WO2010114270A2 - 고발현 재조합 세포주의 선별 방법 - Google Patents

고발현 재조합 세포주의 선별 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting a highly expressed recombinant cell line, and more specifically, to (i) a gene expression cassette comprising a selection marker gene linked to inoperable polyA; And (ii) a method for selecting a highly expressed recombinant cell line using an expression vector comprising a gene expression cassette encoding a recombinant protein of interest linked to operably polyA.
  • the target protein to be produced is inserted into the expression vector of the gene of the target protein, transduced into the cell line to produce the inserted expression vector and cultured in a large amount in a cell line prepared by a suitable method Obtained through separation and purification.
  • Examples of industrially used methods for this purpose include methods using Chinese hamster ovary (CHO) dihydrofolate reductase (dhfr) (-), CHO K1, Baby Hamster Kidney (BHK), NS0, SP2 / 0, and human cell lines.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • BHK Baby Hamster Kidney
  • SP2 / 0, and human cell lines Ogata, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. , 1993, 38 (4), 520-525; Kratje, et al., Biotechnol.Prog ., 1994, 10 (4), 410-20; Peakman, et al., Hum.Antibodies Hybridomas, 1994, 5 (1-2), 65-74).
  • the foreign gene is generally inserted by transduction into the desired cell line together with a selection marker gene (eg neomycin phosphotransferase).
  • a selection marker gene eg neomycin phosphotransferase
  • Foreign and selectable marker genes can be expressed by a single vector or by separate vectors that are simultaneously transduced. 2-3 days after transduction, when using neomycin phosphotransferase-gene, cells are transferred to media containing a selection agent such as G418 and cultured for several weeks under these selection conditions. Appearing resistant cells can then be isolated and examined for expression of the desired gene product. As a result of random, non-directional integration into the host cell genome, cell populations expressing foreign genes in completely different proportions are obtained.
  • They may also include non-expressing cells in which selectable markers are expressed but do not express the gene of interest. Therefore, in order to identify cell clones with high expression of the desired foreign genes, it is necessary to examine and test a large number of clones, which is time-consuming and expensive.
  • Gene amplification is a common task in animal cell cultures used to produce recombinant proteins, and gene amplification dramatically improves the relatively low productivity inherent in many mammalian cell lines.
  • One widely used amplification technique is the dhfr family of gene amplification systems, which are very commonly used in dhfr deficient CHO cells.
  • CHO cell lines deficient in dhfr are industrially preferred for the following reasons: (1) Posttranslational modification of proteins, ie, glycosylation or phosphorylation. More similar to human cells than other cell lines; (2) suspension culture as well as attachment culture is possible; (3) relatively high concentration cultures are possible compared to other cells in serum-free medium; (4) significantly lower target protein productivity compared to microorganisms using dhfr / MTX (methotrexate) gene amplification system; And (5) stability has been verified, making it easy to obtain permits from regulatory agencies such as FDA. For this reason, dhfr-deficient CHO cell lines are widely used industrially to produce recombinant cell lines producing target proteins.
  • the gene encoding the target protein was transduced into a CHO cell line lacking dfhr, and then gradually increased and treated to a concentration of MTX, thereby producing the target protein.
  • the process of increasing the concentration of MTX step by step for a long time and the number of cells to be selected in this process is less than 500 to 4000 groups, high productivity cell population Screening becomes labor intensive, time consuming and costly. Therefore, efforts to simplify this screening step have been attempted in various ways.
  • an object of the present invention is to provide a method for screening a highly expressed recombinant cell line using an expression vector comprising a selectable marker gene linked to polyA inoperable.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector used in the above screening method.
  • Still another object of the present invention is to provide a eukaryotic host cell line transfected with the expression vector.
  • the present invention (i) a gene expression cassette comprising a selectable marker gene linked to polyA inoperable; And (ii) a high expression recombinant cell line using an expression vector comprising a gene expression cassette encoding a target recombinant protein to which polyA is operably linked.
  • the present invention also provides a gene expression cassette comprising (i) a selectable marker gene linked to inoperable polyA; And (ii) a gene expression cassette encoding a recombinant protein of interest to which polyA is operably linked.
  • the present invention also provides a eukaryotic host cell line transduced with the expression vector.
  • a selection marker gene is a marker gene linked to a gene of a target protein and inserted into an expression vector.
  • the selection marker gene enables selection of cells in which the target gene is normally expressed.
  • adding an inhibitor of a protein encoded by the selectable marker gene to the medium may increase the number of copies of the selectable marker gene or increase the number of copies of the gene of the target protein linked to the increased selectable marker gene. To cause it.
  • Selection markers include dhfr gene, glutamine synthetase gene, neomycin phosphotransferase gene, hygromycin B phosphotransferase gene, puromycin-N-acetyltransfer Puromycin-N-acetyltransferase (pac) gene, or Streptoalloteichus hindustanus (Sh) ble gene.
  • polyA is a signal that cleaves a specific site at the 3 'end of eukaryotic mRNA and introduces about 100 to 200 adenine nucleotide (polyA tail) sequences after translation into the cleaved 3' end, the polyadenylation signal. Sequence refers to the consensus sequence AATAAA and downstream located about 10 to 30 nucleotides upstream from the cleavage site, and several polyA signals such as tk polyA, SV40 late and early polyA or BGH polyA, are known.
  • “Operably linked” means that one nucleic acid fragment is combined with another nucleic acid fragment so that its function or expression is affected by the other nucleic acid fragment. “Operably linked” is governed by a promoter sequence in which transcription of the gene sequence is operably linked, is governed by a translation control sequence in which translation of the gene sequence is operably linked, or post-translational processing of the gene sequence is activated A link between a gene sequence and a promoter or other regulatory or processing sequence, possibly governed by linked processing sequences. By “operably linked” is meant in the opposite sense to encompass not being operable due to artificial manipulation by methods such as cleavage, deletion, point mutations and amino acid replacement known to those skilled in the art.
  • the polyA has a great effect on the transcription and stability of mRNA and becomes shorter with time and begins to degrade mRNA when it is shortened to some extent. Therefore, the study focused on polyA to develop a new screening method, focusing on the fact that the half-life of mRNA is much shorter than that of normal mRNA when polyA does not operate normally.
  • a polyA linked to a selectable marker gene in an expression vector is inoperable and then transduced into a host cell and cultured under selection conditions where an inhibitor of the protein encoded by the selectable marker gene is present, Since a poorly functioning selection marker gene cannot stably produce mRNA, most of the cells will die under the selection conditions, and only those cells transfected with a large number of copies of the vector can survive. In this case, since the selection marker gene and the gene encoding the recombinant protein of interest are included together in the expression vector used for transduction, the gene encoding the target protein is also present in a large number of copies in proportion to the copy number of the selection marker gene. Done.
  • the inventors of the present invention have a 3 'end of the dhfr gene, which is a selection marker gene on the pCT107 vector (see FIG. 1).
  • the polyA was cleaved with a suitable restriction enzyme and manipulated so that it could not be operated. Compared.
  • the number of candidate cells of the recombinant protein producing cell line in the experimental group was 7.6 times smaller per plate inoculated with growth cells compared to the control group, and the growth rate was (1/26264) :( 1/814815), 31 times lower (see Table 2).
  • the experiment was performed using the system using the pac selection marker in CHO K1 cells.
  • the dhfr transcription unit (promoter-dhfr-polyA) on the pCT112 vector was removed, and the experimental group (pCT130 vector) (see FIG. 7) and SV40 into which only the SV40 promoter and the pac gene were inserted.
  • pCT129 vector a control vector
  • the present invention has been completed by confirming that the screening method of the present invention is useful for reducing cost and time in selecting a highly efficient recombinant protein-producing cell line using various screening markers.
  • the present invention provides an antibody comprising: (i) a gene expression cassette comprising a selectable marker gene linked to inoperable polyA; And (ii) a high expression recombinant cell line using an expression vector comprising a gene expression cassette encoding a target recombinant protein to which polyA is operably linked.
  • the expression vector may be an expression vector comprising a gene expression cassette comprising a selection marker gene from which polyA has been removed, instead of a gene expression cassette comprising a selection marker gene linked to inoperable polyA of (i). .
  • the present invention provides a gene expression cassette comprising (i) a selectable marker gene to which polyA is operably linked; And (ii) cutting the expression vector comprising a gene expression cassette encoding the recombinant protein of interest linked to polyA to be operable with a suitable restriction enzyme to linearize the expression vector such that polyA of (i) is inoperative.
