WO2011129495A1 - 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법 - Google Patents

감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법 Download PDF

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WO2011129495A1
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licorice
extract
extracting
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edible alcohol
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김형준
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Kim Hyoung Jun
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    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/484—Glycyrrhiza (licorice)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting an anti-caulkizing substance from licorice, and more particularly, extracting and filtering the active ingredient by dipping dried licorice root powder in edible alcohol, removing the solvent from the filtered extract, and then The extracted extract was repeatedly extracted with ethyl acetate and distilled water, and then the solvent was again removed.
  • the obtained extract was separated by a silica gel column using a mixed solvent of hexane and acetone to obtain a fraction, which was identified by TLC to obtain an excellent antimicrobial fraction.
  • the present invention relates to a method for extracting anti-cavities from licorice.
  • the tooth decay that most modern people have in their mouths generally means insect-eaten teeth, which means that the hard tissues of the teeth, like the insects eat, are eroded and deficient, and dental caries are also called dental caries. It is produced when three conditions of teeth, Streptococcus mutans, and carbohydrates are met in the oral cavity. The species is separated by 80% and 20%, respectively.
  • glucan and fructan using sucrose which is the energy source of these two early tooth decay bacteria
  • glucosyltransferase (glucosyltransferase (GTase) and fructosyltransferase (FTase)
  • insoluble glucan adheres to the surface of teeth by the reaction of these enzymes, plaques Will be generated. Tooth decay bacteria in these colonies produce organic acids by using glucan attached to the teeth, which causes tooth decay by decomposing hydroxyapatite, a chemical component of tooth enamel.
  • compositions for preventing and treating tooth decay have been developed and applied.
  • synthetic chemicals are mainly used to harm the human body. They do not specifically affect only pathogens that cause tooth decay. It can cause side effects.
  • Patent No. 10-0937511 a prior application patent of the present inventor, discloses "a method for extracting antimicrobial substances from licorice using solvents such as ethanol, butanol, methanol, ethyl acetate, hexane, chloroform, petroleum ether, and acetone.” This is described.
  • the above method has a problem in that it is difficult to apply licorice extract practically because some of the solvent is not suitable for the production of food additives applied to the human body.
  • an object of the present invention is extracted from licorice using only a solvent available for the production of functional food functional raw materials, there is no harm to the human body, specifically acts only on pathogens causing tooth decay, anti-cavities excellent in caries prevention effect To provide a natural extract for.
  • the dried licorice root powder is immersed in an edible alcohol to extract and filter the active ingredient, and the solvent is removed from the filtered extract.
  • the solvent is removed from the filtered extract.
  • the obtained extract was separated by a silica gel column using a mixed solvent of hexane and acetone to obtain a fraction, and confirmed by TLC to excellent antibacterial
  • anti-cavities can be extracted using only solvents that can be used in the preparation of functional food functional ingredients in compliance with the Korean Food and Drug Administration. It was made.
  • the method of extracting anti-cavities from licorice according to the present invention is extracted from licorice using only solvents that can be used in the manufacture of functional foods for functional foods in compliance with the Korean Food and Drug Administration. Specific to the pathogen, there is an effect that can easily obtain a natural extract for caries excellent anti-cavities.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of different Streptococcus mutans culture results according to licorice extract concentrations in which the culture was completed in a 96-well plate according to the antimicrobial test under the 1% sucrose condition of Experimental Example 1 and Experimental Example 2,
  • Figure 3 is a graph showing the MIC results obtained in the antibacterial experiment of licorice extract in 1% sucrose conditions in Experimental Example 2 as the OD value according to the concentration,
  • Figure 4 is a graph showing the MIC results obtained in the antibacterial experiment of licorice extract with E. coli instead of Streptococcus mutans in Experimental Example 3 as the OD value according to the concentration,
  • 5 and 6 are graphs showing the results of performing a high resolution electro impact mass (test) for the licorice extract confirmed the MIC in the antimicrobial experiment of Experimental Example 1.
  • the dried licorice root powder is immersed in edible alcohol to extract and filter the active ingredient, the solvent is removed from the filtered extract, and then the solvent is removed. After repeated extraction with distilled water and removal of the solvent again, the obtained extract was separated by a silica gel column using a mixed solvent of hexane and acetone to obtain a fraction, and confirmed by TLC to obtain a fraction having excellent antimicrobial properties.
  • Licorice (Glycyrrhiza uralensis) used in the present invention has been used for various purposes in both the East and the West as a medicinal plant from about 6000 years ago, as a perennial herbaceous plant of the dicotyledonous rosewood legume (Leguminosae), the root is reddish brown deep in the ground The stems are gathered and grow straight about 1m.
  • the root is mainly used as a herbal medicine and has a sweet taste because it contains glycyrrhizin (glycyrrhizin), a triterpenoid saponin present in the root, which is a sweetening component of licorice.
