WO2010150819A1 - 虚血性脳血管障害治療剤 - Google Patents

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WO2010150819A1
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cells
interleukin
gene
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博明 大星
昭彦 吉村
崇 七田
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国立大学法人九州大学
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for ischemic cerebrovascular disorder comprising a substance that inhibits the function of interleukin 17, interleukin 23 or ⁇ T cells, or a substance that inhibits infiltration of ⁇ T cells into the brain.
  • Stroke is a leading cause of death and disability worldwide, of which cerebral infarction accounts for approximately 60% of strokes.
  • the difference between cerebral infarction and other diseases is that it not only impairs the patient's QOL but also involves socio-economic loss, which is expected to become a major problem in the future of an aging society.
  • an effective treatment method that can be started in the subacute stage or late stage of cerebral infarction has not yet been established (1, 2) (Non-patent Documents 1 and 2).
  • lymphocyte recruitment and activation has been implicated in the progression of cerebral ischemic reperfusion (I / R) injury, but the role of specific lymphocyte subpopulations and cytokines in stroke It is still not clearly understood.
  • the target for acute treatment is the penumbra, a reversible tissue at the boundary between normal tissue and an irreversibly damaged tissue called ischemic core, and how to save the penumbra It can be said that it is important in maintaining prognosis.
  • the drugs currently used for acute treatment in Japan the one that keeps the penumbra is a brain protective drug.
  • RCTs randomized controlled trials
  • NXY-095 Non-patent Document 7
  • ONO-2506 Non-patent Document 7
  • it has stopped at the clinical trial stage, and since then there has been no strong one. Therefore, the development of a new mechanism of brain protection is awaited.
  • Non-patent Document 8 inflammatory cytokines
  • Treg regulatory T cells
  • Th1 Th1 cells that produce inflammatory cytokines, thereby reducing the infarct range
  • IL-17 was discovered as a new inflammatory cytokine and plays an important role in various autoimmune diseases, but especially in the breakdown of the blood-brain barrier, experimental allergic encephalitis is an animal model of multiple sclerosis. (EAE) has been shown to play a central role (Non-Patent Documents 12 and 13).
  • Non-Patent Documents 4 and 5 studies so far suggest that CD4-positive T lymphocytes and IFN ⁇ play an indispensable role in cerebral ischemic injury 3 (Non-patent Document 3).
  • I / since R is the role of IFN gamma at fault is debatable 6 (Non-Patent Document 6)
  • T lymphocyte subsets and inflammation mediators whether really involved in the development of cerebral infarction It is unknown.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for ischemic cerebrovascular disorders, particularly ischemic cerebrovascular disorders in the acute phase or subacute phase.
  • the present inventor has found that the function of interleukin 17 (IL-17), interleukin 23 (IL-23) or ⁇ T cells or the infiltration of ⁇ T cells into the brain. It has been found that the above-mentioned ischemic cerebrovascular disorder can be improved by suppressing it, and the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • a therapeutic agent for ischemic cerebrovascular disorder or a neuronal protective agent comprising at least one substance selected from the group consisting of the following (a) to (c).
  • the present invention is an interleukin 17 production inhibitor comprising the following substance (b) or (c): (a) Substance that inhibits the function of interleukin-17 (b) Substances that inhibit the function of interleukin 23 (c) a substance that inhibits the function of ⁇ T cells or infiltration of the ⁇ T cells into the brain
  • examples of the substance (a) include an antibody against interleukin 17, or an inhibitory nucleic acid of the interleukin 17 gene.
  • examples of the inhibitory nucleic acid of the interleukin 17 gene include, for example, interleukin 17 Examples include antisense nucleic acids, decoy nucleic acids, microRNAs, shRNAs, or siRNAs against genes.
  • Examples of the substance (b) include an antibody against interleukin 23, or an inhibitory nucleic acid of interleukin 23 gene.
  • Examples of the inhibitory nucleic acid of interleukin 23 gene include, for example, antisense to interleukin 23 gene.
  • a nucleic acid, a decoy nucleic acid, microRNA, shRNA, or siRNA is mentioned.
  • Examples of the substance (c) include antibodies against ⁇ T cells or inhibitory nucleic acids of ⁇ T cell receptor genes.
  • Examples of inhibitory nucleic acids of ⁇ T cell receptor genes include those against ⁇ T cell receptor genes.
  • An antisense nucleic acid, a decoy nucleic acid, microRNA, shRNA, or siRNA is mentioned.
  • the substances (a) and (b) are preferably used for cerebrovascular disorders 3 days after ischemia or thereafter.
  • the substance (c) is preferably used for cerebrovascular disorders within 24 hours after ischemia.
  • the present invention provides a new treatment for ischemic cerebrovascular disorders.
  • the substance that suppresses the function of IL-17, IL-23, or ⁇ T cells, or the infiltration of ⁇ T cells into the brain ischemic cerebrovascular disorder by suppressing the production of IL-17 or IL-23 Can be improved.
  • IL-23 and IL-17 play a major role in the development of cerebral infarction and the accompanying neurological deficits in a cerebral ischemia model.
  • invasive inflammatory cells produced IL-23 within 24 hours after the introduction of cerebral ischemia (FIG. 5).
  • IL-17 stimulates ischemic brain macrophages, microglia cells, and various other cells to produce inflammatory cytokines and other factors did.
  • IL-23 induces IL-17-producing ⁇ T lymphocytes, which maintain inflammatory responses to ischemic brain injury, and apoptotic neuronal death during the subacute phase of cerebral ischemia (FIG. 5).
  • IL-23 functions immediately after ischemia-reperfusion injury (I / R injury), whereas IL-17 is in the subacute phase (3 days after I / R injury) ) Became necessary. This indicates that IL-23 expression increases 1 day after I / R, and IL-17 producing cells enter the brain after 3 days.
  • IL-17-producing cells do not appear in IL-23 gene-deficient mice (IL-23-KO mice) having an I / R disorder, and from this, IL-17-producing cells induced by IL-23 It is shown to be a critical effector for the progression of brain damage. Moreover, intracellular cytokine staining showed that ⁇ T lymphocytes, not CD4 positive helper T cells, were the major source of IL-17. Depletion of ⁇ T lymphocytes by gene disruption or anti-TCR ⁇ antibody treatment improved brain I / R damage to the level observed in IL-17 deficient mice. Furthermore, it was observed that the administration of anti-TCR ⁇ antibody provides a neuroprotective effect even when administered 24 hours after the onset of cerebral ischemia (acute phase).
  • ⁇ T lymphocytes that have entered the brain activated by IL-23 mainly produce IL-17 and cause an inflammatory response to ischemic brain injury.
  • ⁇ T lymphocytes may be a therapeutic target for late inflammatory events that exacerbate early injury in cerebral ischemia.
  • IL-23 is involved in Th17 induction and IL-17 production, and is deeply involved in neutrophil inflammation and autoimmune diseases.
  • IL-12 acts on Th1 and is involved in the production of IFN- ⁇ and TNF- ⁇ . Since both IL-12 and IL-23 are composed of heterodimers and both have p40, suppression of p40 activity leads to the production of IL-17 as well as IFN- ⁇ and TNF- ⁇ .
  • IL-23KO expressed in the brain in the acute phase of cerebral infarction is important for the induction of IL-17-producing ⁇ T cells by an experiment using IL-23KO mice. Found to decrease. Among these, IL-23KO and IFN- ⁇ KO mice have been shown to reduce infarct volume in cerebral ischemia models.
  • Anti-p40 antibodies can be a breakthrough therapeutic agent for brain protection therapy in the acute phase of cerebral infarction.
  • inhibitor function means that each substance acts on IL-17, IL-23 or ⁇ T cells Inhibiting the activation of cytokines or cells, suppressing the expression of the respective cytokines or cells, suppressing the production of the respective cytokines, suppressing the migration of ⁇ T cells to the lesion, or IL-17 And inhibit IL-23 signaling.
  • inhibitor infiltration of ⁇ T cells into the brain means suppressing the migration of ⁇ T cells to the lesion in the brain.
  • the “substance” as long as it has the function of the IL-17, IL-23 or ⁇ T cell or the activity of inhibiting the infiltration of ⁇ T cell into the brain.
  • a substance that inhibits the function of IL-17, IL-23 or ⁇ T cells, or a substance that inhibits infiltration of ⁇ T cells into the brain antibodies against these cytokines or cells, surface proteins of these cytokines or cells
  • Inhibitory nucleic acids for genes encoding such as antisense nucleic acids, decoy nucleic acids, microRNAs, shRNAs or siRNAs.
  • IL-23 is a heterodimer of IL-23p19 (also referred to as p19) and IL-12p40 (also referred to as p40), in order to inhibit the function of IL-23, anti-p40 antibody and / or Anti-19 antibodies can be used.
  • Anti-IL-17 antibody, anti-IL-23 antibody or anti- ⁇ T cell antibody Among antibodies that can be contained in the therapeutic agent or inhibitor of the present invention, anti-IL-17 antibody, anti-IL-23 antibody and anti- ⁇ T cell An antibody can be prepared as follows.
  • (A) Preparation of polyclonal antibody (i) Preparation of antigen and solution thereof
  • a protein to be used as an immunogen (antigen) As the antigen protein, purified IL-17, purified IL-23 and ⁇ T cell surface antigens or receptors can be used, but are not limited thereto.
  • the antigen protein purified IL-17, purified IL-23 and ⁇ T cell surface antigens or receptors can be used, but are not limited thereto.
  • one or several amino acid sequences of these proteins are used. It is also possible to use a protein having an amino acid sequence in which these amino acids are deleted, substituted or added, and having IL-17, IL-23 or anti- ⁇ T cell activity.
  • the amino acid sequence information of human IL-17 and IL-23 can be obtained from NCBI database GeneID: 51561 (IL-23) 3605 (IL-17).
  • commercially available antibodies against purified IL-17, purified IL-23 and ⁇ T cells can be used, for example, human IL-17 (R & D), human IL-23 (R & D), ⁇ T. (Becton Dickison).
  • the obtained purified protein is dissolved in a buffer solution to prepare an antigen solution, and a known adjuvant can be added as necessary.
  • Immunization is performed by administering the purified IL-17 or IL-23, or a solution containing the surface antigen or receptor of ⁇ T cells to a mammal (eg, mouse, rat, rabbit, etc.). Administration is mainly performed by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the collection of serum (antiserum) obtained by the above immunization is not limited, but is performed, for example, 1 to 28 days after the last administration.
  • the antiserum can be collected from the blood of the immunized animal according to a conventional method.
  • the desired antiserum is screened from the antisera collected from each of the immunized animals.
  • a known immunoassay can be performed according to the conventional method.
  • the antibody contained in the target antiserum by the above screening is a polyclonal antibody.
  • a known purification method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel chromatography or the like can be used alone or in combination of two or more. May be adopted and implemented as appropriate.
  • Antigen and its solution can be prepared in the same manner as in the preparation of the polyclonal antibody.
  • the dose using the antigen solution, the administration interval, and the number of administrations the same methods and conditions as in the production of the polyclonal antibody can be employed.
  • Collection of antibody-producing cells (antibody-producing cells) obtained by the above immunization is not limited, but is preferably performed, for example, 1 to 14 days after the last administration, more preferably 2 to 4 days. .
  • antibody-producing cells for example, spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like are preferable, and spleen cells are more preferable.
  • a fused cell can be obtained by performing cell fusion between the collected antibody-producing cells and myeloma cells.
  • the myeloma cell for example, a cell line generally available in a mammal such as a mouse can be used. Specifically, cell lines that have drug selectivity and cannot grow on HAT selection media (hypoxanthine, aminopterin and thymine-containing media) in an unfused state, but can grow in a state fused with antibody-producing cells. preferable.
