WO2010136716A1 - Panel de genes pour le pronostic du cancer de la prostate - Google Patents

Panel de genes pour le pronostic du cancer de la prostate Download PDF

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WO2010136716A1
WO2010136716A1 PCT/FR2010/051004 FR2010051004W WO2010136716A1 WO 2010136716 A1 WO2010136716 A1 WO 2010136716A1 FR 2010051004 W FR2010051004 W FR 2010051004W WO 2010136716 A1 WO2010136716 A1 WO 2010136716A1
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WO
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genes
expression
level
prostate cancer
microfluidic plate
Prior art date
Application number
PCT/FR2010/051004
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Inventor
Yves-Jean Bignon
Dominique Bernard-Gallon
Nadège RABIAU
Yann Dantal
Christophe Haug
Original Assignee
Universite D'auvergne Clermont I
Centre Jean Perrin Centre De Lutte Contre Le Cancer De La Région Auvergne
Soluscience
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic plate for the diagnosis and / or prognosis of prostate cancer, as well as a method of diagnosis and / or prognosis of prostate cancer based on the use of such a plaque. More particularly, the microfluidic plate according to the invention makes it possible to analyze the level of expression of the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes. by RT-qPCR.
  • Prostate cancer is the most common cancer in men over 50, and is the second leading cause of cancer death in men in the developed world.
  • PSA prostate specific antigen
  • PSA Prostatic infections or inflammations, prostate trauma, benign prostatic hyperplasia, etc.
  • PSA is not a specific marker for prostate adenocarcinoma, it has a low predictive value in the early diagnosis of prostate cancer.
  • a microfluidic TaqMan ® plate having low density of the primers to determine the expression of the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EphB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 was built.
  • this microfluidic plate allows a reliable, reproducible and simple prognosis of the aggressiveness of a prostate cancer.
  • a first aspect of the invention relates to a microfluidic plate characterized in that it contains means for detecting the level of expression, in a biological sample, of at least eleven, twelve, thirteen, fourteen or fifteen genes selected from BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes .
  • BRCA1 is meant here the gene encoding the protein called “Breast cancer type 1 susceptibility protein”. This gene codes in particular for TARNm whose reference in the sequence library of the National Center for Biotechnology Information (hereinafter called NCBI bank) is: NM_007294 (PRI 26-APR-2009).
  • BRCA2 is meant here the gene encoding the protein called “Breast cancer type 2 susceptibility protein”. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_000059.3 (PRI 26-APR-2009).
  • AR is meant here the gene encoding the protein called "androgen receptor” in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_00101 1645.1 (PRI 26-APR-2009).
  • IGF1 insulin-like growth factor 1
  • mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_001 11 1283.1 (PRI 26-APR-2009).
  • EPHB2 is meant here the gene encoding the protein called "EPH receptor B2" in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_017449.3 (PRI 10-APR-2009).
  • AMACR is meant here the gene encoding the protein called "alpha-methylacyl-CoA racemase” in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_203382.1 (PRI 22-FEB-2009).
  • ESR1 is meant here the gene encoding the protein called "estrogen receptor 1" in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_001 122742.1 (PRI 26-APR-2009).
  • ESR2 is meant here the gene encoding the protein called "estrogen receptor 2" in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_001040275.1 (PRI 26-APR-2009).
  • BCL2 is meant here the gene encoding the protein called Bcl2 or "oncogene B-cell leukemia 2" in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_000633.2 (PRI 26-APR-2009).
  • RNASEL is meant here the gene encoding the protein called “2 ', 5'-oligoisoadenylate synthetase-dependent ribonuclease L” in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_021133.2 (PRI 29-MAR-2009).
  • MUC1 is meant here the gene encoding the protein called “cell surface associated Mucin 1" in English. This gene is also known as hCG1996357.
  • IL18 is meant here the gene encoding the protein called “interleukin 18” in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the bank
  • NCBI is: NM_001562.2 (PRI 26-APR-2009).
  • COL4A3 is meant here the gene encoding the protein called “alpha 3 type IV collagen” in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_031362.2 (PRI 14-MAR-2009).
  • GSTP1 is meant here the gene encoding the so-called protein
  • Glutathione S-transferase pi in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_000852.2 (PRI 13-JUL-2008).
  • RASSF1 is meant here the gene encoding the protein called “Ras association (RalGDS / AF-6) domain family member 1" in English. This gene codes in particular for the mRNA whose reference in the NCBI bank is: NM_170713.2 (PRI 26-APR-2009).
  • the means for detecting the level of expression of these genes makes it possible to detect the transcript presented in the references in the NCBI library mentioned above, and / or splicing variants of such transcripts, and / or the proteins encoded by these transcribed.
  • the microfluidic plate according to the invention contains means for detecting the level of expression of the following eleven genes: AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 .
  • the microfluidic plate according to the invention contains means for detecting the level of expression of the fifteen following genes: BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1.
  • the microfluidic plate according to the invention also contains means for detecting the level of expression of a calibration gene.
  • calibration gene is meant a gene that is neither overexpressed nor under expressed in prostate cancer.
  • Calibration genes commonly used by those skilled in the art include, for example, the gene coding for 18s ribosomal RNA (reference in the NCBI library: X03205.1, PRI 16-DEC-1994), actin (reference in the NCBI library: NM_001 101, PRI 03-AUG-2008) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (reference in NCBI bank: NM_002046, PRI 22-MAR-2009).
  • a particularly preferred embodiment relates to a microfluidic plate which contains means for detecting the level of expression of the genes consisting of BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1, RASSF1 and a calibration gene (e.g., mRNAs).
