WO2010095684A1 - 脂肪細胞への分化誘導培地及び方法 - Google Patents

脂肪細胞への分化誘導培地及び方法 Download PDF

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佳之 堀田
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富士レビオ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue

Definitions

  • the present invention relates to a medium and a method for inducing differentiation of mammalian somatic stem cells into adipocytes outside the body.
  • Induction of differentiation into adipocytes is used for confirming the undifferentiation ability of human somatic stem cells and for research on metabolic syndrome related to differentiation-induced adipocytes.
  • Animal serum for example, fetal bovine serum, human serum, etc.
  • fetal bovine serum for example, fetal bovine serum, human serum, etc.
  • performance such as the ability to induce differentiation into adipocytes varies depending on the origin of the serum and the lot of the product. Therefore, there is a problem that it is difficult to make the quality of adipocytes induced to differentiate under high serum concentration conditions constant.
  • the method for inducing differentiation from somatic stem cells to adipocytes is a method of using isobutylmethylxanthine, dexamethasone, insulin and thiazole derivatives (such as rosiglitazone and pioglitazone) in a medium containing animal serum (Non-patent Document 1), and A method of using isobutylmethylxanthine, dexamethasone, insulin and indole derivatives (such as indomethacin) (Non-patent Document 2) has been reported. Furthermore, it is known that biotin, prostaglandin and pantothenic acid are added to differentiate adipocytes.
  • Non-patent Document 3 As a substance that induces the activity of RhoA, lysophosphatidic acid (LPA), which is a lysophospholipid, is known. So far, no method has been known for improving the efficiency of fat differentiation by adding LPA having an activation effect of RhoA to a medium for inducing differentiation of somatic stem cells into adipocytes.
  • LPA lysophosphatidic acid
  • a differentiation-inducing medium containing serum has been used to induce differentiation of mammalian somatic stem cells into adipocytes. It is an object of the present invention to provide a medium, an additive, and a method for efficiently inducing differentiation from mammalian somatic stem cells to cells having adipocyte characteristics under serum-free or low-serum medium conditions.
  • an inducer isomethylxanthine, insulin, dexamethasone, rosiglitazone, indomethacin, etc.
  • an inducer isomethylxanthine, insulin, dexamethasone, rosiglitazone, indomethacin, etc.
  • an inducer isomethylxanthine, insulin, dexamethasone, rosiglitazone, indomethacin, etc.
  • a ligand for lysophosphatidic acid LPA
  • biotin a vitamin known as a co-enzyme for carboxyltransferase
  • vitamin C ascorbic acid or ascorbic acid diphosphate
  • a buffer a buffer for blending the organic compound HEPES used in the medium, it can be effectively differentiated from mammalian somatic stem cells into adipocytes under serum-free medium conditions, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a basic medium for mammalian cell culture, an agent for inducing differentiation of mammalian somatic stem cells into adipocytes, biotin, a ligand for an endothelial cell differentiation gene (Edg) family receptor, vitamin C,
  • a medium for inducing differentiation of mammalian somatic stem cells into adipocytes which is serum-free or low-serum, containing HEPES.
  • the present invention also provides a medium for inducing differentiation of mammalian somatic stem cells into adipocytes, which contains biotin, a ligand for endothelial cell differentiation gene (Edg) family receptor, vitamin C, and HEPES.
  • the present invention provides a method for inducing differentiation from somatic stem cells to adipocytes, comprising culturing somatic stem cells that can differentiate into adipocytes in the medium of the present invention.
  • the medium and the medium additive of the present invention are somatic under conditions that do not use serum that has been added to a conventional differentiation-inducing medium, that is, serum-free conditions, when inducing differentiation from somatic stem cells to adipocytes. It makes it possible to effectively differentiate stem cells into adipocytes. Furthermore, the influence on the origin of the serum generated by using the serum, the differentiation efficiency by the lot, and the like can be solved. As a result, it has become possible to provide stable quality differentiation-induced adipocytes.
  • FIG. 3 is a diagram obtained by oil red O staining of cells obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 and induced to differentiate from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into adipocytes in each medium.
  • A A graph showing changes in the amount of adiponectin secreted from cells induced to differentiate from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into adipocytes, obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3,
  • FIG. 3 is a diagram obtained by oil red O staining of cells obtained by differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into adipocytes obtained in Example 2 and Comparative Examples 4 to 8.
  • FIG. 3 is a diagram obtained by oil red O staining of cells obtained in Example 3 and Comparative Examples 9 to 11 and induced to differentiate from human adipose-derived pluripotent stem cells into adipocytes in each medium.
  • FIG. 6 is a diagram obtained by oil red O staining of cells obtained in Example 4 and Comparative Examples 12 to 14 and induced to differentiate from human adipose precursor cells into adipocytes in each medium.
  • “somatic stem cells” form each organ in vivo such as osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, skin cells, nerve cells, muscle cells, blood cells, fibroblasts, liver cells. It means a cell that can be transdifferentiated into one or more types of tissue cells.
  • “Somatic stem cells” are cells excluding embryonic stem cells among stem cells and progenitor cells that have the ability to differentiate into cells having several different functions, and are induced multifunctional stem cells, hematopoietic stem cells, It includes leaf stem cells, neural stem cells, skin stem cells, liver stem cells, pancreatic stem cells and the like.
  • the cells that can be induced to differentiate into adipocytes in the medium of the present invention are not limited as long as they are mammalian somatic stem cells (including adipocyte precursor cells as described above).
  • Preferred examples include adipose tissue. Examples include, but are not limited to, derived stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, fibroblast-derived mesenchymal stem cells somatic stem cells.
  • the medium of the present invention contains a ligand for an endothelial cell differentiation gene (Edg) family receptor having a RhoA activity effect as an essential component.
  • the Edg family receptors are a group of G protein-coupled receptors with high homology in their gene sequences.
  • Edg-1 to Edg-8 have been identified in mammals such as humans, mice, and sheep. ing.
