WO2010120005A1 - 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출된 항충치용 감초추출물 - Google Patents

감초로부터 항균물질을 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출된 항충치용 감초추출물 Download PDF

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solvent
licorice
extracted
methanol
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PCT/KR2009/001970
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김형준
심재현
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주식회사 닥터 앤 푸드
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting an antimicrobial substance from licorice and to an anti-cavity licorice extract extracted by the above method, more specifically, to extract the active ingredient by dipping the dried licorice root powder in a mixed solvent of ethanol and butanol
  • the solvent was removed from the filtrate, and the solvent was removed.
  • the solvent was removed in methanol, extracted repeatedly with ethyl acetate, the solvent was removed again, and the solvent was removed.
  • the ethyl acetate extract was dissolved in methanol, and extracted with n-hexane.
  • the present invention relates to a method for extracting an antimicrobial substance from licorice, which can be obtained by extracting a fungal substance and mixing the same in an anti-cavities composition to obtain an excellent effect on the prevention and treatment of tooth decay and the anti-cavities licorice extract extracted by the above method.
  • tooth decay means worm-eaten teeth, which means that the hard tissue of the tooth is eroded like a worm eats, and it is also called dental caries.
  • dentin caries If it further progresses to dentin, it is called carious second degree, that is, dentin caries.
  • dentinal tubule in the dentin, and according to this, the progress is quick and pitted, the cavity is easy to be formed, and the food waste is grotesque, which promotes the progression more quickly and gives a rotten smell.
  • the dentin has branches of the pulp, so painful contact with cold air or water.
  • dental disease can not be natural healing, if left untreated it will cause pulpitis and severe pain.
  • compositions for preventing and treating tooth decay have been developed and applied.However, synthetic chemicals are mainly used to harm the human body. Not only there is a risk of causing the disease, as well as the materials extracted from natural materials had a problem that the caries prevention and treatment effect is not satisfactory.
  • Another object of the present invention to provide a method for extracting the antimicrobial material from licorice for obtaining the licorice extract of the above object.
  • the dried licorice root powder is immersed in a mixed solvent of ethanol and butanol to extract the active ingredient and filtered, and the solvent is filtered from the filtered extract.
  • the solvent-free extract was dissolved in methanol, extracted repeatedly with ethyl acetate, the solvent was removed again, and the solvent-free ethyl acetate extract was dissolved in methanol and repeatedly extracted with n-hexane to remove the extract.
  • 50% by volume of water was added to the methanol layer, extracted with chloroform, and separated by silica gel column to obtain a fraction. TLC was confirmed by integrating the similar Rf value into 8 fractions. Extraction of antimicrobial material from licorice by antifraction method Mixing with the composition for obtaining a good effect for the prevention and treatment of caries.
  • the anti-cavities licorice extract according to the present invention is harmless to the human body and specifically acts only on the pathogen causing tooth decay and was excellent in caries prevention and treatment.
  • FIG. 5 and 6 are graphs showing the liquid chromatography results of the second and third fractions showing low MIC values in the antimicrobial experiment of Experimental Example 1.
  • FIG. 5 and 6 are graphs showing the liquid chromatography results of the second and third fractions showing low MIC values in the antimicrobial experiment of Experimental Example 1.
  • Method for extracting the antimicrobial substance from licorice is to immerse the dried licorice root powder in a mixed solvent of ethanol and butanol to extract the active ingredient and to filter, remove the solvent from the filtered extract, and then extract the solvent removed Was dissolved in methanol, extracted repeatedly with ethyl acetate, the solvent was removed again, and the removed ethyl acetate extract was dissolved in methanol and repeatedly extracted with n-hexane to remove the extract, followed by 50% by volume of water in the remaining methanol layer. The mixture was extracted with chloroform and separated by a silica gel column to obtain a fraction. TLC was confirmed by incorporating similar Rf values into eight fractions and characterized by obtaining two fractions having excellent antimicrobial properties through antimicrobial experiments.
  • the anti-cavity licorice extract according to the present invention is the dried licorice root powder immersed in a mixed solvent of ethanol and butanol to extract the active ingredient and filtered, the solvent is removed from the filtered extract, and then the solvent is removed extract Dissolve in methanol, extract repeatedly with ethyl acetate, remove solvent again, dissolve the solvent, remove ethyl acetate extract in methanol and extract repeatedly with n-hexane, remove 50% by volume of water in the remaining methanol layer.
  • Licorice used in the present invention is a medicinal plant as a perennial herb of the dicotyledonous plant Rosaceae legume, the root is reddish brown deep into the ground, the stems are gathered and grow straight about 1m. In addition, white hairs are dense and appear gray-white and preemption is scattered. The leaves are shifted and oddly littered leaf. Small leaves 7-17 each, egg-shaped, pointed end. The leaves are 2 ⁇ 5cm long, l ⁇ 3cm butterfly, with white hairs and dots on both sides, and no sawtooth.
  • the pod is elongated like a line and bent like a bow, and contains 6 to 8 seeds.
  • the root is sweet, so use it as a sweetener or herbal medicine.
  • Licorice is widely used as an indispensable medicinal herb among various medicines, and it has a unique weakness to sweeten bitter medicine and make it easy to eat. It is known to relieve all medicines, cough and cough and neutralize all medicines. Consequences of licorice govern the heat and morals of chapter 5 and 6, bringing the physiology of the eyes, nose, mouth, ears and faeces to normal, communicating all blood vessels, strengthening muscles and bones, improving nutrition and all medicines. Detoxify the toxicity of 72 stones and 1200 kinds of herbal medicine to harmonize with each other to make the drug appear well, so the nickname is described as a national.