  • a calibration gene e.g., mRNAs
  • Means for detecting the level of gene expression are well known to those skilled in the art.
  • the expression of a gene can either be detected at the level of the protein encoded by the gene, or at the level of the RNAs transcribed from the gene.
  • Means for detecting the level of gene expression therefore include, for example, antibodies and oligonucleotides such as probes and / or primers.
  • the means for detecting the level of gene expression are preferably oligonucleotides for polymerase chain amplification (PCR or PCR), and more particularly oligonucleotides for chain amplification by quantitative polymerization in real time. (RT-qPCR).
  • PCR or PCR polymerase chain amplification
  • RT-qPCR oligonucleotides for chain amplification by quantitative polymerization in real time.
  • each of the wells of the microfluidic plate according to the invention contains a sense primer, an antisense primer, and a fluorescent probe ("TaqMan probe", "FRET probe” , "Beacon Probe”, etc.).
  • the means for detecting the level of gene expression are preferably oligonucleotides for carrying out RT-qPCR by the Taqman technique.
  • each well of the microfluidic plate according to the invention contains a sense primer, an antisense primer, and a fluorescent probe called "Taqman probe”. Suitable oligonucleotides can readily be selected and constructed by those skilled in the art depending on the technique chosen for performing RT-qPCR.
  • microfluidic plate any plate suitable for use in a high-throughput platform to perform chemical and / or biological reactions such as RT-qPCR.
  • Said microfluidic plate is preferably a low density TaqMan ® card ("TLDA").
  • TLDA low density TaqMan ® card
  • Such a plate contains 384 wells.
  • the TDLA card marketed by Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA) under the reference No. 4346798 is particularly suitable for the present invention since this plate makes it possible to analyze the expression of genes as well as that of a calibration gene. , for eight samples analyzed in parallel.
  • the means for detecting the level of gene expression may, for example, be positioned as shown in FIG.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a microfluidic plate according to the invention for the prognosis and / or diagnosis of prostate cancer.
  • Prognosis refers to the evaluation of the aggressiveness of the cancer and / or the survival time of the patient.
  • Diagnosis means the determination that an individual is suffering from cancer.
  • the invention also relates to the use of means for detecting the level of expression of genes as defined in the above paragraph for the prognosis and / or in vitro diagnosis of prostate cancer.
  • the microfluidic plate according to the invention is particularly useful for evaluating whether a prostate cancer is aggressive or not.
  • Aggressive cancers for which the survival time is low, are defined as cancers whose Gleason score is greater than or equal to 7.
  • the aggressiveness of the cancer can be defined by its grade, which indicates the degree of dedifferentiation cancer cells, or by the TNM classification, which indicates the anatomical extension of a cancer.
  • the present invention makes it possible to determine the aggressiveness of prostate cancers in a simple and rapid manner using a transcriptomic approach.
  • prostate cancer may be prostatic adenocarcinoma, prostatic sarcoma, prostatic squamous cell carcinoma, ductal carcinoma of the prostate, or intraepithelial prostatic neoplasia.
  • Prostate cancer is preferentially a prostatic adenocarcinoma, which is the most common prostate cancer.
  • the invention relates to an in vitro method for prognosis and / or diagnosis of prostate cancer comprising the following steps:
  • step (b) The results obtained in step (b) can then be correlated with the aggressiveness of the prostate cancer from which the patient suffers, thus making it possible to establish the prognosis and / or diagnosis of said patient.
  • the expression level of at least eleven, twelve, thirteen, fourteen or fifteen genes selected from the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18 genes. , COL4A3, GSTP1 and RASSF1 is analyzed.
  • these genes include the following eleven genes: AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1.
  • the level of expression of the fifteen BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes is analyzed.
  • the biological sample of a patient suffering from, or likely to suffer from, prostate cancer corresponds to or contains prostate cells. These can be taken during a biopsy or obtained from a biological fluid (eg blood) that has been treated to enrich it with prostate cells.
  • the biological sample corresponds to a cRNA preparation prepared from prostate cells.
  • the reference sample is a negative control indicative of the level of expression of these genes in a healthy individual. It may for example correspond to a pool of healthy prostatic RNA, such as that marketed by Ozyme (Saint-Quentin-en-Yvelines, France) under the reference No. 636550.
  • This method is preferably implemented using a platform high speed, such as that shown in Figure 2.
  • This method may further comprise a step (c) which consists in determining whether, in the patient, the genes whose level of expression is detected by means of the microfluidic plate according to the invention are overexpressed or under expressed with respect to the reference sample. The results obtained in step (c) can then be correlated with the aggressiveness of the prostate cancer from which the patient suffers, thus making it possible to establish the prognosis and / or the diagnosis of said patient.
  • the method may also include the steps of:
  • RASSF1 are overexpressed compared to the reference sample.
  • the AR gene is under expressed relative to the reference sample; (e) sum the scores obtained for each of the genes in order to obtain an overall score.
  • the overall score is calculated with a binary score of 0 or 1 for each of the genes.
  • the weight of the assigned scores can be modified by weighting the scores to give more importance to some of the genes.
  • the method When the method is implemented with fifteen genes and the scores attributed to the genes are binary (0 or 1), the overall score ranges from 0 to 15. In order to compare it to the Gleason score (ranging from 0 to 10) it may be recalculated on a scale of 0 to 10. As a result, the method according to the invention may further comprise a step (f) of calculating a weighted overall score (ie a score on a scale of 0 to 10). This weighted overall score can for example be obtained by using the following formula:
  • X m ⁇ n indicates the minimum overall score
  • X max indicates the maximum overall score
  • X m a x G indicates the maximum Gleason score (in this case 10)
  • X m ⁇ nG indicates the score
  • the overall score and weighted overall score indicate whether the patient has prostate cancer, and / or the degree of aggressiveness of prostate cancer. If these scores are high, the cancer is aggressive. Conversely, if they are weak, the cancer is not very aggressive. Thus, a weighted overall score greater than or equal to 2 indicates that said patient is probably suffering from prostate cancer. A weighted overall score greater than or equal to 7 indicates that the patient is probably suffering from aggressive prostate cancer.
