WO2010143606A1 - 新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法 - Google Patents

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WO2010143606A1
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中山学
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財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a site-specific recombination method using a novel site-specific recombination enzyme and its recognition sequence.
  • Site-specific recombination is a phenomenon in which DNA is recombined by a specific short homologous base sequence, unlike homologous recombination that occurs by a long base sequence of several hundred base pairs.
  • Cre / loxP system derived from phage is famous and widely used from E. coli to mice.
  • Cre enzyme is a protein composed of 343 amino acids derived from P1 phage and recognizes a specific base sequence of 34 bp called a loxP site and can carry out site-specific recombination.
  • a loxP site can be divided into three parts: 13 bases, 8 bases, and 13 bases.
  • the 13 base sequence has a complementary inverted repeat structure, while 8 bases play a role in determining the orientation of the loxP site. Fulfill.
  • Many loxP mutants called Lox511 and lox2272 have also been reported, and DNA regions sandwiched between two loxPs, including the mutant loxP sites, are deleted or replaced, or reversed. Widely used for gene structure modification.
  • Flp / FRT system derived from yeast plasmid 2 ⁇ Non-patent Document 1
  • Dre / rox system derived from enterobacterial phage D6 patented
  • a site-specific recombination system by expressing a site-specific recombination enzyme under the control of various promoters such as tissue-specific, cell-specific, expression time-specific, or inducible type, Conditional knockout or knock-in experimental animals can be generated.
  • various promoters such as tissue-specific, cell-specific, expression time-specific, or inducible type
  • the present inventor has identified a novel site-specific recombinant enzyme and its recognition sequence, and completed the present invention.
  • a polynucleotide comprising the following base sequence: (1) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7; (2) a base sequence that hybridizes stringently with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence (1), wherein the polypeptide has a site-specific recombinase activity of the polypeptide of (1) A coding base sequence; or (3) A nucleotide sequence having 70% or more homology (identity) with the nucleotide sequence (1) and encoding a polypeptide having a site-specific recombinase activity of the polypeptide of (1) .
  • Aspect 3 The polynucleotide according to claim 1 or 2, which is a synthetic polynucleotide.
  • a vector comprising the polynucleotide according to any one of aspects 1 to 3.
  • Aspect 8 The transgenic animal according to aspect 7, which is a rodent.
  • Site-specific recombinase consisting of the following polypeptides: (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 8; (2) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 8, and the site-specific polypeptide of (1) A polypeptide having recombinant enzyme activity; or (3) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 8, wherein the polypeptide has a site-specific recombinase activity of the polypeptide of (1)
  • Aspect 10 The site-specific recombinant enzyme according to embodiment 9, which is a recombinant enzyme.
  • Aspect 12 An oligonucleotide that is a sequence recognized by the site-specific recombinase according to Aspect 9 or 10 and has the following base sequence: (1) the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 5, 9 to 11, or 13 to 18; or (2) one or several bases are deleted, substituted or inserted in the nucleotide sequence (1). Base sequence.
  • Aspect 13 A vector comprising a target DNA region between two oligonucleotides according to aspect 12.
  • Aspect 14 A cell transformed with the vector according to embodiment 13.
  • [Aspect 16] A non-human targeting animal into which the two oligonucleotides according to aspect 12 are introduced so as to sandwich a target DNA region of a chromosome.
  • [Aspect 18] A conditional knock-in or knock-out experimental animal produced by crossing the transgenic animal according to aspect 7 or 8 and the targeting animal according to aspect 16 or 17.
  • a site-specific recombination method in a nucleotide sequence comprising a target DNA region comprising: (1) introducing two oligonucleotides comprising the base sequence according to aspect 12 into the nucleotide sequence so as to sandwich the target DNA region; (2) The method comprising: bringing the target DNA region into contact with the site-specific recombination enzyme according to aspect 9 to cause site-specific recombination at the oligonucleotide site.
  • the site-specific recombination method according to aspect 20 which occurs in a transformed cell into which the vector according to aspect 4 and the vector according to aspect 13 are introduced.
  • a novel site-specific recombination enzyme (VCre protein and SCre protein) and a specific recombination system comprising their recognition sequences are provided.
  • An outline of an application example of a site-specific recombination system comprising a VCre enzyme and a VloxP site of the present invention is shown.
  • An outline of an application example of the site-specific recombination system comprising the VCre enzyme and the VloxP site of the invention is shown.
  • the comparison of the amino acid sequence of VCre protein (Sbjct) of this invention and Cre protein (Query) is shown.
  • the amino acid sequence inserted downstream of the promoter in Example 1 is shown.
  • the underlined part (8 amino acids) indicates a nuclear translocation signal
  • the part surrounded by a square frame indicates a FLAG tag (antibody recognition peptide).
  • the SCre enzyme of the present invention is a photograph of electrophoresis showing that it does not recognize either the loxP site that is the recognition sequence of the Cre enzyme or the VloxP site that is the recognition sequence of the VCre enzyme. It is the photograph of the electrophoresis which shows the result of the site-specific recombination by the site-specific recombination system which consists of SCre enzyme of this invention, and a SloxP site
  • the structure of the plasmid for assay of SloxP site and Slox2272 site is shown. It is the photograph of electrophoresis which shows the result of the site-specific recombination by the site-specific recombination system which consists of the SCre enzyme of this invention, and the plasmid for a test
  • the state of the plasmid for the assay in which two mutation sites Vlox43 L and Vlox43R are arranged at both ends of the cassette of EGFP and DsRed is shown. Furthermore, the photograph (bottom) showing that the expression of the cell in which the assay plasmid was introduced simultaneously with VCre was changed from EGFP to DsRed. The state of the plasmid for the assay in which two mutation sites, SloxV1L and SloxV1R, are arranged at both ends of the EGFP and DsRed cassettes is shown. Furthermore, the photograph (bottom) showing that the expression of the cell in which the assay plasmid was introduced simultaneously with VCre was changed from EGFP to DsRed.
  • Solid squares indicate amino acid mutation sites introduced into VCre.
  • A—N indicates the region of the alpha helix revealed in Cre. Amino acids thought to be in contact with DNA are circled at the top. The result of measuring the recombination efficiency when a mutation is introduced into the predicted active center of VCre is shown.
  • Schematic diagram of RMCE using VCre / VloxP system Electrophoresis photograph showing the results of RMCE analysis using the VCre / VloxP system (1: control plasmid before RMCE reaction; 2-11: each plasmid after RMCE reaction). Schematic diagram of BAC modification using VCre / VloxP system.
  • the site-specific recombinase (VCre protein or SCre protein) of the present invention recognizes an oligonucleotide having a base sequence different from the loxP site, which is a recognition site for Cre protein, and consists of the following polypeptides.
  • polypeptides described in (2) to (4) above are mutants of the site-specific recombinant enzyme protein of the present invention represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 8 (hereinafter including these mutants, For example, based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 below, any method known to those skilled in the art, for example, site-directed mutagenesis, It can be easily prepared by appropriately combining methods well known to those skilled in the art, such as gene homologous recombination method, primer extension method, and PCR method.
  • Preferred examples of the polynucleotide encoding the above polypeptide include the following base sequences. (1) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7; (2) a base sequence that hybridizes in a stringent manner with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence (1), wherein the polypeptide has a site-specific recombinase activity of the polypeptide of (1) A coding base sequence; or (3) A nucleotide sequence having a homology of 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more with the nucleotide sequence (1), wherein the polypeptide of (1) A base sequence encoding a polypeptide having site-specific recombinase activity.
  • hybridization is performed, for example, in Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) or Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987) and methods known to those skilled in the art, etc. It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • stringent conditions for hybridization between polynucleotides refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Therefore, “stringent conditions” specifically includes, for example, conditions in which a sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and pH is 6 to 8 at a temperature of 60 ° C. to 68 ° C. I can do it.
  • polynucleotide that can hybridize with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the polynucleotide containing the coding region shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 include, for example, homology with the entire base sequence of the DNA Examples include polynucleotides containing a base sequence having an average of 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
  • the polynucleotide of the present invention (SEQ ID NO: 1) is derived from a gene of unknown function (SEQ ID NO: 6) contained in Vibrio plasmid p0908 (Hazen et al., Appl. Environ. Microboil., Dec. 2007). , P.7703-7710).
  • the polynucleotide of the present invention (SEQ ID NO: 7) is derived from a gene of unknown function (SEQ ID NO: 12) contained in Shewanella sp. ANA-3 plasmid 1 which is a plasmid of psychrophilic bacterium Schwannella.
  • the polynucleotide can be obtained by colony hybridization using an appropriate probe or primer PCR that can be prepared based on the sequence information and the like described in the present specification, or can be prepared by amplification by primer PCR.
  • PCR is known to those skilled in the art using, for example, a general thermal cycler such as Perkin Elmer 9600 as a thermal cycler, and a general commercial product such as ExTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo) as a heat-resistant DNA polymerase.
  • a general thermal cycler such as Perkin Elmer 9600 as a thermal cycler
  • a general commercial product such as ExTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo) as a heat-resistant DNA polymerase.
  • the appropriate reaction conditions can be selected as appropriate.
  • a polynucleotide prepared from such a strain can be a cDNA prepared by reverse transcription from genomic DNA or mRNA thereof.
  • polynucleotide of the present invention can be synthesized as an artificial gene by any method known to those skilled in the art.
  • the polynucleotide of the present invention containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 is the above-mentioned Vibrio plasmid p0908 or Schwanella plasmid as described in the Examples of the present specification.
  • SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 12 Based on the base sequence of the gene (SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 12) contained in Shewanella sp.
  • ANA-3 plasmid 1 the codon usage is changed to the mammalian type of mouse or human and the expression is suppressed from within the gene
  • the homology (identity) between base sequences and between amino acid sequences is, for example, the algorithm of Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990 and Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993).
  • a BLAST program or FASTA program using such an algorithm is mainly used for searching a database for sequences showing high sequence homology to a given sequence. These can be used, for example, on the web site on the Internet of National Center for Biotechnology Information.
  • the vector containing the polynucleotide encoding the site-specific recombinase of the present invention is in any form known to those skilled in the art, such as a plasmid or viral vector, and can be easily prepared by any method known to those skilled in the art. I can do it.