  • Edg-2, Edg-4 and Edg-7 function as LPA receptors
  • Edg-1, Edg-3, Edg-5, Edg-6 and Edg-8 are known to function as S1P receptors. It has been.
  • a “ligand for a receptor” is a substance that specifically binds to the receptor, and includes not only natural ligands existing in the body, but also other natural or synthesized compounds known as agonists and antagonists. Include.
  • the ligand for the Edg family receptor includes one or more compounds selected from the group consisting of agonists such as lysophosphatidic acid (LPA) and salts thereof. preferable.
  • An agonist for an Edg family receptor is a substance that binds to the Edg family and acts like LPA.
  • LPA sphingosine 1-phosphate
  • S1P sphingosine 1-phosphate
  • PAF platelet activating factor
  • Sphingosylphosphorylcholine a substance that binds to the Edg family and acts like LPA.
  • S1P sphingosine 1-phosphate
  • PAF platelet activating factor
  • sphingosylphosphorylcholine Alkyl LPA analogs
  • FTY720 Alkyl LPA analogs
  • LPA is the following general formula (I): R—O—CH 2 CH (OH) CH 2 PO 4 H 2 (I) (Wherein R is an alkyl group having 10 to 30 carbon atoms, an alkenyl group having 10 to 30 carbon atoms, or an acyl group having 10 to 30 carbon atoms) It is a compound represented by these. In addition, carbon number of the acyl group about R group of said formula (I) does not include carbon number of a carbonyl group.
  • LPA As the salt of LPA, a conventionally known salt can be used, and examples thereof include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, ammonium salt and the like.
  • alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, ammonium salt and the like.
  • LPA or a salt of LPA include 1-oleoyl lysophosphatidic acid sodium salt and LPA potassium salt.
  • Edg ligands can be used alone or in combination of two or more.
  • the medium of the present invention contains biotin, a vitamin known to act as a coenzyme for carboxyylase.
  • Biotin is known to play an important role in the body as a coenzyme such as pyruvate carboxylase involved in sugar metabolism, acetyl CoA carboxylase and propionyl CoA carboxylase involved in fatty acid metabolism.
  • the medium of the present invention contains vitamin C known as a water-soluble vitamin.
  • Vitamin C is used for the biosynthesis of amino acids, as well as the secretion of hormones from the adrenal gland, the synthesis of L-carnitine, which is a carrier for transporting fatty acids to the mitochondria, and the production of collagen in connective tissues. It is known to play an important role in the chemical reaction.
  • Vitamin C may be ascorbic acid or ascorbic acid diphosphate, or a mixture thereof.
  • the medium of the present invention contains 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), which is an organic compound used for the buffer solution. It is known that HEPES has a pKa of 7.55 (20 ° C.) and has a buffering action in the range of about pH 6.8-8.2.
  • HEPES 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
  • the concentration of lysophosphatidic acid (LPA), which is an Edg ligand, and its salt in this medium is preferably 0.01-100 ⁇ M, more preferably 0.1-10 ⁇ M.
  • the concentration of biotin and its salt is preferably from 0.01 to 10 mM, more preferably from 0.1 to 5 mM.
  • the concentration of vitamin C and its salt is preferably from 0.01 to 10 mM, more preferably from 0.1 to 5 mM.
  • the concentration of HEPES is preferably from 0.01 to 100 mM, more preferably from 0.1 to 50 mM.
  • the medium of the present invention contains an agent for inducing differentiation of mammalian somatic stem cells into adipocytes.
  • Differentiation-inducing agents from somatic stem cells to adipocytes are known per se, and well-known differentiation-inducing agents can be preferably used in the present invention.
  • Preferred examples of known differentiation inducers include isobutylmethylxanthine; insulin; dexamethasone; thiazole derivatives such as rosiglitazone and pioglitazone; and indole derivatives such as indomethacin. These differentiation inducers can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the differentiation-inducing agent in the medium is appropriately set according to the type of differentiation-inducing agent used, the type of cells, and the like.
  • isobutylmethylxanthine is about 10 to 1000 ⁇ M, preferably about 250 to 750 ⁇ M. is there.
  • Insulin is about 0.1 to 10 ⁇ M, preferably about 0.5 to 2.5 ⁇ M.
  • Dexamethasone is about 0.1 to 10 ⁇ M, preferably about 0.5 to 2.5 ⁇ M.
  • the thiazole derivative is about 0.1 to 10 ⁇ M, preferably about 0.5 to 5 ⁇ M.
  • the indole derivative is about 10 to 500 ⁇ M, preferably about 50 to 200 ⁇ M.
  • the medium of the present invention may be the same as a known medium for mammalian cells except that it contains the above-described four kinds of essential components and the differentiation inducer. Therefore, the medium of the present invention can be obtained by adding the above-mentioned four essential components and a differentiation inducer conventionally used for inducing differentiation into adipocytes to a known basic medium.
  • Preferred known serum-free basal media that can be used in the medium of the present invention include minimum essential medium (MEM) such as Eagle medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), minimum essential medium ⁇ (MEM- ⁇ ), Mesenchymal cell basal medium (MSCBM), Ham's F-12 and F-10 medium, DMEM / F12 medium, Williams medium E, RPMI-1640 medium, MCDB medium, 199 medium, Fisher medium, Iscove modified Dulbecco medium ( IMDM), McCoy modified medium, and the like. These media are all well-known media in this field.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • MSCBM Mesenchymal cell basal medium
  • DMEM / F12 medium Williams medium E
  • RPMI-1640 medium RPMI-1640 medium
  • MCDB medium 199 medium
  • Fisher medium Iscove modified Dulbecco medium
  • McCoy modified medium McCoy modified medium
  • the medium of the present invention may further contain various additives that are well known to be included in mammalian cell culture media.
  • additives include amino acids, inorganic salts, vitamins, and other additives such as carbon sources and antibiotics.
