前後のmiRNAのレベルの比較を示す。 RNase処理及び未処理のmiRNAのレベルの比較を示す。
　本発明の方法は、哺乳動物の乳中のmiRNAプロファイルと、該哺乳動物が摂取した食餌又は該食餌に含まれる物質との相関により、乳中のmiRNAの存在量を増加又は低下させる食餌又は物質を同定することを含む、免疫調節作用を有する母乳を産生する食餌又は物質のスクリーニング方法である。
　本発明は、前記免疫調節作用が免疫増強作用であって、前記マイクロＲＮＡの存在量が増加すれば、前記食餌又は物質は免疫増強作用を有する母乳を産生させると判定されることを一態様としている。また、本発明は、前記免疫調節作用が免疫抑制作用であって、前記マイクロＲＮＡの存在量が低下すれば、前記食餌又は物質は免疫抑制作用を有する母乳を産生させると判定されることを他の態様としている。
　本発明は、乳中にmiRNAが含まれているという新たな知見、及び、このmiRNAが胃中の酸性条件下でも安定に存在し得るということ、並びに、母乳がそれを摂取した乳児に免疫発達を促すという事実（例えば、Breastfeed. Med, 2(4):195-204, 2007）から、miRNAの経口投与により免疫調節作用を期待できるという思想に基づくものである。そして、乳中のmiRNAプロファイルは、食餌により影響を受けるとの予測から、乳中のmiRNAの存在量を高めることができる、又は低下させることができる食餌又はそれに含まれる有効成分を同定することに想到した。
　本発明のスクリーニング方法、乳又は乳製品等で規定される免疫調節作用とは、外来からの攻撃に対して「防御」の目的で機能する免疫賦活作用を増強する作用（免疫増強作用）、及び免疫による過剰反応、すなわち「亢進」が生体に悪影響を及ぼすアレルギー反応や自己免疫疾患、慢性炎症等に対して抑制的に機能する免疫抑制作用のいずれも例示することが可能である。
　なお、「免疫増強作用」及び「免疫抑制作用」は相対的な文言であって、ある哺乳動物の母乳が通常持つ免疫賦活作用に比べて、その動物が前記食餌又は物質を摂取したときに該作用が増強されていれば、その母乳は免疫増強作用を有し、低下していれば免疫抑制作用を有する。また、哺乳動物が前記食餌又は物質を摂取する前に比べて、摂取後に該作用が増強されていれば、その動物の母乳は免疫増強作用を有し、低下していれば免疫抑制作用を有する。
　哺乳動物の乳中のmiRNAプロファイルと、該哺乳動物が摂取した食餌又は該食餌に含まれる物質との相関は、例えば以下のようにして調べることができる。
　食餌を摂取した哺乳動物から乳を採取し、乳中のmiRNAプロファイルを調べる。
　哺乳動物は特に制限されないが、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等が挙げられる。好ましくはヒト、ウシである。
　本発明において、miRNAプロファイルとは、miRNAの種類と、それらの存在量からなる。miRNAは一種でもよく、任意の２種以上であってもよい。miRNAの種類は、乳中に存在するものであれば特に制限されないが、miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、le-7e、let-7f、及び、let-7i等が挙げられる。
　これらのmiRNAは、ヒト母乳、ラットの初乳、又はウシの初乳のいずれかで存在が確認されたものである。前記したように、母乳は、それを摂取した乳児に免疫発達を促すことが知られている（例えば、Breastfeed. Med., 2(4):195-204, 2007）。また、一般的に、初乳には乳児（仔）の免疫系に対して重要と考えられる成分が多く含まれていることが報告されている（J. Anim. Sci. 2009. 87 (Suppl. 1): 3-9）。したがって、上記の乳中で存在が確認されたmiRNAは免疫機能に関連することが示唆される。
　上記のうち、好ましいのは、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30 、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d、let-7iである。これらは、免疫調節作用が報告されているmiRNA、ラット及びウシの両者の初乳で存在が確認されたmiRNA、及び、ビフィズス菌を投与したラットの初乳で存在量が上昇したmiRNAである。
　また、上記miRNAのうち、特に好ましいものは、miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d、及び、let-7iである。これらは、ラット及びウシの両者の初乳で存在が確認されたmiRNAである。
　miRNAにはサブタイプが存在するものがあり、例えば、miR-181、miR-92、miR-125、miR-146等は、各々、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-92a、miR-92b、miR-125a、miR-125a-3P、miR-125a-5P、miR-125b、miR-146a、miR-146b、miR-146b-3P、及びmiR-146b-5Pの２～４種類のサブタイプが知られている。その他のmiRNAも、複数種のサブタイプが存在するものがあるが、本発明においては、いずれのサブタイプであってもよい。サブタイプとしては、後記実施例で乳中での存在が確認されたものが挙げられる（実施例１、３、４及び５参照）。
　ヒトmiR-155前駆体hsa-mir-155（MI0000681）、及びその活性部位hsa-miR-155（MIMAT0009241）の塩基配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。カッコ内は、miRNAデータベース（miRBase::Sequences、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml）のアクセション番号である（以下、同様）。
　ウシmiR-155前駆体hsa-miR-155（MI0009752）、及びその活性部位bta-miR-155（MIMAT0000646）の塩基配列を、それぞれ配列番号３及び４に示す。
　ヒトmiR-181a前駆体hsa-mir-181a-1（MI0000289）、hsa-mir-181a-2（MI0000269）、及びその活性部位hsa-miR-181a（MIMAT0000256）の塩基配列を、それぞれ配列番号５、６及び７に示す。
　ヒトmiR-181b前駆体hsa-mir-181b-1（MI0000270）、hsa-mir-181b-2（MI0000683）、及びその活性部位hsa-miR-181b（MIMAT0000257）の塩基配列を、それぞれ配列番号８、９及び１０に示す。
　ウシmiR-181a前駆体bta-mir-181a（MI0004757）、bta-mir-181a-1（MI0010484）、及びその活性部位bta-miR-181a（MIMAT0003543）の塩基配列を、それぞれ配列番号１１、１２及び１３に示す。
　ウシmiR-181b前駆体bta-mir-181b-1（MI0010485）、bta-mir-181b-2（MI0005013）、及びその活性部位bta-miR-181b（MIMAT0003793）の塩基配列を、それぞれ配列番号１４、１５及び１６に示す。