  • the vector thus obtained includes a non-coding sequence (nuclear translocation signal, tag sequence, non-transcribed sequence, non-translated sequence, promoter, Enhancer, suppressor, transcription factor binding sequence, splicing sequence, poly A addition sequence, IRES, mRNA stabilization / destabilization sequence, etc.) are included as appropriate, and function as an expression vector.
  • the site-specific recombinant enzyme can be expressed under the control of various promoters such as tissue-specific, cell-specific, expression time-specific, or inducible type.
  • Suitable host cells are easily transformed by any method known to those skilled in the art using such vectors, for example, lipofection method, calcium phosphate method, and various physical methods such as electroporation and particle gun. I can do it.
  • a host cell For example, mammalian cells, such as a human, a monkey, and a mouse
  • the transformed cells thus prepared are cultured under any conditions known to those skilled in the art, and the target site-specific recombinase of the present invention is recombined from an appropriate fraction such as the cultured cells or culture supernatant thereof. It can be easily prepared as a type enzyme.
  • the present invention also relates to an antibody that specifically recognizes the site-specific recombinant enzyme thus prepared.
  • antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, single chain antibodies, Fab fragment antibodies, and antibodies having any form known to those skilled in the art. I can do it. These can be easily produced by any method known to those skilled in the art.
  • undifferentiated pluripotent cells such as fertilized eggs, embryonic stem cells (ES cells), various tissue stem cells, and induced pluripotent stem cells (Induced Pluripotent Stem Cell; iPS) as host cellscan be mentioned.
  • ES cells embryonic stem cells
  • tissue stem cells various tissue stem cells
  • induced pluripotent stem cells Induced Pluripotent Stem Cell; iPS
  • the polynucleotide encoding the site-specific recombinant enzyme of the present invention is introduced into a fertilized egg of a host animal, which is a laboratory animal such as a mouse, by any method known to those skilled in the art, such as microinjection. After that, a transgenic animal expressing the enzyme can be produced by transplanting it into the uterus of the foster parent.
  • the site-specific recombination enzyme of the present invention has an activity of recognizing an oligonucleotide (recognition sequence: VloxP site or SloxP site) having the following base sequence and causing site-specific recombination.
  • an oligonucleotide recognition sequence: VloxP site or SloxP site
  • Base sequence Base sequence.
  • the above recognition sequence has three parts of 13 bases, 8 bases, and 13 bases, and the 13 base sequence has a complementary inverted repeat structure.
  • 8 bases are considered to play a role in determining the orientation of the recognition sequence.
  • the 13-base sequence does not necessarily have a complementary inverted repeat structure.
  • Specific examples of the recognition sequence of the present invention include the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 5, 9 to 11, or 13 to 18 shown in Examples.
  • a vector having a target DNA region sandwiched between at least two such oligonucleotides (recognition sequences) is prepared in the above-mentioned appropriate vector, and the above-mentioned appropriate host cell is transformed with the vector.
  • a target DNA region sandwiched between at least two recognition sequences can be obtained, for example, the vector introduced into the cytoplasm or a transformed cell introduced into the chromosomal DNA.
  • host cells are not particularly limited, and for example, mammalian cells including humans, monkeys and mice, plant cells, insect cells, and bacteria such as E. coli can be used.
  • a vector having a polynucleotide encoding the above-mentioned site-specific recombinase is introduced into the same host cell, and thereby the duplex.
  • Transformed cells transformed into are also included in the present invention. In such transformed cells, when a site-specific recombination enzyme is expressed under specific conditions, a site-specific recombination reaction occurs and the target DNA region can be specifically removed.
  • a target DNA region sandwiched between at least two recognition sequences of the present invention is introduced into an ES cell by gene targeting known to those skilled in the art, for example, to obtain a chimeric animal, and further, by crossing this with a wild type animal
  • a targeting animal for example, a rodent such as a mouse, into which a target DNA region sandwiched between the recognition sequences has been introduced can be produced.
  • the site-specific recombination enzyme can be selected from various types such as tissue-specific, cell-specific, expression time-specific, or inducible type. It is possible to produce various conditional knockout or knock-in experimental animals, for example, rodents such as mice, by crossing transgenic animals and targeting animals that are expressed under the control of these promoters.
  • the present invention is a site-specific recombination method in a nucleotide sequence comprising a target DNA region, (1) introducing two oligonucleotides consisting of a base sequence that is a recognition sequence of the site-specific recombinase of the present invention into the nucleotide sequence so as to sandwich the target DNA region; (2) According to the above method, which comprises contacting the target DNA region with the site-specific recombinase of the present invention to cause site-specific recombination at the oligonucleotide site.
  • a vector having a polynucleotide encoding a site-specific recombinase is introduced, and the above-mentioned transformation is double transformed. It can be carried out in cells or in the above-mentioned conditional knockout or knockin experimental animals.
  • the direction of the recognition sequence of the site-specific recombinase, or the deletion, substitution, and reverse orientation of the target DNA region are carried out site-specifically by using a mutant VloxP site or mutant SloxP site, etc. I can do it.
  • a site-specific recombination kit comprising: (1) the site-specific recombinant enzyme of the present invention or a polynucleotide encoding the enzyme, and (2) The kit containing an oligonucleotide which is a recognition sequence of the enzyme is also included in the present invention.
  • said polynucleotide and / or oligonucleotide may be contained in the kit with the form inserted in the appropriate vector etc.
  • kits may further comprise other elements or components known to those skilled in the art, for example, antibodies to the site-specific recombinant enzyme of the present invention, various reagents, enzymes, buffers, reactions, depending on the configuration and purpose of use.
  • a plate (container) or the like can be included as appropriate.
  • cell-specific and site-specific genetic modification can be performed by combining with a cell-specific expression promoter.
  • Cre protein is expressed under the promoter expressed in A cells and B cells
  • the site-specific recombinant enzyme of the present invention is expressed under the promoter expressed in B cells and C cells. If this system is used so that the site-specific recombinant enzyme of the present invention can produce a normal protein only when the Cre protein is present, the site-specific recombination of the present invention can be achieved only with B cells. Recombination of the recombinase can occur.
  • a Simultaneous use with viral vectors In order to produce a conditional knockout, it is usual to use two types of site-specific recombination enzymes.
  • Cre / loxP systems have already been used for helper-dependent adenovirus vectors and retroviruses for packaging and transfer to the viral genome, but the site-specific recombination system of the present invention can be used as well. it can.
  • C double conditional knockout When a family of genes is present, deletion of one gene may not be effective. In that case, a method of examining gene function by deleting two genes is performed. In such a case, if each gene is sandwiched between different site-specific recombination enzyme recognition sites, one gene can be deleted at a time. When gene families are generated due to gene duplication, it is particularly effective to use a plurality of types of recombination sites because genes often exist in the vicinity.
  • the RMCE method is used to introduce exons with mutations at high throughput, while the other allele is made a conditional knockout.
  • the allele on one side can be knocked out conditionally and the effect of mutation on the other allele can be examined.
  • E. System using sequential expression cassettes with splicing acceptors Four types of expression with splicing acceptors can be lined up and removed by recombination if necessary. Since the splicing acceptor site closest to the splicing donor site is used, cassettes A, B, C, and D can be expressed depending on the recombinant enzyme. For example, when this system is used, four types of mutations can be expressed sequentially.
  • F tag exchange The tag at the C-terminal part of the protein can be changed sequentially.
  • Tags such as drug resistance genes, fluorescent proteins, and enzymes can be replaced in a recombinant enzyme-dependent manner.
  • BAC and plasmid monomerization It is known that BAC and plasmids become heteromultimers when using the Red / ET recombination method. Site-specific recombinant enzymes can be used to convert to monomers.
  • Cre protein H Increase cell specificity of Cre expression using two types of promoters Specific knockouts are often performed in combination with Cre proteins under the control of cell-specific promoters. By allowing the Cre protein to be expressed in two stages, the Cre protein can be expressed only in cells that work with both promoter A and promoter B.
  • the amino acid sequence of the VCre protein is represented by SEQ ID NO: 2.
  • VCre protein is a novel site-specific recombination enzyme and its recognition sequence is VloxP
  • codon usage is changed to mouse or human mammalian type, and it is involved in suppression of expression from within the gene
  • a promoter excluding the considered CpG sequence is synthesized as an artificial gene (SEQ ID NO: 1), a nuclear translocation signal is added to the N-terminal part of the VCre protein, and the promoter is expressed in human HEK293 cells (CAG promoter) Inserted below.
  • CAG promoter human HEK293 cells
  • VloxP and a plasmid for testing VloxM1 (SEQ ID NO: 3) and VloxM2 (SEQ ID NO: 4) introduced with a single nucleotide mutation as recognition sequences A plasmid in which these sequences are arranged at both ends of a base sequence of about 1 kbp was prepared.
  • the above plasmid expressing the VCre protein and an assay plasmid containing two VloxPs were simultaneously transformed into human HEK293 cells using Fugene6, and DNA was extracted from the cells one day later. Plasmid DNA for assay was recovered by transforming into E.
  • Lane 1 shows the results of using an assay plasmid containing VloxM1, which obtained preliminary results when the recombination efficiency was good among the three types of Vlox.
  • FIG. 5 clearly shows that the size is about 1 kbp shorter than the size of the lane 2 plasmid not deleted with the VCre protein.
  • the nucleotide sequence of this plasmid near VloxM1 was determined using a DNA sequencer. As a result, it was revealed that the VloxM1 site was recombined site-specifically as expected.
  • human HEK293 was combined with a test plasmid having two recognition sites, VloxP, VloxM1, VloxM2 or loxP, and a plasmid for expressing VCre enzyme or Cre enzyme.
  • a test plasmid having two recognition sites, VloxP, VloxM1, VloxM2 or loxP, and a plasmid for expressing VCre enzyme or Cre enzyme.
  • DNA was collected and PCR was performed with a primer located outside each recognition sequence.
  • VCre and VloxP, VloxM1 or VloxM2, and Cre and loxP as indicated by arrows
  • FIG. 7 shows the base sequences of VloxP, VloxM1, and VloxM2, and loxP and various mutant lox sites.
  • SloxP site (SEQ ID NO: 9:34 bases) obtained by removing 3 bases from both ends of the SloxC2 sequence contained in the original plasmid and the 8 bases contained in the center of the SloxP sequence
  • a Slox2272 site (SEQ ID NO: 10) in which 2 bases were mutated was prepared.
