WO2010125762A1 - 抗体性拒絶反応抑制剤 - Google Patents

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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules

Definitions

  • the present invention relates to an antibody rejection inhibitor.
  • organ transplantation is becoming a general treatment due to advances in medical technology.
  • donors organ donors
  • transplantation from donors with different ABO blood types can be performed safely, it can help resolve donor shortages.
  • an antigen having an A-type or B-type blood group sugar chain is targeted and the transplanted organ is abolished by an antigen-antibody reaction (an antigen having these blood group sugar chains is also referred to as a blood group sugar chain antigen).
  • lymphocyte cells play an important role in the antigen-antibody reaction.
  • anti-HM1.24 antibody suppresses the activation of B cells and T cells
  • the lymphocyte activation inhibitor that enables the suppression of T cell blastogenesis and B cell antibody production.
  • Patent Document 1 proposes the lymphocyte activation inhibitor that enables the suppression of T cell blastogenesis and B cell antibody production.
  • the present inventors have also studied B cells that are reactive with the above-mentioned blood group sugar chains.
  • receptors receptors that react with blood group sugar chains are B-1 among B cells. Being attributed to cells, differentiation of this B-1 cell is suppressed by calcineurin inhibitors, calcineurin inhibitors are peptide antigens (corresponding to antigens derived from general external enemies such as microorganisms and viruses) It has been confirmed that it does not affect the differentiation of B-2 cells that react (Non-Patent Documents 1 to 4).
  • the present inventors suppressed the cells that had already differentiated into B-1 cells by using an anti-CD20 antibody preparation that specifically inhibits B cells, and differentiated B-1 cells.
  • the anti-CD20 antibody preparation acts on all B cells and suppresses not only B-1 cells reactive to blood sugar chains but also B-2 cells reactive to peptide antigens. There is a problem that an increase in infectious diseases is inevitable due to a decrease in immune function.
  • an object of the present invention is to provide an antibody rejection inhibitor that is more effective than an anti-CD20 antibody preparation and the like and can reduce a decrease in cellular immune function.
  • NKT natural killer T
  • the present invention is an antibody rejection inhibitor that suppresses signal production between NKT cells and B cells and suppresses the production of antibodies, and is an antibody rejection inhibitor containing anti-CD1d antibodies.
  • the B cell contains B-1 cells, and the antibody whose production is suppressed contains an antibody against a sugar chain antigen. More specifically, blood group sugar chain antigens are included.
  • the antibody whose production is suppressed does not include an antibody against a peptide antigen. Therefore, since the production of antibodies against general antigens derived from external enemies is not suppressed, an excessive decrease in immune function can be reduced.
  • the anti-CD1d antibody is a monoclonal antibody, antibody rejection can be suppressed more efficiently. If the anti-CD1d antibody is a human-type antibody, transplantation from a donor with an incompatible ABO blood group Even if it is, etc., it will be possible to transplant without trouble, and the donor shortage will be greatly resolved.
  • the “NKT cell” is a lymphocyte cell that has both NK (natural killer) cell and T cell markers and is attracting attention as a cell that links innate immunity and acquired immunity.
  • NKT cells are known to recognize antigens presented on CD1d of MHC class I-like molecules by their antigen receptors (invariant T cell antigen receptor: iTCR, V ⁇ 24TCR in humans, V ⁇ 14TCR in mice).
  • iTCR invariant T cell antigen receptor: iTCR, V ⁇ 24TCR in humans, V ⁇ 14TCR in mice).
  • ⁇ -galactosylceramide a chain antigen, has been discovered. When activated, NKT cells are thought to produce a large amount of IFN- ⁇ (interferon-gamma) and IL-4 (interleukin-4) and affect each immune system.
  • a “B cell” is a lymphocyte that differentiates and matures in the bone marrow, and is an antibody-producing precursor cell that produces an antibody by a predetermined stimulus. CD19, 20, 21 as surface markers. B cells are classified into normal B cells (B-2 cells) involved in antibody production against protein antigens and B-1 cells involved in sugar chain antigen antibody production. “B-1 cells” are cells that are present mainly in the abdominal cavity, have a surface marker of IgM high CD5 + , and are responsible for production of antibodies against sugar chain antigens independent of T cells. An “anti-CD1d antibody” is an antibody against a CD1d molecule.
  • sugar chain antigen is a sugar chain antigen among sugar chain antigens, protein antigens, and lipid antigens. It is thought that antibody production against a sugar chain antigen is mainly performed by B-1 cells, and its production is T cell-independent.
  • a “blood group sugar chain antigen” is a sugar chain antigen discovered as an alloantigen on erythrocytes. It is classified into A, B, and O types. The A type is an O type antigen bound to N acetylgalactosamine, and the B type is ⁇ galactose. Blood group sugar chain antigens are also expressed on vascular endothelium in organs other than erythrocytes. Upon organ transplantation, acute antibody rejection is caused by natural antibodies against blood group sugar chain antigens, activated B cells, and antibodies produced from plasma cells. A reaction is triggered.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody against a single antigen.
  • One B cell has a B cell receptor for a single antigen, differentiates into a plasma cell after antigen stimulation, and produces only one type of immunoglobulin.
  • a monoclonal antibody can be obtained by producing an antibody in a heterologous plasmacytoma by antigen stimulation and then purifying it.
  • “Humanized (chimeric) antibodies” are those in which the constant region of a monoclonal antibody produced in a heterologous plasmacytoma is replaced with the constant region of human immunoglobulin, greatly reducing the side effects of administration to humans. is there.
  • Such an antibody-like rejection inhibitor obtains a test mouse by administering a target component into the abdominal cavity of a mouse, and obtains a control mouse by administering an antibody component to be inhibited into the abdominal cavity of another mouse. And a step of immunizing each of the test mouse and the control mouse with erythrocytes and measuring the production of anti-blood group antibodies.