  • Licorice is an indispensable medicinal herb, as the drug says Licorice, and it is not only used to sweeten bitter medicine, but also has a unique weakness. It acts as an antagonist to eggplant polar and toxic drugs to treat drug poisoning caused by extreme medicine or poison, neutralizes and detoxifies the poison caused by bacteria, and neutralizes and alleviates the poison of all medicines.
  • licorice has the effect of adjusting the adrenal cortex hormones, so as to solve the urgent symptoms of muscle pain to relax the tension or nerves to act, anti-allergic, gastric ulcer, duodenal ulcers, Decholesterol action prevents atherosclerosis and detoxifies poisons, which not only enhances the function of the liver, but also pleurisy and pulmonary tuberculosis, anterior pituitary insufficiency, Edison disease, epidemic hepatitis, bronchial asthma, and dermatitis. Eczema, acne, freckles, etc.), schooling, frostbite, and hands and feet are known to have a distinct therapeutic effect.
  • Consequences of licorice govern the heat and morals of chapter 5 and 6, bringing the physiology of the eyes, nose, mouth, ears and faeces to normal, communicating all blood vessels, strengthening muscles and bones, improving nutrition and all medicines. Detoxify the toxicity of 72 stones and 1200 kinds of herbal medicine to harmonize with each other to make the drug appear well, so the nickname is described as a national. This means that licorice is the elder in medicine based on the meaning of the elder of the nation, which is the will of the nation.
  • natural substances exhibiting antimicrobial activity are polyphenolic, which have nonpolar properties, but partially have hydroxyl groups (-OH), and therefore have a polar property.
  • These substances can be extracted and secured by first immersion in edible alcohol (ethanol). Since ethanol can elute both polar and non-polar substances, it is necessary to elute the polar substances that can hinder the extraction of the non-polar substances, and in turn, to elute the non-polar substances again, thus extracting as many active substances from the initial licorice powder as possible. Can be.
  • the dried licorice root was made into a powder, soaked in 2 to 4 times, preferably 3 times of ethanol, extracted at room temperature for 24 hours, and the extracted material was filtered using a filter paper.
  • the licorice root is made of powder to increase the surface area, that is, to increase the area in contact with the extraction solvent so that extraction can be performed efficiently.
  • the first ethanol solvent is preferably used 2 to 4 times the weight of licorice root powder, and when the amount of the solvent is less than 2 times the weight of licorice root powder, there is a disadvantage that the extraction of the antimicrobial material is not easy. If it exceeds 4 times, it is preferable to use 3 times the amount of ethanol because there is a problem that the economic efficiency is lowered.
  • the filter paper is intended to separate simple licorice powder, all of the filter papers commonly used in the art to which the present invention belongs can be used, and in the present invention, Whatman filter paper was used.
  • the extraction time is effective 12 to 36 hours, most preferably 24 hours, the extraction is not complete when the extraction for less than 12 hours, the extract is denatured by the solvent itself when exceeding 36 hours There is a possibility that it is not preferable.
  • the solvent was removed from the filtered extract as described above using a vacuum evaporator which is a device commonly used in the art. Through this vacuum rotary concentrator, almost all solvents used in the present invention can be volatilized. In addition, the final licorice extract is volatilized for at least 24 hours while maintaining the vacuum to volatilize all the remaining solvent.
  • distilled water is added to twice the amount of ethyl acetate to be used in the extraction solution dissolved in the edible alcohol and shaken to release well, and then ethyl acetate is repeatedly extracted using 1/2 the amount of distilled water used. The extraction was carried out in the same manner as the extraction with alcohol (ethanol) and the removal of the solvent.
  • the use of ethyl acetate and distilled water is to separate the non-polar material and the polar material.
  • the non-polar material is dissolved in ethyl acetate and the polar material is dissolved in distilled water. This is because nonpolar substances extracted from edible alcohol (ethanol) can be reliably separated from polar substances without being mixed with water, and are removed relatively quickly using a vacuum rotary concentrator.
  • the solvent was removed, and then dissolved in a small amount of edible alcohol using 10-50% by weight of ethanol-based distilled water extract, and separated by silica gel column.
  • a developing solvent a mixed solvent of hexane and acetone (1 to 6: 1) was used, and Rf point was confirmed by TLC using a hexane and acetone mixed solvent (1 to 6: 1).
  • the antimicrobial material was extracted from licorice by a method of obtaining the same fraction as the excellent antimicrobial fraction obtained in "method of extracting antimicrobial material from licorice".
  • Hexane is a nonpolar solvent and acetone is a water-soluble solvent, and it is well mixed in different organic solvents.
  • the range of mixed solvents is basically limited to the specific anti-cavities in hexane and acetone mixed solvents (1 to 6: 1), but in the mixed solvents with high hexane content, the degree of separation is very slow, and the hexane content is limited. In low mixed solvents, the separation occurs very quickly, causing the anti-cavity material to be attracted to the silica gel column tube, thereby limiting a clear fraction. Therefore, in the present invention, the mixed solvent of hexane and acetone was used in the range of 1 to 6: 1, preferably 3: 1. Licorice extract obtained by the above method can be added to the anti-cavities composition to obtain a composition comprising the licorice extract as an active ingredient.
