WO2011002251A2 - 수태능력 예측용 마커 - Google Patents

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WO2011002251A2
WO2011002251A2 PCT/KR2010/004298 KR2010004298W WO2011002251A2 WO 2011002251 A2 WO2011002251 A2 WO 2011002251A2 KR 2010004298 W KR2010004298 W KR 2010004298W WO 2011002251 A2 WO2011002251 A2 WO 2011002251A2
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방명걸
박유진
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중앙대학교 산학협력단
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction

Definitions

  • the present invention relates to a marker for predicting fertility of a animal and a method for predicting fertility. More specifically, to find a marker that is expressed differently according to the conception ability of the animal, a composition comprising an antibody specifically binding to the marker, a primer or probe specifically binding to the gene encoding the marker and this The present invention relates to a method of predicting an animal's conception ability.
  • AI Artificial insemination
  • Mammalian sperm require some time to develop physiological changes and acquire fertilization. This change is called capacitaion.
  • Studies on fertility gain have been linked to tyrosine kinase by cyclic AMP, lipids of protein in sperm membranes, protein changes, ion transport, sperm motility, protein transport and protein phosphorylation. have. Since capacitation and fertility are deeply related, fertility acquisition status is very important in determining fertility.
  • the present inventors have recognized the necessity of developing a marker capable of predicting conception ability, and as a result of intensive efforts to develop it, find a protein marker whose expression level varies according to the conception ability of an animal, and use the animal to have a high conception capacity. And by confirming that animals with low fertility can be selected, the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting fertility, including an antibody of a marker for predicting fertility of an animal and a primer specific for a gene encoding the marker.
  • Another object of the present invention to provide a method for predicting the conception ability of the animal.
  • the present invention provides a method for obtaining a marker for predicting fertility of the animal.
  • the present invention is somito combined with porin, roporin, enolase 1, actin-related protein T2, and aurovertin B.
  • Chodrial F1-ATPase Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B
  • alpha-tubulin phosphatidylethanolamine-binding protein 1, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen Enzymes (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP synthase subunit, alpha-2-HS-glycoprotein, PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), cytochrome b- characterized by increased expression in sperm of animals selected from the group consisting of c1 complex subunit 2 and apoptosis-stimulating of p53 protein 2 Animal It provides a marker for predicting fertility.
  • the present invention also relates to bovine mitochondrial F1-ATPase (Porin), Roporin (Ropporin), Enolase 1 (enolase 1), actin-related protein T2, and aurovertin B.
  • the animal is preferably a cow.
  • the present invention also provides a kit for predicting fertility of an animal containing the antibody specific for the marker.
  • the present invention also relates to bovine mitochondrial F1-ATPase (Porin), Roporin (Ropporin), Enolase 1 (enolase 1), actin-related protein T2, and aurovertin B.
  • the animal is preferably a cow.
  • the present invention also provides a kit for predicting fertility of an animal comprising a primer or probe specifically binding to the gene encoding the marker.
  • the present invention (1) in the sample (Porin), alpha-tubulin (alpha-tubulin), ATP synthase subunit (ATP synthase subunit), alpha-2-HS-glycoprotein (alpha-2-HS- glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), cytochrome b-c1 complex subunit 2 and apoptosis-stimulating of p53 protein 2 Measuring mRNA or protein levels of the marker for predicting fertility of the at least one selected animal; And (2) analyzing the increase or decrease in the amount of mRNA or protein expression.
  • the sample is preferably bovine sperm.
  • predicting the fertility of at least one animal selected from the group consisting of Porin, ATP synthase subunit and cytochrome b-c1 complex subunit 2 It is preferable to further include the step of predicting that the fertility of the animal is low when the expression level of mRNA or protein of the for marker increases.
  • alpha-tubulin, alpha-2-HS-glycoprotein, phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) and apoptosis stimulating protein of p53 protein 2 preferably further comprises the step of predicting the high fertility of the animal when the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the conception ability of one or more animals selected from the group consisting of.
  • the present invention (1) bovine mitochonds combined with Ropoorin, Enolase 1, actin-related protein T2 and aurovertin B in fertilized sperm obtained from fertility Rial F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), alpha-tubulin, phosphatidylethanolamine-binding protein 1, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA for predicting fertility markers of at least one animal selected from the group consisting of (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx), and apoptosis-stimulating of p53 protein 2 Or measuring protein levels; And (2) analyzing the increase or decrease in the amount of mRNA or protein expression.
  • the expression level of the mRNA or protein of the fertility predictor marker of one or more animals selected from the group consisting of Ropoorin, Enolase 1 and PHGPx (PHGPx) increases, It is preferable to further include the step of predicting that the fertility of low.
  • actin-related protein T2 bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B
  • alpha-tubulin (alpha) -tubulin phosphatidylethanolamine-binding protein 1, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and p53 protein 2 apoptosis-stimulating of It is preferable to further include a step of predicting that the high fertility of the animal when the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the fertility of one or more animals selected from the group consisting of p53 protein 2) is increased.
  • the gain of fertility can be induced by treating heparin.
  • the present invention comprises the steps of (1) classifying the sperm collected from the animal according to the fertility by the dual (Dual) staining method; And (2) comparing the expression amounts of proteins isolated from sperm with high fertilization ability and sperm with low fertilization ability, respectively, to select proteins with increased or decreased expression; It provides a method of obtaining a marker for predicting fertility of the animal comprising a.
  • the step (1) by treating heparin further comprising the step of inducing the acquisition of sperm fertilization can be found markers affecting the conception ability after acquiring fertility.
  • the step of selecting the protein of (2) it is preferable to analyze the concentration of the spot using PD Quest.
  • the present invention provides a composition and prediction method for predicting the conception ability of the animal through the analysis of the protein expressed differently according to the conception ability of the individual, to predict the conception and fertility acquisition aspect of the animal, the animal having a high conception ability It is very useful for easy selection and stable production of excellent animals.
  • Figure 1 shows the separation of proteins in the sperm of a high conception individual and sperm of a low conception individual by 2-D electrophoresis.
  • Figures 2 to 6 show the analysis of sperm protein in the sperm of high and low gestational subjects.
  • CTC chlorotetracycline
  • 11 to 14 show the strength of capacitated sperm proteins in sperm having sperm with different fertility.
  • Figure 15 is a protein isolated by 2-D electrophoresis to show the difference in the amount of expression depending on the ability to conceive.
  • Figure 16 shows the separation of proteins showing the difference in expression according to the conception capacity after obtaining fertility by 2-D electrophoresis.
  • 17 is apoptosis-stimulating of p53 protein 2 which was highly expressed in the sperm of a high conception individual was isolated by 2-D electrophoresis.
  • the present invention relates to a marker for predicting fertility of the animal, a composition for predicting and a prediction method.
  • a marker for predicting fertility of the animal a composition for predicting and a prediction method.
  • the markers include bovine mitochondrial F1-ATPase (Bovine) in combination with porin, roporin, enolase 1, actin-related protein T2, and aurovertin B. mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), alpha-tubulin, phosphatidylethanolamine-binding protein 1, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase dehydrogenase), ATP synthase subunit, alpha-2-HS-glycoprotein, PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), cytochrome b-c1 complex subunit 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) and one or more selected from the group consisting of apoptosis-stimulating of p53 protein 2.
  • Bovine bovine mitochondrial F1-ATPase
  • Aurovertin B mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B
  • the marker for predicting fertility of animal sperm refers to an organic biomolecule expressed differently according to conception ability.
  • Organic biomolecules include, but are not limited to, for example, polypeptides, proteins, nucleic acids, lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars, and the like.
  • the marker for predicting fertility in the present invention may be a protein that is overexpressed in other sperm or a nucleic acid encoding the same.
  • the marker of the present invention can be obtained by analyzing a protein showing a difference in expression amount between sperm of a fertilizing animal and sperm having a low fertility.
  • the marker can be obtained by treating the sperm with different fertility and heparin to obtain fertility, and then separating and analyzing proteins expressed differently in the sperm.
  • step (1) after the treatment of heparin further comprises the step of inducing the acquisition of sperm fertilization can obtain a marker that affects the conception ability after acquiring fertility.
  • the dual staining method comprises the steps of 1) adding sperm to a solution of H33258, culturing in a light-blocking state; 2) suspending the pellets by centrifugation after removing excess staining; 3) observing the suspension under epifluoresce illumination using UV and BP filters.
  • the suspension may comprise PBS, which may consist of 750 ⁇ CTC, 20 ⁇ Tris, 130 ⁇ NaCl and 5 ⁇ cystein.
  • the classification of sperm fertilization ability includes classifying according to the sperm film pattern. According to the sperm's membrane pattern, it can be classified into F (when living and incapacitating ability), B (when living and incapable of acquiring ability), and AR (when living and acrosome responds).