  • a method of screening for expressing recombinant cell lines is provided.
  • the selection marker gene is a dhfr gene, glutamine synthetase gene, neomycin phosphotransferase gene, hygromycin B phosphotransferase gene, prouro Mycin-N-acetyltransferase (pac) gene, or Streptoalloteichus hindustanus (Sh) ble gene, but not limited to any of the selectable marker genes known to those skilled in the art. It can be used in the present invention.
  • the target recombinant protein is preferably a monoclonal antibody, but is not limited thereto.
  • the host cell is a human host cell including a eukaryotic host cell, preferably a CHO cell, a hybridoma cell, or an F2N cell, but is not limited thereto. Any cell line can be used in the present invention.
  • the present invention also provides a gene expression cassette comprising (i) a selectable marker gene linked to inoperable polyA; And (ii) a gene expression cassette encoding a recombinant protein of interest to which polyA is operably linked.
  • the expression vector may include a gene expression cassette including a selection marker gene from which polyA has been removed, instead of a gene expression cassette including a selection marker gene to which polyA of (i) is inoperatively linked.
  • the expression vector may include multiple cloning sites for the introduction of the gene encoding the target protein, instead of the gene encoding the target recombinant protein operably linked to the polyA of (ii).
  • the selectable marker gene is an amplifiable selectable marker gene, preferably a dhfr gene or a glutamine synthetase gene, but is not limited thereto.
  • the selection marker gene is a neomycin phosphotransferase gene, a hygromycin B phosphotransferase gene, a pac gene, or a shble gene, but is not limited thereto.
  • the target recombinant protein is preferably monoclonal antibody, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a eukaryotic host cell line transduced with the expression vector.
  • the host cell is preferably an animal cell, in the embodiment of the present invention used a CHO cell line, but is not limited thereto, including hybridoma cells, or human host cells including F2N cells. Therefore, any cell line for recombinant protein production known to those skilled in the art can be used in the present invention.
  • the transduction method is preferably used a method known to those skilled in the art.
  • a high-productivity cell clone can be selected for a population of cells 10 times or more smaller than a conventional cell line selection method, and a conventional stepwise gene amplification strategy including several amplification steps while increasing the amount of MTX.
  • a conventional stepwise gene amplification strategy including several amplification steps while increasing the amount of MTX.
  • high-productivity cell clones can be screened, resulting in more efficient recombinant protein production by reducing the time spent developing cell lines and reducing the labor and cost of selecting high-productivity cell clones. It is possible.
  • FIG. 1 is a cleavage map of a pCT107 expression vector, the restriction enzymes Pme I, Cla I and Rsr II shown on the map are designed to prevent pCT107 from activating the heavy chain gene, light chain gene and DHFR gene of the antibody encoded by the pCT107 expression vector. The site to cleave the vector is shown.
  • FIG. 3 is a graph comparing titers showing the selection of cell clones with and without polyA linked to the dhfr gene at 96 well-plate scale:
  • RsrII cut A linear pCT107 vector engineered to render polyA linked to the dhfr gene inoperable by treatment with Rsr II.
  • RsrII cut A linear pCT107 vector engineered to render polyA linked to the dhfr gene inoperable by treatment with Rsr II.
  • 5 is a graph comparing titers showing the selection of cell clones with and without polyA linked to the dhfr gene on a 6 well-plate scale:
  • RsrII cut A linear pCT107 vector engineered to render polyA linked to the dhfr gene inoperable by treatment with Rsr II.
  • FIG. 6 is a graph comparing the production of the control group and the experimental group in a batch culture state using a shake flask of six p-clone titers showing high titers according to the conditions with and without polyA:
  • RsrII cut A linear pCT107 vector engineered to render polyA linked to the dhfr gene inoperable by treatment with Rsr II.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of the expression vector cloning process of the pCT130 vector.
  • FIG. 8 is a schematic of the expression vector cloning process of the pCT129 vector.
  • pCT129 (with polyA): a control having polyA activity
  • pCT129 (with polyA): a control having polyA activity
  • FIG. 11 is a graph comparing the production of the control and experimental groups at the 6 well-plate scale:
  • pCT129 (with polyA): a control having polyA activity
  • Figure 13 is a graph comparing the production of the control group and the experimental group in batch culture using a shake flask.
  • Example 1 Derivation of inoperable polyA
  • pCT107 vector As a first step to investigate the expression level of the gene according to the presence or absence of polyA, three transcription units in the IgG antibody expression vector pCT107 vector (Fig. 1), the dhfr gene, the heavy chain gene and the light chain gene
  • the pCT107 vector was cut using Rsr II, Pme I and Cla I restriction enzymes, respectively, to render the polyA operably linked to the 3 ′ end of the.
  • the restriction enzymes Rsr II, Pme I, and Cla I linearize the IgG antibody expression vector by specifically recognizing and cleaving a specific sequence existing between the 3 'end of the dhfr gene, the heavy chain gene and the light chain gene, corresponding polyA. linearization).
  • the restriction enzyme treatment method is as follows. Three tubes were prepared and each tube was prepared with (i) 30 ⁇ g pCT107 vector DNA and Rsr II (R0501S, NEB) 10 U, (ii) 30 ⁇ g pCT107 vector DNA and Pme I (R0560S, NEB) 10 U, and (iii ) 30 ⁇ g of pCT107 vector DNA and 10 U of Cla I (R1097S, NEB) were mixed and treated at 37 ° C. for 4 hours. Next, 0.1 times volume of NaOAC and 3 times volume of 100% ethanol (EtOH) were added to each tube and stirred, and the mixture was left at -70 ° C for 30 minutes to precipitate DNA pellets.
  • EtOH 100% ethanol
  • the linearized vector according to Example 1 was transfected into CHO DG44 cells in equal amounts. The transduction was performed to the control group and the experimental group as shown in Table 1 below:
  • Control group Circular pCT107 Vector Not Treated with Restriction Enzyme Experimental group
  • B Linear pCT107 vector engineered to inactivate polyA linked to dhfr gene by treatment with Rsr II Experimental group
  • C R-linear pCT107 vector engineered with Pme I to inactivate polyA linked to dhfr gene
  • D Linear pCT107 vector engineered with Cla I to inactivate polyA linked to dhfr gene
  • the transduction method is as follows. CHO DG44 cells were seeded at 0.5 ⁇ 10 6 cells / well in a 6- well plate using MEM ⁇ medium (1140076, Invitrogen) containing 10% FBS (12105, Sigma), followed by FBS 24 hours later. Was replaced with MEM ⁇ medium. After 30 minutes, in each well, 2.5 ⁇ g of vector DNA of control (A), experimental group (B), experimental group (C) and experimental group (D) and 500 ⁇ l of Opti-SFM medium (12309-050, Invitrogen) were added well. After mixing, 6.25 ⁇ l of LTX (15338-100, Invitrogen) was added and stirred well using a vortex mixer. After the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, 500 ⁇ l was added to each well, and after 4 hours, the mixture was replaced with MEM ⁇ medium containing serum.
  • MEM ⁇ medium 1140076, Invitrogen
  • ELISA was performed three days after the transduction.
  • Goat's anti-human immunoglobulin G (Fc ⁇ ) (109-006-098, Jackson ImmunoReserarch) was adsorbed onto 96-well microtiter plates (449824, Nunc). The plates were blocked by treatment with phosphate buffered saline (PBS) containing 1% bovine serum albumin (BSA) and serially diluted samples were added to each well of the plate. After standing for 2 hours at room temperature, it was detected with a peroxidase-labeled goat anti-human ⁇ antibody (I1514, Sigma).
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • TMB tetramethyl benzidine
  • human IgG1 kappa purified myeloma plasma A7164, Sigma
  • the concentration was measured by reading the absorbance at 450/650 nm using a plate reader (Spectramax plus 384, Molecular Device).
  • the pCT107 vector was treated with Rsr II restriction enzymes (R0501, NEB) under the same treatment conditions as in Example 1 (Experimental Group (E)). And transduced into CHO DG44 cell line.
  • a pCT107 vector (control (A)) not treated with a restriction enzyme was used as a control. Transduction was performed in the same manner as in Example 1. The expression levels of IgG antibodies measured 3 days after the vectors of the control group (A) and the test group (E) were introduced into the cell line were 3.9 ⁇ g / ml and 3.8 ⁇ g / ml, respectively.
