WO2010110439A1 - 自律神経活動調節用組成物および自律神経を調節する方法 - Google Patents

自律神経活動調節用組成物および自律神経を調節する方法 Download PDF

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浩司 大木
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for regulating autonomic nerve activity and a method for regulating autonomic nerve activity.
  • the present invention relates to a composition for suppressing an increase in sympathetic nerve activity and a composition for promoting parasympathetic nerve activity.
  • the present invention also relates to a method for suppressing an increase in sympathetic nerve activity and a method for promoting parasympathetic nerve activity.
  • the autonomic nervous system is a part of the nervous system that is not regulated by consciousness. Unlike the somatic motor nervous system that mainly controls skeletal muscle, the autonomic nervous system controls the heart muscle, smooth muscle, and glandular tissue. ing. Also, the autonomic nervous system is structurally different from the motor nervous system and is composed of two nerve cells called the prenodal nerve and the retronodal nerve. The autonomic nervous system is roughly divided into two types, the sympathetic nervous system and the parasympathetic nervous system, and their functions are different. Sympathetic activity generally causes an increase in heart rate, increased blood pressure, pupil enlargement, blood glucose release, etc., and parasympathetic activity generally stimulates an increase in gastrointestinal motility and secretion of digestive juices.
  • the present invention provides an orally ingestible composition for modulating autonomic nerve activity.
  • the present invention also provides a method for regulating autonomic nerve activity.
  • the present invention provides an orally ingestible composition for suppressing an increase in sympathetic nerve activity and an ingestible composition for promoting parasympathetic nerve activity.
  • the present invention is a composition for regulating autonomic nervous activity comprising Tyr-Pro or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention is also a composition for promoting parasympathetic nerve activity, comprising Tyr-Pro or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention is a composition for suppressing enhancement of sympathetic nerve activity, comprising Tyr-Pro or a salt thereof as an active ingredient.
  • this invention is a composition as described in (2) or (3) which has a gastrointestinal motility promotion effect, an amnesia prevention effect, or an anxiolytic action.
  • the present invention is also a composition for promoting gastrointestinal motility, comprising Tyr-Pro or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention is also an amnesia-preventing composition comprising Tyr-Pro or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention is also an anxiety-suppressing composition comprising Tyr-Pro or a salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention is also the composition according to any one of claims 1 to 7, which is for oral consumption.
  • the present invention is also a method for regulating autonomic nervous activity in a non-human animal, comprising administering Tyr-Pro or a salt thereof to the non-human animal.
  • the present invention is also a method for promoting parasympathetic nerve activity in a non-human animal, comprising administering Tyr-Pro or a salt thereof to the non-human animal.
  • the present invention is also a method for suppressing an increase in sympathetic nerve activity in a non-human animal, comprising administering Tyr-Pro or a salt thereof to the non-human animal.
  • the present invention is also a method for promoting gastrointestinal motility in a non-human animal, comprising administering Tyr-Pro or a salt thereof to the non-human animal.
  • the present invention is also a method for preventing amnesia in a non-human animal, comprising administering Tyr-Pro or a salt thereof to the non-human animal.
  • the present invention is also a method for suppressing anxiety in a non-human animal, comprising administering Tyr-Pro or a salt thereof to the non-human animal.
  • the present invention is also the method according to any one of claims 9 to 15, wherein the administration is oral administration.
  • FIG. 1 shows the effect of the peptide Tyr-Pro (YP) on gastric parasympathetic activity.
  • the vertical axis shows the relative action potential of each experimental group as a percentage when the value before administration (0 minute value) is 100 (GVNA: gastric vagus nerve activity).
  • the horizontal axis represents the time (minutes) after sample administration.
  • the significant difference test with the water-administered control group was performed by analysis of variance (ANOVA) with the value of 5 to 60 minutes after administration as the group.
  • ANOVA analysis of variance
  • FIG. 2 shows the effect of peptide Tyr-Pro (YP) on adrenal sympathetic nerve activity.
  • the vertical axis shows the relative action potential of each experimental group as a percentage when the value before administration (0 minute value) is 100 (ASNA: adrenal sympathetic nerve activity).
  • the horizontal axis represents the time (minutes) after sample administration.
  • the significant difference test with the water-administered control group was performed by analysis of variance (ANOVA) with the value of 5 to 60 minutes after administration as the group.
  • FIG. 3 shows the effect of Tyr-Pro (YP) (FIG. 3A) or casein degradation product (FIG.
  • FIG. 4 shows the effect of peptide Tyr-Pro (YP) on gastric emptying ability.
  • FIG. 5-1 shows the scopolamine-induced amnesia-preventing effect of peptide Tyr-Pro (YP). Water, scopolamine alone, or Tyr-Pro 1.5 mg / kg body weight or 15 mg / kg body weight was administered to mice together with scopolamine, and the amnesia-preventing effect was evaluated by the method described in Example 3, respectively.
  • 5-1A represents the voluntary alternation behavior change rate
  • the vertical axis in FIG. 5-1B represents the total number of times of entering the arm.
  • the significant difference test between groups was performed by Dunnett's multiple comparison test.
  • *** is P ⁇ 0.001 with respect to the water administration control group
  • # is P ⁇ with respect to the scopolamine single administration group.
  • 0.05 indicates that ### indicates P ⁇ 0.001.
  • * indicates P ⁇ 0.05 with respect to the water-administered control group
  • ## indicates P ⁇ 0.01 with respect to the scopolamine-only administration group.
  • Fig. 5-2 shows the scopolamine-induced amnesia-preventing effect of the casein degradation product.
  • Fig. 5-2A represents the voluntary alternation behavior change rate
  • Fig. 5-2B represents the total number of times of entering the arm.
  • the significant difference test between groups was performed by Dunnett's multiple comparison test.
  • *** is P ⁇ 0.001 with respect to the water administration control group
  • # is P ⁇ with respect to the scopolamine single administration group.
  • 0.05 indicates that ## indicates P ⁇ 0.001.
