WO2010127559A1 - 一种细胞核移植方法 - Google Patents

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WO2010127559A1
WO2010127559A1 PCT/CN2010/000631 CN2010000631W WO2010127559A1 WO 2010127559 A1 WO2010127559 A1 WO 2010127559A1 CN 2010000631 W CN2010000631 W CN 2010000631W WO 2010127559 A1 WO2010127559 A1 WO 2010127559A1
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oocyte
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oocytes
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nucleus
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杜玉涛
王俊
汪建
杨焕明
林琳
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BGI Shenzhen Co Ltd
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BGI Shenzhen Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos

Definitions

  • the present invention relates to the field of embryology, and in particular to a method of nuclear transfer. Background technique
  • “Clone” is an English “clone” transliteration, which refers to the offspring of an animal that can be parthenogenetically propagated. The genetic composition of all cloned offspring is identical, also known as the asexual reproduction cell line.
  • Animal cloning refers to the process of obtaining the same genetically homologous offspring from an animal without sexual reproduction, including parthenogenetic reproduction, identical twins, embryo division, and nuclear transfer. At present, animal cloning is mainly obtained by nuclear transfer and embryo division, and normally develops into a new individual with the same genetic material.
  • Nuclear transfer is a method of micromanipulation, electrofusion, etc., to reconstitute a nuclear donor at a certain stage of development, such as embryonic cells or somatic cells, and nuclear receptors at corresponding developmental stages, such as enucleated pronuclear embryos. Or mature oocytes. Through the embryo transfer of reconstructed embryos, a bioengineering technique for mass production of genetically homogenous mammals is achieved.
  • the enucleation step in the process of nuclear transfer is performed by microscopically taking a microneedle with a microneedle, or by a blade resection method.
  • This operation step is not only cumbersome, but also needs to be performed manually, which may easily lead to operational errors, and cannot be very Good to ensure cell nuclear transfer The success rate of planting.
  • the object of the present invention is to provide a nuclear transfer which is easy to operate and can quickly and accurately remove nuclei without using a micromanipulator mechanical method or a blade excision method to remove a receptor oocyte nuclei without using the micromanipulator mechanical method or the blade excision method. method.
  • the method of the present invention, the method of the invention, the method of the present invention 5 ⁇ 26 ⁇ ,, preferably, 0. 5 - 26 hours, more preferably 0. 05 - 20 ug / ml, more preferably 0. 1 - 10 ug / ml of the denucleating agent for 10 minutes to 48 hours, preferably 20 minutes to 30 hours, more preferably 0. 5 ⁇ 26 hours, More preferably, it is 0.5 to 20 hours, preferably 5 to 10 hours, to obtain a cytoplast.
  • the invention also relates to a method of nuclear transfer, comprising the following steps
  • A constructing an oocyte or obtaining or providing an oocyte
  • oocyte is treated for 10 minutes to 48 hours, preferably 20 minutes to 30 hours, more preferably 0.5 to 26 hours, more preferably 0.5 to 20 hours, preferably 5 to 10 hours, to obtain a cytoplast;
  • the oocyte is preferably a mature oocyte.
  • the oocyte can be from a mammal, such as a scorpion animal or a livestock animal or a human.
  • the oocyte is not a human oocyte (ie, from a non-human mammal).
  • the obtained oocyte may be obtained by collecting mature mammalian oocytes in vivo or by in vitro maturation after being extracted from an isolated ovary.
  • the in vitro maturation of oocytes is well known to those of ordinary skill in the art, and for example, mature oocytes can be obtained in vitro according to the method described in CN101313072A (published on Nov. 26, 2008).
  • the oocyte is an oocyte to which a zona pellucida is attached, or an oocyte to which a zona pellucida is attached.
  • the oocyte is an oocyte that is opaque.
  • the concentration of the enucleating agent is 0.1 to 10 ug/ml, and the time for processing the oocyte is 0. 5 to 20 hours.
  • the final concentration of the denuclear reagent is 0. 001-100 ug/ml, preferably 0, in the step of the method of the present invention.
  • the appropriate temperature for the treatment, contact or placement can be determined by one skilled in the art, and the temperature can be from room temperature to 39 degrees Celsius, such as room temperature - 37 degrees Celsius or 37-39 degrees Celsius.
  • the enucleating agent can be an agent capable of functional enucleation/inactivation of oocytes.
  • the enucleating agent can be an agent that inactivates the oocyte, rendering it incapable of RNA transcription and synthesis of the protein.
  • the enucleating agent can be an anti-tumor drug or an analog thereof.
  • the enucleating agent may be actinomycin, doxorubicin, daunorubicin, pucamycin, phleomycin, muscimol and dichlorobenzimidazole furan riboside One or several of them (such as two, three, or four).
  • a preferred enucleating agent is actinomycin, doxorubicin, daunorubicin, or phosfomycin or a combination of one or more thereof.
  • the oocyte is derived from a mammal.
  • the mammal is a pig.
  • the donor cell or the donor cell or the donor cell nucleus may be derived from an autologous cell or a stem cell.
  • the donor cell or donor cell or donor cell nucleus may be from a mammal, such as an experimental animal or a livestock animal.
  • the donor cell or donor cell or donor cell nucleus is not human, e.g., from a non-human mammal.
  • the present invention removes the nucleus of an oocyte by inactivating an oocyte by using an enucleating reagent, making it impossible to perform RNA transcription and synthesizing a protein, and replacing the step of mechanically removing the oocyte nucleus in the prior art nuclear transfer technique. , simplifies the operation of this step, and can be widely applied to nuclear transfer operations of various species.
  • the invention also provides a composition for removing a cell nucleus of a cell comprising an enucleating agent.
  • the enucleating agent may be capable of functional enucleation or inactivation of oocytes Reagents.
  • the enucleating agent can be an agent that inactivates the oocyte, rendering it incapable of RNA transcription and protein synthesis.
  • the enucleating agent can be an anti-tumor drug or an analog thereof.