  • the antimicrobial effect of Streptococcus mutans, a caries-inducing bacterium showed an excellent anti-detox bactericidal effect with a minimum inhibitory concentration of 5 ⁇ g / ml (5 ppm), and sucrose concentrations of 1%, 5% and 10%.
  • the same also confirmed the inhibitory effect of Streptococcus mutans bacteria, licorice extract obtained in the present invention showed a specific inhibitory ability against Streptococcus mutans, and also a specific inhibitory ability to Streptococcus sobrinas.
  • E. coli common bacteria that do not cause illness in the human body.
  • intestinal Escherichia coli usually reside in the human intestine, except for certain pathogens in Escherichia coli, to form a symbiotic relationship to prevent bacterial invasion, or to synthesize vitamins such as vitamin K, vitamin B5, and biotin to allow humans to perform normal physical activities. Help to do it.
  • Resident bacteria such as Escherichia coli are killed by, for example, antibiotics, so that pathogenic bacteria can invade more easily and cause disease.
  • the present invention does not use highly toxic organic solvents as licorice extract solvents, thereby ensuring safety against toxicity, and more various anti-cavities and anti-causative effects in the presence of sucrose. It was confirmed that the licorice extract with excellent functionality was obtained by checking the caries function and the safety against E. coli.
  • the dried licorice root powder and edible alcohol were added in a ratio of 1: 3, immersed at room temperature for 24 hours to extract the active ingredient, and filtered using Whatman filter paper.
  • the filtered extract was removed using a vacuum evaporator to dissolve the solvent, and then dissolved in 30% by weight of edible alcohol based on the weight of the extract to obtain an extract-edible alcohol solution, and then to the extract-edible alcohol solution.
  • 50% by weight of distilled water was added thereto, shaken to dissolve well, and extracted three times using ethyl acetate twice the amount of distilled water used, and the solvent was removed again using a vacuum rotary concentrator.
  • the solvent was dissolved using 30 wt% edible alcohol based on the weight of the ethyl acetate-distilled water extract, and the mixture was separated by a silica gel column. That is, 150 g of silica gel was filled into a glass column tube having a diameter of 7 cm, and then the extract was placed on a thickness of 5 mm and separated by flowing a developing solvent.
  • a developing solvent a mixed solvent of hexane and acetone (3: 1) was used, and Rf point was confirmed by TLC using a hexane and acetone mixed solvent (2: 1). Extracting the antimicrobial material from licorice by the same method as the fraction obtained in the "Extracting method" excellent antimicrobial and finally, the solvent is completely removed using a vacuum rotary concentrator.
  • Antibacterial experiments were performed on licorice extract divided into fractions obtained in Example 1.
  • In vitro antimicrobial activity experiment was performed using the minimum inhibitory concentration (MIC) protocol recommended by the National Committee of Clinical Laboratory Standards (NCCLS), using Streptococcus mutans, a decayed fungus.
  • Licorice extract was dissolved in edible alcohol to a concentration of 10 mg / ml, diluted 1/10 with autoclaved distilled water to a concentration of 1 mg / ml.
  • the total volume used in the experiment was 300 ⁇ l, and the experimental group containing the most edible alcohol contained 1.5 ⁇ l (0.5% v / v), so that the negative control well contained 1.5 ⁇ l of edible alcohol as negative control.
  • the concentration of the antimicrobial substance in the portion where the optical density (OD) is measured to 0.15 or less due to the growth inhibition of bacteria was set to MIC.
  • FIG. 1 A graph showing the OD value according to the concentration of licorice extract measured above is shown in FIG. 1, and 96-well plate photographs are taken in FIG. 2. All experiments were run in three simultaneous runs.
  • the material extracted from licorice by the method of the present invention can be determined to about 5 ⁇ g / ml (ppm) in MIC.
  • negative control wells added with 1.5 ⁇ g of ethanol no sucrose set three times: H2, H4, H6 / 1% sucrose set three times: H8, H10, H12
  • H2, H4, H6 / 1% sucrose set three times: H8, H10, H12 had little effect on normal bacterial growth. Did not give.

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Abstract

본 발명은 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 건조된 감초뿌리 분말을 식용주정에 침지하여 활성 성분을 추출 및 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 초산에틸과 증류수로 반복 추출하고 다시 용매를 제거한 후, 수득된 추출물을 헥산과 아세톤의 혼합 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 항균성이 우수한 분획을 얻는 방법으로 건강기능식품 기능성 원료의 제조에 사용 가능한 용매만을 사용하여 항충치균 물질을 추출하고, 이를 항충치용 조성물에 혼합하여 충치 예방에 우수한 효과를 얻을 수 있었다.

