WO2010146036A1

WO2010146036A1 - Neue proteasen und mittel enthaltend diese proteasen

Info

Publication number: WO2010146036A1
Application number: PCT/EP2010/058347
Authority: WO
Inventors: Petra Siegert; Nina Mussmann; Timothy O'connell; Karl-Heinz Maurer
Original assignee: Henkel Ag & Co. Kgaa
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2010-12-23
Also published as: DE102009027045A1

Abstract

Proteasen, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 97,9% identisch sind, bzw. Mittel, die eine solche Protease umfassen, zeigen eine sehr gute Reinigungsleistung an Protease-sensitiven Anschmutzungen.

Description

Neue Proteasen und Mittel enthaltend diese Proteasen

Die vorliegende Anmeldung richtet sich auf neue Proteasen sowie deren Herstellung und deren Verwendung. Sie betrifft außerdem Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese Proteasen, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie Verwendungen der Proteasen, insbesondere zu Wasch- und Reinigungszwecken.

Proteasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Für Wasch- und Reinigungsmittel sind sie die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme. Sie bewirken den Abbau protein- haltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Hierunter sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren Serin-Proteasen sind. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen und hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel „Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in „Subtilisin enzymes", herausgegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen gebildet. Hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten und sezernierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.

Beispiele für die in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Protease aus Bacillus lentus, insbesonder aus Bacillus lentus DSM 5483, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Weitere verwendbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme. In Wasch- und Reinigungsmitteln werden Proteasen häufig zur Verbesserung der Wasch- beziehungsweise Reinigungsleistung zusammen mit weiteren Enzymen, insbesondere Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Mannanasen, ß-Glucosidasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen oder Lipasen eingesetzt. Ebenso ist der Einsatz von Proteasen in Waschmitteln in Kombination mit anderen Wirkstoffen wie etwa Bleichmitteln oder Soil-Release-Wirkstoffen dem Fachmann bekannt. Es ist ferner bekannt, dass einige für den Einsatz in Waschmitteln etablierte Proteasen auch für kosmetische Zwecke oder für die organisch-chemische Synthese geeignet sind.

Unterschiedliche technische Einsatzgebiete erfordern Proteasen mit unterschiedlichen Eigenschaften, was beispielsweise die Reaktionsbedingungen, die Stabilität oder die Substratspezifität angeht. Ferner hängen die Einsatzmöglichkeiten einer Protease, beispielsweise in einem Waschoder Reinigungsmittel, ab von weiteren Faktoren wie der Stabilität des Enzyms, insbesondere gegenüber hohen oder niedrigen Temperaturen, oxidierenden Agentien oder Tensiden, von Faltungseffekten oder von erwünschten Synergien mit anderen Inhaltsstoffen.

Es besteht weiterhin ein hoher Bedarf an neuen technisch einsetzbaren Proteasen. Das klassische Vorgehen zur Gewinnung neuer Enzyme besteht darin, Mikroorganismen-haltige Proben aus natürlichen Habitaten zu entnehmen und unter den als geeignet angesehenen Bedingungen - zum Beispiel in alkalischem Milieu - zu kultivieren. Auf diese Weise werden Anreicherungskulturen von Mikroorganismen erhalten, die mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch Enzyme, darunter Proteasen enthalten, welche unter den jeweiligen Bedingungen aktiv sind. Hieraus werden dann beispielsweise über Ausplattieren auf proteinhaltigen Agarplatten und Ausmessen der gebildeten Lysehöfe die Mikroorganismen mit den leistungsfähigsten Enzymen ausgewählt und aufgereinigt beziehungsweise die jeweiligen Gene kloniert. Solch ein Vorgehen wird beispielsweise in dem Lehrbuch „Alkalophilic Mikroorganisms. A new microbial world" von K.Horikoshi und T.Akiba (1982), Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0- 387-10924-2, Kapitel 2, Seiten 9-26 beschrieben.

Aufgabe der Erfindung ist es, weitere, bislang noch nicht bekannte Proteasen bereitzustellen, die eine proteolytische Aktivität aufweisen. Vorteilhafterweise sollte sich die Protease dadurch auszeichnen, dass ihr Beitrag zur Leistung eines Mittels, welches die Protease enthält, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dem Beitrag von einem für diesen Zweck etablierten proteolytischen Enzym zur Leistung des Mittels zumindest nahe kommt und idealerweise übertrifft. Als Beitrag zur Leistung ist diesbezüglich insbesondere der Beitrag zur Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels von Bedeutung.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Proteasen, insbesondere vom Subtilisin-Typ, bereitzustellen, die gegenüber dem Stand der Technik eine verbesserte Stabilität gegenüber Temperatureinflüssen, insbesondere hohen oder niedrigen Temperaturen, sauren oder alkalischen Bedingungen oder pH-Wert-Änderungen, denaturierenden oder oxidierenden Agentien, proteolytischem Abbau, oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse aufweisen. Weitere Aufgaben können in einer verringerten Immunogenität und/oder verringerten allergenen Wirkung gesehen werden.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Proteasen bereitzustellen, die bei niedrigeren Temperaturen, insbesondere zwischen 1O⁰C und 4O⁰C und zunehmend bevorzugt zwischen 1O⁰C und 3O⁰C und zwischen 1O⁰C und 25⁰C, insbesondere bei 2O⁰C, eine verbesserte Reinigungsleistung im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Proteasen, insbesondere denjenigen vom Subtilisin-Typ, aufweisen, wobei die verbesserte Reinigungsleistung an zumindest einer Anschmutzung, vorzugsweise an mehreren Anschmutzungen, vorliegt. Vorteilhafterweise wird die Reinigungsleistung in einer Waschflotte erbracht, die von einer nicht festen Waschmittelformulierung gebildet wurde.