  • the enucleating agent may be actinomycin, doxorubicin, daunorubicin, pucamycin, phleomycin, muscimol and dichlorobenzimidazole furan riboside One or several of them (such as two, three, or four).
  • the cells are preferably oocytes, in particular mature oocytes.
  • the composition can be used to remove the nuclei of oocytes to provide enucleated oocytes for nuclear transfer or other uses.
  • the invention also relates to an agent capable of functionally enucleating or inactivating cells for removing the nucleus of a cell.
  • the invention further relates to the use of an agent capable of functional enucleation or inactivation of a cell in the preparation of an enucleating agent for removing the nucleus of a cell.
  • the invention also relates to the use of an agent capable of functional enucleation or inactivation of cells for removing the nucleus of a cell.
  • the cell is preferably an oocyte, in particular a mature oocyte.
  • the agent capable of functionally enucleating or inactivating the oocyte may be an agent that inactivates the oocyte and makes it impossible to perform RNA transcription and synthesis of a protein.
  • the agent can be an anti-tumor drug or an analog thereof.
  • the agent may be in the actinomycin, doxorubicin, daunorubicin, pucamycin, phleomycin, muscimol, and dichlorobenzimidazole furan riboside. One or several (such as two, three, or four).
  • FIG. 1 is a flow chart of a method for nuclear transfer of an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a typical photograph of the embryo obtained in the step (5) of Example 1-5 and the embryo obtained in the step (9) of Example 6-10, showing that the obtained embryo was well developed. detailed description
  • FIG. 1 The flow chart of the nuclear transfer method provided by the present invention is shown in FIG. 1 , and specifically includes the following steps:
  • the oocyte can be an oocyte of any species.
  • the oocyte can be obtained by collecting the mature mammalian oocyte by living body, or extracting it from the isolated ovary, and obtaining it by in vitro maturation.
  • the mammal is preferably a pig.
  • Eggs are collected from isolated ovaries, including the collection of ovaries, the collection of eggs, and the maturation of eggs.
  • the reagent for removing the nucleus of the recipient egg cell in the present invention includes, in addition to the reagents listed in the following examples, an inactivated egg All alternative reagents for mother cells, including most anti-tumor drugs, such as Doxorubicin, Actinomycin A/D, daunorubicin, Pakamycin Pl icamyc in , mi thramycin , a -amani t in and dichlorobenzimidazole furan riboside ( 5 , 6-dichloro-l- ⁇ -Dr ibofuranosylbenz imidazole ⁇ 5 ⁇ 26 ⁇ , ⁇
  • the inoculation of the nucleus of the nucleus of the nucleus of the nucleus of the nucleus of the nucleus is 0.
  • the action time is 0. 5 ⁇ 26 hours, preferably 0. 1 ⁇ 10ug / ml, the action time is preferably 0. 5 ⁇ 20 hours.
  • the treatment temperature can be from room temperature to 39 degrees Celsius, such as room temperature - 37 degrees Celsius or 37-39 degrees Celsius.
  • Examples 1, 2, 3, 4, and 5 are for the need for a transparent belt
  • Examples 6, 7, 8, 9, and 10 are operations for performing nuclear transfer on oocytes that have gone to the zona pellucida.
  • the culture solution in the following examples was Porcine zygote medium - 3 (PZM-3).
  • composition of the fusion medium used in the following embodiment is: 0. 3 M mannitol, 0.01% polyvinyl alcohol.
  • composition of the activating liquid in the following examples is: 0.3 M mannitol, 0.01% polyvinyl alcohol,
  • the electrofusion parameters are set according to different experiments, and the cells after nuclear transplantation are fused (in this embodiment, the enucleated oocyte and the donor cell are fused under the electric shock of 2. OKV/cm). ), simulating calcium ion fluctuations when sperm enters the egg (in this case) In the example, this is achieved by activation with an electric shock of 0.85 KV/cm, so that the donor cells are fully integrated into the oocyte, and the electrogenerated embryos are transferred into the culture medium in a constant temperature incubator (38. 5 ), cultivating for 40 minutes;
  • Chemically treating the nuclear transfer recombinant embryo according to different experimental setting parameters (in the present embodiment, this is carried out by: placing the recombinant constructor in a medium containing 5 ug/ml cytochalasin and 10 ug/ml The mixture of the cytosine mixed culture solution for 4 hours to 6 hours) inhibits chromosome excretion, ensures the reconstructed embryo ploidy, and the treated recombinant embryo is placed in the culture medium at 38.5, 5% C0 2 incubator The culture was carried out for 5 days, and the development of the embryo was observed to be good.
  • the electrofusion parameters are set according to different actual conditions, and the cells after nuclear transplantation are fused (in this embodiment, both the enucleated oocyte and the donor cell are subjected to an electric shock of 2. OKV/cm. Fusion), simulating calcium ion fluctuations when sperm enters the egg (in this case) In the example, this is achieved by activation with an electric shock of 0.85 KV/cm, and the donor cells are fully integrated into the oocyte, and the electrogenerated embryos are transferred into the culture medium in a constant temperature incubator (38. 5 ⁇ ) , culture for 30 minutes;
  • Chemically treating the nuclear transfer recombinant embryo according to different experimental setting parameters (in the present embodiment, this is carried out by: placing the recombinant constructor in a medium containing 5 ug/ml cytochalasin and 10 ug/ml The mixture of the cytosine mixed culture solution for 4 hours to 6 hours) inhibits chromosome excretion, ensures the reconstructed embryo ploidy, and the treated recombinant embryo is placed in the culture solution at 38.5, 5% C0 2 incubator The medium was cultured for 7 days, and the development of the embryo was observed to be good.