  • FIG. 6 shows the anxiolytic effect of the peptide Tyr-Pro (YP) or casein degradation product.
  • the vertical axis shows the open arm residence time ratio of the control group to which only water was given, the Tyr-Pro administration group, and the casein degradation product administration group.
  • Data show mean ⁇ standard error.
  • the significant difference test with the water-treated control group was performed by unpaired Student's t-test. *, **, and *** indicate P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01, and P ⁇ 0.001, respectively. .
  • the peptide Tyr-Pro which is an active ingredient of the composition of the present invention, may be a peptide synthesized organically or may be a peptide derived from a natural product.
  • a general method such as a solid phase method (Boc method, Fmoc method) or a liquid phase method can be used.
  • PSSM-8 Type Shimadzu Corporation
  • synthesis method to be selected, appropriate reaction conditions, and the like can be arbitrarily set.
  • the peptide Tyr-Pro is a raw material comprising a protein containing a Tyr-Pro sequence (eg, milk, horse milk, goat milk or sheep milk, and their nonfat dry milk, soybeans, wheat, etc.) May be derived from a fermented product obtained by fermenting with a bacterium belonging to the species Lactobacillus helveticus.
  • the content of the protein raw material during fermentation is not particularly limited, but generally 1 to 19% by weight will be preferable.
  • Such a fermented product can be used as it is or after appropriate treatment such as centrifugation, filtration, chromatogram, and drying to obtain the composition of the present invention.
  • Tyr-Pro may be derived from a protein hydrolyzate containing Tyr-Pro.
  • proteins include animal milk casein, such as casein such as cow's milk, horse milk, goat milk, sheep milk, or concentrates thereof.
  • you may originate in the fermented material obtained by fermenting the foodstuff raw material containing animal milk casein with fungi, such as a gonococcus and a lactic acid bacterium.
  • the casein concentration at the time of hydrolysis or fermentation of animal milk casein is not particularly limited, but it is generally preferably 1 to 19% by weight. In the case of using a commercially available enzyme group, the optimum conditions are usually set.
  • the conditions such as the amount of enzyme used and the reaction time are used so that the casein hydrolyzate can be obtained.
  • the enzyme group / animal milk casein has a weight ratio of 1/1000 or more, preferably 1/100 to 1/10, particularly preferably 1/40 to 1/10.
  • Degrading enzymes can be added.
  • the reaction conditions can be appropriately selected according to the enzyme group to be used, and can be usually 25 to 60 ° C., preferably 45 to 55 ° C., pH 3 to 5, preferably 5 to 9.
  • the reaction time can be 2 to 48 hours, preferably 7 to 15 hours.
  • Such a protein hydrolyzate, in particular casein hydrolyzate may be used as it is, or may be subjected to treatment such as centrifugation, filtration, chromatogram, and drying to obtain the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention has an action of regulating autonomic nerve activity.
  • autonomic nerve activity includes sympathetic nerve activity and parasympathetic nerve activity
  • the composition of the present invention has an action of suppressing an increase in sympathetic nerve activity and an action of promoting parasympathetic nerve activity.
  • the composition of the present invention suppresses the increase in sympathetic nerve activity or promotes parasympathetic nerve activity, and thus has a gastrointestinal motility promoting action, an amnesia preventing action, an anxiolytic action, or a blood flow promoting action.
  • the composition of the present invention has an autonomic nerve regulating action, it has broadly a heart rate regulating action, a blood sugar regulating action, a gastric secretion regulating action, a body temperature regulating action, a blood pressure regulating action, a stress relieving action and the like.
  • the autonomic nervous activity regulating action of the composition of the present invention and peptide Tyr-Pro, which is an active ingredient thereof, particularly the action of suppressing the increase of sympathetic nerve activity and the action of promoting parasympathetic nerve activity should be confirmed as follows, for example. I can do it.
  • the parasympathetic nerve activity promoting action of the composition of the present invention is determined by, for example, administering the composition to a rat or mouse, measuring the action potential of the parasympathetic (vagus) nerve governing the stomach with time, and increasing the action potential. Can be confirmed.
  • the composition of the present invention is administered to rats or mice, and after a certain period of time (for example, 15 to 30 minutes), a dye such as phenol red is introduced into the stomach of the rat or mouse, and after a certain period of time (for example, 20 minutes) After a minute)
  • the stomach of the rat or mouse was removed and the amount of residual pigment was measured to confirm the enhancement of gastric emptying capacity, that is, the activity of promoting the parasympathetic nerve activity of the composition with the activity of the stomach being activated. I can do it.
  • the inhibitory action on the increase in sympathetic nerve activity of the composition of the present invention is that the composition is administered to rats or mice, the action potential of the sympathetic nerve governing the adrenal gland is measured over time, and the action potential decreases.
  • mice are administered water or the composition or the peptide Tyr-Pro, and the mice are placed on the platform at the center of the maze at a high altitude. It is possible to confirm that the anxiolytic effect was observed if the residence time in the open arm was increased compared to the control group administered with water alone. I can do it.
  • the amnesia-preventing action of the present composition or the peptide Tyr-Pro can be confirmed using a system according to the evaluation system for Alzheimer's disease therapeutic drug using, for example, a Y-shaped maze.
  • an agent for inducing amnesia such as scopolamine alone or a composition of the present invention is administered to a rat or mouse simultaneously with such a drug, or a composition of the present invention prior to administration of such a drug.
  • the amnesia-preventing action of the composition of the present invention can be confirmed using the rate of voluntary alternation behavior to different arms and the total number of times of entering the maze as an index. See Example 3).
  • the active ingredient of the composition of the present invention is the peptide Tyr-Pro, and the above desired effect can be achieved by oral administration or ingestion.
  • the administration or ingestion period of the composition or peptide Tyr-Pro of the present invention can be variously adjusted in consideration of the age of a subject to be administered or ingested, for example, the age of a human or non-human animal, the health condition of the subject, and the like.
  • Non-human animals include non-human higher vertebrates, particularly non-human mammals, including but not limited to pets such as dogs and cats, and domestic animals such as cows, horses, pigs and sheep.