  • Licorice is effective in solving various poisons with ginger and jujube above all, and antagonizes various polar and toxic drugs to treat drug poisoning caused by extreme medicine or poison, and neutralize and detoxify poison caused by bacteria. It acts to detoxify and alleviate the poison of all drugs.
  • licorice has the effect of adjusting the adrenal cortex hormones, so as to solve the urgent symptoms of muscle pain to relax the tension or nerves to act, anti-allergic, gastric ulcer, duodenal ulcers, Decholesterol action prevents atherosclerosis and detoxifies poisons, which not only enhances the function of the liver, but also pleurisy and pulmonary tuberculosis, anterior pituitary insufficiency, Edison's disease, epidemic hepatitis, bronchial asthma and dermatitis. Eczema, acne, freckles, etc.), schooling, frostbite, and hands and feet are known to have a distinct therapeutic effect.
  • natural substances exhibiting antimicrobial activity are polyphenol-based, but have a non-polar property, but in part have a hydroxyl group (-OH), and often have a polar property.
  • Such materials can be effectively extracted by mixing ethanol and butanol. Unlike conventional boiling methods and using only ethanol, the extraction solvent mixed with ethanol and butanol can effectively extract substances that are not easily extracted from plants in general.
  • Licorice root is made of powder to increase the surface area, that is, increase the area in contact with the extraction solvent, so that extraction can be performed efficiently. Since ethanol can elute both polar and non-polar substances, extraction of non-polar substances It is possible to elute the polar substances that can hinder the first and then elute the non-polar substances in turn. Butanol can more effectively elute the non-polar substances, thereby extracting active substances that may be restricted to extraction with ethanol alone.
  • the mixing solvent of ethanol and butanol is effective to mix in a ratio of 3 to 5: 1 by weight ratio, and when the mixing ratio of ethanol is less than 3 times of butanol, there is a disadvantage that the extraction effect of the polar substance is not satisfactory, and 5 times If it exceeds, there is a problem that the extraction of the non-polar material is not easy.
  • the mixed solvent is preferably used 2 to 10 times the weight of licorice root powder, when the amount of the mixed solvent is less than 2 times the weight of licorice root powder has the disadvantage that the extraction of the antimicrobial material is not easily made. If the amount exceeds 10 times, there is a problem that the economic efficiency is lowered, extraction at room temperature may be denatured when boiling, and the extraction equipment is complicated, the filter paper is a filter paper commonly used in the technical field to which the present invention belongs All can be used, and the present invention used Whatman filter paper. Extraction time is effective for 10 to 48 hours, extraction is less than 10 hours if the extraction is not complete, there is a possibility that the extract may be denatured by the solvent itself when more than 48 hours is not preferable. .
  • the filtrate was filtered to remove the solvent using an apparatus, preferably a vacuum evaporator, which is commonly used in the art.
  • methanol dissolves well as well as polar and non-polar substances and mixes well with water, and the use of 20% methanol, ie, methanol containing 80% water, is not expected to be active. Since it is dissolved in methanol and does not dissolve well when water is added, it is dissolved in a solvent such as EtOAc for easy extraction. Using ethyl acetate is inexpensive, inexpensive, low toxicity and easy to remove.
  • the EtOAc extract was dissolved again with 80% methanol, extracted five times with n-hexane (n-Hexane) to remove the extract, and then 50% by volume of water was added to the remaining methanol layer, followed by chloroform. Extracted 5 times.
  • the material extracted in the same manner as above was separated by a silica gel column. That is, 150 g of silica gel was filled into a glass column tube having a diameter of 7 cm, and then, the extract was placed at a thickness of 5 mm and separated by flowing 3 L of a developing solvent.
  • a developing solvent a mixture of petroleum ether and acetone (Petroleum ether-acetone) was used.
  • Licorice extract obtained by the above method can be added to the anti-cavities composition to obtain a composition comprising the licorice extract as an active ingredient.
  • licorice extract is preferably used 1 to 30% by weight based on the total weight of the composition in terms of anti-cavities prevention and effects.
  • the unsaturated fatty acid oleic acid shows an excellent anti-cartobacterial effect as MIC is 8 ⁇ g / ml in the antimicrobial experiment of S.mutans, the main caries-inducing bacteria compared to other fatty acids, the present invention
  • the licorice extract obtained in the E. coli showed specific inhibitory ability against Streptococcus mutans and also showed inhibitory effect against other common oral bacteria, but its inhibitory ability was significantly lower than that of mutans, and oleic acid also showed specific inhibition against mutans. It shows the ability, but the effect is not great for other bacteria.
  • Streptococcus mitis Streptococcus salivarius ( Streptococcus salivarius ) is a bacterium that exists in the oral cavity and serves to prevent invasion of other pathogenic bacteria. If these bacteria are lost due to antibiotics, pathogenic bacteria can invade and cause illness. Therefore, it is not desirable to remove common bacteria that do not cause disease for the removal of caries.
  • Licorice extract is weaker than Streptococcus mutans, but kills common bacteria, but oleic acid has little inhibitory ability against these bacteria at low concentrations.
  • the drawback of oleic acid is that, on its own, the inhibitory ability is markedly reduced when high concentrations of Streptococcus mutans are present.
  • the compounding ratio of licorice extract and oleic acid can be adjusted through repeated experiments according to the type and amount of caries-inducing bacteria and other types and amounts of oral bacteria.