  • Amino acids include glycine, L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-cystine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-histidine, L-isoleucine, L- Mention may be made of leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine.
  • Inorganic salts include calcium chloride, copper sulfate, iron (III) nitrate, iron sulfate, magnesium chloride, magnesium sulfate, potassium chloride, sodium hydrogen carbonate, sodium chloride, disodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate and zinc sulfate. Can be mentioned.
  • vitamin B1 As vitamins, choline, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B4, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B12, vitamin B13, vitamin B15, vitamin B17, vitamin Bh, vitamin Bt, vitamin Mention may be made of Bx, vitamin D, vitamin E, vitamin F, vitamin K, vitamin M and vitamin P.
  • the amount of each additive may be the same as that of a known medium, and can be appropriately set by a routine test.
  • the addition amount of amino acids is usually about 5 mg / L to 500 mg / L, preferably about 10 mg / L to 400 mg / L for each amino acid
  • the addition amount of inorganic salts is usually 0 mg / L to About 10 g / L, preferably about 0.01 mg / L to 7 g / L.
  • the amount of vitamins added is about 0.01 mg / L to 500 mg / L, preferably 0.05 mg / L for each vitamin. About 300 mg / L.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF endothelial cell growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • FGF growth factors
  • penicillin streptomycin
  • gentamicin kanamycin
  • Carbon sources such as glucose, galactose, fructose and sucrose
  • antioxidants such as 2-mercaptoethanol, catalase, superoxide dismutase and N-acetylcysteine, and adenosine 5′-monophosphate, corticosterone, ethanolamine, insulin, reduced glutathione, Lipoic acid, hypoxanthine, pheno Mention may be made of other additives such as lured, progesterone, putrescine, pyruvate, thymidine, triiodothyronine, transferrin and lactoferrin. The addition amount of these additives may be the same as the conventional one, and can be appropriately set by a routine test according to the purpose of each additive. Usually, it is about 0.001 mg / L to 5 g / L, particularly about 0.1 to 3 g / L.
  • the medium of the present invention can contain one or more of the various additives described above, and usually contains a combination of a plurality of additives.
  • progesterone is preferable because it exerts an effect of enhancing the amount of oil droplets in the fat cells when added to the medium.
  • the preferred concentration in the medium is about 20 nM to 200 nM.
  • the medium of the present invention is serum-free or low-serum, preferably serum-free.
  • low serum means a medium containing serum but containing 5% by weight or less, preferably 1% by weight.
  • Culture of mammalian somatic cells in the medium of the present invention can be carried out in the same manner as in the prior art, and is usually performed at a temperature of 30 to 37 ° C., in a 5% CO 2 environment, and 5 to 21% O. Performed in two environments.
  • the culture time required for differentiation induction is appropriately set depending on the differentiation inducer used, the type of cells, and the like, and can be appropriately selected while observing the state of the cells. Usually, it is about 10 to 28 days. It is.
  • the present invention also provides an additive for constituting the above-described culture medium of the present invention. Therefore, the additive of the present invention contains the above-mentioned Edg ligand, biotin, vitamin C and HEPES. Moreover, the said differentiation-inducing agent may be further included in these. Further, one or more of the various additives described above may be included. Furthermore, the medium of the present invention can be provided simply by including the components of the basic medium and dissolving in water. It is preferable that the additive of the present invention has a composition that gives the above-described medium of the present invention by dissolving in water or a basic medium. In this case, the mixing ratio of various components contained in the additive is the same as the content ratio of each component in the medium. In addition, as a basic medium, the above-mentioned various culture media conventionally used for culture
  • the concentration described in each example is the final concentration in the medium.
  • the lysophosphatidic acid (LPA) used was sodium 1-oleoyl lysophosphatidate.
  • Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 Differentiation induction from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells to adipocytes under serum-free conditions
  • a fat cell differentiation-inducing medium was prepared by adding HEPES-containing DMEM to a final concentration of 500 ⁇ M isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 ⁇ M dexamedazone, 1 ⁇ M insulin, 1 ⁇ M rosiglitazone.
  • IBMX isobutylmethylxanthine
  • serum-free differentiation medium 5 ⁇ M LPA, 1 mM vitamin C, 100 ⁇ M biotin and 41.5 nM progesterone were added to the adipocyte differentiation induction medium, and the serum-free differentiation induction medium of the present invention (hereinafter referred to as serum-free differentiation medium, Example 1). Manufactured.
  • a conventional medium (Comparative Example 2) and a conventional differentiation medium (Comparative Example 3) were prepared by adding 10% fetal bovine serum (FBS) to each of DMEM containing HEPES and the adipocyte differentiation induction medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (strain name: normal human mesenchymal stem cells (Cryo hMSC), source: LONZA) are seeded in a culture vessel of a 48-well culture plate so that the cell density is 30000 cells / cm 2. These media were replaced with new media every 3 to 4 days and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 7 to 21 days to induce differentiation into adipocytes.
  • Fat cells were confirmed by staining fat droplets accumulated in the cells with Oil Red O. Furthermore, oil red O-stained cells were extracted with isopropanol, and the amount of fat accumulated in the cells was measured with an absorptiometer (wavelength 492 nm). Then, the amount of adiponectin (Adiponectin) secreted from the cells during 3 days from the 4th to the 7th day, the 11th to the 14th day, and the 18th to the 21st day of differentiation induction was measured using an adiponectin measurement kit (Fujirebio Co., Ltd.). ). Furthermore, the expression of PPAR- ⁇ and adiponectin mRNA was confirmed by real-time PCR.