  • the effect of the composition of the present invention can be seen even after one administration, but a continuous effect can be expected by continuously ingesting once or more a day.
  • composition of the present invention when used as a medicine, it can be in the form of a preparation for oral administration.
  • examples include tablets, pills, hard capsules, soft capsules, microcapsules, powders, granules, liquids and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, excipient, preservative, stabilizer, binder, pH adjuster, buffer, thickener, if necessary.
  • the composition of the present invention can also be used as a food or drink material or animal feed material.
  • the peptide Tyr-Pro which is an active ingredient of the composition of the present invention or the composition of the present invention, promotes gastrointestinal motility, Functional foods such as foods for specified health use that have anti-anxiety, blood flow promotion, amnesia prevention, heart rate regulation, blood glucose regulation, gastric secretion regulation, body temperature regulation, stress relief, etc. be able to.
  • the administration or intake of the present composition or peptide Tyr-Pro for obtaining a desired effect is generally about 0.045 mg / kg body weight to 100 mg / kg body weight as the amount of peptide Tyr-Pro which is an active ingredient per time. .
  • the intake of the composition of the present invention is preferably 0.045 mg / kg body weight to 0.12 mg / kg body weight as the amount of Tyr-Pro.
  • the amount of Tyr-Pro is particularly preferably 0.1 mg / kg body weight to 100 mg / kg body weight.
  • the amount of Tyr-Pro is 1.5 mg / kg. Body weight to 15 mg / kg body weight is preferred.
  • the appropriate intake can be further adjusted taking into account various factors as described above.
  • a food containing the peptide Tyr-Pro which is the composition of the present invention or its active ingredient, such as a functional food, is a protein degradation product containing Tyr-Pro obtained as described above or a concentrate thereof or Tyr-Pro. It can be produced by adding a raw material fermented product containing a protein containing sucrose, or a fermented product in the form of powder or granules to various foods. If necessary, other ingredients used in foods, such as sugars, proteins, lipids, vitamins, minerals, flavors, such as various carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, sweeteners, fragrances, pigments, texture improvers Etc. or a mixture thereof may be added to improve nutritional balance, flavor, and the like.
  • Animal feeds containing the composition of the present invention or its active ingredient peptide Tyr-Pro can also be prepared in the same manner as human foods.
  • the functional food described above can be in any form of solid, gel, and liquid, for example, fermented milk products such as lactic acid bacteria beverages, various processed foods and drinks, dry powders, tablets, capsules, Examples thereof include granules, and various beverages, yogurt, liquid food, jelly, candy, retort food, tablet confectionery, cookies, castella, bread, biscuits, chocolate and the like.
  • the content of the peptide Tyr-Pro which is an active ingredient contained in the final product, depends on the addition form and product form.
  • the tube was inserted into the trachea from the start of surgery to the end of measurement to secure the airway, and the body temperature (rat rectal temperature) was maintained at 35.0 ⁇ 0.5 ° C. with a heat retaining device.
  • each sample was orally administered in a 1 ml polyethylene tube, and changes in these nerve activities were measured.
  • Samples were Tyr-Pro 0.045 mg / kg body weight, 0.12 mg / kg body weight, 1.2 mg / kg body weight and casein degradation product 4.2 mg / kg body weight.
  • the casein degradation product used was obtained by hydrolyzing milk casein with an enzyme and contains 0.5% by weight or more of Tyr-Pro with respect to the total amount of casein degradation product.
  • the gastric parasympathetic nerve activity after administration was significantly increased in both Tyr-Pro® 0.045 mg / kg body weight and 0.12 mg / kg body weight administration (FIG. 1).
  • the adrenal sympathetic nerve activity was significantly decreased by administration of Tyr-Pro 0.012 mg / kg body weight as compared with the water administration group (FIG. 2).
  • the cutaneous arterial sympathetic nerve activity tended to decrease by administration of Tyr-Pro 0.12 mg / kg body weight (FIG. 3A).
  • cutaneous arterial sympathetic nerve activity was significantly reduced by administration of 4.2 mg / kg body weight of casein degradation product as compared to the water administration group (FIG. 3B).
  • the removed stomach was dipped in a beaker containing 0.1N NaOH, cut into small pieces with scissors, and then homogenized using polytron. The homogenate was allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then a 30% (w / v) trichloroacetic acid solution was added to the supernatant to precipitate the protein. After the supernatant was centrifuged, the absorbance at 560 nm was measured, and gastric emptying (GE) was calculated according to the following formula. The results are shown in FIG. The measurement results are expressed as mean ⁇ standard error, and unpaired Student's t-test was used for comparison with the control group.
  • one arm is 40 cm long, the wall height is 12 cm, the floor width is 3 cm, the top width is 10 cm, and the three arms are connected at an angle of 120 degrees each.
  • the character maze was used as an experimental device. The mouse was placed on the tip of any arm of the Y-shaped maze and allowed to freely explore the maze for 8 minutes, and the arm to which the mouse moved was recorded in order. Count the number of times the mouse has moved to each arm within the measurement time, and use this as the total number of intrusions. In this combination, select three different arms in succession (for example, three arms A, B, When the order of the arms entered was ABCBACACB, it was counted as 4 including duplication), and this number was taken as the number of voluntary replacement actions.
  • the number of voluntary alternations was divided by the total number of ingresses minus 2, and the value obtained by multiplying it by 100 was the voluntary alternation behavior change rate, which was used as an index of voluntary alternation behavior.
  • the measured values were expressed as mean ⁇ standard error for each group.
  • the significance test with the control group was performed by Dunnett's multiple comparison test after one-way analysis of variance. The results are shown in FIGS. 5-1 and 5-2. From these results, it became clear that Tyr-Pro has an amnesia-preventing action in the range of 1.5 mg / kg body weight to 15 mg / kg body weight and the casein degradation product used in the range of 200 mg / kg body weight to 2000 mg / kg body weight. It was.