  • the electrofusion parameters are set according to different experiments, and the cells after nuclear transplantation are fused (in this embodiment, the enucleated oocyte and the donor cell are fused under the electric shock of 2. OKV/cm). ), simulating calcium ion fluctuations when sperm enters the egg (in this case) In the example, this is achieved by activation with an electric shock of 0.85 KV/cm, so that the donor cells are fully integrated into the oocyte, and the electrogenerated embryos are transferred into the culture medium in a constant temperature incubator (38. 5 V), culture for 50 minutes;
  • the electrofusion parameters are set according to different experiments, and the cells after nuclear transplantation are fused (in this embodiment, the enucleated oocyte and the donor cell are fused under the electric shock of 2. OKV/cm). ), simulating calcium ion fluctuations when sperm enters the egg (in this case) In the example, this is achieved by activation with an electric shock of 0.85 KV/cm, and the donor cells are fully integrated into the oocyte, and the electrogenerated embryos are transferred into the culture medium in a constant temperature incubator (38. 5 ⁇ ) , culture for 30-60 minutes;
  • Chemically treating the nuclear transfer recombinant embryo according to different experimental setting parameters (in this embodiment, this is carried out by: placing the recombinant constructor in a medium containing 5 ug/ml cytochalasin and 10 ug/ml The mixture of the cytosine mixed culture solution for 4 hours to 6 hours) inhibits chromosome excretion, ensures the reconstructed embryo ploidy, and the treated recombinant embryo is placed in the culture solution at 38. 5 ⁇ €, 5% of C0 2 The culture was carried out for 5 days in the incubator, and the development of the embryos was observed to be good.
  • the electrofusion parameters are set according to different experiments, and the cells after nuclear transplantation are fused (in this embodiment, the enucleated oocyte and the donor cell are fused under the electric shock of 2. OKV/cm). ), simulating calcium ion fluctuations when sperm enters the egg (in this case) In the example, this is achieved by activation with an electric shock of 0.85 KV/cm), the donor cells are fully integrated into the oocyte, and the electrogenerated recombinant embryos are transferred into the culture medium in a constant temperature incubator (38.5), cultured. 60 minutes;
  • the oocyte from which the first polar body is removed is treated with the plant lectin to increase the surface viscosity, and a donor cell is bonded in the cell fusion instrument, and the two are fused under the electric shock of 2. OKV/cm. ;
  • the fused embryo was placed in an activating solution and activated by an electric shock of 0.85 KV/cm, that is, a calcium fluctuation when simulating sperm entry;
  • the reconstructed embryos were treated in a medium containing 5 ug/ml cytochalasin and lOug/ml cycloheximide for 4 hours to inhibit chromosome excretion and ensure the reconstructed embryo ploidy;
  • the oocyte from which the first polar body is removed is treated with the plant lectin to increase the surface viscosity, and a donor cell is bonded in the cell fusion instrument, and the two are fused under the electric shock of 2. OKV/cm. ;
  • the reconstructed embryos were treated in a medium containing 5 ug/ml cytochalasin and 10 ug/ml cycloheximide for 5 hours to inhibit chromosome excretion and ensure the reconstructed embryo ploidy;
  • the oocyte from which the first polar body is removed is treated with the plant lectin to increase the surface viscosity, and a donor cell is bonded in the cell fusion instrument, and the two are fused under the electric shock of 2. OKV/cm. ;
  • the reconstructed embryos were treated in a medium containing 5 ug/ml of cytochalasin and 10 ug/ml of cycloheximide for 4 hours to inhibit chromosome excretion and ensure the reconstructed embryo ploidy;
  • the oocyte from which the first polar body is removed is treated with the plant lectin to increase the surface viscosity, and a donor cell is bonded in the cell fusion instrument, and the two are fused under the electric shock of 2. OKV/cm. ;
  • the reconstructed embryos were treated in a medium containing 5 ug/ml of cytochalasin and 10 ug/ml of cycloheximide for 4 hours to inhibit chromosome excretion and ensure the reconstructed embryo ploidy;
  • the oocyte from which the first polar body is removed is treated with the plant lectin to increase the surface viscosity, and a donor cell is bonded in the cell fusion instrument, and the two are fused under the electric shock of 2. OKV/cm. ;
  • the reconstructed embryos were treated in a medium containing 5 ug/ml cytochalasin and 10 ug/ml cycloheximide for 4 hours to inhibit chromosome excretion and ensure the reconstructed embryo ploidy;
  • the present invention removes the nucleus of an oocyte by inactivating an oocyte by using a denucleating agent, and replaces the step of mechanically removing the nucleus of the oocyte in the prior art nuclear transfer technique, which simplifies the step.
  • the operation can be widely applied to nuclear transfer operations of various species.