  • the step of selecting the protein of (2) can be analyzed the concentration of the spot using PD Quest.
  • the animal is not limited in kind, but is preferably a cow.
  • the protein expressed before the fertility is obtained 287 protein spots in the sperm of the low fertility individuals, 301 protein spots can be found in the sperm of the high fertility individuals have.
  • the concentration of spots was analyzed using PD-Quest, 12 proteins were expressed high in sperm of a low fertility individual, and one protein was expressed high in sperm of a high fertility individual. It became.
  • highly expressed porin was obtained at low fertilization ability.
  • the protein levels of sperm of low fertility individuals and sperm of high fertility individuals were analyzed to find 592 and 394 protein spots. It was expressed in each sperm.
  • a total of eight protein spots showed different expression patterns according to the conception ability. Four of these proteins were highly expressed in the sperm of individuals with low fertility, and four of them were highly expressed in the sperm of individuals with high fertility.
  • alkaline in order to obtain a protein marker of the alkaline (alkaline), it was identified a protein that is more than three times the amount of expression in the sperm of high and low gestational cattle.
  • ATP synthase subunit cytochrome b-c1 complex subunit 2
  • cytochrome b-c1 complex subunit 2 Two of seven proteins (ATP synthase subunit, cytochrome b-c1 complex subunit 2) that expressed more than three-fold expression difference in the expression of protein related to fertility were highly expressed in low fertility individuals.
  • Alpha-tubulin, alpha-2-HS-glycoprotein, PHGPx, apoptosis stimulating protein of p53 protein 2 was highly expressed in highly pregnant subjects.
  • NCBI gi No. for the marker Is as follows.
  • the present invention also relates to bovine mitochondrial F1-ATPase (Porin), Roporin (Ropporin), Enolase 1 (enolase 1), actin-related protein T2, and aurovertin B.
  • the present invention also relates to bovine mitochondrial F1-ATPase (Porin), Roporin (Ropporin), Enolase 1 (enolase 1), actin-related protein T2, and aurovertin B.
  • the animal is not limited in kind, but is preferably a cow.
  • the present invention also relates to a kit for predicting fertility of an animal comprising the predictive composition.
  • the predictive composition of the present invention may be provided in the form of microarrays and DNA and protein chips.
  • compositions for predicting fertility of an animal provided herein may require specific additional equipment, such as a PCR cycle, microarray reader, or FACS device.
  • antibodies of the present invention can be prepared using techniques well known in the art.
  • Antibodies used in the present invention include monoclonal or polyclonal antibodies, immunologically active fragments (eg, Fab or (Fab) 2 fragments), antibody heavy chains, humanized antibodies, antibody light chains, genetically engineered single chain Fv molecules, Chimeric antibodies and the like.
  • the antibodies used in the present invention can be prepared by conventional methods well known in the field of immunology using the known proteins as antigens.
  • Proteins used as antigens of the antibodies according to the invention can be extracted or synthesized in nature and can be prepared by recombinant methods based on DNA sequences.
  • a nucleic acid encoding a protein is inserted into an appropriate expression vector, the host cell is cultured so that the target protein is expressed in the transformant transformed with the recombinant expression vector, and then It can be obtained by recovering the protein.
  • polyclonal antibodies can be produced by the method of injecting a protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum comprising the antibody.
  • Such antibodies can be prepared using various warm blooded animals such as horses, cattle, goats, sheep, dogs, chickens, turkeys, rabbits, mice or rats.
  • compositions of the present invention may further comprise reagents known in the art for use in immunological assays in addition to antibodies specific for proteins.
  • Immunological analysis in the above may include any method that can measure the binding of the antigen and the antibody.
  • Such methods include, for example, immunocytochemistry and immunohistochemistry, radioimmunoassays, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblotting, and PAR assays.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • PAR assays Farr assay
  • immunoprecipitation latex aggregation, erythrocyte aggregation, non-turbidity, immunodiffusion, counter-current electrophoresis, single radical immunodiffusion, immunochromatography, protein chips and immunofluorescence.
  • Reagents used in immunological analysis include labels, solubilizers, and detergents capable of producing a detectable signal.
  • the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator.
  • the predictive composition of the present invention may be provided in an immobilized state using various methods known on a suitable carrier or support to increase the speed and convenience of diagnosis (Antibodies: A Labotory Manual, Harlow &Lane; Cold Spring Harbor, 1988).
  • suitable carriers or supports include agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, Sephadex, Sepharose, liposomes, carboxymethyl cellulose, polyacrylamides, polyesters, companion rocks, filter papers, ion exchange resins, plastic films, plastic tubes , Glass, polyamine-methyl vinyl-ether-maleic acid copolymers, amino acid copolymers, ethylene-maleic acid copolymers, nylons, cups, flat packs and the like.
  • Other solid substrates include cell culture plates, ELISA plates, tubes and polymeric membranes.
  • the support may have any possible form, for example spherical (bead), cylindrical (test tube or inner surface of the well), planar (sheet, test strip).
  • the prediction kit may be provided, for example, in the form of a lateral flow assay kit based on immunochromatography to detect a specific protein in a sample.
  • the lateral flow assay kit includes a sample pad applied to the sample, a release pad coated with a detection antibody, a developing membrane (e.g., nitro) in which the sample is moved and separated and an antigen-antibody reaction occurs. Cellulose) or strip, and an absorption pad.
  • the microarray is generally intended to attach an antibody onto a slide glass surface treated with a specific reagent to detect a protein that specifically attaches to the antibody by an antigen-antibody reaction.
  • primer refers to a short nucleic acid sequence having a short free hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template, and serves as a starting point for template strand copying.
  • Non-specific amplification refers to nucleic acid amplification other than the target sequence that occurs by primers hybridizing to nucleic acid sequences other than the target sequence and acting as a substrate for primer extension.
  • probe refers to a nucleic acid fragment, such as RNA or DNA, which is short or several hundred bases, capable of specific binding with mRNA, and is labeled. The presence or absence of a specific mRNA can be confirmed. Probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes and the like.
  • Primers or probes of the invention may be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. It can also be modified by methylation, capping, or the like by known methods.
  • composition for predicting fertility of the present invention may further include a reagent generally used in a method for detecting a nucleic acid.
  • a reagent generally used in a method for detecting a nucleic acid.
  • metal ion salts such as deoxynulceotide triphosphate (dNTP), a heat resistant polymerase, and magnesium chloride required for a PCR reaction may be included, and include dNTP, a sequencease, etc. required for sequencing. Can be.
  • the present invention (1) in the sample (Porin), alpha-tubulin (alpha-tubulin), ATP synthase subunit (ATP synthase subunit), alpha-2-HS-glycoprotein (alpha-2-HS- glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), cytochrome b-c1 complex subunit 2 and apoptosis-stimulating of p53 protein 2 Measuring mRNA or protein levels of the marker for predicting fertility of the at least one selected animal; And (2) analyzing the increase or decrease in the amount of mRNA or protein expression.
  • the sample is preferably bovine sperm.
  • the expression level of the mRNA or protein of the marker for increased may further comprise the step of predicting that the conception ability of the animal is low.
  • apoptosis-stimulating of alpha-tubulin, alpha-2-HS-glycoprotein (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), and p53 protein 2 p53 protein 2) may further comprise the step of predicting the high fertility of the animal if the expression level of the mRNA or protein of the marker for predicting the conception ability of one or more animals selected from the group consisting of.
  • the present invention (1) bovine mitochonds combined with Ropoorin, Enolase 1, actin-related protein T2 and aurovertin B in fertilized sperm obtained from fertility Rial F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), alpha-tubulin, phosphatidylethanolamine-binding protein 1, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA for predicting fertility markers of at least one animal selected from the group consisting of (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx), and apoptosis-stimulating of p53 protein 2 Or measuring protein levels; And (2) analyzing the increase or decrease in the amount of mRNA or protein expression.
  • the gain of fertility can be induced by treating heparin.
  • the expression level of the mRNA or protein of the fertility predictor marker of one or more animals selected from the group consisting of Ropoorin, Enolase 1 and PHGPx (PHGPx) increases, It may further include the step of predicting that the low fertility of.
  • actin-related protein T2 bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B
  • alpha-tubulin phosphatidyl Phosphatidylethanolamine-binding protein 1, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and apoptosis-stimulating of p53 protein 2
  • the expression level of the mRNA or protein of the fertility predictor marker of the at least one animal selected from the group may further comprise the step of predicting that the fertility of the animal is high.
  • NRR Non-Return Rate
  • the medium was incubated at a temperature of 39 ° C. with 5% CO 2 in air for the night before the day of the experiment.
  • the acidity and osmoticity of the medium were maintained at 7.5 and 300 mOsmo / kg, respectively.