  • a plasmid for testing each of the SloxP site, loxP site, and VloxP site as recognition sequences a plasmid was prepared in which these sequences were arranged at both ends of a base sequence of about 1 kbp.
  • the above plasmid expressing each site-specific recombinant enzyme protein and the assay plasmid containing each of the two recognition sequences are simultaneously transformed into human HEK293 cells using Fugene6, and DNA is extracted from the cells one day later. Were collected and PCR was performed with a polymerase located outside of each recognition sequence.
  • the plasmid for the assay was compared with the case where SCre was applied (lane 2) and the case where it was not applied (lane 1). It was confirmed that the size of was reduced as expected (FIG. 13).
  • Bsd blastosidin S inactivating enzyme
  • EGFP mutant GFP
  • Cm chloramphenicol acetyl transferase
  • Lane 1 shows the results using a plasmid purified from an independent Escherichia coli colony when lanes 1 to 4 were transformed with the assay plasmid alone. From FIG. 15, it was clarified that the SCre protein causes site-specific recombination between SloxP sites and between Slox2272 sites, but does not cause site-specific recombination between the SloxP sites and Slox2272 sites.
  • FIG. 16 shows a comparison of the base sequences of SloxP, SloxC2, 227Slox2272, loxP, and VloxP.
  • the same base between the two compared base sequences is underlined, and the base that is not complementary is shown in bold (bold font).
  • a plasmid was prepared in which two predicted recombination sites were placed between the promoter and the EGFP gene (FIG. 17). Between this recombination site, there is a stop codon and a poly A addition site. When recombination occurs at the VloxP site, the stop cassette is removed and EGFP is expressed. Using this, as in Example 1, it was introduced into human HEK293 cells and DNA was collected from the cells one day later to examine whether recombination had occurred.
  • the plasmid was purified from the colony and compared in size with the original plasmid (FIG. 18). As a result, it can be seen that the size is reduced by recombination at the VloxP site. Furthermore, when the vicinity of VloxP of this plasmid was examined by sequence, it was confirmed that recombination was carried out at the VloxP portion. Furthermore, EGFP expression was observed in a VCre-dependent manner as expected (FIG. 19).
  • the Cre / loxP system has improved convenience due to various mutation sites. Therefore, we tried to identify the recognition sequence of the mutant type in this VCre / VloxP system.
  • One useful mutation site in the loxP site is lox2272. It is known that this mutation site has mutations introduced into two positions of the 8 bases of the core, and recombination occurs between lox2272 but does not occur between loxP and lox2272. The part where the base is replaced with lox2272 happens to be common in loxP and VloxP. Therefore, it was confirmed whether or not such a change was named Vlox2272 (SEQ ID NO: 13) and could be used as a mutation site.
  • Vlox2272 is a mutation site that can be similar to lox2272.
  • lox66 / lox71 type mutation sites In addition, we attempted to identify lox66 / lox71 type mutation sites. It is known that this type of mutation site is reversed at the opposite recognition site, but once reversed, a double mutation site is formed, and the efficiency of reversion is significantly reduced. Desired mutation sites were screened from a random library as follows using oligos in which the outer 5 bases had a random sequence. A kanamycin resistance gene is placed in the reverse direction between the recognition sites containing random bases in the outer five bases, and introduced into the cells in the same manner as in Example 1 together with the VCre expression plasmid. After transformation, the kanamycin resistance gene was inverted and fused with GST, and a plasmid showing kanamycin resistance was selected.
  • the resulting plasmid was sequenced to confirm the sequence.
  • several kanamycin resistance plasmids thus selected were mixed and introduced again at the same time as the VCre expression plasmid. Since the re-inverted one becomes kanamycin-sensitive, the clones screened in this way were sequenced and a sequence that was difficult to reverse was selected.
  • a lox66 / lox71 type mutation site was identified for the SloxP site.
  • SloxP a mutation similar to the base substitution introduced in the sequences of lox66 and lox71 was introduced without screening as in the case of Vlox43L and Vlox43R.
  • mutation sites were placed at both ends of the EGFP and DsRed cassettes (FIG. 23). When this cassette is inverted, the expression is expected to change from EGFP to DsRed.
  • the plasmid for assay containing SCre expression plasmid and SloxV1R (SEQ ID NO: 16) and SloxV1L (SEQ ID NO: 17) was simultaneously expressed in HEK293 cells in the same manner as in Example 1.
  • Panels a and b, and c and d shown in FIG. 23 are photographs of the same field of view, and clearly show that the expression of EGFP changes to DsRed in cells in which the plasmid for the assay is introduced simultaneously with SCre. .
  • Table 1 shows the base sequences of representative examples of the mutation sites (underlined indicates the mutation sites) in the VCre / VloxP system and SCre / SloxP system. A comparison of amino acid sequences between VCre and SCre proteins is also shown in Table 2.
  • FIG. 24 It was investigated whether the VloxP site introduced on the ES cell genome could undergo recombination (FIG. 24).
  • the fluorescence microscope showed the distribution of intracellular EGFP (B, b, e) and the distribution of DsRed (B, c, f) (scale bar 10 ⁇ m).
  • ES cells were prepared in which exon 3 of the Lin28 gene on the other chromosome was sandwiched between VloxP sites (C).
  • the VCre expression plasmid was introduced by electroporation, and single colonized ES cells were assayed by PCR. From the results of PCR analysis (D), Southern hybridization (E), and immunoblot (F), the portion between VloxP was deleted and the fragment was shortened. As a result, the endogenous Lin28 protein was found to be You can see that it has disappeared.
  • VCre and SCre were introduced into the plasmid of the pSIM system, which can be induced by heat shock, and the plasmid can be maintained at 32 ° C, but the plasmid becomes unstable at 37 ° C and can be removed.
  • the DNA of VCre and SCre was not the original plasmid of each bacterium, but the DNA prepared in Example 1 and Example 3 and optimized for the mouse and human codon usage was used.
  • the origin of ori101 was used so that it could coexist with BAC and high copy plasmid.
  • This plasmid is a temperature sensitive origin and can be removed by heat shock. Moreover, it is controlled by a temperature sensitive cI857 repressor and induces expression at 42 degrees.
  • an ampicillin-resistant gene is sandwiched between kanamycin-resistant plasmids at the VloxP site, and a plasmid in which the loxP sites are sandwiched at both ends of the chloramphenicol-resistant gene on the same plasmid at 42 ° C.
  • the cells were transformed by electroporation.
  • each drug-resistant plate was plated and examined for the growth of colonies the next day. For confirmation, 100 kanamycin plate colonies were randomly selected and grown on ampicillin and chloramphenicol plates.
  • H314L nor Y349F was found to have recombination activity with VloxP (FIG. 29). It was revealed that the mutation at the active center estimated from Cre (Y349F) and the mutation that nicked at the recognition site estimated from Flp and remained covalently bonded to DNA (H314L) were also similar in VCre. It was. From the above, it became clear that the enzyme is structurally similar to Cre.
  • Vlox2272 recombines between Vlox2272 but does not recombine between Vlox2272 and VloxP. Using this fact, I tried to confirm whether the RMCE method can be used.
  • VloxP and Vlox2272 Since there are two VloxP and Vlox2272, there is a possibility of 6816bp, 6029bp, 5707bp, 4920bp, but it was confirmed that they were all smaller types than the sequence results. Even if this is first inserted into the inner VloxP site or Vlox2272 site, the second recombination between VloxPs and Vlox2272 occurs, and it seems that the shortest form will eventually occur. In this system of E. coli heat shock, protein induction and Oli 101 destabilization occur simultaneously, so the VCre protein is induced transiently, and the protein concentration is diluted by one turnover of the protein and E. coli division. It is thought that multiple site-specific recombination occurs within a short period of time.
  • pBACe3.6 is a very commonly used BAC, but has a loxP site and a lox511 site in the vector.
  • Nanog is a gene used as an index for iPS conversion, and has a use in which a marker protein or a drug resistance marker is expressed under the control of the Nanog promoter and used as a marker for iPS conversion.
  • the drug selection marker gene part may interfere, so it is necessary to remove it. Arise. It was shown that the VCre / VloxP system is effective in removing the drug selection marker gene portion that is no longer necessary.
  • Various experiments can be performed by combining the site-specific recombination enzyme according to the present invention and the site-specific recombination system comprising the enzyme recognition sequence with the already known Cre / loxP and Flp / FRT systems. it can.
  • it can be used in a VCre / VloxP or SCre / SloxP system in cultured cells of a wide variety of species, mouse ES cells and human iPS cells.
  • FIGS. 34 to 38 can be given.
  • FIG. 37 several tens of SloxP sites are introduced as sites for degradation when an artificial chromosome is prepared.
  • the mutation site corresponding to lox66 / lox71 in the Cre / loxP system is inserted in front of the Neo and Puro genes as shown in the figure, and the mutation site of VloxP or SloxP. Introduce into the exchanged plasmid.
  • a gene of interest can be introduced into an artificial chromosome in a VCre- or SCre-dependent manner.
  • a system for decomposing and removing the artificial chromosome can be constructed by expressing VCre or SCre protein.
  • the system that eliminates the artificial chromosome depending on the recombination enzyme is possible with other recombination enzyme systems other than these site-specific recombination enzymes, it is not particularly limited to VCre / VloxP and SCre / SloxP. Absent.
  • the present invention can be used not only to modify chromosomal DNA of industrially useful microorganisms including E. coli but also to modify BAC clones maintained in E. coli. It can be easily imagined by the parties that the efficiency is improved by changing the codon usage to the E. coli type. Furthermore, since it is proved from the examples of the present specification that the presence of a cofactor is not necessary, it is possible to express the VCre protein of the present invention in E. coli and cause recombination in vitro.
  • iPS gene introduced from iPS can be used for a disease state model animal. It can also be used for modification and gene transfer on human and mouse artificial chromosomes.