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Description

一种细胞核移植方法 技术领域
本发明涉及胚胎学领域， 尤其涉及一种细胞核移植方法。 背景技术
"克隆" 是英文 "clone" 音译， 是指一个动物经无性繁殖可 孤雌生殖产生的后代，克隆的所有后代的遗传组成是完全相同的， 又称无性繁殖细胞系。
动物克隆是指由一个动物不经过有性生殖的方式而直接获得 与亲本具有相同遗传同质性后代的过程， 包括孤雌激活生殖、 同 卵双生、 胚胎分割以及核移植等。 目前动物克隆主要通过细胞核 移植及胚胎分割两种方法获得， 正常发育为具有相同遗传物质的 新个体。
核移植是通过显微操作， 电融合等实验室手段， 将发育一定 阶段的核供体， 如胚胎细胞或体细胞， 及相应发育阶段的核受体 进行体外重构， 如去核的原核胚或成熟卵母细胞。 通过重构胚的 胚胎移植，达到大量生产遗传同质哺乳动物的一种生物工程技术。 运用核移植方法， 成功的获得一只克隆动物， 需有效地完成下述 过程： 供体细胞的选择和处理、 受体卵母细胞的获得与处理、 在 显微操作仪下用显微操作针显微取核或用刀片切除法去核， 进行 注射细胞、 核质融合和卵母细胞激活、 重构胚的体外培养以及胚 胎移植和体内发育。
以上方案中， 细胞核移植过程中去核步骤采用了用显微操作 针显微取核， 或用刀片切除法去核， 这种操作步骤不仅繁瑣， 而 且需要手工进行， 容易导致操作失误， 不能很好的保证细胞核移 植的成功率。
因此， 现有技术还有待改进和提高 发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述缺点， 提供一种无需 采用显微操作仪机械法， 或刀片切除法去除受体卵母细胞细胞核 的， 易于操作、 且能快速准确去核的细胞核移植方法。
一方面， 本发明涉及将细胞（优选是卵母细胞， 特别是成熟 卵母细胞） 去核的方法， 包括： 将细胞和终浓度为 0. 001-100 ug/ml，优选 0. 01-50 ug/ml ,更优选 0. 05 - 20ug/ml，更优选 0. 1 - 10ug/ml的去核试剂接触 10分钟到 48小时， 优选 20分钟到 30 小时， 更优选 0. 5 ~ 26小时， 更优选 0. 5 ~ 20小时， 优选为 5 ~ 10小时， 获得细胞质体。
另一方面， 本发明还涉及一种细胞核移植方法， 包括以下步
A、 构建卵母细胞或者获得或提供卵母细胞；
B、 釆用浓度为 0. 001-100 ug/ml , 优选 0. 01-50 ug/ml , 更 优选 0. 05 ~ 20ug/ml， 更优选 0. 1 ~ l Oug/ml的去核试剂， 将所述 卵母细胞处理 10分钟到 48小时， 优选 20分钟到 30小时， 更优 选 0. 5 ~ 26小时， 更优选 0. 5 ~ 20小时， 优选为 5 ~ 10小时， 获 得细胞质体；
C、 构建（或者获得或提供）具有所需遗传特性的供体细胞或 供体细胞核， 将细胞质体与所述供体细胞或供体细胞核融合， 得 到重建的胚胎。
在本发明方法中， 所述卵母细胞优选是成熟卵母细胞。 卵母 细胞可以来自哺乳动物， 例如实猃动物或者家畜动物或者人。 在 一个实施方案中， 所述卵母细胞不是人的卵母细胞（即来自非人 哺乳动物） 。
在本发明所述的方法中， 所述获得卵母细胞可以是通过活体 采集成熟哺乳动物卵母细胞， 或从离体卵巢上抽出后， 经过体外 成熟获得。 卵母细胞体外成熟的培养过程是本领域普通技术人员 所熟知的， 例如可以按照 CN101313072A (公开日 2008年 11月 26 日 ） 中描述的方法获得体外培养成熟的卵母细胞。
在本发明所述的方法的一个实施方案中， 所述卵母细胞为需 透明带附着的卵母细胞， 或者有透明带附着的卵母细胞。
在本发明所述的方法的另一个实施方案中， 所述卵母细胞为 去透明带的卵母细胞。
在本发明所述的方法的一个实施方案中， 所述步骤 B或者去 核步骤中， 所述去核试剂的浓度为 0. l ~ 10ug/ml， 处理所述卵母 细胞的时间为 0. 5 ~ 20小时。
在本发明方法的一个实施方案中， 步骤 B或去核步骤可以如 下进行： 将所述卵母细胞和终浓度为 0. 001-100 ug/ml , 优选 0. 01-50 ug/ml , 更优选 0. 05 ~ 20ug/ml , 更优选 0. 1 - 10ug/ml 的去核试剂接触 10分钟到 48小时， 优选 20分钟到 30小时， 更 优选 0. 5 ~ 26小时， 更优选 0. 5 ~ 20小时， 优选为 5 ~ 10小时， 获得细胞质体。
在本发明方法的另一个实施方案中， 步骤 B或去核步骤可以 如下进行： 将所述卵母细胞和去核试剂混合， 去核试剂终浓度为 0. 001-100 ug/ml , 优选 0. 01-50 ug/ml， 更优选 0. 05 ~ 20ug/ml， 更优选 0. 1 ~ 10ug/ml , 放置 10分钟到 48小时， 优选 20分钟到 30小时，更优选 0. 5 ~ 26小时，更优选 0. 5 ~ 20小时，优选为 5 ~ 10小时， 获得细胞质体。 所述处理、 接触或放置的适当温度可以由本领域技术人员来 确定， 所述温度可以是室温到 39摄氏度， 如室温 - 37摄氏度或 37-39摄氏度。
在本发明所述的方法的一个实施方案中， 所述去核试剂可以 为能够功能性去核 /灭活卵母细胞的试剂。 在另一个实施方案中， 所述去核试剂可以是灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA转录和合 成蛋白的试剂。 在另一个实施方案中， 所述去核试剂可以是抗肿 瘤药物或其类似物。 在一个优选实施方案中， 所述去核试剂可以 是放线菌素、 阿霉素、 柔红霉素、 普卡霉素、 光辉霉素、 蝇蕈素 和二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷中的一种或几种 （如两种、 三种、 或四种） 。 优选的去核试剂是放线菌素、 阿霉素、 柔红霉素、 或 光辉霉素或者其一种或者几种的组合。
在本发明所述的方法的一个实施方案中， 所述卵母细胞来源 于哺乳动物。
在本发明所述的方法的一个实施方案中，所述哺乳动物是猪。 在本发明中， 所述供体细胞或供核细胞或供体细胞核可以来 自体细胞或干细胞。 所述供体细胞或供核细胞或供体细胞核可以 来自哺乳动物，例如实验动物或者家畜动物。在一个实施方案中， 所述供体细胞或供核细胞或供体细胞核不是人的， 例如即来自非 人哺乳动物。
本发明通过使用去核试剂灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA 转录和合成蛋白， 来去除卵母细胞的细胞核， 取代现有技术的细 胞核移植技术中需要机械操作去除卵母细胞细胞核的步骤， 简化 了该步骤的操作， 可广泛应用于多种物种的细胞核移植操作中。
本发明还提供用于去除细胞的细胞核的组合物， 其包含去核 试剂。 所述去核试剂可以为能够功能性去核或者灭活卵母细胞的 试剂。在另一个实施方案中， 所述去核试剂可以是灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA转录和合成蛋白的试剂。在另一个实施方案中， 所述去核试剂可以是抗肿瘤药物或其类似物。 在一个优选实施方 案中， 所述去核试剂可以是放线菌素、 阿霉素、 柔红霉素、 普卡 霉素、 光辉霉素、 蝇蕈素和二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷中的一种 或几种 （如两种、 三种、 或四种） 。