　ヒトmiR-223前駆体hsa-mir-223（MI0000300）、及びその活性部位hsa-miR-223（MIMAT0000280）の塩基配列を、それぞれ配列番号１７及び１８に示す。
　ウシmiR-223前駆体bta-mir-223（MI0009782）、及びその活性部位bta-miR-223（MIMAT0009270）の塩基配列を、それぞれ配列番号１９、及び２０に示す。
　ヒトmiR-17前駆体hsa-mir-17（MI0000071）、及びその活性部位hsa-miR-17（MIMAT0000070）（hsa-miR-17-5pとも称される）の塩基配列を、それぞれ配列番号２１及び２２に示す。
　ウシmiR-17前駆体bta-mir-17（MI0005031）、及びその活性部位bta-miR-17-5p（MIMAT0003815）及びbta-miR-17-3p（MIMAT0003816）の塩基配列を、それぞれ配列番号２３、２４及び２５に示す。
　ヒトmiR-92a前駆体hsa-mir-92a-1（MI0000093）、hsa-mir-92a-2（MI0000094）、及びその活性部位hsa-miR-92a（MIMAT0000092）の塩基配列を、それぞれ配列番号２６、２７及び２８に示す。
　ヒトmiR-92b前駆体hsa-mir-92b（MI0003560）、及びその活性部位hsa-miR-92b（MIMAT0003218）の塩基配列を、それぞれ配列番号２９及び３０に示す。
　ウシmiR-92前駆体bta-mir-92（MI0005024）、及びその活性部位bta-miR-92（MIMAT0003808）の塩基配列を、それぞれ配列番号３１及び３２に示す。
　ウシmiR-92a前駆体bta-mir-92a（MI0009905）、及びその活性部位bta-miR-92a（MIMAT0009383）の塩基配列を、それぞれ配列番号３３及び３４に示す。
　ウシmiR-92b前駆体bta-mir-92b（MI0009906）、及びその活性部位bta-miR-92b（MIMAT0009384）の塩基配列を、それぞれ配列番号３５及び３６に示す。
　ヒトlet-7i前駆体hsa-let-7i（MI0000434）、及びその活性部位hsa-let-7i（MIMAT0000415）の塩基配列を、それぞれ配列番号３７及び３８に示す。
　ウシlet-7i前駆体bta-let-7i（MI0005065）、及びその活性部位bta-let-7i（MIMAT0003851）の塩基配列を、それぞれ配列番号３９及び４０に示す。
　ヒトmiR-125a前駆体hsa-mir-125a（MI0000469）、及びその活性部位hsa-miR-125a-5p（MIMAT0000443）、及びhsa-miR-125a-3p（MIMAT0004602）の塩基配列を、それぞれ配列番号４１、４２及び４３に示す。
　ヒトmiR-125b前駆体hsa-mir-125b-1（MI0000446）、hsa-mir-125b-2（MI0000470）、及びその活性部位hsa-miR-125b（MIMAT0000423）の塩基配列を、それぞれ配列番号４４、４５及び４６に示す。
　ウシmiR-125a前駆体bta-mir-125a（MI0004752）、及びその活性部位bta-miR-125a（MIMAT0003538）の塩基配列を、それぞれ配列番号４７及び４８に示す。
　ウシmiR-125b前駆体bta-mir-125b-1（MI0004753）、bta-mir-125b-2（MI0005457）、及びその活性部位bta-miR-125b（MIMAT0003539）の塩基配列を、それぞれ配列番号４９、５０及び５１に示す。
　ヒトmiR-146a前駆体hsa-mir-146a（MI0000477）、及びその活性部位hsa-miR-146a（MIMAT0000449）の塩基配列を、それぞれ配列番号５２及び５３に示す。
　ヒトmiR-146b前駆体hsa-mir-146b（MI0003129）、及びその活性部位hsa-miR-146b-5p（MIMAT0002809）（hsa-miR-146bとも称される）、及びhsa-miR-146b-3p（MIMAT0004766）の塩基配列を、それぞれ配列番号５４、５５及び５６に示す。
　ウシmiR-146a前駆体bta-mir-146a（MI0009746）、及びその活性部位bta-miR-146a（MIMAT0009236）の塩基配列を、それぞれ配列番号５７及び５８に示す。
　ウシmiR-146b前駆体bta-mir-146b（MI0009745）、及びその活性部位bta-miR-146b（MIMAT0009235）の塩基配列を、それぞれ配列番号５９及び６０に示す。
　ヒトmiR-150前駆体hsa-mir-150（MI0000479）、及びその活性部位hsa-miR-150（MIMAT0000451）の塩基配列を、それぞれ配列番号６１及び６２に示す。
　ウシmiR-150前駆体bta-mir-150（MI0005058）、及びその活性部位bta-miR-150（MIMAT0003845）の塩基配列を、それぞれ配列番号６３及び６４に示す。
　上記miRNAに加えて、ラット又はウシの乳中での存在が確認されたmiRNA、及びそれらのmiRNAに相当する他の動物のmiRNAを、表１～１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
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　miRNAは、上記配列を有するものに限られず、miRNAとしての機能、すなわち標的遺伝子の発現を制御し得るものであれば、１又は数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等を含んでいてもよい。具体的には例えば、上記配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するRNAが挙げられる。
　miRNAの存在量は、絶対量であってよく、相対量であってもよい。相対量は、動物における平均的な存在量に対する相対量であってもよく、食餌の摂取前の存在量に対する摂取後の存在量の相対量であってもよい。核酸の存在量の測定は、通常miRNA量の測定に用いられる方法を採用することができ、例えば、定量逆転写PCR（qRT-PCR）が挙げられる。また、マイクロアレイ法によってもmiRNA量を測定することができる。乳からのmiRNAの抽出も、通常miRNAの抽出に用いられる方法を採用することができ、市販のmiRNA単離キットを用いることもできる。
　また、miRNAの乳中の存在量は、乳腺細胞中のmiRNAの発現量を測定することによっても、間接的に測定し得る。
　哺乳動物の乳中のmiRNAプロファイルと、該哺乳動物が摂取した食餌又は該食餌に含まれる物質との相関を調べる。哺乳動物の乳中のmiRNAプロファイルと、該哺乳動物が摂取した食餌又は該食餌に含まれる物質との相関とは、miRNAプロファイルと、前記物質の存在の有無又は存在量との相関をいう。例えば、ある物質を動物が摂取しないときに比べて、該物質を摂取したときに、１種又は複数種のmiRNAの乳中の存在量が高いか、又は低ければ、該物質とmiRNAプロファイルは、各々正又は負の相関がある。また、ある物質の摂取がmiRNAプロファイルに影響しなければ、該物質とmiRNAプロファイルとは相関しない。