  • the filtered extract was removed using a vacuum evaporator to remove the solvent, and then the extract was dissolved in 20% methanol and extracted five times with ethyl acetate (EtOAc). Was removed.
  • EtOAc extract was then dissolved again with 80% methanol, extracted five times with n-hexane (n-Hexane) to remove the extract, and then 50 vol% water was added to the remaining methanol layer and chloroform Extracted 5 times.
  • the extract obtained above was placed on a thickness of 5 mm and separated by flowing 3 L of a developing solvent.
  • a developing solvent a mixture of petroleum ether and acetone (Petroleum ether-acetone) was used.
  • 500 ml of a developing solvent having a mixing ratio of 6: 1 was used, 500 ml of a developing solvent having a mixing ratio of 5: 1, and a mixing ratio of 4 : 500 ml of developing solvent for 1, 500 ml of developing solvent for mixing ratio 3: 1, 500 ml of developing solvent for mixing ratio 2: 1, and finally, 500 ml of developing solvent having mixing ratio of 1: 1, separated using 35 Fractions were obtained. Thirty-five fractions were identified by TLC using petroleum ether-acetone (3: 1) as a developing solvent, and those having similar Rf values were combined into eight fractions to obtain licorice extract.
  • Antibacterial experiment was performed on licorice extract divided into eight fractions obtained in Example 1.
  • 150 ⁇ l of medium containing 10 6 colony-forming units / ml of mutans was added to 150 ⁇ l of 8 serially diluted antimicrobial substances.
  • the total volume used for the experiment was 300 ⁇ l, which included 3 ⁇ l (1% v / v) of methanol.
  • a well containing 3 ⁇ l of methanol was used as negative control.
  • the concentration of the antimicrobial substance was determined to be MIC at an optical density (OD) of 0.15 or less due to bacterial growth inhibition.
  • FIG. 1 A graph showing the OD value according to the concentration of licorice extract measured above is shown in FIG. 1, and 96-well plate photographs are taken in FIG. 2.
  • the MIC of the second (B) fraction and the third (C) fraction was determined to be 5 ⁇ g / ml and fractions C, D, and E were 10 ⁇ g / ml, but the remaining fractions were MIC in this experiment. The value was not determined, and negative control wells (A-12, B-12, E-12, and F-12) added with 3 ⁇ g of methanol showed little effect on bacterial growth as shown in FIG. 2.
  • Antimicrobial experiments were conducted on unsaturated fatty acids oleic acid, linoleic acid, palmitic acid, oleanolic acid and xylitol, respectively. All samples were purchased from Tokyo Chemical Industry corporation. Since antimicrobial experiments on licorice extracts were conducted by mass ratio, all experiments on these materials were unified by mass ratio. The initial concentration was tested using a 2-fold serial dilution method starting at 500 ⁇ g / ml, and the experimental results are shown in FIG. 3.
  • MIC of oleic acid was 7.8 ⁇ g / ml
  • linoleic acid was 15.6 ⁇ g / ml
  • olenoic acid was 31.3 ⁇ g / ml.
  • the reason why the OD value increased at 500 ⁇ g / ml was because samples were precipitated due to their low solubility in water. That is, some of the wells with a high OD value at 500 ⁇ g / ml were collected and observed under a microscope, and the pH was measured for each well. . In this experiment, it was confirmed that xylitol showed almost no antimicrobial effect.
  • Antimicrobial experiments were carried out for the mixture of licorice extract and oleic acid at a ratio of 3: 1, 1: 1, 1: 3 and the addition of 20% olenolic acid to the mixture in the same manner as in Experimental Example 1, and the results 4 is shown.
  • the liquid chromatography experiment was performed on the second and third fractions showing low MIC values, and the results are shown in FIGS. 5 and 6.
  • the second fraction has seven strong peaks and about ten weak peaks
  • the third fraction has two strong peaks, ten intermediate peaks, and approximately nine weak peaks. I could confirm it.

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Abstract

본 발명은 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출된 항충치용 감초추출물에 관한 것으로, 건조된 감초뿌리 분말을 에탄올과 부탄올의 혼합 용매에 침지하여 활성 성분을 추출하여 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 메탄올에 용해하고 에틸아세테이트로 반복 추출하고 다시 용매를 제거하고, 용매를 제거한 에틸 아세테이트 추출물을 메탄올에 용해하고 n-헥산으로 반복추출하여 추출물을 제거한 후, 남아 있는 메탄올층에 50부피%의 물을 가하여 클로로포롬으로 추출하고 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 Rf값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하고 항균실험을 통하여 항균성이 우수한 2개의 분획을 얻는 방법으로 감초로부터 항균물질을 추출하고 이를 항충치용 조성물에 혼합하여 충치 예방 및 치료에 우수한 효과를 얻을 수 있다.

Description

감초로부터 항균물질을 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출된 항충치용 감초추출물
본 발명은 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출된 항충치용 감초추출물에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 건조된 감초뿌리 분말을 에탄올과 부탄올의 혼합 용매에 침지하여 활성 성분을 추출하여 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 메탄올에 용해하고 에틸아세테이트로 반복 추출하고 다시 용매를 제거하고, 용매를 제거한 에틸 아세테이트 추출물을 메탄올에 용해하고 n-헥산으로 반복추출하여 추출물을 제거한 후, 남아 있는 메탄올층에 50부피%의 물을 가하여 클로로포롬으로 추출하고 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 Rf값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하고 항균실험을 통하여 항균성이 우수한 2개의 분획을 얻는 방법으로 감초로부터 항균물질을 추출하고 이를 항충치용 조성물에 혼합하여 충치 예방 및 치료에 우수한 효과를 얻을 수 있도록 하는 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법 및 상기 방법으로 추출된 항충치용 감초추출물에 관한 것이다.