  • the methods according to the invention aim to predict the aggressiveness of a prostate cancer.
  • the methods according to the invention aim to determine whether a patient is likely to suffer from an aggressive prostate cancer, that is to say a cancer whose Gleason score is greater than or equal to 7. .
  • the invention relates to any in vitro method for prognosis and / or diagnosis of prostate cancer comprising the step of (a) determining the level of expression in a biological sample of a patient suffering from, or susceptible to at least eleven, twelve, thirteen, fourteen or fifteen genes selected from the BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL and MUC1 genes, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1.
  • these genes include the following eleven genes: AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1.
  • the expression level of all fifteen BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 genes is determined.
  • This method may further comprise a step (b) of comparing the level of expression of each of these genes with the level of expression determined in a reference sample.
  • step (a) or (b) above can then be correlated with the aggressiveness of the prostate cancer from which the patient suffers, thus making it possible to establish the prognosis and / or diagnosis of said patient.
  • the level of expression of the genes is preferably determined by quantitation of the mRNAs transcribed from these genes, for example by RT-qPCR or by hybridization with nucleic probes. Alternatively, the level of expression is determined by quantifying the protein translated from the gene with antibodies.
  • the methods of the invention can be used not only to determine whether an individual is suffering from prostate cancer and / or to estimate aggressiveness.
  • prostate cancer but also to establish the treatment regimen ("treatment regimen") of a patient, to adjust the treatment regimen of a patient, to monitor the progression of prostate cancer, and / or to follow the response of a patient to a given treatment ("drug monitoring").
  • the methods according to the invention may therefore comprise an additional step of establishing and / or adjusting the treatment scheme of a patient. Indeed, if the cancer is aggressive, the doctor will opt for an aggressive treatment, for example a chemotherapy combining several medicinal principles. On the other hand, if the cancer is not aggressive, it will be able to opt for a less heavy treatment producing less side effects in the patient.
  • the treatment scheme of a patient can therefore be established and / or adjusted according to the overall score obtained in step (e).
  • the method according to the invention is repeated at least twice on samples. taken from the same patient at different times. For example, samples can be taken and analyzed every month or every six months or so.
  • samples can be taken and analyzed every month or every six months or so.
  • Figure 1 shows a microfluidic plate according to the invention, in this case a TaqMan ® low density map (“TLDA”), which comprises 384 wells. Each number designates a gene whose expression is detected by virtue of the oligonucleotides present in the well.
  • TLDA TaqMan ® low density map
  • FIG. 1 shows a high-throughput platform suitable for the diagnostic method and / or prognosis according to the invention.
  • 1 Computer with acquisition and analysis software.
  • 2 Barcode shower for plate identification.
  • 3 Analysis apparatus by RT-qPCR.
  • 4 Plate loading arms. 5.
  • Barcode reader. 6 High speed platform robot.
  • Example 1 Diagnostic Protocol and prostate cancer prognosis using a microfluidic plate according to the invention
  • the microfluidic TaqMan ® plates at low density referred to as "TLDA” for "TaqMan Low Density Array ®” are boards having 384 wells and allowing 384 simultaneous real-time quantitative PCR reactions (RT-qPCR), without the use of filling robots or multichannel pipettes to fill them. Such a plate allows the simultaneous analysis of eight samples.
  • TLDA taqMan Low Density Array ®
  • RT-qPCR real-time quantitative PCR
  • Figure 1 shows a diagram of this microfluidic plate, called "Oncodiag plate”.
  • This plate contains oligonucleotides allowing the analysis of sixteen genes (fifteen diagnostic / prognostic genes and a calibration gene) by RT-qPCR.
  • the fifteen diagnostic / prognostic genes whose expression is detected by the microfluidic plate according to the invention are known to be genes that are either overexpressed or expressed in cancers.
  • BRCA1, BRCA2, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 and RASSF1 are known to be overexpressed in cancers, and the AR gene is known to be under expressed in cancers.
  • RNA pool of 32 healthy prostates in this case, an RNA pool of 32 healthy prostates, reference No. 636550, Ozyme, Saint -Quentin-en-Yvelines, France.
  • a score of 1 is assigned if the difference in expression observed for the sample to be tested relative to the reference sample is that found during cancers. For example, if IGF1 is overexpressed in the test sample relative to the reference sample, a value of 1 is assigned for IGF1. Conversely, if IGF1 is under expressed in the test sample relative to the reference sample, a value of 0 is assigned for IGF1. In the case of RA, a score of 1 is assigned if this gene is under-expressed in the test sample relative to the reference sample, and otherwise a score of 1 is assigned.
  • This score is between 0 and 15 and is correlated with the degree of aggressiveness of prostate cancer.
  • the above protocol has been implemented for cDNA samples from twenty-two different patients.
  • the Oncodiag score was compared to the Gleason score.
  • the Gleason score which is determined by pathology, is an arbitrary score established during examination of slide tissue. It corresponds to the sum of the evaluation of the degree of malignancy (ranging from 0 to 5) on two samples.
  • the microfluidic plate according to the invention allows an effective diagnosis and prognosis of cancers of aggressive prostate.
  • Example 3 The Advantages of Microfluidic Plates and Methods According to the Invention
  • the use of microfluidic plate in RT-qPCR is a recent and innovative technique.