　具体的には、例えば、前記食餌の摂取前後の各々の乳中に含まれるmiRNAプロファイルを比較し、摂取前に比べて摂取後に少なくとも一種、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上のmiRNAの存在量が高ければ、前記食餌は乳中のmiRNAの存在量を増加させると判定される。
　また、前記食餌の摂取前後の各々の乳中に含まれるmiRNAプロファイルを比較し、摂取前に比べて摂取後に少なくとも一種、好ましくは２種以上、より好ましくは５種以上のmiRNAの存在量が低ければ、前記食餌は乳中のmiRNAの存在量を低下させると判定される。
　さらに、食餌摂取前のmiRNAプロファイルの測定は、必須ではなく、食餌摂取後のmiRNAプロファイルを、予め測定された対象の哺乳動物の平均なmiRNAプロファイルと比較することによっても、食餌とmiRNAの存在量との相関を調べることができる。
　他の形態では、乳中のmiRNAプロファイルと、血清中又は血漿中のmiRNAプロファイルとを比較し、乳中と血清中又は血漿中のいずれにも含まれるmiRNAの存在量が、前記食餌の摂取により血清中又は血漿中よりも乳中の方が高まれば、乳中のmiRNAの存在量を増加させると判定される。血清中又は血漿中に比べて乳中でmiRNAの存在量が高まる度合は、例えば１．２倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上である。
　また、乳中のmiRNAプロファイルと、血清中又は血漿中のmiRNAプロファイルとを比較し、乳中と血清中又は血漿中のいずれにも含まれるmiRNAの存在量が、前記食餌の摂取により血清中又は血漿中よりも乳中の方が低ければ、乳中のmiRNAの存在量を低下させると判定される。血清中又は血漿中に比べて乳中でmiRNAの存在量が低下する度合は、例えば０．８倍以下、好ましくは０．５倍以下、より好ましくは０．２倍以下、さらに好ましくは０．１倍以下である。
　食餌は、経口摂取が可能である限り、単一の物質でも組成物でもよい。また、食餌の摂取前又は摂取後とは、一回の食餌の摂取の前後であってもよく、複数回の食餌の摂取の前後であってもよい。また、複数回の食餌の摂取は、同一の食餌の複数回の摂取でもよく、２種又はそれ以上の食餌の摂取であってもよい。
　食餌の摂取は、計画的に行われてもよく、自由に行われてもよい。後者の場合は、ヒトにおいては摂取した食餌の内容を聴取することによって、食餌と乳中のmiRNAプロファイルの相関を調べることができる。食餌の摂取又は投与が計画的に行われる場合は、食餌は「被検試料」と言い換えることができる。食餌は、通常の食餌であってもよく、通常の食餌に被検物質を添加したものであってもよい。食餌の摂取量、摂取時間、及び摂取回数等は、特に制限されない。
　乳中のmiRNAの存在量を増加させる食餌が選択されれば、上記と同様にして、その食餌中に含まれる、乳中のmiRNAの存在量を増加させる物質を同定することができる。また、乳中のmiRNAの存在量を低下させる食餌が選択されれば、上記と同様にして、その食餌中に含まれる、乳中のmiRNAの存在量を低下させる物質を同定することができる。
　乳中のmiRNAの存在量を増加もしくは低下させる食餌又は物質が同定されれば、乳中のmiRNAの存在量を増加又は低下させる食餌を設計することができる。すなわち、乳中のmiRNAの存在量を増加させる食餌又はそれに含まれる物質は、免疫増強作用を有する乳の産生に好適であり、乳中のmiRNAの存在量を低下させる食餌又はそれに含まれる物質は、免疫増強作用を有する乳の産生に不適と考えられる。
　また、乳中のmiRNAの存在量を低下させる食餌又はそれに含まれる物質は、免疫抑制作用を有する乳の産生に好適であり、乳中のmiRNAの存在量を増加させる食餌又はそれに含まれる物質は、免疫抑制作用を有する乳の産生に不適と考えられる。
　上記のようにして、免疫調節作用を有する母乳を産生する食餌もしくは物質、又は、免疫調節作用を有する母乳の産生に不適な食餌又は物質をスクリーニングすることができる。後記実施例に示すように、ラット及びウシの初乳中に多種のmiRNAの存在が確認された。このことは、miRNAの経口投与により免疫調節作用を期待できるという本発明の思想を裏付けるものである。また、後記実施例に示すように、ビフィズス菌（ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum））をラットに経口投与したところ、５２種類のmiRNAの存在量が増加した。
　ビフィズス菌は、プロバイオティクス機能を有しており、特に免疫調節作用を有することが知られている。したがって、ビフィズス菌投与により乳中のmiRNAの存在量が増加したという事実からも、乳中のmiRNAが免疫調節に関与していることが裏付けられる。ビフィズス菌投与による乳中のmiRNAの存在量の増加、すなわちビフィズス菌とmiRNAプロファイルの相関が示されたことは、本発明のスクリーニング方法が実施可能であることを示している。また、ビフィズス菌投与により乳中の存在量が変動しなかったmiRNAも存在するが、それらのmiRNAの存在量が、他の食餌又はそれに含まれる物質によって増加する可能性を否定するものではない。
　尚、ビフィズス菌の持つプロバイオティクス機能として、気道感染症、急性伝染性下痢症、抗菌薬関連下痢症、クロストリジウム・ディフィシル関連下痢症、壊死性腸炎、旅行者下痢症、及び、ヘリコバクター・ピロリ感染症等の予防又は緩解等が知られている（The Jounal of Nutirition, 2010 Mar;140(3):698S-712S. Epub 2010 Jan 27.）。ビフィズス菌投与により乳中の存在量が増加するmiRNAは、それらを摂取した動物において、免疫調節のみならず、上記のプロバイオティクス機能と同様の機能を奏することが示唆される。
　上記のようにして選択される乳中のmiRNAの存在量を増加させる食餌又は物質を哺乳動物に摂取させ、該動物から乳を採取することによって、免疫増強作用を有する乳、又は免疫増強作用が高められた乳が得られる。また、上記のように選択される乳中のmiRNAの存在量を低下させる食餌又は物質を哺乳動物が摂取するのを低減又は避けることによって、乳の免疫増強作用を高めるか、又は免疫増強作用の低下を防ぐことができる。
　また、乳中のmiRNAの存在量を増加させる食餌又は物質の摂取、及び、乳中のmiRNAの存在量を低下させる食餌又は物質の摂取を低減又は避けることは、組みあわせてもよい。また、上記のようにして選択される乳中のmiRNAの存在量を低下させる食餌又は物質を哺乳動物に摂取させ、該動物から乳を採取することによって、免疫抑制作用を有する乳、又は免疫増強作用が低下された乳が得られる。また、上記のように選択される乳中のmiRNAの存在量を増加させる食餌又は物質を哺乳動物が摂取するのを低減又は避けることによって、乳の免疫抑制作用を高めるか、又は免疫増強作用を低下させることができる。また、乳中のmiRNAの存在量を低下させる食餌又は物質の摂取、及び、乳中のmiRNAの存在量を増強させる食餌又は物質の摂取を低減又は避けることは、組みあわせてもよい。