  • HAT selection media hyperxanthine, aminopterin and thymine-containing media
  • mouse myeloma cells for example, PAI, P3X63-Ag.8.U1 (P3U1), NS-I and the like can be used.
  • the cell fusion is performed, for example, by mixing antibody-producing cells and myeloma cells in a culture medium for animal cell culture such as RPMI-1640 medium without serum.
  • the mixing ratio of antibody-producing cells and myeloma cells is arbitrary, for example 5: 1.
  • the fusion reaction is preferably carried out in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
  • the cells after the fusion reaction are cultured using, for example, a HAT selective medium. After the above culture, cells in which growth on the HAT selection medium is observed become fused cells (hybridomas).
  • the target hybridoma is screened from the hybridoma obtained by the above culture.
  • the screening method is not particularly limited, and a known immunoassay method (for example, ELISA or the like) can be performed according to the usual method.
  • Cloning of the target hybridoma by the above screening that is, establishment of a monoclonal antibody-producing cell line can be generally performed by selecting colonies derived from one cell by culturing using a limiting dilution method or the like.
  • a cell culture method, ascites formation method or the like can be generally employed as a method for collecting a monoclonal antibody from the hybridoma obtained by the above cloning. These methods are well known in the art.
  • one or more known purification methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and gel chromatography can be used. A combination can be adopted and implemented as appropriate.
  • humanized antibodies, human antibodies, and fragments of the antibodies can also be used.
  • a human-type antibody (CDR-grafted antibody) is a monoclonal antibody produced by genetic engineering, and specifically, part or all of the complementarity determining region of the hypervariable region is derived from a mouse monoclonal antibody.
  • the antibody is a complementarity determining region of a hypervariable region, a framework region of the variable region is a framework region of a variable region derived from human immunoglobulin, and a constant region thereof is a constant region derived from human immunoglobulin.
  • Human-type antibodies can be prepared by methods well known in the art.
  • the human antibody is an antibody in which all regions including the variable region of the heavy chain and the constant region of the heavy chain and the variable region of the light chain and the constant region of the light chain are derived from a gene encoding human immunoglobulin.
  • the human antibody is prepared in the same manner as the above-described polyclonal antibody or monoclonal antibody by preparing a transgenic animal that produces a human antibody by a method well known in the art and immunizing the transgenic animal with an antigen. Can be manufactured.
  • the antibody fragment means a portion containing the antigen-binding region of the antibody or a portion derived from the region, and specifically F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv (variable fragment of antibody), scFv (single chain Fv), dsFv (disulphide stabilized) and the like.
  • Gene inhibitory nucleic acid Inhibitory nucleic acid of IL-17 gene, IL-23 gene or ⁇ T cell receptor gene means a nucleic acid that suppresses its gene function or gene expression, for example, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, microRNA, shRNA or siRNA Etc. These inhibitory nucleic acids can suppress the expression of the gene.
  • the base sequence of the gene to be suppressed is known, and sequence information can be obtained for each.
  • GenBank accession numbers for each gene are shown below.
  • IL-17 gene NM010552.3 (mouse), NM 002190.2 (human) IL-23 gene: NM031252 (mouse), NM 016584.2 (human) ⁇ T cell receptor ⁇ chain gene: NM 000073.2 (human) ⁇ T cell receptor ⁇ chain gene: NM000732 or NM001040651 (human) Genomic sequence including ⁇ T cell receptor ⁇ chain gene: NG001332 (human)
  • each gene is represented by the following SEQ ID NO.
  • Mouse IL-17 gene SEQ ID NO: 1 Human IL-17 gene: SEQ ID NO: 2
  • Mouse IL-23 gene SEQ ID NO: 3
  • Human IL-23 gene SEQ ID NO: 4
  • Human ⁇ T cell receptor ⁇ chain gene SEQ ID NO: 5
  • Human ⁇ T cell receptor ⁇ chain gene SEQ ID NOs: 6, 7
  • IL-23 is a heterodimer of IL-23p19 and IL-12p40, it targets either or both of IL-23p19 and IL-12p40 in order to suppress the expression of the IL-23 gene. It can be.
  • Antisense nucleic acid is a single strand that can bind to mRNA (sense) or DNA (antisense) sequence of IL-17 gene, IL-23 gene or ⁇ T cell receptor gene (target gene). Nucleic acid sequence (either RNA or DNA). The length of the antisense nucleic acid sequence is at least about 14 nucleotides, preferably about 14-100 nucleotides. Antisense nucleic acid binds to the gene sequence to form a double strand and suppresses transcription or translation.
  • Antisense nucleic acids can be produced using chemical synthesis methods or biochemical synthesis methods known in the art. For example, a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a gene recombination technique can be used.
  • Antisense nucleic acids are introduced into cells by, for example, various gene transfection methods such as DNA transfection or electroporation, or by using viral vectors.
  • a decoy nucleic acid can bind to a transcription factor of IL-17 gene, IL-23 gene or ⁇ T cell receptor gene and suppress promoter activity.
  • the decoy nucleic acid of the present invention means a short decoy nucleic acid containing a binding site for a transcription factor. The nucleic acid is introduced into a cell, and the transcription factor binds to the nucleic acid, thereby returning to the original genome binding site of the transcription factor. Is competitively inhibited, and as a result, the expression of the transcription factor is suppressed.
  • a decoy nucleic acid is a nucleic acid that can bind to a target binding sequence or an analog thereof.
  • decoy nucleic acids of the present invention include, for example, nucleic acids that can bind to transcription factors that bind to the promoters of the above genes.
  • the decoy nucleic acid can be designed as a single strand or a double strand including the complementary strand based on the promoter sequence of the gene.
  • the length is not particularly limited, and is 15 to 60 bases, preferably 20 to 30 bases.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may include modified nucleic acids and / or pseudo-nucleic acids within the nucleic acid. Further, these nucleic acids, variants thereof, or nucleic acids containing these in the molecule may be single-stranded or double-stranded, and may be circular or linear.
  • a variant is a nucleotide sequence in which one or several bases (for example, 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 2) of the decoy nucleic acid sequence are deleted, substituted, or added. And a nucleic acid having a function of inhibiting the promoter activity of the gene, that is, a function of binding to a transcription factor.
  • the decoy nucleic acid used in the present invention can be produced using a chemical synthesis method or a biochemical synthesis method known in the art.
  • a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a gene recombination technique can be used.
  • a PCR method or a gene amplification method using a cloning vector can also be used.
  • the desired nucleic acid may be produced by cleaving the nucleic acid obtained by these methods using a restriction enzyme or the like and binding using a DNA ligase.
  • a method for producing a variant of a decoy nucleic acid can be synthesized by a method known in the art, for example, by site-directed mutagenesis.
  • Site-directed mutagenesis is well known in the art, and commercially available kits such as GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.) (Manufactured by Takara Bio Inc.)).
  • luciferase assay For the analysis of the transcriptional activity of a promoter when using a decoy nucleic acid, a commonly performed luciferase assay, gel shift assay, western blotting method, FACS analysis method, RT-PCR, etc. can be employed. Kits for performing these assays are also commercially available (eg, promega dual luciferase assay kit).
  • RNA interference small nucleic acid molecules capable of regulating gene expression by RNA interference (RNAi) in cells, such as siRNA, microRNA (miRNA) and shRNA molecules
  • siRNA small interfering RNA
  • various RNAs corresponding to the target gene can be targeted. Examples of such RNA include mRNA, variants obtained by alternative splicing of the target gene, and post-transcriptionally modified RNA of the target gene. If alternative splicing results in a family of transcripts that are distinguished by the use of appropriate exons, siRNA molecules can be used to inhibit expression of exon portions or conserved sequences.
  • the target sequence on the mRNA can be selected from a cDNA sequence corresponding to the mRNA, and is preferably a region 50 to 100 nucleotides downstream from the start codon. However, the target sequence may be located in the 5 ′ or 3 ′ untranslated region or the region near the start codon.
  • siRNA molecules can be designed based on criteria well known in the art. For example, the target segment of the target mRNA can be selected as a continuous 15-30 base, preferably 19-25 base segment, preferably starting with AA (most preferred), TA, GA or CA. The GC ratio of siRNA molecules is 30 to 70%, preferably 35 to 55%.
  • siRNAs can be generated as single stranded hairpin RNA molecules that fold on their nucleic acid to generate a double stranded portion.
  • siRNA molecules can be obtained by conventional chemical synthesis.
  • siRNA molecules can be generated biologically using expression vectors containing sense and antisense siRNA sequences.
  • a method of linking siRNA synthesized in vitro to plasmid DNA and introducing it into cells a method of annealing double-stranded RNA, and the like can be employed.
  • the present invention can also use shRNA to bring about the RNAi effect.
  • An shRNA is called a short hairpin RNA, and is an RNA molecule having a stem loop structure in which a part of a single strand forms a complementary strand with another region.
  • shRNA can be designed so that a part thereof forms a stem-loop structure. For example, if the sequence of a certain region is set as sequence A and the complementary strand to sequence A is set as sequence B, these sequences are linked in the order of sequence A, spacer, and sequence B so that they are present in one RNA strand. Design to be 45-60 bases in length.
  • the sequence A is a sequence of a partial region of the target gene, and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate.
  • the length of sequence A is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases. Furthermore, this invention can suppress the expression of the said gene using microRNA.
  • MicroRNA is a single-stranded RNA with a length of 20-25 bases that exists in the cell, and is considered to have a function to regulate the expression of other genes (non coding RNA) It is a kind of. miRNAs are produced as a nucleic acid that forms a hairpin structure that is produced by being processed when transcribed into RNA and suppresses the expression of a target sequence. Since miRNA is also an inhibitory nucleic acid based on RNAi, it can be designed and synthesized according to shRNA or siRNA.
  • Ischemic cerebrovascular disorder therapeutic agent IL-17 production inhibitor and neuronal cell protective agent
  • IL-23 is released from inflammatory cells upon ischemic brain injury, and ⁇ T cells are stimulated by the stimulation. Is stimulated to produce IL-17 by ⁇ T cells. Therefore, in the present invention, a substance that inhibits the function of IL-17, IL-23, or ⁇ T cells, or a substance that inhibits the infiltration of ⁇ T cells into the brain can suppress the production of IL-17.
  • the above substance can be used as a therapeutic agent for ischemic cerebrovascular disorder, a nerve cell protective agent, and an IL-17 production inhibitor.
  • the ischemic cerebrovascular disorder to be applied in the present invention includes cerebral infarction and a transient ischemic attack (TIA) which is considered as a precursor. Cerebral infarction is classified into four types: atherothrombotic cerebral infarction, cardiogenic cerebral embolism, lacunar infarction and other cerebral infarctions (NINDS: National Institute of Neurological Disorders and Stroke).
  • the therapeutic agent of the present invention is applied to any of the above cerebral infarction and TIA.
  • spinal cord infarction can be illustrated as a disease used as the object of application in this invention. Examples of cells targeted for neuronal cell protection include cerebral neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia.
  • the period of ischemic cerebrovascular disorder to be applied in the present invention is the acute phase and the subacute phase.
  • the “acute phase” is a period within 24 hours after ischemia, and the “subacute phase” is basically within 3 days after ischemia, but ischemia gradually worsens due to the nature of vascular lesions. If you do, it can be after 3 days.
  • the substance that inhibits the function of IL-17 or the function of ⁇ T cells or the infiltration of ⁇ T cells into the brain can be applied to cerebrovascular disorders 3 days after ischemia or later.
  • a substance that inhibits the function of -23 can be applied to cerebrovascular disorders within 24 hours after ischemia.
  • Administration of the therapeutic agent, protective agent or inhibitor of the present invention into the body can be carried out by a known method such as parenteral or oral, and is not limited, but is preferably parenteral administration.