  • the technical advantages are numerous because this technique is reliable, reproducible, easy to use and easily achievable. It is also less expensive than the use of biochips.
  • the possibility of using a high-speed platform offers the possibility of a routine analysis. Reliability is ensured in the continuity of the information system thanks to a system of barcode reader.
  • TLDA plates are numerous. TDLA technology is sensitive and reproducible for the study of gene expression. In addition, this new technique has been shown to produce results comparable to those obtained by the conventional RT-qPCR method. The essential advantage of this type of plate comes from the possibility of simultaneously studying the expression of several genes from the same sample, which moreover makes it possible to achieve savings in terms of costs and materials.
  • This technique is a new approach to the sensitivity and study of transcriptomic profiles. Thus, in less than three days, it is possible to obtain an Oncodiag score illustrating the degree of aggressiveness of the patient's prostate cancer after transcriptomic study of the gene panel using the Oncodiag plate.

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Abstract

La présente invention concerne une plaque microfluidique permettant le diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate, ainsi qu'une méthode de diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate basée sur l'utilisation d'une telle plaque. Plus particulièrement, la plaque microfluidique selon l'invention permet d'analyser le niveau d'expression des gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 par RT-qPCR.

Description

PANEL DE GENES
POUR LE PRONOSTIC DU CANCER DE LA PROSTATE
La présente invention concerne une plaque microfluidique permettant le diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate, ainsi qu'une méthode de diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate basée sur l'utilisation d'une telle plaque. Plus particulièrement, la plaque microfluidique selon l'invention permet d'analyser le niveau d'expression des gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 par RT-qPCR.
Le cancer de la prostate est le plus fréquent des cancers de l'homme de plus de 50 ans, et représente la deuxième cause de décès par cancer chez l'homme dans le monde développé.
La méthode de diagnostic du cancer de la prostate la plus utilisée actuellement est le dosage du PSA (« prostate spécifie antigen ») sanguin. Cependant, le taux de PSA dans le sang peut s'élever au cours de pathologies de la prostate autres que les cancers
(infections ou inflammations prostatiques, traumatismes de la prostate, hyperplasie bénigne de la prostate, etc.). De plus, le PSA n'étant pas un marqueur spécifique des adénocarcinomes prostatiques, il a une faible valeur prédictive dans le diagnostic précoce des cancers de la prostate.
Par conséquent, il existe un besoin en méthodes pour diagnostiquer et/ou établir un pronostic du cancer de la prostate. Plus particulièrement, il serait souhaitable de disposer d'une technique permettant d'établir rapidement un diagnostic fiable, tout en évaluant l'agressivité du cancer de la prostate.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Une plaque microfluidique TaqMan® à basse densité comportant des amorces permettant de déterminer l'expression des gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 a été construite.
Les inventeurs ont trouvé que cette plaque microfluidique permettait un pronostic fiable, reproductible et simple de l'agressivité d'un cancer de la prostate.
1. Plaques microfluidiques selon l'invention Un premier aspect de l'invention concerne une plaque microfluidique caractérisée en ce qu'elle contient des moyens pour détecter le niveau d'expression, dans un échantillon biologique, d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1.
Par « BRCA1 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « Breast cancer type 1 susceptibility protein » en anglais. Ce gène code notamment pour TARNm dont la référence dans la banque de séquences du National Center for Biotechnology Information (dénommé ci après banque NCBI) est : NM_007294 (PRI 26-APR-2009).
Par « BRCA2 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « Breast cancer type 2 susceptibility protein » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_000059.3 (PRI 26-APR-2009).
Par « AR », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « androgen receptor » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_00101 1645.1 (PRI 26-APR-2009).
Par « IGF1 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « insulin- like growth factor 1 » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001 11 1283.1 (PRI 26-APR-2009).
Par « EPHB2 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « EPH receptor B2 » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_017449.3 (PRI 10-APR-2009). Par « AMACR », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « alpha- methylacyl-CoA racemase » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_203382.1 (PRI 22-FEB-2009).
Par « ESR1 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « estrogen receptor 1 » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001 122742.1 (PRI 26-APR-2009).
Par « ESR2 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « estrogen receptor 2 » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001040275.1 (PRI 26-APR-2009).
Par « BCL2 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée Bcl2 ou « oncogene B-cell leukemia 2 » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_000633.2 (PRI 26-APR-2009).
Par « RNASEL », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « 2', 5'- oligoisoadenylate synthetase-dependent ribonuclease L » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_021133.2 (PRI 29-MAR-2009). Par « MUC1 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « cell surface associated Mucin 1 » en anglais. Ce gène est également connu sous le nom hCG1996357.
Par « IL18 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « interleukin 18 » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque
NCBI est : NM_001562.2 (PRI 26-APR-2009).
Par « COL4A3 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « alpha 3 type IV collagen » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_031362.2 (PRI 14-MAR-2009). Par « GSTP1 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée
« glutathione S-transferase pi » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_000852.2 (PRI 13-JUL-2008).
Par « RASSF1 », on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée « Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1 » en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_170713.2 (PRI 26-APR-2009).
Les moyens pour détecter le niveau d'expression de ces gènes permettent de détecter le transcrit présenté dans les références dans la banque NCBI mentionnés ci- dessus, et/ou des variants d'épissage de tels transcrits, et/ou les protéines codées par ces transcrits.
La référence de ces gènes dans différentes bases de données est présentée dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Figure imgf000005_0001
Dans un mode de réalisation préféré, la plaque microfluidique selon l'invention contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des onze gènes suivants : AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la plaque microfluidique selon l'invention contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des quinze gènes suivants : BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1.