　上記のようにして得られる免疫調節作用を有する乳を加工することによって、免疫調節作用を有する乳製品を製造することができる。
　乳製品としては、miRNAが機能を維持したまま存在し得る限り特に制限されず、加工乳、調製乳、乳飲料、調製粉乳、発酵乳、クリーム、バター、チーズ、アイスクリーム等が挙げられる。乳製品としては、乳児用又は幼児用の乳製品が好ましい。
　本発明により、miRNA、特に免疫発達、抗アレルギー、抗炎症、感染防御等、免疫増強に関与することが知られているmiRNAが乳中に存在することが示された。その一方で、母乳がそれを摂取した乳児に免疫増強作用を与えることはよく知られている。したがって、免疫調節に関与するmiRNAが、経口摂取したヒト等の動物の免疫を調節し得ることは、合理的に予測される。miRNAは多様な遺伝子の発現を制御する物質であることから、母体から乳児ににこのような制御分子が移動する意義は、特に免疫機構が未発達な乳幼児にとって非常に大きいと考えられる。
　本発明の他の形態は、miRNAが経口摂取用組成物基剤に添加された、免疫増強作用を有する経口摂取用組成物である。
　前記miRNAとしては、miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、le-7e、let-7f、及び、let-7i等が挙げられる。
　上記のmiRNAの中では、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30 、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d、及び、let-7iが好ましく、miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d、及び、let-7iがより好ましい。
　miRNAは一種でもよく、任意の二種以上であってもよい。
　経口摂取用組成物基剤は、経口摂取又は経口投与が可能であり、miRNAが機能を維持したまま存在し得るものであれば特に制限されず、食品、飲料、医薬品基剤、飼料等が挙げられる。
　食品は、性状は問わず、飲料も含まれる。食品としては、成人用食品、乳児用食品または幼児用食品等が挙げられる。
　成人用食品としては、経腸栄養剤、濃厚流動食等の流動食と栄養補助食品等が例示することができる。
　乳児用食品又は幼児用食品としては、例えば調製乳類（例えば乳児用調製乳、低出生体重児用調製乳、フォローアップミルクなどや、アレルギー疾患用調製乳、無乳糖乳、先天性代謝異常症用の特殊乳など、又はこれらの粉乳）、母乳又は調製粉乳に添加する粉末、ベビーフードなどを例示することができる。
　ここで、調製乳類とは乳又は乳製品を主要原料とし、乳幼児に必要な栄養素を添加して製造した食品であり、乳児期にあっては主として母乳代替の食品として使用されるものであり、幼児期においては母乳代替又は栄養摂取の補完的役割を果たす食品として使用されるものであり、その他、特定の先天性又は後天性の疾患を有する乳幼児に適した栄養の摂取に寄与する目的で製造される食品が例示される。
　miRNAは、凍結融解、低pH、例えばpH 1の酸性条件、及びRNase AやRNase T等のRNaseに対して比較的耐性であり、食品に添加される有効成分として好適である。低pHで安定であることは、miRNA分子は乳児の胃内環境に耐性があり、乳児の主な免疫臓器の一つである腸管で吸収されうることを示唆しており、乳児の免疫系に影響を及し得る。また、母乳の保存と凍結、融解もmiRNAを変性させることはなく、このことは通常凍結保存した母乳を与えられる低出生体重児や入院している乳児にとって栄養学的に重要である。さらに、RNaseに耐性があることは、母乳中でmiRNAはエクソソームや微細小胞などの複合体の中に存在しているかもしれないことを示唆している。
　上記の知見からは、母親が児に対して環境に適応するようオーダーメイドの母乳を提供しているような感を受ける。母乳由来エクソソームがFoxp3+CD4+CD25+制御性Ｔ細胞の数を増加させることを示唆した報告がある。免疫関連miRNAが母乳エクソソーム中に含まれているなら、乳児消化管においてFoxp3+CD4+CD25+制御性T細胞の増加に寄与する可能性はある。なぜならば、miR-181a、miR-181bなど母乳中に検出された免疫関連miRNAは高発現しており、それらはT細胞分化に関与しているものであるからである。さらに、母乳中に豊富に含まれていたmiR-181やmiR-155はＢ細胞分化を誘導することが知られており、Ｂ細胞分化を抑制するmiR-150は母乳中にはほとんどなかったことから、母乳中miRNAはＢ細胞の分化を誘導するかもしれない。
　組成物中のmiRNAの含有量は、特に制限されず適宜選択すればよいが、合計で、例えば１０～１０，０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０～１０，０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５０～１０，０００ｎｇ／ｍｌである。また、miRNA摂取量は、合計で、例えば５μｇ～１２０ｍｇ／日、好ましくは１０μｇ～１２０ｍｇ／日、より好ましくは２５μｇ～１２０ｍｇ／日である。
　miRNAは、その前駆体（pri-miRNA）である部分的２本鎖RNAを調製し、これをDicer酵素で切断することによって得ることができる。Dicer酵素は、市販されているものを使用することができる。前記２本鎖RNAは、例えば、相補的配列を有する２本鎖DNAを鋳型とするRNAポリメラーゼ反応によって調製することができる。２本鎖DNAは、哺乳動物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、miRNAの配列を増幅できるように設計されたプライマーを用いてPCRにより増幅することによって、調製することができる。
　上記のようにして得られる２本鎖RNAをDicer酵素等で切断することによって、miRNAが得られる。
　また、miRNAは、化学合成によっても製造することができる。すなわち、センス鎖とアンチセンス鎖を合成し、それらをアニールさせることによって、miRNAが得られる。
　また、哺乳動物の内在性Dicer酵素によって目的のmiRNAが生成するような２本鎖RNAを経口摂取用組成物に配合してもよい。
　本発明の経口摂取用組成物が医薬である場合は、miRNAを製剤学的に許容される経口投与用製剤担体と組み合わせて、製造することができる。医薬の製剤形態は特に限定されず、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤等を例示できる。製剤化にあたっては経口用製剤担体として通常の医薬に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤等の添加剤を使用できる。また、本発明の効果を損わない限り、miRNAと、他の免疫調節作用を有する薬剤とを併用してもよい。
　医薬中に含まれるmiRNAの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、合計で、例えば２μｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは４μｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇである。