所述细胞优选是卵母细胞， 特别是成熟卵母细胞。 所述组合 物可以用于去除卵母细胞的细胞核， 以提供去核卵母细胞， 用于 细胞核移植或者其它用途。
本发明还涉及能够功能性去核或者灭活细胞的试剂， 用于去 除细胞的细胞核。 本发明还涉及能够功能性去核或者灭活细胞的 试剂在制备用于去除细胞的细胞核的去核试剂中的用途。 本发明 还涉及能够功能性去核或者灭活细胞的试剂用于去除细胞的细胞 核的用途。 在这些方面， 所述细胞优选是卵母细胞， 特别是成熟 卵母细胞。 所述能够功能性去核或者灭活卵母细胞的试剂可以是 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA转录和合成蛋白的试剂。 在另 一个实施方案中， 所述试剂可以是抗肿瘤药物或其类似物。 在一 个优选实施方案中， 所述试剂可以是放线菌素、 阿霉素、 柔红霉 素、 普卡霉素、 光辉霉素、 蝇蕈素和二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷 中的一种或几种 （如两种、 三种、 或四种） 。 附图说明
图 1是本发明实施例的细胞核移植方法流程图。
图 2是实施例 1 - 5步骤（ 5 ) 获得的嚢胚和实施例 6 - 10步 骤（9 )获得的胚胎的典型照片， 显示所获得的胚胎发育良好。 具体实施方式
以下结合附图， 对本发明的较佳实施例加以详细说明。
本发明提供的细胞核移植方法流程图如图 1所示， 具体包括 以下步驟：
5101、 构建卵母细胞；
本发明方法的所有实施例中， 卵母细胞可以是任何物种的卵 母细胞。 卵母细胞可以通过如下方式获得： 通过活体釆集成熟哺 乳动物卵母细胞， 或从离体卵巢上抽出后， 经过体外成熟获得。 本发明的具体实施例中， 哺乳动物优选为猪。 从离体卵巢上采集 卵子， 包括卵巢的采集， 卵子的采集和卵子的成熟培养。
5102、采用去核试剂处理所构建的卵母细胞， 获得细胞质体； 本发明中去除受体卵细胞的细胞核所采用的试剂， 除包括以 下实施例中所列举的试剂外， 还包括可以灭活卵母细胞的全部可 代替的试剂， 包括大多数抗肿瘤药物，如阿霉素（Doxorubicin )、 放线菌素 A/D ( Act inomycin A/D )、 柔红霉素 ( daunorubicin )、 普卡霉素 ( pl icamyc in ) 、 光辉霉素 ( mi thramycin ) 、 蝇蕈素 ( a -amani t in )和二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷（ 5 , 6-dichloro-l- β -D-r ibofuranosylbenz imidazole ^。该灭活受体细胞核所釆 用的试剂， 以下均称为去核试剂， 其对^母细胞的处理浓度为 0. 05 ~ 20ug/ml，作用时间为 0. 5 ~ 26小时，优选为 0. 1 ~ 10ug/ml , 作用时间优选为 0. 5 ~ 20小时。处理温度可以是室温到 39摄氏度， 如室温 - 37摄氏度或 37-39摄氏度。
5103、 构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核， 将细胞 质体与供体细胞或细胞核融合， 得到重建的胚胎。
以下提供 10组具体实施例，以说明本发明所提供的细胞核移 植最佳实施方法。 其中， 实施例 1、 2、 3、 4和 5是针对需透明带 附着的卵母细胞进行细胞核移植的操作， 实施例 6、 7、 8、 9 和 10是针对去透明带的卵母细胞进行细胞核移植的操作。
在下述实施例中的培养液为猪胚胎培养液（Porc ine zygote medium - 3， PZM-3 ) 。
在下述实施例中融合步骤所用的融合介质组成为： 0. 3 M 甘 露醇， 0. 01% 聚乙烯醇。
在下述实施例中的激活液组成为： 0. 3 M甘露醇， 0. 01% 聚 乙烯醇，
0. 05 ~ 0. 5 mM MgS04, 0. 05 ~ 0. 5 mM CaCl2。
实施例 1
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作一：
( 1 ) 用 0. lug/ml放线菌素作为去核试剂， 处理经体外培养 成熟的猪卵母细胞 20 小时， 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA 转录和合成蛋白；
( 2 )取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成棵卵， 便于进行显微操作；
( 3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中， 用固定管从极体对侧 固定卵母细胞， 通过尖的去核管吸取供核细胞， 直接把供核细胞 注入卵母细胞质内， 退针时， 顺势将第一极体一并去除， 即去除 极体的遗传物质， 并整理和恢复卵膜切口。 如果是采用卵周隙注 入法， 为有利于融合， 用去核管先吸取少量卵母细胞细胞质， 再 将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中， 使供体细胞与卵膜紧 贴在一起；
( 4 )依据不同实验设定电融合参数， 将核移植后的细胞进行 融合（在本实施例中，在 2. OKV/cm的电击作用下使去核卵母细胞 与供体细胞二者融合） ， 模拟精子入卵时的钙离子波动 （在本实 施例中， 这通过以 0. 85KV/cm的电击进行激活来实现） ， 使供体 细胞充分融入卵母细胞中， 电激后的重组胚移入培养液中， 于恒 温培养箱 （ 38. 5 ) ， 培养 40分钟；
( 5 )依据不同实验设定参数， 将核移植重组胚的进行化学处 理 （在本实施例中， 这通过如下方式实施： 将重组构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 10ug/ml放线菌酮混合的培养液中处理 4小 时~ 6 小时） ， 抑制染色体排出， 保证重构胚倍型， 处理后的重 组胚放入培养液中， 在 38. 5 、 5%的 C02培养箱中培养 5天， 观 察嚢胚的发育情况良好。
实施例 2
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作二：
( 1 )用 10ug/ml阿霉素作为去核试剂， 处理经体外培养成熟 的猪卵母细胞 0. 5小时， 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA转录 和合成蛋白；
( 2 )取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成棵卵， 便于进行显微操作；
( 3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中， 用固定管从极体对侧 固定卵母细胞， 通过尖的去核管吸取供核细胞， 直接把供核细胞 注入卵母细胞质内， 退针时， 顺势将第一极体一并去除， 即去除 极体的遗传物质， 并整理和恢复卵膜切口； 如果是釆用卵周隙注 入法， 为有利于融合， 用去核管先吸取少量卵母细胞细胞质， 再 将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中， 使供体细胞与卵膜紧 贴在一起；
( 4 )依据不同实猃设定电融合参数， 将核移植后的细胞进行 融合（在本实施例中，在 2. OKV/cm的电击作用下使去核卵母细胞 与供体细胞二者融合） ， 模拟精子入卵时的钙离子波动 （在本实 施例中， 这通过以 0. 85KV/cm的电击进行激活来实现） ， 使供体 细胞充分融入卵母细胞中， 电激后的重组胚移入培养液中， 于恒 温培养箱 （38. 5 Ό ) ， 培养 30分钟；