Préférentiellement, la plaque microfluidique selon l'invention contient en outre des moyens pour détecter le niveau d'expression d'un gène de calibration. Par « gène de calibration », on entend un gène qui est ni surexprimé, ni sous exprimé, dans un cancer de la prostate. Des gènes de calibration couramment utilisés par l'homme du métier incluent, par exemple, le gène codant pour l'ARN ribosomique 18s (référence dans la banque NCBI: X03205.1 , PRI 16-DEC-1994), actine (référence dans la banque NCBI: NM_001 101 , PRI 03-AUG-2008) et la glyceraldehyde-3-phosphate déhydrogénase (référence dans la banque NCBI: NM_002046, PRI 22-MAR-2009).
Un mode de réalisation particulièrement préféré porte sur une plaque microfluidique qui contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des gènes consistant en BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 , RASSF1 et un gène de calibration (par exemple l'ARNMδs).
Des moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont bien connus de l'homme de l'art. L'expression d'un gène peut soit être détectée au niveau de la protéine codée par le gène, soit au niveau des ARN transcrits à partir du gène. Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes incluent donc, par exemple, des anticorps et des oligonucléotides tels que des sondes et/ou des amorces.
Dans le cadre de la présente invention, les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont préférentiellement des oligonucléotides pour amplification en chaîne par polymérisation (ACP ou PCR), et plus particulièrement des oligonucléotides pour amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR). Une telle amplification par RT-qPCR peut être réalisée par plusieurs techniques différentes, incluant la technique SYBR Green et les techniques utilisant des sondes fluorescentes (techniques dites « TaqMan », « FRET », « Beacon », etc.). Dans le cas d'une détection basée sur l'utilisation de sondes fluorescentes, chacun des puits de la plaque microfluidique selon l'invention contient une amorce sens, une amorce antisens, et une sonde fluorescente (« sonde TaqMan », « sonde FRET », « sonde Beacon », etc.). Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont préférentiellement des oligonucléotides pour la réalisation d'une RT-qPCR par la technique Taqman. Dans ce cas, chacun des puits de la plaque microfluidique selon l'invention contient une amorce sens, une amorce antisens, et une sonde fluorescente dite « sonde Taqman ». Les oligonucléotides appropriés peuvent aisément être choisis et construits par l'homme du métier en fonction de la technique choisie pour réaliser la RT-qPCR. Alternativement, des oligonucléotides appropriés et/ou des plaques microfluidiques contenant des oligonucléotides appropriés peuvent être commandés auprès de fournisseurs tels que Applied Biosystem (Carlsbad, Californie, USA). Par « plaque microfluidique », on entend ici toute plaque convenant à être utilisée dans une plateforme à haut débit pour réaliser des réactions chimiques et/ou biologiques telles que des RT-qPCR.
Ladite plaque microfluidique est préférentiellement une carte TaqMan® à basse densité (« TLDA »). Une telle plaque contient 384 puits. La carte TDLA commercialisée par Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA) sous la référence n°4346798 convient tout particulièrement à la présente invention puisque cette plaque permet l'analyse de l'expression de 15 gènes ainsi que celle d'un gène de calibration, et ce pour huit échantillons analysés en parallèle. Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes peuvent par exemple être positionnés comme montré sur la Figure 1.
2. Méthodes de pronostic et/ou diagnostic selon l'invention Un autre aspect de l'invention porte sur l'utilisation d'une plaque microfluidique selon l'invention pour le pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate. Par « pronostic », on entend l'évaluation de l'agressivité du cancer et/ou de la durée de survie du patient. Par « diagnostic », on entend la détermination qu'un individu souffre d'un cancer. L'invention porte également sur l'utilisation de moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes tels que définis dans le paragraphe ci-dessus pour le pronostic et/ou diagnostic in vitro du cancer de la prostate.
La plaque microfluidique selon l'invention est particulièrement utile pour évaluer si un cancer de la prostate est agressif ou non. Les cancers agressifs, pour lesquels la durée de survie est faible, sont définis comme des cancers dont le score de Gleason est supérieur ou égal à 7. Alternativement, l'agressivité du cancer peut être définie par son grade, lequel indique le degré de dédifférenciation des cellules cancéreuses, ou par la classification TNM, laquelle indique l'extension anatomique d'un cancer. La présente invention permet de déterminer l'agressivité des cancers de la prostate de manière simple et rapide grâce à une approche transcriptomique. Le cancer de la prostate peut par exemple être un adénocarcinome prostatique, un sarcome prostatique, un carcinome squameux prostatique, un carcinome ductal de la prostate ou une néoplasie intra-épithéliale de prostate. Le cancer de la prostate est préférentiellement un adénocarcinome prostatique, lequel est le cancer de la prostate le plus courant.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant les étapes suivantes :
(a) mettre une plaque microfluidique selon l'invention en contact avec :
(i) au moins un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate ; et
(ii) au moins un échantillon de référence ;
(b) réaliser une amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR).
Les résultats obtenus à l'étape (b) peuvent ensuite être corrélés avec l'agressivité du cancer de la prostate dont souffre le patient, permettant ainsi d'établir le pronostic et/ou le diagnostic dudit patient.
Dans cette méthode, le niveau d'expression d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est analysé. De préférence, ces gènes incluent les onze gènes suivants : AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Dans un mode de réalisation préféré, le niveau d'expression des quinze gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est analysé. L'échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate correspond ou contient des cellules prostatiques. Celles-ci peuvent être prélevées lors d'une biopsie ou être obtenues à partir d'un fluide biologique (par exemple du sang) ayant subi un traitement visant à l'enrichir en cellules prostatiques. Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique correspond à une préparation d'ARNc préparé à partir des cellules prostatiques.