  • the elevated cross maze is formed by crossing two vinyl chloride plates with a length of 65 cm and a width of 5 cm in a cross shape, and around the single passage, except for the central intersection, A 50cm wall (black acrylic resin) is attached. That is, the cross maze is composed of two arms with no walls (open arms), two arms with walls (closed arms), and a central intersection.
  • the elevated plus-maze test place the mouse on the arm with one wall at the center of the maze, let it freely explore the maze for 5 minutes, observe its behavior, and stay on the open arm. Time was measured. From the measured values, the ratio of accumulated stay time of the open arm during the test for 5 minutes was obtained and used as an index of the anxiolytic action.
  • the control group was orally administered with distilled water and the positive control group was orally administered with 1 mg / kg body weight of diazepam.
  • Each measured value was expressed as an average value ⁇ standard error for each group, and an unpaired Student's t-test was used for comparison with the control group.
  • the results are shown in FIG. From these results, it was clarified that Tyr-Pro exhibits an anxiolytic action in the range of 0.1 mg / kg body weight to 100 mg / kg body weight, and the casein degradation product used exhibits 10 mg / kg body weight to 1000 mg / kg body weight.

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Abstract

　本発明により、自律神経活動を調節するための経口摂取可能な組成物および方法が提供される。特に、本発明により、交感神経活動の亢進を抑制することの出来る、経口摂取可能な組成物、および、副交感神経活動を促進することの出来る、経口摂取可能な組成物が提供される。本発明は、Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、自律神経活動調節用組成物である。

Description

自律神経活動調節用組成物および自律神経を調節する方法
　本発明は、自律神経活動を調節するための組成物および自律神経活動を調節する方法に関する。特に、本発明は、交感神経活動の亢進を抑制するための組成物、および、副交感神経活動を促進するための組成物に関する。また、本発明は交感神経活動の亢進を抑制する方法および副交感神経活動を促進する方法に関する。
　自律神経系は、意識によって調節されない神経系の一部を構成している神経系であり、主として骨格筋を制御している体性運動神経系とは異なり心筋、平滑筋や腺組織を支配している。また、自律神経系は構造的にも運動神経系とは異なり節前神経と節後神経と呼ばれる２つの神経細胞から構成されている。自律神経系は交感神経系と副交感神経系の２つに大別され、それぞれ機能が異なっている。交感神経の活動により一般に心拍数の増大、血圧上昇、瞳孔拡大、血中グルコースの遊離などが起こり、副交感神経の活動により一般に消化管運動の増加や消化液の分泌などが刺激され、心拍数は減少することが知られている。両者は協同して働き生体の恒常性の維持に重要な役割を果たしている。
　ペプチドまたはペプチド誘導体に関して自律神経活動への影響を直接測定した報告として、カルノシンの自律神経調節作用が報告されている（特許文献１）。しかし、この作用は静脈内投与により測定されており、経口投与による作用は不明であった。さらに、ジペプチドTyr-Pro（YP）およびその類縁体については、自律神経活動への影響を直接測定した報告はない。一方、Tyr-Proおよびその類縁体における生理機能についてはいくつかの報告がなされている。たとえば摘出した回腸縦走筋を用いた試験により、Tyr-Pro-をN末端部分とするある種のペンタペプチドが、痛みを和らげるオピオイド活性を有し、感情を制御し、呼吸、体温および消化活動を調節するために有効であることが知られている（特許文献２）。また、Tyr-Proについて、オピオイド受容体との結合性はないもののラットの腹腔内に投与した場合、鎮痛作用を示すことが知られている（非特許文献１）。また、Tyr-Proを含む４～９残基からなるペプチドのいくつかがストレス負荷による神経伝達物質の作用を調節することが報告されている（特許文献３）。しかし、これらの報告において何れもペプチドの自律神経活動への影響を直接測定した例はなく、その調節作用に着目した具体的な報告はなされていない。さらに、これらは摘出した消化器官への作用や腹腔内投与による生体への作用であるため、経口摂取可能な物質として十分な効果を示すものではない。また一方では、Tyr-Proの経口投与により血圧降下作用を有することが知られているが（特許文献４）、こちらも自律神経活動調節に関わる作用は不明であった。
国際公開第2002/076455号公報 特開05-247089号公報 国際公開第2007/030035号公報 特許第3364579号
Izv. Akad. Nauk. Ser.　Biol. (2008) No.1, 61-67
　本発明は、自律神経活動を調節するための経口摂取可能な組成物が提供される。また、本発明は、自律神経活動を調節する方法を提供する。
　特に、本発明は、交感神経活動の亢進を抑制するための経口摂取可能な組成物、および、副交感神経活動を促進するための経口摂取可能な組成物を提供する。