( 5 )依据不同实验设定参数， 将核移植重组胚的进行化学处 理 （在本实施例中， 这通过如下方式实施： 将重组构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 10ug/ml放线菌酮混合的培养液中处理 4小 时~ 6 小时） ， 抑制染色体排出， 保证重构胚倍型， 处理后的重 组胚放入培养液中， 在 38. 5 、 5% 的 C02培养箱中培养 7天， 观 察嚢胚的发育情况良好。
实施例 3
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作三：
( 1 ) 用 5ug/ml 柔红霉素作为去核试剂， 处理经体外培养成 熟的猪卵母细胞 10小时， 灭活卵母细胞，使之无法进行 RNA转录 和合成蛋白；
( 2 )取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成棵卵， 便于进行显微操作；
( 3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中， 用固定管从极体对侧 固定卵母细胞， 通过尖的去核管吸取供核细胞， 直接把供核细胞 注入卵母细胞质内， 退针时， 顺势将第一极体一并去除， 即去除 极体的遗传物质， 并整理和恢复卵膜切口； 如果是采用卵周隙注 入法， 为有利于融合， 用去核管先吸取少量卵母细胞细胞质， 再 将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中， 使供体细胞与卵膜紧 贴在一起；
( 4 )依据不同实验设定电融合参数， 将核移植后的细胞进行 融合（在本实施例中，在 2. OKV/cm的电击作用下使去核卵母细胞 与供体细胞二者融合） ， 模拟精子入卵时的钙离子波动 （在本实 施例中， 这通过以 0. 85KV/cm的电击进行激活来实现） ， 使供体 细胞充分融入卵母细胞中， 电激后的重组胚移入培养液中， 于恒 温培养箱 （ 38. 5 V ) ， 培养 50分钟；
( 5 )依据不同实驗设定参数， 将核移植重组胚的进行化学处 理 （在本实施例中， 这通过如下方式实施： 将重组构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 l Oug/ml放线菌酮混合的培养液中处理 4小 时~ 6 小时） ， 抑制染色体排出， 保证重构胚倍型， 处理后的重 组胚放入培养液中， 于 38. 5 °C、 5% 的 C02培养箱中培养 6天， 观 察嚢胚的发育情况良好。
实施例 4
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作四：
( 1 )用 0. 05ug/ml放线菌素作为去核试剂， 处理经体外培养 成熟的猪卵母细胞 26 小时， 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RM 转录和合成蛋白；
( 2 )取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成棵卵， 便于进行显微操作；
( 3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中， 用固定管从极体对侧 固定卵母细胞， 通过尖的去核管吸取供核细胞， 直接把供核细胞 注入卵母细胞质内， 退针时， 顺势将第一极体一并去除， 即去除 极体的遗传物质， 并整理和恢复卵膜切口； 如果是采用卵周隙注 入法， 为有利于融合， 用去核管先吸取少量卵母细胞细胞质， 再 将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中， 使供体细胞与卵膜紧 贴在一起；
( 4 )依据不同实验设定电融合参数， 将核移植后的细胞进行 融合（在本实施例中，在 2. OKV/cm的电击作用下使去核卵母细胞 与供体细胞二者融合） ， 模拟精子入卵时的钙离子波动 （在本实 施例中， 这通过以 0. 85KV/cm的电击进行激活来实现） ， 使供体 细胞充分融入卵母细胞中， 电激后的重组胚移入培养液中， 于恒 温培养箱 （38. 5 Ό ) ， 培养 30-60分钟；
( 5 )依据不同实验设定参数，将核移植重组胚的进行化学处理（在 本实施例中， 这通过如下方式实施： 将重组构胚置于含有 5ug/ml 细胞松弛素与 10ug/ml放线菌酮混合的培养液中处理 4 小时 ~ 6 小时） ， 抑制染色体排出， 保证重构胚倍型， 处理后的重组胚放 入培养液中， 于 38. 5 ·€、 5% 的 C02培养箱中培养 5天， 观察嚢胚 的发育情况良好。
实施例 5
针对需透明带附着的卵母细胞进行克隆的操作五：
( 1 )用 20ug/ml放线菌素作为去核试剂， 处理经体外培养成 熟的猪卵母细胞 10小时， 灭活卵母细胞，使之无法进行 RNA转录 和合成蛋白；
( 2 ) 取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明盾酸酶消 化卵丘细胞， 形成棵卵， 便于进行显微操作；
( 3 )将棵卵放入显微操作盘操作滴中， 用固定管从极体对侧 固定卵母细胞， 通过尖的去核管吸取供核细胞， 直接把供核细胞 注入卵母细胞质内， 退针时， 顺势将第一极体一并去除， 即去除 极体的遗传物质， 并整理和恢复卵膜切口； 如果是釆用卵周隙注 入法， 为有利于融合， 用去核管先吸取少量卵母细胞细胞质， 再 将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中， 使供体细胞与卵膜紧 贴在一起；
( 4 )依据不同实验设定电融合参数， 将核移植后的细胞进行 融合（在本实施例中，在 2. OKV/cm的电击作用下使去核卵母细胞 与供体细胞二者融合） ， 模拟精子入卵时的钙离子波动 （在本实 施例中， 这通过以 0.85KV/cm的电击进行激活来实现） ， 使供体 细胞充分融入卵母细胞中， 电激后的重组胚移入培养液中， 于恒 温培养箱 （38.5 ） ， 培养 60分钟；
(5)依据不同实验设定参数， 将核移植重组胚的进行化学处 理 （在本实施例中， 这通过如下方式实施： 将重组构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 10ug/ml放线菌酮混合的培养液中处理 4小 时~6 小时） ， 抑制染色体排出， 保证重构胚倍型， 处理后的重 组胚放入培养液中， 于 38.5"C、 5% C02培养箱中培养 5天， 观察 嚢胚的发育情况良好。
实施例 6
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作一：
(1) 用 0. lug/ml光辉霉素作为去核试剂， 处理经体外培养 成熟的猪卵母细胞 26 小时， 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA 转录和合成蛋白；
(2)取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成棵卵， 便于后续克隆操作；
( 3)将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化， 去除透明带；
(4)用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去 除极体的遗传物质；
