WO2010094587A1 - Mikrobielle siderophorsynthese - Google Patents

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WO2010094587A1
WO2010094587A1 PCT/EP2010/051464 EP2010051464W WO2010094587A1 WO 2010094587 A1 WO2010094587 A1 WO 2010094587A1 EP 2010051464 W EP2010051464 W EP 2010051464W WO 2010094587 A1 WO2010094587 A1 WO 2010094587A1
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WO
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microorganism
pseudobactin
siderophore
nucleic acid
acid sequence
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PCT/EP2010/051464
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English (en)
French (fr)
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Thomas Weber
Johannes Bongaerts
Stefan Evers
Karl-Heinz Maurer
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Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)

Definitions

  • the present application relates to siderophore-forming microorganisms having a mutated fur gene.
  • the present application further relates to methods and uses for the preparation of siderophores with such microorganisms and with Bacillus licheniformis.
  • the invention is in the field of biotechnology, in particular the production of siderophores by fermentation of microorganisms.
  • Siderophores are small molecules with complexing properties associated with catecholates, hydroxamates or ⁇ -hydroxy / ⁇ -ketocarboxylic acids.
  • Siderophores have a high affinity for iron (Fe) (III) ions and therefore bind very selectively iron (III) ions, which can then be transported into the cells. Despite the large amount of naturally occurring iron, this has a very low bioavailability, which can often be compensated by siderophores. After complexation of the iron ions, the loaded siderophores are resumed by the cells of the siderophore producers via specific transport systems. Siderophores usually have a molar mass of 300 to 2,000 daltons. The small size of the molecules allows them to traverse the cell wall of bacteria, fungi or plants twice through relatively narrow channels.
  • siderophores Since the complex binding constant of siderophores for Fe (II) ions is much lower than for trivalent iron, the iron ion in the cell is released from the complex after reduction to iron (II). Alternative release mechanisms rely on the hydrolytic cleavage of the siderophore and thereby abolition of the chelating effect.
  • siderophores are enterobactins, which are produced by enterobacteria, the ferrioxamines of streptomycetes, the ferrichromes of fungi and the citrate-containing siderophores in fungi and bacteria.
  • Siderophores are of value for various engineering applications, for example for removing metal ions, especially iron ions, that can be bound by them, for example in the body of patients suffering from free iron in the blood, for rust removal or for the removal of aluminum from highly pure ones Silicon surfaces for semiconductor fabrication, probiotic manipulation of microbial consortia in cosmetics, suppression of microbial growth of iron dependent organisms that can not utilize the siderophore bound iron, or production of siderophore coupled antibiotics taken up by the siderophore producers and then in the cell develop antibiotic effect. Consequently, siderophores are valuable active ingredients whose versatile applicability also requires a variety of different siderophores in technically relevant quantities. Among the most valuable siderophores is schizokines, among others, as it is too the siderophores whose metal complexes can be used as a bleach catalyst in detergents and cleaners.
  • siderophores and in particular schizokines can be produced with microorganisms.
  • microorganisms are Bacillus megaterium ATCC 19213, Rhizobium leguminosarum IARI 917, Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum ATCC 1 1696 or Anabaena sp. ATCC 27898.
  • siderophore production by microorganisms is dependent on the availability of iron for the microorganism. If enough iron is present, the microorganisms down regulate siderophore production.
  • the product yield for siderophores in a fermentation is improved if the fermented microorganisms have a reduced expression of the fur gene or a correspondence thereof, in particular if the fermentation does not take place under iron deficiency.
  • it is achieved by the greatest possible inactivation of the fur gene that the respective microorganism synthesizes more siderophore, even in the presence of sufficient iron.
  • the invention thus relates to a siderophore-forming microorganism, which is characterized in that the microorganism by at least one mutation in the fur gene has a reduced expression of this gene in comparison to a second microorganism which does not have this mutation.
  • a siderophore-forming microorganism is a microorganism capable of synthesizing at least one siderophore, preferably iron deficient. Iron deficiency is present, for example, if less than 10 ⁇ M and increasingly preferably less than 5 ⁇ M, 4 ⁇ M, 3 ⁇ M, 2 ⁇ M, 1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M and 0.1 ⁇ M iron ions in the environment of the microorganism, in particular in the cult medium or in the substrate on which the microorganism grows are present.
  • a siderophore in the context of the present invention is a molecule having complex-forming properties, which contains at least one polydentate (or multidentidic) ligand which has a high affinity for iron (Fe) (III) ions and an iron (Fe) (III ) ion preferably binds with six, rarely four centers, in particular one which is associated with the catecholates, hydroxamates or to the ⁇ -hydroxy / ⁇ -ketocarboxylic acids or which has a nitrogen ligand.
  • Preferred siderophores also have properties as described in the introduction.