  • TALP medium to which 10 ⁇ g / ml of heparin (Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA) was added was used as a capacitation medium (CM).
  • CM capacitation medium
  • sperm was induced to acquire fertility under conditions of 400 ⁇ L of CM, 5% CO 2 , 39 ° C. for 20 minutes. After 20 minutes, the obtained sperm was centrifuged at 20,000 Xg for 2 minutes, and the supernatant was removed.
  • Fertility status is described by Perez et al. It was determined by slightly modifying the Dual staining method devised by (1996). More specifically, 15 ⁇ l of H33258 solution (10 ⁇ g H33258 / ml D-PBS) was added to 100 ⁇ l of Korean sperm and incubated at 39 ° C. for 5 minutes in a light-blocked bucket. Excess staining was removed by layer separation of the mixture using 250 ⁇ l of 2% poly vinylpyrrolidone in PBS.
  • sperm were classified as follows.
  • Dead Type D, with bright blue fluorescence on sperm head
  • Live and capacitive live non capacitated (F type, with bright green fluorescence evenly over the entire sperm head with strong or no fluorescence in the center)
  • Live capacitated type B, dark fluorescence on the acrosome region and dark back of the acrosome
  • Live acrosome reacted (AR type, green fluorescence on the sperm head or green fluorescence on the back of the acrosome or no fluorescence on the head)
  • 450 ul of rehydration solution without sperm sample was added to the IPG box kit, and then placed on an IPG strip (24 cm, pH 4-7 and non linear), and this condition was maintained at room temperature for 24 hours in consideration of the hydration time. Maintained.
  • the hydrated strip was placed in a strip holder manifold (top of the gel), and 450 ul of rehydration solution containing sperm protein was soaked in the paper bridge and placed on top of the strip. Covered with mineral oil.
  • Application time was set at 200V (16 hours), 300V (2 hours), 600V (2 hours), 1000V (1 hour), 8000V (1 hour), 10000V (40000Vhr). 100V (1 hour), 200V (1 hour ), 500V (1 hour), 1000V (1 hour), 5000V (1.5 hours), and 8000V (1.5 hours) were set, and the voltage gradient was 40000Vhr.
  • Strips of interest were added to 10 ml of equilibration buffer [0.67 ml of 1.5 M Tris-cl (pH 8.8) / ml, 6 M of urea, 30% (v / v) glycerol, 2% (w / v) sodium dodecyl sulfate and 0.005% (w / v) bromophenol blue] for 15 min. , Equilibrated with 135 mM iodine acetamide in 10 ml of equilibration buffer for 15 minutes.
  • Silver staining of the gel was performed with a slight modification of the method proposed by Roncoletta et al. (1996). Silver staining was divided into five stages: fixing, sensitizing, staining, developing and stopping.
  • the gel was scanned at high resolution of GS-800 (Bio-rad). Protein spots of each gel were found with PDQuest (Bio-rad) and spots were found while warping and matching all gel sets.
  • Trypsin cleaved peptides of the secreted proteins were analyzed using nanoflow electrospray and liquid chromatography on a QTOFII (Micromass, UK) mass spectrometer.
  • Peptides were isolated using a two-way solvent system on a C18 reverse phase column (0.15 mm ⁇ 150 mm, VC-10-C18-150; Micro-Tech Scientific, Vista, CA, USA).
  • the binary solvent system consists of solvent A consisting of 98.9 wt% water, 1 wt% acetonitrile, 0.2 wt% formic acid and 94.8 wt% acetonitrile, 5 wt% water, 0.2 wt% formic acid It consisted of B.
  • Peptides were eluted from the column with a linear gradient program that changes the composition of the solvent from 5% B to 90% B for 100 minutes at a constant rate of 1 i L / min. Data of the eluted peptides were obtained using Water MassLynx 4.0 software. The first 40 minutes of MS / MS analysis (1 ⁇ l injected into each site) was performed to confirm the quality and concentration of the secretome. The final data were obtained using 180 min analyses (injecting approximately 2 ⁇ g protein based on the intensity of the initial operation) in data-dependant mode. To optimize peptide coverage, we maintained a list of mass / ion exclusions to ensure that peptides with the same MS / MS were not selected. Analysis of two samples from each cell line was repeated to confirm the reliability of the MS results.
  • H-1, H-2, H-3 is a sperm of a high fertility individual
  • L-1, L-2, L-3 is a sperm of a low fertility individual.
  • 200 ⁇ g of protein was placed on each gel. The molecular weight is indicated on the vertical axis, and the pH range is indicated on the horizontal axis (pH range is indicated so that the end of the gel is low). All experiments were repeated three times, and the spots shown included increased / decreased or missing protein expression in small or large size gels. The other points are marked with arrows.
  • the inventors identified 287 ⁇ 20.07 and 301 ⁇ 25.33 spots in the group classified according to conception ability (high and low conception capacity), respectively. Thirteen protein expression spots showed significant differences in fertility and the number of increased or decreased spots (more than threefold in intensity) was also detected. In the sperm of low fertility individuals 12 spots were expressed higher than in sperm of high fertility individuals.
  • porin (porin) protein expressed highly in sperm of a low fertility individual has been described as a mechanism for sperm motility and apoptosis.
  • the remaining proteins are not yet known in mechanism and name.
  • sperm from individuals with different fertility abilities derived from bulls were fertilized (20 min CM) and no fertility gain was obtained (NCM, not cultured). .
  • FIG. 7 shows that the sperm of an individual showing a difference in conception ability was treated with 10 ⁇ g / ml heparin for 20 minutes to induce fertility and then analyzed using chlorotetracycline (CTC) fluorescence assay. It is shown.
  • CTC chlorotetracycline
  • a and b indicate that there was a significant difference between the control group and the F pattern group by T-test (P ⁇ 0.05), and A and B were the control group and B by T-test. The pattern was significantly different between groups (P ⁇ 0.05).
  • sperm (B pattern) obtained with fertility were markedly increased in CM as compared to NCM.
  • Prediction composition of the present invention can be used in the form of a kit, protein chips, etc. that can predict the conception ability of the animal, it is possible to select an animal with excellent conception ability.

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Abstract

본 발명은 동물의 수태능력 예측용 마커, 수태능력 예측용 조성물 및 수태능력을 예측하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 동물의 수태능력에 따라 달리 발현되는 마커를 발굴하고, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 마커를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 조성물 및 이를 이용하여 동물의 수태 능력을 예측하는 방법에 관한 것이다.

Description

수태능력 예측용 마커
본 발명은 동물의 수태능력 예측용 마커 및 수태능력을 예측하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 동물의 수태능력에 따라 달리 발현되는 마커를 발굴하고, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 마커를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 조성물 및 이를 이용하여 동물의 수태 능력을 예측하는 방법에 관한 것이다.
인공 수정 (AI)은 가치 있는 유전자들의 빠른 공급과 동물 혈통의 유전적 질을 향상시키기 위해 사용되어 왔다. 소의 경우에는 인공 수정 시 소 동결 정액을 주로 사용하는데, 이는 특정 유전자의 보급을 통해서 유전적으로 소의 생산능력을 향상시키는데 중요한 역할을 하고 있다.
그러나 인공수정에 의한 종자는 약 50% 정도의 성공률만 보이고 있다. 하나의 황소 동결 정액이 수천 마리의 소를 수태시키는데 사용되어지기 때문에 높은 수정 능력을 가진 황소의 생산은 임신율을 증가 시키는데 매우 높은 경제적인 가치를 가지게 된다. 여러 실험들에 의해 정자 수, 운동성, 형태학적인 면, 정자 막의 손상정도, 자궁경부 정액이나 난모세포의 침투력 등이 동물의 수태능력을 결정하는 요소라고 연구되고 있어도, 상기의 요소들이 소의 수태 능력에도 영향을 미친다고 정확히 입증되지는 않았다. 더욱이, 생체 내에서는 높은 수태 능력을 가지고 있는 것으로 증명된 황소라도 시험관 내에서는 그 수태 능력이 달라질 수가 있다.
상기와 같은 이유로, 동물의 수태능력을 예측할 수 있는 효율적인 방법에 대한 연구는 필요하며 특히, 소에서 수태능력과 관련된 마커를 획득하는 것이 절실한 상황이다.
포유류 정자는 생리학적인 변화를 일으켜 수정 능력을 획득할 수 있는 상태가 되는데 까지 어느 정도의 시간이 요구된다. 이러한 변화를 수정능 획득 (capacitaion)이라고 한다. 수정능 획득은 싸이클릭 AMP (cyclic AMP)에 의한 타이로신 인산화 효소 (tyrosine kinase), 정자막의 지질, 단백질 변화, 이온의 이동, 정자의 운동성, 단백질 이동, 단백질 인산화와 관련이 있다는 연구들이 보고되고 있다. 수정능 획득 (capacitation)과 수태능력 (fertility)은 깊은 관련성이 있기 때문에, 수정능 획득 상태는 수태능력을 결정하는데 매우 중요하다.