Gegenstand der Erfindung ist eine Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.3 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 97,9% identisch ist b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,0% identisch ist, insbesondere eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,0%, 98,1 %, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,1 %,98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.

Hiermit sind als weitere Erfindungsgegenstände die zugehörigen, für erfindungsgemäße Proteasen codierende Nukleinsäuren, erfindungsgemäße Proteasen oder Nukleinsäuren enthaltende nicht menschliche Wirtszellen, geeignete Verfahren zu ihrer Herstellung, insbesondere auf den Nukleinsäuren bzw. Wirtszellen aufbauende Verfahren und Verfahrenselemente sowie Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren und über die erfindungsgemäßen Proteasen definierte Verwendungsmöglichkeiten verbunden. Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende, natürlicherweise gebildete Protease ist, wie anhand der Beispiele nachvollzogen werden kann, aus dem Kulturüberstand eines Bacillus Stammes erhältlich, der von der DSMZ (DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Deutschland) als ein Bacillus amyloliquefaciens Stamm identifiziert ist (ID 98-566). Der Stamm bzw. die ihn enthaltende Bodenprobe stammt aus Vietnam. Zum Zweck der Nacharbeitbarkeit wurde gemäß Budapester Vertrag ein Plasmid, das die Nukleinsäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease enthält, bei der DSMZ mit der Hinterlegungsnummer DSM 12319 am 20.07.1998 hinterlegt.

Eine erfindungsgemäße Protease weist eine proteolytische Aktivität auf, das heißt, sie ist zur Hydrolyse von Peptidbindungen eines Polypeptids bzw. Proteins befähigt, insbesondere in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. Eine erfindungsgemäße Protease ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu spalten. Eine erfindungsgemäße Protease ist insbesondere ein Subtilisin. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine bzw. Polypeptide zusammengefasst, da ein Protein ein Polypeptid ist.

Eine erfindungsgemäße Protease ist auf Grund ihrer proteolytischen Aktivität und ihrer weiteren Eigenschaften, insbesondere betreffend ihre Stabilität gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder ihr Temperaturprofil und/oder ihr pH-Profil, für die Anwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet. Überraschenderweise leistet sie bereits in ihrer Wildtyp-Form einen so guten Beitrag zur Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, welches die Protease enthält, der dem Beitrag von einem für diesen Zweck etablierten proteolytischen Enzym zur Reinigungleistung des Mittels nahe kommt und ihn an unterschiedlichen Anschmutzungen sogar übertrifft. Sie ermöglicht daher eine verbesserte Entfernung von mindestens einer, bevorzugt von mehreren protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien und/oder harten Oberflächen, beispielsweise Geschirr. Besonders vorteilhafte Reinigungsleistungen zeigen erfindungsgemäße Proteasen an Ei-enthaltenden Anschmutzungen, beispielsweise den Anschmutzungen VoII- Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle: Produkt Nr. 1 ON der Firma wfk Testgewebe GmbH (Brüggen-Bracht, Deutschland) oder Produkt C-S-37 des CFT (Center For Testmaterials B.V., Viaardingen, Niederlande). Weiter überraschend wurde festgestellt, dass solche vorteilhaften Reinigungsleistungen auch bei niedrigen Temperaturen zwischen 1O⁰C und 4O⁰C, zwischen 1O⁰C und 3O⁰C und zwischen 1O⁰C und 25⁰C, beispielsweise bei 2O⁰C, erzielt werden.

Unter Reinigungsleistung wird erfindungsgemäß die Aufhellungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels an Anschmutzungen, insbesondere an Protease-sensitiven Anschmutzungen und hierunter insbesondere an Protease-sensitiven Wäscheanschmutzungen, verstanden. Die Reinigungsleistung wird bevorzugt ermittelt wie weiter unten angegeben.

Aufgrund der zur Verfügung gestellten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ist eine zusätzliche Optimierung dieser Protease, beispielsweise durch Substitutionen, Insertionen oder Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren, oder weiteren Sequenzveränderungen, möglich. Ferner können erfindungsgemäße Nukleinsäuren in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Proteasen oder anderer Polypeptide genutzt werden.

Zahlreiche Proteasen und insbesondere Subtilisine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Propeptid und einem Signalpeptid gebildet, wobei die Funktion des Signalpeptids üblicherweise darin besteht, die Ausschleusung der Protease aus der sie produzierenden Zelle in das Periplasma oder das die Zelle umgebende Medium zu gewährleisten, und das Propeptid üblicherweise für die korrekte Faltung der Protease nötig ist. Das Signalpeptid und das Propeptid sind in der Regel der N-terminale Teil des Präproteins. Das Signalpeptid wird unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase von der übrigen Protease abgespalten. Anschließend erfolgt die durch das Propeptid unterstützte korrekte endgültige Faltung der Protease. Die Protease ist dann in ihrer aktiven Form und spaltet das Propeptid selbst ab. Nach der Abspaltung des Propeptids übt die dann reife (mature) Protease, insbesondere Subtilisin, ihre katalytische Aktivität ohne die ursprünglich vorhandenen N-terminalen Aminosäuren aus.

Eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ist unter SEQ ID NO.1 angegeben. Diese Nukleinsäure codiert für eine Protease, welche eine für Subtilisine typische Einteilung in Signalpeptid, Propeptid und reife (mature) Protease aufweist. Das Gesamtlängenprotein ist unter SEQ ID NO.2 und die reife (mature) Protease unter SEQ ID NO.3 angegeben. Hiermit ist das tatsächlich aktive reife Protein gemeint, weil dieses die technisch relevante proteolytische Funktion ausübt. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind daher die reifen, aktiven Proteasen. Diese weisen ein Molekulargewicht zwischen 25 und 30 kD (Kilodalton) auf, insbesondere 27 kD, ermittelt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.

