KR20090025459A - 정배수성 정자의 선별법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 정배수성 정자의 선별법에 관한 것으로, 정자의 생존과 온전성 여부를 판별하는 저장액팽창검사 (Hypo-Osmotic Swelling Test, 이하 HOST라 한다) 및 정자에 형광 DNA프로브를 붙여 염색체수를 알아보는 형광면역접합법 (Fluorescence In Sity Hybridzation, 이하 FISH라 한다)을 병행함으로써 건강한 정자를 가려내는 확률을 획기적으로 높인 방법을 제공한다.
본 발명의 선별법에 따르면, 정자 수와 활동이 정상적이지 않은 남성이 염색체수에 이상이 있는 정자를 생산할 확률이 30-70%에 달해 불임, 유산, 기형아 출산 가능성이 높은 문제점을 극복하고, 불임 남성에게서도 정상적인 정자를 추출할 가능성이 높아져 시험관 아기 시술 등 불임 클리닉의 성공률을 개선하고 유산이나 기형아 출산 확률을 획기적으로 낮출 수 있다.
형광면역접합법, 이수성, 정자 선별, 저장액팽창검사
Description
본 발명은 정배수성 정자의 선별법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 정자의 생존과 온전성 여부를 판별하는 저장액팽창검사(Hypo-Osmotic Swelling Test, 이하 HOST라 한다) 및 정자에 형광 DNA 프로브를 붙여 염색체수를 알아보는 형광면역접합법(Fluorescence In Sity Hybridzation, 이하 FISH라 한다)를 병행함으로써 건강한 정자를 가려내는 확률을 획기적으로 높인 방법에 관한 것이다.
불임의 빈도는 15% 가량으로 단일 질환중 빈도가 가장 높으며, 이중 절반은 남성측 요인에 의한 불임으로, 이 경우 남성불임증 환자의 정자는 높은 염색체 수 이상을 흔히 동반하는 것으로 알려져 있다. 실제로 정자 수와 활동성이 정상적인 남성은 염색체 수에 이상이 있는 정자를 약10%정도 생산하는데 반해 비정상적인 남성은 염색체 수에 이상이 있는 정자를 생산할 확률이 30-70%에 달하여 불임, 유산, 기형아 출산 가능성이 높은 것으로 알려져있다.
근래들어, 세포질내 정자 직접 주입술 (Intracytoplasmic Sperm Injection, 이하 ‘ICSI’ 라 한다)와 같이 불임에 대한 치료가 현저한 개선을 보이고 있는 가 운데, 세포유전적으로 비정상적인 결과를 최소화할 필요가 증가하고 있다. 이뿐 아니라 정상인에게서도 유산과 염색체 이상은 증가하는 추세인데, 특히 늦은 분만연령에 의한 염색체 이상이 증가추세에 있다.
이에 Fertility & Sterility Jakab (2005, 84:1665-1673)등에 따르면, 히알루론산에 결합한 정자의 염색체 수 이상의 전체 정자에 비해 염색체 수 이상이 현저하게 감소(최고 6배 감소)하므로, 보조생식술 시행 시 히알루론산에 결합한 정자를 사용하면 염색체 수 이상을 감소시킬 수 있다고 제안하고 있다.
그러나 수정에 대하여 세포유전적으로 정상적인 정자를 선별하기 위한 비침투성을 갖는 도구는 아직까지 제시된 바 없다. 따라서 정자 특성과 이수성(aneuploidy)을 동시에 측정할 뿐 아니라 임상적으로도 손쉽게 적용할 수 있는 기술에 대한 개발 필요성이 절실하다.
한편, 유전질환의 진단에 이용되는 FISH 방법은 최근 들어 염색체 이상이나 착상전유전자진단 (PGD) 등에 유용하게 사용되고 있다.
이에 본 발명자는 정자의 생존과 온전성 여부를 판별하는 HOST 방법과 염색체 수의 이상 여부를 파악하는 FISH 방법을 병행함으로써 세포유전적으로 비정상적인 결과를 최소화하고 건강한 정자를 가려내는 확률을 획기적으로 높일 수 있다는 점에 착안하여 연구를 계속한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 일 목적은 정자 특성과 이수성을 동시에 측정할 뿐 아니라 임상적으로도 손쉽게 적용할 수 있는 정자 선별법을 제공하려는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 이와같이 하여 선별된 정배수성 정자를 제공하려는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 선별된 정배수성 정자를 이용하여 보조생식술을 시행하는 수정방법을 제공하려는데 있다.