  • the fur gene (or a respective equivalent thereof) is of importance since the gene product encoded by it, the Fur protein ("ferric uptake regulator "), which regulates siderophore biosynthesis
  • the production of siderophores is usually coupled to the iron concentration within the cell, which binds zinc (II) and iron (II) ions (bivalent iron) in the presence of sufficient
  • iron (II) ions bind to certain gene sequences, called fur boxes, which bind to and thus reduce transcription (as a prerequisite of gene expression) of genes necessary for the biosynthesis of the siderophore or is suppressed, ie, is a transcriptional repressor (Fur-repressor) . If there is no longer enough bivalent iron in the cell, that loses Fur-protein bound bivalent iron, whereby no longer binds to the respective Fur box, so that the transcriptional repressor (Fur-repressor)
  • the fur-regulon is therefore the set of all genes or operons which are fur-regulated, in particular repressed.
  • the fur regulon comprises genes or operons comprising a fur box.
  • a fur box the consensus sequence of the fur box of Bacillus subtilis is shown in SEQ ID NO. 4 indicated.
  • An operon (gene cluster) is a functional unit of the DNA of prokaryotes, consisting of promoter, operator (s) and several (structural) genes that code for proteins with typically related functions.
  • the genes for the biosynthesis of a siderophore are summarized in many microorganisms, especially bacteria, in one or more operons.
  • various regulatory proteins repressors or activators
  • ligands or effector molecules interact with the operators and thereby transcribe the genes in the operon - or switch off.
  • mRNA messenger RNA
  • ie proteins activated or inhibited. All genes of an operon are therefore coordinated.
  • a Fur box is an operator, for example, in a siderophore biosynthetic operon, which is controlled by the Fur protein.
  • a mutation is a change in a nucleic acid or amino acid sequence. Such a change can be brought about for example by known molecular biological methods, concerning nucleic acids, however, it can also arise in the living organism by environmental influences or during nucleic acid synthesis processes. A sequence altered in comparison with an initial sequence can therefore be regarded as a mutated sequence. Depending on the nature of the change For example, deletion, insertion or substitution mutations (often referred to as point mutations in nucleic acids) or those in which different genes or parts of genes are fused together.
  • a substitution is a change at a nucleotide or amino acid position, ie a nucleotide or amino acid exchange, in an insertion at or after the respective sequence position one or more additional nucleotide (s) or amino acid ( n), and at least one or more nucleotide (s) or amino acid (s) are missing in a deletion.
  • the associated organisms are called mutants.
  • nucleotide refers to a nucleic acid building block, ie one of the bases adenine, guanine, cytosine and thymine or uracil with its sugar phosphate moiety and thus relates more to a single-stranded nucleic acid , Since DNA molecules are double-stranded, a deletion of a nucleotide in a DNA strand is therefore equated with the deletion of the entire base pair, since the corresponding nucleotide is then also removed on the hybridizing strand.
  • nucleotide in relation to RNA molecules means the single nucleotide, and DNA molecules the base pair, unless stated otherwise at the respective site Fragments are understood as meaning all nucleic acids or proteins or peptides that are shorter than their complete equivalents, in particular, for example, the particular wild-type nucleic acid or the particular wild-type protein.
  • Wild-type means that the nucleic acid or protein is present in and isolated from a natural habitat in a naturally occurring organism or organism Because of their sequence, they can be assigned to the respective complete nucleic acids or proteins, for example in an alignment, for example they can assume the same structures or carry out enzymatic activities or partial activities ben, such as the complexation of a particular substrate.
  • nucleic acids and nucleic acid fragments are in principle similar in that one or more nucleotides are missing compared to an initial sequence; while fragments usually comprise small pieces of an initial sequence, deletion-mutated nucleic acids usually lack only short regions.
  • deletion-mutated nucleic acids after translation, the mRNA produced from the DNA can form a protein that can no longer perform its original function.
  • a frameshift may be caused when a number of nucleotides that are not divisible by three are removed.
  • the deletion of one or more whole codons / base triplets usually also leads to a defective protein, since then at least one amino acid is missing -but the reading frame is not shifted.
  • insertions are not limited to single nucleotides or amino acids. Rather, several nucleotides or amino acids or whole fragments or even whole nucleic acids or proteins may be inserted into a corresponding starting sequence or fused with an initial sequence. This also includes new combinations of larger nucleic acid or protein sections, ie fragments, with other nucleic acids or proteins.
  • the expression of a gene is understood as meaning its translation into the gene product (s) encoded by this gene, ie into a protein or into a plurality of proteins.
  • gene expression comprises transcription, ie the synthesis of a ribonucleic acid (mRNA) based on the DNA (deoxyribonucleic acid) sequence of the gene and its translation into the corresponding polypeptide chain.
  • mRNA ribonucleic acid
  • the expression of a gene leads to the formation of the corresponding gene product, which exercises its respective function.