Für die Protease gemäß SEQ ID NO.3 bzw. SEQ ID NO.2 wurde eine Sequenzanalyse sowie ein Sequenzvergleich mit bekannten Proteinsequenzen aus den allgemein zugänglichen Datenbanken UniProtKB und/oder Swiss-Prot (vgl. UniProtKB, EMBL Outstation - European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, United Kingdom; http://www.uniprot.org) und/oder GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) durchgeführt, um die Proteine mit der größten Ähnlichkeit zu ermitteln. Für die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO.1 wurde entsprechend ein Sequenzvergleich mit bekannten Nukleinsäuresequenzen durchgeführt. Dieser Sequenzvergleich erfolgte basierend auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403- 410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T- Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen bzw. Algorithmen basieren. In der vorliegenden Patentanmeldung wurden alle Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standard parametern erstellt, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert.

Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe bzw. identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide bzw. Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- bzw. Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz. Durch einen solchen Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind, lässt sich für eine Aminosäuresequenz ferner deren enzymatische Aktivität folgern.

Für die reife (mature) Protease gemäß SEQ ID NO.3 wurde auf Aminosäureebene über die Gesamtlänge von SEQ ID NO.3 als nächstähnliches Protein identifiziert: Protease aus Bacillus amyloliquefaciens mit 97,8% Identität bzw. Abweichungen in sechs Aminosäurepositionen (Sequenz 1SUP_A: Accession 1SUP_A; UniProtKB/Swiss-Prot P00782 SUBT_BACAM; vgl. Gallagher, T. et al. (1996): Subtilisin BPN' at 1.6 A resolution: analysis for discrete disorder and comparison of crystal forms (Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 52(6), 1 125-1135)). Diese Sequenz, angegeben als SEQ ID NO.5, stimmt überein mit dem GenBank-Datenbankeintrag K02496 (genomische DNA; Translation: AAB05345.1 ), wobei die Angaben jeweils bezogen sind auf die reife Protease.

Für die gesamte Protease gemäß SEQ ID NO.2 wurde auf Aminosäureebene über die Gesamtlänge von SEQ ID NO.2 mit 97,9% Identität bzw. Abweichungen in acht Aminosäurepositionen ebenfalls der GenBank-Datenbankeintrag K02496 (genomische DNA; Translation: AAB05345.1 ) als nächstähnliches Protein identifiziert.

Somit handelt es sich bei der gefundenen Protease um ein neues Enzym. In den Schutzbereich eingeschlossen werden somit alle Proteasen, die mindestens zu 97,9% identisch zu SEQ ID NO.3 sind und/oder die sich von der Sequenz der reifen Protease gemäß 1SUP_A bzw. K02496/AAB05345.1 (angegeben als SEQ ID NO.5) in mindestens einer, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäuren unterscheiden. Zu der im Stand der Technik etablierten Protease aus Bacillus lentus (SEQ ID NO.4, vgl. auch WO 97/21760 A1 ) ergibt sich eine Identität von 59,3% bezogen auf jeweils das reife Enzym. Bevorzugte erfindungsgemäße reife Proteasen sind diesbezüglich ausgehend von SEQ ID NO.5 Varianten von BPN^' umfassend eine, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Aminosäure-Substitutionen, besonders bevorzugt an einer oder mehreren der Positionen 21 , 79, 161 , 181 , 194, 260 in der Zählweise von BPN^' (reife Protease) gemäß SEQ ID NO.5. Besonders bevorzugt ist eine oder mehrere der Aminosäure-Substitutionen Y21 F, I79V, S161G, D181 N, P194S und S260A.

In den Schutzbereich eingeschlossen werden ferner alle Proteasen, die mindestens zu 98,0% identisch zu SEQ ID NO.2 sind und/oder die sich von der Protease gemäß K02496/AAB05345.1 (angegeben als SEQ ID NO.6) in mindestens einer, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder acht Aminosäuren unterscheiden. Bevorzugte erfindungsgemäße Gesamtlängen-Proteasen sind diesbezüglich ausgehend von SEQ ID NO.6 Varianten von BPN^' umfassend eine, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder acht Aminosäure-Substitutionen, besonders bevorzugt an einer oder mehreren der Positionen -82, -3, 21 , 79, 161 , 181 , 194, 260 in der Zählweise gemäß SEQ ID NO.6 (BPN^' Gesamtlängenprotein), wobei sich negative Werte auf Positionen im Signal- bzw. Propeptid beziehen, d.h. Aminosäureposition eins ist wiederum der Beginn der reifen Protease. Besonders bevorzugt ist eine oder mehrere der Aminosäure-Substitutionen S-82T, H-3Q, Y21 F, I79V, S161G, D181 N, P194S und S260A.

Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt. Beispielsweise beschreibt A95G die Substitution von Alanin an Position 95 durch Glycin, A95AG die Insertion von Glycin nach der Aminosäure Alanin an Position 95 und A95* die Deletion von Alanin an Position 95. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt.