  • the antibody rejection inhibitor of the present invention for example, it is possible to specifically suppress only the antibody rejection that occurs at the time of transplantation, without significantly impairing the biological defense function. It becomes possible to transplant from a donor who is incompatible with the ABO blood group, to suppress the occurrence of autoimmune diseases, and the like.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram for explaining the operation in the present embodiment.
  • FIG. 2 is a graph showing test results in Example 1.
  • (A) shows before immunization and (b) shows 2 weeks after immunization.
  • FIG. 3 is a graph showing test results in Example 1.
  • (A) shows before immunization, and (b) shows 6 weeks after immunization.
  • FIG. 4 is a graph showing test results in Example 2.
  • FIG. 5 is a graph showing test results in Example 3.
  • 6 is a graph showing test results in Example 3.
  • FIG. (A) shows before immunization, and (b) shows 6 weeks after immunization.
  • FIG. 7 is a graph showing the test results in Example 4.
  • NKT cells may be involved in the production of antibodies against blood group sugar chain antigens (also referred to as anti-blood group antibodies) in some form and analyzed them. It was. The details will be described in Example 1, but mice lacking the CD1d molecule (also referred to as knockout mice) and normal mice were immunized with human erythrocytes, and the subsequent production of anti-blood group antibodies was compared.
  • blood group sugar chain antigens also referred to as anti-blood group antibodies
  • NKT cells are involved in the production of anti-blood group antibodies and are essential for antibody class switching.
  • NKT cells have little effect on peptide antigens.
  • anti-blood group antibodies could be specifically suppressed by controlling the activity of NKT cells. Focusing on the point that the first signal transduction is performed by antigen presentation via CD1d molecule, the production of anti-blood group antibody can be suppressed by inhibiting the signal transduction between NKT cells and B cells with anti-CD1d antibody I thought that.
  • Fig. 1 schematically shows the mechanism.
  • reference numeral 1 is an NKT cell
  • reference numeral 2 is a B-1 cell
  • reference numeral 3 is an anti-CD1d antibody.
  • B-1 cell 2 has antigen receptor 6 on its surface that binds in response to CD1d molecule 4 and blood group sugar chain antigen 5, while NKT cell 1 It has an antigen receptor (iTCR) 7 that reacts and binds to the CD1d molecule 4 of 1 cell 2 on its surface.
  • iTCR antigen receptor
  • Signal transmission between the NKT cell 1 and the B-1 cell 2 is performed via the iTCR7 and the CD1d molecule 4.
  • CD1d molecule 4 is not unique to B-1 cell 2 but also exists in B-2 cells.
  • anti-CD1d antibody 3 is applied and bound to CD1d molecule 4, and signal transduction between NKT cell 1 and B-1 cell 2 is inhibited, anti-blood It should be possible to suppress the production of type 8 antibody.
  • isotype ⁇ control mice administered with isotype antibody
  • anti-AIgM antibody and anti-AIgG antibody were compared over time (details are given in Example 3).
  • mice administered with isotype antibodies As a result, normal antibody production was observed in mice administered with isotype antibodies, and in mice administered with anti-CD1d antibodies, the effect of suppressing the production of anti-blood group antibodies and the suppression of antibody class switching were suppressed as in the case of knockout mice. The effect was recognized (refer FIG. 5, FIG. 6).
  • an anti-CD1d antibody inhibitor for mice can be easily obtained by obtaining and appropriately adjusting the anti-CD1d antibody.
  • the antibody-based rejection inhibitor for mice when administered, for example, so that the amount of anti-CD1d antibody per mouse is 400 to 600 ⁇ g, preferably 450 ⁇ g, the production of anti-blood group antibodies in the mouse is specifically detected. It is possible to suppress organs and transplant organs regardless of blood type.
  • monoclonal human anti-CD1d antibodies may be produced using a series of known techniques for producing human monoclonal antibodies. Then, the prepared monoclonal human anti-CD1d antibody is mixed with other adjuvants such as preservatives and nutrients according to a conventional method, and adjusted as, for example, an injection, thereby suppressing human antibody rejection. An agent can be obtained.
  • the prescribed amount for example, 30 g per mouse is converted on the basis of body weight
  • the production of anti-blood group antibodies of type A and B can be specifically suppressed, and blood group Regardless, it becomes possible to transplant organs without impairing the normal immune response.
  • this anti-CD1d antibody is effective against cells that have already differentiated into B-1 cells, in combination with administration of this anti-CD1d antibody, -1 It is considered to be more effective if a calcineurin inhibitor that suppresses the differentiation of cells is administered.
  • the present invention may also be applicable to xenotransplantation, for example, transplantation using a pig organ that is physiologically and anatomically similar to a human in place of a human organ.
  • Gal ⁇ 1-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc (Gal) sugar chain and N-glycolylneuraminic acid (NeuGc) sugar chain in the porcine organ there are Gal ⁇ 1-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc (Gal) sugar chain and N-glycolylneuraminic acid (NeuGc) sugar chain in the porcine organ, and these sugar chain antigens become the target of natural antibodies and cause antibody rejection.
  • Gal sugar chains and NeuGc sugar chains are similar to blood group sugar chain antigens, the antibody rejection inhibitor of the present invention is highly likely to be effective for xenotransplantation between humans and pigs. .
  • the antibody rejection inhibitor of the present invention can be put into practical use relatively easily and can be used to safely perform organ transplantation even from donors who are incompatible with the ABO blood group. This is expected to help resolve the donor shortage.
  • Human type A erythrocytes are immunized by collecting blood from healthy volunteers with blood type A, washing twice with PBS, diluting to 8 ⁇ 10 8 / ml, and administering 1 ml intraperitoneally to the mouse, at 1-week intervals. Immunized twice.