  • This function may be a physiological activity and / or cause and / or contribute to a higher level physiological activity involving several different gene products.
  • a preferred physiological activity in the context of the present invention is the enzymatic catalysis of a reaction of the siderophore biosynthesis, the overall physiological activity is corresponding to the total siderophore biosynthesis.
  • the expression of a gene is increased if more gene product is formed and / or the physiological activity and / or higher physiological activity caused by the gene product, in which several different gene products are involved, is intensified or occurs.
  • the expression of a gene is reduced if less gene product is formed and / or the physiological activity and / or higher physiological activity caused by the gene product involving several different gene products is reduced or diminished.
  • the measurement of gene expression is carried out by standard routine methods of molecular biology. It can be carried out, for example, by measuring the RNA concentration in the cells by Northern blotting, SAGE, RT-PCR, microarray techniques, etc.
  • the expression of such a gene can also be detected by determining siderophore synthesis, wherein decreased gene expression is manifested in enhanced siderophore synthesis in the presence of sufficient iron (III) ions in the culture medium.
  • Decreased expression of the fur gene is achieved in the sense of the present application by any kind of modification or mutation of the gene, according to which the amount and / or function of the gene product encoded by the gene, in the case of the fur gene, ie the Fur protein, in view of its ability to reduce or completely suppress siderophore synthesis, is reduced or advantageously completely inhibited as far as possible.
  • These include the embodiments that a virtually complete but inactive protein is formed, that inactive parts of such a protein are present in the cell, that the associated gene is no longer translated or transcribed, or even completely or partially deleted.
  • substitution mutations or insertions may also be present which effect the above.
  • Such changes at the genetic level ensure that the respective gene is switched off or at least negatively influenced
  • the decreased expression of the mutated fur gene is determined against a second microorganism that does not have this mutation.
  • the microorganism according to the invention and the second microorganism can basically be any two microorganisms. Due to its mutation in the fur gene, the microorganism according to the invention is capable of undergoing a culture and / or fermentation in comparison with the second microorganism in the presence of sufficient iron (III) ions, preferably in the presence of at least 10 ⁇ M iron (III) ions Increased siderophoresis, since the siderophore synthesis in this microorganism is not suppressed by a gene product of the fur gene. The increased siderophore formation is related to the single cell or the same cell number.
  • the optical density of the culture at 600 nm wavelength can also be used.
  • Siderophore production is measured by a CAS liquid and / or iron perchlorate assay, as described below.
  • a microorganism according to the invention is characterized in that the microorganism is a non-natural microorganism.
  • the second microorganism is a natural microorganism.
  • the microorganism does not occur in this form in nature, so the microorganism is not a wild type.
  • a natural nucleic acid sequence would therefore be present in the genome of the considered microorganism per se, ie in its wild-type form.
  • a sequence has been introduced or generated in it, for example with the aid of genetic engineering methods.
  • Such a microorganism therefore preferably has a genetically modified nucleic acid sequence, in particular a genetically modified fur gene. This sequence was thus not naturally present in the particular microorganism, so that the microorganism was enriched by this modified sequence.
  • a microorganism according to the invention is preferably produced by a genetic engineering method from a precursor microorganism, wherein the precursor microorganism may be a wild-type or a microorganism already having genetic changes compared to its original form (wild-type).
  • a nucleic acid coding for a non-active Fur protein can be used, for example one which has one or more substitutions or one or more deletions or one or more insertions or combinations thereof.
  • a nucleic acid which is changed in a region which does not encode the protein itself may be used for example, for the expression of which has a regulatory function (gene regulatory sequence), for example a promoter sequence, an enhancer sequence, an operator or generally a sequence with a control function of the expression of this gene.
  • a regulatory function gene regulatory sequence
  • flanking regions are located in adjacent sequence segments to the protein-encoding nucleic acid segment, the so-called flanking regions.
  • the flanking regions can be determined starting from the known sequences by methods known per se, for example by means of outwardly directed PCR primers and a preparation of genomic DNA as a template (anchored PCR).
  • anchored PCR anchored PCR
  • regions can be extracted from database entries for many microorganisms or related species, for example the SubtiList database of Institut Pasteur, Paris, France (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/index.html) , in particular for bacteria of the genus Bacillus, for example Bacillus subtilis or Bacillus licheniformis.
  • nucleic acids can be generated by methods known per se for the modification of nucleic acids. Such are illustrated, for example, in pertinent handbooks such as that of Fritsch, Sambrook and Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.
  • kits are now available for example, the QuickChange® kit from Stratagene, La JoIIa, USA, whose principle is that oligonucleotides with single exchanges (mismatch primers) are synthesized and hybridized with the single-stranded gene, and subsequent DNA polymerization yields a corresponding nucleic acid
  • a nucleic acid having one or more deletion or insertion mutations, or combinations thereof, is employed to reduce the expression of a gene.