일반적으로 충치는 벌레먹은 치아라는 뜻으로 벌레가 먹은 것처럼 치아의 경조직이 침식되어 결손하는 증세를 의미하는 것으로, 치과의학상 우식증이라고도 한다.
충치가 없는 사람은 매우 드물고, 평균 85.7%에 해당하는 사람들에게 충치가 있다. 미개인에게는 적고, 반대로 문명인에게 많으며, 또 야생동물에는 없는데 동물원에서 자라는 사육동물에는 있다.
충치의 원인에 대해서는 미국의 치과의사이며 세균학자인 W. D. 밀러의 연구를 바탕으로 한 화학세균설이 현재 일반적으로 인정되고 있다. 즉, 구강 내에 상주하는 세균의 발효작용에 의하여 치아에 부착된 음식찌꺼기의 당분이나 전분 등의 탄수화물이 분해되어 생기는 젖산이 치아의 경조직의 석회를 탈각시키며, 더욱이 유기성분은 단백질을 용해하는 다른 세균의 작용에 의해서 파괴된다는 설이다. 이 밖에 충치에 걸리기 쉬운 소질은 유전한다고 하며, 특히 치아의 발생기에 비타민이나 칼슘이 부족하여 법랑질의 발육불충분을 야기하거나, 당분이나 산성식품을 과도하게 섭취하거나, 당뇨병, 신장병과 여성에서는 임신도 그 원인이 되고 있다.
음식물의 찌꺼기가 부착하기 쉬운 위턱, 아래턱의 어금니의 표면에 있는 홈이나 쑥 들어간 곳이나 인접면 앞니의 사이 등이 발생하기 쉬운 부위이며, 우선 제1 표층에 있는 법랑질이 침식당한다. 이 단계를 우식 제1도, 즉 법랑질 우식이라고 하며, 지각신경이 없으므로 아프지 않으나 그 부분이 조잡하게 파괴되어 검게 변하게 된다.
그것이 더욱 진행하여 상아질까지 이르게 되면 우식 제2도, 즉 상아질 우식이라고 한다. 상아질에는 상아세관이 있고, 이것에 따라 진행이 빨라지고 움푹 패여 공동이 생기기 쉬우며, 음식찌꺼기 등이 괴기 쉽게 되어 더욱 진행을 빨리 촉진시키며 썩은 냄새를 나게 한다. 상아질에는 치수의 분지가 있으므로 찬 공기나 물에 접촉하면 통증이 있다.
일반적으로 치아질환은 자연치유가 될 수 없으므로 방치하면 그것은 곧 치수염을 일으키고 심한 통증을 느끼게 된다.
최근에는 식후의 구강위생의 철저함이 강조되고 있다. 플루오린의 치면 도포는 1969년 WHO 총회에서 그 추진이 결의되었으며, 현재는 치과병원에서 실시하고 있다. 즉, 맹출 직후의 유치 또는 영구치에 2% 플루오린화나트륨액 또는 8% 플루오린화주석액을 발라서 침으로 희석되지 않도록 30분 동안 그대로 방치한다. 이것은 충치의 원인이 되는 분해효소의 작용을 저지함으로써 예방목적을 달성하는 것이다.
최근 들어서는 충치를 예방 및 치료 하기 위한 조성물들이 많이 개발되어 적용되고 있지만 합성된 화학물질을 주로 사용하기 때문에 인체에 해를 끼칠 수가 있으며, 충치를 유발하는 병균에만 특이적으로 작용하지 못하여 병원성 세균이 침입하기 때문에 병을 일으킬 우려가 있을 뿐만 아니라 천연물질에서 추출된 물질들은 충치 예방 및 치료 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 인체에 해가 없으며 충치를 유발하는 병균에만 특이적으로 작용하고 충치 예방 및 치료 효과가 우수한 항충치용 감초추출물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 목적의 감초추출물을 얻기 위한 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적들 뿐만 아니라 용이하게 표출될 수 있는 또 다른 목적들을 달성하기 위하여 본 발명에서는 건조된 감초뿌리 분말을 에탄올과 부탄올의 혼합 용매에 침지하여 활성 성분을 추출하여 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 메탄올에 용해하고 에틸아세테이트로 반복 추출하고 다시 용매를 제거하고, 용매를 제거한 에틸 아세테이트 추출물을 메탄올에 용해하고 n-헥산으로 반복추출하여 추출물을 제거한 후, 남아 있는 메탄올층에 50부피%의 물을 가하여 클로로포롬으로 추출하고 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 Rf값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하고 항균실험을 통하여 항균성이 우수한 2개의 분획을 얻는 방법으로 감초로부터 항균물질을 추출하고 이를 항충치용 조성물에 혼합하여 충치 예방 및 치료에 우수한 효과를 얻을 수 있었다.
본 발명에 따른 항충치용 감초추출물은 인체에 해가 없으며 충치를 유발하는 병균에만 특이적으로 작용하고 충치 예방 및 치료 효과가 우수하였다.