본 발명자는 수태능력을 예측할 수 있는 마커 개발에 대한 필요성을 인식하고, 이를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 동물의 수태능력에 따라 발현량이 달라지는 단백질 마커를 찾아내고, 이를 이용하여 높은 수태능력을 가지는 동물 및 낮은 수태능력을 가지는 동물을 선별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 동물의 수태능력 예측용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동물의 수태능력 예측용 마커의 항체 및 마커를 암호화하는 유전자에 특이적인 프라이머 등을 포함하는 수태능력 예측용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물의 수태능력을 예측하는 방법을 제공하는데 있다.
또한 본 발명은 동물의 수태능력 예측용 마커의 획득방법을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된, 동물의 정자에서 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 동물의 수태능력 예측용 마커를 제공한다.
또한 본 발명은 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 조성물을 제공한다.
상기 동물은 소가 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 마커에 특이적인 항체가 포함된 동물의 수태능력 예측용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 조성물을 제공한다.
상기 동물은 소가 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 마커를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 시료에서 포린 (Porin), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (2) 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 분석하는 단계를 포함하여 동물의 수태능력을 예측하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 시료는 소의 정자인 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 포린 (Porin), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit) 및 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 낮은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 (1) 수정능 획득된 소의 정자에서 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (2) 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 분석하는 단계를 포함하여 동물의 수태능력을 예측하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1) 및 PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 낮은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한 상기 방법에 있어서, 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기 수정능 획득은 헤파린을 처리하여 유도될 수 있다.
또한 본 발명은 (1) 동물로부터 채취한 정자를 듀얼 (Dual) 염색 방법으로 수정능력에 따라 분류하는 단계; 및 (2) 수정 능력이 높은 정자와 수정 능력이 낮은 정자에서 분리된 단백질의 발현양을 각각 비교하여 발현이 증가 또는 감소된 단백질을 선별하는 단계; 를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 마커의 획득방법을 제공한다.
상기 획득방법에 있어서, 상기 (1) 단계 후 헤파린을 처리하여 정자의 수정능 획득을 유도하는 단계를 더 포함함으로써 수정능 획득 후 수태능력에 영향을 미치는 마커를 발굴할 수 있다.
또한 상기 방법에 있어서, 상기 (2)의 단백질을 선별하는 단계는 PD Quest를 이용하여 스팟의 농도를 분석하는 것이 바람직하다.
본 발명은 개체의 수태능력에 따라 달리 발현되는 단백질의 분석을 통하여 동물의 수태능력 예측용 조성물 및 예측 방법을 제공함으로써, 동물의 수태능력 및 수정능 획득 양상을 예측하고, 높은 수태능력을 가지는 동물을 쉽게 선별하여 우수 동물의 안정적 생산을 도모하는데 매우 유용하다.
도 1은 고수태성 개체의 정자와 저수태성 개체의 정자에서의 단백질을 2-D 전기영동으로 분리해 낸 것이다.
도 2 내지 6은 고수태성 개체의 정자와 저수태성 개체의 정자에서 정자 단백질의 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 고수태성 개체의 정자와 저수태성 개체의 정자에 20분간 10 μg/ml 헤파린(heparin)을 처리하여 수정능 획득을 야기 시킨 후 클로로테트라싸이클린 (CTC) 형광 염색(fluorescence assay)을 이용하여 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 8 내지 10은 수정능 획득 후 수태능력이 낮은 정자(왼쪽)와 수태능력이 높은 정자 세포 (오른쪽)의 2-D 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 11 내지 14는 다른 수태 능력을 가지는 정자에서 수정능 획득 정자의 단백질 (capacitated sperm proteins)의 강도를 나타낸 것이다.
도 15는 수태능력에 따라 발현량의 차이를 보이는 단백질들을 2-D 전기영동하여 분리해낸 것이다.
도 16은 수정능 획득 후 수태능력에 따라 발현량의 차이를 보이는 단백질들을 2-D 전기영동하여 분리해낸 것이다.
도 17은 수태능력이 높은 개체의 정자에서 발현이 높았던 apoptosis-stimulating of p53 protein 2 를 2-D 전기영동으로 분리해낸 것이다.
본 발명은 동물의 수태능력 예측용 마커, 예측용 조성물 및 예측 방법에 관한 것이다. 이하 본 발명에 대해 자세히 설명한다.
상기 마커는 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택한 것이다.
동물 정자의 수정능력 예측용 마커란 수태능력에 따라 달리 발현되는 유기 생체 분자를 말한다. 유기 생체 분자로는 예를 들면, 이에 한정하지는 않으나, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등이 포함된다. 본 발명에서의 수정 능력 예측용 마커는 수정 능력이 다른 정자에서 과량 발현되는 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산일 수 있다.
본 발명의 상기 마커는 수정능력이 높은 동물의 정자와 수정능력이 낮은 정자 사이에서 발현량의 차이를 보이는 단백질을 분석하여 획득할 수 있다. 또한 상기 마커는 수정능력이 다른 정자를 헤파린 처리하여 수정능을 획득시킨 후, 정자에서 달리 발현되는 단백질을 분리, 분석함으로써 획득할 수 있다.
예를 들어, (1) 동물로부터 채취한 정자를 듀얼 (Dual) 염색 방법으로 수정능력에 따라 분류하는 단계; 및 (2) 수정 능력이 높은 정자와 수정 능력이 낮은 정자에서 분리된 단백질의 발현양을 각각 비교하여 발현이 증가 또는 감소된 단백질을 선별하는 단계; 를 포함하여 수태능력 예측용 마커를 획득할 수 있다.
또한 상기 (1) 단계 후 헤파린을 처리하여 정자의 수정능 획득을 유도하는 단계를 더 포함함으로써 수정능 획득 후 수태능력에 영향을 미치는 마커를 발굴할 수 있다.
상기 듀얼 염색방법은 1) 정자를 H33258 용액에 첨가하고, 빛을 차단한 상태에서 배양하는 단계; 2) 과잉 염색을 제거한 후, 원심분리를 통해 펠렛을 현탁시키는 단계; 3) 상기 현탁액을 UV와 BP 필터를 사용하여 에피플루오레센스 조명 하에서 관찰하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 현탁액은 PBS를 포함할 수 있으며, PBS 는 750 μM CTC, 20 μM Tris, 130 μM NaCl 및 5 μM 시스테인 (cystein)으로 이루어질 수 있다.
상기 획득 방법에 있어서, 정자의 수정 능력의 분류는 정자 막 패턴에 따라 분류하는 것을 포함한다. 정자의 막 패턴에 따라 F (살아 있으면서 수정능 획득 능력이 없는 경우), B (살아 있으면서 수정능 획득 능력이 있는 경우), AR (살아있으면서 첨체부위가 반응을 하는 경우)로 분류할 수 있다.
또한 상기 (2)의 단백질을 선별하는 단계는 PD Quest 를 이용하여 스팟의 농도를 분석할 수 있다.
본 발명에서 동물은 그 종류가 제한되지 않으나, 바람직하게는 소이다.
본 발명의 실시예에 의하면, 수정능 획득하기 전에 발현되는 단백질은, 수태능력이 낮은 개체의 정자에서는 287개의 단백질 스팟 (spot)이, 수태능력이 높은 개체의 정자에서는 301개의 단백질 스팟을 찾을 수 있다. PD-Quest 를 이용하여 스팟의 농도를 분석한 본 발명의 실시예에 의하면, 12개의 단백질이 수태능력이 낮은 개체의 정자에서 높게 발현되었으며, 1개의 단백질이 수태능력이 높은 개체의 정자에서 높게 발현되었다. 이 13개의 단백질 스팟을 LC/MS-MS 를 이용하여 분석한 결과, 낮은 수정 능력에서 높게 발현된 포린 (Porin)을 획득할 수 있었다.
더 나아가, 본 발명의 실시예에 의하면, 헤파린 처리를 통해 수정능 획득을 유도시킨 후 수태능력이 낮은 개체의 정자와 수태능력이 높은 개체의 정자의 단백질 수준을 분석한 결과 592개와 394개의 단백질 스팟이 각각의 정자에서 발현되었다. 본 발명의 실시예에서는 PD-Quest 를 이용하여 스팟의 농도를 분석한 결과 총 8개의 단백질 스팟이 수태 능력에 따라 다른 발현양상을 나타내었다. 그 중 4개의 단백질이 수태 능력이 낮은 개체의 정자에서 높게 발현되었고, 그 중 4개의 단백질이 수태 능력이 높은 개체의 정자에서 높게 발현되었다. 이 8개의 단백질 스팟을 LC/MS-MS 를 이용하여 분석한 결과, 수정 능력이 낮은 개체에서 운동성을 저해하는 로포린 (ropporin) 및 이상 정자와 미성숙 정자 생성에 관여하는 에놀레이즈 1 (enolase 1)이 높게 발현되었다. 반면에 수정능 획득과 첨체반응 및 수정 후 생식세포분열에 관여하는 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related T2)가 수태 능력이 높은 개체에서 높게 발현되었다. 또한 본 발명에서 새롭게 발견된 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B) 단백질이 수태 능력이 높은 개체에서 높게 발현되었다.