L'échantillon de référence est un contrôle négatif indicatif du niveau d'expression de ces gènes chez un individu sain. Il peut par exemple correspondre à un pool d'ARN de prostates saines, tel que celui commercialisé par Ozyme (Saint-Quentin-en-Yvelines, France) sous la référence n° 636550. Cette méthode est préférentiellement mise en œuvre en utilisant une plateforme de haut débit, telle que celle représentée sur la Figure 2. Cette méthode peut en outre comporter une étape (c) qui consiste à déterminer si, chez le patient, les gènes dont le niveau d'expression est détecté grâce à la plaque microfluidique selon l'invention sont surexprimés ou sous exprimés par rapport à l'échantillon de référence. Les résultats obtenus à l'étape (c) peuvent ensuite être corrélés avec l'agressivité du cancer de la prostate dont souffre le patient, permettant ainsi d'établir le pronostic et/ou le diagnostic dudit patient.
Afin de corréler les résultats de l'étape (c) avec l'agressivité du cancer de la prostate dont souffre le patient, la méthode peut également comporter les étapes de :
(d) pour chacun des gènes, attribuer un score de 1 si : (i) chez le patient, les gènes BRCA1 , BRCA2, IGF1 , EPHB2, AMACR,
ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et
RASSF1 sont surexprimés par rapport à l'échantillon de référence ; et
(ii) chez le patient, le gène AR est sous exprimé par rapport à l'échantillon de référence ; (e) faire la somme des scores obtenus pour chacun des gènes afin d'obtenir un score global.
Dans la méthode ci-dessus, le score global est calculé avec un score binaire de 0 ou de 1 pour chacun des gènes. Cependant, le poids des scores attribués peut être modifié en pondérant les scores afin de d'accorder plus d'importance à certains des gènes. Par ailleurs, il est envisageable n'attribuer un score de 1 que si la différence de niveau d'expression entre l'échantillon du patient et l'échantillon de référence est statistiquement significative.
Lorsque la méthode est mise en œuvre avec quinze gènes et que les scores attribués aux gènes sont binaires (0 ou 1 ), le score global va de 0 à 15. Afin de pouvoir le comparer au score de Gleason (allant de 0 à 10), il peut être recalculé sur une échelle de 0 à 10. De ce fait, la méthode selon l'invention peut en outre comporter une étape (f) de calcul d'un score global pondéré (i.e. un score sur une échelle de 0 à 10). Ce score global pondéré peut par exemple être obtenu en utilisant la formule suivante :
(score global -Xmm)
X (XmaxG-XmmG)
('^max"'^mιn) où Xmιn indique le score global minimun, Xmax indique le score global maximum, XmaxG indique le score de Gleason maximum (en l'occurrence 10) et XmιnG indique le score de Gleason mnimum (en l'occurrence 0).Par exemple, pour un score global de 9 obtenu lorsque la méthode est mise en œuvre avec quinze gènes et que les scores attribués aux gènes sont binaires (0 ou 1 ), le score global pondéré sera de 6 : (9 "0) x (10-0) = 6.
(15-0) Le score global et le score global pondéré indiquent si le patient souffre d'un cancer de la prostate, et/ou le degré d'agressivité du cancer de la prostate. Si ces scores sont élevés, le cancer est agressif. A l'inverse, s'ils sont faibles le cancer est peu agressif. Ainsi, un score global pondéré supérieur ou égal à 2 indique que ledit patient souffre probablement d'un cancer de la prostate. Un score global pondéré supérieur ou égal à 7 indique que le patient souffre probablement d'un cancer de la prostate agressif.
Dans un mode de réalisation préféré, les méthodes selon l'invention visent à pronostiquer l'agressivité d'un cancer de la prostate. En particulier, les méthodes selon l'invention visent à déterminer si un patient est susceptible de souffrir d'un cancer de la prostate agressif, c'est-à-dire d'un cancer dont le score de Gleason est supérieur ou égal à 7.
Plus généralement, l'invention concerne toute méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant l'étape (a) de déterminer le niveau d'expression, dans un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate, d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. De préférence, ces gènes incluent les onze gènes suivants : AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le niveau d'expression de l'ensemble des quinze gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est déterminé.
Cette méthode peut en outre comprendre une étape (b) de comparer le niveau d'expression de chacun de ces gènes avec le niveau d'expression déterminé dans un échantillon de référence.
Les résultats obtenus à l'étape (a) ou (b) ci-dessus peuvent ensuite être corrélés avec l'agressivité du cancer de la prostate dont souffre le patient, permettant ainsi d'établir le pronostic et/ou le diagnostic dudit patient
Le niveau d'expression des gènes est de préférence déterminé par quantification des ARNm transcrits à partir de ces gènes, par exemple par RT-qPCR ou par hybridation à des sondes nucléiques. Alternativement, le niveau d'expression est déterminé par quantification de la protéine traduite à partir du gène grâce à des anticorps.
Les méthodes selon l'invention peuvent être utilisées non seulement pour déterminer si un individu souffre d'un cancer de la prostate et/ou pour estimer l'agressivité du cancer de la prostate, mais aussi pour établir le schéma de traitement (« treatment regimen ») d'un patient, pour ajuster le schéma de traitement d'un patient, pour suivre la progression d'un cancer de la prostate, et/ou pour suivre la réponse d'un patient à un traitement donné (« drug monitoring »). Les méthodes selon l'invention peuvent donc comporter une étape supplémentaire d'établir et/ou ajuster le schéma de traitement d'un patient. En effet, si le cancer est agressif, le médecin va opter pour un traitement agressif, par exemple une chimiothérapie associant plusieurs principes médicamenteux. En revanche, si le cancer n'est pas agressif, il pourra opter pour un traitement moins lourd produisant moins d'effets secondaires chez le patient. Le schéma de traitement d'un patient peut donc être établi et/ou ajusté en fonction du score global obtenu à l'étape (e).