　経口摂取用組成物が食品である場合は、免疫増強作用を利用するような種々の用途をとることが可能である。例えば、抵抗力の低下した人に適した食品、免疫低下により引き起こされる種々の疾患の危険要因の低減・除去に役立つ飲食品等の用途を例示することができる。
　本発明の飲食品は、免疫調節のために用いられるものである旨の表示を付した食品等として販売することができる。
　前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、上記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明の「表示」に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましい。具体的には、本発明の食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為、等が例示できる。
　一方、表示としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましく、特に包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。
　また、例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができ、その他厚生労働省によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として列挙することが可能である。
　次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕母乳中のmiRNAの解析
　ヒトの母乳を2,000×gで10分遠心分離して、細胞、及び大きな残渣を取り除き、表面層の脂質以外の上清をさらに12,000×gで30分遠心分離することで、細胞残渣や小さなごみを取り除いた。上清から、mirVana miRNA isolation kitを用いて、メーカープロトコルに従って、総RNAを抽出した。血清からのRNA抽出も、母乳と同様にして行なった。
　抽出されたRNAをバイオアナライザーを用いて分析した。母乳中にRNAは相当量含まれていたが、リボソームRNA（18S rRNA、28S rRNA）はほとんど、あるいは全く含まれていなかった。
　マイクロアレイ解析システム（アジレント社製を使用）によりmiRNAの検出を行った。miRNAの発現量は、GeneSpring GX11.0（アジレント社製）を用いて解析した。その結果を図１に示す。その結果、miR-181a、miR-181b、miR-155、miR-125b、miR-146b、miR-223、let-7iが顕著に検出された。Ｔ細胞及びＢ細胞を制御するmiR-150は検出できなかった。また、miR-122（肝臓）、miR-216、miR-217（膵臓）、miR-142-5p、miR-142-3p（造血細胞）など複数の臓器特異的miRNAはほとんど検出できなかった。また、miR-124（脳）は少量検出された。
　出生から最初の６ヶ月間（n=5）、及びその後の６ヶ月間（n=13）の母乳について、定量RT-PCRにより解析したmiR-181aのレベルを比較した結果を図２に示す。miR-155、miR-17、及びmiR-92aについても、同様の解析を行った結果を図３に示す。尚、RNA単離過程におけるサンプル間の変動を正規化するため、線虫（Caenorhabditis elegans）の合成miRNAであるcel-miR-39（キアゲン社により合成）を変性したものをサンプルに添加し（総量5mlに対しオリゴヌクレオチドが25 fmolとなるように）、cel-miR-39に対する相対量としてmiRNAの量を示した（以下の実験でも同様）。
　その結果、出生後最初の６ヶ月間の方が、その後の６ヶ月間よりも、miR-181aの存在量は多かった（図２）。miR-155、miR-17、及びmiR-92aについても同様であった（図３）。
　なお、RT-PCRに用いたプライマーは、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製の以下のAssay IDを使用した。
　・miR-181a：000480
　・miR-155：002623
　・miR-17：002308
　・miR-92a：000431
　・Cel-miR-39：000200
　分娩後６ヶ月以内の７人の健康なヒトの母乳及び血清中の免疫関連miRNAレベルを比較した結果を、図４に示す（母乳：n=5、血清：n=6）。母乳中miRNAのプロファイルは血清中のそれと異なっている。例えば、顆粒球を制御するmiRNAであるmiR-223は正常なヒト血清中及び血漿中に最も高度に存在するが、母乳中の発現量は血清と比較し、極めて低かった。さらに、血清中には豊富には存在しないmiR-146bは母乳中には豊富に存在した。
　一方で、母乳中に豊富に存在したmiR-181やmiR-155は血清中の発現量と同程度であった。分娩後６ヶ月という離乳食摂取前時期の母乳中に、複数の免疫関連miRNAが高発現していたことは興味深い。
　細胞間のmiRNAの移動はmiRNAが細胞内分子を制御しているだけでなく、サイトカインのように細胞間のコミュニケーションに役割を果たす分子であることも意味する。上記結果は、miRNAが母親から児へ移行可能な「遺伝的物質(genetic material)」であることを示唆する。おおよそ0.15 pg/L/日 (1.3×107 コピー/L/日)のmiR-181が母乳を介して乳児に摂取されると計算される。
　尚、クラスター解析の結果、異なる母親の母乳間で、miRNAプロファイルは類似していた。
〔実施例２〕miRNAの物理化学的性質
　母乳を室温で24時間静置し、又は３回まで凍結（-20℃）、融解を繰り返した。miRNA（miR-21、miR-181a）のレベルをTaqMan qRT-PCRにて測定した。結果を図５に示す。また、母乳を３時間低pH（pH=1）溶液中で処理し、処理前後のmiRNAレベル（miR-181a）をTaqMan qRT-PCRで測定した。結果を図６に示す。
　さらに、母乳に、母乳量の２％のRNase A/T（Ambion社製：RNase A(500U/ml)、RNase T1(20,000U/ml)の混合溶液）溶液を添加して、37 ℃、３時間処理し、処理前後のmiRNAレベル（miR-181a）をTaqMan qRT-PCRで測定した。結果を図７に示す。
　なお、TaqMan qRT-PCRに用いたプライマーは、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製の以下のAssay IDを使用した。
　・miR-181a：000480
　・miR-21：000397
　・Cel-miR-39：000200
　miRNAは、凍結融解、低pH、及びRNaseに対して比較的安定であることが示された。
〔実施例３〕免疫調節作用を有する乳を産生する食餌又は物質の同定