또한 본 발명의 일 실시예에서는 알칼리 (alkaline) 부분의 단백질 마커를 획득하고자, 고수태성 한우와 저수태성 한우의 정자에서 발현량이 3배 이상 차이나는 단백질을 동정하였다.
수태능력 관련 단백질 발현비교에서 3배 이상 발현차이를 나타내는 단백질 총 7개 중 2개 (ATP 합성효소 서브유닛, 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2)가 낮은 저수태성 개체에서 높게 발현 하였으며, 5개의 단백질 (알파-튜뷸린, 알파-2-HS-당단백질, PHGPx, p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질)이 고수태성 개체에서 높게 발현되었다.
또한 수태능력에 따른 수정능 획득 관련 단백질 중 3배 이상 차이를 보이는 단백질은 5개 있었으며, 총 5개 중 4개 (알파-튜뷸린, 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소, p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질)가 고수태성 개체에서 높게 발현되고, 오직 하나의 단백질 (PHGPx)만이 저수태성 개체에서 높게 발현되었다.
PHGPx의 경우, 수정능 획득 전에는 수태능력이 높은 개체에서 발현이 높게 되지만 수정능 획득 후에는 수태능력이 낮은 개체에서 높게 발현되었다.
상기 마커에 대한 NCBI gi No. 는 하기와 같다.
포린 (Porin)의 NCBI gi No.: 190201,
로포린 (ropporin)의 NCBI gi No.: 74002908,
에놀레이즈 1 (enolase 1)의 NCBI gi No.: 87196501,
액틴 관련 단백질 T2 (actin-related T2)의 NCBI gi No.: 84000199,
아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B)의 NCBI gi No.: 1827812,
알파-튜뷸린 (alpha-tubulin)의 NCBI gi No.: Q2HJ86,
포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1)의 NCBI gi No.: P13696,
글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 NCBI gi No.: Q2KJE5,
ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit)의 NCBI gi No.: P19483,
알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein)의 NCBI gi No.: P12763,
PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase)의 NCBI gi No.: Q9N2J2
시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2)의 NCBI gi No.: P23004,
p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2) 의 NCBI gi No.: Q13625
또한 본 발명은 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 조성물에 관한 것이다.
상기 동물은 그 종류가 제한되지 않으나, 바람직하게는 소 이다.
또한 본 발명은 상기 예측용 조성물을 포함하는 동물의 수태능력 예측용 키트에 관한 것이다. 키트 외에도 본 발명의 예측용 조성물은 마이크로어레이 및 DNA 및 단백질 칩의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 동물의 수태능력 예측을 위한 조성물은 PCR 사이클로, 마이크로어레이 판독기, 또는 FACS 장치와 같은 특정 부가 장비를 필요로 할 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.
본 발명의 마커 단백질들은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 상기 공지된 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며, DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.
예를 들어, 다클론 항체는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈동물을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 예측용 조성물은 단백질에 특이적인 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯 (immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 예측용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다 (Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩 (flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형 (비드), 원통형 (시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
상기 예측용 키트로는 예를 들면, 샘플 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 샘플에 적용되는 샘플패드 (sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 샘플이 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막 (예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.
상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.
당업자는 공지된 마커들의 유전자 서열을 바탕으로 표적 유전자내 서열간의 혼성화 정도 등의 변수를 고려하여, 비특이적 증폭을 유발하지 않아 특이성 및 민감성이 높은 다양한 프라이머 쌍의 조합을 쉽게 결정할 수 있다. 본 발명에서 상기 용어, "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산 서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 말한다. "비특이적 증폭"이란 표적 서열 이외의 핵산 서열에 프라이머가 하이브리드되어, 프라이머 연장의 기질로서 작용함으로써 일어나는 표적 서열 이외의 핵산증폭을 지칭하는 말이다.
mRNA 수준 측정을 위한 제제의 또 다른 예인, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
상기 본 발명의 수태 능력 예측용 조성물은 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP (deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속 이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 (1) 시료에서 포린 (Porin), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (2) 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 분석하는 단계를 포함하여 동물의 수태능력을 예측하는 방법에 관한 것이다.
상기 시료는 소의 정자가 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 포린 (Porin), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit) 및 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 낮은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 (1) 수정능 획득된 소의 정자에서 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (2) 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 분석하는 단계를 포함하여 동물의 수태능력을 예측하는 방법에 관한 것이다.
상기 수정능 획득은 헤파린을 처리하여 유도될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1) 및 PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 낮은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다
<실시예 1> 재료 준비
1-1. 정액의 근원과 수정 능력의 분류
본 발명에서는 인공수정 (AI) 단계에서 정상의 생식 능력을 가졌던 한우동결 정액을 사용하였다. 한우동결 정액의 NRR (발정비재귀율: Non-Return rate) 수치는 각 농가의 수태 자료에서 얻었다. NRR은 전체 소의 수에 대해서 60일까지의 후기 수태까지 발정을 보이지 않았던 소의 수에 대한 비율로서 결정되었다. 수태 능력은 황소의 60일까지의 NRR로 표현되고, 그 범위는 47.78 에서 88.3% 로 나타냈다 (p<0.05, 표 1).
표 1 생식 수행에 따른 소들의 분류
수태능력 ID No. of inseminated cows NRR (%)
높음 537 25 88.3±1.84
641 15 80.56±5.78
642 45 88.56±2.73
평균 85 85.80a
낮음 550 90 51.31±7.09
606 183 36.24±4.38
622 79 56.80±6.68
평균 352 48.12b
a, b 는 ANOVA 에 의해 p<0.05 범위에서 유의적인 차이가 있었음을 나타냄.
1-2.배지의 준비
100mM NaCl, 3.1 mM KCl, 2.0 mM CaCl2H2O, 0.4mM MgCl6H2O, 0.3 mM Na2HPO4, 12H2O, 21.6 mM 소디움 락테이트 (sodium lactate), 25 mM NaHCO3, 1.0 mM 피루브산 나트륨 (Sodium pyruvate)이 포함된 TALP 배지를 기본 배지로 사용하였다.
이 배지는 실험일 하루 전의 밤 동안 공기 중 5%의 CO2, 온도 39℃의 조건에서 배양해 두었다. 배지의 산도와 삼투는 각각 7.5 와 300mOsmo/kg 으로 유지하였다.
10 μg/ml의 헤파린 (heparin) (Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA) 을 첨가한 TALP 배지를 수정능 획득 배지 (capacitation medium, CM)로 사용하였다.
1-3.정자 준비와 처리
6마리 소의 스트로(straws)를 39℃의 물에서 20초 동안 해동시킨 후, 고수태성 개체의 정자와 저수태성 개체의 정자, 두 그룹으로 나누었다. 해동한 정자를 불연속적인 Percoll density gradient로 세척하였다.
45% 와 90% 퍼콜 (Percoll)에 층을 이룬 정자를 인산염 완충 용액 (phosphate buffered saline: PBS) 으로 희석시켰다. 400 Xg로 20분 동안 상온에서 원심분리 한 후에 상청액을 제거하고, 펠렛을 다시 300㎕의 TALP에 현탁하였다. 그리고 400 Xg 로 5분간 원심 분리 한 후 상청액을 버렸다 (수정능을 획득하지 못한 그룹 ; NC).
정자를 20분 동안 400㎕의 CM, 5 %의 CO2, 39℃ 조건으로 수정능 획득을 유도시켰다. 20분 후에 수정능을 획득한 정자를 20,000 Xg 에서 2분 동안 원심 분리 한 후 상청액을 제거했다.
<실시예 2> 실험 과정
2-1. 수정능 획득 단계에서의 Combined Hoechst 33258/ 클로테트라싸이클린(chlortetracycline) 형광 분석 (H33258/CTC)
수정 능력 상태는 Perez et al. (1996)에 의해 고안된 듀얼 (Dual) 염색 방법을 약간 변형시켜서 결정하였다. 보다 구체적으로는, 100㎕의 한우 정자에 15㎕의 H33258 용액 (10㎍ H33258/ml D-PBS)을 첨가하고, 빛을 차단한 물통에 5분간 39℃에서 배양하였다. 과잉 염색은 PBS에서 2% 폴리 비닐피로리돈 (poly vinylpyrrolidone) 250 ㎕를 사용해 혼합물의 층분리를 통해 제거하였다. 5분 동안 400 Xg 에서 원심분리 한 후, 상청액은 버리고, 펠렛을 100㎕의 PBS 와 100 ㎕의 새롭게 준비된 CTC 용액 (5ml 완충용액 안의 750 μM CTC, 완충용액은 20 μM Tris, 130 μM NaCl, 5 μM 시스테인)에 현탁하였다.