Lors de l'ajustement d'un schéma de traitement, du suivi de la progression d'un cancer et/ou du suivi de la réponse d'un patient, la méthode selon l'invention est répétée à au moins deux reprises sur des échantillons prélevés d'un même patient à différents moments. Des échantillons peuvent par exemple être prélevés et analysés tous les mois, ou tous les six mois environ. Lors du suivi de la réponse d'un patient, un échantillon est d'abord prélevé avant le début du traitement, et un ou plusieurs échantillons sont prélevés après le début de traitement.
Tous les articles, revues, demandes de brevet, brevets et manuels mentionnés ici sont incorporées par référence au texte de la présente demande.
Bien qu'ayant des significations distinctes, les termes « comprenant », « contenant », « comportant » et « consistant en » ont été utilisés de manière interchangeable dans la description de l'invention, et peuvent être remplacés l'un par l'autre.
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
LEGENDES DES FIGURES
La Figure 1 représente une plaque microfluidique selon l'invention, en l'occurrence une carte TaqMan® à basse densité (« TLDA »), laquelle comporte 384 puits. Chaque numéro désigne un gène dont l'expression est détectée grâce aux oligonucléotides présents dans le puits. 1 : BRCA1 ; 2 : BRCA2; 3 : AR; ctl : gène de calibration (ARNr
18s); 4 : IGF1 ; 5 : EPHB2; 6 : ESR1 ; 7 : ESR2; 8 : AMACR; 9 : BCL2; 10 : RNASEL; 1 1 :
MUC1 ; 12 : IL18; 13 : COL4A3; 14 : GSTP1 ; 15 : RASSF1. Les emplacements destinés au chargement des échantillons sont représentés par des accolades. La Figure 2 représente une plateforme à haut débit convenant à la méthode de diagnostic et/ou pronostic selon l'invention. 1 : Ordinateur avec logiciels d'acquisition et d'analyse. 2 : Douchette à code barres pour identification des plaques. 3: Appareil d'analyse par RT-qPCR. 4: Bras de chargement des plaques. 5. Lecteur de code barres. 6: Robot pour plateforme à haut débit.
EXEMPLES
Exemple 1 : Protocole de diagnostic et de pronostic du cancer de la prostate en utilisant une plaque microfluidique selon l'invention Les plaques microfluidiques TaqMan® à basse densité, dénommées « TLDA » pour « TaqMan® Low Density Array », sont des cartes comportant 384 puits et permettant 384 réactions simultanées de PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR), sans utilisation de robots de remplissage ou de pipettes multicanaux pour les remplir. Une telle plaque permet l'analyse simultanée de huit échantillons. Une plaque microfluidique TDLA selon l'invention a été fabriquée par Applied
Biosystem (Carlsbad, California, USA). La Figure 1 montre un schéma de cette plaque microfluidique, dénommée « plaque Oncodiag ». Cette plaque comporte des oligonucléotides permettant l'analyse de seize gènes (quinze gènes de diagnostic/pronostic et un gène de calibration) par RT-qPCR. Les quinze gènes de diagnostic/pronostic dont l'expression est détectée par la plaque microfluidique selon l'invention sont connus comme étant des gènes soit surexprimés, soit sous exprimés, dans les cancers. Ainsi, BRCA1 , BRCA2, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 sont connus comme étant surexprimés dans les cancers, et le gène AR est connu comme étant sous exprimé dans les cancers.
Huit échantillons peuvent être chargés et analysés simultanément grâce à cette plaque. Une fois les échantillons chargés sur la plaque, une RT-qPCR est mise en œuvre en utilisant une plateforme de haut débit telle que celle représentée sur la Figure 2. La plaque Oncodiag permet ainsi d'estimer la sous expression ou la surexpression des gènes par rapport à un échantillon de référence (en l'occurrence, un pool d'ARN de 32 prostates saines, référence n° 636550, Ozyme, Saint -Quentin-en-Yvelines, France).
Plus précisément, 100 ng d'ADNc issu d'ARN de prostate, à 2 ng/μL, et 50 μL de « Mix TaqMan® Universel » sont chargés dans chaque cupule de la plaque. Un échantillon de référence est étudié en parallèle des échantillons à tester. Un ensemble de cycles de PCR est ensuite lancé afin d'étudier et d'évaluer la sous expression ou surexpression des gènes de diagnostic/pronostic grâce au logiciel d'analyse RQmanager. Les résultats de la RT-qPCR sont obtenus à partir des logiciels de la plateforme de haut débit. Pour chaque échantillon à tester, la sous expression ou la surexpression des gènes de diagnostic/pronostic, par rapport à l'échantillon de référence, est calculée et fournie par le logiciel RQManager. Les données sont exportables sous Excel. Ainsi en passant les données en LOG, la référence étant évaluée à zéro, si la valeur est positive, il y a surexpression du gène et inversement si la valeur est négative, le gène est sous exprimé par rapport à la référence.
Pour chacun des gènes, on attribue un score de 1 si la différence d'expression observée pour l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence est celle qui est retrouvée lors de cancers. Par exemple, si IGF1 est surexprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, on attribue une valeur de 1 pour IGF1 . Inversement, si IGF1 est sous exprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, on attribue une valeur de 0 pour IGF1. Dans le cas de RA, on attribue un score de 1 si ce gène est sous exprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, et sinon on attribue un score de 1.