Description

감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법
본 발명은 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 건조된 감초뿌리 분말을 식용주정에 침지하여 활성 성분을 추출 및 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 초산에틸과 증류수로 반복 추출하고 다시 용매를 제거한 후, 수득된 추출물을 헥산과 아세톤의 혼합 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 항균성이 우수한 분획을 얻는 방법으로 대한민국 식품의약품안전청 규정에 부합되는 건강기능식품 기능성 원료의 제조에 사용 가능한 용매만을 사용하여 항충치균 물질을 추출하고, 이를 항충치용 조성물에 혼합하여 충치 예방에 우수한 효과를 얻을 수 있도록 하는 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법에 관한 것이다.
현대인들 대부분이 구강(口腔)에 가지고 있는 충치는 일반적으로 벌레먹은 치아라는 뜻으로 벌레가 먹은 것처럼 치아의 경조직이 침식되어 결손하는 증세를 의미하고, 치과의학상 우식증(dental caries)이라고도 한다. 이는 치아, 스트렙토코커스 뮤탄스(streptococcus mutans), 탄수화물의 3가지 조건이 구강내에서 충족될 때 생성되며 초기 치아우식증에 관련되는 미생물로는 스트렙토코커스 뮤탄스와 스트렙토코커스 소브리너스(streptococcus sobrinus)의 2종이 각각 80%와 20% 정도 수준으로 분리된다.
충치의 대표적인 원인으로는 상기 두 가지 초기 충치세균의 에너지원인 슈크로오스(sucrose)를 기질로 하여 글루칸(glucan)과 프룩탄(fructan)을 생성하며, 이들을 합성하는 효소는 각각 글루코실트란스퍼라아제(glucosyltransferase : GTase)와 프룩토실트란스퍼라아제(fructosyltransferase : FTase)로, 이들 효소의 반응에 의해 불용성인 글루칸(glucan)이 치아의 표면에 부착되며, 이를 통하여 형성된 치아의 미생물 부착군집인 플라그(plaque)를 생성하게 된다. 이러한 군집내 충치균들이 치아에 부착된 글루칸을 활용하여 유기산을 생성하게 되고, 이는 치아의 에나멜질의 화학성분인 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 분해시켜 충치를 유발하게 된다.
음식물의 찌꺼기가 부착하기 쉬운 위턱, 아래턱의 어금니의 표면에 있는 홈이나 쑥 들어간 곳이나 인접면, 앞니의 사이 등이 발생하기 쉬운 부위이며, 우선 제1 표층에 있는 법랑질이 침식당한다. 이 단계를 우식 제1도, 즉 법랑질 우식이라고 하며, 지각신경이 없으므로 아프지 않으나 그 부분이 조잡하게 파괴되어 검게 변하게 된다. 그것이 더욱 진행하여 상아질까지 이르게 되면 우식 제2도, 즉 상아질 우식이라고 한다. 상아질에는 상아세관이 있고, 이것에 따라 진행이 빨라지고 움푹 패여 공동이 생기기 쉬우며, 음식찌꺼기 등이 괴기 쉽게 되어 더욱 진행을 빨리 촉진시키며 썩은 냄새를 나게 한다. 상아질에는 치수의 분지가 있으므로 찬 공기나 물에 접촉하면 통증이 있다. 일반적으로 치아질환은 자연치유가 될 수 없으므로 방치하면 그것은 곧 치수염을 일으키고 심한 통증을 느끼게 된다.
최근 들어서는 충치를 예방 및 치료하기 위한 조성물들이 많이 개발되어 적용되고 있지만 합성된 화학물질을 주로 사용하기 때문에 인체에 해를 끼칠 수가 있으며, 충치를 유발하는 병원균에만 특이적으로 작용하지 못하여 병원성 세균이 침입할 수 있기 때문에 부작용을 일으킬 우려가 있다.
특히, 본 발명자 등의 선출원 특허인 특허 제10-0937511호에는 "에탄올, 부탄올, 메탄올, 초산에틸, 헥산, 클로로포름, 석유 에테르, 그리고 아세톤 등의 용매를 사용하여 감초로부터 항균물질을 추출하는 방법"이 기재되어 있다.
그러나, 상기의 방법은 인체에 적용되는 식품첨가물의 제조에 적합하지 않은용매를 일부 사용하였기에 감초추출물을 실제적으로 적용하기 어려운 문제점이 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 건강기능식품 기능성 원료의 제조에 사용 가능한 용매만을 사용하여 감초에서 추출한 것으로 인체에 해가 없으며, 충치를 유발하는 병원균에만 특이적으로 작용하고, 충치 예방 효과가 우수한 항충치용 천연추출물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 목적의 감초 추출물을 얻기 위하여 감초로부터 항충치용 물질을 추출하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적들 뿐만 아니라 용이하게 달성할 수 있는 또 상기 목적들을 용이하게 달성하기 위하여 본 발명에서는 건조된 감초뿌리 분말을 식용주정에 침지하여 활성 성분을 추출 및 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 초산에틸과 증류수로 반복 추출하고 다시 용매를 제거한 후, 수득된 추출물을 헥산과 아세톤의 혼합 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 항균성이 우수한 분획을 얻는 방법으로 대한민국 식품의약품안전청 규정에 부합되는 건강기능식품 기능성 원료의 제조에 사용 가능한 용매만을 사용하여 항충치균 물질을 추출하고, 이를 항충치용 조성물에 혼합하여 충치 예방에 우수한 효과를 얻을 수 있도록 하였다.