（１）本発明は、Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、自律神経活動調節用組成物である。
（２）本発明は、Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、副交感神経活動の促進用組成物でもある。
（３）本発明は、Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、交感神経活動の亢進抑制用組成物である。
（４）また、本発明は、消化管運動促進作用、健忘予防作用または抗不安作用を有する、（２）または（３）記載の組成物である。
（５）本発明は、Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、消化管運動促進用組成物でもある。
（６）本発明は、Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、健忘予防用組成物でもある。
（７）本発明は、Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、不安抑制用組成物でもある。
（８）本発明は、経口摂取用である、請求項１～７のいずれか１項記載の組成物でもある。
（９）また、本発明は、非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における自律神経活動を調節する方法である。
（１０）本発明は、非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における副交感神経活動を促進する方法でもある。
（１１）本発明は、非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における交感神経活動の亢進を抑制する方法でもある。
（１２）また、非ヒト動物において消化管運動を促進する、健忘を予防する、または不安を抑制する、（１０）または（１１）記載の方法でもある。
（１３）本発明は、非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における消化管運動を促進する方法でもある。
（１４）本発明は、非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における健忘を予防する方法でもある。
（１５）本発明は、非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における不安を抑制する方法でもある。
（１６）本発明は、投与が経口投与である、請求項９～１５のいずれか１項記載の方法でもある。
図１は、胃の副交感神経活動に対するペプチドTyr-Pro（YP）の効果を示す。水またはTyr-Pro0.045mg/kg体重または0.12mg/kg体重をラット（n=3）に投与し、胃を支配する副交感（迷走）神経の活動電位を経時的に測定した。縦軸は投与前の値（0分値）を100とした場合の各実験群の相対活動電位を百分率で示す（GVNA：胃迷走神経活動）。横軸はサンプル投与後の時間（分）である。水投与対照群との有意差検定は、投与5～60分の値を群として、分散分析法 (ANOVA)により行った。 図２は、副腎交感神経活動に対するペプチドTyr-Pro（YP）の効果を示す。水またはTyr-Pro0.12mg/kg体重をラット（n=3）に投与し、副腎を支配する交感神経の活動電位を経時的に測定した。縦軸は投与前の値（0分値）を100とした場合の各実験群の相対活動電位を百分率で示す（ASNA：副腎交感神経活動）。横軸はサンプル投与後の時間（分）である。水投与対照群との有意差検定は、投与5～60分の値を群として、分散分析法 (ANOVA)により行った。 図３は皮膚動脈交感神経活動に対するTyr-Pro（YP）（図３A）またはカゼイン分解物（図３B）の効果を示す。水またはTyr-Pro 0.12mg/kg体重、またはカゼイン分解物 4.2mg/kg体重をラット（n=3）に投与し尾部の皮膚動脈交感神経の活動電位を経時的に測定した。縦軸は投与前の値（0分値）を100とした場合の各実験群の相対活動電位を百分率で示す（CASNA：皮膚動脈交感神経活動）。横軸はサンプル投与後の時間（分）である。水投与対照群との有意差検定は、投与5～60分の値を群として、分散分析法 (ANOVA)により行った。 図４は、ペプチドTyr-Pro（YP）の胃排出能に対する作用を示す。ラット（n=10）に水またはTyr-Pro0.1mg/kg体重を投与し、30分後に色素（フェノールレッド）を投与し、更に20分後に胃を摘出して胃内の残存色素を測定した。水投与対照群との有意差検定は、対応のないスチューデントのｔ検定により行った。 図５-1はペプチドTyr-Pro（YP）のスコポラミン誘発健忘予防効果を示す。水、または、スコポラミン単独、または、Tyr-Pro1.5mg/kg体重若しくは15mg/kg体重をスコポラミンと共にマウスに投与し、それぞれ実施例３記載の方法によって健忘予防効果を評価した。図５-1Aの縦軸は自発的交替行動変化率を表し、図５-1Bの縦軸はアームへの総進入回数を示す。群間の有意差検定はダネット型多重比較検定により行い、図５-1Aにおいて、***は水投与対照群に対してP<0.001であること、#はスコポラミン単独投与群に対してP<0.05であること、###はP<0.001であることを示す。また、図５-1Bにおいて、*は水投与対照群に対してP<0.05であること、##はスコポラミン単独投与群に対してP<0.01であることを示す。 図５-2はカゼイン分解物のスコポラミン誘発健忘予防効果を示す。水、または、スコポラミン単独、または、カゼイン分解物200mg/kg体重若しくは2000mg/kg体重をスコポラミンと共にマウスに投与し、それぞれ実施例３記載の方法によって健忘予防効果を評価した。図５-2Aの縦軸は自発的交替行動変化率を表し、図５-2Bの縦軸はアームへの総進入回数を示す。群間の有意差検定はダネット型多重比較検定により行い、図５-2Aにおいて、***は水投与対照群に対してP<0.001であること、#はスコポラミン単独投与群に対してP<0.05であること、##はP<0.001であることを示す。また、図５-2Bにおいて、***は水投与対照群に対してP<0.001であること、#はスコポラミン単独投与群に対してP<0.05であることを示す。 図６は、ペプチドTyr-Pro（YP）またはカゼイン分解物の抗不安作用を示す。水、または、Tyr-Pro0.1mg/kg体重～100mg/kg体重またはカゼイン分解物10mg/kg～1000mg/kg体重をマウス（n=12）に投与し、オープンアーム滞在時間を測定した（実施例４）。縦軸は水のみを与えた対照群、Tyr-Pro投与群およびカゼイン分解物投与群のオープンアーム滞在時間比率を示す。データは平均値±標準誤差を示す。水投与対照群との有意差検定は、対応のないスチューデントのｔ検定により行い、*、**、および***は、それぞれP<0.05、P<0.01、およびP<0.001であることを示す。