  • Detection using anti-A antibody titer using ELISA was performed with 5 ⁇ g / ml A-BSA (bovin ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ serum albumin) (Dextra) in a polystyrene 96-well flat bottom plate (costar) or 5 ⁇ g / ml BSA (Roche) as a background control. Coating was performed at 0 ° C. for 8 hours. After washing the plate, it was blocked with 1% BSA, diluted mouse serum was added to each well and incubated for 2 hours at room temperature.
  • A-BSA bivin ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ serum albumin
  • the results are shown in FIGS.
  • the graph of FIG. 2 shows the change of the antibody amount of the anti-AIgM antibody, (a) is before immunization, and (b) is 2 weeks after immunization.
  • the vertical axis of the graph represents the amount of antibody, and the horizontal axis represents the dilution factor of the added serum.
  • the graph of FIG. 3 shows the change in the antibody amount of the anti-AIgG antibody, (a) is before immunization, and (b) is 6 weeks after immunization.
  • the vertical axis of the graph indicates the amount of antibody as in FIG. 2, and the horizontal axis indicates the dilution factor of the added serum.
  • the thymus of C57BL / 6 wild-type mice was removed, the thymus was ground in a dish, and ACK lysing solution (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA-2Na, and PBS, pH 7.4)
  • ACK lysing solution 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA-2Na, and PBS, pH 7.4
  • the thymocytes were isolated, diluted to 20 ⁇ 10 6 / ml with 199 medium, 1 ml was intraperitoneally injected into the mouse, and immunized twice at weekly intervals.
  • Detection of anti-homogeneous MHC antibody was carried out by isolating thymocytes of C57BL / 6 wild-type mice by the above method and using flow cytometer (FCM) medium (PBS containing 0.1% BSA and 0.1% sodium azide). 10 ⁇ 10 6 / ml. To 1 ⁇ 10 6 cells, 10 ⁇ l of test plasma was added and incubated at 4 ° C. for 1 hour. 10 ⁇ l of anti-mouse IgM or IgG1,2a / b, 3-biotin was added as a secondary antibody and incubated at 4 ° C. for 30 minutes.
  • FCM flow cytometer
  • streptavidin-PE was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 15 minutes, analyzed by FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson), and the amount of the main fluorescein intensity (MFI) was used as the antibody amount.
  • mice After 24 hours, each of these mice was immunized twice with a weekly human A-type erythrocyte, and the production of anti-blood group antibodies was measured using ELISA as described above.
  • the graph in FIG. 5 shows the change in the antibody amount of the anti-AIgM antibody, (a) is before immunization, and (b) is 6 weeks after immunization.
  • the vertical axis of the graph represents the amount of antibody, and the horizontal axis represents the dilution factor of the added serum.
  • the graph of FIG. 6 shows the change in the antibody amount of the anti-AIgG antibody, (a) is before immunization, and (b) is 6 weeks after immunization.
  • the vertical axis of the graph indicates the amount of antibody as in FIG. 5, and the horizontal axis indicates the dilution factor of the added serum.
  • Example 4 In order to confirm that the same effect as in the case of the mouse described above can be obtained in the case of human, a test was conducted using a human lymphocyte chimeric mouse.
  • Human lymphocyte chimeric mice were purchased from severe combined immunodeficient mice (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug / Jic ; manufactured by Central Research Institute for Experimental Animals). The collected peripheral blood lymphocytes were prepared by intraperitoneal administration of 20 ⁇ 10 6 mice per mouse.
  • FIG. 7 shows the abundance ratio of anti-A receptor-expressing B cells in human CD19 + B cells in the spleen of human lymphocyte chimeric mice.
  • the black circle is the value of each solid, and the white circle is the average value.
  • human B cells recognizing type A antigen in the spleen of test mice administered with anti-CD1d antibody have a significantly lower abundance ratio than in the spleen of control mice administered with control antibody. It was. That is, it was confirmed that the anti-CD1d antibody specifically and significantly suppresses the response of human B cells to blood group antigens.
  • mice and humans In addition to organ transplantation and xenotransplantation of mice and humans, it can also be used to suppress the occurrence of autoimmune diseases.