　ＳＤ系統・妊娠９～１０日目のラットを購入し、妊娠１３日目から２０日目までの期間、試験群（ｎ＝３）に、ビフィズス菌ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum） BB536（ATCC BAA-999）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させた懸濁液（１×１０9 ｃｆｕ／ｍｌ）をラット１匹あたり１ｍｌ／日で連日経口投与した。
　また、対照群（ｎ＝３）として、ＰＢＳをラット１匹あたり１ｍｌ連日投与した。B. longum ATCC BAA-999株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所　12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から購入することができる。
　全てのラットは、妊娠２１日目に出産し、出産後１日目にエーテル麻酔下で搾乳を行なった。得られた初乳サンプルを１，２００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を２回行ない、脂肪層と細胞片を除いた。
　続いて、上清を２１，５００×ｇ、４℃で４０分間、さらに同条件で１時間遠心分離を行ない、カゼイン画分を除き乳清を得た。得られた乳清サンプルから、miRNeasy Mini Kit（キアゲン社製）を用いて総ＲＮＡを得た。
　得られたＲＮＡサンプル１００ｎｇを用いて、常法に従って、マイクロアレイ解析システム（アジレント社製）を用いてmiRNAの検出を行った。結果はGeneSpring GX11.0（アジレント社製）を用いて解析した。
　マイクロアレイデータをGeneSpring GX11.0を用いて統計解析を行なったところ、検出された試験群、対照群で発現が確認されたマイクロＲＮＡは、総数で１５５種類であった。これらのマイクロＲＮＡは以下のとおりである。尚、miR-150は検出されなかった。
［試験群、対照群で発現が確認されたマイクロＲＮＡ：１５５種］
　miR-16，miR-17-5p，miR-18 (miR-18a)，miR-19 (miR-19b)，miR-20 (miR-20a)，miR-21，miR-23 (miR-23a)，miR-27 (miR-27a，miR-27b)，miR-29 (miR-29a，miR-29b，miR-29c，miR-29c*)，miR-30 (miR-30a，miR-30c，miR-30d，miR-30e*)，miR-33，miR-34b，miR-92a，miR-93，miR-100，miR-101 (miR-101a，miR-101b)，miR-106b，miR-130b，miR-140*，miR-141，miR-143，miR-146a，miR-185，miR-186，miR-192，miR-193，miR-195，miR-200a，miR-205，miR-218，miR-219-5p，miR-221，miR-301a，miR-322，miR-340-5p，miR-361，miR-429，miR-455，miR-466b，miR-497，miR-500，miR-503，miR-532-5p，miR-542-3p
　let-7a，let-7a*，let-7b，let-7c，let-7d，le-7e，let-7f，let-7i，miR-10 (miR-10a-5p，miR-10b)，miR-15 (miR-15b)，miR-19 (miR-19a)，miR-20 (miR-20a*)，miR-22，miR-23 (miR-23b)，miR-24，miR-25，miR-26 (miR-26a，miR-26b)，miR-28，miR-30 (miR-30a*，miR-30b-5p，miR-30c-1*，miR-30c-2*，miR-30e)，miR-31，miR-34 (miR-34a)，miR-96，miR-98，miR-99 (miR-99a，miR-99b)，miR-103，miR-107，miR-125 (miR-125a-3p，miR-125a-5p，miR-125b-3p，miR-125b-5p)，miR-128，miR-130 (miR-130a)，miR-133 (miR-133a，miR-133b)，miR-134，miR-139 (miR-139-3p)，miR-140，miR-146 (miR-146b)，miR-148 (miR-148b-3p)，miR-151，miR-152，miR-181 (miR-181a，miR-181a*，miR-181b，miR-181c，miR-181d)，miR-182，miR-183，miR-188，miR-196 (miR-196c)，miR-199 (miR-199a-3p)，miR-200 (miR-200b，miR-200c)，miR-203，miR-204，miR-206，miR-210，miR-212，miR-214，miR-222，miR-223，miR-290，miR-291 (miR-291a-5p)，miR-292 (miR-292-5p)，miR-294，miR-296 (miR-296*)，miR-320，miR-324 (miR-324-3p，miR-324-5p)，miR-327，miR-328，miR-331，miR-340 (miR-340-3p)，miR-341，miR-342 (miR-342-3p)，miR-345 (miR-345-5p)，miR-347，miR-352，miR-365，miR-370，miR-375，miR-378 (miR-378，miR-378*)，miR-425，miR-465，miR-483，miR-484，miR-494，miR-542 (miR-542-5p)，miR-652，miR-672，miR-685，miR-760 (miR-760-3p)，miR-872，miR-874，miR-1224
　尚、miR-No.の後に（ ）で記載しているものがあるが、それらはサブタイプが存在したものであり、（ ）内が実際に変動していたサブタイプである。
　また、上記のマイクロＲＮＡについて、ビフィズス菌BB536株投与群と対照群における発現量を比較したところ、Mann-Whitney U-testで検定し、危険率５％未満の確率で、以下の５２種類のマイクロＲＮＡが、ビフィズス菌BB536株投与群で増加変動していることが明らかとなった。各miRNAの発現の変動倍率を、表１１に示す。
［ビフィズス菌BB536株摂取により増加変動が確認されたマイクロＲＮＡ：５２種］
　miR-16，miR-17-5p，miR-18 (miR-18a)，miR-19 (miR-19b)，miR-20 (miR-20a)，miR-21，miR-23 (miR-23a)，miR-27 (miR-27a，miR-27b)，miR-29 (miR-29a，miR-29b，miR-29c，miR-29c*)，miR-30 (miR-30a，miR-30c，miR-30d，miR-30e*)，miR-33，miR-34b，miR-92a，miR-93，miR-100，miR-101 (miR-101a，miR-101b)，miR-106b，miR-130b，miR-140*，miR-141，miR-143，miR-146a，miR-185，miR-186，miR-192，miR-193，miR-195，miR-200a，miR-205，miR-218，miR-219-5p，miR-221，miR-301a，miR-322，miR-340-5p，miR-361，miR-429，miR-455，miR-466b，miR-497，miR-500，miR-503，miR-532-5p，miR-542-3p，