본 발명에 따른 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법은 대한민국 식품의약품안전청 규정에 부합되는 건강기능식품 기능성 원료의 제조에 사용 가능한 용매만을 사용하여 감초에서 추출한 것으로 인체에 해가 없으며, 충치를 유발하는 병원균에만 특이적으로 작용하고, 충치 예방 효과가 우수한 항충치용 천연추출물을 용이하게 얻을 수 있는 효과가 있다.
도 1은 실험예 1의 감초추출물의 항균실험에서 얻어진 MIC(Minimum inhibitory concentration) 결과 값을 농도에 따른 OD(optical density)값으로 나타내는 그래프이고,
도 2는 실험예 1와 실험예 2의 1% 슈크로오스 조건에서의 항균실험에 따른 96-웰 플레이트에서 배양이 완료된, 감초추출물 농도별 다른 스트렙토코커스 뮤탄스 배양결과를 볼 수 있는 사진이며,
도 3은 실험예 2에서 1% 슈크로오스 조건에서의 감초추출물의 항균실험에서 얻어진 MIC 결과 값을 농도에 따른 OD값으로 나타내는 그래프이고,
도 4는 실험예 3에서 스트렙토코코스 뮤탄스균 대신에 대장균을 가지고 감초추출물의 항균실험에서 얻어진 MIC 결과 값을 농도에 따른 OD값으로 나타내는 그래프이고,
도 5 및 도 6은 실험예 1의 항균실험에서 MIC를 확인한 감초추출물에 대하여 고해상도 질량분석(high resolution electro impact Mass) 실험을 수행하여 그 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따른 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법은 건조된 감초뿌리 분말을 식용주정에 침지하여 활성 성분을 추출 및 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 초산에틸과 증류수로 반복 추출하고 다시 용매를 제거한 후, 수득된 추출물을 헥산과 아세톤의 혼합 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 항균성이 우수한 분획을 얻는 것으로 특징지워진다.
본 발명에서 사용되는 감초(Glycyrrhiza uralensis)는 대략 6000년 전부터 약용식물로 동양 및 서양 모두에서 다양한 목적으로 사용되어졌으며, 쌍떡잎식물 장미목 콩과(Leguminosae)의 다년생 초본식물로서, 뿌리는 적갈색으로 땅속 깊이 들어가고 줄기는 모가 지며 1m 정도 곧게 자란다. 뿌리는 한방 약재로 주로 사용하며 단맛이 나는데, 이는 뿌리에 존재하는 트리터페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)인 글리시리진(glycyrrhizin : glycyrrhizic acid)이 함유되었기 때문이며, 이 성분이 감초의 감미 성분이다.
약방에 감초라는 말이 있듯이 감초는 여러 약재 가운데 빠져서는 안 되는 약재로 매우 광범위하게 사용되고 있으며, 쓴 약을 달게 하여 먹기 좋게 할 뿐만 아니라 독특한 약성을 가지고 있는 데, 이는 갖가지 독을 푸는데 효과가 있고, 여러 가지 극성약이나 독성약에 대한 길항작용을 하여 극약이나 독약으로 인한 약물중독도 치료하고, 세균으로 인한 독에도 중화작용 및 해독작용을 하며, 모든 약의 독을 풀어 중화 및 완화시키는 작용을 한다.
또한, 감초는 부신피질호르몬처럼 조정작용도 있어 급박한 증상을 푸는 것으로 근육의 긴장으로 인한 동통이나 신경의 긴장을 풀어주는 작용을 하며, 항알러지 작용을 하고, 위궤양, 십이지장궤양에도 효과가 있으며, 탈콜레스테롤 작용이 있어 동맥경화를 방지하고, 독물질을 해독하는 작용을 하므로 간장의 기능을 강화시킬 뿐만 아니라 늑막염과 폐결핵, 하수체전엽기능부전증, 에디슨병, 유행성 간염, 기관지천식, 피부염(두드러기, 습진, 여드름, 주근깨 등), 학질, 동상, 손발이 튼데 등 여러 질병에 뚜렷한 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
동의보감에는 감초는 5장 6부의 한열과 사기를 다스리며 눈, 코, 입, 귀와 대소변의 생리를 정상으로 되게 하고, 모든 혈맥을 소통시키며, 근육과 뼈를 튼튼하게 하고 영양 상태를 좋게 하고 또 모든 약의 독성을 해독하고 72가지 석약과 1200가지 초약을 서로 조화하여 약효를 잘 나타나게 하므로 별명을 국노라 한다고 기재되어 있다. 이는 국노의 원뜻인 나라의 원로라는 뜻에 바탕을 두어 감초가 약 가운데 원로라는 뜻이다.