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Abstract

　生体防御機能を大きく損なうことなく、ＡＢＯ式血液型が不適合なドナーからの移植や自己免疫疾患の発生抑制などを可能にする。　ＮＫＴ細胞１とＢ細胞２との間のシグナル伝達を阻害して抗体の産生を抑制する抗体性拒絶反応抑制剤である。この抗体性拒絶反応抑制剤には、抗ＣＤ１ｄ抗体３が含まれている。

Description

抗体性拒絶反応抑制剤
　本発明は、抗体性拒絶反応抑制剤に関する。
　近年、医療技術の進歩から臓器移植が一般治療化されつつある。しかし、臓器提供者（ドナー）が圧倒的に不足しており、ＡＢＯ式血液型の異なるドナーからの移植が安全に施行可能となればドナー不足解決の一助となりえる。
　しかしながら、このようなＡＢＯ式血液型不適合ドナーから臓器移植を行う場合、抗体性拒絶反応という大きな問題がある。すなわち、Ａ型やＢ型の血液型糖鎖を有する抗原が標的となり抗原抗体反応により移植臓器が廃絶されるのである（これら血液型糖鎖を有する抗原を血液型糖鎖抗原ともいう）。
　そのため、多剤併用の免疫抑制法が提案されてはいるが、いずれも治療効果は不確実、一時的なものであるうえ、非特異的であるため免疫機能全般が一様に抑制されてしまい、免疫機能の低下を招くという問題がある。
　このような状況の下、抗原抗体反応では各種リンパ球細胞が重要な役割を果たしていることから、これらに着目した検討が行われている。例えば、抗ＨＭ１．２４抗体がＢ細胞やＴ細胞の活性化を抑制するという知見に基づき、Ｔ細胞の幼若化やＢ細胞の抗体産生の抑制を可能にした、リンパ球の活性化抑制剤などが提案されている（特許文献１）。
　本発明者らもまた、上述した血液型糖鎖に反応性を示すＢ細胞について研究を行っており、これまでに血液型糖鎖に反応するレセプター（受容体）はＢ細胞の中でもＢ-１細胞に帰属していることや、このＢ-１細胞の分化がカルシニューリン阻害剤で抑制されること、カルシニューリン阻害剤はペプチド抗原（微生物やウイルス等の一般的な外敵由来の抗原に相当する）に反応するＢ-２細胞の分化には影響しないことなどを確認している（非特許文献１～４）。
特許第３５５２８９８号公報
Irei T, Ohdan H, Ishiyama K, Tanaka Y, et al　The persistent elimination of B cells responding to blood group A carbohydrates by synthetic group A carbohydrates and B-1 cell differentiation blockade: novel concept in preventing antibody-mediated rejection in ABO-incompatible transplantation. Blood. 110(13):4567-4575.2007. Ohdan H, Zhou W, Tanaka Y, Irei T, et al　Evidence of immune tolerance to blood group antigens in a case of ABO-incompatible pediatric liver transplantation. Am J Transplant. 7(9):2190-4.2007 Zhou W, Ohdan H, Tanaka Y, Hara H, et al　NOD/SCID mice engrafted with human peripheral blood lymphocytes can be a model for investigating B cells responding to blood group A carbohydrate determinant. Transpl Immunol. 12(1):9-18.2003 Ohdan H, Swenson KG, Huw S. Gray K,et al　Mac-1-Negative B-1b Phenotype of Natural Antibody-Producing Cells, Including Those Responding to Galα1,3Gal Epitopes inα1,3-Galactosyltransferase-Deficient Mice. The Journal of Immunology. 165:5518-5529.2000
　上記研究結果に基づき、本発明者らは、Ｂ細胞を特異的に抑制する抗ＣＤ２０抗体製剤を用いて既にＢ-１細胞に分化してしまった細胞を抑制し、Ｂ-１細胞の分化をカルシニューリン阻害剤で抑制するという、抗ＣＤ２０抗体製剤とカルシニューリン阻害剤との併用について検討を進めている。
　しかしながら、抗ＣＤ２０抗体製剤は全てのＢ細胞に作用し、血液型糖鎖に反応性を示すＢ-１細胞だけでなく、ペプチド抗原に反応性を示すＢ-２細胞まで抑制してしまうことから、免疫機能の低下により感染症の増加は避けられないという問題があった。
　かかる点に鑑み、本発明では、抗ＣＤ２０抗体製剤等よりも効果的で、細胞性免疫機能の低下を軽減することのできる、抗体性拒絶反応抑制剤の提供を課題とする。
　本発明者らは、natural killer T (ＮＫＴ)細胞に着目して鋭意研究を行った結果、ＮＫＴ細胞とＢ細胞との間のシグナル伝達を阻害することで有効な効果が得られることを見い出した。
　すなわち、本発明は、ＮＫＴ細胞とＢ細胞との間のシグナル伝達を阻害して抗体の産生を抑制する抗体性拒絶反応抑制剤であって、抗ＣＤ１ｄ抗体を含む抗体性拒絶反応抑制剤である。具体的には、前記Ｂ細胞にはＢ-１細胞が含まれており、産生が抑制される前記抗体には糖鎖抗原に対する抗体が含まれている。より詳しくは血液型糖鎖抗原が含まれている。