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Abstract

以下のポリペプチドから成る部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチド： （１）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド； （２）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、 （３）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、 （４）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。

Description

新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法
　本発明は、新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法等に関する。
部位特異的組換えとは、数百塩基対にも及ぶ長い塩基配列によって起こる相同的組換えとは異なり、特定の短い相同的な塩基配列によってＤＮＡが組換えをする現象である。
　部位特異的組換え酵素による部位特異的組換えとしては、ファージ由来のCre/loxP系が有名で、大腸菌からマウスまで広く使用されている。
Cre酵素はP1ファージ由来の３４３個のアミノ酸から成る蛋白質でloxP部位と呼ばれる34bpの特異的な塩基配列を認識し、部位特異的組換えを行うことができる。Cre/loxPの特異的組み換えシステムに関しては多くの知見が蓄積されている（特許文献１及び特許文献２）。loxP部位は13塩基、８塩基、及び13塩基の３つの部分に分けることができ、13塩基の配列は相補的なインバーテッドリピート構造となっている一方、８塩基はloxP部位の向きを決める役割を果たす。Lox511やlox2272と呼ばれる変異型のloxPも多く報告されており、変異型のloxP部位を含めて２個のloxPにはさまれたDNA領域の欠損や置換、逆向きにする等の染色体DNA上の遺伝子構造の改変に幅広く利用されている。
更に、部位特異的組換え酵素による部位特異的組換えシステムの他の例として、酵母プラスミド２μ由来のFlp/FRT系（非特許文献１）及び腸内細菌ファージD6由来のDre/rox系（特許文献３）を挙げることが出来る。
このような部位特異的組換えシステムにおいて、部位特異的組換え酵素を組織特異的、細胞特異的、発現時期特異的、又は誘導型等の各種のプロモーターの制御下で発現させることによって、様々な条件付きノックアウト又はノックイン実験動物を作製することが可能である。
特許第２７２１６６６号公報 米国特許４９５９３１７号明細書 米国特許７４２２８８９号明細書
Broach JR, Guarascio VR, Jayaram M., Cell, 1982 May, 29(1):227-34
異なる配列を認識する制限酵素がそれぞれ利用価値があるように、異なる特異配列を認識する部位特異的組換え酵素を互いに他と組み合わせることにより、様々な実験系を構成することが可能となる。従って、新たな部位特異的組換え酵素を提供することが求められている。
　本発明者は上記課題を解決すべく研究の結果、新規の部位特異的組換え酵素とその認識配列を同定し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
［態様１］
以下のポリペプチドから成る部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（２）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（３）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（４）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。
［態様２］
以下の塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）配列番号１又は７で示される塩基配列；
（２）塩基配列（１）と相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイズする塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；又は、
（３）塩基配列（１）と７０％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
［態様３］合成ポリヌクレオチドである、請求１又は２記載のポリヌクレオチド。
［態様４］
態様１ないし３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［態様５］
態様４記載のベクターによって形質転換された細胞。
［態様６］
幹細胞である、態様５記載の細胞。
［態様７］
態様１ないし３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが染色体に導入された、ヒト以外のトランスジェニック動物。
［態様８］
齧歯類である、態様７記載のトランスジェニック動物。
［態様９］
以下のポリペプチドから成る部位特異的組換え酵素：
（１）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（２）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（３）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（４）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。
［態様１０］
組換え型酵素である、態様９記載の部位特異的組換え酵素。
［態様１１］
態様９又は１０記載の部位特異的組換え酵素を特異的に認識する抗体。
［態様１２］
態様９又は１０記載の部位特異的組換え酵素によって認識される配列であって、以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド：
（１）配列番号３～５、９～１１又は１３～１８のいずれかに示される塩基配列；又は
（２）塩基配列（１）において一個又は数個の塩基が欠失、置換又は挿入された塩基配列。
［態様１３］
態様１２記載の２つのオリゴヌクレオチドの間に標的ＤＮＡ領域を含むベクター。
［態様１４］
態様１３記載のベクターによって形質転換された細胞。
［態様１５］
幹細胞である、態様１４記載の細胞。
［態様１６］
染色体の標的ＤＮＡ領域を挟むように態様１２記載の２つのオリゴヌクレオチドが導入された、ヒト以外のターゲッティング動物。
［態様１７］
齧歯類である、態様１６記載のターゲッティング動物。
［態様１８］
態様７又は８記載のトランスジェニック動物、態様１６又は１７記載のターゲッティング動物の交配によって作製された条件付ノックイン又はノックアウト実験動物。
［態様１９］
齧歯類である、態様１８記載の条件付ノックイン又はノックアウト動物。
［態様２０］
標的ＤＮＡ領域を含むヌクレオチド配列において部位特異的組換え方法であって、
（１）標的ＤＮＡ領域を挟むように態様１２記載の塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを該ヌクレオチド配列に導入し、
（２）該標的ＤＮＡ領域を態様９記載の部位特異的組換え酵素と接触させて、該オリゴヌクレオチド部位において部位特異的組換えを生起させる、ことから成る前記方法。
［態様２１］
態様４記載のベクター及び態様１３記載のベクターが導入された形質転換細胞において生起する、態様２０記載の部位特異的組換え方法。
［態様２２］
態様１８又は１９記載の条件付ノックアウト又は実験動物において行なわれる、態様２１記載の部位特異的組換え方法。
［態様２３］
標的ＤＮＡ領域が蛋白質又はその一部をコードする、態様２１又は２２記載の部位特異的組換え方法。
［態様２４］
部位特異的な標的ＤＮＡ領域の欠損、置換、又は逆向きが起こる、態様２１ないし２３のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法。
［態様２５］
態様２１ないし２４のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法を行なうための部位特異的組換え用キットであって、
（１）態様９記載の部位特異的組換え酵素又は該酵素をコードするポリヌクレオチド、
（２）態様１２記載のオリゴヌクレオチド、を含む該キット。
本発明によって、新規な部位特異的組換え酵素（VCre蛋白質及びSCre蛋白質）及びそれらの認識配列から成る特異的組換えシステム等が提供される。
本発明のVCre酵素及びVloxP部位から成る部位特異的組換えシステムの応用例の概要を示す。 発明のVCre酵素及びVloxP部位から成る部位特異的組換えシステムの応用例の概要を示す。 本発明のVCre蛋白質（Sbjct）とCre蛋白質（Query）とのアミノ酸配列の比較を示す。 実施例１においてプロモーター下流に挿入したアミノ酸配列を示す。ここで、下線部（８アミノ酸）は核移行シグナル、及び、四角枠で囲まれた部分はFLAGタグ（抗体認識用ペプチド）を示す。 本発明のVCre酵素及びVloxP部位から成る部位特異的組換えシステムによる部位特異的組換えの結果を示す電気泳動の写真である。 本発明のVCre酵素はCre酵素の認識配列であるloxP部位を認識しないことを示す電気泳動の写真である。 VloxP、VloxM1、及びVloxM2、並びに、loxP及び各種の変異lox部位の塩基配列を比較したものである。 本発明のSCre酵素及びSloxP部位から成る部位特異的組換えシステムの応用例の概要を示す。 発明のSCre酵素及びSloxP部位から成る部位特異的組換えシステムの応用例の概要を示す。 本発明のSCre蛋白質とCre蛋白質とのアミノ酸配列の比較を示す。 本発明のSCre蛋白質とVCre蛋白質とのアミノ酸配列の比較を示す。 本発明のSCre酵素は、Cre酵素の認識配列であるloxP部位、又は、VCre酵素の認識配列であるVloxP部位のいずれをも認識しないことを示す電気泳動の写真である。 本発明のSCre酵素及びSloxP部位から成る部位特異的組換えシステムによる部位特異的組換えの結果を示す電気泳動の写真である。 SloxP部位及びSlox2272部位の検定用プラスミドの構造を示す。 本発明のSCre酵素、並びに、SloxP部位及び及びSlox2272部位を含む検定用プラスミドから成る部位特異的組換えシステムによる部位特異的組換えの結果を示す電気泳動の写真である。 SloxP, loxP, 及びVloxPの塩基配列を比較したものを示す。 予測した組み換え部位をプロモーターとEGFPの遺伝子の間に２カ所配置したプラスミドを示す。 VCre発現細胞で組み換え後に大腸菌に導入し、それらの大腸菌コロニーからプラスミドを精製して元のプラスミドと大きさを比較した電気泳動の写真である。 VCre依存的に発現したEGFPを示す写真である。 Vlox2272部位を２ヶ所もつ検定用のプラスミドを示す。 VloxP同士、Vlox2272同士は組み換えを起こし、VloxPとVlox2272が組み換わるものは検出されないことを示す電気泳動の写真である。 EGFPとDsRedのカセットの両端に２つの変異部位Vlox43 L 及びVlox43Rを配置した検定用のプラスミドの様子を示す。更に、検定用のプラスミドがＶCreと同時に導入された細胞はEGFPからDsRedに発現が変わっていること示す写真（下）である。 EGFPとDsRedのカセットの両端に２つの変異部位SloxV1L及びSloxV1Rを配置した検定用のプラスミドの様子を示す。更に、検定用のプラスミドがＶCreと同時に導入された細胞はEGFPからDsRedに発現が変わっていること示す写真（下）である。 ＥＳ細胞のゲノム上に導入したVloxPサイトで組み換えを起こすことができるかを調べた実験の結果を示す。 大腸菌でのVCreとSCre部位特異的組み換え酵素の発現プラスミドと組み換えテスト用のプラスミドの模式図。 VCreとCreの大腸菌内での組み換え効率と特異性を示す。 SCreとCreの大腸菌内での組み換え効率と特異性を示す。 ClustalW法により並べたCre, VCre, SCreのアミノ酸配列を示す。アスタリスクはアミノ酸が一致していることを示し、「：」は類似アミノ酸を示す。四角で囲まれているアミノ酸はCreの活性中心のアミノ酸を示す。実線の四角はVCreに導入されたアミノ酸変異部位を示している。Ａ－ＮはCreで明らかになっているアルファへリックスの領域を示す。ＤＮＡに接触していると考えられているアミノ酸は上部に丸を描いてある。 VCreの予想活性中心に変異を導入した場合の組み換え効率を測定した結果を示す。 VCre/VloxPシステムを用いたRMCEの模式図。 VCre/VloxPシステムを用いたRMCEの解析の結果を示す電気泳動の写真（１：コントロールのRMCE反応前のプラスミド。２～１１：RMCE反応後の各プラスミド）。 VCre/VloxPシステムを用いるBAC改変の模式図。 VCre/VloxPシステムによるBAC改変の結果を示す電気泳動の写真である。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。