  • control (A) and experimental (E) cells were transferred to 96-well-plates, respectively, containing 2% fetal bovine serum (FBS) and 100 nM MTX (813630, Bedford Labs). Culture was performed using SFM4CHO TM medium (SH30549.02, HyClone). Inoculation was inoculated in 0.5 x 10 6 cells / 96 well-plate for the control group (A) and 2 x 10 6 cells / 96 well-plate for the experimental group (E).
  • the wells showing the high titer were selected from the wells with the cells growing.
  • 157 wells were selected from 514 wells in the control group (A) and 54 in the experimental group (E). 28 wells were selected from the wells.
  • the cells in the selected wells were transferred to 24-well-plates and the culture scale was increased to increase the culture scale.
  • the cell groups showing high titers in the 24-well-plates were transferred to the control group (A) and the experimental group (E). Six were selected and inoculated in 6-well-plates and cultured.
  • the six cell groups of the selected control group (A) and the experimental group (E) were named as p-clone, inoculated into a Erlenmeyer flask using a medium without FBS and MTX, and cultured under agitation conditions with the control group (A) and The productivity of the experimental group (E) was compared.
  • the cell lines used in the experiment were CHO K1 and F2N78 (human cell line), and each cell line was cultured in CD Opti CHO medium (12681, Invitrogen) and EX-CELL 293 serum-free medium (14571c, Sigma). The same medium was used in the example. Inoculation concentrations of cells were added to each well of 6 well-plates at 5 ⁇ 10 4 cells / ml and 15 ⁇ 10 4 cells / ml, which concentration per plate was based on the actual 96 well-plate standard. (20 ml) 1 ⁇ 10 6 ⁇ 10 6 cells sepogwa 3 corresponds to the concentration.
  • the concentrations of 1 ⁇ 10 6 cells and 3 ⁇ 10 6 cells in 96 well-plates are the cell concentrations used in the selection method using a selection marker that lacked polyA in Example 6.
  • Three concentrations of drug per cell line were applied and half of the culture medium (2.5 mL) was removed in each well every 3 days and the same amount of fresh medium was added.
  • the types and details of the treated drugs are indicated in Table 4 below.
  • the fresh medium always contained the drug at the indicated concentration.
  • the screening method using the dhfr selection marker gene linked to polyA inoperability was found to be very efficient in terms of cost and time saving for high-productivity cell clone selection in CHO DG44 cell line.
  • this screening method is applied to other screening markers and other cell lines other than the dhfr gene and the CHO DG44 cell line, this time, the screening method using the pac selection marker gene which is completely depleted of polyA was applied to the CHO K1 cell line. Reviewed.
  • the dhfr transcription unit (promoter-dhfr gene-polyA) is completely removed from the immunoglobulin expression vector (pCT112 vector), and the promoter-pac gene or promoter- is removed in order to completely remove the function of polyA.
  • pCT130 vector and pCT129 vector in which the pac gene-polyA was inserted were constructed (FIGS. 7 and 8). The vector production method is as follows.
  • the cloned pPRU vector was selected by using the Pvu II and BamH I (R0136S, NEB) restriction enzymes to insert the SV40 promoter, pac gene, and polyA at the position where the dhfr transcription unit of the pCT112 vector was removed.
  • PCT129 vector (FIG. 8) was produced.
  • CHO K1 cell lines were transfected with pCT129 vector and pCT130 vector, and two days later, 96 well-plates were inoculated respectively using a medium to which various concentrations of puromycin were added as shown in Table 5 below.
  • the medium used at this time is CD OptiCHO medium and FBS was not added.
  • the inoculation concentration of 0.3 ⁇ 10 6 cells / plate and the selection conditions of 6 ⁇ g / ml puromycin were appropriate.
  • 3 ⁇ 10 6 Inoculation concentrations of cells / plates and selection conditions using 6 ⁇ g / ml puromycin were appropriate.
  • a number of transfection experiments were performed to compare the expression levels of immunoglobulins by selecting similar numbers of p-clone from the group with the polyA (control) and the group without the selection marker (control group).
  • the high-productivity p-clone 129-4 and 130-35 were selected from each group for limiting dilution cloning (LDC).
  • LDC limiting dilution cloning
  • clones derived from the pCT130 vector had a higher yield than clones derived from the pCT129 vector (the yield of 7-18 ⁇ g / ml / 3 days). It is about twice as high. It can be seen that clones with higher productivity can be produced from vectors without polyA of the selection marker. In addition, in stationary culture conditions using shake flasks, which can examine productivity in a more practical manner, as shown in FIG. 13, clones derived from the pCT130 vector (experimental group) without polyA of the selection marker had a productivity of 62-72 ⁇ g / ml.
  • clones derived from the pCT129 vector (control) with polyA of the selection marker showed a productivity of 2-10 ⁇ g / ml.
  • clones derived from the pCT130 vector (experimental group) showed a six-fold productivity. This remarkable difference may be attributed to the fact that clones derived from the pCT129 vector (control) are likely to be either inhibited by the expression of the IgG gene or readily deleted in the absence of selection conditions.
  • the present invention can obtain a cell line with a high antibody expression amount compared to the cell line transduced with the expression vector containing the polyA of the selection marker, the cell line transduced with the expression vector without the polyA of the selection marker. It can be seen that. Therefore, the screening method according to the present invention can reduce the time for screening high-productivity cell clones as compared to conventional stepwise gene amplification strategies that include several amplification steps while increasing the amount of MTX, and thus human / physical development. This is a way to reduce costs.

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Abstract

본 발명은 (i) polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 이용한 고발현 재조합 세포주의 선별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존의 세포주 선별 방법보다 10 배 이상 적은 수의 세포군을 대상으로 고생산성 세포 클론의 선별이 가능하고, 특히 MTX의 양을 증가시키면서 수회 증폭 단계를 포함하는 통상적인 단계적 유전자 증폭 전략과 비교하여 저농도의 MTX를 사용하여 고생산성 세포 클론을 선별할 수 있으므로 세포주 개발 기간을 단축시킬 수 있고, MTX가 아닌 일반 선별 마커 유전자를 사용할 때에도 보다 효율적인 단백질의 생산이 가능하다.

Description

고발현 재조합 세포주의 선별 방법 {A METHOD FOR AN EFFEICIENT SELECTION OF CELL LINE PRODUCING RECOMBINANT PROTEINS}
본 발명은 고발현 재조합 세포주의 선별 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 (i) polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 이용한 고발현 재조합 세포주의 선별 방법 및 그 발현 벡터에 관한 것이다.
생물학 또는 의학 분야에 있어서 생산하고자 하는 목적 단백질은 목적 단백질의 유전자를 발현 벡터에 삽입하고, 상기 삽입된 발현 벡터를 생산하고자 하는 세포주에 형질 도입하여 제조된 세포주를 대량으로 배양하고, 이를 알맞은 방법으로 분리 및 정제 과정을 거쳐 수득된다.
이를 위하여 산업적으로 사용되는 방법의 일례로는 CHO(Chinese hamster ovary) dhfr(dihydrofolate reductase)(-), CHO K1, BHK(Baby Hamster Kidney), NS0, SP2/0 및 인간 세포주 등을 이용한 방법이 있다(Ogata, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, 38(4), 520-525; Kratje, et al., Biotechnol. Prog., 1994, 10(4), 410-20; Peakman, et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 1994, 5(1-2), 65-74).
목적하는 외래 유전자를 발현하는 안정한 포유 동물 세포주를 제작하기 위하여, 외래 유전자는 일반적으로 선별 마커 유전자(예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제)와 함께 바람직한 세포주로 형질 도입에 의해 삽입된다. 외래 유전자 및 선별 마커 유전자는 단일 벡터 또는 동시 형질 도입되는 개별 벡터들에 의해 발현될 수 있다. 형질 도입시킨 후 2 내지 3일째, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제-유전자를 사용하는 경우, 세포를 G418과 같은 선별제를 함유하는 배지로 옮기고 이들 선별 조건 하에 몇 주 동안 배양한다. 이어서 출현하는 내성 세포를 분리할 수 있고 목적하는 유전자 생성물의 발현을 조사한다. 숙주 세포 게놈으로 무작위로 비방향적으로 통합된 결과로서, 완전히 상이한 비율로 외래 유전자를 발현하는 세포 집단을 수득한다. 이들은 또한 선별 마커가 발현되지만 목적하는 유전자를 발현하지 않는 비발현 세포를 포함할 수 있다. 따라서 목적하는 외래 유전자의 발현이 매우 높은 세포 클론을 동정하기 위해서는 다수의 클론을 조사하고 시험할 필요가 있고 이는 시간 소모적이면서 많은 노동과 비용을 초래한다.