　従って、少なくともＡ型やＢ型の血液型糖鎖抗原に対する抗体の産生を抑制することができるので、臓器移植等の際に生じる抗体性拒絶反応を効果的に防ぐことができる。
　その一方で、産生が抑制される前記抗体には、ペプチド抗原に対する抗体は含まれない。従って、一般的な外敵由来の抗原に対する抗体の産生は抑制されないので、免疫機能の過剰な低下を軽減できる。
　更に、前記抗ＣＤ１ｄ抗体がモノクローナル抗体であれば、より効率よく抗体性拒絶反応を抑制することができ、前記抗ＣＤ１ｄ抗体がヒト型抗体であれば、ＡＢＯ式血液型が不適合なドナーからの移植等であっても支障なく移植できるようになり、ドナー不足を大幅に解消できるようになる。
　尚、「ＮＫＴ細胞」とは、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞とＴ細胞の両方のマーカーを有し、自然免疫と獲得免疫を繋ぐ細胞として注目されているリンパ球細胞である。ＮＫＴ細胞は、その抗原レセプター（invariant T cell antigen receptor：ｉＴＣＲ、ヒトではＶα２４ＴＣＲ、マウスではＶα１４ＴＣＲ）により、ＭＨＣクラスＩ様分子のＣＤ１ｄに提示された抗原を認識するとされており、例えばその抗原として糖鎖抗原であるα-ガラクトシルセラミド(α galactosylceramide)が発見されている。ＮＫＴ細胞は、活性化されるとIFN-γ（interferon-gamma）やIL-4（interleukin-4）を多量に産生し、各免疫系に影響を与えると考えられている。
　「Ｂ細胞」とは、骨髄で分化成熟するリンパ球細胞であり、所定の刺激により抗体を産生するようになる抗体産生前駆細胞である。表面マーカーとしてＣＤ１９，２０，２１を持つ。Ｂ細胞は蛋白抗原に対する抗体産生にかかわる通常のＢ細胞（Ｂ－２細胞）と糖鎖抗原の抗体産生にかかわるＢ－１細胞に分類される。「Ｂ-１細胞」とは、主に腹腔内に存在し、ＩｇＭhighＣＤ５+の表面マーカーを有し、Ｔ細胞に依存することなく糖鎖抗原に対する抗体の産生を司る細胞である。「抗ＣＤ１ｄ抗体」とは、ＣＤ１ｄ分子に対する抗体である。
　「糖鎖抗原」とは、糖鎖抗原、蛋白抗原、脂質抗原のうちの糖鎖抗原である。糖鎖抗原に対する抗体産生は主にＢ－１細胞が担うと考えられ、その産生はＴ細胞非依存性である。「血液型糖鎖抗原」とは、赤血球上の同種抗原として発見された糖鎖抗原である。Ａ、Ｂ、Ｏ型に分類され、Ａ型はＯ型抗原にＮアセチルガラクトサミンがＢ型はβガラクトースが結合したものである。血液型糖鎖抗原は赤血球以外の臓器内血管内皮にも発現し、臓器移植の際、血液型糖鎖抗原に対する自然抗体や活性化されたＢ細胞、形質細胞からの産生抗体により急性抗体性拒絶反応が惹起される。
　「モノクローナル抗体」とは、単一の抗原に対する抗体のことである。ひとつのＢ細胞は、唯一の抗原に対するＢ細胞レセプターを持ち、抗原刺激後形質細胞に分化し、一種類のみの免疫グロブリンを産生する。抗原刺激により異種形質細胞腫に抗体を産生させた後精製し、モノクローナル抗体を得ることができる。「ヒト型（キメラ）抗体」とは、異種形質細胞腫に産生させたモノクローナル抗体の定常部をヒトの免疫グロブリンの定常部と置き換え、ヒトに投与する際の副作用を大幅に軽減させたものである。
　このような抗体性拒絶反応抑制剤は、例えば、マウスの腹腔内に対象成分を投与してテストマウスを得るとともに、他のマウスの腹腔内に抑制すべき抗体成分を投与して対照マウスを得る工程と、前記テストマウス及び前記対照マウスのそれぞれを赤血球で免疫し、抗血液型抗体の産生を測定する工程と、を含むスクリーニング方法によって得ることができる。
　以上説明したように、本発明の抗体性拒絶反応抑制剤であれば、例えば、移植時に生じる抗体性拒絶反応のみを特異的に抑制することが可能となるため、生体防御機能を大きく損なうことなく、ＡＢＯ式血液型が不適合なドナーからの移植や自己免疫疾患の発生抑制などが可能になる。
図１は、本実施形態における作用を説明するための概念図である。 図２は、実施例１における試験結果を示すグラフである。（ａ）は免疫前を、（ｂ）は免疫２週間後を表している。 図３は、実施例１における試験結果を示すグラフである。（ａ）は免疫前を、（ｂ）は免疫６週間後を表している。 図４は、実施例２における試験結果を示すグラフである。 図５は、実施例３における試験結果を示すグラフである。（ａ）は免疫前を、（ｂ）は免疫６週間後を表している。 図６は、実施例３における試験結果を示すグラフである。（ａ）は免疫前を、（ｂ）は免疫６週間後を表している。 図７は、実施例４における試験結果を示すグラフである。
　以下、実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。尚、以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物或いはその用途を制限することを意図するものではない。
　本発明者らは、まず、ＮＫＴ細胞が血液型糖鎖抗原に対する抗体（抗血液型抗体ともいう）の産生に対しても何らかの形で関与している可能性があると考え、その解析を行った。その詳細については実施例１で説明するが、ＣＤ１ｄ分子が欠損しているマウス（ノックアウトマウスともいう）と正常なマウスとをヒト赤血球で免疫し、その後の抗血液型抗体の産生を比較した。
　その結果、免疫後にはノックアウトマウスの抗血液型抗体の産生が正常なマウスに比べて低下することが確認された。また、正常なマウスでは抗体のクラススイッチ、すなわち免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の出現後にＩｇＧなどの他のアイソタイプの抗体の産生が認められたが、ノックアウトマウスでは全く認められなかった（図２、図３参照）。