　本発明の部位特異的組換え酵素（VCre蛋白質又はSCre蛋白質）は、Cre蛋白質の認識部位であるloxP部位とは異なる塩基配列から成るオリゴヌクレオチドを認識し、以下のポリペプチドからなる。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列（３８０個のアミノ酸）又は配列番号８に示されるアミノ酸配列（３７１個のアミノ酸）から成るポリペプチド；
（２）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（３）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（４）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。
上記の（２）～（４）に記載されたポリペプチドは配列番号２又は配列番号８で示される本発明の部位特異的組換え酵素蛋白質の変異体（以下、これら変異体も含めて、「部位特異的組換え酵素」ともいう）であり、例えば、以下の配列番号１又は配列番号７に示される塩基配列に基づき、当業者に公知の任意の方法、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、上記の部位特異的組換え酵素のペプチドを適当な場所で分断し、不活性な２個の蛋白質とそれら再構成され活性を持つようになるスプリット蛋白質ができることは当事者であれば推定できる。
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの好適例は以下の塩基配列を含むものである。
（１）配列番号１又は配列番号７で示される塩基配列；
（２）塩基配列（１）と相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイズする塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；又は、
（３）塩基配列（１）と７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
　ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，２００１）又はＣｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８７）等の当業者に公知の文献に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
　本明細書において、ポリヌクレオチド間のハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。従って、「ストリンジェントな条件下」とは、具体的には、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度１５０～９００ｍＭ、好ましくは６００～９００ｍＭ、ｐＨ６～８であるような条件を挙げることが出来る。
　尚、配列番号１又は配列番号７に示されたコード領域を含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上である塩基配列を含有するポリヌクレオチド等を挙げることができる。
本発明のポリヌクレオチド（配列番号１）はビブリオ菌プラスミドp0908中に含まれる機能未知の遺伝子（配列番号６）に由来するものである（Hazen et al., Appl. Environ. Microboil., Dec. 2007, p.7703-7710）。又、本発明のポリヌクレオチド（配列番号７）は低温菌であるシュワネラ菌のプラスミドであるShewanella sp. ANA-3 plasmid 1中に含まれる機能未知の遺伝子（配列番号１２）に由来するものである（LOCUS CP000470, 278942bp DNA circular BCT 29-NOV-2007 DEFINITION Shewanella sp. ANA-3 plasmid 1, complete sequence. ACCESSION CP000470 AALH01000000 AALH01000001-AALH01000116）。該ポリヌクレオチドは本明細書に記載された配列情報等に基づき作成可能な適当なプローブ又はプライマーＰＣＲを用いて、コロニーハイブリダイズにより取得したり、プライマーＰＣＲにより増幅して調製することが出来る。尚、ＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製９６００など一般のサーマルサイクラー、及び、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）などの一般の市販品を用いて当業者に公知の適当な反応条件を適宜選択して実施することができる。　　
従って、このような菌株から調製されたポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ又はそのｍＲＮＡからの逆転写によって調製されたｃＤＮＡであり得る。
更に、本発明のポリヌクレオチドは人工遺伝子として当業者に公知の任意の方法で合成することもできる。例えば、配列番号１又は配列番号７で示される塩基配列を含む本発明のポリヌクレオチドは、本明細書の実施例に記載されているように、上記のビブリオ菌プラスミドp0908又はシュワネラ菌のプラスミドであるShewanella sp. ANA-3 plasmid 1中に含まれている遺伝子の塩基配列（配列番号６又は配列番号１２）に基づき、コドン使用頻度をマウスやヒトの哺乳類型に変更し、かつ遺伝子中から発現抑制に関与すると考えられているCpG配列を除いて人工的にデザインし合成した塩基配列である。
尚、塩基配列間及びアミノ酸配列間の相同性（同一性）は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４－２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３－５８７７，１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブ部位において利用可能である。
　本発明の部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターはプラスミド又はウイルス性ベクター等の当業者に公知の任意の形態であり、当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来る。こうして得られたベクターには、本発明の部位特異的組換え酵素のコード領域以外に、５’および３’に非コード配列（核移行シグナル、タグ配列、非転写配列、非翻訳配列、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー、転写因子結合配列、スプライシング配列、ポリＡ付加配列、ＩＲＥＳ、ｍＲＮＡ安定化・不安定化配列等を含む）が適宜含まれており、発現ベクターとして機能する。
ここで、部位特異的組換え酵素は組織特異的、細胞特異的、発現時期特異的、又は誘導型等の各種のプロモーターの制御下で発現させることができる。
このようなベクターを用いた当業者に公知の任意の方法、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、並びに、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の各種物理的方法によって、適当な宿主細胞を容易に形質転換させることが出来る。
宿主細胞に特に制限はなく、例えば、ヒト、サル及びマウス等を含む哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び、大腸菌等の細菌類を用いることができる。こうして作製された形質転換細胞は当業者に公知の任意の条件で培養し、培養した菌体又はその培養上清等の適当な画分から目的とする本発明の部位特異的組換え酵素を組換え型酵素として容易に調製することが出来る。
従って、本発明は、こうして調製された部位特異的組換え酵素を特異的に認識する抗体にも係るものである。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Fab断片抗体、及びFab’断片抗体等の当業者に公知の任意の形態を有するものを挙げることが出来る。これらは当業者に公知の任意の方法によって容易に製造することができる。
更に、宿主細胞として、受精卵、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、各種組織性幹細胞、及び、人工多能性幹細胞（Induced Pluripotent Stem Cell; iPS）等の様々な種類の未分化の多能性細胞を挙げることが出来る。
本発明の部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、マイクロインジェクション等の当業者に公知の任意の方法によってマウス等の齧歯類である実験動物である宿主動物の受精卵に導入した後、仮親の子宮に移植して、該酵素を発現するトランスジェニック動物を作製することが出来る。
本発明の部位特異的組換え酵素は、以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（認識配列：VloxP部位又はSloxP部位）を認識して部位特異的組換えを起こす活性を有する。
（１）配列番号３～５、９～１１又は１３～１８のいずれかに示される塩基配列；又は
（２）塩基配列（１）において一個又は数個の塩基が欠失、置換又は挿入された塩基配列。
　上記の認識配列は、Cre酵素に対するloxP部位と同様に、１３塩基、８塩基、及び１３塩基の３つの部分を有しており、１３塩基の配列は相補的なインバーテッドリピート構造となっていることが好ましく、一方、８塩基は認識配列の向きを決める役割を果たしていると考えられる。
　具体的には例えば、当業者であれば、Cre/loxPシステムの変異lox部位である、lox511, lox2272, lox2372, lox66、及びlox71に準じて容易に変異VloxP部位又は変異SloxP部位を作製し、部位特異的なDNAの欠損、置換、逆向きにするシステムを構築することができる。従って、このような変異VloxP部位又は変異SloxP部位においては１３塩基の配列は必ずしも相補的なインバーテッドリピート構造となっている必要はない。本発明の認識配列の具体例として、実施例に示された配列番号３～５、９～１１、又は１３～１８に示される塩基配列を挙げることが出来る。
　従って、上記の適当なベクター内に、少なくとも２つのこのようなオリゴヌクレオチド（認識配列）で挟まれる標的ＤＮＡ領域を有するベクターを作製し、該ベクターを用いて上記の適当な宿主細胞を形質転換して、少なくとも２つの認識配列に挟まれた標的ＤＮＡ領域が、例えば、細胞質内に導入された該ベクター又は染色体ＤＮＡ内に導入された形質転換細胞を得ることができる。このような宿主細胞に特に制限はなく、例えば、ヒト、サル及びマウス等を含む哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び、大腸菌等の細菌類を用いることができる。