본 발명의 일견지에 의하면,
정자를 선별함에 있어서,
상기 정자를 저장액 팽창검사 (Hypo-Osmotic Swelling Test)를 통하여 정자의 생존과 온전성 여부를 판별하고 생존성과 온전성을 모두 갖는 그룹의 슬라이드를 선별하는 단계; 이와 동시에 혹은 순차적으로
선별된 슬라이드에 형광 DNA프로브를 붙여 염색체수를 알아보는 형광면역접 합법 (Fluorescence In Sity Hybridzation)을 통하여 이수성까지 함께 갖는 정자를 꼬리-끝 팽창을 보이는 정자 그룹의 선별로서 판별하는 단계; 를 수행하여 이루어지는 정배수성 정자를 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2견지에 의하면,
상기 일견지의 방법에 의해 선별된 꼬리-끝 팽창을 갖는 정배수성 정자를 제공한다.
본 발명의 제3견지에 의하면,
상기 제2견지의 정배수성 정자를 이용하여 보조생식술을 시행하는 수정방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명은 정자를 저장액 팽창검사 (Hypo-Osmotic Swelling Test)를 통하여 정자의 생존과 온전성 여부를 판별하고 생존성과 온전성을 모두 갖는 그룹의 슬라이드를 선별하는 단계; 이와 동시에 혹은 순차적으로 선별된 슬라이드에 형광 DNA 프로브를 붙여 염색체수를 알아보는 형광면역접합법 (Fluorescence In Sity Hybridzation)을 통하여 이수성까지 함께 갖는 정자를 꼬리-끝 팽창을 보이는 정자 그룹의 선별로서 판별하는 단계; 를 수행하여 이루어진다.
이때 상기 저장액팽창검사는 이에 한정하는 것은 아니나, 선별하려는 정자를 정자 내부보다 농도가 낮은 저장액에 정자를 넣어 슬라이드를 작성하고 삼투압 원리에 의한 정자의 팽창 여부를 a에서 g까지 7가지 형태로 분류하는 것으로, 이 가운데 정자의 꼬리 끝 부분이 팽창되는 b～d 형태가 온전하게 살아있는 정자가 되는 것으로 정자 특성을 확인하는 기술로 적용된다(도 1 참조).
이와 동시에 혹은 순차적으로, 상기 저장액팽창검사에 의해 정자꼬리의 팽창을 나눈 슬라이드에 형광면역접합법을 적용하게 된다. 형광면역접합법은 정자 속 염색체에 형광 물질을 묻힌 DNA를 부착해 형광물질로 빛나는 염색체 수를 파악함으로써 염색체 수의 이상 여부를 파악하는 것으로, 이수성 특성을 확인하는 기술로 적용된다. 구체적으로 상기 형광면역접합법은 염색체 1/13/21 및 X/Y/18에 대하여 2가지 DNA 프로브 셋트를 사용하여 3가지 프로브 3가지 색상 면역접합법을 동시에 수행하여 상 염색체(autosomes) 및 성 염색체(sex chromosomes) 모두에 대한 정자의 팽창 유형에 따른 염색체 이상을 동시에 탐색할 수 있다.
특히 인간 정자내 이수성 및 생존율을 동시에 판단하기 위하여 저장액내에 팽윤시킨 다음 FISH법을 적용하는 것이 바람직하다.
상기 정배수성 정자로는 하기 실시예에서 규명한 바와 같이, FISH에 의한 염 색 결과에 기초하여 꼬리-끝 팽창을 보이는 정자를 선별하는 것이 그렇지 않은 경우에 비해 남성불임환자에게서 발생가능한 염색체 이상에 의한 문제점을 17배 낮추는 이점을 갖는 측면에서 볼 때 바람직하다.
이와 같은 정자 선별법에 의해 선별된 정배수성 정자가 제공된다. 또한, 이들 정배수성 정자를 이용하여 보조생식술을 시행하는 것을 특징으로 하는 수정방법이 제공된다.
즉, 하기 실시예에서도 규명된 바와 같이, 인간 정자내 이수성 및 생존율을 동시에 판단하기 위하여 저장액 매질내에 팽윤시킨 다음 FISH법을 적용한 결과,
첫째, 가임남성과 불임남성내 이수성의 총 빈도는 각각 1.03% 및 4.31%이었고, 초기 비-선별 정자, 꼬리 팽창을 갖지 않는 정자, E,F, 및 G타입 팽창 패턴을 갖는 정자와 대비하여 볼 때 꼬리-끝 팽창 패턴을 보이는 정자에서 이수성 빈도가 실질적으로 감퇴한 것을 확인할 수 있다.