　従って、ＮＫＴ細胞は抗血液型抗体の産生に関与しており、抗体のクラススイッチに必須であることが確認された。
　次に、このＮＫＴ細胞の抗血液型抗体の産生への関与が特異的なものであるか否かを確認するために、ＮＫＴ細胞の通常のペプチド抗原に対する抗体産生への影響について解析を行った（詳細は実施例２に示す）。具体的には、ノックアウトマウスと正常なマウスとを同種マウス細胞で免疫し、抗アロ抗体産生を比較した。
　その結果、ノックアウトマウス及び正常なマウスともに免疫後の抗アロ抗体の産生が認められ、また、抗体のクラススイッチも双方ともに確認された（図４参照）。
　従って、ＮＫＴ細胞のペプチド抗原に対する影響は少ないことが確認された。
　以上の結果より、ＮＫＴ細胞の活性を制御することによって抗血液型抗体の産生を特異的に抑制できる可能性が示唆されたことから、更に本発明者らは、ＮＫＴ細胞とＢ細胞との間の最初のシグナル伝達はＣＤ１ｄ分子を介した抗原提示によりなされる点に着目し、ＮＫＴ細胞とＢ細胞との間のシグナル伝達を抗ＣＤ１ｄ抗体により阻害することによって抗血液型抗体の産生を抑制できるのではないかと考えた。
　図１に、そのメカニズムを模式的に表す。図中、符号１はＮＫＴ細胞、符号２はＢ-１細胞、符号３は抗ＣＤ１ｄ抗体である。
　同図に示すように、Ｂ-１細胞２は、ＣＤ１ｄ分子４や血液型糖鎖抗原５に反応して結合する抗原レセプター６をその表面に持っており、一方、ＮＫＴ細胞１は、Ｂ-１細胞２のＣＤ１ｄ分子４と反応して結合する抗原レセプター（ｉＴＣＲ）７をその表面に持っている。ＮＫＴ細胞１とＢ-１細胞２との間のシグナル伝達は、このｉＴＣＲ７とＣＤ１ｄ分子４とを介して行われる。尚、ＣＤ１ｄ分子４はＢ-１細胞２に固有のものではなく、Ｂ-２細胞にも存在する。
　血液型糖鎖抗原５がＢ-１細胞２に結合すると、ＣＤ１ｄ分子４上に抗原提示され、ＮＫＴ細胞１に抗原情報が伝達され、その後、ＮＫＴ細胞１とＢ-１細胞２との協働により抗血液型抗体８の産生が行われるものと考えられる。
　そうであれば、同図に示すように、抗ＣＤ１ｄ抗体３を付与してＣＤ１ｄ分子４に結合させ、ＮＫＴ細胞１とＢ-１細胞２との間のシグナル伝達を阻害させれば、抗血液型抗体８の産生抑制が可能になるはずである。
　そこで、本発明者らは、この仮説を検証すべく、抗ＣＤ１ｄ抗体を投与したマウス、アイソタイプ抗体（isotype control)を投与したマウスをそれぞれヒトＡ型赤血球で免疫し、抗ＡIgＭ抗体や抗ＡIgＧ抗体の産生を経時的に比較した（詳細は実施例３に示す）。
　その結果、アイソタイプ抗体を投与したマウスでは通常の抗体産生が認められ、抗ＣＤ１ｄ抗体を投与したマウスでは、ノックアウトマウスと同様に抗血液型抗体の産生を抑制する効果や抗体のクラススイッチを抑制する効果が認められた（図５、図６参照）。
　従って、抗ＣＤ１ｄ抗体を含む抗体性拒絶反応抑制剤を用いてＮＫＴ細胞とＢ細胞との間のシグナル伝達を阻害し、抗体の産生を抑制すれば、通常のペプチド抗原に対する抗体産生を損なうことなく抗血液型抗体の産生を特異的に抑制することが可能になる。
　マウスの場合であれば、例えば、既に抗ＣＤ１ｄ抗体が市販されているため、その抗ＣＤ１ｄ抗体を入手して適宜調整することで簡単にマウス用の抗体性拒絶反応抑制剤を得ることができる。
　そして、そのマウス用の抗体性拒絶反応抑制剤を、例えば、マウス１匹当たり抗ＣＤ１ｄ抗体が４００～６００μｇ、好ましくは４５０μｇとなるように投与すれば、そのマウスの抗血液型抗体の産生を特異的に抑制することができ、血液型にかかわらず臓器移植することが可能になる。
　ヒトの場合であれば、ヒト型のモノクローナル抗体を作成する一連の公知技術を使用して、モノクローナルなヒト型の抗ＣＤ１ｄ抗体を作製すればよい。そして、作製したモノクローナルなヒト型の抗ＣＤ１ｄ抗体と、定法に従って保存剤や栄養剤等のその他の補助薬剤等とを混合し、例えば注射薬として調整することにより、ヒト用の抗体性拒絶反応抑制剤を得ることができる。
　そしてその所定量（例えばマウス１匹を３０ｇとして体重を基に換算すればよい）を投与すれば、Ａ型やＢ型の抗血液型抗体の産生を特異的に抑制することができ、血液型にかかわらず通常の免疫反応を損なうことなく臓器移植することなどが可能になる。
　なおその際には、この抗ＣＤ１ｄ抗体は、既にＢ-１細胞に分化してしまった細胞に対して有効なものであるため、この抗ＣＤ１ｄ抗体の投与と併せて、Ｂ－０細胞からＢ-１細胞の分化を抑制するカルシニューリン阻害剤を投与すれば、いっそう効果的であると考えられる。
　また、本発明は異種移植、例えば、生理学的、解剖学的にヒトとの間で類似性が高いブタの臓器をヒトの臓器の代わりに用いる移植などにも応用できる可能性がある。
　すなわち、ブタの臓器には、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc（Ｇａｌ）糖鎖やN-glycolylneuraminic acid（ＮｅｕＧｃ）糖鎖が存在し、これら糖鎖抗原が自然抗体の標的となって抗体性拒絶反応を引き起こすが、これらＧａｌ糖鎖やＮｅｕＧｃ糖鎖は血液型糖鎖抗原と類似していることから、本発明の抗体性拒絶反応抑制剤はヒト－ブタ間の異種移植にも有効である可能性が高い。
　以上説明したように、本発明の抗体性拒絶反応抑制剤であれば、比較的簡単に実用化できるうえ、その使用によりＡＢＯ式血液型が不適合なドナー等からも安心して臓器移植ができるようになることが予想されるため、ドナー不足の解消に役立つと考えられる。
　（実施例１）