유전자 증폭은 재조합 단백질을 제조하는데 사용되는 동물 세포 배양에서 보편화된 작업으로서, 유전자 증폭은 다수의 포유동물 세포주가 본래 가지는 상대적으로 낮은 생산성을 급격하게 개선시킨다. 광범위하게 사용되는 하나의 증폭 기술은 dhfr 계열의 유전자 증폭 시스템이고, 이는 dhfr 결핍 CHO 세포에서 매우 흔히 사용된다.
dhfr이 결핍된 CHO 세포주가 산업적으로 선호되는 이유로는 다음과 같은 점들을 들 수 있다: (1) 단백질의 번역 후 수정 과정(posttranslational modification), 즉 글리코실화(glycosylation) 과정이나 인산화(phosphorylation) 과정이 다른 세포주보다 더욱 인간 세포와 유사하다; (2) 부착배양 뿐만 아니라 부유배양이 가능하다; (3) 무혈청 배지에서 다른 세포에 비하여 상대적으로 고농도 배양이 가능하다; (4) 미생물에 비하여 현저히 낮은 목적 단백질 생산성을 dhfr/MTX(methotrexate) 유전자 증폭시스템을 이용하여 증가시킬 수 있다; 및 (5) 안정성이 검증되어 FDA와 같은 감독기관으로부터 허가를 쉽게 받을 수 있다. 상기와 같은 이유로 목적 단백질을 생산하는 재조합 세포주를 제작하기 위하여 dhfr이 결핍된 CHO 세포주가 산업적으로 널리 사용되고 있다.
그러나 광범위하게 사용되는 dhfr/MTX 유전자 증폭시스템을 이용하는 경우에도, 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 dfhr이 결핍된 CHO 세포주에 형질 도입한 후, MTX의 농도로 단계적으로 증가하여 처리함으로써, 목적 단백질의 생산량을 현저히 높일 수 있다는 장점이 있음에도 불구하고, 오랜 시간 동안 MTX의 농도를 단계적으로 높여서 처리하는 과정과 이 과정에서 선별해야 할 세포군의 수가 적게는 500군서부터 4000군이 넘기 때문에, 높은 생산성을 가지는 세포군을 선별하는 단계가 노동 집약적이고 시간 및 비용 소모적이게 된다. 따라서 이러한 선별 단계를 간소화하기 위한 노력이 다각도로 시도되고 있다.
그 일환으로, 당업계의 연구자들은 1) 시작 코돈(start codon) 주위를 변형시켜 선별 마커 유전자의 발현을 저하시키는 방법(Reff, US Patent 5,733,799, 1998); 2) 선별 마커 유전자를 돌연변이시켜 그 유전자의 기능을 저하시키는 방법(Niwa et al., Gene 108, 193-200, 1991; Sauter and Enenkel, Biotechnol. Bioeng. 89, 530-538, 2005); 3) 시작 코돈 자체를 변형시키고 이를 발현하고자 하는 유전자와 연결하여 레벨을 증가시키는 방법(van Blokland et al., J of Biotechnology 128, 237-245, 2007); 및 4) 선별 마커 유전자를 인트론(intron)과 연결시켜 발현하는 방법(Lucas et al., Nucleic Acids Res. 24, 1774-1779, 1996) 등을 응용하여 선별 단계를 간소화시키고자 노력하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이용한 고발현 재조합 세포주의 선별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 선별 방법에 이용되는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터가 형질 도입된 진핵 숙주 세포주를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 이용한 고발현 재조합 세포주의 선별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질 도입된 진핵 숙주 세포주를 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 정의한다.
선별 마커 유전자(selection marker gene)란 목적 단백질의 유전자와 연결되어 발현 벡터에 삽입된 마커 유전자로서, 목적 유전자가 정상적으로 발현되는 세포를 선별 확인할 수 있게 한다. 또한 선별 마커 유전자가 암호화하는 단백질의 억제제를 배지에 첨가하면 선별 마커 유전자의 카피(copy)수를 증가시키거나 증가된 선별 마커 유전자에 연결되어 있는 목적 단백질의 유전자의 카피수를 함께 증가된 결과를 초래시킬 수 있게 한다. 선별 마커로는 dhfr 유전자, 글루타민 신테타제(glutamine synthetase) 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycine phosphotransferase) 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(hygromycin B phosphotransferase) 유전자, 푸로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제(puromycin-N-acetyltransferase; pac) 유전자, 또는 스트렙도알로데이커스 힌더스터너스(Streptoalloteichus hindustanus: Sh) ble 유전자 등이 있다.
"polyA”는 진핵 mRNA의 3’ 말단에서 특정 부위를 절단시키고 절단된 3’ 말단에 약 100 내지 200개의 아데닌 뉴클레오타이드(polyA tail) 서열을 번역 후 도입하는 시그널로서 상기 폴리아데닐화 시그널(polyadenylation signal) 서열은 절단 부위에서 약 10 내지 30 뉴클레오타이드 상류에 위치한 보존(consensus) 서열 AATAAA 및 하류에 위치한 서열을 말한다. tk polyA, SV40 late 및 early polyA 또는 BGH polyA 등과 같은 여러 가지 polyA 시그널이 공지되어 있다.
“작동 가능하도록 연결된(operably linked)”이란 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. “작동 가능하도록 연결된”은 유전자 서열의 전사가 작동가능하게 연결된 프로모터 서열에 의해 지배되고, 유전자 서열의 번역이 작동 가능하게 연결된 번역 조절 서열에 의해 지배되고, 또는 유전자 서열의 번역-후 처리가 작동가능하게 연결된 처리 서열에 의해 지배되는, 유전자 서열과 프로모터 또는 다른 조절 또는 처리 서열 간의 연결을 의미한다. "작동 불가능하도록 연결된"은 이와 반대되는 의미로서 당업자에게 공지된 절단, 결실, 점 돌연변이 및 아미노산 교체와 같은 방법으로 인위적인 조작으로 인하여 작동 가능하지 않도록 되는 것을 포괄하여 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 새로운 고발현 재조합 세포 클론을 선별하는 방법에 대하여 연구하던 중, polyA가 mRNA의 전사와 안정성에 큰 영향을 끼치며 시간이 지날수록 길이가 짧아져 어느 정도 짧아졌을 경우 mRNA가 분해되기 시작하기 때문에 polyA가 정상적으로 작동하지 않으면 mRNA의 반감기가 정상 mRNA에 비해 아주 짧다는 점에 착안하여 새로운 선별 방법을 개발하기 위하여 polyA에 주목하고 연구를 수행하였다.
예를 들어, 발현 벡터 내의 선별 마커 유전자에 연결된 polyA를 작동 불가능하도록 조작한 후, 이를 숙주 세포 내로 형질 도입하여 선별 마커 유전자가 암호화하는 단백질의 억제제가 존재하는 선별 조건 하에서 배양하는 경우에는, polyA가 정상적으로 작동하지 않은 선별 마커 유전자는 안정적으로 mRNA를 생산해 낼 수 없으므로 상기 선별 조건 하에서는 대부분의 세포가 사멸할 것이며, 그 중에서 많은 카피수의 벡터가 형질 도입된 세포만이 생존할 수 있게 된다. 이 때, 형질 도입에 이용된 발현 벡터 내에는 선별 마커 유전자와 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 유전자가 함께 포함되어 있으므로 선별 마커 유전자의 카피수와 비례하여 목적 단백질을 암호화하는 유전자 또한 많은 카피수로 존재하게 된다.
이와 같이 선별 마커 유전자에 연결된 polyA의 작동 유무가 새로운 고발현 세포주의 선별 방법으로 적용될 수 있음을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 pCT107 벡터(도 1 참조) 상의 선별 마커 유전자인 dhfr 유전자의 3' 말단에 연결된 polyA를 적당한 제한 효소로 절단하여 polyA가 작동하지 않도록 조작한 후 이를 CHO DG44 세포주(실험군)에 형질 도입하여 제한 효소를 처리하지 않은 pCT107 벡터를 형질 도입한 CHO DG44 세포주(대조군)와 선별 과정을 비교하였다. 그 결과, 실험군 중에서 재조합 단백질 생산 세포주 후보군의 숫자가 대조군에 비교하였을 때 성장이 있는 세포의 웰 수가 접종된 플레이트당 7.6 배 정도 적었으며, 또한 성장을 진행하는 세포비율은 (1/26264):(1/814815)로서 31 배가 낮음을 확인하였다(표 2 참조).