Aufgrund der zu erkennenden Übereinstimmungen und der Verwandtschaft zu bekannten Subtilisinen ist eine erfindungsgemäße Protease ein Subtilisin.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes sind Proteasen umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO.3 oder in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz wie vorstehend angegeben identisch sind und die aus einer Protease gemäß SEQ ID NO.3 oder SEQ ID NO.2 durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution erhalten wird bzw. erhältlich ist. Der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass ihre Reinigungsleistung mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO.4 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, und/oder mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO.5 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, und/oder mindestens derjenigen der Protease gemäß WO 03/057713 entspricht, wobei die Reinigungsleistung in einem Waschsystem bestimmt wird, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden Proteasen aktivitätsgleich eingesetzt sind und die Reinigungsleistung gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle, Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle, Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle, Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle, Gras auf Baumwolle und Kakao auf Baumwolle, insbesondere gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen

- Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle: Produkt Nr. C-05 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande

- Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle: Produkt Nr. 10N erhältlich von der Firma wfk Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Deutschland, oder Produkt C-S-37 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande

- Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle: Produkt Nr. C-03 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande

- Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC-10 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials) B.V. Viaardingen, Niederlande

- Gras auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz

- Kakao auf Baumwolle: Produkt Nr. 112 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz, bestimmt wird durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien, der Waschvorgang für mindestens 30 Minuten, optional 60 Minuten, bei einer Temperatur von 2O⁰C erfolgt und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche Härte) aufweist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die Begriffe Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment hinsichtlich der Anschmutzungen als gleichwertig und einander entsprechend zu betrachten.

Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3- 0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat) , 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1 ,1-di-phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9. Ein bevorzugtes pulverförmiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1 ,5 % C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0 % C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20 % Natrium- carbonat, 6,5 % Natriumhydrogencarbonat, 4,0 % amorphes Natriumdisilikat, 17 % Natrium- carbonat-peroxohydrat, 4,0 % TAED, 3,0 % Polyacrylat, 1 ,0 % Carboxymethylcellulose, 1 ,0 % Phosphonat, 25 % Natriumsulfat, Rest: optional Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe und ggfs. Wasser ad 100%. Bevorzugt beträgt die Dosierung des pulverförmigen Waschmittels zwischen 5,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 5,6, 5,9 oder 6,7 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 9 und pH 11.

Im Rahmen der Erfindung erfolgt die Bestimmung die Reinigungsleistung bevorzugt bei 2O⁰C gegenüber einer Anschmutzung Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle unter Verwendung eines flüssigen Waschmittels wie vorstehend angegeben.

Der Weißheitsgrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird bevorzugt mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.

Durch den aktivitätsgleichen Einsatz der jeweiligen Protease wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also beispielsweise die Reinigungsleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Verfahren zur Bestimmung der Proteaseaktivitäten sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig angewendet. Beispielsweise sind solche Verfahren offenbart in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132. Die Proteaseaktivität wird vorzugsweise in PE (Protease-Einheiten) angegeben. Beispielsweise geeignete Proteaseaktivitäten betragen 2,25, 5 oder 10 PE (Protease-Einheiten) pro ml Waschflotte. Die Proteaseaktivität ist jedoch nicht gleich Null.

Proteine können über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefasst werden. Die Angehörigen einer solchen Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen. Sie sind daher einander strukturell so ähnlich, dass sie von einem Antiserum oder bestimmten Antikörpern erkannt werden. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher Proteasen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Protease aufweisen. Solche Proteasen sind auf Grund ihrer immunologischen Übereinstimmungen den erfindungsgemäßen Proteasen strukturell so ähnlich, dass auch von einer gleichartigen Funktion auszugehen ist.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Protease natürlicherweise in einem Organismus vorhanden, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist. Diese Ausführungsform ist deshalb besonders vorteilhaft, weil dann der zugehörige Organismus selbst in Kultur genommen werden kann. Vorteilhafterweise lassen sich dann aus dessen Zellextrakten oder Kulturüberständen erfindungsgemäße Proteasen isolieren und herstellen.

Bevorzugt ist die Protease in einem Mikroorganismus vorhanden, weiter bevorzugt in einem Pilz, in einem gramnegativen oder in einem grampositiven Bakterium, und hierunter besonders bevorzugt in einem Bakterium der Gattung Bacillus. Denn besonders für diese Organismen sind im Stand der Technik Kultivierungsmethoden bekannt und etabliert. Das gilt insbesondere für Bacilli, die in der technischen Enzymherstellung eine herausragende Rolle einnehmen. Ganz besonders bevorzugt ist die Protease vorhanden in Bacillus amyloliquefaciens und insbesondere in Bacillus amyloliquefaciens DSM ID 98-566.

Ferner wurde eine für eine bevorzugte erfindungsgemäße Protease codierende Nukleinsäure im Rahmen der vorliegenden Erfindung rekombinant in eine Wirtszelle eingebracht und wie vorstehend beschrieben unter der Nummer DSM 12319 am 20.07.1998 bei der DSMZ hinterlegt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungform der Erfindung ist die Protease somit dadurch gekennzeichnet, dass sie von einer Nukleinsäure codiert wird, die in einer Wirtszelle mit der Hinterlegungsnummer DSM 12319 vorhanden ist.

Proteasen bzw. Enzyme im allgemeinen können durch verschiedene Verfahren, z.B. gezielte genetische Veränderung durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert werden. Hierfür werden insbesondere Änderungen der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz herbeigeführt und als Mutationen bezeichnet. Grundsätzlich sind Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen möglich oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert werden. Die zugehörigen Organismen sind entsprechende Mutanten, und von mutierten Nukleinsäuren codierte Proteine die entsprechenden Enzym-Varianten. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-, substitutionsmutierten Genen bzw. Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutions- Varianten beziehungsweise Fusionsproteinen. Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise die Reinigungsleistung von erfindungsgemäßen Enzymen zu verbessern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen die Stabilität der Protease erhöht und dadurch ihre Reinigungsleistung verbessert werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Protease, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder anderen Komponenten, kann daher im Rahmen der Erfindung zusätzlich weiterentwickelt werden.

Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den jeweiligen vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder enzymatische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines bestimmten Substrats. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig dadurch, dass eine oder mehrere Aminosäuren im Vergleich zu einer Ausgangssequenz fehlen; während Fragmente üblicherweise kleine Stücke einer Ausgangssequenz umfassen, fehlen Deletionsmutanten üblicherweise nur kurze Bereiche und damit ggfs. nur einzelne Teilaktivitäten.