도 1은 실험예 1의 항균실험에서 MIC가 낮은 값을 보이는 2번째, 3번째 분획의 농도에 따른 OD값을 나타내는 그래프이고,
도 2는 실험예 1의 항균실험에 따른 96-웰 플레이트 사진이며,
도 3은 지방산과 올레놀산의 항균실험 결과를 나타내는 그래프이고,
도 4는 감초추출물과 지방산 혼합물의 항균실험 결과를 나타내는 그래프로서, A는 분획 2 + 3 : 올레산 = 3 : 1, B는 분획 2+3 : 올레산 = 2 : 1, C는 분획 2 + 3 : 올레산 = 1 : 1, D는 분획 2 + 3 : 올레산 = 1 : 2, E는 분획 2 + 3 : 올레산 = 1 : 3, F는 A + 20% 올레놀산, G는 B + 20% 올레놀산, H는 C + 20% 올레놀산에 대한 결과를 나타내는 것이며,
도 5 및 도 6은 실험예 1의 항균실험에서 MIC가 낮은 값을 보이는 2번째, 3번째 분획의 액체크로마토그래피 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따른 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법은 건조된 감초뿌리 분말을 에탄올과 부탄올의 혼합 용매에 침지하여 활성 성분을 추출하여 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 메탄올에 용해하고 에틸아세테이트로 반복 추출하고 다시 용매를 제거하고, 용매를 제거한 에틸 아세테이트 추출물을 메탄올에 용해하고 n-헥산으로 반복추출하여 추출물을 제거한 후, 남아 있는 메탄올층에 50부피%의 물을 가하여 클로로포롬으로 추출하고 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 Rf값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하고 항균실험을 통하여 항균성이 우수한 2개의 분획을 얻는 것으로 특징지어진다.
또한, 본 발명에 따른 항충치용 감초추출물은 건조된 감초뿌리 분말을 에탄올과 부탄올의 혼합 용매에 침지하여 활성 성분을 추출하여 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 메탄올에 용해하고 에틸아세테이트로 반복 추출하고 다시 용매를 제거하고, 용매를 제거한 에틸 아세테이트 추출물을 메탄올에 용해하고 n-헥산으로 반복추출하여 추출물을 제거한 후, 남아 있는 메탄올층에 50부피%의 물을 가하여 클로로포롬으로 추출하고 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 Rf값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하고 항균실험을 통하여 항균성이 우수한 2개의 분획을 얻는 방법으로 감초추출물을 얻고 이를 항충치용 조성물에 첨가하는 것으로 특징지어진다.
본 발명에서 사용되는 감초는 쌍떡잎식물 장미목 콩과의 여러해살이풀로 약용식물이며, 뿌리는 적갈색으로 땅속 깊이 들어가고 줄기는 모가 지며 1m 정도 곧게 자란다. 또한, 흰털이 밀생하여 회백색으로 보이며 선점이 흩어져 있다. 잎은 어긋나고 홀수깃꼴겹잎이다. 작은 잎은 7 ∼ 17개씩이고 달걀 모양이며 끝이 뾰족하다. 작은 잎의 길이는 2 ∼ 5cm, 나비 l ∼ 3cm로 양면에 흰털과 선점이 있으며 톱니는 없다.
꽃은 7 ∼ 8월에 피는데 길이 1.4 ∼ 2.5cm로 보라색이며, 총상꽃차례로 잎겨드랑이에 달린다. 꼬투리는 선처럼 가늘고 긴 모양으로 활처럼 굽으며 신장형의 종자가 6 ∼ 8개씩 들어 있다. 뿌리는 단맛이 나서 감미료, 한약재로 사용한다.
약방에 감초라는 말이 있듯이 감초는 여러 약재 가운데 빠져서는 안 되는 약재로 광범위하게 사용되고 있으며, 쓴 약을 달게하여 먹기 좋게 할뿐만 아니라 독특한 약성을 가지고 있다. 모든 약의 독성을 풀어 주고 기침과 담을 삭이며 모든 약을 중화하는 것으로 알려져 있다. 동의보감에는 감초는 5장 6부의 한열과 사기를 다스리며 눈, 코, 입, 귀와 대소변의 생리를 정상으로 되게 하고, 모든 혈맥을 소통시키며, 근육과 뼈를 튼튼하게 하고 영양 상태를 좋게 하고 또 모든 약의 독성을 해독하고 72가지 석약과 1200가지 초약을 서로 조화하여 약효를 잘 나타나게 하므로 별명을 국노라 한다고 기재되어 있다.
감초는 무엇보다도 생강, 대추와 함께 갖가지 독을 푸는데 효과가 있고, 여러 가지 극성약이나 독성약에 대한 길항작용을 하여 극약이나 독약으로 인한 약물중독도 치료하고, 세균으로 인한 독에도 중화작용 및 해독작용을 하며, 모든 약의 독을 풀어 중화 및 완화시키는 작용을 한다. 또한, 감초는 부신피질호르몬처럼 조정작용도 있어 급박한 증상을 푸는 것으로 근육의 긴장으로 인한 동통이나 신경의 긴장을 풀어주는 작용을 하며, 항알러지 작용을 하고, 위궤양, 십이지장궤양에도 효과가 있으며, 탈콜레스테롤 작용이 있어 동맥경화를 방지하고, 독물질을 해독하는 작용을 하므로 간장의 기능을 강화시킬 뿐만 아니라 늑막염과 폐결핵, 하수체전엽기능부전증, 에디슨병, 유행성 간염, 기관지천식, 피부염(두드러기, 습진, 여드름, 주근깨 등), 학질, 동상, 손발이 튼데 등 여러 질병에 뚜렷한 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 향균작용을 보이는 천연물질은 폴리페놀계열로 비극성인 성질을 가지지만 부분적으로 하이드록실기(-OH)를 가지고 있어서 극성인 성질도 동시에 가지고 있는 경우가 많다. 이러한 물질은 에탄올과 부탄올을 혼합하여 효과적으로 추출할 수 있다. 기존의 끓이는 방법과 에탄올만 사용한 방법과는 달리 에탄올과 부탄올을 혼합한 추출용매는 일반적으로 식물에서 잘 추출되지 않는 물질을 효과적으로 추출할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 건조된 감초뿌리를 분말로 만들어서 에탄올 : 부탄올 = 3 ∼ 5 : 1의 비율로 혼합된 혼합용매에 투입하여 10 ∼ 48시간 동안 상온에서 추출하고 추출된 물질을 여과지를 이용하여 여과하였다.