　ＮＫＴ細胞の血液型糖鎖抗原に対する抗体産生への影響を解析するため、Ｂａｌｂ/ｃ　ＣＤ1ｄ－／－マウス（ｉＴＣＲのリガンドであるＣＤ１ｄを欠き、ＮＫＴ細胞が顕著に減少していることが知られているマウス；ノックアウトマウス、ｎ＝４）と、比較対照のＢａｌｂ/ｃ野生種マウス（ｎ＝５）とをヒトＡ型赤血球（８×１０８/マウス）で免疫し、抗血液型Ａ抗体産生をＥＬＩＳＡを用いて測定した。
　ヒトＡ型赤血球の免疫は、血液型がＡ型の健常人ボランティアから採血し、ＰＢＳで２回洗浄後、８×１０８/ｍｌに希釈してその１ｍｌをマウス腹腔内に投与し１週間隔で２回免疫した。
　抗Ａ抗体価のＥＬＩＳＡを用いた検出は、ポリスチレン96wellフラットボトムプレート（ｃｏｓｔａｒ）を５μｇ/ｍｌ Ａ-ＢＳＡ(bovin serum albumin)(Ｄｅｘｔｒａ)、もしくはバックグラウンドコントロールとして５μｇ/ｍｌ ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）で４℃、８時間コーティングした。プレートを洗浄後、１％ＢＳＡでブロッキングし、希釈マウス血清を各wellに添加して、室温で２時間インキュベーションした。次に、０．２５μｇ/ｍｌ抗マウスＩｇＭもしくはＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を二次抗体として添加し、室温で１時間インキュベーションした。プレートの洗浄の後、０．１ｍｇ/ｍｌ Ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）を添加、発色し、マルチプレートリーダー（ＣＯＬＯＮＡ）で４９２ｎｍでの吸光度を測定した。Ａ－ＢＳＡコーティングプレートの吸光度より、ＢＳＡバックグラウンドプレートの吸光度を引き、その差を抗Ａ抗体価とした（非特許文献１参照）。
　その結果を図２、図３に示す。図２のグラフは抗ＡＩｇＭ抗体の抗体量の変化を表しており、（ａ）は免疫前、（ｂ）は免疫２週間後である。グラフの縦軸は抗体量を、横軸は添加血清の希釈倍数を示している。
　（ａ）のグラフに示されるように、免疫前ではノックアウトマウスと野生種マウスとで抗ＡＩｇＭ自然抗体の抗体量に差は認められなかった。しかし、（ｂ）のグラフに示されるように、野生種マウスでは、免疫後に抗ＡＩｇＭ抗体の抗体量の増加が認められたのに対し、ノックアウトマウスでは、免疫の前後で抗ＡＩｇＭ抗体の抗体量にほとんど変化は認められなかった。
　一方、図３のグラフは抗ＡＩｇＧ抗体の抗体量の変化を表しており、（ａ）は免疫前、（ｂ）は免疫６週間後である。グラフの縦軸は図２と同様に抗体量を、横軸は添加血清の希釈倍数を示している。
　（ａ）のグラフに示されるように、抗ＡＩｇＧ抗体は免疫前にはいずれのマウスでも認められないが、（ｂ）のグラフに示されるように、野生種マウスでは抗ＡＩｇＧ抗体の産生が認められたのに対し、ノックアウトマウスでは抗ＡＩｇＧ抗体の産生は認められなかった。
　（実施例２）
　ＮＫＴ細胞の通常のペプチド抗原に対する抗体産生の影響を解析するため、上記ノックアウトマウスと、Ｂａｌｂ/ｃ野生種マウス（ＭＨＣハプロタイプｄ）とをそれぞれＣ５７ＢＬ／６野生型マウス（ＭＨＣハプロタイプｂ）の胸腺細胞（２０×１０６/マウス）で免疫し、抗アロＭＨＣ抗体の産生量をフローサイトメーターを用いて測定した（ｎ＝６、比較対照として未処理群：ｎ＝３）。
　同種ＭＨＣ抗原の免疫は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの胸腺を摘出、ディッシュで胸腺をすりつぶし、ＡＣＫ ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA-2Na, and PBS, pH 7.4)で赤血球を除去、胸腺細胞を単離し１９９ｍｅｄｉｕｍで２０×１０６/ｍｌに希釈、１ｍｌをマウス腹腔内に投与し、１週間隔で２回免疫した。
　抗同種ＭＨＣ抗体（抗ＭＨＣハプロタイプｂ抗体）の検出は、上記方法によりＣ５７ＢＬ／６野生型マウスの胸腺細胞を単離、ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙ（ＦＣＭ）ｍｅｄｉｕｍ(PBS containing 0.1% BSA and 0.1% sodium azide)で１０×１０６/ｍｌとした。１×１０６ｃｅｌｌに対し、被検血漿１０μｌを添加して４℃で1時間インキュベートした。二次抗体としてａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＭもしくはＩｇＧ１，２ａ／ｂ，３－ｂｉｏｔｉｎを１０μｌ添加し、４℃で３０分インキュベートした。さらにｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥを添加、４℃で１５分インキュベートし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析、ｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）を抗体量とした。
　その結果を図４に示す。同図中、（ａ）はＩｇＧ１、（ｂ）はＩｇＧ２ａ/ｂ、（ｃ）はＩｇＧ３のそれぞれサブクラス別のＩｇＧの抗体量の変化を表しており、縦軸はｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）で抗体量を、横軸は経過期間を示している。
　未処理区ではいずれも抗体量に経時的な変化は認められなかったが、抗アロＩｇＧ型抗体の産生はノックアウトマウス及び野生型マウスともに正常に認められた。また、各サブクラス間でのクラススイッチにも差は認められなかった。
　（実施例３）