Insertionen sind wie Deletionen nicht auf einzelne Aminosäuren beschränkt. Vielmehr können auch mehrere Aminosäuren oder ganze Fragmente oder selbst ganze Proteine in eine Ausgangssequenz eingefügt sein oder mit einer Ausgangssequenz fusioniert sein. Im letzteren Fall handelt es sich dann um ein chimäres Protein. Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren Enzymabschnitten, also Fragmenten, mit anderen Enzymen oder Proteinen anderer Funktion. So ist es beispielsweise möglich, ein erfindungsgemäßes Enzym oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Ebenso können erfindungsgemäße Enzyme beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen oder Fragmenten davon verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit eine Protease, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50 oder mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 , 272, 273 oder 274 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.

So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die proteolytische Aktivität verloren wird. Durch derartige Deletionen kann beispielsweise auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der Fragmentierung oder Deletionsmutagenese ihre proteolytische Aktivität.

Auch Substitionen können vorteilhafte Wirkungen bewirken. Sowohl einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist und einen oder mehrere Aminosäureaustausche in Positionen aufweist, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO.4 in einem Alignment zugeordnet sind. Die Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Protease mit der Aminosäuresequenz der Protease aus Bacillus lentus, wie sie in SEQ ID NO.4 angegeben ist, definiert. Ein solches Alignment ist in Figur 1 angegeben. Da die Protease aus Bacillus lentus im Stand der Technik ein wichtiges Referenzmolekül zur Beschreibung neuer Proteasen und von Aminosäureveränderungen darstellt und die hier beschriebenen neuen Proteasen und somit auch ihre Sequenz bislang unbekannt sind, ist es vorteilhaft, in der Zuordnung der Aminosäurepositionen auf die Zählung der Protease aus Bacillus lentus (SEQ ID NO.4) Bezug zu nehmen. Weiterhin richtet sich die Zählung nach dem reifen (maturen) Protein. Diese Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease eine höhere Zahl von Aminosäurenresten umfasst als die Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO.4. Ausgehend von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der Protease aus Bacillus lentus sind die Veränderungspositionen in einer erfindungsgemäßen Protease diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment gemäß Figur 1 zugeordnet sind.

Vorteilhafte Positionen für Sequenzveränderungen, insbesondere Substitutionen, der Protease aus Bacillus lentus, die übertragen auf homologe Positionen der erfindungsgemäßen Proteasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Protease vorteilhafte funktionelle Eigenschaften verleihen, sind demnach die Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268, zuzuordnen in einem Alignment mit SEQ ID NO.4 und damit in der Zählung gemäß SEQ ID NO.4. In den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der Protease aus Bacillus lentus folgende Aminosäurereste: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61 , T69, E87, A96, R99, A101 , 1102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141 , S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211 , A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 beziehungsweise T268.

Vorteilhaft sind insbesondere beispielsweise Substitutionen 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211 D, 211G und 21 1 E, sofern die entsprechend homologen Positionen in einer erfindungsgemäßen Protease nicht schon natürlicherweise von einer dieser bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden. Die Austausche 3T und 4I führen über einen Stabilisierungseffekt auf das Molekül zu einer Verbesserung der Reinigungsleistung der Protease und damit zu einer verbesserten Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, das die Protease enthält.

Eine weitere Bestätigung der korrekten Zuordnung der zu verändernden Aminosäuren, d.h. insbesondere deren funktionelle Entsprechung, können Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden miteinander verglichenen Proteasen auf die gleiche Weise verändert werden und beobachtet wird, ob bei beiden die enzymatische Aktivität auf gleiche Weise verändert wird. Geht beispielsweise ein Aminosäureaustausch in einer bestimmten Position der Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO.4 mit einer Veränderung eines enzymatischen Parameters einher, beispielsweise mit der Erhöhung des K_M-Wertes, und wird eine entsprechende Veränderung des enzymatischen Parameters, beispielsweise also ebenfalls eine Erhöhung des K_M-Wertes, in einer erfindungsgemäßen Protease-Variante beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin eine Bestätigung dieses Erfindungsaspekts zu sehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Protease, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer. Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit die Reinigungsleistung verbessert wird. Grundsätzlich kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht. Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Muationen des Enzyms selbst erreicht werden, da solche Stabilisierungen im Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte erfordern. Beispiele für hierfür geeignete Sequenzveränderungen sind vorstehend genannt. Weitere geeignete Sequenzveränderungen sind aus dem Stand der Technik bekannt. So können Proteasen beispielsweise auch dadurch stabilisiert werden, dass einer oder mehrere Tyrosin-Reste gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.

Weitere Möglichkeiten der Stabilisierung sind beispielsweise:

- Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise durch Austauschen von einer oder mehreren der an der Calcium-Bindung beteiligten Aminosäure gegen eine oder mehrere negativ geladene Aminosäuren und/oder durch Einführen von Sequenzveränderungen in mindestens einer der Folgen der beiden Aminosäuren Arginin/Glycin;

- Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf bzw. an der Oberfläche des Proteins bewirken;

- Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.

Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf mehrere Arten stabilisiert wird, da mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Protease wie vorstehend beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. Eine Protease mit einer solchen Veränderung wird als Derivat bezeichnet, d.h. die Protease ist derivatisiert.

Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung demnach solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise in vivo durch die Wirtszelle erfolgen, die das Protein exprimiert. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Derivatisierungen können aber auch in vitro durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. Eine solche andere Verbindung kann auch ein weiteres Protein sein, das beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden wird. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, oder auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Derivatisierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können ferner auch dazu dienen, die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern.