둘째, 초기 비선별 정자 꼬리 팽창을 갖지 않는 정자와 대비할 때 꼬리-끝 팽창을 보이는 정자에서 현저히 낮은 유의성(p<0.05)을 갖는 이수성 빈도가 검출된 것을 확인할 수 있었다.
셋째, 가임 남성과 불임 남성내 이배성 정자 세포의 평균 빈도는 각각 0.02% 및1.17%이었다. 초기 비선별 정자와 대비할 때 꼬리-끝 팽창을 보이는 정자와 E 및 F 팽창을 갖는 정자에서 현저하게 낮은 유의성(p<0.05)을 갖는 이수성 빈도가 검출되었다.
넷째, 초기 비선별 정자와 대비할 때 꼬리-끝 팽창 패턴을 보이는 정자에 있어서, 가임남성내 총 이수성 빈도는 7.9배 감소하였으며, 불임남성의 총 이수성 빈도는 17.2배 감소하였다(p<0.05). 특히, 정자꼬리 팽창이 b,c,d에 해당하는 정자의 염색체 수 이상이 최고 17배 감소한 것을 확인할 수 있다(도 2 참조).
다섯째, HOST법과 FISH법을 병행할 경우 비정상적인 정자가 추출되는 확률이 20배 가량 낮아진 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 선별법에 따르면, 정자 수와 운동성이 정상적이지 않은 남성이 염색체수에 이상이 있는 정자를 생산할 확률이 30-70%에 달해 불임, 유산, 기형아 출산 가능성이 높은 문제점을 극복하고, 불임 남성에게서도 정상적인 정자를 추출할 가능성이 높아져 시험관 아기 시술 등 불임 클리닉의 성공률을 개선하고 유산이나 기형아 출산 확률을 획기적으로 낮출 수 있다.
실시예
1:
HOST
법과
FISH
법 병행
본 실시예는 HOST에 의해 관찰된 특이한 정자 꼬리 팽창 패턴이 이수성 정자로부터 정상 정자를 판별하는데 유용한지를 확인하기 위한 것이다.
인간 정자내 이수성 및 생존율을 동시에 판단하기 위하여 저장액 용액내에 팽윤시키면서 FISH법을 적용하였다.
구체적으로는, 도 1을 참조하면, 정자를 저장액에 노출 후 슬라이드를 작성 하고 정자꼬리의 팽창 형태에 따라 a,b,c,d,e,f,g 그룹으로 분류하였다. 상기 a그룹은 무변화 (죽은 정자 혹은 정자막이 손상된 정자)를, 그리고 b 내지 g그룹은 다양한 꼬리 변화 (정자막이 온전하며 살아있는 정자)를 나타내며, 특히 b 내지 d그룹은 정자 꼬리 끝의 팽창이 있을시 가능한 형태별 분류를 나타낸다.
그런 다음 선별된 b 내지 g 그룹 관련 슬라이드에 FISH를 적용하였으며, 이때 상 염색체(autosomes) 및 성 염색체(sex chromosomes) 모두를 조사하기 위하여, 염색체 1/13/21 및 X/Y/18에 대하여 2가지 프로브 셋트를 사용하여 3가지 프로브 3가지 색상 FISH를 동시에 수행하여 정자의 팽창 유형에 따른 염색체 이상을 탐색할 수 있었다. 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 정자의 저장액 노출후 꼬리의 팽창 형태에 따라 FISH 방법의 적용시 FISH 이미지를 도시한 도면으로서, 상부측 도면을 반전시킨 하부측 도면에서 정자 꼬리의 팽창 형태를 보다 잘 확인가능하다.
상하부측 도면내에서 (a)는 도 1내 b그룹 팽창형태로 두 개의 X 염색체를 가지며(성염색체 이염색체[sex chromosome disomy]) 18번 염색체가 없는 정자 (무염색체 18[nullisomy 18])를 나타내고, (b)는 도 1내 a그룹 팽창형태로 하나의 Y 염색체와 하나의 18번 염색체를 가진 정자(Y-함유 정상정자)를 나타내며, (c)는 도 1내 g그룹 팽창형태를 가진 성염색체 무염색체를 가진 정자를 나타내며, (d)는 도 1내 e그룹 팽창형태를 가진 성염색체 무염색체를 가진 정자를 나타내고, (e)는 도 1내 a그룹 팽창형태를 가진 하나의 X 염색체와 하나의 18번 염색체를 가진 정자(X- 함유 정상정자)를 나타내며, (f)는 도 1내 b그룹 팽창형태를 가진 정자로 하나의 Y 염색체와 하나의 18번 염색체를 가진 정자를 나타낸다.