감초뿌리를 분말로 만든 것은 표면적을 넓히는 효과, 즉 추출 용매와 접촉하는 면적을 높임으로써 추출이 효율적으로 이루어 지도록 하기 위한 것이고, 에탄올은 극성 물질과 비극성 물질을 모두 용출시킬 수 있기 때문에 비극성 물질의 추출을 방해할 수 있는 극성물질을 먼저 용출시키고 차례로 비극성 물질을 또 용출시킬 수 있도록 하며, 부탄올은 비극성 물질을 좀 더 효과적으로 용출시킬 수 있어 에탄올만으로 추출이 제한적일 수 있는 활성물질을 추출 가능하게 한다.
에탄올과 부탄올의 혼합 용매는 중량비로 3 ∼ 5 : 1의 비율로 혼합하는 것이 효과적이며, 에탄올의 혼합비율이 부탄올의 3배량 미만일 경우에는 극성 물질의 추출 효과가 만족스럽지 못한 단점이 있고, 5배량을 초과할 경우에는 비극성 물질의 추출이 용이하게 이루어지지 않는 문제점이 있다.
혼합 용매는 감초뿌리 분말 중량에 대하여 2 ∼ 10배량을 사용하는 것이 바람직하며, 혼합 용매의 사용량이 감초뿌리 분말 중량에 대하여 2배량 미만일 경우에는 항균물질의 추출이 용이하게 이루어지지 않는 단점이 있고, 10배량을 초과할 경우에는 경제성이 저하되는 문제점이 있으며, 상온에서 추출하는 것은 끓일 경우 변성이 될 수 있고 추출장비가 복잡해지기 때문이고, 여과지는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 여과지가 모두 사용 가능하며, 본 발명에서는 와트만 여과지를 사용하였다. 추출 시간은 10 ∼ 48시간이 효과적이고, 10시간 미만 동안 추출할 경우에는 추출이 완전히 이루어지지 않는 단점이 있으며, 48시간을 초과할 경우에는 용매 자체에 의해 추출물이 변성될 가능성이 있어 바람직하지 못하다.
상기와 같이 여과된 추출액을 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 장치, 바람직하게는 진공회전농축기(evaporator)를 이용하여 용매를 제거하였다.
그 다음에 용매가 제거된 추출액을 20% 메탄올(Methanol)로 용해하여 에틸 아세테이트(EtOAc)로 5회 반복해서 추출하고, 진공회전농축기를 이용하여 다시 용매를 제거하였다.
상기 단계에서 메탄올을 사용하는 것은 메탄올이 극성 뿐만 아니라 비극성 물질도 잘 용해하고 물과 잘 섞이기 때문이며, 20% 메탄올, 즉 물이 80% 포함된 메탄올을 사용하는 것은 활성이 있을 것으로 예상되는 물질이 메탄올에 용해되어 있다가 물이 첨가되면 잘 녹지 않기 때문에 EtOAc같은 용매에 용해되어 추출이 용이하게 이루어지며, 에틸 아세테이트를 사용하는 것은 물과 섞이지 않고 값이 싸고 독성이 적고 제거하기 쉽기 때문이다.
용매를 제거한 EtOAc 추출물을 다시 80% 메탄올을 이용하여 용해하고, n-헥산(n-Hexane)을 이용하여 5회 추출하여 추출물을 제거한 다음, 남아있는 메탄올층에 50부피%의 물을 첨가하고 클로로포름으로 5회 추출하였다.
상기 단계에서 80% 메탄올을 사용하는 것은 비극성물질을 더 잘 용해하기 위함이고, n-헥산은 아주 비극성인 물질을 다시 추출하기 위한 것이며, 아주 비극성인 물질을 제거함으로써 감초에서 추출된 화합물의 복잡성을 줄일 수 있다. 그리고 다시 물을 첨가하는 것은 극성인 물질의 용해도를 낮추기 위함이고 이렇게 해서 클로로포름으로 비극성 물질을 다시 효과적으로 추출하였다. 그러나, 클로로포름은 독성이 문제가 될 수 있기 때문에 매우 비극성인 물질을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 제거할 수도 있다.
상기와 같은 방법으로 추출한 물질을 실리카겔 컬럼으로 분리하였다. 즉, 실리카겔 150g을 직경 7cm인 유리 컬럼관에 충전한 후, 추출액을 5mm두께로 얹고 전개용매 3ℓ를 흘려서 분리하였다. 전개 용매로는 석유 에테르와 아세톤의 혼합물(Petroleum ether-acetone)을 사용하였으며, 초기에는 혼합 비율 6 : 1인 전개 용매 500㎖를 사용하고, 혼합 비율 5 : 1인 전개 용매 500㎖, 혼합 비율 4 : 1인 전개 용매 500㎖, 혼합 비율 3 : 1인 전개 용매 500㎖, 혼합 비율 2 : 1인 전개 용매 500㎖, 마지막에는 혼합 비율 1 : 1인 전개 용매 500㎖를 사용하는 방법으로 분리하여 35개의 분획을 얻었다. 35개의 분획을 전개용매로 석유 에테르 - 아세톤(3:1)을 사용하는 TLC로 확인하여 Rf 값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하고 항균실험을 통하여 항균성이 우수한 2개의 분획을 얻는 방법으로 감초로부터 항균물질을 추출하였다.