Unter Derivaten eines erfindungsgemäßen Proteins können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit Protease-Inhibitoren ist vorteilhaft.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Protease codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure.

Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren, insbesondere DNA- oder RNA- Moleküle. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen.

Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann, was als Degeneriertheit des genetischen Codes bezeichnet wird. Aus diesen Gründen werden sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleinsäuresequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen. Daher sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt worden sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon- Usage. Unter Codon-Usage wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.

Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition CoId Spring Laboratory Press, bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Protease codiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

a) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden mindestens zu 97,9% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,0%, 98,1 %, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 322 bis 1146 mindestens zu 97,9% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,0%, 98,1 %, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist c) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 98,0% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,1 %, 98, 2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.

In einer weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 zusammenhängenden Nukleotiden jeweils mindestens zu 97,9% und zunehmend bevorzugt jeweils zu mindestens 98,0%, 98,1 %, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.

Betreffend die Gesamtsequenz von SEQ ID NO.1 weist diese in den Positionen 1 bis 3 alternativ das Codon GTG auf. Da es sich hierbei um das Startcodon handelt, codiert dieses ebenfalls für die Aminosäure Methionin (bzw. Formyl-Methionin (fMet)) und nicht für Valin (VaI).

Die vorstehend unter b) angegebene Nukleinsäuresequenz betrifft den Bereich, der für die reife (mature) Protease codiert. Sollte sich herausstellen, dass das reife (mature) Protein nur von einem Teil dieser Sequenz gebildet wird, so gilt der Schutzbereich entsprechend für diesen Teil. Bevorzugt sind solche Nukleinsäuren, die für reife (mature) Proteine codieren.

Mit allen genannten Erfindungsgegenständen und Ausführungsformen sind als weitere Erfindungsgegenstände entsprechende Vektoren, Wirtszellen, Herstellungsverfahren, in denen entsprechende Vektoren oder Wirtszellen eingesetzt werden sowie Verwendungen entsprechender Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen verbunden. Daher betreffen die vorstehenden Ausführungen diese Erfindungsgegenstände entsprechend.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Es wird unterschieden zwischen Klonierungsvektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, und Expressionsvektoren, die die Funktion erfüllen, die Nukleinsäure bzw. das auf dieser vorhandene Gen (oftmals Transgen) in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Polypeptids zu ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachomosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom bzw. chromosomale DNA integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.

Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird.

Expressionsvektoren ermöglichen, dass ein erfindungsgemäßes Protein heterolog, also in einer anderen Zelle bzw. Wirtszelle als derjenigen, aus der es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Die Zellen können dabei zu verschiedenen Organismen zugehörig sein oder von verschiedenen Organismen stammen. Auch eine homologe Gewinnung eines erfindungsgemäßen Proteins aus einer Wirtszelle, die dieses Protein natürlicherweise (also bereits in ihrer Wildtyp- Form) exprimiert, ist mit einem erfindungsgemäßen Vektor möglich. Dies kann den Vorteil aufweisen, dass natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden. Zu einem einsetzbaren Expressionssystem können ferner zusätzliche Nukleinsäuren (Gene) bzw. von ihnen codierte Proteine zählen, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, und die die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Proteine handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beeinflussen. In der Regel müssen aus der Fülle an verschiedenen im Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systemen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermittelt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße Protease beinhaltet, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor wird bevorzugt in die Wirtszelle eingebracht durch deren Transformation. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d.h. Nukleinsäure-Teile bzw. -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Ferner können die Proteasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können die Protease funktionell beeinflussen. Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.

Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren bzw. Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.

Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist.

Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren. Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.

Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen oder Lipasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen.

Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann.

Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Proteasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.

Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Protease. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.

Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zu lauf Strategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse bzw. Trockenmasse und/oder vor allem der Aktivität der interessierenden Protease erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.

Die hergestellte Protease kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d.h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern bzw. -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Protease in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d.h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen. Auch hierfür sind verschiedene Verfahren bekannt, wie Fällung z.B. durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung.

Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine erfindungsgemäße Protease wie vorstehend beschrieben enthält. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel. Da erfindungsgemäße Proteasen vorteilhafte Reinigungsleistungen insbesondere an Ei-haltigen Anschmutzungen aufweisen, sind die Mittel insbesondere zur Entfernung von Ei-haltigen Anschmutzungen geeignet und vorteilhaft.

Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- bzw. Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet.

Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können neben einer erfindungsgemäßen Protease alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Tenside, Builder, Persauerstoffverbindungen oder Bleichaktivatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyt^, pH-Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaum reg u latoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.

Insbesondere eine Kombination einer erfindungegemäßen Protease mit einem oder mehreren weiteren lnhaltsstoff(en) des Mittels ist vorteilhaft, da ein solches Mittel eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen aufweist. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem Tensid und/oder einem Builder (Gerüststoff) und/oder einer Persauerstoffverbindung und/oder einem Bleichaktivator kann ein solcher Synergismus erreicht werden.

Vorteilhafte Inhaltsstoffe erfindungsgemäßer Mittel sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO2009/121725, dort beginnend auf Seite 5, vorletzter Absatz, und endend auf Seite 13 nach dem zweiten Absatz. Auf diese Offenbarung wird ausdrücklich Bezug genommen und der dortige Offenbarungsgehalt in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen.

Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält die Protease vorteilhafterweise in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels. Ferner kann die in dem Mittel enthaltene Protease, und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels, mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist. Weiterhin kann auch das Wasch- oder Reinigungsmittel selbst in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es

(a) in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder

(b) in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt, und/oder

(c) als Einkomponentensystem vorliegt, oder

(d) in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.

Diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen erfindungsgemäßer Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt.

Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich eine Protease enthalten. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden.

Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 x 10^~8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Bevorzugt sind die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von 0,05 bis 4 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, wobei jedes enthaltene Enzym in den genannten Mengenverhältnissen vorliegen kann. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751-766) bestimmt werden. Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132 beschriebenen Methode ermittelt werden. Sie wird in PE (Protease-Einheiten) angegeben.

Bei dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme muss zwischen proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden werden. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend nebenaktivitätsfreien Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht. Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob dieselben Proteinmengen - als Maß für den Ertrag der fermentativen Produktion - zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Besonders bevorzugt unterstützen die weiteren Enzyme die Wirkung des Mittels, beispielsweise die Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, hinsichtlich bestimmter Anschmutzungen oder Flecken. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte hinsichtlich ihrer Wirkung gegenüber bestimmter Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Waschoder Reinigungsmittels zur Entfernung von Anschmutzungen, insbesondere von protease- sensitiven Anschmutzungen, auf Textilien oder harten Oberflächen, d.h. zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dar.

Denn erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere auf Grund der vorstehend beschriebenen Eigenschaften der enthaltenen Protease, vorteilhaft dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen entsprechende Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.

Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt. In bevorzugten Ausführungsformen dieser Verwendung werden die betreffenden Wasch- oder Reinigungsmittel daher nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt.

Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes Mittel verwendet wird. Das Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet ist.

Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind. Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung bzw. Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, insbesondere von harten Oberflächen. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease katalytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Proteasen beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.

Da erfindungsgemäße Proteasen natürlicherweise bereits eine hydrolytische Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner und/oder der einziger Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen, dass gewünschtenfalls als einzige reinigungsaktive Komponente eine solche Protease mit der Anschmutzung in Kontakt gebracht wird, bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Dies stellt eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes dar.

Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide. Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide.

Erfindungsgemäße Enzyme sind entsprechend der vorstehenden Ausführungen vorteilhaft in erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere Wasch- und Reinigungsmitteln, und Verfahren, insbesondere Wasch- und Reinigungsverfahren, einsetzbar. Sie können also dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet daher die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease, wie sie vorstehend beschreiben wurde zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen. Bevorzugt wird die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Proteasen beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme im Rahmen eines erfindungsgemäßen Mittels, vorzugsweise eines erfindungsgemäßen Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittels, bereitgestellt.

Beispiele

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.

Beispiel 1

Isolierung und Identifizierung des proteolytisch aktiven Bakterienstamms

0,1g einer Bodenprobe wurden in 1 ml sterilen 0,9%iger NaCI-Lösung suspendiert und auf milchpulverhaltigen Agarplatten (1 ,5% Agar, 0,1 % K₂HPO₄, 0,5% Hefeextrakt, 1 % Pepton, 1 % Milchpulver, 0,02% MgSO₄*7H₂O, 0,4% Na₂CO₃, pH 10) ausplattiert und bei 3O⁰C inkubiert. Anhand eines Klärungshofes wurde ein proteolytisch aktives Bakterium isoliert, welches von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) als Bacillus amyloliquefaciens identifiziert wurde (ID 98-566).

Beispiel 2

Isolierung und Klonierug der neuen Serinprotease aus dem Boden

Das proteolytisch aktive Bakterium wurde in TBY-Medium (0,5% NaCI, 0,5% Hefeextrakt, 1 % Trypton, pH 7,4) für 16h bei 3O⁰C kultiviert. Die Gesamt-DNA dieses Bakteriums wurde nach Standardmethoden präpariert, mit dem Restriktionsenzym Sau 3A behandelt und in einen Bacillusvektor (Derivat des pBC16; Bernhard et al. (1978), J. Bacteriol., Band 133 (2), S. 897 ff.) kloniert. Dieser Vektor wurde in den Protease-negativen Wirtsstamm Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura und Doi (1984), J. Bacteriol., Band 160 (1 ), S. 442-444) transformiert.

Die Transformanden wurden zunächst auf DM3-Medium regeneriert und dann auf milchpulverhaltige Agarplatten (TBY-Skimmilk-Platten; siehe Beispiel 1 ) überimpft. Proteolytisch aktive Klone wurden anhand ihrer Lysehöfe identifiziert. Aus den erhaltenen proteolytisch aktiven Klonen wurde einer ausgewählt, dessen Plasmid (Vektor) isoliert und das in diesem Vektor enthaltene Genfragment (Insert) nach Standardmethoden sequenziert.

Das Insert enthält einen offenen Leserahmen von ca. 1 ,2 kb, dessen DNA-Sequenz für eine Protease vom Subtilisin-Typ codiert. Die Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert, in der E. coli Vektor pUC19 kloniert und gemäß dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM 12319 hinterlegt. Beispiel 3: Ermittlung der Reinigungsleistung bei Einsatz in einem handelsüblichen pulverförmigen Waschmittel

Für dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt. Es wurden folgende Anschmutzung und Textilien verwendet:

A: Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle: Produkt Nr. 10N (erhältlich von der Firma wfk Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Deutschland)

Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf ihre Reinigungsleistung hin untersucht. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 4O⁰C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von 16° deutscher Härte gewaschen.

Als Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1 ,5 % C12- C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0 % C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20 % Natriumcarbonat, 6,5 % Natriumhydrogencarbonat, 4,0 % amorphes Natriumdisilikat, 17 % Natriumcarbonat- peroxohydrat, 4,0 % TAED, 3,0 % Polyacrylat, 1 ,0 % Carboxymethylcellulose, 1 ,0 % Phosphonat, 25 % Natriumsulfat, Rest: Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe. Die Waschmittel- Basis-Rezeptur wurde für die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich (5 PE/ml Endkonzentration) mit folgenden Proteasen versetzt: erfindungsgemäße Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 (Ansatz 1 ), Protease gemäß WO 03/057713 (Ansatz 2) und die alkalische Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN^' gemäß GenBank- Datenbankeintrag K02496 (genomische DNA; Translation: AAB05345.1 ) und diesbezüglich die reife Protease wie in SEQ ID NO. 5 angegeben) (Ansatz 3).

Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d (Lichtart D65, 10°). Das Gerät wurde zuvor mit einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen Ergebnisse sind die Differenzremissionen zwischen einem Waschvorgang mit einem Waschmittel enthaltend eine Protease und einem parallel durchgeführten Kontrollwaschgang mit einem Waschmittel ohne Protease. STABW bezeichnet die Standardabweichung bei parallel durchgeführten Versuchsansätzen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt und erlauben einen unmittelbaren Rückschluss auf den Beitrag des jeweils enthaltenen Enzyms zur Reinigungsleistung des verwendeten Mittels. Tabelle 1 : Waschergebnisse mit einem pulverförmigen Waschmittel bei 4O⁰C

Es wird deutlich, dass eine erfindungsgemäße Protease bereits in ihrer Wildtyp-Form eine bessere Reinigungsleistung zeigt im Vergleich zu BPN^' und selbst im Vergleich mit einer für Waschmittel etablierten leistungsverbesserten Proteasevariante gemäß Ansatz 2, die kein Wildtyp-Molekül ist.

Beispiel 4: Ermittlung der Reinigungsleistung bei Einsatz in einem handelsüblichen flüssigen Waschmittel

Für dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt. Es wurden folgende

Anschmutzung und Textilien verwendet:

A: Voll-Ei/Pigment (Ganzei/Ruß) auf Baumwolle: Produkt Nr. 10N (erhältlich von der Firma wfk

Testgewebe GmbH; Brüggen-Bracht, Deutschland)

B: Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle: Produkt Nr. C-05 (erhältlich von CFT Center For

Testmaterials, B.V. Viaardingen, Niederlande)

Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf ihre Reinigungsleistung hin untersucht. Dafür wurden die Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von 2O⁰C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von 16° deutscher Härte gewaschen.

Als Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3-0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat), 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1 ,1-di-phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Die Waschmittel-Basis- Rezeptur wurde für die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich (5 PE/ml Endkonzentration) mit folgenden Proteasen versetzt: erfindungsgemäße Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 (Ansatz 1 ), Protease gemäß WO 03/057713 (Ansatz 2) und die alkalische Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN^' gemäß GenBank-Datenbankeintrag K02496 (genomische DNA; Translation: AAB05345.1 ) und diesbezüglich die reife Protease wie in SEQ ID NO. 5 angegeben) (Ansatz 3). Die weitere Versuchsdurchführung und -auswertung erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2: Waschergebnisse mit einem flüssigen Waschmittel bei 2O⁰C

Es wird wiederum deutlich, dass eine erfindungsgemäße Protease bereits in ihrer Wildtyp-Form, insbesondere in einem Flüssigwaschmittel bei 2O⁰C, eine bessere Reinigungsleistung zeigt im Vergleich zu BPN^' und selbst im Vergleich mit einer für Waschmittel etablierten leistungs- verbesserten Proteasevariante gemäß Ansatz 2, die kein Wildtyp-Molekül ist.

Beschreibung der Figur:

Figur 1 : Sequenzvergleich (Alignment) der erfindungsgemäßen reifen Protease (SEQ ID

NO. 3) mit Proteasen aus dem Stand der Technik, erstellt mit dem Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) unter Standardparametern.

Darin bedeuten:

1 : Erfindungsgemäße Protease gemäß SEQ ID NO. 3 (reifes Enzym)

2: alkalische Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (reifes Enzym, Sequenz 1SUP_A bzw.

K02496/AAB05345.1 ; vgl. SEQ ID NO.5) 3: Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (reifes Enzym, vgl. auch WO 92/21760 A1 bzw.

SEQ ID NO.4)

Claims

Patentansprüche

1. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 97,9% identisch ist b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,0% identisch ist, insbesondere eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 98,0%, 98,1 %, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 98,1 %,98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.

2. Protease nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie natürlicherweise in einem Organismus vorhanden ist, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist, insbesondere in einem Mikroorganismus, vorzugsweise in einem Pilz, in einem gramnegativen oder in einem grampositiven Bakterium, hierunter besonders bevorzugt in einem Bakterium der Gattung Bacillus, insbesondere in Bacillus amyloliquefaciens und insbesondere in Bacillus amyloliquefaciens DSM ID 98-566, oder dass sie von einer Nukleinsäure codiert wird, die in einer Wirtszelle mit der Hinterlegungsnummer DSM 12319 vorhanden ist.

3. Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50 und zunehmend bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 oder 268 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, und/oder dass sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch einen oder mehrere Aminosäureaustausche in Positionen, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. 4 in einem Alignment zugeordnet sind.

4. Nukleinsäure codierend für eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3, insbesondere eine, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden mindestens zu 97,9% identisch ist b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 322 bis 1146 mindestens zu 97,9% identisch ist c) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 98,0% identisch ist.

5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 4, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.

6. Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5 beinhaltet, oder die eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 beinhaltet, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert.

7. Wirtszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Zellkern besitzt, oder dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.

8. Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.

9. Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält, insbesondere in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels, und/oder dass es mindestens eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält und die Protease mit einer bei Raumtemperatur und/oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist.

10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es

(b) in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt, und/oder

(c) als Einkomponentensystem vorliegt, oder

(d) in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.

11. Mittel nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es eines oder mehrere weitere Enzyme umfasst, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie vorzugsweise deren Gemische.

12. Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Entfernung von protease- sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen.

13. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 11 angewendet ist.

14. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 katalytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.

15. Verwendung einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.