  • Formulations (parenteral agents, oral agents, etc.) used in these various usages are excipients, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, lubricants, surfactants, dispersions commonly used in drug production.
  • An agent, a buffer, a preservative, a solubilizer, a preservative, a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer, an isotonic agent and the like can be appropriately selected and used, and can be prepared by a conventional method.
  • the dosage of the therapeutic agent, protective agent or inhibitor of the present invention is generally determined by the active ingredient (anti-IL-17 antibody, anti-IL-23 antibody, anti- ⁇ T antibody, IL17 gene, IL-23 gene or Taking into account the compounding ratio of the inhibitory nucleic acid of the ⁇ T cell receptor gene), taking into account the age, weight, type of disease, progress of administration, administration route, number of administration, administration period, etc. It can be set appropriately.
  • parenteral agent or oral agent
  • its form is not generally limited.
  • any of intravenous injection including infusion
  • intramuscular injection including infusion
  • intraperitoneal injection intraperitoneal injection
  • subcutaneous injection suppository, etc. There may be.
  • the parenteral preparation can contain various known shaping materials and additives in accordance with various forms as long as the effects of the active ingredients are not impaired.
  • water, glycerol, propylene glycol, aliphatic polyalcohols such as polyethylene glycol, and the like can be mentioned.
  • the dose of parenteral agent is not limited.
  • the above-mentioned active ingredient in the case of antibody is 300 ⁇ g per 1 kg of the subject (patient) body weight. It is preferably -30 mg / day, more preferably 3-8 mg / day.
  • its form is generally not limited, and for example, any of tablets, capsules, granules, powders, pills, troches, liquids for internal use, suspensions, emulsions, syrups, etc. Alternatively, it may be a dry product which is redissolved when used.
  • the oral preparation can contain various types of excipients and additives according to various forms as long as the effect of the active ingredient is not impaired.
  • binder polyrup, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth, polyvinylpyrrolidone, etc.
  • filler lactose, sugar, corn starch, potato starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine, etc.
  • lubricant magnesium stearate, talc, Polyethylene glycol, silica, etc.
  • disintegrating agents various starches, etc.
  • wetting agents sodium lauryl sulfate, etc.
  • the dose of oral preparation is generally 1 ⁇ g to 100 mg / day, preferably 1-10 mg / day, per 1 kg body weight of the application subject (patient) of the above-mentioned active ingredient.
  • antisense nucleic acid is administered, 1 ⁇ g to 100 mg / day, preferably 1-10 mg / day, per 1 kg body weight of the subject (patient), administered continuously or once to several times a day Is done.
  • the administration route is preferably parenteral administration (for example, intravenous injection).
  • the effective amount is not particularly limited as long as it is sufficient to cause RNAi-mediated degradation of the target mRNA.
  • the effective amount to be administered to a subject taking into account factors such as the subject's height and weight, age, sex, route of administration, or local or systemic administration.
  • the siRNA, shRNA or miRNA is at an intracellular concentration of about 1 nM to about 100 nM, preferably 2 nM to 50 nM, for parenteral administration (eg, intravenous injection).
  • parenteral administration eg, intravenous injection
  • mice 1. Materials and methods mouse IL-17 -/-(29) , IL-23p19 -/-(11) , IFN ⁇ -/- , IL-6 -/- and ⁇ TCR -/- knockout (KO) mice derived from C57BL / 6 As well as wild type C57BL / 6 mice.
  • mice were cardiac perfused with cold PBS to remove blood cells.
  • the forebrain was excised from the cerebellum and fully suspended in RPMI-1640. Suspended on a shaker for 45 minutes at 37 ° C with type IV collagenase (1 mg / ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and DNaseI (50 ⁇ g / ml, Roche, Basel, Switzerland) The solution was enzyme treated.
  • Inflammatory cells were isolated by 37% / 70% Percoll (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Bucks., UK) density gradient centrifugation according to known method 19 . During this procedure, inflammatory cells were removed and washed with RPMI-1640 for further analysis.
  • Anti-TCR ⁇ antibody (UC7-13D5) was used to deplete ⁇ T lymphocytes.
  • Mice were administered PBS or 250 ⁇ g of the antibody 7 days before (ip) or 24 hours after induction of cerebral ischemia. Whether to administer PBS or antibody was randomly selected. Seven days after induction of cerebral ischemia, mice were sacrificed and infarct size was measured by anti-MAP2 immunostaining. There was no significant difference in body weight or CBF reduction between PBS-treated or antibody-treated mice and TCR ⁇ KO mice.
  • mice 9-17 week old male mice (body weight 20-30 g) were used. There was no significant difference in body weight between wild type mice and all KO groups.
  • Cerebral ischemia was induced by known method 15 .
  • mice were anesthetized with halothane in a 70% nitrous oxide / 30% oxygen mixture.
  • the head temperature was maintained at 36 ° C with a heating lamp.
  • Cerebral blood flow (CBF) in the parietal cortex was measured through the skull before and during ischemia by laser Doppler velocimetry in the ipsilateral parietal bone.
  • the quiescent CBF value for each mouse was considered the baseline for that mouse and the change in CBF value after inducing cerebral ischemia was expressed as a percentage of the quiescent value.
  • the right middle cerebral artery was occluded with 7-0 nylon monofilament (ETHILONE) using a tip with a round tip.
  • a filament (11 mm long) was inserted from the right CCA and advanced to the internal carotid artery (ICA). The distance from the suture tip to the right CCA branch was approximately 9 mm.
  • laser Doppler flow velocity measurement confirmed that CBF decreased by more than 60%.
  • the filament was withdrawn and the right MCA area was reperfused. No cerebral vascular abnormalities (evaluated by Evans blue staining) were observed in IL-17, IL-23p19, IL-6 or IFN ⁇ KO mice.
  • TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • Neurological evaluation The neurological function was blindly evaluated using a 4-point scale neurological score. The evaluation contents of each point are as follows. 0: No observable defects 1: Forelimb flexion 2: Resistance to the pressing force from the side decreases (no turning) 3: Same behavior as 2 (with turning)
  • TUNEL staining On the 4th day after reperfusion, brain DNA sections at caudoputamen level were evaluated for genomic DNA cleavage using the TUNEL kit (In situ Cell Death Detection Kit POD, Roche) . In the periphery, positively stained cells on the cortex were counted. Positive cells were considered to have spread 1 mm behind the bregma and 2.5 mm outside the midline 30 . The number of positive cells (per 0.1 square mm) in three different regions was expressed as an average value.
  • RNAiso RNAiso (Takara, Shiga, Japan) for RNA preparation.
  • Real-time PCR was performed on cDNA samples using Power SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Relative quantitative values were expressed as 2 - ⁇ Ct .
  • ⁇ Ct is the difference between the mean Ct values of duplicate measurements of the sample and the control (endogenous hypoxatin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)).
  • Intracellular cytokine staining For invasive inflammatory cells collected by Percoll for surface and intracellular cytokine staining, 50 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma-Aldrich), 1 ⁇ g / ml ionomycin (Sigma -Aldrich) and 1 ⁇ M brefeldin A (eBioscience, San Diego, Calif., USA) for 4.5 hours. Surface staining was performed for 15 minutes with the corresponding mixture of fluorescently labeled antibodies. These invading inflammatory cells derived from ischemic brain tissue were classified by different surface markers. The relationship between each inflammatory cell and the surface marker is as follows.
  • Macrophages CD45 high CD11b high; Microglia cells: CD45 high in CD11b; Neutrophils: CD45 high CD11b high Gr-1 + cells; T lymphocytes: CD45 high CD3 + cells; ⁇ T lymphocytes: CD45 high CD3 + TCR ⁇ + cells
  • FACS analysis was performed on a FACSAria instrument (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) and analyzed using FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR, USA).
  • Th17 a newly identified T lymphocyte subset. The reason is that these cells have been shown to play an essential role in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). EAE is a well-established model of T cell-mediated brain and spinal inflammation. In this model, IL-17 and other inflammatory mediators derived from Th17 cells are involved in the development and progression of EAE 7-9 . Th17 has been shown to differentiate from naive CD4 positive T cells by in vitro stimulation with IL-6 and TGF ⁇ .
  • IL-23 a heterodimer of IL-23p19 and IL-12p40, has been shown to be essential for inducing Th17 in vivo 10 .
  • IL-23 is mainly produced from antigen-presenting cells such as dendritic cells.
  • IL-23 has been demonstrated to be an important cytokine for the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) 11,12 .
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • both IL-23 and IL-17 have been reported to modify many inflammatory responses in the central nervous system 13,14 .
  • FIG. 1 shows that IL-17 or IL-23 deficiency attenuated cerebral ischemic injury.
  • A The result of measuring the time course of the volume of the infarct portion by TTC staining on the first day and the fourth day.
  • B Anti-MAP2 immunostaining of day 7 brain section.
  • C Neurological scores of WT and KO mice on day 1 and day 4.
  • D Results of TUNEL staining on day 4 brain section (scale bar: 100 ⁇ m). *: P ⁇ 0.05, **: P ⁇ 0.01, ***: P ⁇ 0.001 vs wild type (universal ANOVA using Dunnett's correction, error bar, sd). The number of mice is indicated on the bar.
  • the volume of the infarct area was evaluated on days 1 and 4 by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining 16 .
  • TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • WT wild type
  • KO IFN ⁇ knockout mice
  • IL-17 KO mice it was observed that the volume of the infarct portion was significantly reduced on day 1 and day 4 as compared to wild-type mice (FIG. 1a).
  • IL-17 KO mice also showed a marked decrease in infarct volume on the 4th day, but no extreme decrease was observed on the 1st day, indicating the very early (acute phase) of the disorder.
  • IL-24p19 functions within 24 hours after ischemia
  • IL-17 plays a role in the subacute phase of the disorder.
  • MAP2 anti-microtubule-associated protein 2
  • ischemic brain injury is associated with apoptotic neuronal death that occurs in the periphery (adjacent region around the ischemic center) hours or days after cerebral ischemia 17,18 .
  • TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin in situ nick end labeling
  • FIG. 2 shows that IL-17 and IL-23 enhanced the inflammatory response that occurs later in the cerebral ischemic injury.
  • Each panel in FIG. 2 is as follows.
  • E Comparison of TNF ⁇ production of macrophages and microglial cells assessed by intracellular FACS.
  • the MFI was as follows: WT macrophages, 701; IL-17KO macrophages, 421; and WT microglia cells, 28.4; IL-17KO microglia cells, 28.7. Data are representative of two independent experiments.
  • the absolute number of CD45 positive inflammatory cells increased to day 3 and began to decrease on day 6.
  • the number of invading macrophages increased rapidly on the third day, but decreased extremely on the sixth day. In contrast, there was no noticeable change in the number of microglia cells.
  • the number of invading T lymphocytes and ⁇ T lymphocytes continued to increase until day 3, and the number of CD4 helper T cells gradually increased until day 6.
  • FIGS. 2b, c There were no significant differences in cell population and macrophage MHC class II expression between wild type and KO mice. However, more T lymphocytes and ⁇ T lymphocytes invaded the ischemic brain of IL-17 KO mice and IL-23p19 KO mice compared to wild type mice.
  • IL-1 ⁇ and TNF ⁇ are neurotoxic cytokines, and matrix metalloproteinases (MMPs) (eg, MMP-3 and MMP-9) are responsible for blood brain barrier (BBB) breakdown and neuroinflammatory responses. It has been reported that it is related 20-22 . Further, both the IL-1 beta and MMP-9 is 23 to promote apoptotic neuronal death have been suggested, 24.
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • TNF ⁇ production from macrophages was reduced in IL-17 KO mice ( Figure 2e). Consistent with this, TNF ⁇ and IL-1 ⁇ mRNA levels in day 3 invasive inflammatory cells were significantly reduced in IL-17 KO mice (Fig. 2f).