가임남성 3명과 불임남성 6명으로부터 얻은 16,370개의 정자(가임남성 9,523개 및 불임남성 6,847개)를 대상으로 이 두 방법을 함께 사용해 분석하였으며, 시험된 염색체에 대한 총 이수성의 빈도는 염색체 이수성 및 이배성(diploidy)의 총합으로 정의하고 얻어진 결과를 하기표 1에 정리하였다.
| 꼬리 팽창 패턴 | 가임남성 | 불임남성 |
| 비선별(증가 혹은 감소 X) | 1.03±0.21(1.00) | 4.31±0.88(1.00) |
| 비팽창(증가 혹은 감소 X) | 1.67±0.51(+0.62) | 4.76±1.15(+1.10) |
| 꼬리-끝 팽창(증가 혹은 감소X) | 1.13±0.13(-7.92) | 0.25±0.39(-17.24) |
| e&f 타입 팽창(증가 혹은 감소X) | 0.60±0.82(-1.72) | 3.74±4.16(-1.15) |
| g타입 팽창(증가 혹은 감소 X) | 2.15±1.37(+2.09) | 5.90±2.50(+1.37) |
상기 표에서 보듯이, 가임남성과 불임남성내 이수성의 총 빈도는 각각 1.03% 및 4.31%이었다. 모든 패턴에서 불임남성이 현저하게 빈도수치가 높았다. 초기 비-선별 정자, 꼬리 팽창을 보이지 않는 않는 정자, e, f, 및 g그룹 팽창 패턴을 갖는 정자와 대비하여 볼 때 꼬리-팁 팽창 패턴을 보이는 정자에서 이수성 빈도가 실질적으로 감퇴한 것을 확인할 수 있다.
특히 초기 비선별 정자 및 꼬리 팽창을 갖지 않는 정자와 대비할 때 꼬리-끝 팽창을 보이는 정자에서 현저히 낮은 유의성(p<0.05)을 갖는 이수성 빈도가 검출되었다.
가임 남성과 불임 남성내 이배성 정자 세포의 평균 빈도는 각각 0.02% 및 1.17%이었다. 이배성의 빈도는 꼬리-팁 팽창을 보이는 정자 세포와 e 및 f 팽창 패턴을 갖는 정자 2그룹 내에서 거의 차이가 없었다. 또한, 초기 비선별 정자와 대비할 때 꼬리-끝 팽창을 보이는 정자와 E 및 F 팽창을 갖는 정자에서 현저하게 낮은 유의성(p<0.05)을 갖는 이수성 빈도가 검출되었다.
초기 비선별 정자와 대비할 때 꼬리-끝 팽창 패턴을 보이는 정자에 있어서, 가임남성내 총 이수성 빈도는 7.9배 감소하였으며, 불임남성의 총 이수성 빈도는 17.2배 감소하였다(p<0.05). 구체적으로는 정자꼬리 팽창이 b,c,d에 해당하는 정자의 염색체 수 이상이 최고 17배 감소한 것을 도 2를 통해 확인할 수 있었다.
팽창이 없는 정자 및 G 타입 팽창을 갖는 정자내 총 이수성 빈도는 비선별 정자 세포와 대비시 다소 증가하였다. 흥미롭게도, 불임남성으로부터 총 이수성 빈도는 가임 남성으로부터 초기 비-선별 정자 세포보다 4배 정도 낮았다.
결론적으로, HOST법과 FISH법을 병행할 경우 비정상적인 정자가 추출되는 확률이 20배 가량 낮아진 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 정자 선별법에 따르면, 불임 남성에게서도 정상적인 정자를 추출할 가능성이 높아져 시험관 아기 시술 등 불임 클리닉의 성공률을 개선하고 유산이나 기형아 출산 확률을 획기적으로 낮출 수 있다.
이뿐 아니라 해당 분야에 있어서 정자의 특성과 염색체 이상여부의 연관성에 대한 단일 정자 수준 및 정자집단 전체에서의 이해가 가능하게 되며, 비정상적인 염색체를 지닌 정자의 특성 및 생리를 파악할 수 있고, 유전학적 측면에서 생식 및 발생을 전반적으로 이해할 수 있다.