　ＮＫＴ細胞とＢ-１細胞との間のシグナル伝達を抗ＣＤ１ｄ抗体で阻害することにより抗血液型抗体の産生を抑制できるか否かを解析するため、Ｂａｌｂ/ｃ野生型マウスに抗ＣＤ１ｄ抗体（rat anti-mouse CD1d monoclonal antibody、clone:1B1）をマウス１匹当たり４５０μｇ腹腔内投与した（テストマウス、ｎ＝３）。また、同様にrat IgG2b抗体（isotype control)をマウス１匹当たり４５０μｇ腹腔内投与した（対照マウス、ｎ＝３）。
　２４時間後、これらマウスをそれぞれヒトＡ型赤血球で１週間隔で２回免疫し、抗血液型抗体の産生を前述のごとく、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
　その結果を図５、図６に示す。
　図５のグラフは抗ＡＩｇＭ抗体の抗体量の変化を表しており、（ａ）は免疫前、（ｂ）は免疫６週間後である。グラフの縦軸は抗体量を、横軸は添加血清の希釈倍数を示している。
　（ａ）のグラフに示されるように、免疫前ではテストマウスと対照マウスとで抗ＡＩｇＭ自然抗体の抗体量に差は認められなかった。しかし、（ｂ）のグラフに示されるように、対照マウスでは、免疫後に抗ＡＩｇＭ抗体の抗体量の増加が認められたのに対し、テストマウスでは、免疫の前後で抗ＡＩｇＭ抗体の抗体量にほとんど変化は認められなかった。
　一方、図６のグラフは抗ＡＩｇＧ抗体の抗体量の変化を表しており、（ａ）は免疫前、（ｂ）は免疫６週間後である。グラフの縦軸は図５と同様に抗体量を、横軸は添加血清の希釈倍数を示している。
　同図の各グラフに示されるように、対照マウスでは抗ＡＩｇＧ抗体が免疫後に増加（産生）し、クラススイッチが認められたのに対し、テストマウスでは免疫後にも抗ＡＩｇＧ抗体は増加（産生）せず、クラススイッチは認められなかった。
　（実施例４）
　ヒトの場合においても上述したマウスの場合と同様の効果が得られることを確認するため、ヒトリンパ球キメラマウスを用いて試験を行った。
　ヒトリンパ球キメラマウスは、重度複合免疫不全マウス（NOD.Cg-Prkdcscid　Il2rgtm1Sug/Jic；財団法人 実験動物中央研究所製）を購入し、この重度複合免疫不全マウスに、Ｏ型ヒト健常ボランティアから採取した末梢血リンパ球をマウス１匹当たり２０×１０６個腹腔内投与して作製した。
　リンパ球投与６日後に、抗ＣＤ１ｄ抗体（mouse anti-human CD1d monoclonal antibody、clone:CD1d42）をマウス１匹当たり５００μｇ腹腔内投与した（テストマウス、ｎ＝３）。また同様に、mouse IgG1抗体（isotype control clone:107.3)をマウス１匹当たり５００μｇ腹腔内投与した（対照マウス、ｎ＝４）。なお、本実験ではヒトを対象としているため、ヒトＣＤ１ｄ分子に特異的なモノクローナル抗体を作製して使用した。
　リンパ球投与７日後に、ヒトＡ型赤血球で免疫した（マウス１匹当たり８×１０８個）。そして、リンパ球投与２１日後に、各マウスから脾臓を採取し、脾臓内ヒトＣＤ１９＋Ｂ細胞中の抗Ａ型レセプター表出Ｂ細胞の存在比率をフローサイトメーターで測定した。その結果を図７に示す。
　図７は、ヒトリンパ球キメラマウスの脾臓中における、ヒトＣＤ１９＋Ｂ細胞中の抗Ａ型レセプター表出Ｂ細胞の存在比率を表している。同図中、黒丸は各固体の値、白丸はその平均値である。
　同図に示すように、抗ＣＤ１ｄ抗体を投与したテストマウスの脾臓中におけるＡ型抗原を認識するヒトＢ細胞は、コントロール抗体を投与した対照マウスの脾臓中と比べ、有意に存在比率が低下していた。すなわち、抗ＣＤ１ｄ抗体は、ヒトＢ細胞の血液型抗原に対する応答についても特異的かつ著明に抑制することが確認された。
　マウスやヒト等の臓器移植や異種移植の他、自己免疫疾患の発生抑制などにも利用できる。
１　ＮＫＴ細胞
２　Ｂ-１細胞
３　抗ＣＤ１ｄ抗体
４　ＣＤ１ｄ分子
５　糖鎖抗原
６　抗原レセプター
７　ｉＴＣＲ
８　抗体

Claims (8)

  1. 　ＮＫＴ細胞とＢ細胞との間のシグナル伝達を阻害して抗体の産生を抑制する抗体性拒絶反応抑制剤であって、
    　抗ＣＤ１ｄ抗体を含む抗体性拒絶反応抑制剤。
  2. 　請求項１に記載の抗体性拒絶反応抑制剤であって、
    　前記Ｂ細胞がＢ-１細胞を含む抗体性拒絶反応抑制剤。
  3. 　請求項１又は請求項２に記載の抗体性拒絶反応抑制剤であって、
    　産生が抑制される前記抗体に糖鎖抗原に対する抗体が含まれる抗体性拒絶反応抑制剤。
  4. 　請求項３に記載の抗体性拒絶反応抑制剤であって、
    　前記糖鎖抗原が血液型糖鎖抗原を含む抗体性拒絶反応抑制剤。
  5. 　請求項４に記載の抗体性拒絶反応抑制剤であって、
    　産生が抑制される前記抗体にペプチド抗原に対する抗体が含まれない抗体性拒絶反応抑制剤。
  6. 　請求項１に記載の抗体性拒絶反応抑制剤であって、
    　前記抗ＣＤ１ｄ抗体がモノクローナル抗体である抗体性拒絶反応抑制剤。
  7. 　請求項６に記載の抗体性拒絶反応抑制剤であって、
    　前記抗ＣＤ１ｄ抗体がヒト型抗体である抗体性拒絶反応抑制剤。
  8. 　抗体性拒絶反応抑制剤のスクリーニング方法であって、
    　マウスの腹腔内に対象成分を投与してテストマウスを得るとともに、他のマウスの腹腔内に抑制すべき抗体成分を投与して対照マウスを得る工程と、
    　前記テストマウス及び前記対照マウスのそれぞれを赤血球で免疫し、抗血液型抗体の産生を測定する工程と、
    を含む抗体性拒絶反応抑制剤のスクリーニング方法。
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