상기의 방법으로 얻은 감초 추출물을 항충치 조성물에 첨가하여 감초추출물을 유효 성분으로 하는 조성물을 얻을 수 있다. 이 때 감초 추출물은 전체 조성물 중량에 대하여 1 ∼ 30중량%를 사용하는 것이 항충치 예방 및 효과 측면에서 바람직하다.
한편, 불포화 지방산인 올레산(oleic acid)은 다른 지방산에 비해서 주된 충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄스(S.mutans)의 항균 실험에서 MIC가 8㎍/㎖일 정도로 뛰어난 항충치균 효과를 보이고, 본 발명에서 얻은 감초추추물은 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해서 특이적으로 억제능력을 보일 뿐만 아니라 다른 일반 구강세균에도 억제효과를 보이지만 뮤탄스균에 비해 그 억제능력이 현저히 떨어지며, 올레산도 뮤탄스균에 대해서 특이적인 억제능력을 보이지만 다른 세균에 대해서는 그 효과가 크지 않다.
구강에는 병을 일으키지 않는 일반세균들도 같이 존재한다. 특히, 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 사리바리우스(Streptococcus　 salivarius) 등은 구강 내에 존재하면서 다른 병원성을 가진 세균들의 침입을 막아주는 역할을 하는 세균들이다. 만약, 이들 세균들이 항생제 등으로 인하여 없어진다면 병원성을 가진 세균들이 침입하여 병을 일으킬 수 있다. 그러므로, 충치균 제거를 위해서 병을 일으키지 않는 일반세균들을 제거하는 것은 바람직하지 못하다. 감초추출물은 스트렙토코커스 뮤탄스에 비해서 약하기는 하지만 일반세균들도 죽이는 작용을 하지만 올레산은 적은 농도에서는 이러한 세균들에 대해 억제능력이 거의 없다. 그러나, 올레산의 단점은 단독으로는 스트렙토코커스 뮤탄스가 높은 농도로 존재할 때는 억제능력이 현저히 떨어진다.
따라서, 본 발명에서 얻은 감초추출물과 올레산을 효과적으로 배합함으로써 충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄스를 효과적으로 억제하고 유익한 일반 세균들에 대해서는 거의 영향을 주지 않는 효과를 발휘하게 되어 충치발생을 아주 효과적으로 억제할 수 있고, 인체에는 나쁜 영향을 거의 주지 않게 되는 효과를 얻을 수 있다.
감초추출물과 올레산의 배합비는 충치 유발 세균 종류 및 양, 기타 구강내 세균의 종류와 양에 따라 반복실험을 통하여 조절될 수 있다.
다음의 실시예 및 실험예는 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하는 것이지만, 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
건조된 감초뿌리를 분말로 만들어서 에탄올 : 부탄올 = 4 : 1의 비율로 혼합된 혼합용매에 20중량%의 양으로 투입하여 24시간 동안 상온에서 추출하고 추출된 물질을 와트만 여과지를 이용하여 여과하였다.
여과된 추출액을 진공회전농축기(evaporator)를 이용하여 용매를 제거한 다음, 추출액을 20% 메탄올(Methanol)로 용해하여 에틸 아세테이트(EtOAc)로 5회 반복해서 추출하고, 진공회전농축기를 이용하여 다시 용매를 제거하였다.
그 다음에 EtOAc 추출물을 다시 80% 메탄올을 이용하여 용해하고, n-헥산(n-Hexane)을 이용하여 5회 추출하여 추출물을 제거한 다음, 남아있는 메탄올층에 50부피%의 물을 첨가하고 클로로포름으로 5회 추출하였다.
실리카겔 150g을 직경 7cm인 유리 컬럼관에 충전한 후, 상기에서 얻은 추출액을 5mm 두께로 얹고 전개용매 3ℓ를 흘려서 분리하였다. 전개 용매로는 석유 에테르와 아세톤의 혼합물(Petroleum ether-acetone)을 사용하였으며, 초기에는 혼합 비율 6 : 1인 전개 용매 500㎖를 사용하고, 혼합 비율 5 : 1인 전개 용매 500㎖, 혼합 비율 4 : 1인 전개 용매 500㎖, 혼합 비율 3 : 1인 전개 용매 500㎖, 혼합 비율 2 : 1인 전개 용매 500㎖, 마지막에는 혼합 비율 1 : 1인 전개 용매 500㎖를 사용하는 방법으로 분리하여 35개의 분획을 얻었다. 35개의 분획을 전개용매로 석유 에테르 - 아세톤(3:1)을 사용하는 TLC로 확인하여 Rf 값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하여 감초추출물을 얻었다.
실험예 1
실시예 1에서 얻은 8개의 분획으로 구분된 감초추출물에 대한 항균실험을 행하였다.