  • Adiponectin adiponectin secreted from the cells during 3 days from the 4th to the 7th day, the 11th to the 14th day, and the 18th to the 21st day of differentiation induction was measured using an adiponectin measurement kit (
  • Primers are: PPRA- ⁇ : forward (ggtttcagaaatgccttgcag (SEQ ID NO: 1)), reverse (tcgcctttgctttggtcag (SEQ ID NO: 2)), adiponectin: forward (ccctcccgatatcaaaaagact (SEQ ID NO: 3)), reverse (tcagaaacaggcacacaactca (SEQ ID NO: 4), : Forward (aacagcctcaagatcatcagc (SEQ ID NO: 5)) and reverse (ggatgatgttctggagagcc (SEQ ID NO: 6)) were used.
  • FIGS. 1 to 3 The results are shown in FIGS. 1 to 3, it was confirmed that human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were efficiently induced to differentiate into adipocytes in the serum-free medium of the present invention, as in the conventional serum-containing differentiation induction medium.
  • Example 2 and Comparative Examples 4 to 7 Differentiation induction from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells to adipocytes under serum-free conditions 2
  • an adipocyte differentiation-inducing medium was prepared by adding HEPES-containing DMEM to 500 ⁇ M final IBMX, 1 ⁇ M dexamedazone, 1 ⁇ M insulin, 1 ⁇ M rosiglitazone.
  • a serum-free differentiation medium of the present invention was prepared by adding 5 ⁇ M LPA, 1 mM vitamin C, 0.5 mM biotin and 41.5 nM progesterone to this adipocyte differentiation induction basal medium.
  • Adipocyte differentiation induction medium 2 was prepared by adding 500 ⁇ M IBMX, 1 ⁇ M dexamedazone, 1 ⁇ M insulin, 1 ⁇ M rosiglitazone to DMEM without HEPES. Serum-free differentiation medium 2 was produced by adding 5 ⁇ M LPA, 1 mM vitamin C, 100 ⁇ M biotin and 41.5 nM progesterone to this adipocyte differentiation induction basal medium 2 (Comparative Example 8).
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were seeded in wells of a 48-well culture plate at a cell density of 30000 cells / cm 2 , and these media were added to each new media every 3-4 days. By exchanging and culturing at 37 ° C., 5% CO 2 for 21 days, differentiation into adipocytes was induced.
  • Fat cells were confirmed by staining fat droplets accumulated in cells with Oil Red O, as in Example 1.
  • Example 3 and Comparative Examples 9 to 11 Differentiation induction from human adipose-derived pluripotent stem cells to adipocytes under serum-free conditions
  • Example 9 As in Example 1, 5 ⁇ M LPA, 1 mM vitamin C, 100 ⁇ M biotin and 41.5 nM progesterone were added to DEP containing HEPES to produce a serum-free control medium (Comparative Example 9).
  • an adipocyte differentiation-inducing medium was prepared by adding HEPES-containing DMEM to a final concentration of 500 ⁇ M IBMX, 1 ⁇ M dexamedazone, 1 ⁇ M insulin, 1 ⁇ M rosiglitazone.
  • a serum-free differentiation medium was prepared by adding 5 ⁇ M LPA, 1 mM vitamin C, 100 ⁇ M biotin and 41.5 nM progesterone to this adipocyte differentiation induction basal medium (Example 3).
  • a conventional medium (Comparative Example 10) and a conventional differentiation medium (Comparative Example 11) were prepared by adding 10% fetal bovine serum (FBS) to each of DMEM containing HEPES and the above-described adipocyte differentiation induction medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • Human adipose-derived pluripotent stem cells (strain name: hMADS cells, source: Stem Cell Science Co., Ltd.) are seeded in wells of a 48-well culture plate so that the cell density is 30000 cells / cm 2. Differentiating into adipocytes was performed by replacing each fresh medium every 4 days and culturing at 37 ° C., 5% CO 2 for 14 days.
  • Fat cells were confirmed by staining fat droplets accumulated in cells with Oil Red O, as in Example 1.
  • Example 4 Comparative Examples 12 to 14 Differentiation induction from human adipocyte progenitor cells to adipocytes under serum-free conditions
  • Example 4 Except that human adipose-derived pluripotent stem cells were replaced with human adipose precursor cells (strain name: normal human precursor adipocytes-organ adipose tissue-derived (Cryo HPRAD-VICE), source: LONZA), Example 3 and The same operations as in Comparative Examples 9 to 11 were performed (Example 4 and Comparative Examples 12 to 14, respectively).

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Abstract

要約 課題　無血清又は低血清培地条件下で効率よく哺乳類の体性幹細胞から脂肪細胞の特徴を持った細胞へ分化誘導する培地、添加剤および方法を提供すること。 解決手段　哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地は、哺乳動物細胞培養用基本培地と、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤と、ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含み、無血清又は低血清である。

Description

脂肪細胞への分化誘導培地及び方法
　本発明は、体外で哺乳動物の体性幹細胞を脂肪細胞へ分化誘導する培地および方法に関する。
　脂肪細胞への分化誘導は、ヒト体性幹細胞の未分化能の確認や分化誘導した脂肪細胞でのメタボリックシンドローム関連等の研究などに利用されている。
　ヒト体性幹細胞および脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化誘導には、動物血清（例えば、ウシ胎児血清、ヒト血清など）が用いられている。そして、動物血清は、成分構成が完全にわかっていないことに加え、血清の起源や製品等のロットにより脂肪細胞への分化誘導能力等の性能が異なることが知られている。そのため、高濃度の血清条件下で分化誘導させた脂肪細胞の品質を一定にすることが難しいという問題点がある。
　従来、体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導方法は、動物血清含有の培地にイソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリンおよびチアゾール誘導体（ロシグリタゾン、ピオグリタゾンなど）を使用する方法（非特許文献１）および、イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリンおよびインドール誘導体（インドメタシンなど）を使用する方法（非特許文献２）などが報告されている。さらに、ビオチン、プロスタグランジン、パントテン酸を添加して脂肪細胞分化することが知られている。
　ＲｈｏＡを活性化することで、脂肪細胞への分化誘導を抑制し、骨細胞への分化誘導を促進することが知られている（非特許文献３）。このＲｈｏＡの活性を誘導する物質としては、リゾリン脂質であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が知られている。これまでに、ＲｈｏＡの活性化作用を有するＬＰＡを体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地に添加することで、脂肪分化効率を改善する方法は知られていない。
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９５:２８１８３－７. Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ. ２００５:１３５７－６６. Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ. ２００４:４８３－９５.