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　なお、表１１から明らかなとおり、増加変動が確認された５２種類のマイクロＲＮＡの変動倍率はいずれも１．２倍以上であることが判明した。
　すなわち、これら５２種類のマイクロＲＮＡの検出により、ビフィズス菌BB536株を、免疫調節作用を有する乳を産生する食餌又は物質としてスクリーニングすることが可能であることが判明した。
〔実施例４〕ラット由来の初乳に発現しているマイクロＲＮＡの検出
　Ｆ３４４系統の妊娠１４日目のラット３匹を購入した。購入した全てのラットは、妊娠２１日目に出産し、出産後２日目にエーテル麻酔下で搾乳を行なって、初乳を回収した。
　各初乳サンプルについて、１，２００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を２回行ない、脂肪層と細胞片を除いた。
　続いて２１，５００×ｇ、４℃で４０分間、さらに同条件で１時間遠心分離を行ない、カゼイン部分を除いて乳清を得た。
　得られた乳清サンプルから、miRNeasy Mini Kit (キアゲン社製)を用いて総ＲＮＡを得た。
　得られたＲＮＡサンプル１００ｎｇを用い、常法に従って、マイクロアレイ（アジレント社製）実験に供した。マイクロアレイ実験の結果をGeneSpring GX11.0 (アジレント社製)を用いて解析した。
　その結果、実施例３で確認された１５５種類のマイクロＲＮＡの他に、４種類のマイクロＲＮＡ（miR-193*、miR-409-3p、miR-664、miR-877）が発現していることが確認された。
〔実施例５〕ウシ由来の初乳に発現しているマイクロＲＮＡの検出
　ホルスタイン種のウシより、出産後１日目～３日目までの乳を、初乳サンプルとして５検体用意した。また、出産後８日目～８ヶ月目までの乳を、常乳サンプルとして５検体用意した。
　乳（初乳、常乳）サンプルについて、１，２００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を２回行ない、脂肪層と細胞片を除いた。
　続いて２１，５００×ｇ、４℃で４０分間、さらに同条件で１時間遠心分離を行ない、カゼイン部分を除いて乳清を得た。
　得られた乳清サンプルから、miRNeasy Mini Kit (キアゲン社製)を用いて総ＲＮＡを得た。
　得られたＲＮＡサンプル２０ｎｇを用い、常法に従って、マイクロアレイ（アジレント社製）実験に供した。マイクロアレイ実験の結果をGeneSpring GX11.0 (アジレント社製)を用いて解析した。
　その結果、初乳サンプルと常乳サンプルから、総計１０２種類のmiRNAの発現が確認された。特に、その１０２種類のうち、４９種類は初乳でのみ発現が確認された。
　以下に初乳サンプルのみで発現が確認された４９種類のマイクロＲＮＡを示す。
〔初乳のみで発現が確認されたマイクロＲＮＡ：４９種〕
　let-7d, let-7i, miR-15a, miR-15b, miR-16b,  miR-17-3p, miR-19b, miR-21, miR-23b-3p, miR-24-3p, miR-26b, miR-27b, miR-30a-5p, miR-30c, miR-30f, miR-34a, miR-99a, miR-106, miR-106b, miR-107, miR-125b, miR-126, miR-129-3p, miR-130a, miR-130b, miR-140, miR-155, miR-181b, miR-184, miR-193a-3p, miR-193a-5p, miR-196a, miR-210, miR-222, miR-223, miR-338, miR-361, miR-362-5p, miR-370, miR-429, miR-452, miR-486, miR-500, miR-532, miR-584, miR-708, miR-877, miR-1300b, miR-1307
　本発明により、免疫調節作用を有する乳を産生する、食餌又はそれに含まれる成分をスクリーニングすることができる。また、本発明により、免疫調節作用を有する乳製品の製造方法が提供される。本発明の経口摂取用組成物は、免疫増強作用を有し、特に乳幼児に有用である。

Claims (20)

  1. 　哺乳動物の乳中のマイクロＲＮＡプロファイルと、該哺乳動物が摂取した食餌又は該食餌に含まれる物質との相関を指標として、乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加又は減少させる食餌又は物質を同定することを含む、免疫調節作用を有する母乳を産生する食餌又は物質のスクリーニング方法。
  2. 　前記免疫調節作用が免疫増強作用であって、前記マイクロＲＮＡの存在量が増加すれば、前記食餌又は物質は免疫増強作用を有する母乳を産生させると判定される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記食餌の摂取前後の各々の乳中に含まれるマイクロＲＮＡプロファイルを比較し、摂取前に比べて摂取後に少なくとも一種のマイクロＲＮＡの存在量が高ければ、前記食餌は乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加させると判定する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　乳中のマイクロＲＮＡプロファイルと、血清中又は血漿中のマイクロＲＮＡプロファイルとを比較し、乳中と血清中又は血漿中のいずれにも含まれるマイクロＲＮＡの存在量が、前記食餌の摂取により血清中又は血漿中よりも乳中の方が１．２倍以上高まれば、乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加させると判定する、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　前記免疫調節作用が免疫抑制作用であって、前記マイクロＲＮＡの存在量が低下すれば、前記食餌又は物質は免疫抑制作用を有する母乳を産生させると判定される、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記食餌の摂取前後の各々の乳中に含まれるマイクロＲＮＡプロファイルを比較し、摂取前に比べて摂取後に少なくとも一種のマイクロＲＮＡの存在量が低ければ、前記食餌は乳中のマイクロＲＮＡの存在量を低下させると判定する、請求項５に記載の方法。