  • FIG. 3 shows the expression of IL-23 and IL-17 in the ischemic brain.
  • each panel is as follows.
  • C Time course of the number of invading IL-17 positive cells or IFN ⁇ positive cells in the ischemic brain.
  • mRNA levels of IL-23p19, IL-12p35 and IL-12p40 were high on day 1 in invasive inflammatory cells and then decreased (FIG. 3a).
  • intracellular FACS analysis was performed using invasive inflammatory cells to identify IL-17 producing cells in ischemic brain tissue. Specific staining of IL-17 and IFN ⁇ was confirmed using KO cells (FIG. 3b).
  • IFN ⁇ producing cells are present in IL-17 KO and IL-23p19 KO mice at a level similar to that found in wild type mice, and IL-17 producing cells are also IFN ⁇ Present in KO mice.
  • IL-17-producing cells were not detected in invading mononuclear cells derived from IL-23 KO mice (FIG. 3b). These data indicate that the IL-23 / IL-17 axis and IL-17 / IFN ⁇ axis are independent of each other in cerebral ischemia.
  • the number of IL-17 positive cells in ischemic brain tissue was first measurable on day 3 and decreased on day 6 (FIG. 3c). Similarly, the number of IFN ⁇ positive cells increased up to day 3 and decreased on day 6 (Fig. 3c).
  • intracellular FACS staining was performed on various surface markers (FIG. 7). Cerebral ischemia was induced in several mice, and invading inflammatory cells were collected from the ischemic brain on day 3 and pooled. Using these cells, intracellular FACS was performed using various surface markers to (a) detect the source of IL-17, and (b) detect the source of IFN ⁇ . Data are representative of 3 or more independent experiments.
  • IL-17 positive cells and IFN ⁇ positive cells were also CD45 positive. Approximately 90% of IL-17 positive cells and 85% of IFN ⁇ positive cells were CD3 positive T lymphocytes. None of the cells were double positive for IL-17 and IFN ⁇ . Surprisingly, almost all IL-17 producing T lymphocytes were CD4 negative but ⁇ TCR positive (Fig. 3d). On the other hand, approximately 60% of IFN ⁇ producing T lymphocytes were CD4 positive and ⁇ TCR negative. These data indicate that the source of IL-17 is ⁇ T cells rather than Th17 cells, and the source of IFN ⁇ is Th1 cells.
  • FIG. 4 shows the effect of ⁇ T lymphocyte depletion in ischemic brain tissue.
  • each panel is as follows.
  • D Infarct volume of mice treated with PBS or antibody for 24 hours after induction of cerebral ischemia. ****: P ⁇ 0.024. *: P ⁇ 0.05, ***: P ⁇ 0.001 vs wild type (one-way ANOVA with Dunnett's correction (a) or two-sided Student's t-test (c, d), error bar) , Sd). The number of mice is indicated on the bar.
  • FIG. 4a It was observed that the volume of the infarct portion was significantly reduced in the antibody-treated mouse and the ⁇ TCR KO mouse (FIG. 4a).
  • the present inventors confirmed that administration of this antibody almost completely depleted ⁇ T lymphocytes in the brain and IL-17 positive T lymphocytes in the ischemic brain tissue (FIG. 4b).
  • the administration of the antibody also significantly reduced the mRNA expression level of inflammatory cytokines in the invading inflammatory cells on day 3 (Fig. 4c), and the same effect as the knockout of IL-17 in mice was obtained (Fig. 2c). ).
  • a neuroprotective effect was obtained even when 24 hours after the occurrence of cerebral ischemia, administration of anti-TCR ⁇ antibody (FIG. 4d).
  • T lymphocytes are the primary source of IL-17, to play an essential role in the liver and intestine to prevent bacterial infection it has been revealed 26 .
  • IL-23 but not IL-6 directly activates IL-17 secretion from NKT lymphocytes 28 . Shibata et al. Say that these ⁇ T lymphocytes that produce IL-17 (but not IFN- ⁇ or IL-4) develop in the thymus and are called naturally occurring IL-17 producing cells 25 reported.
  • mice were divided into a control group to which only the solvent was administered and an anti-p40 antibody (C17.8) administration group, and approximately the same number was prepared.
  • the route of drug (antibody) administration was intraperitoneal administration (ip), the dose was 500 ⁇ g, and the administration time was immediately before the ischemia was released. The effect was determined by the following method. 2) Neurological symptoms Neurological symptoms were scored every day from immediately after surgery to sacrifice using Bederson's score (31) .
  • Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain.Nature.421, 744-748 (2003) 12. Chen Y et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. J Clin Invest. 116, 1317-1326 (2006) 13. Kebir H et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med. 13 1173-1175 (2007) 14. Ifergan I et al. The blood-brain barrier induces differentiation of migrating monocytes into Th17-polarizing dendritic cells. Brain. 131785-799 (2008) 15. Hara H et al.
  • Thymic selection determines gammadelta T cell effector fate: antigen-naive cells make interleukin-17 and antigen-experienced cells make interferon gamma. Immunity. 29, 90-100 (2008) 28. Rachitskaya AV et al. Cutting edge: NKT cells constitutively express IL-23 receptor and RORgammat and rapidly produce IL-17 upon receptor ligation in an IL-6-independent fashion.J Immunol. 180, 5167-5171 (2008) 29. Nakae S et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17, 375-387 (2002) 30. Takada J et al.
  • IL-23-induced IL-17 production from ⁇ T lymphocytes in the subacute phase of cerebral ischemia promotes the inflammatory response of invading macrophages and promotes apoptotic neuron death.
  • substances that inhibit the function of ⁇ T lymphocytes that produce IL-23 and IL-17 have become a novel therapeutic target for ischemic cerebrovascular disorders, and the treatment time for neuroprotection against cerebral ischemia has been increased.
  • a substance that inhibits the function of interleukin 17, interleukin 23 or ⁇ T cells or infiltration of ⁇ T cells into the brain is useful as a therapeutic agent for ischemic cerebrovascular disorder.

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Abstract

インターロイキン17、インターロイキン23又はγδT細胞の機能、あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質を含む、虚血性脳血管障害治療剤。

Description

虚血性脳血管障害治療剤
　本発明は、インターロイキン17、インターロイキン23又はγδT細胞の機能を阻害する物質、あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質を含む、虚血性脳血管障害治療剤に関する。
　脳卒中は、世界中で死亡および障害の主要な原因であり、そのうち脳梗塞は脳卒中の約6割を占める。脳梗塞が他の疾患と異なる点は患者本人のQOLを損なうばかりでなく社会的経済的な損失も伴うことで、今後高齢化社会を迎えるに当たり大きな問題となることが予想される。しかしながら、脳梗塞の亜急性期または後期において開始することができる有効な治療法はまだ確立されていない(1,2)(非特許文献１，２）。最近、リンパ球の漸増および活性化が大脳の虚血性再灌流（I/R）障害の進行に関係していると考えられているが、脳卒中における特定のリンパ球の亜集団およびサイトカインの役割は依然としてはっきりと解明されていない。
急性期治療でターゲットとなるのはペナンブラ、つまり正常組織とischemic coreと呼ばれる非可逆的に障害された組織との境界にある可逆的な組織であり、いかにペナンブラを救うかということがその後の機能予後を保つ上で重要であると言える。
現在国内で急性期治療に使われる薬剤のなかでペナンブラを保つものとしては脳保護薬が挙げられる。現在認可されているのはエダラボンのみであり、それに続く薬剤としてNXY-095 (非特許文献7) やONO-2506などのRCT（randomized controlled trial、ランダム化比較試験）が行われていたが、いずれも臨床治験の段階で止まっており、以降有力なものはない。従って、新規の機序の脳保護薬の開発が待たれている。