　従来、哺乳類の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導には、血清を含んだ分化誘導培地が使用されている。本発明は、無血清又は低血清培地条件下で効率よく哺乳類の体性幹細胞から脂肪細胞の特徴を持った細胞へ分化誘導する培地、添加剤および方法を提供することを課題とする。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、従来から脂肪細胞の分化誘導に使用されている誘導剤（イソメチルキサンチン、インスリン、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、インドメタシンなど）に内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドであるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、カルボキシル基転移酵素の補酵素で知られているビタミンのビオチン、抗酸化作用を有するビタミンのビタミンＣ（アスコルビン酸またはアスコルビン酸２リン酸）および緩衝剤として使用される有機化合物のＨＥＰＥＳを培地に配合することにより無血清培地条件下で効果的に哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞へ分化させることができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、哺乳動物細胞培養用基本培地と、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤と、ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含み、無血清又は低血清である、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地を提供する。また、本発明は、ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含む、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地添加剤を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の培地中で、脂肪細胞へ分化し得る体性幹細胞を培養することを含む、体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導方法を提供する。
　本発明の培地および培地添加剤は、体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導する際に、従来の分化誘導培地に添加されていた血清を用いない条件下、すなわち、無血清条件下で体性幹細胞を脂肪細胞へ効果的に分化させることを可能にする。さらに、血清を用いることにより発生していた血清の起源、ロットによる分化効率などへの影響を解決することができる。その結果、安定した品質の分化誘導された脂肪細胞を提供することが可能となった。
実施例１及び比較例１～３で得られた、各培地中でヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞をオイルレッドＯ染色した図である。 実施例１及び比較例１～３で得られた、（Ａ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞から分泌されたアディポネクチン量の変化を示したグラフ、（Ｂ）オイルレッドＯで染色された脂肪量の変化を示したグラフ（縦軸は、波長492nmでの吸光度を細胞数で序した値）である。 実施例１及び比較例１～３で得られた、（Ａ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞のＰＰＡＲ－γ遺伝子および（Ｂ）アディポネクチン遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）変化を示したグラフである。 実施例２、比較例４～８で得られた、各培地中でヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞をオイルレッドＯ染色した図である。 実施例３、比較例９～１１で得られた、各培地中でヒト脂肪由来多能性幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞をオイルレッドＯ染色した図である。 実施例４、比較例１２～１４で得られた、各培地中でヒト脂肪前駆細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞をオイルレッドＯ染色した図である。
　本発明において、「体性幹細胞」とは、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液系細胞、繊維芽細胞、肝臓細胞など生体内の各器官を形成する１種類以上の組織細胞に分化転換することができる細胞を意味する。そして、「体性幹細胞」は、何種類かの異なった機能を持つ細胞に分化する能力を有する幹細胞および前駆細胞のうち、胚性幹細胞を除く細胞であり、誘導多機能幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞などを含む。
　本発明の培地中で脂肪細胞へ分化誘導可能な細胞としては、哺乳動物の体性幹細胞（上記の通り脂肪細胞の前駆細胞を包含する）であれば何ら限定されず、好ましい例として、脂肪組織由来幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、線維芽細胞等由来の間葉系間幹細胞の体性幹細胞を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の培地には、ＲｈｏＡ活性効果を有する内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドが必須成分として含まれる。ここで、Ｅｄｇファミリーレセプターは、その遺伝子配列の相同性が高いＧタンパク質共役型のレセプターの一群であり、現在までにヒト、マウス、ヒツジなどの哺乳類でＥｄｇ－１からＥｄｇ－８までが同定されている。これらのうち、Ｅｄｇ－２、Ｅｄｇ－４及びＥｄｇ－７はＬＰＡレセプターとして機能し、Ｅｄｇ－１、Ｅｄｇ－３、Ｅｄｇ－５、Ｅｄｇ－６及びＥｄｇ－８はＳ１Ｐレセプターとして機能することが知られている。また、「レセプターに対するリガンド」とは、該レセプターと特異的に結合する物質であり、生体内に存在する天然のリガンドのみならず、アゴニストやアンタゴニストとして知られる天然又は合成された他の化合物をも包含する。
　Ｅｄｇファミリーレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「Ｅｄｇリガンド」と呼ぶことがある）としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩などのアゴニストからなる群より選択される１又は複数種の化合物が好ましい。
　Ｅｄｇファミリーレセプターに対するアゴニストとは、Ｅｄｇファミリーと結合してＬＰＡ同様に作用する物質であり、例えば、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）、ジヒドロスフィンゴシン１リン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、スフィンゴシルホスホリルコリン、アルキルＬＰＡアナログ、ＦＴＹ７２０などが挙げられる。
　ＬＰＡとは、下記の一般式（Ｉ）：
Ｒ－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＰＯ４Ｈ２　　　　　　　　　　（Ｉ）
（式中、Ｒは、炭素数１０～３０のアルキル基、炭素数１０～３０のアルケニル基又は炭素数１０～３０のアシル基である）
で表される化合物である。なお、上記の式（Ｉ）のＲ基についてのアシル基の炭素数は、カルボニル基の炭素数を含まない。
　ＬＰＡの塩としては、従来公知の塩を用いることができ、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。ＬＰＡ又はＬＰＡの塩としては、例えば１－オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩、ＬＰＡカリウム塩などが挙げられる。
　Ｅｄｇリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　本発明の培地には、カルボキシル基転移酵素（ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）の補酵素として働くとして知られているビタミンのビオチンが含まれる。ビオチンは、糖代謝に関与するピルビン酸カルボキシラーゼ、脂肪酸代謝に関与するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼやプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼなどの補酵素として体内で重要な役割を果たすことが知られている。
　本発明の培地には、水溶性ビタミンとして知られているビタミンＣが含まれている。ビタミンＣは、アミノ酸の生合成に利用されるほか、副腎からのホルモンの分泌、脂肪酸をミトコンドリアに運ぶための担体であるL-カルニチンの合成、結合組織でコラーゲンを生成など、体内で進行するヒドロキシル化反応に重要な役割を果たすことが知られている。ビタミンＣは、アスコルビン酸またはアスコルビン酸２リン酸でよく、これらの混合物でもよい。