나아가, 염색체 이상의 발생을 최소화하여 높은 유산 및 기형아 출생에 따른 국가의 제경비를 극소화할 수 있고, X 정자와 Y 정자의 특성을 규명함으로써 200여종이 넘는 X 염색체 관련 질환의 치료대안으로 효율적인 성 염색체 선별 기술의 개발을 제공할 수 있을 뿐 아니라 동물 산업에서도 생산성 및 경제성을 극대화할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 정자의 HOST 방법에 의하여 저장액에 노출 후 전형저긴 정자 꼬리 팽창 형태를 분류별로 나누어 도시한 도면으로서, a그룹은 무변화 (죽은 정자 혹은 정자막이 손상된 정자)를, 그리고 b 내지 g그룹은 다양한 꼬리 변화 (정자막이 온전하며 살아있는 정자)를 나타내며, 특히 b 내지 d그룹은 정자 꼬리 끝의 팽창이 있을시 가능한 형태별 분류를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 정자의 저장액 노출후 꼬리의 팽창 형태에 따라 FISH 방법의 적용시 FISH 이미지를 도시한 도면으로서, 상부측 도면을 반전시킨 하부측 도면에서 정자 꼬리의 팽창 형태를 보다 잘 확인가능한 것이다. 상하부측 도면내에서 (a)는 도 1내 b그룹 팽창형태로 두 개의 X 염색체를 가지며(성염색체 이염색체[sex chromosome disomy]) 18번 염색체가 없는 정자 (무염색체 18[nullisomy 18])를 나타내고, (b)는 도 1내 a그룹 팽창형태로 하나의 Y 염색체와 하나의 18번 염색체를 가진 정자(Y-함유 정상정자)를 나타내며, (c)는 도 1내 g그룹 팽창형태를 가진 성염색체 무염색체를 가진 정자를 나타내며, (d)는 도 1내 e그룹 팽창형태를 가진 성염색체 무염색체를 가진 정자를 나타내고, (e)는 도 1내 a그룹 팽창형태를 가진 하나의 X 염색체와 하나의 18번 염색체를 가진 정자(X-함유 정상정자)를 나타내며, (f)는 도 1내 b그룹 팽창형태를 가진 정자로 하나의 Y 염색체와 하나의 18번 염색체를 가진 정자를 나타낸다.
Claims (6)
- 정자를 선별함에 있어서,상기 정자를 저장액 팽창검사 (Hypo-Osmotic Swelling Test)를 통하여 정자의 생존과 온전성 여부를 판별하고 생존성과 온전성을 모두 갖는 그룹의 슬라이드를 선별하는 단계; 이와 동시에 혹은 순차적으로선별된 슬라이드에 형광 DNA를 붙여 염색체수를 알아보는 형광면역접합법 (Fluorescence In Sity Hybridzation)을 통하여 이수성까지 함께 갖는 정자를 꼬리-팁 팽창을 보이는 정자 그룹의 선별로서 판별하는 단계; 를 수행하여 이루어지는 정배수성 정자의 선별 방법
- 제1항에 있어서, 상기 저장액팽창검사는 상기 정자를 저장액에 노출 후 슬라이드를 작성하고 정자꼬리의 팽창 형태에 따라 그룹별 분류하는 것을 특징으로 하는 정배수성 정자의 선별 방법
- 제1항에 있어서, 상기 형광면역접합법은 상기 저장액팽창검사에 의해 저장액에 팽윤된 상태의 슬라이드 내 정자에 적용하는 것을 특징으로 하는 정배수성 정자를 선별해내는 방법
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 형광면역접합법은 염색체 1/13/21 및 X/Y/18에 대하여 2가지 프로브 셋트를 사용하여 3가지 프로브 3가지 색상 면역접합법을 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 정배수성 정자를 선별해내는 방법
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항의 선별 방법에 의해 선별된 꼬리-끝 팽창을 갖는 정배수성 정자
- 제5항의 정배수성 정자를 이용하여 보조생식술을 시행하는 것을 특징으로 하는 수정방법
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|---|---|---|---|
| KR1020070090333A KR20090025459A (ko) | 2007-09-06 | 2007-09-06 | 정배수성 정자의 선별법 |
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| KR (1) | KR20090025459A (ko) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101907620A (zh) * | 2010-08-10 | 2010-12-08 | 山东省计划生育科学技术研究所 | 一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法 |
| WO2011002251A3 (ko) * | 2009-07-01 | 2011-05-05 | 중앙대학교 산학협력단 | 수태능력 예측용 마커 |
| KR101112747B1 (ko) * | 2009-07-01 | 2012-03-13 | 중앙대학교 산학협력단 | 동물 정자의 수정능력 예측용 마커 |
| CN103235137A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-08-07 | 山西医科大学 | 利用间接免疫荧光染色检测生精细胞核蛋白的方法 |
-
2007
- 2007-09-06 KR KR1020070090333A patent/KR20090025459A/ko not_active Ceased
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| CN103235137A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-08-07 | 山西医科大学 | 利用间接免疫荧光染色检测生精细胞核蛋白的方法 |
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