 一方、従来よりヒトや実験モデルで脳虚血組織に対しCD4+T cellやIFN-γやTNF-αといった炎症性サイトカインが重要な役割を果たしていることが知られていたが（非特許文献8、9、10）、それだけではなく抑制性T細胞であるregulatory T cell (Treg ) が炎症性サイトカインを産生するミクログリアやTh1 cellを抑制し梗塞範囲を減少するといった報告もなされている（非特許文献11）。
さらに近年新たな炎症性のサイトカインとしてIL-17が発見され、様々な自己免疫疾患において重要な役割を果たしているが、特に血液脳関門の破綻においては多発性硬化症の動物モデルであるexperimental allergic encephalitis (EAE) で中心的な役割を果たしていることが示されている(非特許文献12、13)。
  また、虚血性再灌流（I/R）障害において、先天性免疫応答が重要な役割を果たすということを示唆する多くのデータが存在する。さらに、最近、Tリンパ球は、亜急性炎症期においてI/R障害のメディエータとして役割を果たすことが示唆されている。T細胞は、虚血後の脳において、免疫組織化学によって再灌流の24時間後には同定されており、梗塞の境界領域（典型的には血管の近く4,5）に位置しているようである（非特許文献４，５）。また、これまでの研究からは、CD4陽性Tリンパ球およびIFN γが、脳の虚血性障害において欠くことのできない役割を果たしていることが示唆されている3（非特許文献３）。しかしながら、I/R障害でのIFN γの役割には議論の余地があるので6（非特許文献６）、Tリンパ球サブセットと炎症メディエータが、脳梗塞の発症に本当に関与しているかどうかについては不明である。
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　本発明は、虚血性脳血管障害、特に急性期又は亜急性期における虚血性脳血管障害に対する治療剤を提供することを目的とする。
  本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 インターロイキン１７（IL-17)、インターロイキン23（IL-23)又はγδT細胞の機能あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を抑制することにより上記虚血性脳血管障害を改善し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
  すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の(a)～(c)からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質を含む、虚血性脳血管障害治療剤、又は神経細胞保護剤である。また、本発明は、以下の(b)又は(c)の物質を含む、インターロイキン17産生阻害剤である。
(a) インターロイキン17の機能を阻害する物質
(b) インターロイキン23の機能を阻害する物質
(c) γδT細胞の機能、又は該γδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質
本発明において、前記(a)の物質としては、インターロイキン17に対する抗体、又はインターロイキン17遺伝子の阻害性核酸を例示することができ、インターロイキン17遺伝子の阻害性核酸としては、例えばインターロイキン17遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAが挙げられる。
前記(b)の物質としては、インターロイキン23に対する抗体、又はインターロイキン23遺伝子の阻害性核酸を例示することができ、インターロイキン23遺伝子の阻害性核酸としては、例えばインターロイキン23遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAが挙げられる。
前記(c)の物質としては、γδT細胞に対する抗体、又はγδT細胞受容体遺伝子の阻害性核酸を例示することができ、γδT細胞受容体遺伝子の阻害性核酸としては、例えばγδT細胞受容体遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAが挙げられる。
本発明において、前記(a)及び(b)の物質は、虚血後３日又はそれ以降の脳血管障害に使用されることが好ましい。また、前記(c)の物質は、虚血後24時間以内の脳血管障害に使用されることが好ましい。
  本発明により、虚血性脳血管障害の新たな治療法が提供される。本発明において、IL-17、IL-23又はγδT細胞の機能、あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を抑制する物質は、IL-17又はIL-23の産生を抑えることにより虚血性脳血管障害を改善することができる。
IL-17またはIL-23の欠損と脳虚血障害の改善との関係を示す図である。 IL-17及びIL-23と、脳虚血障害の際に生じる炎症反応との関係を示す図である。 虚血脳におけるIL-23及びIL-17の発現を示す図である。 虚血脳組織におけるγδ Tリンパ球枯渇の効果を示す図である。 脳虚血導入後におけるIL-23及びIL-17の産生メカニズムを示す概要図である。 虚血脳組織におけるケモカインのmRNA発現レベルを示す図である。 細胞内のFACS染色を種々の表面マーカーについて行った結果を示す図である。 p40抗体の効果を示す図である。
  以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
　本発明は、IL-23及びIL-17が、脳虚血モデルにおいて脳梗塞とそれに伴う神経学的欠損の発症に大きな役割を果たしているという知見に基づき完成されたものである。
具体的には、脳虚血の導入後24時間以内に、侵入性炎症細胞はIL-23を産生した（図５）。産生されたIL-23は、侵入性γδ Tリンパ球のIL-17産生を誘導した。脳虚血の亜急性期である3日目及び4日目において、IL-17は虚血脳のマクロファージ、ミクログリア細胞及び種々の他の細胞を刺激して、炎症性サイトカインおよび他の因子を産生した。従って、IL-23はIL-17産生性のγδ Tリンパ球を誘導し、そのTリンパ球が虚血脳障害に対して炎症反応を維持し、脳虚血の亜急性期にアポトーシス性神経死を促進することが示される（図５）。
遺伝子欠損マウスを用いた分析から、IL-23は虚血再灌流障害（I/R障害）の直後に機能するのに対し、IL-17は亜急性期の間（I/R障害の3日後）に必要とされることが明らかになった。このことは、IL-23の発現は、I/Rの１日後に増加し、IL-17産生細胞は、３日後には脳内に侵入することを示すものである。
IL-17産生細胞は、I/R障害を有するIL-23遺伝子欠損マウス（IL-23-KOマウス）では出現せず、このことから、IL-23によって誘導されるIL-17産生細胞が、脳の損傷の進行にとって重大なエフェクターであることが示される。また、細胞内でのサイトカイン染色によって、CD4陽性ヘルパーT細胞ではなく、γδTリンパ球がIL-17の主要な供給源であることが示された。遺伝子分断または抗TCRγδ抗体処置によってγδTリンパ球を枯渇させると、IL-17欠損マウスで観察されるレベルまで脳のI/R障害は改善した。さらに、抗TCR γδ抗体の投与は、脳虚血を発症した24時間後（急性期）の投与であっても、神経保護効果が得られることが観察された。これらの知見は、IL-23によって活性化された脳内に侵入したγδTリンパ球が、主にIL-17を産生し、虚血性脳障害に対する炎症反応を引き起こすことを示している。したがって、γδTリンパ球は、後期に起こる炎症事象（これは、脳虚血において初期損傷を悪化させる）に対する治療ターゲットとなり得るものである。
  また、IL-23はTh17の誘導やIL-17産生に関与しており、好中球炎症や自己免疫疾患により深く関与していることが最近明らかになってきている。またIL-12はTh1に作用し、IFN-γやTNF-αの産生に関与する。IL-12とIL-23はともにヘテロ2量体で構成され、共にp40を有していることから、p40の活性を抑えることでIFN-γやTNF-αのみならずIL-17の産生が抑えられると期待される。
実際にp40 KOマウスではIFN-γ産生とTh17 cellの分化が共に抑制されることから、抗p40抗体投与により同様の効果が期待でき、すでにEAEでは効果が確認されている(12)。また、本発明においては、IL-23KOマウスを用いた実験により、脳梗塞急性期に脳内に発現しているIL-23がIL-17産生性γδT細胞の誘導に重要であり、梗塞体積を減少させることを見出した。この中でIL-23KOやIFN-γKOマウスでは脳虚血モデルで梗塞体積の減少が示されている。
以上より、急性期脳保護療法の新たな治療法として炎症性サイトカインを抑える抗体、すなわち抗p40抗体を投与することにより虚血組織のダメージを軽減し機能予後を改善することができると考えられ、抗p40抗体は、脳梗塞急性期の脳保護療法の画期的な治療薬となり得る。
２．IL-17、IL-23又はγδT細胞の機能あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質
「機能を阻害する」とは、IL-17、IL-23又はγδT細胞に作用してそれぞれのサイトカイン又は細胞の活性化を抑制すること、それぞれのサイトカイン又は細胞の発現を抑制すること、それぞれのサイトカインの産生を抑制すること、γδT細胞の病巣への移動を抑制すること、あるいは、IL-17やIL-23のシグナル伝達を阻害することを意味する。
また、「γδT細胞の脳内への浸潤を阻害する」とは、γδT細胞の脳内の病巣への移動を抑制することを意味する。
従って、当該IL-17、IL-23若しくはγδT細胞の機能、又はγδT細胞の脳内への浸潤を阻害する活性を有する限り、「物質」に限定はない。例えば、IL-17、IL-23又はγδT細胞の機能を阻害する物質、あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質として、これらのサイトカイン又は細胞に対する抗体、これらのサイトカイン又は細胞の表面タンパク質（表面抗原又は受容体）をコードする遺伝子に対する阻害性核酸、例えばアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAなどが挙げられる。
ここで、IL-23は、IL-23p19（p19ともいう）とIL-12p40（p40ともいう）とのヘテロダイマーであるため、IL-23の機能を阻害するために、抗p40抗体及び/又は抗19抗体を使用することができる。
 (1) 抗IL-17抗体、抗IL-23抗体又は抗γδT細胞抗体
　本発明の治療剤又は阻害剤に含まれ得る抗体のうち、抗IL-17抗体、抗IL-23抗体及び抗γδT細胞抗体は、以下のようにして作製することができる。
 (A) ポリクローナル抗体の作製
 (i) 抗原及びその溶液の調製
　上記抗体を作製するに当たり、まず、免疫源（抗原）として用いるタンパク質を調製・入手することが必要である。
　抗原タンパク質としては、精製IL-17、精製IL-23及びγδT細胞の表面抗原又は受容体を用いることができるが、これに限定はされず、例えば、これらのタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつIL-17、IL-23又は抗γδT細胞活性を有するタンパク質を用いることもできる。
なお、ヒトIL-17及びIL-23のアミノ酸配列情報は、NCBIデータベースGeneID: 51561（IL-23）3605 (IL-17)から取得することができる。また、精製IL-17、精製IL-23及びγδT細胞に対する抗体は、市販のものを用いることもでき、例えば、human IL-17（R&D社製）、human IL-23（R&D社製）、γδT（BectonDickison社製）等を挙げることができる。
　次に、得られた精製タンパク質を、緩衝液に溶解させて抗原溶液を調製し、必要に応じて、公知のアジュバントを添加することができる。免疫は、上記精製IL-17若しくはIL-23、又はγδT細胞の表面抗原若しくは受容体を含む溶液を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に投与することにより行う。投与は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入して行う。
　上記免疫により得られる血清（抗血清）の採取は、限定はされないが、例えば、最終投与の日から1～28日後に行われる。抗血清の採取方法は、常法に従い、免疫した動物の血液から採取することができる。
免疫した動物のそれぞれから採取した抗血清の中から、目的の抗血清をスクリーニングする。スクリーニング方法は、公知の免疫検定法(immunoassay)を、その常法に従い行うことができる。上記スクリーニングによる目的の抗血清に含まれる抗体はポリクローナル抗体である。当該抗体の精製を必要とする場合は、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、1種のみ用いて、又は2種以上組み合わせて、適宜採用し実施すればよい。
 (B) モノクローナル抗体の作製
　抗原及びその溶液の調製は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことが
できる。
　免疫方法や、上記抗原溶液を用いた投与量、投与間隔及び投与回数は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様の方法・条件が採用できる。
　上記免疫により得られる抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）の採取は、限定はされないが、例えば、最終投与の日から1～14日後に行うことが好ましく、より好ましくは2～4日後である。
　抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が好ましく、脾臓細胞がより好ましい。
　採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことにより、融合細胞（ハイブリドーマ）を得ることができる。
　ミエローマ細胞としては、例えば、マウス等の哺乳動物において一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。詳しくは、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン含有培地）で生育できないが、抗体産生細胞と融合した状態では生育できる性質の株化細胞が好ましい。具体的には、マウスミエローマ細胞としては、例えば、PAI、P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどを用いることができる。上記細胞融合は、例えば、血清を含まないRPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合して融合反応させることにより行う。抗体産生細胞とミエローマ細胞との混合比は任意であり、例えば5：1である。