시료들을 H33258과 CTC 각각에 대하여 UV BP 340-380/LP 425 와 BP 450-490/LP 515 excitation/emission 필터를 사용하여 에피플루오레센스 (epifluorescence) 조명하에 Nikon microphot-FXA로 관찰하였다.
표 2에 나타난 바와 같이 정자를 다음과 같이 분류하였다.
- 죽은 경우: Dead (D 타입, 정자 두부 위에 핵이 밝은 파란 형광을 띄는 경우)
- 살아 있으면서 수정능 획득 능력이 없는 경우 : live non capacitated (F 타입, 전체 정자 두부에 균등하게 밝은 녹색 형광을 띄면서 가운데 부분에 강한 형광을 띄고 있거나 띄지 않은 경우)
- 살아 있으면서 수정능 획득 능력이 있는 경우 : live capacitated (B 타입, 첨체 부위 위에 초록 형광 및 첨체 뒷부분이 어두운 경우)
- 살아 있으면서 첨체부위가 반응을 하는 경우 : live acrosome reacted (AR 타입, 정자 두부 위에 반상문의 초록형광 또는 첨체 뒷부분에만 초록 형광 또는 두부에 형광이 없는 경우)
모든 정자는 가운데 부분에 녹색 형광을 띄고 있었다. 각 샘플에 대한 두개의 슬라이드는 하나의 슬라이드당 적어도 400개의 정자가 있다고 추정하였다.
표 2 CTC 염색에 따른 정자막 패턴의 정의
패턴 묘사
F 사정된 정자가 전체로 형광을 띄는 경우: 수정능을 획득하지 못한 정자의 특징
B 밴드 형태로 발현되거나 오직 첨체부분에서만 형광을 띄는 경우: 수정능 획득한 정자의 특징
AR 전형적인 첨체 반응 정자
2-2. 2-D 전기 영동
한우의 수태능력 및 수태능력에 따른 수정능획득 관련 마커 중 alkaline 부분의 단백질 마커를 획득하고자 고수태성 한우 3 개체와 저수태성 한우 3개체의 정자를 이용하여 7-11, 3-7pH 범위에서 10% 아크릴아미드 겔 (acrylamide gel)을 사용하여 2-Dimensional Electrophoresis (2-DE)를 수행하였으며, densitometer에서 발현이 3배 이상 차이를 나타내는 단백질을 동정하였다.
상온에서 정자 샘플들을 7M 요소 (urea), 2M 티오요소 (thiourea), 4% CHAPS, 0.05% 트리톤 (Triton) X-100, 1% 옥틸 베타-D-글루코피로사이드 (octyl β-D-glucopyroside), 24μM 페닐메탄 설포닐 플루오르 (phenylmethane sulfonyl fluoride), 0.1% DTT, 0.5% IPG 완충용액과 0.005% 브로모페놀 블루 (bromophenol blue)가 포함된 1ml의 재수화 완충액 (rehydration buffer)으로 1시간동안 용해시켰다. 20,000Xg으로 10분간 원심분리하여 불용해성 물질을 제거하고, 상층액을 모았다. 단백질의 양은 450ul의 평형 샘플 용액에서 200㎍으로 유지시켰다.
정자샘플이 첨가되지 않은 450ul의 재수화 용액을 IPG 박스 키트에 첨가한 후, IPG strip (24cm, pH 4-7 및, non linear) 위에 올리고, 수화시간을 고려하여 상온에서 24시간 동안 이 상태를 유지시켰다. 그리고 수화된 스트립 (strip)을 스트립 홀더 매니폴드 (strip holder manifold) (겔의 윗부분)에 두고, 정자 단백질이 포함된 재수화용액 450 ul를 페이퍼 브릿지(paper bridge)에 적신 후 스트립의 상단에 올리고 미네랄 오일로 덮었다. 적용 시간을 200V (16시간), 300V (2시간), 600V (2시간), 1000V (1시간), 8000V (1시간), 10000V (40000Vhr)로 하였다.100V (1시간), 200V (1시간), 500V (1시간), 1000V (1시간), 5000V (1.5시간), 8000V (1.5 시간)으로 설정하고, 전압 경사(voltage gradient)는 40000Vhr 로 하였다.
관심있는 스트립 (strip)을 각각의 스트립에 65 mM DTT가 포함된 10ml의 평형 완충액 [0.67 ml of 1.5 M Tris-cl (pH 8.8)/ml, 6 M의 요소 (urea), 30% (v/v) 글라이세롤 (glycerol), 2% (w/v) 도데실 황산 나트륨 (Sodium dodecyl sulfate) 및 0.005% (w/v) 브로모페놀 블루 (bromophenol blue)] 으로 15분간 평형상태가 되도록 하였고, 15분 동안 10ml의 평형 완충액 속에서 135mM 요오드 아세트 아미드 (iodoacetamide) 로 평형을 유지시켰다.
겔의 실버 (Silver) 염색은 Roncoletta et al.(1996) 에 의해 제안된 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 실버 염색은 고정 (fixing), 감광 (sensitizing), 염색 (staining), 현상 (developing), 정지 (stopping) 5단계로 나뉘었다.
각각의 겔을 5% (v/v) 아세트산과 50% (v/v) 에탄올 안에서 20분간 고정시켰고, 증류수(DW)로 20분간 2번 세척했다. 증류수로 2분간 2번 세척하면서 0.02% (w/v) 소디움 티오설페이트 (sodium thiosulfate)에서 감광 (sensitizing)시켰다. 0.1 % (w/v) 질산 은 (silver nitrate)으로 겔을 염색시킨 후 각각을 증류수로 1분간 세척했다. 단백질 스팟은 0.1%(v/v) 포름알데히드(formaldehyde)를 포함하는 4% (w/v) 탄산나트륨 (sodium carbonate)으로 현상시켰고, 각각의 용액은 깨끗한 것으로 사용하였다. 현상된 겔은 1% (v/v) 아세트산으로 이동을 중지시켰다.
2-3. 겔 분석
겔을 GS-800 (Bio-rad)의 높은 해상도로 스캔하였다. 각각의 겔의 단백질 스팟 (spot)들은 PDQuest (Bio-rad)로 찾아냈고, 워핑 (warping)하고 모든 겔 세트에 매칭 시키면서 스팟 (spot)을 찾아냈다.
이 실험을 통해 스팟 양에 있어서 표시된 차이는 소프트웨어 장치로 진행되었을 때 3배 이상의 차이가 있었다. 'Spot parameters' 윈도우로 상기 스팟들의 양을 읽어냈다. 'Comparisions window'로 결과를 도출해냈고, 다르게 표현된 숫자는 이미 알고 있는 부피 비율 (volume ratio)과 비교하였다.
2-4. 단백질 분해
마른 단백질 부분들을 요소 (8M), EDTA (5 mM) 및 TCEP (10 mM) 를 포함한 용액(10㎕)으로 용해시키고, 제거하였다. 그런 후, 약 2시간 동안 상온에서 배양시켰다. 과잉 알킬화의 문제를 피하기 위해 15개 시스테인 (cysteines)의 공간을 닫아 주지 (capped) 않았고, 안전한 TCEP를 유지시켜줌으로써 다이설파이드 (disulfides)의 재형성을 막았다. 최종적으로 2M의 요소를 얻기 위해 pH 7.8의 암모니움 바이카보네이트 (ammonium bicarbonate) 50mM을 사용하여, 제거된 단백질들을 40㎕로 희석시켰다. 서열화한 트립신 (trypsin) (20pmol) (V5111, Pomega, Madison, WI)을 단백질 용액에 첨가하여 37℃로 밤새 절단시켰다.