(5)将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理， 使之表 面粘度增加， 黏合一个供体细胞在细胞融合仪中， 在 2. OKV/cm 的电击作用下使二者融合；
(6)将融合后的胚胎放置在培养液中 60分钟， 使供体细胞 充分融入卵母细胞中；
(7)将融合后的胚胎放在激活液中， 以 0.85KV/cm的电击进 行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动； ( 8 )将重构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 lOug/ml放线 菌酮混合的培养液中处理 4小时， 抑制染色体排出， 保证重构胚 倍型；
(9) 4小时后， 将重构胚放在微穴 （well of the well)培 养体系中， 在胚胎培养液中培养 5天， 观察胚胎发育情况良好。 实施例 7
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作二：
( 1 )用 10ug/ml放线菌素作为去核试剂， 处理经体外培养成 熟的猪卵母细胞 0.5小时， 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA转 录和合成蛋白；
(2)取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成棵卵， 便于后续克隆操作；
( 3)将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化， 去除透明带；
( 4 )用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去 除极体的遗传物质；
(5)将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理， 使之表 面粘度增加， 黏合一个供体细胞在细胞融合仪中， 在 2. OKV/cm 的电击作用下使二者融合；
(6)将融合后的胚胎放置在培养液中 60分钟， 使供体细胞 充分融入卵母细胞中；
(7)将融合后的胚胎放在激活液中， 以 0.85KV/cm的电击进 行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动；
( 8 ) 将重构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 10ug/ml放线 菌酮混合的培养液中处理 5小时， 抑制染色体排出， 保证重构胚 倍型；
(9) 4小时后， 将重构胚放在微穴 （ wel 1 of the wel 1 )培 养体系中， 在胚胎培养液中培养 7天， 观察胚胎发育情况良好。 实施例 8
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作三：
(1) 用 5ug/ml放线菌素作为去核试剂， 处理经体外培养成 熟的猪卵母细胞 5小时， 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA转录 和合成蛋白；
(2)取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成棵卵， 便于后续克隆操作；
( 3)将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化， 去除透明带；
( 4 )用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去 除极体的遗传物质；
(5)将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理， 使之表 面粘度增加， 黏合一个供体细胞在细胞融合仪中， 在 2. OKV/cm 的电击作用下使二者融合；
(6)将融合后的胚胎放置在培养液中 60分钟， 使供体细胞 充分融入卵母细胞中；
( 7)将融合后的胚胎放在激活液中， 以 0.85KV/cm的电击进 行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动;
(8)将重构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 10ug/ml放线 菌酮混合的培养液中处理 4小时， 抑制染色体排出， 保证重构胚 倍型；
(9) 4小时后， 将重构胚放在微穴 （well of the well )培 养体系中， 在胚胎培养液中培养 7天， 观察胚胎发育情况良好。 实施例 9
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作四：
( 1 )用 0.05ug/ml放线菌素作为去核试剂， 处理经体外培养 成熟的猪卵母细胞 20 小时， 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA 转录和合成蛋白；
(2)取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成裸卵， 便于后续克隆操作；
( 3)将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化， 去除透明带；
( 4 )用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去 除极体的遗传物质；
(5)将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理， 使之表 面粘度增加， 黏合一个供体细胞在细胞融合仪中， 在 2. OKV/cm 的电击作用下使二者融合；
(6) 将融合后的胚胎放置在培养液中 60分钟， 使供体细胞 充分融入卵母细胞中；
( 7 )将融合后的胚胎放在激活液中， 以 0.85KV/cm的电击进 行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动；
(8)将重构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 10ug/ml放线 菌酮混合的培养液中处理 4小时， 抑制染色体排出， 保证重构胚 倍型；
(9) 4小时后， 将重构胚放在微穴 （well of the well)培 养体系中， 在胚胎培养液中培养 5天， 观察胚胎发育情况良好。 实施例 10
针对去透明带的卵母细胞进行克隆的操作五：
( 1)用 20ug/ml放线菌素作为去核试剂， 处理经体外培养成 熟的猪卵母细胞 5小时， 灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA转录 和合成蛋白；
(2)取出成熟后的卵母细胞-卵丘复合体， 用透明质酸酶消 化卵丘细胞， 形成裸卵， 便于后续克隆操作； ( 3 ) 将脱去棵卵放在链酶蛋白酶中消化， 去除透明带；
( 4 )用口吸管反复吹打卵母细胞去掉其表面的第一极体即去 除极体的遗传物质；
( 5 )将去掉第一极体的卵母细胞用植物凝集素处理， 使之表 面粘度增加， 黏合一个供体细胞在细胞融合仪中， 在 2. OKV/cm 的电击作用下使二者融合；
( 6 ) 将融合后的胚胎放置在培养液中 60分钟， 使供体细胞 充分融入卵母细胞中；
( 7 )将融合后的胚胎放在激活液中， 以 0. 85KV/cm的电击进 行激活， 即模拟精子入卵时的钙波动；
( 8 ) 将重构胚置于含有 5ug/ml细胞松弛素与 10ug/ml放线 菌酮混合的培养液中处理 4小时， 抑制染色体排出， 保证重构胚 倍型；