　融合反応は、一般には、細胞融合促進剤の存在下で行うことが好ましく、当該促進剤としては、平均分子量1000～6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　融合反応後の細胞は、例えばHAT選択培地による培養を行う。上記培養後、HAT選択培地での増殖が認められる細胞が融合細胞（ハイブリドーマ）となる。
　上記培養により得られたハイブリドーマから、目的のハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニング方法は、特に限定されるものではなく、公知の免疫検定法（例えばELISA等）を、その常法に従い行うことができる。
　上記スクリーニングによる目的のハイブリドーマのクローニング、すなわちモノクローナル抗体産生細胞株の樹立は、一般には、限界希釈法を用いた培養等により、1細胞由来のコロニーを選択することによって行うことができる。
　上記クローニングにより得られたハイブリドーマから、モノクローナル抗体を採取する方法は、一般には、細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。これらの方法は当分野において周知である。
モノクローナル抗体の採取時又は採取後に当該抗体の精製を必要とする場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、1種又は2種以上組み合わせて、適宜採用し実施することができる。
  また、本発明においては、ヒト型化抗体、ヒト抗体、前記抗体の断片も使用することが可能である。
ヒト型抗体（CDR-grafted抗体）は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部がマウスモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域である抗体である。ヒト型抗体は、当該分野で周知の方法により作製することができる。
ヒト抗体とは、イムノグロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体をいう。ヒト抗体は、当該分野で周知の方法により、ヒト抗体を産生するトランスジェニック動物を作製し、当該トランスジェニック動物を抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。
抗体断片とは、上記抗体の抗原結合領域を含む部分又は当該領域から誘導された部分を意味し、具体的にはF(ab')２、Fab'、Fab、Fv（variable fragment of antibody）、scFv（single chain Fv）、dsFv（disulphide stabilised Fv）等が挙げられる。
（２）遺伝子の阻害性核酸
IL-17遺伝子、IL-23遺伝子又はγδT細胞受容体遺伝子の阻害性核酸は、その遺伝子機能又は遺伝子発現を抑制する核酸を意味し、例えば、アンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAなどが挙げられる。これらの阻害性核酸により、上記遺伝子の発現を抑制することが可能である。抑制の対象となる遺伝子の塩基配列は公知であり、それぞれ配列情報を入手することができる。各遺伝子のGenBankアクセッション番号を以下に示す。
IL-17遺伝子：NM010552.3（マウス）、NM 002190.2（ヒト）
IL-23遺伝子：NM031252(マウス）、NM 016584.2（ヒト）
γδT細胞受容体γ鎖遺伝子：NM 000073.2（ヒト）
γδT細胞受容体δ鎖遺伝子：NM000732又はNM001040651（ヒト）
γδT細胞受容体δ鎖遺伝子を含むゲノム配列：NG001332（ヒト）
各遺伝子の塩基配列は以下の配列番号で表す。
マウスIL-17遺伝子：配列番号１
ヒトIL-17遺伝子：配列番号２
マウスIL-23遺伝子：配列番号３
ヒトIL-23遺伝子：配列番号４
ヒトγδT細胞受容体γ鎖遺伝子：配列番号５
ヒトγδT細胞受容体δ鎖遺伝子：配列番号６、７
ヒトγδT細胞受容体δ鎖遺伝子を含むゲノム配列：配列番号８
  ここで、IL-23は、IL-23p19とIL-12p40とのヘテロダイマーであるため、IL-23遺伝子の発現を抑制するために、IL-23p19及びIL-12p40のいずれか一方又は両方を標的とすることができる。
(2-1) アンチセンス核酸
アンチセンス核酸は、IL-17遺伝子、IL-23遺伝子又はγδT細胞受容体遺伝子（標的遺伝子）のmRNA（センス）又はDNA（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（RNA又はDNAのいずれか）である。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも約14ヌクレオチドであり、好ましくは約14～100ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、転写又は翻訳を抑制する。
アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術として一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。
アンチセンス核酸は、例えば、各種DNAトランスフェクション又はエレクトロポレーション等の遺伝子導入方法により、あるいはウイルスベクターを用いることにより、細胞に導入される。
 (2-2) デコイ核酸
本発明において、デコイ核酸は、IL-17遺伝子、IL-23遺伝子又はγδT細胞受容体遺伝子の転写因子に結合し、プロモーター活性を抑制することができる。本発明のデコイ核酸は、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味し、この核酸を細胞内に導入し、転写因子がこの核酸に結合することにより、転写因子の本来のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、その転写因子の発現が抑制される。具体的には、デコイ核酸は、標的結合配列に結合しうる核酸又はその類似体である。
  本発明の好ましいデコイ核酸の例は、例えば上記遺伝子のプロモーターに結合する転写因子と結合し得る核酸などが挙げられる。デコイ核酸は、上記遺伝子のプロモーター配列をもとに、１本鎖、又はその相補鎖を含む２本鎖として設計することができる。長さは特に限定されるものではなく、15～60塩基、好ましくは20～30塩基である。
核酸は、DNAでもRNAでもよく、またはその核酸内に修飾された核酸及び/又は擬核酸を含んでいてもよい。またこれらの核酸、その変異体、又はこれらを分子内に含む核酸は、１本鎖又は２本鎖であってもよく、また環状でも線状でもよい。変異体とは、上記デコイ核酸配列の１又は数個（例えば1個～10個、１個～５個又は１個～２個等）の塩基が、欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、上記遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能、すなわち、転写因子と結合する機能を有する核酸をいう。
本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術として一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、PCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、DNAリガーゼを用いて結合することにより所望の核酸を製造してもよい。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。デコイ核酸の変異体の作製方法は、当業界で公知の方法を用いて、たとえば、部位特異的突然変異誘発法等によって合成することもできる。部位特異的突然変異誘発法は当分野において周知であり、市販のキット、例えばGeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等（タカラバイオ社製））を使用することができる。
  デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロッティング法、FACS解析法、RT-PCR等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている（例えばpromega dual luciferase assay kit）。
 (2-3) RNA干渉
本発明においては、細胞においてRNA干渉（RNAi）により遺伝子発現を調節しうる合成小核酸分子、例えばsiRNA、マイクロRNA（miRNA）及びshRNA分子を使用することができる。
siRNA（small interfering RNA）分子を用いる場合は、標的遺伝子に対応する種々のRNAを標的とすることができる。そのようなRNAとしては、mRNA、標的遺伝子の選択的スプライシングにより得られるバリアント、標的遺伝子の転写後修飾RNA等が挙げられる。選択的スプライシングによって適当なエクソンの使用により区別される転写産物のファミリーが生ずる場合、siRNA分子を用いてエクソン部分又は保存配列の発現を阻害することができる。
一般に、mRNA上の標的配列は、mRNAに対応するcDNA配列から選択することができ、好ましくは開始コドンから50～100ヌクレオチド下流領域である。但し、標的配列は、５’若しくは３’非翻訳領域、又は開始コドン付近の領域に位置していてもよい。
siRNA分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的mRNAの標的セグメントは、好ましくはAA（最も好ましい）、TA、GA又はCAで始まる連続する15～30塩基、好ましくは19～25塩基のセグメントを選択することができる。siRNA分子のGC比は、30～70％、好ましくは35～55％である。
siRNAは、二本鎖部分を生成するために自身の核酸上で折り畳む一本鎖ヘアピンRNA分子として生成することができる。siRNA分子は、通常の化学合成により得ることができる。または、siRNA分子は、センス及びアンチセンスsiRNA配列を含有する発現ベクターを用いて生物学的に生成することも可能である。
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本鎖RNAをアニールする方法などを採用することができる。
  また、本発明は、RNAi効果をもたらすためにshRNAを使用することもできる。shRNA とは、ショートヘアピンRNAと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。
  shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Aとし、配列Aに対する相補鎖を配列Bとすると、配列A、スペーサー、配列Bの順でこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するように連結し、全体で45～60塩基の長さとなるように設計する。配列Aは、標的となる遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Aの長さは19～25塩基、好ましくは19～21塩基である。
  さらに、本発明は、マイクロRNAを用いて上記遺伝子の発現を抑制することができる。マイクロRNA(miRNA)とは、細胞内に存在する長さ20～25塩基ほどの1本鎖RNAであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているncRNA（non coding RNA）の一種である。miRNAは、RNAに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。
  miRNAも、RNAiに基づく阻害性核酸であるため、shRNA又はsiRNAに準じて設計し合成することができる。
３．虚血性脳血管障害治療剤、IL-17の産生阻害剤及び神経細胞保護剤
  図５に示すとおり、虚血性脳障害を受けると、炎症性細胞からIL-23が放出され、その刺激によりγδT細胞は刺激を受け、γδT細胞によりIL-17が産生される。したがって、本発明において、IL-17、IL-23又はγδT細胞の機能を阻害する物質、あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質は、IL-17の産生を抑えることができ、これにより虚血性脳血管障害を改善することができる。従って、上記物質は虚血性脳血管障害治療剤、神経細胞保護剤及びIL-17の産生阻害剤として使用することができる。
本発明において適用の対象となる虚血性脳血管障害は、脳梗塞と、その前兆と考えられる一過性脳虚血発作(transient ischemic attack：TIA）がある。脳梗塞は、アテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓、ラクナ梗塞及びその他の脳梗塞の4種類に分類される（NINDS: National Institute of Neurological Disorders and Stroke）。本発明の治療剤は上記いずれの脳梗塞及びTIAにも適用される。また、本発明において適用の対象となる疾患として、脊髄梗塞を例示することができる。
神経細胞保護の対象となる細胞は、脳神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、マイクログリアなどが挙げられる。
  ここで、本発明において適用の対象となる虚血性脳血管障害の時期は急性期と亜急性期である。「急性期」とは、虚血後24時間以内の時期であり、「亜急性期」とは基本的には虚血後３日以内であるが、血管病変の性状により虚血が緩徐に増悪する場合には3日以降もあり得る。
  本発明においては、IL-17の機能又はγδT細胞の機能あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質は、虚血後３日又はそれ以降の脳血管障害に適用することができ、IL-23の機能を阻害する物質は、虚血後24時間以内の脳血管障害に適用することができる。
　本発明の治療剤、保護剤又は阻害剤の体内への投与は、例えば、非経口または経口等の公知の用法で行うことができ、限定はされないが、好ましくは非経口投与である。
　これら各種用法に用いる製剤（非経口剤や経口剤等）は、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。
　本発明の治療剤、保護剤又は阻害剤の投与量は、一般には、製剤中の有効成分（抗IL-17抗体、抗IL-23抗体、抗γδT抗体、又はIL17遺伝子、IL-23遺伝子若しくはγδT細胞受容体遺伝子の阻害性核酸）の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類・進行状況や、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
　本発明の治療剤、保護剤又は阻害剤を非経口剤又は経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。
　非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。