2-5. LC-MS/MS 분석
분비된 단백질들의 트립신으로 절단된 펩타이드 (peptide)는 QTOFⅡ (Micromass, UK) 질량 분광계의 나노플로 전자 분무 (nanoflow electrospray)와 액체 크로마토그래피 (liquid chromatography)를 사용하여 분석했다. 펩타이드는 C18 reverse phase column (0.15 mm X 150mm, VC-10-C18-150 ; Micro-Tech Scientific , Vista, CA, USA) 에서 2원의 용매시스템을 사용하여 분리되었다. 2원의 용매 시스템은 98.9중량% 물, 1중량% 아세토니트릴 (acetonitrile), 0.2중량% 포름산으로 구성된 용매 A와 94.8중량% 아세토니트릴 (acetonitrile), 5중량% 물, 0.2중량% 포름산으로 구성된 용매 B 로 구성되었다. 펩타이드는 1 iL/ min의 일정한 속도로 100분 동안 5% B 에서 90% B로 용매의 구성을 변화시키는 리니어 그래디언트 프로그램 (linear gradient program) 으로 컬럼에서 용출됐다. 용출된 펩타이드의 자료는 Water MassLynx 4.0 소프트웨어를 사용하여 얻었다. 처음 40분의 MS/ MS 분석 (각 부위에 1㎕ 주입됨)은 세크레톰 (secretome)의 질과 농도를 확인하기 위해 수행했다. 마지막 자료는 자료 의존 모드 (data-dependant mode)에서 180 min analyses (처음 동작의 강도를 기본으로 약 2 μg 단백질을 주입함) 를 사용하여 얻었다. 펩타이드 적용범위를 최적화하기 위해 질량/이온 배제 (exclusion) 목록을 유지하여 MS/MS 가 같은 펩타이드가 선택되지 않도록 했다. MS 결과의 신뢰도를 확인하기 위해 각각의 세포라인에서 얻은 두 개의 표본의 분석을 반복 수행하였다.
2-6. 통계학적 분석
통계 분석은 통계 소프트웨어 프로그램 SPSS 버전 12.0 (USA)을 사용하여 수행하였다 수정능 획득 상태와 생체 내 수정능력 (NRR)의 현저한 차이를 결정하기 위해 T-test를 계산하였다. P < 0.05는 범위에서 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.
본 발명의 소 동결 정액에서 수정능 획득 능력과 상대적인 생식능력에 관련된 단백질 발현에 대한 결과는 다음과 같았다.
<실시예 3> 수태능력에 따른 단백질 발현
3-1. 수태 능력에 따른 단백질 발현
소 정액에 2-DE를 수행하여 얻은 결과를 설명하기 위해, 3번의 실험을 PDQest 프로그램으로 겔 분석을 수행하였고, 그 결과는 하기 표 3, 도 1 및 도 2 내지 6에 나타난 바와 같았다.
표 3 겔 분석을 통한 정자 프로테옴 평가
Experimental comparison 참고 겔에서 검출된 총 스팟의 수 다른 정자와 비교했을 때 발현양이 증가한 스팟의 수 다른 정자와 비교했을 때 발현양이 감소된 스팟의 수
수정능력이 낮은 경우 287 ±20.07 12 1
수정능력이 높은 경우 301 ±25.33 1 12
도 1에서, H-1, H-2, H-3는 수태능력이 높은 개체의 정자, L-1, L-2, L-3은 수태능력이 낮은 개체의 정자에 대한 것이다. 각 겔에는 200μg의 단백질을 올려놓았다. 분자량은 세로축에 표시되었고, pH 범위는 가로축 (pH 범위는 겔의 끝부분이 낮도록 표시)에 표시되었다. 모든 실험은 세 번씩 반복했으며, 나타난 스팟들은 작거나 큰 사이즈의 겔에서 증가된/감소된 발현 또는 빠진 단백질 발현을 포함하고 있다. 다른 점들은 화살표로 표시해두었다.
본 발명자들은 287 ± 20. 07 과 301 ± 25.33개의 스팟들을 수태 능력에 따라 (높고 낮은 수태 능력) 분류된 그룹에서 각각 확인하였다. 13개의 단백질 발현 스팟이 수정 능력에 따라 현저한 강도차이를 보였으며, 증가되거나 감소한 스팟 (강도에서 3배 이상의 차이를 보임)의 수도 감지되었다. 수태능력이 낮은 개체의 정자에서는 12개의 스팟들이 수태능력이 높은 개체의 정자에서보다 높게 발현되었다.
다시 말해서, 오직 하나의 스팟만이 수태능력이 높은 개체의 정자에서 높게 발현되었다. 적어도 세개의 펩타이드에 의해 확인된 13개의 스팟들만이 다르게 발현되었는 바, 본 발명자들은 수태 능력이 다른 정액에서 13개의 단백질이 다르게 발현됨을 2-DE와 더불어 LC/MS-MS 질량 분광계 분석을 통하여 확인할 수 있었다.
상기 13개의 단백질 스팟을 LC/MS-MS를 이용하여 분석한 결과, 수태능력이 낮은 개체의 정자에서 높게 발현된 포린 (porin) 단백질만이 정자의 운동성 및 세포사멸에 관한 기전 설명이 되어 있으며, 나머지 단백질은 아직 기전 및 명칭이 밝혀지지 않았다.
도 2 내지 6은 수정 능력의 차이에 따라 정자에서 달리 발현되는 단백질의 분석을 나타낸 것이다. 이를 설명하기 위해서 3번의 실험을 PDQest 소프트웨어로 상세한 겔 분석을 실행하였다. 위의 스팟과 흰 막대는 수태능력이 높은 개체의 정자에서의 단백질 발현양이고 아래의 스팟과 검은 막대는 수태능력이 낮은 개체의 정자에서의 단백질 발현양이다.
3-2. 다른 수태능력을 가진 개체의 정자에서의 수정능 획득과 관련된 단백질 확인
수정능 획득과 관련된 단백질을 확인하기 위해, 황소에서 유래된 서로 다른 수태 능력을 가진 개체의 정자를 수정능 획득하도록 하였다 (20분간 CM).또한 수정능 획득하지 못하도록 두었다 (NCM,배양하지 않음).
우선, 수정능 획득 상태는 CTC/H33258 염색에 의해 결정되었다.
도 7은 수태능력의 차이를 보이는 개체의 정자에 20분간 10 ㎍/ml 헤파린(heparin)을 처리하여 수정능 획득을 야기 시킨 후 클로로테트라싸이클린 (CTC) 형광 염색(fluorescence assay)을 이용하여 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 7의 자료는 F, B, AR로 표시된 % 세포들 (mean ± SEM ) 로 나타낸 것이다.
도 7에서, a, b는 T-test 에 의해 대조군(control) 과 F 패턴 그룹간에 유의적인 차이가 있었음을 나타내고 (P<0.05), A, B는 T-test 에 의해 대조군(control) 과 B 패턴 (pattern) 그룹간에 유의적으로 다른 양상을 보였음을 나타내는 것이다 (P<0.05).
B 패턴은 수정능 획득과 관련이 있기 때문에 수정능 획득한 정자는 높은 수정 능력을 갖게 되고, 수정능을 획득하지 못한 정자는 낮은 수정 능력을 갖게 된다. 도 7에 의하면, 수정능을 획득한 정자 (B 패턴)는 NCM 과 비교했을 때 현저하게 CM에서 증가되어 있었다.
두 번째로, 2-DE 로 수정능 획득에 따른 정자에서 발현되는 단백질을 확인하였다. 수정능 획득한 단백질과 그렇지 않은 단백질을 확인하였다. 3번의 실험은 PDQest 소프트웨어를 사용하여 겔을 분석하였고, 그 결과는 표 4, 도 8 내지 10, 도 11 내지 14, 도 15 에 나타냈다..
낮은 수태능력의 정자에서는 모두 529 ± 94.64 개의 단백질 스팟이, 높은 수태능력의 정자에서는 모두 394 ± 41.41 개의 단백질 스팟이 발현되었다. 이 단백질 중에서 8개의 스팟이 수태 능력에 따른 단백질 발현에서 현저하게 다름을 보였다 (강도에서 3배 이상의 차이를 보임) (표 4 및 도 8 내지 10 참조).
표 4 자동 겔 분석에 의한 수정능 획득된 정자 단백질의 설명
실험적 비교 참조 겔에서 발견된 전체 스팟 수 다른 겔과 비교했을 때 하나의 겔위에서 높게 발현된 스팟의 수 (전체 스팟 수의 퍼센트) 다른 겔과 비교했을 때 하나의 겔 위에서 낮게 발현된 스팟의 수 (전체 스팟 수의 퍼센트)
수태 능력이 낮은 정자에서의 단백질 (capacitated protein in low fertility) 529±94.64 4 4
수태 능력이 높은 정자에서의 단백질 (capacitated protein in high fertility) 394±41.41 4 4
수정능을 획득한 후에, 높은 수태능력을 가지는 정자(high fertility capacitation sperm)는 낮은 수태능력을 가지는 정자 (low fertility capacitation sperm)와 비교했을 때 4개의 스팟에서 높은 발현을 보였다 (도 11 내지 12 참조). 반면에 수정능 획득 후 4개의 스팟은 높은 수태능력을 가지는 정자와 비교했을 때 낮은 수태능력을 가지는 정자에서 높은 발현을 보였다 도 13 내지 14 참조). 이러한 단백질들은 LC/MS-MS 질량 분광계에 의해 확인되었다 (표 5 참조). 즉, 수태능력이 낮은 개체에서 운동성을 저해하는 로포린 (ropporin) 및 이상 정자와 미성숙정자 생성에 관여하는 에놀레이즈 1 (enolase 1)이 높게 발현되었다. 반면에 수정능 획득과 첨체반응 및 수정 후 생식세포분열에 관련하는 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related T2)가 수태능력이 높은 개체에서 높게 발현되었다. 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B) 또한 수태능력이 높은 개체에서 높게 발현되었다. 이는 수정능 획득에 영향을 미치는 단백질일 것임을 유추해낼 수 있었다.