다음으로 성장을 진행하는 세포군들에서 생산성을 비교하기 위하여 각 군에서 최상위 생산성을 나타내는 6개의 세포주를 선별하여 생산성을 조사하였다. 대조군의 경우 6개의 p-clone들 중에서 1개의 p-clone만이 약 100 ㎍/㎖/3일의 생산성을 나타낸 반면, 실험군의 경우에는 6개의 p-clone들 중에서 4개의 p-clone들이 약 100 ㎍/㎖/3일의 생산성을 나타내는 것을 확인하였다(도 6 참조).
또한 앞서 확인한 본 발명의 선별 방법이 CHO DG44 세포에서의 dhfr 선별 마커를 이용한 시스템이 아닌 또 다른 시스템에서도 적용되는지 확인하기 위하여 CHO K1 세포에서의 pac 선별 마커를 이용한 시스템을 이용하여 실험하였다. 먼저 pCT112 벡터(도 7 및 8 참조) 상의 dhfr 전사 단위(프로모터-dhfr-polyA)를 제거하고, 여기에 SV40 프로모터(promoter)와 pac 유전자만을 삽입한 실험군(pCT130 벡터)(도 7 참조)과 SV40 프로모터와 pac 유전자 및 polyA(pac 전사 단위)를 삽입한 대조군 벡터(pCT129 벡터)(도 8 참조)를 제작한 후, CHO K1 세포에 형질 도입하여 대조군 세포주와 실험군 세포주를 선별한 후 생산성을 조사하였다. 도 9 내지 13에서 보여지는 바와 같이, 대조군(pCT129 벡터)에서 유래된 클론에 비해 실험군(pCT130 벡터)에서 유래된 클론의 생산성이 높음을 확인할 수 있다. 특히 상기 웰-플레이트를 이용한 선별 단계에서의 단백질 생산성과 비교시, 보다 실질적인 생산성을 나타내는 쉐이크 플라스크를 이용한 회분식 배양(batch culture)에서는 실험군에서 유래된 단일세포 유래 클론의 생산성(67-72 ㎍/㎖)이 대조군에서 유래된 단일세포 유래 클론의 생산성(2-10 ㎍/㎖)이 보다 훨씬 높음을 알 수 있다.
이를 통해 본 발명의 선별 방법이 여러 가지 선별 마커를 이용한 고효율 재조합 단백질 생산 세포주 선별에 있어서 비용 및 시간을 절감하는데 유용함을 확인함으로 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (i) polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 이용한 고발현 재조합 세포주의 선별 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 (i)의 polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트 대신, polyA를 제거한 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터일 수 있다.
본 발명은 (i) polyA가 작동 가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 적당한 제한 효소로 절단하여 (i)의 polyA가 작동하지 않도록 발현 벡터를 선형화시키는 단계를 포함하는 고발현 재조합 세포주의 선별 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 선별 마커 유전자는 dhfr 유전자, 글루타민 신테타제(glutamine synthetase) 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycine phosphotransferase) 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(hygromycin B phosphotransferase) 유전자, 푸로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제(puromycin-N-acetyltransferase; pac) 유전자, 또는 스트렙도알로데이커스 힌더스터너스(Streptoalloteichus hindustanus: Sh) ble 유전자이나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려지 선별 마커 유전자라면 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 재조합 단백질은 바람직하게는 모노클로날 항체이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포는 진핵 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 하이브리도마 세포, 또는 F2N 세포를 포함하는 인간 숙주 세포이나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 공지된 재조합 단백질 생산을 위한 세포주라면 본 발명에서 모두 이용 가능하다.
또한, 본 발명은 (i) polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 상기 (i)의 polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트 대신, polyA를 제거한 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 (ii)의 polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 대신, 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 도입을 위한 다중 클로닝 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 선별 마커 유전자는 증폭 가능한 선별 마커 유전자, 바람직하게는 dhfr 유전자 또는 글루타민 신테타제 유전자이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 선별 마커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자, pac 유전자, 또는 Sh ble 유전자이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 재조합 단백질이 모노클로날 항체가 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질 도입된 진핵 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포는 동물 세포인 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 CHO 세포주를 이용하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, 하이브리도마 세포, 또는 F2N 세포를 포함하는 인간 숙주 세포 등을 포함하여 당업자에게 공지된 재조합 단백질 생산을 위한 세포주라면 본 발명에서 모두 이용 가능하다. 상기 형질 도입 방법은 당업자에게 공지된 방법을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 기존의 세포주 선별 방법보다 10 배 이상 적은 수의 세포군을 대상으로 고생산성 세포 클론의 선별이 가능하고, 특히 MTX의 양을 증가시키면서 수회 증폭 단계를 포함하는 통상적인 단계적 유전자 증폭 전략과 비교하여 저농도의 MTX를 사용하여 고생산성 세포 클론을 선별할 수 있으므로, 결과적으로 세포주 개발 기간의 단축과 고생산성 세포 클론의 선별에 소요되는 노동 및 비용을 줄임으로써, 보다 효율적인 재조합 단백질의 생산이 가능하다.
도 1은 pCT107 발현 벡터의 개열 지도로서 지도상에 표시된 제한 효소 Pme I, Cla I 및 Rsr II은 pCT107 발현 벡터가 암호화하고 있는 항체의 중쇄 유전자, 경쇄 유전자 및 DHFR 유전자에 연결된 pA가 작동하지 않도록 pCT107 벡터를 절단시키는 부위를 나타낸다.
도 2는 대조군(A), 실험군(B), 실험군(C) 및 실험군(D)의 발현 벡터가 각각 형질 도입된 CHO 세포에서 IgG 항체의 발현 타이터를 측정한 결과이다:
대조군(A): 제한 효소로 처리하지 않은 환형 pCT107 벡터;
실험군(B): Rsr II로 처리하여 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터;
실험군(C): Pme I으로 처리하여 중쇄 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터; 및
실험군(D): Cla I으로 처리하여 경쇄 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터,
* ELISA의 특성으로 인하여 시료에 중쇄나 경쇄가 없는 경우(실험군(C) 및 실험군(D))에서는 IgG 항체의 타이터가 측정되지 않았다. 실험은 총 5 회 진행되었으며, 오차 범위는 표준 오차로 나타내었다.
도 3은 96 웰-플레이트 스케일에서의 dhfr 유전자에 연결된 polyA의 유무에 따라 세포 클론의 선별 과정이 나타난 타이터를 비교한 그래프이다:
uncut: 정상적인 환형 pCT107 벡터; 및
RsrII cut: Rsr II로 처리하여 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터.
도 4는 24 웰-플레이트 스케일에서의 dhfr 유전자에 연결된 polyA의 유무에 따라 세포 클론의 선별 과정이 나타난 타이터를 비교한 그래프이다:
uncut: 정상적인 환형 pCT107 벡터; 및
RsrII cut: Rsr II로 처리하여 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터.
도 5는 6 웰-플레이트 스케일에서의 dhfr 유전자에 연결된 polyA의 유무에 따라 세포 클론의 선별 과정이 나타난 타이터를 비교한 그래프이다:
uncut: 정상적인 환형 pCT107 벡터; 및
RsrII cut: Rsr II로 처리하여 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터.
도 6은 polyA의 유무에 따른 조건에 따라 높은 타이터를 보여 선별된 6개의 p-clone의 타이터를 쉐이크 플라스크를 이용한 회분식 배양(batch culture) 상태에서 대조군과 실험군의 생산량을 비교한 그래프이다:
uncut: 정상적인 환형 pCT107 벡터; 및
RsrII cut: Rsr II로 처리하여 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터.
도 7은 pCT130 벡터의 발현 벡터 클로닝 과정 도식도이다.
도 8은 pCT129 벡터의 발현 벡터 클로닝 과정 도식도이다.
도 9는 96 웰-플레이트 스케일에서의 대조군과 실험군의 생산량을 비교한 그래프이다:
pCT129(with polyA): polyA 활성을 가지는 대조군; 및
pCT130(without polyA): polyA 결실된 실험군.
도 10은 24 웰-플레이트 스케일에서의 대조군과 실험군의 생산량을 비교한 그래프이다:
pCT129(with polyA): polyA 활성을 가지는 대조군; 및
pCT130(without polyA): polyA 결실된 실험군.