한편, 항균작용을 보이는 천연물질은 폴리페놀계열로 비극성인 성질을 가지지만 부분적으로 하이드록실기(-OH)를 가지고 있어서 극성인 성질도 동시에 가지고 있는 경우가 많다. 이러한 물질은 식용주정(에탄올)으로 최초 침지시켜 추출하여 확보할 수 있다. 에탄올은 극성 물질과 비극성 물질을 모두 용출시킬 수 있기 때문에 비극성 물질의 추출을 방해할 수 있는 극성물질을 먼저 용출시키고 차례로 비극성 물질을 또 용출시킬 수 있도록 하여 최초 감초분말에서 활성물질들을 최대한 많이 추출할 수 있다. 본 발명에서는 건조된 감초뿌리를 분말로 만들어서 2 ～ 4배량, 바람직하게는 3배량의 에탄올에 침지시켜 24시간 동안 상온에서 추출하고 추출된 물질을 여과지를 이용하여 여과하였다. 감초뿌리를 분말로 만든 것은 표면적을 넓히는 효과, 즉 추출 용매와 접촉하는 면적을 높임으로써 추출이 효율적으로 이루어지도록 하기 위한 것이다.
최초 에탄올 용매는 감초뿌리 분말 중량에 대하여 2 ～ 4배량을 사용하는 것이 바람직하며, 용매의 사용량이 감초뿌리 분말 중량에 대하여 2배량 미만일 경우에는 항균물질의 추출이 용이하게 이루어지지 않는 단점이 있고, 4배량을 초과할 경우에는 경제성이 저하되는 문제점이 있기 때문에 3배량의 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 여과지는 단순 감초분말을 분리하는 목적이므로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 여과지가 모두 사용 가능하며, 본 발명에서는 와트만 여과지를 사용하였다. 추출 시간은 12 ～36시간이 효과적이고, 24시간이 가장 바람직하며, 12시간 미만 동안 추출할 경우에는 추출이 완전히 이루어지지 않는 단점이 있고, 36시간을 초과할 경우에는 용매 자체에 의해 추출물이 변성될 가능성이 있어 바람직하지 못하다.
상기와 같이 여과된 추출액을 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 장치인 진공회전농축기(evaporator)를 이용하여 용매를 제거하였다. 이 진공회전농축기를 통하여 본 발명에서 사용한 모든 종류의 용매를 거의 모두 휘발시킬 수 있다. 또한, 최종 감초추출물을 진공 상태를 유지하면서 24시간 이상 휘발시켜 잔류용매를 모두 휘발시킨다.
그 다음에 용매가 제거된 추출액 중량에 대하여 10 ～ 50중량%의 식용주정을 이용하여 용해한 다음, 증류수에 다시 용해시키고 초산에틸로 반복해서 1 ～ 5회 추출하고, 진공회전농축기를 이용하여 다시 용매를 제거하였다. 바람직하게는 식용주정에 용해된 추출액에 증류수를 사용될 초산에틸의 2배량 첨가하고 잘 풀어지도록 흔들어준 후, 초산에틸을 사용된 증류수의 1/2배량 사용하여 반복 추출한다.이후 용매 제거 방법은 식용주정(에탄올)으로 추출하고 용매를 제거하는 방법과 동일하게 행하였다.
상기 단계에서 초산에틸과 증류수를 사용하는 것은 비극성물질과 극성물질을 분리하기 위한 것으로 비극성물질은 초산에틸에, 극성물질은 증류수에 용해되어 각각이 분리 추출이 용이하게 이루어지며, 초산에틸을 사용하는 것은 물과 섞이지 않으면서도 식용주정(에탄올)에서 추출된 비극성물질을 극성물질과 확실히 분리할 수 있으며, 진공회전농축기를 이용하여 상대적으로 신속히 제거되기 때문이다.
용매를 제거한 초산에틸-증류수 추출물 중량에 대하여 10 ～ 50중량%의 식용주정을 이용하여 다시 소량의 식용주정에 용해하고, 실리카겔 컬럼으로 분리하였다.