更に、このような２つのオリゴヌクレオチドの間に標的ＤＮＡ領域を含むベクターに加えて、上記の部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドを有するベクターが同じ宿主細胞に導入され、これらによって二重に形質転換された形質転換細胞も本発明に含まれる。このような形質転換細胞においては、部位特異的組換え酵素が特定の条件下で発現すると、部位特異的組換え反応が起こり標的ＤＮＡ領域を特異的に除去することができる。
本発明の少なくとも２つの認識配列で挟まれた標的ＤＮＡ領域を当業者に公知の遺伝子ターゲッティングによって、例えば、ＥＳ細胞に導入してキメラ動物を得、更に、これと野生型動物を交配することによって、該認識配列で挟まれた標的ＤＮＡ領域が導入された、例えば、マウス等の齧歯類であるターゲッティング動物を作製することが出来る。
以上の部位特異的組換え酵素及び該酵素の認識配列から成る部位特異的組換えシステムにおいて、部位特異的組換え酵素を組織特異的、細胞特異的、発現時期特異的、又は誘導型等の各種のプロモーターの制御下で発現させるトランスジェニック動物及びターゲッティング動物を交配することによって、例えば、マウス等の齧歯類である、様々な条件付きノックアウト又はノックイン実験動物を作製することが可能である。
従って、本発明は、標的ＤＮＡ領域を含むヌクレオチド配列における部位特異的組換え方法であって、
（１）本発明の部位特異的組換え酵素の認識配列である塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡ領域を挟むように該ヌクレオチド配列に導入し、
（２）該標的ＤＮＡ領域を本発明の部位特異的組換え酵素と接触させて、該オリゴヌクレオチド部位において部位特異的組換えを生起させる、ことから成る前記方法に係る。
この方法は、２つの認識配列の間に標的ＤＮＡ領域を含むベクターに加えて、部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドを有するベクターが導入されて二重に形質転換された上記の形質転換細胞、又は、上記の条件付きノックアウト又はノックイン実験動物内において行なうことが可能である。
　既に記載したように、部位特異的組換え酵素の認識配列の向き、又は、変異VloxP部位又は変異SloxP部位等を用いることにより、標的ＤＮＡ領域の欠損、置換、及び逆向きを部位特異的に行うことが出来る。
更に、部位特異的組換え用キットであって、
（１）本発明の部位特異的組換え酵素又は該酵素をコードするポリヌクレオチド、及び、
（２）該酵素の認識配列であるオリゴヌクレオチド、を含む該キットも本発明に含まれる。尚、上記のポリヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドは適当なベクター等に挿入された形態でキットに含まれていても良い。
　係るキットには、その構成・使用目的などに応じて、更に当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、本発明の部位特異的組換え酵素に対する抗体、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等を適宜含むことが出来る。
　既に記載したように、細胞特異的発現のプロモーターと組み合わせることにより、細胞特異的で部位特異的な遺伝子改変を行うことができる。例えば、Ａ細胞とＢ細胞で発現するプロモーターの下でCre蛋白質を発現させ、Ｂ細胞とＣ細胞で発現するプロモーターのもとで本発明の部位特異的組換え酵素を発現させるようにする。このシステムを用いて、Cre蛋白質が存在しているときにだけ本発明の部位特異的組換え酵素が正常な蛋白質ができるようしておくと、最終的にＢ細胞だけで本発明の部位特異的組換え酵素の組み換えを生じさせることができる。
　更に、以下に本発明に係る部位特異的組換え酵素及び該酵素の認識配列から成る部位特異的組換えシステムの応用例を挙げ、これらの概要を図１、図２、図８及び図９、更に、図３４～３８に示す。
A　ウイルスベクターと同時に使用
コンデショナルノックアウトを作製するために、2種類の部位特異的組み換え酵素を用いることが通常であるが、ウイルスベクターで導入する場合にもう１種類必要になる。例えば、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターやレトロウイルスはパッケージングやウイルスゲノムへ移すためにCre/loxPのシステムが既に使用されているが、本発明の部位特異的組換えシステムも同様に使用することができる。
B　一つの遺伝子の２本の染色体のそれぞれをコンデショナルノックアウト
ヒト細胞を扱う場合に、マウスのように交配はできないので２本の染色体をそれぞれ改変する必要が生じる。同じ遺伝子の片側のアレルをそれぞれにコンデショナルノックアウトする場合に使用できる。片側のアレルに突然変異をノックインすることにより、突然変異の効果を調べることも可能となる。
C　ダブルコンデショナルノックアウト
遺伝子のファミリーが存在する場合、１つの遺伝子の欠損では効果の出ないことがある。その場合に２つの遺伝子を欠損させることにより遺伝子機能を調べる方法が行われる。このような場合にそれぞれの遺伝子を別の部位特異的組み換え酵素の認識部位でははさむと、片方ずつ順番に欠損させることができる。遺伝子重複により遺伝子ファミリーが生じた場合、遺伝子が近傍に存在することが多いので特に複数種類の組み換え部位を用いられることは有効である。
D　RMCE法とコンデショナルKOとの組み合わせ
変異の入ったエクソンをハイスループットで導入するためにRMCE法を用いる一方、もう片側のアレルはコンデショナルノックアウトにする。このようなシステムにすることで、片側のアレルをコンデショナルにノックアウトを行い、もう片側のアレルの変異の効果を調べることができる。
E　スプライシングのアクセプターをもつ発現カセットを順次使用するシステム
スプライシングのアクセプターをもつ４種類の発現を並べて、必要に応じて組み換え反応で取り除くことができる。スプライシングドナー部位に最も近いスプライシングアクセプター部位が使用されることから、カセットA,B,C,Dを組み換え酵素依存的に発現させることができる。例えば、このシステムを用いると４種類の突然変異を順次発現させることができる。
F　タグの交換
蛋白質のC末端部分のタグを順次変えることができる。薬剤抵抗性遺伝子、蛍光蛋白質、酵素などのタグを組み換え酵素依存的に入れ換えることができる。
G　BACやプラスミドのモノマー化
Red/ET組み換え法を用いた時にBACやプラスミドがヘテロなマルチマーになってしまうことが知られている。部位特異的な組み換え酵素を用いて、モノマーに変換することができる。
H　２種類のプロモーターを用いてCre発現の細胞特異性を高める
特異性をコンデショナルノックアウトは細胞特異的なプロモーター制御下のCre蛋白質と組み合わせて行うことが多い。２段階でCre蛋白質が発現するようにすることによりプロモーターAとプロモーターBの両方で働く細胞のみでCre蛋白質を発現させることができる。
以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、以下の実施例における各遺伝子操作の手段・条件等は、特に断わりがない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８９；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｎ．Ｙ，　１９９５等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。
Cre蛋白質のアミノ酸配列を用いて、公共のDNAデータベース（Genbank/EMBL/DDBJ）に対してBlastプログラムを用いて相同性検索を行った結果、９８％以上の相同性を示すごく近縁のファージ由来の蛋白質の他に、３０％程度の弱い相同性を示す蛋白質が見出された。その中の１つは塩堆積物中で見つかったビブリオ菌のプラスミドであるp0908上に存在し、該遺伝子がコードする該蛋白質をVCre蛋白質と名づけた。このVCre蛋白質はCre蛋白質とは29％の相同性を示した（図３）。尚、VCre蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２で示す。
部位特異的組換え酵素システムを実行するにあたり、もうひとつ重要なことはこの推定上の組み換え酵素が認識する特異的な塩基配列を決定することである。本発明のVCre蛋白質とCre蛋白質との相同性は29％と低いことから考えて、認識配列も類似性が低いと推測できる。loxP部位が１３塩基、８塩基、１３塩基の３つの部分に分かれていることから、このような構造をとりうる配列をp0908で予測した。その結果、配列番号５で示される塩基配列を見出し、これを「VloxP部位」と名づけた。VCre蛋白質が新規部位特異的組換え酵素であり、その認識配列がVloxPであることを証明するために、コドンユーセージをマウスやヒトの哺乳類型に変更し、かつ遺伝子中から発現抑制に関与すると考えられているCpG配列を除いたものを人工遺伝子（配列番号１）として合成し、更に、VCre蛋白質のN末端部分に核移行シグナル等を付加し、ヒトHEK293細胞で発現するプロモーター（CAGプロモーター）の下に挿入した。尚、このプロモーター下流に挿入したアミノ酸配列を図４に示す。
一方、VloxP部位を完全なインバーテッドリピート構造とするために、VloxPとそれぞれ一塩基の変異を導入したVloxM1（配列番号３）とVloxM2（配列番号４）を認識配列として検定するためのプラスミドとして、これらの配列を約１ｋｂｐの塩基配列の両端に配置したプラスミドを作製した。VCre蛋白質を発現する上記のプラスミドと２個のVloxPを含む検定用のプラスミドを同時にヒトHEK293細胞へFugene6を用いて形質転換し、１日後に細胞からDNAを抽出した。検定用のプラスミドDNAを大腸菌に形質転換することにより回収し、電気泳動によりサイズを比較した（図５）。レーン１は現時点で３種類のVloxの中で組み換え効率が良いと予備的な結果が得られたVloxM1を含む検定用のプラスミドを用いた結果を示している。図５から、VCre蛋白質で欠損させていないレーン２のプラスミドのサイズより約１kbp短くなっていることが明らかである。このプラスミドのVloxM1付近をDNAシーケンサーで塩基配列を決定した結果、予想通りにVloxM1部位で部位特異的に組み変わっていることが明らかになった。
更に、認識配列であるVloxP, VloxM1, VloxM2又はloxP部位を夫々２個持っている検定用のプラスミドと、VCre酵素又はCre酵素を発現させるプラスミドを組み合わせて、実施例１と同様に同時にヒト HEK293に導入後、一日経った時点でDNAを回収し、夫々の認識配列の外側に位置するプラ イマーでPCRを行なった。その結果、VCreとVloxP, VloxM1又はVloxM2 、及び、 CreとloxPのみで（矢印のように）明確な短いバンドが検出できた（図６）。これは、これらの間でのみ、部位特異的な組み換えが起こったことを意味しており、本発明のVCre酵素はCre酵素の認識配列であるloxP部位は認識しないことが確認された。
　尚、VloxP, VloxM1, 及びVloxM2、並びに、loxP及び各種の変異lox部位の塩基配列を図７に示す。
Cre蛋白質のアミノ酸配列を用いて、公共のDNAデーターベース（Genbank/EMBL/DDBJ）に対してBlastプログラムを用いて相同性検索を行った結果、９８％以上の相同性を示すごく近縁のファージ由来の蛋白質の他に、３０％程度の弱い相同性を示す蛋白質が見出された。その中の１つは塩堆積物中で見つかった低温菌であるシュワネラ菌のプラスミドであるShewanella sp. ANA-3 plasmid 1上に存在し、該遺伝子がコードする該蛋白質をSCre蛋白質と名づけた。尚、SCre蛋白質のアミノ酸配列を配列番号８で示す。このSCre蛋白質はCre蛋白質とは３１％の相同性を示した（図１０）。又、SCre蛋白質はVCre蛋白質とは４０％の相同性を示した（図１１）。