各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。
　非経口剤の投与量（1日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した有効成分（抗体の場合）は、適用対象（患者）の体重1kgあたり300μg-30mg/日であることが好ましく、より好ましくは3-8mg/日である。
　経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。当該経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン等）、充填材（乳糖、糖、コーンスターチ、馬鈴薯でんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（各種でんぷん等）、および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。
　経口剤の投与量（1日あたり）は、一般には、前述した有効成分を、適用対象（患者）の体重1kgあたり1μg～100mg/日、好ましくは1-10mg/日である。
アンチセンス核酸を投与する場合は、適用対象（患者）の体重1kgあたり1μg～100mg/日、好ましくは1-10mg/日であり、連続的に、あるいは１日１回から数回に分けて投与される。投与経路は、非経口投与（例えば静注）であることが好ましい。
  siRNA、shRNA又はmiRNAを投与する場合は、その有効量は、標的mRNAのRNAi媒介分解を引き起こすのに十分な量であれば特に限定されるものではない。当業者は、被験者に投与すべき有効量を、被験者の身長及び体重、年齢、性別、投与経路、又は局所若しくは全身投与などの要素を考慮して容易に決定することができる。一般に、siRNA、shRNA又はmiRNAは、非経口投与（例えば静注）の場合約１nM～約100nM、好ましくは2nM～50nMの細胞内濃度である。
  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
１．材料と方法
マウス
C57BL/6由来のIL-17-/- (29)、IL-23p19-/-(11)、IFN γ-/-、IL-6-/-及びγδ TCR-/-の各ノックアウト（KO)マウス、並びに野生型C57BL/6マウスを使用した。
脳梗塞の炎症細胞の調製
　マウスに脳虚血を誘導した。各時間のポイントにおいて、血液細胞を除去するために、マウスに冷PBSによる心臓灌流を行った。小脳から前脳を切り出し、RPMI-1640に十分に懸濁した。IV型コラーゲナーゼ（1mg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）およびDNaseI（50μg/ml, Roche, Basel, Switzerland）を用いて、37 °Cで45分間、シェーカー上で懸濁液を酵素処理した。公知方法19に従い、37%/70% Percoll（GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Bucks., UK）密度勾配遠心分離によって炎症細胞を単離した。この操作途中、炎症細胞を取り出してさらなる分析のためにRPMI-1640で洗浄した。
γδ T リンパ球の枯渇
　抗TCR γδ抗体（UC7-13D5）を使用して、γδ Tリンパ球を枯渇させた。脳虚血を誘導する7日前（i.p.）または誘導した24時間後に、PBSまたは250μgの上記抗体をマウスに投与した。PBS及び抗体のどちらを投与するかは、ランダムに選択した。脳虚血を誘導した7日後に、マウスを屠殺し、抗MAP2免疫染色により梗塞のサイズを測定した。PBS処置マウスまたは抗体処置マウスとTCR γδ KO マウスとの間で、体重またはCBFの減少において顕著な差はみられなかった。
統計分析
　データは、平均値＋S.D.で表す。一元配置分散分析（ANOVA）とその後のpost hoc 多重比較試験（Dunnett’s correction）を行って、3以上のマウスの群の間の差を分析した。２つのマウス群の間では、Unpaired Student’s t 検定を行って差の有意性を決定した。P < 0.05は、有意差であるとみなした。
マウスの脳虚血モデル
　局所的な脳虚血実験を行うため、9～17週齢の雄マウス（体重20～30g）を使用した。野生型マウスと全てのKO群との間で体重の有意差はなかった。
　脳虚血は公知方法15によって誘導した。要約すると、70% 亜酸化窒素/30% 酸素の混合物中のハロタンでマウスを麻酔した。加温ランプで、頭部の温度を36°Cに維持した。頭頂葉皮質での脳の血流（CBF）は、同側の頭頂骨においてレーザードップラー流速測定によって虚血の前と虚血の間に、頭蓋を通して測定した。各々のマウスの静止CBF値は、そのマウスについてのベースラインとみなし、脳虚血を誘導した後のCBF値の変化を静止値のパーセンテージとして表した。右総頚動脈（CCA）を結紮した後、右中大脳動脈（MCA）を、先端の丸いチップを用いて7-0ナイロンモノフィラメント（ETHILONE）により閉塞した。右のCCAからフィラメント（長さ11mm）を挿入し、内頚動脈（ICA）に進めた。縫合チップから右CCA分岐への距離は、およそ9mmであった。右MCAを閉塞する間、レーザードップラー流速測定によってCBFが60%以上減少することを確認した。脳虚血の60分後、フィラメントを引き抜いて、右MCA領域を再灌流した。なお、IL-17、IL-23p19、IL-6またはIFN γ KOマウスでの脳血管の異常（エバンスブルー染色による評価）は観察されなかった。
　再灌流後1日目および4日目に、梗塞部分の容積を測定するために、脳からの連続した冠状のスライス（厚さ1mm）を2% 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で染色した。7日目にサンプルを得て、冷PBSとその後の4% パラホルムアルデヒド/PBSによる心臓灌流によってマウスを固定した。脳から採取した連続冠状スライス（厚さ1mm）をパラフィン切片中に包埋し、抗microtubule associated protein 2（MAP2）で免疫染色した。TTC及び抗MAP2染色によって同定した梗塞領域を、Photoshop Creative Suite 3（Adobe, San Jose, CA, USA）を使用して各切片中で測定し、梗塞部分の容積を公知方法に従って計算した16。
神経学的評価
　4ポイントスケールの神経学的スコアを用いて神経学的機能を盲目的に評価した。各ポイントの評価内容は以下の通りである。
0：観察できる欠陥なし 
1：前肢の屈曲
2：横から押す力に対して抵抗力が低下（旋回はなし）
3：2と同じ挙動（旋回あり）
TUNEL染色
　再灌流後4日目に、尾状核被殻（caudoputamen level）における脳切片について、TUNEL法のキット（In Situ Cell Death Detection Kit POD, Roche）を使用してゲノムDNAの切断を評価した。周辺部において皮質上の陽性染色細胞をカウントした。陽性細胞は、ブレグマの後ろ1mm及び正中線の外側2.5mmに広がっているとみなした30。3箇所の異なる領域内の陽性細胞の数（0.1平方mmあたり）を平均値として表した。
定量的リアルタイムPCR
　虚血脳組織またはPercoll 勾配遠心分離によって調製した侵入性炎症細胞を、RNA調製のためにRNAiso（Takara, Shiga, Japan）中に溶解した。Power SYBR Green（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて、cDNAサンプルに対してリアルタイムPCRを行った。相対的な定量値は2-ΔCtとして表した。式中、ΔCtは、サンプルとコントロール（内因性ヒポキサチンホスホリボシルトランスフェラーゼ 1（HPRT1））との二重測定値の平均Ct値の間の差である。
細胞内サイトカイン染色
　表面及び細胞内のサイトカイン染色のために、Percollによって収集した侵入性炎症細胞を、50 nM ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート（PMA, Sigma-Aldrich）、1 μg/ml イオノマイシン（Sigma-Aldrich）及び1 μM ブレフェルジン A（eBioscience, San Diego, CA, USA）で4.5時間再刺激した。蛍光標識した抗体の対応混合物を用いて表面染色を15分間行った。虚血脳組織に由来するこれらの侵入性炎症細胞を異なる表面マーカーによって分類した。各炎症性細胞と表面マーカーとの関係は以下の通りである。
マクロファージ：CD45 高 CD11b 高；
ミクログリア細胞：CD45 高 CD11b 中；
好中球：CD45 高 CD11b 高 Gr-1+ 細胞；
Tリンパ球：CD45 高 CD3+ 細胞；
γδ Tリンパ球：CD45 高 CD3+ TCR γδ+ 細胞
表面染色の後、Fixation緩衝液（eBioscience）に細胞を懸濁し、製造業者のプロトコルのとおりに抗IL-17-APC、抗IFNγ-APC及び抗TNF α-PE （eBioscience）を用いて細胞内サイトカイン染色を行った。
FACS分析
　FACSAria機器（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）でFACS分析を行って、FlowJoソフトウェア（Tree Star, Ashland, OR, USA）を用いて分析した。
２．結果
　脳のI/R障害に関与するいくつかの型のT細胞とサイトカインの中で、本発明者らは、新たに同定されたTリンパ球サブセットであるTh17に焦点をあてた。その理由は、これらの細胞は、実験的自己免疫脳脊髄炎（EAE）において欠くことのできない役割を果たすことが示されているからである。EAEは、よく確立された、T細胞媒介性の脳と脊髄の炎症モデルである。このモデルにおいて、IL-17及びTh17細胞に由来する他の炎症メディエータは、EAEの発症及び進行に関与している7-9。 Th17は、IL-6及びTGF βを用いてインビトロで刺激することによって、ナイーブCD4陽性T細胞から分化することが示されている。さらに、IL-23p19とIL-12p40とのヘテロダイマーであるIL-23は、Th17をインビボで誘導するために必要不可欠であることが示されている10。IL-23は、樹状細胞などの抗原提示細胞から主に産生される。実験的自己免疫脳脊髄炎（EAE）の発症については、IL-23が重要なサイトカインであることが実証されている11,12。また、IL-23及びIL-17の両方が、中枢神経系の多くの炎症反応を改変することが報告されている13,14。
　脳梗塞に対するサイトカイン（特に、IL-17、IL-23p19、IL-6及びIFN γ）の機能的な重要性を決定するために、本発明者らは、 遺伝子が破壊されたマウスに対して、実験的な脳虚血モデルを適用した15。
結果を図１に示す。図１は、IL-17またはIL-23の欠損が脳虚血障害を弱めたことを示すものである。図１の各パネルは以下の通りである。
（a）梗塞部分の容積の時間経過を1日目及び4日目にTTC染色によって測定した結果。
（b）7日目の脳切片の抗MAP2免疫染色。
（c）1日目と4日目のWTマウス及びKOマウスの神経学的スコア。
（d）4日目の脳切片に対するTUNEL染色の結果（スケールバー：100μm）。
 *: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001 vs 野生型（Dunnett’s correctionを用いた一元ANOVA、エラーバー、s.d.）。
マウスの数はバー上に記載する。
図1aに示すように、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）染色によって、１日目と４日目に梗塞部分の容積を評価した16。驚くべきことに、野生型（WT）マウスとIFN γノックアウト（KO）マウスとの間で、梗塞部分の容積に顕著な差はなかった（図1a）。しかしながら、IL-23p19 KOマウスにおいては、野生型マウスと比較して、1日目と４日目に梗塞部分の容積が顕著に減少したことが観察された（図1a）。IL-17 KOマウスにおいても、4日目に梗塞部分の容積の顕著な減少が示されたが、1日目には極端な減少は観察されず、このことから、障害のごく初期（急性期：虚血後24時間以内）にIL-23p19が機能する一方で、IL-17は障害の亜急性期に役割を果たすことが示唆される。
また、7日目の抗微小管結合タンパク質2（microtubule associated protein 2: MAP2）免疫染色により、IL-17及びIL-23p19の欠損に関連して梗塞部分の容積が顕著に減少することが確認された（図1b）。興味深いことに、IL-6欠損は、I/Rによって生じる梗塞部分の容積の増加に影響しなかった（図1b）。
　4日目にIL-17 KO マウスとIL-23p19 KOマウスとの両方において神経欠損が減少していることが確認され、IL-17及びIL-23p19が、I/R障害によって引き起こされる神経障害を促進していることが示唆される（図1c）。虚血性脳障害の進行は、脳虚血の数時間から数日後に周辺部（虚血中心部の周りの隣接領域）で起こるアポトーシス性のニューロン死と関連する17,18。予想したとおり、虚血脳の周辺領域でのTUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin in situ nick end labeling）染色から、野生型及びIFN γ KOマウスよりもIL-17 KOマウス及びIL-23p19 KOマウスにおいてアポトーシス性のニューロンが少ないことが明らかになった（図1d）。
　次に、どの型の細胞が炎症性サイトカインを産生するかを明確にするために、虚血脳からPercoll勾配遠心分離によって単核細胞を単離し19、フローサイトメトリーを用いてフラクションに分けた。
 結果を図２に示す。図２は、IL-17及びIL-23が、脳虚血障害についてその後期に生じる炎症反応を増強したことを示すものである。図2の各パネルは以下の通りである。
（a）虚血脳に侵入した種々の炎症細胞の絶対数の時間経過。
（b）WTマウスとKOマウスとの間の3日目の侵入性炎症細胞の細胞集団の比較。
（c）WTマウスとKOマウスとの間の3日目の侵入性炎症細胞のマクロファージにおけるMHCクラスII発現の平均蛍光強度（MFI）。
インタクト（無処置）マウス、n=2；
WTマウス及びKOマウス、各々n=4。
（d）炎症性サイトカインおよび他の炎症因子のmRNA発現レベルの相対的変化（虚血脳組織を使用した定量的リアルタイムPCRによる、インタクトマウスとの比較）。
インタクトマウス、各々n=2、1日目：WT、n=4；IL-17KO、n=3；IL-23p19KO、n=3；及び4日目：WT、n=5；IL-17KO、n=4；IL-23p19KO、n=3。
（e） 細胞内FACSによって評価されたマクロファージおよびミクログリア細胞のTNF α産生の比較。
MFIは以下のとおりであった。
WTのマクロファージ、701；IL-17KOのマクロファージ、421；及び、WTのミクログリア細胞、28.4；IL-17KOのミクログリア細胞、28.7。
データは、2回の独立した実験の典型である。
（f）3日目の侵入性炎症細胞における炎症性サイトカインのmRNA発現レベルの比較。
インタクトマウスと比較した相対値を示す。