  7. 　乳中のマイクロＲＮＡプロファイルと、血清中又は血漿中のマイクロＲＮＡプロファイルとを比較し、乳中と血清中又は血漿中のいずれにも含まれるマイクロＲＮＡの存在量が、前記食餌の摂取により血清中又は血漿中よりも乳中の方が０．８倍以下低下すれば、乳中のマイクロＲＮＡの存在量を低下させると判定する、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　前記哺乳動物がヒト、ラット、又はウシである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記マイクロＲＮＡプロファイルが、miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、le-7e、let-7f、及び、let-7iからなる群から選ばれるマイクロＲＮＡの存在量である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記マイクロＲＮＡプロファイルが、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30 、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d、及び、let-7iからなる群から選ばれるマイクロＲＮＡの存在量である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記マイクロＲＮＡプロファイルが、miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d、及び、let-7iからなる群から選ばれるマイクロＲＮＡの存在量である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により哺乳動物の乳中のマイクロＲＮＡの存在量を増加又は低下させると同定された食餌又は物質を、哺乳動物（ヒトを除く）に摂取させる工程、及び、同動物の乳を採取する工程を含む、免疫調節作用を有する乳又は乳製品の製造方法。
  13. 　前記免疫調節作用が免疫増強作用であって、かつ、前記食餌又は物質は前記マイクロＲＮＡの存在量を増加させると同定されたものである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記免疫調節作用が免疫抑制作用であって、かつ、前記食餌又は物質は前記マイクロＲＮＡの存在量を低下させると同定されたものである、請求項１２に記載の方法。
  15. 　マイクロＲＮＡが経口摂取用組成物基剤に添加された、免疫増強作用を有する経口摂取用組成物。
  16. 　前記マイクロＲＮＡが、miR-10、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-25、miR-26、miR-27、miR-28、miR-29、miR-30、miR-31、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-96、miR-98、miR-99、miR-100、miR-101、miR-103、miR-106、miR-107、miR-125、miR-126、miR-128、miR-129、miR-130、miR-133、miR-134、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-148、miR-151、miR-152、miR-155、miR-181、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-188、miR-192、miR-193、miR-195、miR-196、miR-199、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-210、miR-212、miR-214、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-290、miR-291、miR-292、miR-294、miR-296、miR-301、miR-320、miR-322、miR-324、miR-327、miR-328、miR-331、miR-338、miR-340、miR-341、miR-342、miR-345、miR-347、miR-352、miR-361、miR-362、miR-365、miR-370、miR-375、miR-378、miR-409、miR-425、miR-429、miR-452、miR-455、miR-465、miR-466、miR-483、miR-484、miR-486、miR-494、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、miR-584、miR-652、miR-664、miR-672、miR-685、miR-708、miR-760、miR-872、miR-874、miR-877、miR-1224、miR-1300、miR-1307、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、le-7e、let-7f、及び、let-7iからなる群から選ばれる、請求項１５に記載の経口摂取用組成物。
  17. 　前記マイクロＲＮＡが、miR-15、miR-16、miR-17、miR-18、miR-19、miR-20、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-29、miR-30 、miR-33、miR-34、miR-92、miR-93、miR-99、miR-100、miR-101、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-141、miR-143、miR-146、miR-155、miR-181、miR-185、miR-186、miR-192、miR-193、miR-195、miR-200、miR-205、miR-210、miR-218、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-301、miR-322、miR-340、miR-361、miR-370、miR-429、miR-455、miR-466、miR-497、miR-500、miR-503、miR-532、miR-542、let-7d、及び、let-7iからなる群から選ばれる、請求項１５に記載の経口摂取用組成物。
  18. 　前記マイクロＲＮＡが、miR-15、miR-16、miR-19、miR-21、miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-30、miR-34、miR-99、miR-106、miR-107、miR-125、miR-130、miR-140、miR-181、miR-193、miR-210、miR-222、miR-223、miR-361、miR-370、miR-429、miR-500、miR-532、let-7d、及び、let-7iからなる群から選ばれる、請求項１５に記載の経口摂取用組成物。
  19. 　経口摂取用組成物が乳児用食品又は幼児用食品である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の経口摂取用組成物。
  20. 　前記乳児用食品又は幼児用食品が乳児用調製乳又は幼児用調製乳である、請求項１９に記載の経口摂取用組成物。
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