( 9 ) 4小时后， 将重构胚放在微穴 （wel l of the wel l ) 培 养体系中， 在胚胎培养液中培养 7天， 观察胚胎发育情况良好。
经测定， 以上实施例中的细胞核移植方法， 均能得到能正常 发育成熟的胚胎。
综上所述， 本发明通过使用去核试剂灭活卵母细胞来去除卵 母细胞的细胞核， 取代现有技术的细胞核移植技术中需要机械操 作去除卵母细胞细胞核的步骤， 简化了该步骤的操作， 可广泛应 用于多种物种的细胞核移植操作中。
应当理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述 说明加以改进或变换， 而这些改进和变换都应属于本发明所附权 利要求的保护范围。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种细胞核移植方法， 包括以下步骤：
A、 构建或者获得或提供卵母细胞；
B、 采用浓度为 0. 001-100 ug/ml , 优选 0. 01- 50 ug/ml , 更 优选 0. 05 ~ 20ug/ml， 更优选 0. 1 ~ 10ug/ml的去核试剂， 将所述 卵母细胞处理 10分钟到 48小时， 优选 20分钟到 30小时， 更优 选 0. 5 ~ 26小时， 更优选 0. 5 ~ 20小时， 优选为 5 ~ 10小时， 获 得细胞质体；
C、 构建（或者获得或提供）具有所需遗传特性的供体细胞或 供体细胞核， 将细胞质体与所述供体细胞或供体细胞核融合， 得 到重建的胚胎。
2、 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述卵母细胞 为需透明带附着的卵母细胞或者去透明带的卵母细胞。
3、 如权利要求 1-2 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所 述去核试剂可以为能够功能性去核 /灭活卵母细胞的试剂，优选地 所述去核试剂可以是灭活卵母细胞， 使之无法进行 RNA转录和合 成蛋白的试剂，更优选地所述去核试剂是抗肿瘤药物或其类似物， 例如放线菌素 （如放线菌素 A/D ) 、 阿霉素、 柔红霉素、 普卡霉 素、 光辉霉素、 蝇蕈素和二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷中的一种或 几种。
4、 如权利要求 1 - 3任一项所述的方法， 其特征在于， 所述 卵母细胞优选是成熟卵母细胞； 所述卵母细胞优选来源于哺乳动 物如猪， 或者所述卵母细胞可以不是人的卵母细胞， 即来自非人 哺乳动物。
5、 用于细胞核移植的， 具有功能性去核 /灭活卵母细胞功能 的组合物，其包括浓度为 0.001-100 ug/ml,优选 0.01-50 ug/ml, 更优选 0.05 - 20ug/ml, 更优选 0.1 - 10ug/ml的的抗肿瘤药物， 例如放线菌素 （如放线菌素 A/D) 、 阿霉素、 柔红霉素、 普卡霉 素、 光辉霉素、 蝇蕈素和二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷中的一种或 几种。
6、 能够功能性去核 /灭活卵母细胞的试剂 （例如权利要求 1 -4中定义的那些）在制备用于去核试剂中的用途。
7、 能够功能性去核或者灭活细胞的试剂 （例如权利要求 1 -4中定义的那些） 用于去除细胞的细胞核的用途。
8、 能够功能性去核 /灭活卵母细胞的试剂 （例如权利要求 1 - 4中定义的那些） ， 用于去除细胞的细胞核。
9、 将细胞 （优选是卵母细胞， 特别是成熟卵母细胞） 去核 的方法，包括：将细胞和终浓度为 0.001-100 ug/ml，优选 0.01-50 ug/ml, 更优选 0.05~20ug/ml， 更优选 0.1 ~ 10ug/ml 的去核试 剂 （例如权利要求 1-4中定义的那些）接触 10分钟到 48小时， 优选 20分钟到 30小时， 更优选 0.5 ~ 26小时， 更优选 0.5 ~ 20 小时， 优选为 5 ~ 10小时， 获得细胞质体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119331864A (zh) * 2024-11-02 2025-01-21 广州市中誉仪器科技有限公司 一种电融合显微授精方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101580828B (zh) * 2009-05-06 2012-06-20 深圳华大基因科技有限公司 一种细胞核移植方法
CN102367454B (zh) * 2011-10-11 2015-04-01 深圳华大基因研究院 转基因动物及其制备方法
CN106754348B (zh) * 2016-12-23 2024-02-09 南京农业大学 一种电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的rna干扰方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004010771A2 (en) * 2002-07-29 2004-02-05 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
CN101580828A (zh) * 2009-05-06 2009-11-18 深圳华大基因科技有限公司 一种细胞核移植方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPR451401A0 (en) * 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004010771A2 (en) * 2002-07-29 2004-02-05 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
CN101580828A (zh) * 2009-05-06 2009-11-18 深圳华大基因科技有限公司 一种细胞核移植方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAYONA-BAFALUY, M. P. ET AL.: "A chemical enucleation method for the transfer of mitochondrial DNA to P ° cells.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH., vol. 31, no. 16, 2003, pages 98 *
MOURA, M.T. ET AL.: "Analysis of actinomycin D treated cattle oocytes and their use for somatic cell nuclear transfer.", ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE., vol. 109, 26 December 2007 (2007-12-26), pages 40 - 49 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119331864A (zh) * 2024-11-02 2025-01-21 广州市中誉仪器科技有限公司 一种电融合显微授精方法

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