WT及びIL-17KO、各々n=3。
  *: P<0.05, **: P<0.01 vs 野生型（Dunnett’s correctionを用いた一元ANOVA（d）または両側Student’s t-test （f））。
エラーバー、s.d.。
図2aに示すとおり、CD45陽性の炎症細胞（そのほとんどはマクロファージ及びミクログリア細胞である）の絶対数は、3日目まで増加し、6日目には減少し始めた。侵入したマクロファージの数は3日目に急に増加したが、6日目には極端に低下した。これに対し、ミクログリア細胞の数には目立った変化はなかった。侵入性Tリンパ球及びγδTリンパ球の数は、3日目まで増加し続け、CD4ヘルパーT細胞の数は、6日目まで徐々に増加した。野生型マウスとKOマウスとの間で細胞集団及びマクロファージのMHCクラスII発現に顕著な差はなかった（図2b,c）。しかしながら、野生型マウスと比較して、より多くのTリンパ球及びγδTリンパ球がIL-17 KOマウス及びIL-23p19 KOマウスの虚血脳に侵入していた。
　脳虚血におけるIL-17及びIL-23の関連についての分子機構を明らかにするために、炎症メディエータの発現レベルを定量的リアルタイムPCRによって評価した（図2d）。
IL-1 β及びTNF αは神経毒性サイトカインであり、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）（例えば、MMP-3及びMMP-9）は、血液脳関門（BBB）のブレークダウン（breakdown）及び神経炎症反応と関係しているということが報告されている20-22。また、IL-1 βとMMP-9との両方が、アポトーシス性のニューロン死を促進することが示唆されている23, 24。
　脳全体におけるこれらの全ての因子の発現は、I/Rの4日後にはIL-23p19 KO マウスとIL-17 KOマウスとの両方で低かった（図2d）。しかしながら、ケモカインのmRNAレベルは、野生型マウスとKOマウスとの間で変化はなかった（図６）。
図６は、虚血脳組織におけるケモカインのmRNA発現レベルを示す図である。
インタクトマウス（n=2）、WT （n=5）、IL-17KOマウス（n=4）及びIL-23p19KOマウス（n=3）。得られた差は全て、Dunnett’s correctionを用いた一元ANOVA（エラーバー、s.d.）によって計算した。
　従って、IL-17 KOマウス及びIL-23p19 KOマウスにおいて梗塞部分の容積が減ったことは、おそらく、これらの神経毒性の炎症因子が減少したことに起因する。これらのうちの一部（IL-1 β、TNF α及びMMP-3）は、1日目からIL-23p19 KOマウスの脳で既に低下していた。この結果は、IL-23はIL-17の上流に作用し、IL-17が脳虚血の亜急性期において重要な役割を果たすことを示すものである（図５）。
　細胞内のサイトカイン染色から、TNF αは、侵入したマクロファージから多く産生されるが、ミクログリア細胞からは産生されないことが明らかになった（図2e）。マクロファージからのTNF α産生は、IL-17 KOマウスにおいて減少した（図2e）。これと矛盾なく、3日目の侵入性炎症細胞のTNF α及びIL-1 βのmRNAレベルは、IL-17 KOマウスで顕著に減少した（図2f）。
　次に、虚血脳におけるIL-23及びIL-12の発現を調べた。
  結果を図３に示す。図３は、虚血脳におけるIL-23及びIL-17の発現を示すものである。図３において、各パネルは以下の通りである。
（a）野生型マウスの侵入性炎症細胞におけるIL-23とIL-12とのmRNA発現の時間経過（インタクトマウスとの比較）。
インタクト、n=2；
1日目及び3日目、各々n=3。
（b）侵入したTリンパ球中のIFNγ産生細胞及びIL-17産生細胞のマウス間の比較。
データは、2回の独立した実験の典型例である。
（c）虚血脳における侵入性のIL-17陽性細胞またはIFN γ陽性細胞の数の時間経過。
エラーバー、s.d.（各時間ポイントについて、n=3）。
（d）虚血脳でのIL-17及びIFN γの供給源。IL-17陽性またはIFNg陽性の細胞集団を、TCRgdまたはCD4の発現レベルに対してさらに分析した。データは、3回の独立した実験の典型である。
  本発明者らは、IL-23p19、IL-12p35及びIL-12p40のmRNAレベルは、侵入性炎症細胞において1日目で高く、その後低下することを見出した（図3a）。次に、虚血脳組織においてIL-17産生細胞を同定するために、侵入性炎症細胞を使用して細胞内FACS分析を行った。KO細胞を用いてIL-17及びIFN γの特異的な染色を確認した（図3b）。重要なことに、IFN γ産生細胞は、IL-17 KOマウス及びIL-23p19 KOマウスにおいて、野生型マウスで見出されるのと同様のレベルで存在し、そしてIL-17産生細胞もまた、IFN γ KOマウスに存在した。しかし、IL-23 KOマウス由来の侵入性単核細胞においてはIL-17産生細胞は検出されなかった（図3b）。これらのデータは、IL-23/IL-17軸とIL-17/IFN γ軸は、脳虚血において互いに独立していることを示している。
　虚血脳組織中のIL-17陽性細胞の数は、まず3日目に測定可能であり、そして6日目には減少した（図3c）。同様に、IFN γ陽性細胞の数は、3日目まで増加し、6日目には減少した（図3c）。
　IL-17及びIFN γの供給源を決定するために、細胞内のFACS染色を種々の表面マーカーについて行った（図７）。数匹のマウスにおいて脳虚血を誘導し、3日目の虚血脳から侵入性炎症細胞を回収してプールした。これらの細胞を用い、種々の表面マーカーを用いて細胞内FACSを行って、（a）IL-17の供給源を検出し、そして（b）IFN γの供給源を検出した。データは、3回以上の独立した実験の典型である。
全てのIL-17陽性細胞及びIFN γ陽性細胞は、CD45陽性でもあった。およそ90%のIL-17陽性細胞及び85%のIFN γ陽性細胞は、CD3陽性のTリンパ球であった。IL-17とIFN γが二重で陽性である細胞はなかった。驚くべきことに、ほとんど全てのIL-17産生Tリンパ球はCD4陰性であるが、γδ TCR陽性であった（図3d）。他方で、およそ60%のIFN γ産生Tリンパ球は、CD4陽性かつγδ TCR陰性であった。これらのデータから、IL-17の供給源は、Th17細胞よりむしろγδ T細胞であり、IFN γの供給源はTh1細胞であることが示される。
　脳虚血におけるγδ Tリンパ球枯渇の効果を試験するために、本発明者らは、γδ TCR欠損マウスまたは抗TCR γδ抗体（UC7-13D5）で処置したマウスを使用した25。
  結果を図４に示す。図４は、虚血脳組織におけるγδ Tリンパ球枯渇の効果を示すものである。図４において、各パネルは以下の通りである。
（a）抗MAP2免疫染色によって評価した梗塞部分の容積の比較。
（b）侵入性炎症細胞を用いた細胞内FACSによって、IL-17産生γδ Tリンパ球枯渇の効果を評価した。
（c）3日目の侵入性炎症細胞における炎症性サイトカインのmRNA発現。インタクトマウスと比較した相対発現を示す。
WTマウス及び抗体処理マウス、各々n=3。
（d）脳虚血の誘導後、24時間PBSまたは抗体で処置したマウスの梗塞部分の容積。
****: P<0.024. *: P<0.05, ***: P<0.001 vs 野生型（Dunnett’s correctionを用いた一元ANOVA（a）または両側Student’s t-test （c,d）、エラーバー、s.d.）。
マウスの数はバー上に記載する。
抗体で処置したマウスとγδ TCR KO マウスにおいて、梗塞部分の容積が顕著に減少したことが観察された（図4a）。本発明者らは、この抗体を投与すると、脳のγδ Tリンパ球および虚血脳組織のIL-17陽性Tリンパ球がほぼ完全に枯渇したことを確認した（図4b）。抗体の投与によっても、3日目に侵入性炎症細胞において炎症性サイトカインのmRNA発現レベルが顕著に低下し（図4c）、マウスにおけるIL-17のノックアウトと同様の効果が得られた（図2c）。さらに、脳虚血の発生の24時間後でさえ、抗TCR γδ抗体を投与すると神経保護効果が得られることが観察された（図4d）。
最近の研究から、γδ Tリンパ球はIL-17の主要な供給源であり、肝臓および腸において細菌感染を予防するのに欠くことのできない役割を果たしていることが明らかになっている26,27。IL-6ではなくIL-23が、NKTリンパ球からIL-17分泌を直接活性化する28。Shibata et al.は、IL-17を産生するこれらのγδ Tリンパ球（しかし、IFN-γまたはIL-4は産生しない）は胸腺で発生し、天然に存在するIL-17産生細胞と呼ばれることを報告した25。虚血脳におけるγδ Tリンパ球は、IFN γではなくIL-17を産生するので、そしてIL-23は、IL-17産生細胞の発生に必要不可欠であるので、本発明者らは、脳に侵入するγδ Tリンパ球は、このような天然に存在するIL-17産生γδ Tリンパ球に由来するものであると推測した。本発明者らは、IL-17とIFN γとのいくつかの組み合わせ、またはIL-17とγδ Tリンパ球に由来する他のいくつかのメディエータとの組み合わせが、脳のI/R障害の進行において重要であるという可能性を排除することはできなかった。しかしながら、IL-17 KOマウス及びTCR γδ KOマウスにおいて同様の梗塞部分の容積の減少が観察されるので、本発明者らの研究は、IL-17はγδ Tリンパ球の最も強力なエフェクターであることを実証した。IL-17産生γδ Tリンパ球が他の組織に対するI/R障害において重要であるか否かを決定することは興味深い。
 
＜方法＞
1) Ischemia/ reperfusion modelの作成
　  B57BL/6J (オス、7- 12週齢、WT)を用い1％ハロセン、70％笑気、30％酸素下で全身麻酔を行い右総頚動脈よりモノフィラメントでできたsutureを栓子として(15) 、露出した右総頚動脈から右中大脳動脈の起始部に留置し1時間閉塞（60分虚血）させた後、再び上記の全身麻酔下でsutureを回収し再潅流させた。その際、同時に右側頭筋直下の側頭骨上からレーザードップラーを用いた脳血流計を装着し、中大脳動脈閉塞前後の血流低下の割合 (%) を計測した。
　  マウスは、溶媒のみを投与するcontrol 群と抗p40抗体(C17.8)投与群に分けそれぞれほぼ同数作製した。薬剤（抗体）投与経路は、腹腔内投与 (i.p.)で投与量は500μg、投与時期は虚血解除直前とした。
　  効果判定は下記の方法で行った。
2) 神経症状
　神経症状はBederson’s score(31)を用い、術直後から屠殺まで連日点数化した。具体的には0; 正常、1; 左前肢の伸展障害（軽度）、2; 患側側に回転する（中等度）、3; 歩行困難（重度）とした。
　 
　＜結果＞
　コントロール群ではマウスの行動の回復が緩やかなのに対し、p40抗体投与群では神経麻痺の早期の回復が確認された。図８参照。
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　本発明により、脳虚血の亜急性期においてγδ Tリンパ球からのIL-23誘導型のIL-17産生が、侵入性マクロファージの炎症反応を促進し、かつアポトーシス性ニューロン死を促進することが示された。これらの知見から、IL-23とIL-17を産生するγδ T リンパ球の機能を阻害する物質が虚血性脳血管障害に対する新規の治療ターゲットとなり、脳虚血に対する神経保護のための治療時間を確保することができる。
  本発明において、インターロイキン17、インターロイキン23又はγδT細胞の機能、あるいはγδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質は、虚血性脳血管障害治療剤として有用である。

Claims (16)

  1. 以下の(a)～(c)からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質を含む、虚血性脳血管障害治療剤。
    (a) インターロイキン17の機能を阻害する物質
    (b) インターロイキン23の機能を阻害する物質
    (c) γδT細胞の機能、又は該γδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質
  2. 前記(a)の物質が、インターロイキン17に対する抗体、又はインターロイキン17遺伝子の阻害性核酸である請求項１に記載の治療剤。
  3. インターロイキン17遺伝子の阻害性核酸が、インターロイキン17遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAである請求項２に記載の治療剤。
  4. 前記(b)の物質が、インターロイキン23に対する抗体、又はインターロイキン23遺伝子の阻害性核酸である請求項１に記載の治療剤。
  5. インターロイキン23遺伝子の阻害性核酸が、インターロイキン23遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAである請求項４に記載の治療剤。
  6. 前記(c)の物質が、γδT細胞に対する抗体、又はγδT細胞受容体遺伝子の阻害性核酸である請求項１に記載の治療剤。
  7. γδT細胞受容体遺伝子の阻害性核酸が、γδT細胞受容体遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAである請求項６に記載の治療剤。
  8. 前記(a)及び(c)の物質は、虚血後３日又はそれ以降の脳血管障害に使用されるものである請求項１に記載の治療剤。
  9. 前記(b)の物質は、虚血後24時間以内の脳血管障害に使用されるもの請求項１に記載の治療剤。
  10. 以下の(b)又は(c)の物質を含む、インターロイキン17産生阻害剤。
    (b) インターロイキン23の機能を阻害する物質
    (c) γδT細胞の機能、又は該γδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質
  11. 前記(b)の物質が、インターロイキン23に対する抗体、又はインターロイキン23遺伝子の阻害性核酸である請求項１０に記載の阻害剤。
  12. 前記(c)の物質が、γδT細胞に対する抗体、又はγδT細胞受容体遺伝子の阻害性核酸である請求項１１に記載の阻害剤。
  13. インターロイキン23遺伝子の阻害性核酸が、インターロイキン23遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAである請求項１１に記載の阻害剤。
  14. γδT細胞受容体遺伝子の阻害性核酸が、γδT細胞受容体遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAである請求項１２に記載の治療剤。
  15. 以下の(a)～(c)からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質を含む、神経細胞保護剤。
    (a) インターロイキン17の機能を阻害する物質
    (b) インターロイキン23の機能を阻害する物質
    (c) γδT細胞の機能、又は該γδT細胞の脳内への浸潤を阻害する物質
  16.   神経細胞が脳神経細胞である請求項１５に記載の保護剤。
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