En additionnant les scores obtenus pour chacun des quinze gènes, un score global est obtenu. Ce score est compris entre 0 et 15 et est corrélé avec le degré d'agressivité du cancer de la prostate.
Exemple 2: Résultats
Le protocole ci-dessus a été mis en œuvre pour des échantillons d'ADNc provenant de vingt-deux patients différents. Afin de valider la méthode selon l'invention, le score Oncodiag a été comparé au score de Gleason. Le score de Gleason, qui est déterminé par anatomo-pathologie, est un score arbitraire établi durant l'examen des tissus sur lames. Il correspond à la somme de l'évaluation du degré de malignité (allant de 0 à 5) sur deux prélèvements.
Les résultats obtenus pour le patient 1 sont présentés dans le tableau 2 ci- dessous. Les scores Oncodiag et de Gleason déterminés pour chacun des soixante treize patients étudiés sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 2
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Tableau 3
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Une bonne corrélation entre le score Oncodiag et le score de Gleason est observée. Plus particulièrement, quasiment tous les cancers dont le score de Gleason est supérieur ou égal à 7 présentent également un score Oncodiag supérieur ou égal à 7. De ce fait, la plaque microfluidique selon l'invention permet un diagnostic et un pronostic efficace des cancers de la prostate agressifs.
Exemple 3 : Les avantages des plaques microfluidiques et méthodes selon l'invention L'utilisation de plaque microfluidique en RT-qPCR est une technique récente et novatrice. Les avantages techniques sont nombreux car cette technique est fiable, reproductible, simple d'utilisation et facilement réalisable. Elle est également moins coûteuse que l'utilisation de biopuces. De plus, la possibilité d'utiliser une plateforme haut débit (appareil robotisé) offre la possibilité d'une analyse de routine. La fiabilité est assurée dans la continuité du système d'information grâce à un système de lecteur de code barres.
Les avantages des plaques TLDA sont nombreux. La technologie TDLA est sensible et reproductible pour l'étude de l'expression des gènes. De plus, il a été démontré que cette nouvelle technique permet de produire des résultats comparables à ceux obtenus par la méthode conventionnelle de RT-qPCR. L'avantage essentiel de ce type de plaque provient de la possibilité d'étudier simultanément l'expression de plusieurs gènes issus d'un même échantillon, ce qui permet qui plus est de réaliser des économies en termes de coûts et de matériaux. Cette technique constitue une nouvelle approche de la sensibilité et de l'étude des profils transcriptomiques. Ainsi, en moins de trois jours, il est possible d'obtenir un score Oncodiag illustrant le degré d'agressivité du cancer de la prostate du patient après étude transcriptomique du panel de gènes grâce à la plaque Oncodiag.

Claims

REVENDICATIONS
1. Plaque microfluidique caractérisée en ce qu'elle contient des moyens pour détecter le niveau d'expression, dans un échantillon biologique, d'au moins onze gènes choisis parmi les gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1.
2. Plaque microfluidique selon la revendication 1 , où ladite plaque microfluidique contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des gènes AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1.
3. Plaque microfluidique selon la revendication 2, où ladite plaque microfluidique contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2, AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1.
4. Plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où ladite plaque microfluidique contient en outre des moyens pour détecter le niveau d'expression d'un gène de calibration.
5. Plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où lesdits moyens pour détecter le niveau d'expression d'un gène sont des oligonucléotides pour amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR).
6. Plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où ladite plaque microfluidique est une carte TaqMan à basse densité (TLDA).
7. Utilisation de moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour le pronostic et/ou diagnostic in vitro du cancer de la prostate.
8. Utilisation d'une plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour le pronostic et/ou diagnostic in vitro du cancer de la prostate.
9. Méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant les étapes suivantes : (a) mettre une plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en contact avec :
(i) au moins un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate ; et (ii) au moins un échantillon de référence ;
(b) réaliser une amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR) ; et, de manière optionnelle,
(c) déterminer si, chez le patient, les gènes tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 3 sont surexprimés ou sous exprimés par rapport à l'échantillon de référence.
10. Méthode selon la revendication 9, comprenant en outre les étapes de:
(d) pour chacun des gènes tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 3, attribuer un score de 1 si : (i) chez le patient, les gènes BRCA1 , BRCA2, IGF1 , EPHB2, AMACR,
ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 sont surexprimés par rapport à l'échantillon de référence ; (ii) chez le patient, le gène AR est sous exprimé par rapport à l'échantillon de référence ; et (e) faire la somme des scores obtenus pour chacun des gènes afin d'obtenir un score global.
11. Méthode selon la revendication 10, où ledit score global est converti en un score global pondéré calculé sur une échelle de 0 à 10.
12. Méthode selon la revendication 1 1 , où un score global pondéré supérieur ou égal à 2 indique que ledit patient souffre probablement d'un cancer de la prostate.
13. Méthode selon la revendication 1 1 , où un score global pondéré supérieur ou égal à 7 indique que le patient souffre probablement d'un cancer de la prostate agressif.
14. Méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant les étapes suivantes : (a) déterminer le niveau d'expression, dans un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate, d'au moins onze gènes choisis parmi les gènes BRCA1 , BRCA2, AR, IGF1 , EPHB2,
AMACR, ESR1 , ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1 , IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 ; et, de manière optionnelle,
(b) comparer le niveau d'expression mesuré à l'étape (a) avec le niveau d'expression mesuré dans un échantillon de référence.
15. Méthode selon la revendication 14, où le niveau d'expression des gènesrminé par quantification des ARNm par RT-qPCR.
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