표 5 다르게 표현된 단백질들
기능 스팟 No. NCBI gi No. 단백질 이름 펩타이드
운동성 관련 11 190201 포린 (porin) K.LTFDTTFSPNTGK.K
1111 74002908 예상: 로포린, 단백질 1과 연합된 로피린 R.FTEEIEWLK.F
수정능 획득과 첨체반응 관련 2404 84000199 액틴 관련 단백질 T2 K.AGLSGEIGPR.H
해당 작용/ 미성숙 정자 생성에 관여 5508 87196501 에놀레이즈 1 K.SCNCLLLK.V + 2 Carbamidomethyl (C)
기능이 알려지지 않음 1505 1827812 체인 D (chain D), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase K.VLDSGAPIR.I
다른 단백질들 1 189054178 이름이 정해지지 않은 단백질 K.YEELQITAGR.H
2 189054178 이름이 정해지지 않은 단백질 R.DYQELMNTK.L
3 28317 이름이 정해지지 않은 단백질 K.VTMQNLNDR.L
4 28317 이름이 정해지지 않은 단백질 K.DAEAWFNEK.S
5 12859782 이름이 정해지지 않은 단백질 R.TNAENEFVTIK.K
6 12859782 이름이 정해지지 않은 단백질 R.FLEQQNQVLQTK.W
7 189054178 이름이 정해지지 않은 단백질 R.DYQELMNTK.L
8 119912330 예상: 가상 단백질 K.QAMQNLNDR.L
9 189054178 이름이 정해지지 않은 단백질 R.SLVNLGGSK.S
10 189054178 이름이 정해지지 않은 단백질 K.YEELQITAGR.H
12 12859782 이름이 정해지지 않은 단백질 R.TNAENEFVTIK.K
13 126308132 예상: 가상 단백질 R.LENEIETYR.R
312 189054178 이름이 정해지지 않은 단백질 K.AEAESLYQSK.Y
1525 56242 이름이 정해지지 않은 단백질 K.LVDENLLFHGEASEQLR.T
2419 189054178 이름이 정해지지 않은 단백질 R.DYQELMNTK.L
3411 28317 이름이 정해지지 않은 단백질 R.VLDELTLTK.A
3-3. 알칼리 수태능력 예측용 마커 발굴
한우의 수태능력 및 수태능력에 따른 수정능 획득 관련 마커 중 알칼리 (alkaline) 부분의 단백질 마커를 획득하고자, 고수태성 한우 3개체와 저수태성 한우 3개체의 정자를 이용하여 7-11pH 범위에서 10% 아크릴아미드 겔 (acrylamide gel)을 사용하여 2-DE를 수행하였으며, densitometer 에서 발현이 3배 이상 차이를 나타내는 단백질을 동정하였다 (도 15, 16, 17).
수태능력 관련 단백질 발현비교에서 세 배 이상 발현 차이를 나타내는 단백질 총 7개 중 2개가 저수태성 개체에서 높게 발현을 하였으며, 5개의 단백질이 고수태성 개체에서 높게 발현하였다. 또한 수태능력에 따른 수정능 획득 관련 단백질 중 3배 이상 차이를 보이는 단백질은 5개가 있었으며 총 5개 중 4개가 고수태성 개체에서 높에 발현되고, 오직 하나의 단백질만이 저수태성 개체에서 높게 발현하였다. 이 단백질을 LC-MS/MS를 이용하여 분석한 결과는 표 6과 같다.
표 6 외에 pH 3-7 범위에서 spot no.2606 의 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2, NCBI gi No.:Q13625)이 고수태성 개체의 정자에서 높게 발현됨을 확인할 수 있었다 (도 17) .
즉, 수태능력 관련 단백질 발현비교에서 3배 이상 발현차이를 나타내는 단백질 총 7개 중 2개 (ATP 합성효소 서브유닛, 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2)가 저수태성 개체에서 높게 발현되었으며, 5개의 단백질 (알파-튜뷸린, 알파-2-HS-당단백질, PHGPx, p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질)이 고수태성 개체에서 높게 발현되었다. 또한 수태능력에 따른 수정능 획득 관련 단백질 중 3배 이상 차이를 보이는 단백질은 5개 있었으며, 총 5개 중 4개 (알파-튜뷸린, 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질)가 고수태성 개체에서 높게 발현되고, 오직 하나의 단백질 (PHGPx)만이 저수태성 개체에서 높게 발현되었다.
표 6
기능 spot No. NCBI gi No. 단백질 이름 펩타이드
운동성 관련 (motility related) 35 Q2HJ86 Alpha-tubulin R.TIQFVDWCPTGFK.V
111 P13696 phosphatidylethanolamine-binding protein 1 K.LYEQLSGK.-
해당/ 미성숙 정자(glycolysis/immature sperm) 5830 Q2KJE5 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase K.AGIALNDNFVK.L
대사 관련 (metabolism related) 4846 P19483 ATP synthase subunit R.VLSIGDGIAR.V
305 P12763 alpha-2-HS-glycoprotein R.HTFSGVASVESSSGEAFHVGK.T
단백질 산화 (protein oxidation) 6016 Q9N2J2 phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) K.DLPCYL.-
티로신 인산화 관련 (tyrosine phosphorylation) 2632 P23004 as cytochrom b-c1 complex subunit 2 R.GSNATSSLYQAVAK.G
본 발명의 예측용 조성물은 동물의 수태능력을 예측할 수 있는 키트, 단백질 칩 등의 형태로 사용하여, 수태능력이 우수한 동물을 선별할 수 있다.

Claims (18)

  1. 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된, 동물의 정자에서 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 동물의 수태능력 예측용 마커.
  2. 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 동물은 소 인것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 2항의 조성물을 포함하는 동물의 수태능력 예측용 키트.
  5. 포린 (Porin), 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 동물은 소 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5항의 조성물을 포함하는 동물의 수태능력 예측용 키트
  8. (1) 시료에서 포린 (Porin), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase), 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (2) 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 분석하는 단계를 포함하여 동물의 수태능력을 예측하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 시료는 소의 정자임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 포린 (Porin), ATP 합성효소 서브유닛 (ATP synthase subunit) 및 시토크롬 b-c1 콤플렉스 서브유닛 2 (cytochrom b-c1 complex subunit 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 낮은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 알파-2-HS-당단백질 (alpha-2-HS-glycoprotein), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. (1) 수정능 획득된 소의 정자에서 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1), 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (2) 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 분석하는 단계를 포함하여 동물의 수태능력을 예측하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 로포린 (Ropporin), 에놀레이즈 1 (enolase 1) 및 PHGPx (phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 낮은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 액틴 관련 단백질 T2 (actin-related protein T2), 아우로버틴 B와 결합된 소 미토콘드리알 F1-ATPase (Bovine mitochondrial F1-ATPase complexed with Aurovertin B), 알파-튜뷸린 (alpha-tubulin), 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질 1 (phosphatidylethanolamine-binding protein 1), 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 및 p53 단백질 2의 세포 사멸 자극 단백질 (apoptosis-stimulating of p53 protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 동물의 수태능력 예측용 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 증가하면 동물의 수태능력이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12항에 있어서, 수정능 획득은 헤파린을 처리하여 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. (1) 동물로부터 채취한 정자를 듀얼 (Dual) 염색 방법으로 수정능력에 따라 분류하는 단계; 및
    (2) 수정 능력이 높은 정자와 수정 능력이 낮은 정자에서 분리된 단백질의 발현양을 각각 비교하여 발현이 증가 또는 감소된 단백질을 선별하는 단계;
    를 포함하는 동물의 수태능력 예측용 마커의 획득방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 (1) 단계 후 헤파린을 처리하여 정자의 수정능 획득을 유도하는 단계를 더 포함함으로써 수정능 획득 후 수태능력에 영향을 미치는 마커를 발굴하는 것을 특징으로 하는 획득방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 (2)의 단백질을 선별하는 단계는 PD Quest를 이용하여 스팟의 농도를 분석하는 것을 특징으로 하는 획득방법.
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