도 11은 6 웰-플레이트 스케일에서의 대조군과 실험군의 생산량을 비교한 그래프이다:
pCT129(with polyA): polyA 활성을 가지는 대조군; 및
pCT130(without polyA): polyA 결실된 실험군.
도 12는 6 웰-플레이트 스케일에서의 대조군과 실험군의 생산량을 비교한 그래프이다.
도 13은 쉐이크 플라스크를 이용한 회분식 배양에서 대조군과 실험군의 생산량을 비교한 그래프이다.
약어
dhfr 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase)
CHO 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)
polyA 폴리아데닐화 시그널(polyadenylation signal)
p-clone 단일세포 유래 클론이 아닌 예비 클론(preliminary clone)
MTX 메토트렉세이트(methotrexate)
ELISA 효소 연결된 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay)
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다.
단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 작동 불가능한 polyA의 유도
polyA의 유무에 따른 유전자의 발현 정도를 조사하기 위한 첫 단계로서, IgG 항체 발현 벡터인 pCT107 벡터(도 1) 내의 3 가지 전사 단위체인 dhfr 유전자, 중쇄(heavy chain) 유전자 및 경쇄(light chain) 유전자의 3' 말단에 작동 가능하도록 연결된 polyA를 작동 불가능한 상태로 만들기 위하여 상기 pCT107 벡터를 각각 Rsr II, Pme I 및 Cla I 제한 효소를 이용하여 절단하였다. 상기 제한 효소 Rsr II, Pme I 및 Cla I는 각각 dhfr 유전자, 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 3' 말단에서부터 해당 polyA 사이에 존재하는 일정 서열을 특이적으로 인식하여 절단함으로써 상기 IgG 항체 발현 벡터를 선형화(linearization)시키는 제한효소이다.
제한 효소 처리 방법은 하기와 같다. 3 개의 튜브를 준비한 후 각 튜브에 (i) pCT107 벡터 DNA 30 ㎍와 Rsr II(R0501S, NEB) 10 U, (ii) pCT107 벡터 DNA 30 ㎍와 Pme I(R0560S, NEB) 10 U, 및 (iii) pCT107 벡터 DNA 30 ㎍와 Cla I(R1097S, NEB) 10 U를 혼합하고 37℃에서 4 시간 동안 처리하였다. 다음으로, 총 시료 부피의 0.1 배 부피의 NaOAC와 3 배 부피의 100 % 에탄올(EtOH)을 각 튜브에 넣고 교반한 후, -70℃에서 30 분 동안 방치하여 DNA 펠렛(pellet)을 침전시켰다. 이어서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리시켜 DNA 튜브 바닥으로 침전시키고, 튜브에 남아 있는 에탄올을 제거하였다. 이후 동일 부피의 70 % 에탄올을 이용하여 펠렛을 세척한 후, 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리하였고, 튜브에 남아 있는 에탄올을 제거 후에 DNA 펠렛을 10 분간 공기 중에서 건조시켰다. 건조된 펠렛에 증류수를 첨가하고 상온에서 10 분간 방치 후 파이펫(pipette)을 이용하여 DNA 펠렛이 완전히 증류수에 용해될 수 있도록 리서스펜션(resuspesion)시켰다. 나노드롭(Nanodrop 1000, Thermo scientific)을 이용하여 DNA의 농도를 측정한 뒤 아가로스 젤(agarose gel)을 이용한 전기영동을 수행하여 벡터 DNA가 각각 Rsr II, Pme I 또는 Cla I 제한효소에 의해 선형화되었는지를 확인하였다. 발현 벡터의 선형화는 pCT107 벡터 중의 3 종류의 전사 단위체인 중쇄 유전자, 경쇄 유전자 및 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 모두 작동 불가능하게 되었음을 의미한다.
실시예 2: CHO 세포주로의 형질 도입
실시예 1에 따라 선형화된 벡터를 CHO DG44 세포에 동일한 양으로 형질 도입하였다. 다음 표 1과 같은 대조군과 실험군으로 형질 도입을 수행하였다:
표 1
대조군(A) 제한효소로 처리하지 않은 환형 pCT107 벡터
실험군(B) Rsr II로 처리하여 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터
실험군(C) Pme I으로 처리하여 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 R선형 pCT107 벡터
실험군(D) Cla I으로 처리하여 dhfr 유전자에 연결된 polyA가 작동 불가능하도록 조작된 선형 pCT107 벡터
형질 도입 방법은 하기와 같다. CHO DG44 세포를 10 % FBS(12105, Sigma)를 포함한 MEMα 배지(1140076, Invitrogen)를 이용하여 6-웰-플레이트(well plate)에 0.5X106 세포/웰로 접종한 후, 24 시간 뒤에 FBS를 포함하지 않는 MEMα 배지로 교체하였다. 30 분 경과 후, 각각의 웰에 대조군(A), 실험군(B), 실험군(C) 및 실험군(D)의 벡터 DNA 2.5 ㎍과 Opti-SFM 배지(12309-050, Invitrogen) 500 ㎕를 넣고 잘 혼합한 뒤, LTX(15338-100, Invitrogen) 6.25 ㎕를 첨가하고 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 이용하여 잘 교반하였다. 상기 혼합물을 상온에서 30 분간 방치한 후, 각 웰에 500 ㎕씩 첨가하고 이후 4 시간 뒤에 혈청이 포함된 MEMα 배지로 다시 교체하였다.
실시예 3: ELISA를 이용한 IgG 항체 유전자의 발현 확인
IgG 항체 유전자의 발현 유무를 확인하기 위하여, 형질 도입 3 일 후에 ELISA를 수행하였다. 먼저 염소의 항-인간 면역글로불린 G(Fcγ)(109-006-098, Jackson ImmunoReserarch)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(449824, Nunc) 위에 흡착시켰다. 상기 플레이트를 1 % 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin)이 함유된 포스페이트 완충 생리식염수(PBS, Phospate-buffered Saline)로 처리하여 블로킹한 후, 연속 희석한 샘플을 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 2 시간 방치한 다음, 과산화효소가 붙은 염소의 항-인간 카파 항체(peroxidase-labeled goat anti-human κ antibody)(I1514, Sigma)로 감지하였다. 실온에서 1 시간 방치한 후에 테트라메틸 벤지딘(TMB, tetramethyl benzidine)과 반응시키고, 1 N HCl을 가하여 반응을 중지시켰다. 스탠더드(standard)로는 골수종 플라스마에서 정제된 인간 IgG1 카파(human IgG1 kappa purified myeloma plasma)(A7164, Sigma)를 250 ng/㎖의 농도부터 사용하였다. 이를 플레이트 리더(Spectramax plus 384, Molecular Device)를 사용해 450/650 nm에서 흡광도를 읽어 농도를 측정하였다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군(A)과 실험군(B)에서는 IgG가 정상적으로 발현하였으나, 실험군(C) 및 실험군(D)의 경우에는 IgG가 정상적으로 발현되지 않았다. 이를 통해 해당 유전자의 3' 말단에 연결된 polyA가 작동하지 않도록 조작한 유전자 발현 카세트의 경우, 해당 유전자가 암호화하는 단백질이 정상적으로 발현되지 않음을 알 수 있었다(실험군 (C) 및 실험군(D)). 또한 적어도 선별 드럭(drug)을 사용하지 않고 배양하는 일시적 형질 도입(transient transfection)에서는 선별 마커 유전자가 암호화하는 단백질(DHFR 단백질)의 발현 유무가 발현 벡터 중의 해당 유전자가 암호화하는 단백질, 특히 항체의 발현량에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: polyA가 작동하지 않는 dhfr 선별 마커 유전자를 이용한 세포 클론의 선별
선별 마커 유전자인 dhfr 유전자의 3' 말단에 연결된 polyA가 작동되지 않도록 조작하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 처리 조건 하에서 pCT107 벡터를 Rsr II 제한 효소(R0501, NEB)로 처리(실험군(E))하여 CHO DG44 세포주에 형질 도입하였다. 대조군으로는 제한 효소로 처리하지 않은 pCT107 벡터(대조군(A))를 사용하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 형질 도입을 수행하였다. 대조군 (A)의 벡터와 실험군 (E)의 벡터를 세포주에 도입하고 3일 후 측정한 IgG 항체의 발현량은 각각 3.9 ㎍/㎖ 및 3.8 ㎍/㎖이었다. 형질 도입 후 배양 3 일째 되는 날 대조군(A) 세포 및 실험군(E) 세포를 각각 96-웰-플레이트에 옮긴 다음 2% FBS(fetal bovine serum) 및 100 nM MTX(813630, Bedford Labs)가 포함된 SFM4CHOTM 배지(SH30549.02, HyClone)를 이용하여 배양하였다. 대조군(A)의 경우 0.5×106 세포/96 웰-플레이트, 실험군(E)의 경우 2×106 세포/96 웰-플레이트에 접종하여 배양하였다.