　本発明の組成物の有効成分であるペプチドTyr-Proは有機化学的に合成したペプチドであってもよく、また天然物由来のペプチドであってもよい。これらのペプチドの有機化学的合成法としては、固相法（Boc法、Fmoc法）や液相法といった一般的な方法を用いることができ、例えば、島津製作所製のペプチド合成装置（PSSM-8型）といったペプチド自動合成装置を用いて合成したものであってもよい。ペプチド合成の反応条件等については、当業者の技術常識に基づき、選択する合成方法や適切な反応条件等を任意で設定することができる。化学的に合成されたペプチドの精製方法も当業者にはよく知られたものである。
　本明細書において、ペプチドTyr-Proについて言及する場合、特に明示した場合および文脈上除外されることが明らかである場合を除き、「Tyr-Pro」および「ペプチドTyr-Pro」にはその塩が含まれる。そのような塩には、例えばナトリウム塩、カリウム塩などの生理的条件下で存在しえる塩が含まれる。また、本発明の組成物は、本発明の組成物の有効成分であるペプチド、Tyr-Pro以外に他のペプチドおよび遊離アミノ酸またはその塩を含んでいても良い。なお、発明との関連において、アミノ酸の三文字表記および一文字表記ならびにペプチドの表記は当業者によく知られた一般的規則に従う。
　本発明のある態様においては、ペプチドTyr-Proは、Tyr-Pro配列を含有するタンパク質を含む原料（例えば、牛乳、馬乳、山羊乳または羊乳、およびそれらの脱脂粉乳や大豆、小麦など）をラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）種に属する菌などにより醗酵させて得られる醗酵物に由来するものであってもよい。醗酵の際のタンパク質原料含有量は特に限定されないが、一般には１～１９重量％が好ましいであろう。このような醗酵物をそのまま、あるいは遠心分離、ろ過、クロマトグラム、乾燥等の適切な処理をして本発明の組成物とすることもできる。
　本発明の別の態様においては、Tyr-ProはTyr-Proを含有するタンパク質の加水分解物に由来しても良い。そのようなタンパク質には、例えば牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等のカゼインのような獣乳カゼイン又はその濃縮物が含まれる。また、獣乳カゼインを含む食品原料を麹菌や乳酸菌といった菌類によって醗酵させて得られる醗酵物に由来するものであってもよい。獣乳カゼインを加水分解又は醗酵する際のカゼイン濃度は、特に限定されないが、一般には１～１９重量％が好ましい。市販の酵素群を用いる場合には、通常、至適条件が設定されているが、前記カゼイン加水分解物が得られるように条件、例えば、使用酵素量や反応時間等を、用いる酵素群に応じて適宜変更して行なうことができる。例えば、獣乳カゼインを溶解した水溶液に、酵素群/獣乳カゼインが重量比で1/1000以上、好ましくは1/100～1/10、特に好ましくは1/40～1/10の割合でタンパク質分解酵素を添加することができる。反応条件は、使用する酵素群に応じて適宜選択できるが、通常25～60℃、好ましくは45～55℃、ｐH３～５、好ましくは、５～９とすることができる。また、反応時間については、２～48時間、好ましくは７～15時間にて行うことができる。このようなタンパク質加水分解物、特にカゼイン加水分解物をそのまま、あるいは遠心分離、ろ過、クロマトグラム、乾燥等の処理をして本発明の組成物としてもよい。
　本発明の組成物は、自律神経活動の調節作用を有する。自律神経の活動には交感神経の活動および副交感神経の活動が含まれるが、本発明の組成物は、交感神経活動の亢進を抑制する作用および副交感神経活動を促進する作用を有する。特に、本発明の組成物は交感神経の活動の亢進を抑制する、あるいは副交感神経活動を促進する結果、消化管運動促進作用、健忘予防作用、抗不安作用、あるいは血流促進作用を有する。さらに、本発明の組成物は自律神経の調節作用を有するため、広く、心拍数調節作用、血糖調節作用、胃液分泌調節作用、体温調節作用、血圧調節作用およびストレス緩和作用等を有する。
　本発明の組成物およびその有効成分であるペプチドTyr-Proの自律神経活動調節作用、特に交感神経活動の亢進を抑制する作用および副交感神経活動を促進する作用は、例えば以下のように確認することが出来る。
　本発明の組成物の副交感神経活動促進作用は、例えば、ラットまたはマウスに本組成物を投与し、胃を支配する副交感（迷走）神経の活動電位を経時的に測定し、活動電位が上昇することによって確認することが出来る。また、ラットまたはマウスに本発明の組成物を投与し、一定時間経過後（例えば15分～30分後）色素、たとえばフェノールレッドをラットまたはマウスの胃に投入し、一定時間経過後（たとえば20分後）そのラットまたはマウスの胃を摘出し残存色素の量を測定することによって胃排出能の増強、すなわち胃の活動が活発化することを指標として本組成物の副交感神経活動促進作用を確認することが出来る。また、本発明の組成物の交感神経活動亢進に対する抑制作用は、ラットまたはマウスに本組成物を投与し、副腎を支配する交感神経の活動電位を経時的に測定し、活動電位が低下することによって確認することが出来る。さらに、本組成物の抗不安作用は、例えば、マウスの高架式十字迷路試験によって確認することが出来る。具体的には、マウスに水または本組成物若しくはペプチドTyr-Proを投与し、マウスを高所にある迷路の中心のプラットフォームに置き、一定時間内に オープンアーム（壁のないアーム）とクローズドアーム（壁のあるアーム）にそれぞれ滞在していた時間を測定し、水のみを投与した対照群に比較してオープンアームでの滞在時間が増加すれば抗不安作用が認められたとして確認することが出来る。本組成物またはペプチドTyr-Proの健忘予防作用は、例えばY字型迷路を用いた、アルツハイマー病治療薬の評価系に準じた系を用いて確認することができる。具体的には、ラットまたはマウスにスコポラミンのような健忘症を誘発する薬剤単独または本発明の組成物をそのような薬剤と同時に投与、またはそのような薬剤の投与に先立って本発明の組成物を投与し、Y字型迷路を用いた試験において異なるアームへの自発的交替行動変化率や迷路への総進入回数を指標として本発明の組成物の健忘予防作用を確認することが出来る（実施例３参照）。
　本発明の組成物はその有効成分がペプチドTyr-Proであり、経口投与または経口摂取することにより上述の所望の効果を達成することが出来る。本発明の組成物またはペプチドTyr-Proの投与又は摂取期間は、投与又は摂取する対象、たとえばヒトや非ヒト動物の年齢やその対象の健康状態等を考慮して種々調整することができる。非ヒト動物には非ヒト高等脊椎動物、特に非ヒト哺乳類が含まれ、イヌ、ネコ等の愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜が含まれるがこれらに限られない。本発明の組成物は１回の投与でも効果が見られるが、１日１回以上、継続摂取することで継続した効果が期待できる。本発明の組成物を医薬として用いる場合の形態は、経口投与用の製剤の形態とすることができる。例えば、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル、散剤、顆粒剤、液剤等が挙げられる。医薬として製造する場合は、例えば、適宜必要に応じて、製薬的に許容される担体、賦形剤、補形剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、保存剤、抗酸化剤等を用い、一般に認められた製剤投与に要求される単位用量形態で製造することができる。