部位特異的組換え酵素システムを実行するにあたり、もうひとつ重要なことはこの推定上の組み換え酵素が認識する特異的な塩基配列を決定することである。本発明のSCre蛋白質とCre蛋白質との相同性は31％と低いことから考えて、認識配列も類似性が低いと推測できる。loxP部位が１３塩基、８塩基、１３塩基の３つの部分に分かれていることから、このような構造をとりうる配列を上記のシュワネラ菌のプラスミドであるShewanella sp. ANA-3 plasmid 1中で予測した。その結果、配列番号５で示される塩基配列を見出し、これを「SloxC2部位（４０塩基）」と名づけた。更に、元のプラスミドに含まれているSloxC2の配列の両末端から夫々３塩基を除いたものがSloxP部位（配列番号９：３４塩基）、及び、SloxP配列の中央に含まれる８塩基の中の２塩基を変異させたSlox2272部位（配列番号１０）を作製した。
まず、新規部位特異的組換え酵素であるSCre蛋白質と、上記のCre蛋白質及びVCre蛋白質との間の反応特異性（交差反応の有無）に関して検討した。
上記のSCre蛋白質のコドンユーセージをマウスやヒトの哺乳類型に変更し、かつ遺伝子中から発現抑制に関与すると考えられているCpG配列を除いたものを人工遺伝子（配列番号１）として合成し、更に、SCre蛋白質のN末端部分に核移行シグナル（MVPKKKRK）及び抗体認識用ＦＬＡＧタグ（DYKDDDK）を付加し、ヒトHEK293細胞で発現するプロモーター（CAGプロモーター）の下に挿入した。同様にしてCre蛋白質及びVCre蛋白質を夫々発現するプラスミドを作成した。
一方、SloxP部位、loxP部位、及びVloxP部位を夫々認識配列として検定するためのプラスミドとして、これらの配列を約１ｋｂｐの塩基配列の両端に配置したプラスミドを作製した。以上の各部位特異的組換え酵素蛋白質を発現する上記のプラスミドと夫々２個の各認識配列を含む検定用のプラスミドを同時にヒトHEK293細胞へFugene6を用いて形質転換し、１日後に細胞からDNAを回収し、夫々の認識配列の外側に位置するプラ イマーでPCRを行なった。この結果、その結果、SCreとSloxPのみで（矢印のように）明確な短いバンドが検出でき、SCre蛋白質は、Cre/loxP系又は Vcre/VloxP系のいずれの部位特異的組換え系とも交差反応を起こさないことが確認された（図１２）。
更に、検定用のプラスミドDNAを形質転換した大腸菌から抽出し、電気泳動によりサイズを比較した結果、SCreを作用させた場合（レーン２）では、作用させない場合（レーン１）と比べて検定用プラスミドのサイズが予想通り小さくなったことが確認された（図１３）。
次に、SloxP部位及びSlox2272部位を認識配列として検定するためのプラスミドとして、Bsd （ブラストサイジンS不活化酵素）、EGFP（変異型ＧＦＰ）及び Cm（クロラムフェニコールアセチルトランセフェラーゼ）の各遺伝子を各２か所のSloxP部位及びSlox2272部位で挟むようなに配置した検定用のプラスミドを作製した（図１４）。SCre蛋白質を発現する上記のプラスミドとこの検定用のプラスミドを同時にヒトHEK293細胞へFugene6を用いて形質転換し、１日後に細胞からDNAを抽出した。検定用のプラスミドDNAを大腸菌に形質転換することにより回収し、電気泳動によりサイズを比較した（図１５）。レーン１は検定用のプラスミドのみを形質転換した場合、レーン２～４は夫々、独立した大腸菌コロニーから精製したプラスミドを用いた結果を示している。図１５から、SCre蛋白質によって、SloxP部位同士及びSlox2272部位同士では部位特異的組み換えが起こるが、SloxP部位及びSlox2272部位の間では部位特異的組み換えが起こらないことが明らかとなった。
　尚、SloxP, SloxC2, Slox2272, loxP, 及びVloxPの塩基配列を比較したものを図１６に示す。ここで、比較した２つの塩基配列の間で同じ塩基は下線で示し、又、相補的になっていない塩基はボールド（太い字体）で示した。
更に、VCre/VloxP系に関する追加の実験を行った。
まず、予測した組み換え部位をプロモーターとEGFPの遺伝子の間に２カ所配置したプラスミドを作製した（図１７）。この組み換え部位の間にはストップコドンとポリA付加部位があり、VloxP部位で組み換えが起きると、ストップカセットがぬけてEGFPが発現する。これを用いて、実施例１と同様に、ヒトHEK293細胞に導入して、１日後の細胞からDNAを回収して、組み換えが起こっているかどうかを調べた。
回収したDNAを大腸菌に形質転換した後、コロニーからプラスミドを精製して元のプラスミドと大きさを比較した（図１８）。この結果、VloxP部位で組み換わって、サイズが小さくなっているのがわかる。更にこのプラスミドのVloxP付近をシーケンスで調べてみると、VloxPの部分で組み換えが行われていることが確認できた。更に、予想通りにVCre依存的にEGFPの発現が観察された（図１９）。
Cre/loxP系は、色々な変異部位があることで利便性が向上している。そこで、今回の VCre/VloxPシステムでも更に変異型の認識配列を同定することを試みた。loxP部位の有用な変異部位の一つにlox2272がある。この変異部位はコアの８塩基の２ヶ所に変異が導入されており、lox2272同士では組み換えが起きるが、loxPとlox2272の間では組み換えは起きないことが知られている。lox2272で塩基を置換している部分は偶然にもloxPとVloxPでは共通している。そこでこのように変化させたものをVlox2272（配列番号１３）と名付けて変異部位として使用できるかどうかを確認した。
即ち、この部分にVlox2272部位を２ヶ所もつ検定用のプラスミド（図２０）を作製し、実施例１と同様にVCreで反応をさせてみるとVloxP同士、Vlox2272同士は組み換えを起こし、このようなタイプは検出されるが、VloxPとVlox2272が組み換わるものは検出されないことがわかった（図２１）。この結果から、Vlox2272はlox2272と同様のことができる変異部位であることが明らかになった。
 
更に、lox66/lox71タイプの変異部位を同定することを試みた。このタイプの変異部位は向かい合った認識部位で反転するが、一度反転すると２重の変異部位ができてしまい、再度反転する効率は著しく下がることが知られている。外側の５塩基がランダムな配列になるようにしたオリゴを用いて、ランダムライブラリーから望ましい変異部位を下記のようにスクリーニングした。外側の５塩基にランダム塩基を含んだ認識部位の間にカナマイシン抵抗性遺伝子を逆向きに配置し、VCre発現プラスミドと同時に実施例１と同様に細胞に導入した後に、プラスミドを回収して大腸菌に形質転換して、カナマイシン抵抗性遺伝子が反転してGSTと融合し、カナマイシン抵抗性を示すプラスミドを選択した。得られたプラスミドのシーケンスを行い配列を確認した。次に、再度反転しにくいクローンを選ぶために、こうして選択したカナマイシン抵抗性プラスミドを何個か混ぜてもう一度VCre発現プラスミドと同時に導入した。再度反転したものはカナマイシン感受性になるため、このようにしてスクリーニングしたクローンをシーケンスして反転しにくい配列を選んだ。
その結果、２つの変異部位Vlox43R（配列番号１４）及びVlox43 L（配列番号１５）が選択された。これらが反転することを確認するために、EGFPとDsRedのカセットの両端に変異部位を配置した（図２２）。この部分のカセットが反転すると発現がEGFPからDsRedに換わることが期待される。VCre発現プラスミドとVlox43Lと Vlox43Rを含む検定用のプラスミドを実施例１と同様に同時にHEK293細胞に発現させた。図２２に示すパネルaとb、cとdは同視野の写真であり、検定用のプラスミドがＶCreと同時に導入された細胞はEGFPからDsRedに発現が変わっていることが明確に示されている。
同様に、SloxP部位に関してもlox66/lox71タイプの変異部位を同定した。SloxPの場合は、 Vlox43L及びVlox43Rの時のようなスクリーニングを行わずlox66とlox71の配列に導入されている塩基置換と似た変異を導入した。反転することを確認するために、EGFPとDsRedのカセットの両端に変異サイトを配置した（図２３）。この部分のカセットが反転すると発現がEGFPからDsRedに換わることが期待される。SCre発現プラスミドとSloxV1R（配列番号１６）及びSloxV1L（配列番号１７）を含む検定用のプラスミドを実施例１と同様に同時にHEK293細胞に発現させた。図２３に示すパネルaとb、cとdは同視野の写真であり、検定用のプラスミドがSCreと同時に導入された細胞はEGFPからDsRedに発現が変わっていることが明確に示されている。
以上のVCre/VloxP系及びSCre/SloxP系における変異部位（下線が変異箇所を示す）の代表例の塩基配列を以下の表１に示す。又、VCre及びSCre蛋白質の間のアミノ酸配列の比較を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
更に、ＥＳ細胞のゲノム上に導入したVloxPサイトは組み換えを起こすことができるかを調べた（図２４）。loxPサイトとlox2272サイトを用いたＲＭＣＥ法でLin28発現マウスES細胞の片側の染色体のＣ末端のEGFPタグをDsRedタグと交換した。蛍光顕微鏡によって、細胞内のEGFPの分布（Ｂ，b,e）及びDsRedの分布（Ｂ，c,f）を示した（スケールバー１０μm）。更にもう片側の染色体のLin28遺伝子のエクソン３をVloxPサイト挟んだES細胞を作製した (C)。エレクトロポレーション法でVCre発現プラスミドを導入し、シングルコロニー化したＥＳ細胞をＰＣＲで検定した。ＰＣＲ分析（Ｄ）、サザンハイブリダイゼーション（Ｅ）及びイムノブロット（Ｆ）の結果から、VloxPで挟まれた部分が欠損され、断片が短くなっていることと、その結果として 内在性のLin28蛋白質が消失したことがわかる。
更に、大腸菌でもVCre/VloxPとSCre/SloxPが使用できるかどうかを確認し、変異タンパク質の効率を測定した。更に、BAC改変にも利用できるかどうかを調べた。
heat shockで誘導ができ、３２度でプラスミドが維持できるが３７度でプラスミドが不安定になりプラスミドを除去できるpSIMシステムのプラスミドにVCreとSCreを導入し、発現をさせた。VCreとSCre のDNAは各菌のプラスミドのオリジナルなものではなく、実施例１及び実施例３で作製したマウスとヒトのコドン使用頻度に最適化したDNAを用いた。BACや高コピーのプラスミドと共存できるように、ori１０１のオリジンを使用した。このプラスミドは温度感受性のオリジンであり、熱ショックにより除去することができる。また、温度感受性のcI857のリプレッサーにより制御されており、４２度で発現誘導がかかる。
図２５で示すように、カナマイシン抵抗性のプラスミド上にアンピシリン抵抗性の遺伝子をVloxPサイトではさみ、同じプラスミド上でクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子の両端にloxPサイトを挟んだプラスミドを４２℃で１５分間の誘導後にエレクトロポレーション法で形質転換し、２時間のインキュベート後に各薬剤耐性のプレートにまき、翌日コロニーの増殖の有無を調べた。さらに、確認するためにカナマイシンプレートのコロニーをランダムに１００個選び、アンピシリンとクロラムフェニコールのプレートで育てた。
その結果、アンピシリンのプレートではVCreを発現させた大腸菌は生えてこないが、Cmではすべて生えてくることから、VloxPサイトでは組み換えが起こるがloxPサイトでは全く組み換えが起こらなかったが確認された（図２６）。又、VCreではほぼ９９％組み換えが起こったプラスミドのシーケンスを確認してみると、同じ向きに並べた２個のVloxP間で期待通りに正確に組み換えが起こっていることが明らかになった。一方、VCre等の組み換え酵素を発現しない空ベクターでは全く組み換えが起こらなかった。このように、ＢＡＣ等を含めたプラスミドで部位特異的な組み換えを起こさせる便利なプラスミドを作製した。
SCreも同様に大腸菌内で活性を示すことが明らかになった（図２７）。今回は１３ベースのインバーティッドリピートをパーファクトマッチに戻したSloxM1を用いた。９９％は組み換わっていた。シーケンスでも確認ができた。
CreとSCreとCreのアミノ酸配列を比較してみると、３０％程度しか相同性がないにも関わらず、Creで活性中心と考えられているアミノ酸は良く一致していた（図２８）。３次元予測の結果もCreの構造と一致していた。そこで、VCre酵素もCreと同様のアミノ酸を用いて活性中心を作り出しているかどうかを調べるために、VCreの変異の効果を調べた。