배양 후 성장을 진행하는 세포가 있는 웰의 개수를 조사한 결과 대조군(A)의 경우 총 2,592 개의 웰 중 514 개의 웰(19.8%)이, 실험군(E)의 경우 총 2112개의 웰 중 54 개의 웰(2.5%)이 세포 성장으로 보였다. 상기 대조군(A)와 실험군(E)의 경우 수치상으로 볼 때 1 개의 96 웰-플레이트에서 대조군(A)의 경우 19개의 웰에서, 실험군(E)의 경우 2.5개의 웰에서만 성장을 진행하는 세포가 존재하였다. 이러한 결과를 토대로 하여 세포 성장을 보이는 각각의 웰에서 자라는 세포들이 하나의 세포에서 유래되었다고 가정하였을 때, 각각의 집단에서 성장을 진행하는 세포의 비율은 31:1(대조군(A):실험군(E))로서 더 큰 차이가 있음을 확인할 수 있었다(하기 표 2, 도 3 내지 5).
표 2
대조군(A) 실험군(E) 대조군(A)/실험군(E)
접종 플레이트 수 27 22 -
총 웰 수 2,592 2,112 -
양성 성장 반응 보이는 웰 수 514 (19.8%) 54 (2.5%) 9.5
양성 성장 반응 보이는 웰 수/접종 플레이트 수 19.8 2.6 7.8
접종 농도 0.5x106 세포/플레이트 2.0x106 세포/플레이트 -
총 접종 세포수 1.35x107 세포 4.4x107 세포 -
양성 성장 세포 비율 1/26,264 세포 1/814,815 세포 31
다음으로 성장을 진행하는 세포를 가진 웰 중에서 높은 타이터(titer)를 보이는 웰을 선별한 결과, 대조군(A)의 경우 514 개의 웰 중에서 157 개의 웰을 선별하였고, 실험군(E)의 경우 54 개의 웰 중에서 28 개의 웰을 선별하였다. 이 후 상기 선별된 웰 내의 세포를 24-웰-플레이트로 옮겨 배양 스케일을 증가시켜 배양한지 3일 후에 상기 24-웰-플레이트에서 높은 타이터를 보이는 세포군을 대조군(A) 및 실험군(E)에 대하여 각각 6 개씩 선별하여 6-웰-플레이트에 접종하여 배양하였다. 상기 선별된 대조군(A)과 실험군(E)의 6개 세포군을 p-clone으로 명명하고, FBS와 MTX가 없는 조건의 배지를 이용하여 삼각 플라스크에 접종하고 교반 조건에서 배양하여 대조군(A)과 실험군(E)의 생산성을 비교하였다.
그 결과, 대조군(A)의 경우 6 개의 p-clone 중 1 개의 p-clone만이 약 100 ㎍/㎖/3일의 생산성을 나타낸 반면, 실험군(E)의 경우 6 개의 p-clone 중에서 4 개의 p-clone이 대략 100 ㎍/㎖/3일 정도의 생산성을 보였다(도 6).
실시예 5: 선별 마커 유전자의 활용성을 위한 세포성장 조건
여러 가지의 세포주에서 유전자 증폭에 관여하지 않는 일반 선별 마커 유전자의 활용성을 보기 위하여 각 선별 마커 유전자에 작용하는 드럭(drug)을 세포별로 표 3에 기술한 조건과 같이 적용하여 세포 성장의 억제 범위를 측정하였다.
실험에 사용된 세포주는 CHO K1과 F2N78(human cell line)이었고, 각각의 세포주는 CD Opti CHO 배지(12681, Invitrogen)와 EX-CELL 293 serum-free 배지(14571c, Sigma)에서 배양하던 것으로 본 실시예에서도 동일한 배지를 사용하였다. 세포의 접종 농도는 5×104 세포/㎖과 15×104 세포/㎖로 6 웰-플레이트의 각 웰에 5 ㎖씩 첨가하였는데, 이 농도는 실제 96 웰-플레이트 기준으로 볼 때, 플레이트 당(20 ㎖) 1×106 세포과 3×106 세포 농도에 해당한다. 96 웰-플레이트에서의 1×106 세포과 3×106 세포 농도는 실시예 6에서 polyA가 결실된 선별 마커를 이용한 선별 방법에서 사용되는 세포 농도이다. 세포주별 3가지 농도의 드럭을 적용하였으며 매 3일마다 각 웰에 절반의 배양 배지(2.5 ㎖)를 제거하고, 동일 양의 새로운 배지를 넣었다. 처리된 드럭의 종류 및 상세 정도는 하기 표 4에 명시하였다. 이때 새로운 배지는 항상 지정된 농도의 드럭을 포함하고 있었다.
2주 후 트립판 블루(trypan bule)를 이용한 세포 염색 방법을 통해, 모든 드럭 처리 조건(표 2)에서 형질 도입을 진행하지 않은 CHO K1 세포와 F2N 세포의 성장이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 즉, 형질 도입 후 이러한 드럭 처리 조건에서 배양하였을 때, 성장을 진행하는 세포가 있다는 것은 형질 도입된 선별 마커 유전자에 의해 처리된 드럭이 불활성화됨으로써, 세포가 성장하는 것임을 의미한다.
표 3 CHO K1 세포 및 F2N 세포에 대x한 다양한 드럭 처리 조건
Blasticidin(㎍/㎖) G418(㎍/㎖) HygB(㎍/㎖) puromycin(㎍/㎖) Zeocin(㎍/㎖)
선별마커 유전자 약자 Bsd neo Hyg pag Zeo
CHO K1 102040 4008001200 2505001000 4816 2505001000
F2N 102040 적용 불가* 200400800 248 200400800
(* F2N 세포는 neo 유전자를 포함하고 있음)
표 4 선별 드럭의 정보
선별 드럭 제조사 선별마커 유전자 Cat #
G418 또는 Geneticinⓡ(Invitrogen brand name) Invitrogen G418 10131-035
Puromycin Invitrogen pac A11138-03
Blasticidin SHCl Invitrogen bsd, bsr A11139-03
ZeocinTM Invitrogen sh ble(zeor) R250-01
Hygromycin B(mycophenolic acid) Invitrogen hyg, hph 10678-010
실시예 6: polyA가 없는 pac 선별 마커 유전자를 이용한 생산세포주 확립
앞서 polyA가 작동 불가능하도록 연결된 dhfr 선별 마커 유전자를 이용한 선별 방법이 CHO DG44 세포주에서의 고생산성 세포 클론 선별에 있어 비용 및 시간을 절감하는 측면에서 매우 효율적임을 확인하였다. 이러한 선별 방법이 dhfr 유전자와 CHO DG44 세포주에서가 아닌 다른 선별 마커와 다른 세포주에서도 적용되는지 조사하기 위하여 이번에는 polyA가 완전히 결실된 pac 선별 마커 유전자를 이용한 선별 방법을 CHO K1 세포주에 적용하여 그 효능을 검토하였다.
polyA의 기능을 완전히 제거하기 위하여 본 실시예에서는 면역글로블린(immunoglobulin) 발현 벡터(pCT112 벡터)에서 dhfr 전사 단위(프로모터-dhfr 유전자-polyA)를 완전히 제거하고, 프로모터(promoter)-pac 유전자 또는 프로모터-pac 유전자-polyA를 삽입한 pCT130 벡터와 pCT129 벡터를 제작하였다(도 7 및 8). 벡터 제작 방법은 하기와 같다. pac 유전자가 있는 pPUR 벡터(631601, Clontech)에서 Pvu II(10-642-690-0014, Roche)와 Xba I(R0145S, NEB) 제한효소를 이용하여 SV40 프로모터와 pac 유전자의 코딩 서열(coding sequence)만을 선택하여, pCT112 백터에서 Nru I(R0192L, NEB)과 Xba I 제한효소를 이용하여 dhfr 전사 단위를 제거한 위치에 삽입하는 클로닝을 진행하여 pCT130 벡터(도 7)을 제작하였다. 그리고 이에 대한 비교군을 위하여 pPRU 벡터에서 Pvu II 와 BamH I(R0136S, NEB) 제한효소를 이용하여 SV40 프로모터, pac 유전자 및 polyA까지 선택하여 pCT112 벡터의 dhfr 전사 단위를 제거한 위치에서 삽입하는 클로닝을 진행하여 pCT129 벡터(도 8)를 제작하였다.