　本発明の組成物は飲食品用素材または動物用飼料素材として用いることもでき、例えば、本発明の組成物または本発明の組成物の有効成分であるペプチドTyr-Proを消化管運動促進作用、抗不安作用、血流促進作用、健忘予防、心拍数調節作用、血糖調節作用、胃液分泌調節作用、体温調節作用、またはストレス緩和作用等の効能を有する特定保健用食品等の機能性食品とすることができる。
　所望の効果を得るための本組成物またはペプチドTyr-Proの投与または摂取量は、１回あたり有効成分であるペプチドTyr-Proの量として一般に0.045mg/kg体重～100mg/kg体重程度である。特に、消化管運動促進が主として望まれる場合、本発明の組成物の摂取量は、Tyr-Proの量として0.045mg/kg体重～0.12mg/kg体重が好ましい。また主として抗不安作用が望まれる場合は、Tyr-Proの量として0.1mg/kg体重～100mg/kg体重が特に好ましく、主として健忘予防作用が望まれる場合はTyr-Proの量として1.5mg/kg体重～15mg/kg体重が好ましい。１日あたりの摂取回数に応じて、食品、例えば機能性食品における１回あたりの摂取量を前記量より更に低くすることも可能である。適切な摂取量は、上述の通り種々の要因を考慮して更に調整することができる。
　本発明の組成物またはその有効成分であるペプチドTyr-Proを含む食品、例えば機能性食品は、上述のようにして得たTyr-Proを含有するタンパク質の分解物又はその濃縮物やTyr-Proを含有するタンパク質を含む原料の醗酵物そのもの、あるいは醗酵物を粉末状や顆粒状にして各種食品に添加して製造することができる。また必要に応じて、食品に用いる他の成分、例えば、糖類、タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル、フレーバー、例えば、各種炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類、甘味料、香料、色素、テクスチュア改善剤等又はこれらの混合物等の添加物を添加し、栄養的バランスや風味等を改善してもよい。本発明の組成物またはその有効成分であるペプチドTyr-Proを含む動物用飼料もヒト用食品と同様にして調製することが出来る。
　例えば前述の機能性食品は、固形物、ゲル状物、液状物の何れの形態とすることができ、例えば、乳酸菌飲料等の醗酵乳製品、各種加工飲食品、乾燥粉末、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等が挙げられ、更には各種飲料、ヨーグルト、流動食、ゼリー、キャンディ、レトルト食品、錠菓、クッキー、カステラ、パン、ビスケット、チョコレート等とすることができる。
　本発明の組成物を含む特定保健用食品等の機能性食品を製造する場合、添加形態や製品形態によるが、最終製品に対して、含有される有効成分であるペプチドTyr-Proの含有量が0.00001質量％～10質量％、好ましくは0.00003質量％～3質量％、さらに好ましくは0.0001質量％～1質量％となるように調製する。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例に限られない。
Tyr-Proの自律神経活動に対する効果
　体重約300ｇのWistar系雄ラット（約９週齢）(n=3)を用い、餌及び水は自由摂取させた。自律神経の活動を検討するために、3時間絶食後、明期の中間期にウレタン麻酔下に経口投与用のポリエチレンチューブを口腔内に挿入した。その後、副腎を支配する交感神経、胃を支配する副交感（迷走）神経もしくは尻尾の皮膚動脈交感神経を銀電極で吊り上げて、神経の電気活動を測定した。尚、手術開始から測定終了までチューブを気管に挿入して気道を確保し、保温装置にて体温（ラット直腸温）を35.0±0.5℃に保つようにした。これらの神経の活動が落着いた時期に各サンプルを1mlポリエチレンチューブにて経口投与し、これらの神経活動の変化を測定した。サンプルは、Tyr-Pro 0.045mg/kg体重、0.12mg/kg体重、1.2mg/kg体重およびカゼイン分解物4.2mg/kg体重とした。使用したカゼイン分解物は牛乳カゼインを酵素により加水分解して得られたもので、カゼイン分解物の総量に対して0.5重量％以上のTyr-Proを含む。
　対照として溶媒の水１mlを経口投与した。副腎交感神経、胃副交感神経および皮膚動脈交感神経の活動のデータは５分間毎の５秒あたりの発火頻度（pulse/5 s）の平均値にて解析し刺激開始前の値（０分値）を100%として百分率で表し、その平均値±標準誤差で示した。対照群との有意差検定は、投与5～60分の値を群として、分散分析法 (ANOVA)により行った。結果を図１～図３に示す。
　水投与群に比較し、Tyr-Pro 0.045mg/kg体重および0.12mg/kg体重投与のいずれにおいても投与後の胃副交感神経活動が有意に上昇した（図１）。また、水投与群に比較し、Tyr-Pro 0.012mg/kg体重投与により副腎交感神経活動が有意に低下した（図２）。さらに、水投与群に比較し、Tyr-Pro 0.12mg/kg体重投与により皮膚動脈交感神経活動が低下する傾向を示した（図３A）。また、水投与群に比較し、カゼイン分解物4.2mg/kg体重投与により皮膚動脈交感神経活動が有意に低下した（図３B）。この結果から、Tyr-Proの経口投与は0.045mg/kg体重～0.12mg/kg体重の範囲で胃副交感神経活動を促進、副腎交感神経活動を抑制、および皮膚動脈交感神経活動を抑制することが明らかになった。また、用いたカゼイン分解物の場合、4.2mg/kg体重で皮膚動脈交感神経活動を抑制することが明らかとなった。
Tyr-Proの胃排出能に対する効果