　本発明の培地には、緩衝液に用いられる有機化合物である２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が含まれる。ＨＥＰＥＳは、ｐＫａが７．５５（２０℃）で、およそｐＨ ６．８-８．２の範囲で緩衝作用を持つころが知られている。
　本培地中のＥｄｇリガンドであるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩の濃度は、０．０１～１００μＭが好ましく、 ０．１～１０μＭがさらに好ましい。ビオチンおよびその塩の濃度は、０．０１～１０ｍＭが好ましく、０.１～５ｍＭがさらに好ましい。ビタミンＣおよびその塩の濃度は、０．０１～１０ｍＭが好ましく、０.１～５ｍＭがさらに好ましい。ＨＥＰＥＳの濃度は、０.０１～１００ｍＭが好ましく、０.１～５０ｍＭがさらに好ましい。
　本発明の培地は、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤を含む。体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤自体は公知であり、本発明においても公知の分化誘導剤を好ましく用いることができる。公知の分化誘導剤の好ましい例として、イソブチルメチルキサンチン；インスリン；デキサメタゾン；ロシグリタゾン及びピオグリタゾン等のチアゾール誘導体；及びインドメタシン等のインドール誘導体が挙げられる。これらの分化誘導剤は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　培地中の分化誘導剤の濃度は、用いる分化誘導剤の種類や細胞の種類等に応じて適宜設定されるが、通常、イソブチルメチルキサンチンは、１０～１０００μM程度、好ましくは、２５０～７５０μM程度である。インスリンは、０．１～１０μM程度、好ましくは、０．５～２．５μM程度である。デキサメタゾンは、０．１～１０μM程度、好ましくは、０．５～２．５μM程度である。チアゾール誘導体は、０．１～１０μM程度、好ましくは、０．５～５μM程度である。インドール誘導体は、１０～５００μM程度、好ましくは、５０～２００μM程度である。
　本発明の培地は、上記した４種類の必須成分および上記分化誘導物質を含むことを除き、公知の哺乳動物細胞用培地と同様でよい。従って、公知の基本培地に、上記した４種類の必須成分および従来から脂肪細胞への分化誘導に使用されている分化誘導剤を添加することにより、本発明の培地を得ることができる。
　本発明の培地に用いることができる、好ましい公知の無血清基本培地としては、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ－α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２及びＦ－１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地などが挙げられる。これらの培地は、いずれもこの分野において周知の培地である。
　本発明の培地は、さらに、哺乳動物細胞用培地に含ませることが周知である種々の添加剤を含んでいてもよい。このような周知の添加剤として、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類、及び炭素源や抗生物質等の他の添加剤を挙げることができる。
　アミノ酸類としては、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン及びＬ－バリンを挙げることができる。
　無機塩類としては、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（III）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム及び硫酸亜鉛を挙げることができる。
　ビタミン類としては、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ及びビタミンＰを挙げることができる。
　これらの添加剤を哺乳動物細胞用の培地に添加すること自体は公知であり、各添加剤の添加量も公知の培地と同様でよく、また、ルーチンな試験により適宜設定することもできる。例えば、アミノ酸類の添加量は、通常、各アミノ酸毎に５ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌ程度、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ～４００ｍｇ／Ｌ程度であり、無機塩類の添加量は、通常、０ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ程度、好ましくは、０．０１ｍｇ／Ｌ～７ｇ／Ｌ程度であり、ビタミン類の添加量は、各ビタミン毎に０．０１ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌ程度、好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ～３００ｍｇ／Ｌ程度である。
　他の添加剤としては、（１）繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の増殖因子、（２）ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン及びカナマイシン等の抗生物質、（３）グルコース、ガラクトース、フルクトース及びスクロース等の炭素源、（４）マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル及びケイ素等の微量金属）、（５） ２－メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及びＮ-アセチルシステイン等の抗酸化剤、並びにアデノシン ５‘－一りん酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン及びラクトフェリン等の他の添加剤を挙げることができる。これらの添加剤の添加量も従来と同様でよく、また、各添加剤の目的に応じ、ルーチンな試験により適宜設定することもできる。通常、０．００１ｍｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌ、特に０．１～３ｇ／Ｌ程度である。
　本発明の培地は、上記した各種添加剤の１種又は複数種を含むことができ、通常、複数の添加剤を組み合わせて含む。
　なお、これらの他の添加剤のうち、プロゲステロンは、培地に添加した場合に脂肪細胞内の油滴量を増強する効果を発揮するので好ましい。プロゲステロンの場合、培地中の好ましい濃度は、２０ｎＭ～２００ｎＭ程度である。
　本発明の培地は、無血清又は低血清であり、無血清が好ましい。なお、ここで「低血清」は、血清を含むがその含有量が５重量％以下、好ましくは１重量％の培地を意味する。
　本発明の培地中での哺乳動物体細胞の培養自体は、従来と同様な方法で行なうことができ、通常、３０～３７℃の温度、及び５％ＣＯ２環境下、及び５～２１％Ｏ２環境下で行なわれる。また、分化誘導に必要な培養時間は、用いる分化誘導剤や細胞の種類等により適宜設定され、また、細胞の様子を観察しながら適宜選択することができるが、通常、１０日～２８日程度である。
　本発明は、上記した本発明の培地を構成するための添加剤をも提供する。従って、本発明の添加剤は、上記したＥｄｇリガンド、ビオチン、ビタミンＣ及びＨＥＰＥＳを含む。また、これらにさらに上記分化誘導剤を含むものであってもよい。さらに、上記した各種添加剤の１種又は複数種を含んでいてもよい。さらに、基本培地の成分を含ませ、水に溶解するだけで、本発明の培地を与えるものとすることもできる。本発明の添加剤は、水又は基本培地に溶解することにより、上記した本発明の培地を与える組成を有するものが簡便で好ましい。この場合には、添加剤に含まれる各種成分の配合比率は、培地における各成分の含有量の比率と同じになる。なお、基本培地としては、従来から哺乳動物細胞の培養に用いられている、上記した各種培地が挙げられる。
　以下、本発明を実施例及び比較例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、各例に記載されている濃度は、培地中の終濃度である。また、用いたリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、いずれも１－オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウムであった。
実施例１、比較例１～３　　無血清条件下でのヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化誘導１
　ＨＥＰＥＳ含有（濃度２５ｍＭ）のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して無血清コントロール培地（比較例１）を製造した。
　ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭに最終濃度が５００μＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭのデキサメダゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地を製造した。
　上記脂肪細胞分化誘導培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して、本発明の無血清分化誘導培地（以下、無血清分化培地、実施例１）を製造した。
　ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭ及び前記脂肪細胞分化誘導培地のそれぞれに１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して、従来培地（比較例２）および従来分化培地（比較例３）を製造した。
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（株名：正常ヒト間葉系幹細胞（Ｃｒｙｏ ｈＭＳＣ）、入手先：ＬＯＮＺＡ）を３００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように４８穴培養プレートの培養容器に播種し、これらの培地を３～４日ごとに新しい各培地に交換して、３７℃、５％ＣＯ２で７～２１日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。
　脂肪細胞は、オイルレッドＯにて細胞内に蓄積した脂肪滴を染色して確認した。さらに、オイルレッドＯ染色した細胞をイソプロパノールで抽出し、細胞に蓄積された脂肪量を吸光光度計にて測定した(波長492nm)。そして、分化誘導４日目～７日目、１１日目～１４日目、１８日目～２１日目の３日間で細胞から分泌されたアディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）量をアディポネクチン測定キット（富士レビオ社製）で確認した。さらに、ＰＰＡＲ－γおよびアディポネクチンのｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲ法にて確認した。プライマーは、ＰＰＲＡ－γ：フォワード（ggtttcagaaatgccttgcag（配列番号１））、リバース（tcgcctttgctttggtcag（配列番号２））、アディポネクチン：フォワード（ccctcccgatatcaaaaagact（配列番号３））、リバース（tcagaaacaggcacacaactca（配列番号４））、ＧＡＰＤＨ：フォワード（aacagcctcaagatcatcagc（配列番号５））、リバース（ggatgatgttctggagagcc（配列番号６））を使用した。
　結果を、図１～図３に示す。図１～図３より、従来の血清含有分化誘導培地と同様に、本発明の無血清培地でヒト骨髄由来間葉系幹細胞が脂肪細胞に効率良く分化誘導されたことが確認された。
実施例２、比較例４～７　　無血清条件下でのヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化誘導２
　実施例１と同様に、ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭに最終濃度が５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメダゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地を製造した。この脂肪細胞分化誘導基本培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、０．５ｍＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加した、本発明の無血清分化培地（実施例２）を製造した。一方、比較のため、ＬＰＡのみを添加しない培地（比較例４）、ビタミンＣのみを添加しない培地（比較例５）、ビオチンのみを添加しない培地（比較例６）及びプロゲステロンのみを添加しない培地（比較例７）も調製した。
　ＨＥＰＥＳ不含のＤＭＥＭに最終濃度が５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメダゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地２を製造した。この脂肪細胞分化誘導基本培地２に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して、無血清分化培地２を製造した（比較例８）。
　実施例１と同様、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を３００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように４８穴培養プレートのウェルに播種し、これらの培地を３～４日ごとに新しい各培地に交換して、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。
　脂肪細胞は、実施例１と同様、オイルレッドＯにて細胞内に蓄積した脂肪滴を染色して確認した。
　結果を図４に示す。図４に示されるように、実施例２及び比較例７の培地中で培養した場合に比べ、比較例４～６及び比較例８の培地中で培養した場合には、脂肪細胞内の脂肪油滴量が明らかに少なかった。このことより、ＬＰＡ、ビタミンＣ、ビオチン、ＨＥＰＥＳは、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化誘導に必要な物質であるが、プロゲステロンは分化誘導に必須ではないことが確認された。
実施例３、比較例９～１１　　無血清条件下でのヒト脂肪由来多能性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導
　実施例１と同様にＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭに５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して無血清コントロール培地（比較例９）を製造した。
　実施例１と同様、ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭに最終濃度が５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメダゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地を製造した。この脂肪細胞分化誘導基本培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して、無血清分化培地を製造した（実施例３）。
　ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭおよび上記脂肪細胞分化誘導培地のそれぞれに１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して、従来培地（比較例１０）および従来分化培地（比較例１１）を製造した。
　ヒト脂肪由来多能性幹細胞（株名：ｈＭＡＤＳ細胞、入手先：ステムセルサイエンス株式会社）を３００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように４８穴培養プレートのウェルに播種し、これらの培地を３～４日ごとに新しい各培地に交換して、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。
　脂肪細胞は、実施例１と同様、オイルレッドＯにて細胞内に蓄積した脂肪滴を染色して確認した。
　結果を図５に示す。図５に示されるように、比較例８（無血清コントロール培地）及び比較例９（従来培地）では、脂肪細胞は誘導されなかった。一方、実施例３の培地で培養した場合には、比較例１０の培地（血清を含む従来分化培地）中で培養した場合と同程度に多くの脂肪細胞が効率よく分化した。
実施例４、比較例１２～１４　　無血清条件下でのヒト脂肪細胞前駆細胞から脂肪細胞への分化誘導
　ヒト脂肪由来多能性幹細胞を、ヒト脂肪前駆細胞（株名：正常ヒト前駆脂肪細胞－臓器脂肪組織由来（Ｃｒｙｏ　ＨＰＲＡＤ－ＶＩＣＥ）、入手先：ＬＯＮＺＡ）に代えたことを除き、実施例３及び比較例９～１１と同じ操作を行った（それぞれ、実施例４、比較例１２～１４）。
　結果を図６に示す。図６に示されるように、比較例１２（無血清コントロール培地）及び比較例１３（従来培地）では、脂肪細胞は誘導されなかった。一方、実施例４の培地で培養した場合には、比較例１４の培地（血清を含む従来分化培地）中で培養した場合と同程度に多くの脂肪細胞が効率よく分化した。

Claims (10)

  1. 　哺乳動物細胞培養用基本培地と、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤と、ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含み、無血清又は低血清である、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地。
  2. 　内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドの培地中の濃度が、０．０１μＭ～１００μＭ、ビオチン濃度が１０μＭ～１０ｍＭ、ビタミンＣ濃度が１０μＭ～１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ濃度が１０μＭ～１００ｍＭである請求項１記載の培地。
  3. 　内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドがリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項１又は２記載の培地。