즉, 8개의 크로마토그래피 분획에 대한 in vitro 향균 활성 실험은 충치유발균인 스트렙토코코스 뮤탄스균을 이용하여 National Committee of Clinical Laboratory Standards(NCCLS)가 추천하는 Minimum inhibitory concentration(MIC) protocol을 이용하였다. 8개의 분획을 메탄올에 용해하여 모두 10mg/㎖ 농도가 되게 하였고, Microtest 96 microtiter plate를 이용하여 초기 농도 10㎍/㎖로 시작하여 2배 연속 희석법으로 연속적인 희석을 하였다. 뮤탄스균은 Trypicase soy broth(TSB) 배지에서 37℃, 호기적 조건(aerobic conditions)으로 배양되었다. 106 colony-forming units/㎖ 농도의 뮤탄스균이 포함된 150㎕의 배지를 8개의 연속 희석된 항균 물질 150㎕에 첨가하였다. 실험에 사용된 총 부피는 300㎕이고, 여기에 메탄올은 3㎕(1% v/v)가 포함되었다. 메탄올 3㎕가 포함된 well은 negative control로 사용되었다. MIC는 37℃에서 16시간 이상 경과 후, 박테리아의 성장 억제로 인하여 OD(optical density)가 0.15 이하로 측정되는 부분의 항균물질 농도를 MIC로 정하였다.
상기에서 측정된 감초 추출물 농도에 따른 OD값을 나타내는 그래프를 도 1에 도시하였고, 96-웰 플레이트 사진을 촬영하여 도 2에 도시하였다.
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이 2번째(B) 분획과 3번째(C) 분획의 MIC는 5㎍/㎖, 분획 C, D, E는 10㎍/㎖으로 결정되었지만 나머지 분획은 이 실험에서는 MIC 값이 결정되지 못했으며, 도 2에 도시된 바와 같이 메탄올 3㎍이 첨가된 negative control well(A-12, B-12, E-12, F-12)은 박테리아 성장에 거의 영향을 주지 않았다.
실험예 2
불포화 지방산인 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 올레놀산(oleanolic acid) 및 자일리톨(xylitol)에 대하여 각각 항균실험을 진행하였다. 시료들은 모두 Tokyo Chemical Industry corporation에서 구입하였다. 감초추출물에 대한 항균실험을 질량비로 계산하여 진행하였기 때문에 이 물질들에 대한 실험도 모두 질량비로 통일하였다. 초기 농도를 500㎍/㎖로 시작하여 2배 연속 희석방법을 이용하여 실험하였으며, 실험 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이 올레산의 MIC는 7.8㎍/㎖, 리놀레산은 15.6㎍/㎖, 올레놀산은 31.3㎍/㎖를 나타내었다. 500㎍/㎖에서 OD값이 증가한 이유는 시료들이 물에 대한 용해도가 낮아서 석출되어 나왔기 때문이다. 즉, 500㎍/㎖에서 OD값이 높게 나온 웰(well)의 일부를 채취하여 현미경으로 관찰하고, 또 각 웰에 대하여 pH를 측정한 결과, 부유물은 세균이 아닌 항균실험 물질들의 부유물로 확인되었다. 이 실험에서 자일리톨은 거의 항균효과를 보이지 못한다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3
감초 추출물과 올레산을 3:1, 1:1, 1:3의 비율로 혼합한 것과 상기 혼합물에 20%의 올레놀산을 첨가한 것에 대한 항균 실험을 실험예 1과 동일한 방법으로 행하고, 그 결과를 도 4에 도시하였다.
실험예 4
실험예 1의 항균실험에서 MIC가 낮은 값을 보이는 2번째, 3번째 분획에 대하여 액체크로마토그래피 실험을 수행하여 그 결과를 도 5 및 도 6에 도시하였다. 도 5로부터 알 수 있는 바와 같이 두번째 분획은 7개의 강한 피크와 약 10가지 정도의 약한 피크가 나타났으며, 세번째 분획은 2개의 강한 피크와 10개의 중간 피크, 그리고 대략 9개의 약한 피크가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

  1. 건조된 감초뿌리 분말을 에탄올과 부탄올의 혼합 용매에 침지하여 활성 성분을 추출하여 여과하고,
    여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음,
    용매가 제거된 추출액을 메탄올에 용해하고 에틸아세테이트로 반복 추출하고 다시 용매를 제거하고,
    용매를 제거한 에틸 아세테이트 추출물을 메탄올에 용해하고 n-헥산으로 반복추출하여 추출물을 제거한 후,
    남아 있는 메탄올층에 50부피%의 물을 가하여 클로로포롬으로 추출하고 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고,
    TLC로 확인하여 Rf값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하고 항균실험을 통하여 항균성이 우수한 2개의 분획을 얻는 것을 특징으로 하는 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    에탄올과 부탄올의 혼합 용매는 에탄올 : 부탄올 = 3 ∼ 5 : 1의 비율로 혼합된 것임을 특징으로 하는 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법.
  3. 건조된 감초뿌리 분말을 에탄올과 부탄올의 혼합 용매에 침지하여 활성 성분을 추출하여 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 메탄올에 용해하고 에틸아세테이트로 반복 추출하고 다시 용매를 제거하고, 용매를 제거한 에틸 아세테이트 추출물을 메탄올에 용해하고 n-헥산으로 반복추출하여 추출물을 제거한 후, 남아 있는 메탄올층에 50부피%의 물을 가하여 클로로포롬으로 추출하고 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 Rf값이 유사한 것을 통합하여 8개의 분획으로 구분하고 항균실험을 통하여 항균성이 우수한 2개의 분획을 얻는 방법으로 추출된 항충치용 감초추출물.
  4. 청구항 3의 감초추출물 1 ∼30중량%를 유효성분으로 함유하는 항충치용 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    올레산이 부가적으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 항충치용 조성물.
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