CHO K1 세포주를 pCT129 벡터 및 pCT130 벡터로 형질 도입하고 2일 후에 96 웰-플레이트에 하기 표 5와 같이 여러 농도의 퓨로마이신(puromycin)이 첨가된 배지를 이용하여 각각 접종하였다. 이때 사용한 배지는 CD OptiCHO 배지이며 FBS는 첨가되지 않았다. pCT129 벡터를 형질 도입한 군(대조군)에서는 0.3×106 세포/플레이트의 접종 농도와 6 ㎍/㎖ 퓨로마이신의 선별 조건이 적절하였으며, pCT130 벡터를 형질 도입된 군(실험군)에서는 3×106 세포/플레이트의 접종 농도와 6 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 사용한 선별 조건이 적절하였다. 특히 본 실시예에서는 여러 번 형질 도입 실험을 통해, 선별 마커에서 polyA가 있는 군(대조군)과 없는 군(실험군)에서 비슷한 수의 p-clone들을 선별하여 면역글로블린의 발현량을 각각 비교하였다.
표 5 96 웰-플레이트에 접종된 세포의 선별 조건 비교
pCT129 벡터(대조군:polyA 있는 pac 유전자 사용) pCT130 벡터(실험군:polyA 없는 pac 유전자 사용)
Seeding density(×106 cells/plate) Puromycin(㎍/㎖) Seeding density(×106 cells/plate) Puromycin(㎍/㎖)
0.1 6 1 10
8 3 6
0.3 6 8
10
상기 표 5의 선별조건에서 성장하는 세포들이 있는 웰들의 항체 생산량을 ELISA로 측정하여 96 웰-플레이트에서 항체 생산 상위군에 속하는 p-clone들을 1차적으로 선별하여(도 9), 24 웰-플레이트로 옮긴 다음 다시 생산성을 측정하기 위하여 각 시료를 2배씩 순차 희석(2-fold serial dilution)하여 ELISA를 하고(도 10), 이 중에서 상위군에 속하는 41개의 p-clone을 6 웰-플레이트로 옮긴 다음 다시 이들의 생산성을 측정하였다(도 11). 도 9 내지 11에서 보여지는 바와 같이, 생산성이 높은 p-clone들에 대한 2 차례의 선별과정(96 웰-플레이트와 24 웰-플레이트에서의 선별 과정)에서, polyA가 있는 pCT129 벡터(대조군)에서 유도된 p-clone들 보다는 polyA가 없는 pCT130 벡터(실험군)에서 유도된 p-clone에서 생산성이 높은 p-clone들이 더 많이 선택되었음을 알 수 있다.
또한 각 군에서 생산성이 높은 p-clone인 129-4 및 130-35를 선택하여 제한 희석 클로닝(Limiting dilution cloning, LDC)을 진행하였다. 96 웰-플레이트에서 배양할 때는 2 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 처리하였으며, 24 웰-플레이트 이후의 배양 단계부터는 퓨로마이신을 배양 배지에 첨가하지 않았다. 96 웰-플레이트, 24 웰-플레이트 및 6 웰-플레이트 스케일에서의 선별 과정을 거쳐 생산성이 높은 단일세포 클론 5개씩 선별하여 6 웰-플레이트에서의 생산성(도 12) 및 쉐이크 플라스크(shake flask) 상태에서의 생산성(도 13)을 조사하였다. 쉐이크 플라스크에서의 생산성은 동일한 조건의 정치 배양(batch culture)으로 중복 진행되었다.
도 12에서 보여진 바와 같이 pCT130 벡터에서 유래된 클론들(생산량: 25-32 ㎍/㎖/3 days)은 pCT129 벡터(생산량 7-18 ㎍/㎖/3 days)에서 유래된 클론들보다 생산량이 2배 정도 높음을 알 수 있다. 이는 선별 마커의 polyA가 없는 벡터에서 보다 높은 생산성을 가진 클론을 제작할 수 있음을 알 수 있다. 또한 생산성을 보다 실질적인 측면에서 검토할 수 있는 쉐이크 플라스크를 이용한 정치배양 조건에서는 도 13에서 보여진 바와 같이, 선별 마커의 polyA가 없는 pCT130 벡터(실험군)에서 유래된 클론들은 62-72 ㎍/㎖의 생산성을 보여준 반면, 선별 마커의 polyA가 있는 pCT129 벡터(대조군)에서 유래된 클론들은 2-10 ㎍/㎖의 생산성을 보여주었다. 이 실험 조건에서 세포 성장률은 비슷하였지만, pCT130 벡터(실험군)에서 유래된 클론들이 6배 이상의 생산성을 보여주고 있다. 이러한 현격한 차이는 pCT129 벡터(대조군)에서 유래한 클론들은 아마도 선별조건이 없는 조건에서, IgG 유전자의 발현이 쉽게 억제되거나 또는 IgG 유전자가 쉽게 결실되는 현상에 기인한다고 생각할 수 있다.
이상의 결과를 통해, 본 발명은 선별 마커의 polyA가 존재하지 않는 발현벡터로 형질 도입된 세포주가 선별 마커의 polyA가 존재하는 발현벡터로 형질 도입된 세포주에 비해 항체 발현량이 높은 세포주를 획득할 수 있는 방법임을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 선별 방법은 MTX의 양을 증가시키면서 수회 증폭 단계를 포함하는 통상적인 단계적 유전자 증폭 전략과 비교하여 고생산성 세포 클론을 선별하기 위한 시간을 감소시킬 수 있으며, 이에 따라 인적/물적 개발 비용을 줄일 수 있는 방법이다.

Claims (16)

  1. (i) 폴리아데닐화 시그널(polyA)이 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 이용한 고발현 재조합 세포주의 선별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터가 (i)의 polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트 대신, polyA를 제거한 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 고발현 재조합 세포주의 선별 방법.
  3. (i) polyA가 작동 가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 적당한 제한 효소로 절단하여 (i)의 polyA가 작동하지 않도록 발현 벡터를 선형화시키는 단계를 포함하는 고발현 재조합 세포주의 선별 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커 유전자가 dhfr(dihydrofolate reductase) 유전자, 글루타민 신테타제(glutamine synthetase) 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycine phosphotransferase) 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(hygromycin B phosphotransferase) 유전자, 푸로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제(puromycin-N-acetyltransferase; pac) 유전자, 또는 스트렙도알로데이커스 힌더스터너스(Streptoalloteichus hindustanus: Sh) ble 유전자인 것을 특징으로 하는 고발현 재조합 세포주의 선별 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 재조합 단백질이 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 고발현 재조합 세포주의 선별 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵 숙주 세포인 것을 특징으로 하는 고발현 재조합 세포주의 선별 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 진핵 숙주 세포가 CHO 세포, 하이브리도마 세포, 또는 F2N 세포를 포함하는 인간 숙주 세포인 것을 특징으로 하는 고발현 재조합 세포주의 선별 방법.
  8. (i) polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트; 및 (ii) polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, (i)의 polyA가 작동 불가능하도록 연결된 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트 대신, polyA를 제거한 선별 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  10. 제8항에 있어서, 상기 발현 벡터가 (ii)의 polyA가 작동 가능하도록 연결된 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 대신, 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 도입을 위한 다중 클로닝 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커 유전자가 증폭 가능한 선별 마커 유전자인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 증폭 가능한 선별 마커 유전자가 dhfr 유전자 또는 글루타민 신테타제 유전자인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  13. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별 마커 유전자가 글루타민 신테타제 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자, pac 유전자, Sh ble 유전자인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  14. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 재조합 단백질이 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  15. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터로 형질 도입된 진핵 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 진핵 숙주 세포가 CHO 세포, 하이브리도마 세포, 또는 F2N 세포를 포함하는 인간 숙주 세포인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
PCT/KR2010/001912 2009-03-31 2010-03-30 고발현 재조합 세포주의 선별 방법 WO2010114270A2 (ko)

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