Flpの変異実験の結果から認識サイトのDNAにニックを入れ、ニックの部位でDNAとタンパク質の結合が起こるが、その後の組み換えの反応が起こらない変異が知られている。Cre, VCre, SCreの相同性は非常に低いが一部分で似ている部分が存在するのであるが、Flpの上記の変異の部位はこの相同領域に存在する。そこで、Creから推定される活性中心のチロシン残基とFlpから推定されるヒスチジン残基の変異がVCreでも同様の効果があるかを知るためにH314LとY349Fの変異を導入し、組み換えの活性を調べた。H314LとY349FともにVloxPで組み換えを起こす活性は見いだせなかった（図２９）。Creから推定された活性中心の変異（Y349F）と Flpから推定された認識サイトでニックを入れDNAと共有結合したまま離れない変異（H314L）がVCreでも同様の変異体であることが明らかになった。以上のことから、Creと構造的にも良く似た酵素であることが明らかになった。
loxPの変異と同様の効果があるVloxPとSloxPサイトの変異を見出している。その中の一つのVlox2272はVlox2272同士では組み換えが起きるが、Vlox2272とVloxPとの間では組み換えが起きない。このことを利用して、RMCE法をできるかどうかを確認してみた。
VCre発現大腸菌にpVloxP-Bsn-VloxP-Vlox2272-Cm-Vlox2272のプラスミドとVloxP-amp-Vlox2272のカセットを形質転換した結果（図３０）、amp耐性の大腸菌が得られた。得られたプラスミドをシングルサイトであるSnaBIで切断後、電気泳動を行った（図３１）。シーケンスの結果から正しく組み変っていることがわかった。その結果、RMCE法でカセットは導入できることが明らかになった。更に精製VCre蛋白質を用いても組み換えが起こることが明らかになった。このように、大腸菌の中でＲＭＣＥ法により、プラスミドとカセットのVloxP間の組み換えが起こり、カセット導入が可能であることが明らかになった。
VloxPとVlox2272が２ヶ所あることから、6816bp, 6029bp, 5707bp、4920bpとなる可能性があるが、シーケンスの結果よりすべて小さいタイプであることが確認された。このことは例え最初に内側のVloxPサイトやVlox2272サイトに挿入されたとしても、２回目のVloxP同士やVlox2272同士の組み換えが起こり、最終的には最も短い形になるものと思われる。大腸菌のヒートショックのこの系はタンパク質の誘導とオリ１０１の不安定化が同時に起こるので、一過的にVCreタンパク質が誘導されて、タンパク質の一回のターンオーバーと大腸菌の分裂によるタンパク濃度の希釈される短い時間の間に複数回の部位特異的な組み換えが起こるのだと考えられる。
次にBACの改変には制限酵素サイトを用いないＲｅｄ組み換えシステムをしばしば使用するが、導入した薬剤カセットを除去する用途のためにVCre/VloxPシステムを使用できることを確認した。　
pBACe3.6は非常によく使われるBACであるがloxPサイトとlox511サイトをベクター内に持っている。NanogはiPS化の指標として用いられる遺伝子であり、Nanogプロモーターの制御下でマーカー蛋白質や薬剤耐性マーカーを発現させて、iPS化のマーカーとして使用する用途がある。このことからヒトゲノムDNAを含むBACを改変して、Nanogの開始ATGの直下にピューロマイシン抵抗性遺伝子をRed組み換えを用いて改変した後に、Red組み換えのために使用したBsd薬剤耐性カセットをVCre/VloxPを取り除くことにした（図３２）。得られたBACクローンを図３２のＰＣＲプライマー（Ｆ，Ｒ）で増幅した結果、VloxPで挟まれたBsd薬剤選択マーカー遺伝子部分が除かれていることがわかる（図３３）。BACをRed組み換え法を用いて改変するためは薬剤選択マーカー遺伝子部分が必要であるが、細胞やマウス受精卵に導入する時には、薬剤選択マーカー遺伝子部分が邪魔する可能性があるので、取り除く必要が生じる。このように不要となった薬剤選択マーカー遺伝子部分を取り除くために、VCre/VloxPシステムは有効であることが示された。
　本発明に係る部位特異的組換え酵素及び該酵素認識配列から成る部位特異的組換えシステムを、既に知られているCre/loxP及び Flp/FRTシステムと組み合わせることにより、様々な実験を行うことができる。例えば、幅広い生物種の培養細胞およびマウスES細胞やヒトiPS細胞でVCre/VloxP又はSCre/SloxPシステムで利用することができる。
本発明の上記システムの応用例として、既に記載した例のほかに、更に、例えば、図３４～３８に示されるような以下の例を挙げることが出来る。例えば、図３７において示されるように、人工染色体を作製する時に分解用の部位としてSloxP部位を数十カ所導入しておく。また、興味ある遺伝子を人工染色体へ導入部位として使用するために、Cre/loxPの系のlox66/lox71に相当する変異部位を図のようにNeoとPuro遺伝子の直前に VloxP 又はSloxPの変異部位を入れた交換用のプラスミドに導入しておく。これらのことによりVCre又はSCre依存的に興味ある遺伝子を人工染色体に導入することができる。また、人工染色体が不要になった場合には、VCre又はSCre蛋白質を発現させることにより人工染色体を分解、除去するシステムを構築することができる。尚、組み換え酵素依存的に人工染色体を消失させる系は、これらの部位特異的組換え酵素以外の他の組み換え酵素システムでも可能であるので、特にVCre/VloxP及びSCre/SloxPに限定されるものではない。
本発明は大腸菌を含む産業上有用な微生物の染色体DNAの改変に用いられるだけでなく、大腸菌内で維持されるBACクローンの改変に用いることができる。コドンユーセージを大腸菌型に換えることで効率が上がることは、当事者であれば容易に想像できる。更に、コファクターの存在が必要ないことは本明細書の実施例から証明されているので、大腸菌で本発明のVCre蛋白質を発現させ、試験管内で組み換えを起こすことは可能である。
iPSから導入したiPS化因子の遺伝子を特異的に除去することが可能となる。更に、病態モデル動物にも使用することができる。ヒトおよびマウスの人工染色体上の改変や遺伝子導入にも用いることができる。
更に、本発明において、VCreとSCreの活性中心やＤＮＡ認識ドメインはCre蛋白質と同じであり、同じ機構を使用していることが明らかになった。このことからCreで得られている多くの実験結果がVCreやSCreにも使用できるであろう。特にCreの構造解析でえられた、Creのどのアミノ酸が認識サイトのDNA配列と直接相互作用を及ぼすかが分かっているので、その部分のアミノ酸がVCreとSCreのではどのように変化しているかという知見と、認識サイトはどのように変わっているかの知見を検討することは非常に有益であろう。

Claims (25)

  1. 以下のポリペプチドから成る部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチド：
    （１）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
    （２）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
    （３）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
    （４）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。
  2. 以下の塩基配列を含むポリヌクレオチド：
    （１）配列番号１又は配列番号７で示される塩基配列；
    （２）塩基配列（１）と相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイズする塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；又は、
    （３）塩基配列（１）と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
  3. 合成ポリヌクレオチドである、請求１又は２記載のポリヌクレオチド。
  4. 請求項１ないし３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  5. 請求項４記載のベクターによって形質転換された細胞。
  6. 幹細胞である、請求項５記載の細胞。
  7. 請求項１ないし３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが染色体に導入された、ヒト以外のトランスジェニック動物。
  8. 齧歯類である、請求項７記載のトランスジェニック動物。
  9. 以下のポリペプチドから成る部位特異的組換え酵素：
    （１）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
    （２）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
    （３）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
    （４）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。
  10. 組換え型酵素である、請求項９記載の部位特異的組換え酵素。
  11. 請求項９又は１０記載の部位特異的組換え酵素を特異的に認識する抗体。
  12. 請求項９又は１０記載の部位特異的組換え酵素によって認識される配列であって、以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （１）配列番号３～５、９～１１、又は１３～１８のいずれかに示される塩基配列；又は
    （２）塩基配列（１）において一個又は数個の塩基が欠失、置換又は挿入された塩基配列。
  13. 請求項１２記載の２つのオリゴヌクレオチドの間に標的ＤＮＡ領域を含むベクター。
  14. 請求項１３記載のベクターによって形質転換された細胞。
  15. 幹細胞である、請求項１４記載の細胞。
  16. 染色体の標的ＤＮＡ領域を挟むように請求項１２記載の２つのオリゴヌクレオチドが導入された、ヒト以外のターゲッティング動物。
  17. 齧歯類である、請求項１６記載のターゲッティング動物。
  18. 請求項７又は８記載のトランスジェニック動物、請求項１６又は１７記載のターゲッティング動物の交配によって作製された条件付ノックイン又はノックアウト実験動物。
  19. 齧歯類である、請求項１８記載の条件付ノックイン又はノックアウト動物。
  20. 標的ＤＮＡ領域を含むヌクレオチド配列において部位特異的組換え方法であって、
    （１）標的ＤＮＡ領域を挟むように請求項１２記載の塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを該ヌクレオチド配列に導入し、
    （２）該標的ＤＮＡ領域を請求項９記載の部位特異的組換え酵素と接触させて、該オリゴヌクレオチド部位において部位特異的組換えを生起させる、ことから成る前記方法。
  21. 請求項４記載のベクター及び請求項１３記載のベクターが導入された形質転換細胞において生起する、請求項２０記載の部位特異的組換え方法。
  22. 請求項１８又は１９記載の条件付ノックアウト又は実験動物において行なわれる、請求項２１記載の部位特異的組換え方法。
  23. 標的ＤＮＡ領域が蛋白質又はその一部をコードする、請求項２１又は２２記載の部位特異的組換え方法。
  24. 部位特異的な標的ＤＮＡ領域の欠損、置換、又は逆向きが起こる、請求項２１ないし２３のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法。
  25. 請求項２１ないし２４のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法を行なうための部位特異的組換え用キットであって、
    （１）請求項９記載の部位特異的組換え酵素又は該酵素をコードするポリヌクレオチド、
    （２）請求項１２記載のオリゴヌクレオチド、を含む該キット。
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