즉, 실리카겔 150g을 직경 7cm인 유리 컬럼관에 충전한 후, 추출액을 5mm두께로 얹고 전개용매를 흘려서 분리하였다. 전개 용매로는 헥산과 아세톤의 혼합용매(1～6:1)를 사용하였으며, 헥산과 아세톤 혼합용매(1～6:1)를 사용하여 TLC로 확인하여 Rf point가 특허 제10-0937511호 "감초로부터 항균물질을 추출하는 방법"에서 얻은 항균성이 우수한 분획과 동일한 분획을 얻는 방법으로 감초로부터 항균물질을 추출하였다. 헥산은 무극성 용매이며 아세톤은 물에 녹는 용매이면서, 서로 다른 유기용매에도 잘 섞이는 성질을 가지고 있기 때문에 이 두 용매의 조화를 통하여 감초에서 특이적인 항충치물질을 분리하였다. 혼합용매의 범위는 기본적으로 헥산과 아세톤 혼합용매(1～6:1)에서 특이적인 항충치물질이 분리되지만 헥산의 함량이 높은 혼합용매에서는 분리 정도가 매우 느리게 나타나게 되므로 제한적이며, 헥산의 함량이 낮은 혼합용매에서는 분리가 매우 빠르게 이뤄져 항충치물질이 실리카겔 컬럼관에 끌리는 현상이 발생하여 명확한 분획을 확보하는데 제한이 된다. 그러므로 본 발명에서는 헥산과 아세톤 혼합용매는 1～6 : 1인 것, 바람직하게는 3 : 1인 것을 사용하여 진행하였다. 상기의 방법으로 얻은 감초 추출물을 항충치 조성물에 첨가하여 감초추출물을 유효 성분으로 하는 조성물을 얻을 수 있다.
충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄스의 항균 실험에서 MIC(Minimum inhibitory concentration)가 5㎍/㎖(5ppm)일 정도로 뛰어난 항충치균 효과를 보였으며, 또한 슈크로오스가 1%, 5%, 10% 농도일 때도 동일하게 스트렙토코커스 뮤탄스균의 억제 효과를 확인하였다, 본 발명에서 얻은 감초 추추물은 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해서 특이적으로 억제능력을 보였고, 스트렙토코커스 소브리너스에도 특이적인 억제능력을 보였다.
본 발명에서는 대장균을 통하여 감초추출물의 일반세균의 영향을 스트렙토코커스 뮤탄스균 실험과 비교 평가한 결과, 대장균에는 어떠한 영향이 없는 것으로 확인하였다. 인체내에는 병을 일으키지 않는 일반세균들도 같이 존재한다. 특히, 장내 대장균들은 대장균내 특정 병원균을 제외하고는 일반적으로 인체 장내에서 상주하면서 공생관계를 이뤄 세균의 침입을 방지해주거나, 비타민 K, 비타민 B5, 바이오틴 같은 비타민을 합성하여 인간이 정상적인 신체활동을 수행하도록 도움을 준다. 이러한 대장균같은 상주 세균이 예를 들어, 항생제같은 물질들로 인하여 죽어 없어진다면 병원성을 가진 세균들이 침입이 더욱 원활하여 쉽게 병을 일으킬 수 있다. 그러므로, 충치균 제거를 위해서 병을 일으키지 않는 일반 세균들을 제거하는 것은 바람직하지 못하다. 이러한 배경으로 동일한 실험조건에서 스트렙토코커스 뮤탄스을 대신하여 대장균을 사용한 실험을 수행하였고, 본 발명에서 얻은 감초추출물은 대장균에 안정한 추출 물질임을 확인하였다.
본 발명은 특허 제10-0937511호와는 달리 감초 추출용매로 독성이 강한 유기용매들을 사용하지 않았으므로 독성에 대한 안전성을 확보할 수 있을 뿐만 아니라 더 다양한 항충치기능 효과, 슈크로오스 존재 하에서 항충치기능 및 대장균에 대한 안전성 등을 확인하여 기능성이 우수한 감초추출물을 얻을 수 있음을 확인하였다
다음의 실시예 및 실험예는 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하는 것이지만, 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
건조된 감초뿌리 분말과 식용주정을 1 : 3의 비율이 되도록 투입하고 24시간 동안 상온에서 침지하여 활성 성분을 추출하고 와트만 여과지를 이용하여 여과하였다.
여과된 추출액을 진공회전농축기(evaporator)를 이용하여 용매를 제거한 다음, 추출액 중량에 대하여 30중량%의 식용주정을 이용하여 용해하여 추출액-식용주정용해액을 얻은 다음, 추출액-식용주정용해액에 대하여 50중량%의 증류수를 가하고 잘 풀어지도록 흔들어준 후, 사용된 증류수의 1/2배량의 초산에틸을 사용하여 3회 추출하고, 진공회전농축기를 이용하여 다시 용매를 제거하였다.
용매를 제거한 초산에틸-증류수 추출물 중량에 대하여 30중량%의 식용주정을 이용하여 용해하고, 실리카겔 컬럼으로 분리하였다. 즉, 실리카겔 150g을 직경 7cm인 유리 컬럼관에 충전한 후, 추출액을 5mm두께로 얹고 전개용매를 흘려서 분리하였다. 전개 용매로는 헥산과 아세톤의 혼합용매(3:1)를 사용하였으며, 헥산과 아세톤 혼합용매(2:1)를 사용하여 TLC로 확인하여 Rf point가 특허 제10-0937511호 "감초로부터 항균물질을 추출하는 방법"에서 얻은 항균성이 우수한 분획과 동일한 분획을 얻는 방법으로 감초로부터 항균물질을 추출하였고 최종적으로, 진공회전농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거한다.