　Sprague-Dawley(SD)系雄性ラット（6週齢）を用い（n=10）、餌及び水は自由摂取させ、１週間以上の予備飼育後、実験に供した。試験前、全てのラットは絶食ケージを用いて24時間絶食させた。この間、水の摂取は自由とした。試験はラットに溶媒（注射用蒸留水）およびTyr-Pro0.1mg/kg体重を経口投与し、30分後さらに0.05％の色素（フェノールレッド）溶液（1.5％カルボキシルメチルセルロース含有）を1.5 ml/ratの容量で経口投与し、色素投与20分後にエーテル麻酔下に直ちに胃を摘出した。摘出した胃は、0.1N NaOHを入れたビーカー内に浸し、ハサミで細切後にポリトロンを用いてホモジナイズした。ホモジネートは室温で1時間放置した後、上清に30％（w/v）トリクロロ酢酸溶液を添加して蛋白を沈殿させた。上清を遠心後、560 nmにおける吸光度を測定し、以下の式に従って胃排出能（GE：gastric emptying）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　結果を図４に示す。測定結果は平均値±標準誤差で表し、対照群との群間比較は対応のないスチューデントのt検定を用いた。ラット胃排出能試験において、対照群（蒸留水投与群）の色素排出率は78.8±2.41%であった。Tyr-Pro投与群の色素排出率は、85.4±2.01%であった。この結果から、Tyr-Proは0.1mg/kg体重の投与において、消化管運動促進作用を示すことが明らかになった。
Tyr-Proおよびカゼイン分解物の健忘予防作用
　ddY系雄性マウス(約7週齢)を用い（n=15）、餌及び水は自由摂取させた。被検物質として、Tyr-Pro 1.5mg/kg体重、15mg/kg体重、カゼイン分解物200mg/kg体重および2000mg/kg体重を用いた。使用したカゼイン分解物は実施例１に記載したものと同じである。
　被験物質は自発的交替行動を評価するY字迷路試験の実施60分前にマウスに単回経口投与した。また、Y字迷路試験の実施30分前には、マウスに記憶障害および／または認知障害を誘発するため、スコポラミンを1mg/kg体重となるよう背部に皮下投与した。Y字迷路試験では、一本のアームの長さが40cm、壁の高さが12cm、床の幅が3cm、上部の幅が10cmで3本のアームがそれぞれ120度の角度で接続されたY字迷路を実験装置として用いた。マウスをY字迷路のいずれかのアームの先端に置き、8分間にわたって迷路内を自由に探索させ、マウスが移動したアームを順に記録した。マウスが測定時間内に各アームに移動した回数をカウントし、これを総進入数とし、この中で連続して異なる三つのアームを選択した組み合わせ（例えば、3本のアームをそれぞれA、B、Cとした際に、進入したアームの順番がABCBACACBの場合は重複も含めて4とカウントする）を調べ、この数を自発的交替行動数とした。自発的交替行動数を総進入数から2を引いた数で割り、それに100を掛けて求めた値を自発的交替行動変化率とし、これを自発的交替行動の指標とした。測定値は群毎に平均値±標準誤差で表した。対照群との有意差検定は、一元配置分散分析後にダネット（Dunnett）型多重比較検定で行った。結果を図５-1および図５-2に示す。
　これらの結果から、Tyr-Proは1.5mg/kg体重～15mg/kg体重の範囲、使用したカゼイン分解物は200mg/kg体重～2000mg/kg体重の範囲において健忘予防作用を示すことが明らかになった。
高架式十字迷路試験によるTyr-Proの抗不安作用の評価
　ddY 系雄性マウス(約6週齢)を用い（n=12）、予備飼育後、Tyr-Pro（0.1mg/kg体重, 1.0mg/kg体重, 10mg/kg体重, 30mg/kg体重, 100mg/kg体重）またはカゼイン分解物（10mg/kg体重, 100mg/kg体重, 1000mg/kg体重）を単回経口投与し、投与30分後に高架式十字迷路試験により抗不安作用を検討した。カゼイン分解物は実施例１に記載したものと同じである。尚、陽性対照として抗不安薬として知られるジアゼパム（1.0mg/kg体重）を投与した。　高架式十字迷路は、長さ65cm、幅5cmの塩化ビニル製の板を2本、十字型に交差させた形状をし、その1本の通路の周囲には中央の交差部分を除いて、高さ50cmの壁（黒色アクリル製樹脂）が取り付けられている。すなわち、十字迷路は壁のない2本のアーム（オープンアーム）と壁のある2本のアーム（クローズドアーム）、及び中央の交差部分で構成されている。高架式十字迷路試験では、迷路の中央の交差部に、一方の壁のあるアームに向けてマウスを置き、5分間迷路上を自由に探索させ、その行動を観察し、オープンアーム上の累積滞在時間を測定した。測定値から5分間の試験中のオープンアーム累積滞在時間比率を求め、これを抗不安作用の指標とした。尚、対照群には蒸留水、陽性対照群にはジアゼパム(diazepam)1mg/kg体重を単回経口投与した。各測定値は群毎に平均値±標準誤差で表し、対照群との群間比較は対応のないスチューデントのt検定を用いた。結果を図６に示す。
　これらの結果から、Tyr-Proは0.1mg/kg体重～100mg/kg体重の範囲、使用したカゼイン分解物は10mg/kg体重～1000mg/kg体重において抗不安作用を示すことが明らかになった。

Claims (16)

  1. 　Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、自律神経活動調節用組成物。
  2. 　Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、副交感神経活動の促進用組成物。
  3. 　Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、交感神経活動の亢進抑制用組成物。
  4. 　消化管運動促進作用、健忘予防作用または抗不安作用を有する、請求項２または請求項３記載の組成物。
  5. 　Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、消化管運動促進用組成物。
  6. 　Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、健忘予防用組成物。
  7. 　Tyr-Proまたはその塩を有効成分とする、不安抑制用組成物。
  8. 　経口摂取用である、請求項１～７のいずれか１項記載の組成物。
  9. 　非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における自律神経活動を調節する方法。
  10. 　非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における副交感神経活動を促進する方法。
  11. 　非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、非ヒト動物における交感神経活動の亢進を抑制する方法。
  12. 　非ヒト動物において消化管運動を促進する、健忘を予防するまたは不安を抑制する、請求項１０または請求項１１記載の方法。
  13. 　非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、消化管運動を促進する方法。
  14. 　非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、健忘を予防する方法。
  15. 　非ヒト動物にTyr-Proまたはその塩を投与することを含む、不安を抑制する方法。
  16. 　投与が経口投与である、請求項９～１５のいずれか１項記載の方法。
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