  4. 　前記分化誘導剤が、イソブチルメチルキサンチン、インスリン、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及びインドメタシンから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の培地。
  5. 　前記基本培地が、ＤＭＥＭ、ＭＥＭα、ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地から成る群より選ばれる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の培地。
  6. 　無血清培地である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地。
  7. 　ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含む、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地添加剤。
  8. 　体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤をさらに含む請求項７記載の添加剤。
  9. 　水又は基本培地に溶解することにより請求項１ないし８のいずれか１項に記載の培地を与える組成を有する請求項７又は８記載の添加剤。
  10. 　請求項１ないし６のいずれか１項に記載の培地中で、脂肪細胞へ分化し得る体性幹細胞を培養することを含む、体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導方法。
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CA (1) CA2753299C (ja)
WO (1) WO2010095684A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108130310A (zh) * 2016-11-30 2018-06-08 江阴瑞康健生物医学科技有限公司 一种干细胞培养基

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5663841B2 (ja) * 2009-02-23 2015-02-04 富士レビオ株式会社 骨細胞への分化誘導培地及び方法
WO2013173688A1 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 The Cooper Health System A method of making tissue engineered blood vessels and generating capillary networks, articles, and methods of use thereof
KR101877793B1 (ko) * 2016-07-15 2018-07-13 주식회사 엔바이오텍 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 배양 방법
EP3624815A4 (en) 2017-05-15 2021-01-20 Stem Cell Medicine Ltd. TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS WITH LONG-ACTING GLATIRAMER AND ADAPTIVE STEM CELLS
WO2018211498A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Stem Cell Medicine Ltd. Treatment of multiple sclerosis with adipose-derived stem cells
CN110257324A (zh) * 2019-07-24 2019-09-20 安徽科门生物科技有限公司 一种用于脂肪间充质干细胞成脂诱导的培养基以及诱导方法
CN113337457B (zh) * 2021-06-01 2024-06-25 澳门大学 一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法以及调节剂的应用
CN115927172A (zh) * 2022-12-15 2023-04-07 南京周子未来食品科技有限公司 一种诱导体外成脂分化的化学成分明确的改良培养基及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009084662A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Fujirebio Inc. 哺乳動物体細胞用培地及びそのための添加剤

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003230792A1 (en) * 2002-04-03 2003-10-20 Artecel Sciences, Inc. Improvements of adipocytic differentiated adipose derived adult stem cells and uses thereof
JP2008533114A (ja) * 2005-03-18 2008-08-21 ユーシーエル ビジネス パブリック リミテッド カンパニー メカノ成長因子ペプチドおよびその使用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009084662A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Fujirebio Inc. 哺乳動物体細胞用培地及びそのための添加剤

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEV CELL, 2004, pages 483 - 95
J BIOL CHEM., 1995, pages 28183 - 7
NEUMANN, K. ET AL.: "BMP7 promotes adipogenic but not osteo-/chondrogenic differentiation of adult human bone marrow-derived stem cells in high-density micro-mass culture", JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, vol. 102, no. 3, 15 October 2007 (2007-10-15), pages 626 - 637 *
PAGES, C. ET AL.: "Endothelial Differentiation Gene-2 Receptor Is Involved in Lysophosphatidic Acid-dependent Control of 3T3F442A Preadipocyte Proliferation and Spreading", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 15, 13 April 2001 (2001-04-13), pages 11599 - 11605 *
RODRIGUEZ, A-M. ET AL.: "Adipocyte differentiation of multipotent cells established from human adipose tissue", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 315, no. 2, 5 March 2004 (2004-03-05), pages 255 - 263, XP004487272, DOI: doi:10.1016/j.bbrc.2004.01.053 *
See also references of EP2399989A4 *
SIMON, M, F. ET AL.: "Expression of Ectolipid Phosphate Phosphohydrolases in 3T3F442A Preadipocytes and Adipocytes: INVOLVEMENT IN THE CONTROL OF LYSOPHOSPHATIDIC ACID PRODUCTION", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 26, 28 June 2002 (2002-06-28), pages 23131 - 23136 *
STEM CELLS., 2005, pages 1357 - 66
YOSHIYUKI HOTTA ET AL.: "Mukessei Jokenka deno Shibo Yurai Tanosei Kan Saibo (hMADS) no Shibo Saibo Oyobi Kotsu Saibo Bunka", REGENERATIVE MEDICINE, vol. 9, 5 February 2010 (2010-02-05), pages 209 - ABST.P-113 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108130310A (zh) * 2016-11-30 2018-06-08 江阴瑞康健生物医学科技有限公司 一种干细胞培养基

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