실험예 1
실시예 1에서 얻은 분획으로 구분된 감초추출물에 대한 항균실험을 행하였다. In vitro 항균 활성 실험은 충치유발균인 스트렙토코코스 뮤탄스균을 이용하여 National Committee of Clinical Laboratory Standards(NCCLS)가 추천하는 Minimum inhibitory concentration(MIC) protocol을 이용하였다. 감초추출물을 식용주정에 용해하여 10㎎/㎖ 농도가 되게 하였고, 고압멸균한 증류수로 1/10 희석하여 1㎎/㎖의 농도로 만든다. 이것을 Trypicase soy broth(TSB) 배지로 serial dilution 실시 (50㎍/㎖～0.39㎍/㎖)의 2배수인 (100㎍/㎖～0.78㎍/㎖)로 희석을 실시한다. 이는 Microtest 96 microtiter plate를 이용하여 초기 농도를 50㎍/㎖로 시작하여 2배 연속 희석법으로 연속적인 희석을 하였다. 스트렙토코코스 뮤탄스균은 TSB 배지에서 37℃, 호기적 조건(aerobic conditions)으로 배양되었다. 106 colony-forming units/㎖ 농도의 뮤탄스균이 포함된 150㎕의 배지를 감초추출물이 연속 희석된 항균 물질 150㎕에 첨가하였다. 실험에 사용된 총 부피는 300㎕이고, 여기에 식용주정이 가장 많이 함유된 실험군이 1.5㎕(0.5% v/v)가 포함되었으므로, 이를 negative control로 식용주정 1.5㎕가 포함된 well은 negative control로 사용되었다. MIC는 37℃에서 16시간 이상 경과 후, 박테리아의 성장 억제로 인하여 OD(optical density)가 0.15 이하로 측정되는 부분의 항균물질 농도를 MIC로 정하였다.
상기에서 측정된 감초 추출물 농도에 따른 OD값을 나타내는 그래프를 도 1에 도시하였고, 96-웰 플레이트 사진을 촬영하여 도 2에 도시하였다. 모든 실험은 3회 동시 수행으로 진행하였다.
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 방법으로 감초에서 추출한 물질은 MIC에서 약 5㎍/㎖(ppm)으로 결정될 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이 에탄올 1.5㎍이 첨가된 negative control well(none sucrose set 3회 : H2, H4, H6/ 1% sucrose set 3회 :H8, H10, H12)은 박테리아 정상적인 성장에 거의 영향을 주지 않았다.
실험예 2
실험예 1과 동일한 실험조건 가운데, 스트렙토코코스 뮤탄스균을 배양하는 TSB 배지에 sucrose 농도를 1%, 5%, 10%로 맞춰서 실험을 진행하였다. 결과는 당(糖)이 없이 실험한 실험예 1과 비슷한 패턴으로 감초추출물이 스트렙토코코스 뮤탄스균의 성장을 억제하였다.
실험예 3
실험예 1과 동일한 실험조건 가운데, 스트렙토코코스 뮤탄스균 대신에 대장균을 가지고 실험하였다. 결과는 대장균의 정상적인 성장에 감초추출물의 영향은 없었다.
실험예 4
실험예 1의 항균실험에서 MIC를 확인한 감초추출물에 대하여 high resolution electro impact Mass 실험을 수행하여 그 결과를 도 5 및 도 6에 도시하였다. 도 5, 6으로부터 알 수 있는 바와 같이 유의한 피크가 약 12가지 정도 나타났음을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

  1. 건조된 감초뿌리 분말을 식용주정에 침지하여 활성 성분을 추출 및 여과하고, 여과된 추출액으로부터 용매를 제거한 다음, 용매가 제거된 추출액을 초산에틸과 증류수로 반복 추출하고 다시 용매를 제거한 후, 수득된 추출물을 헥산과 아세톤의 혼합 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼으로 분리하여 분획을 얻고, TLC로 확인하여 항균성이 우수한 분획을 얻는 것을 특징으로 하는 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    식용주정은 감초뿌리 분말 중량에 대하여 2~4배량을 사용하는 것을 특징으로 하는 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    식용주정을 이용한 추출은 상온에서 12~36시간 동안 행하는 것을 특징으로 하는 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    초산에틸과 증류수로의 추출은 용매가 제거된 식용주정 추출액 중량에 대하여 10~50중량%의 식용주정을 이용하여 용해하고, 증류수를 가해 다시 용해한 후, 초산에틸로 1~5회 추출하는 것을 특징으로 하는 감초로부터 항충치 물질을 추출하는 방법.
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