  • deletions may involve the border sequences of the protein coding region comprising 70 to 150 nucleic acid positions ,
  • the expression of the fur gene by a microorganism, in particular a microorganism used in a fermentation as a host cell, that an activity-modified, advantageously inactive copy of the gene in question or a part thereof into the microorganism is transformed, where the active gene or the corresponding part of the active gene is exchanged for the activity-modified, advantageously inactive copy of a - hitherto still possible - homologous recombination.
  • the activity-modified, advantageously inactive copy of the gene for this purpose is usually introduced into a corresponding transformation vector.
  • a gene regulatory part can be replaced by a correspondingly modified section, so that the gene regulatory effect of this sequence is altered, in particular the expression-stimulating effect of such a regulatory sequence is reduced or no longer present.
  • an insertion of a sequence, for example a selection marker, into such a gene regulatory sequence can take place.
  • a microorganism according to the invention is characterized in that it can be obtained from the second microorganism by at least one deletion and / or at least one insertion and / or substitution of at least one nucleotide in the fur gene.
  • the second microorganism is the precursor microorganism, which may be a wild type or a microorganism which already has genetic alterations compared to its original form (wild-type).
  • the microorganism according to the invention is then obtained from this second microorganism by a corresponding genetic modification of the fur gene, ie by a deletion and / or an insertion and / or substitution of at least one nucleotide or base pair.
  • a microorganism capable of synthesizing at least one iron deficiency siderophore - that is, the parent microorganism - may be modified in accordance with the present invention so that the microorganism will retain the siderophore even in the absence of iron deficiency and thus in the presence of sufficient iron , in particular iron (III) ions, synthesized.
  • Such microorganisms are preferred for fermentative siderophore production because they allow for higher product yields in the presence of iron, especially iron (III) ions, such as those found in bulk media or complex media.
  • a further preferred embodiment of the invention is thus characterized in that a microorganism according to the invention in the presence of at least 0.1 ⁇ M and increasingly preferably of at least 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M and 10 ⁇ M iron (III) ions has a relation to the second microorganism enhanced siderophore synthesis.
  • the increased siderophore synthesis is again based on the single cell or the same number of cells.
  • the optical density of the culture at 600 nm wavelength (OD600) can also be used.
  • the measurement of siderophore production is preferably carried out by a CAS liquid test and / or an iron perchlorate test as described below: 1.
  • CAS Liquid Assay For the quantitative detection of siderophores in solutions and culture supernatants, the CAS liquid test is determined according to Schwyn & Neilands (1987; Universal chemical assay for the detection and determination of siderophore; Anal Biochem 160: 47-56). carried out in a slightly modified way.
  • test itself is performed in 96-well polystyrene microtiter plates with 100 ⁇ l sample per well. 10 ⁇ l of each CAS test solution are added quickly to all samples and the plate is incubated for ten minutes at room temperature. Subsequently, the measurement of the extinction E at 630 nm wavelength is carried out in a microtiter plate reader.
  • Reference 1 is a sample of 10 ⁇ l of deionized water which has been treated equally Advantageously, duplicates or triplicates of each sample are measured and the corresponding results are averaged, since the linear range of the assay is up to approximately 70% CAS units ( su), samples over 70% CAS units are diluted accordingly and measured again
  • reference 1 water
  • reference 2 another sample
  • the extinction for the corrected reference is thus determined as follows:
  • Iron Perchlorate Test The quantification of hydroxamate siderophores in culture supernatants can also be carried out with the iron perchlorate test according to Varma (1998; Mycorrhiza Manual, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany).
  • a microorganism according to the invention is characterized in that the fur gene comprises a nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 nucleic acid sequence is at least 50% identical.
  • the fur gene comprises a nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1, more preferably at least 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, and most preferably 100% identical.
  • the associated amino acid sequence of the Fur protein is shown in SEQ ID NO. 2 indicated.
  • This embodiment of the invention relates to the nucleic acid sequence of Bacillus licheniformis.
  • microorganisms of the species Bacillus licheniformis can be modified particularly advantageously according to the invention in order to improve siderophore formation even in the presence of sufficient iron, in particular iron (III) ions.
  • the same applies to microorganisms having a fur sequence according to SEQ ID NO. 1 of Bacillus licheniformis correspondingly have similar nucleic acid sequence, that is to the in SEQ ID NO. 1 nucleic acid sequence identical to the specified percentages.
  • Such microorganisms therefore have a Fur-correspondence, ie a too homologous gene.
  • nucleic acid (or amino acid) sequences The determination of the identity of nucleic acid (or amino acid) sequences is carried out by a sequence comparison. Such a comparison is made by assigning similar sequences in the nucleotide sequences (or amino acid sequences) to each other. A tabular assignment of the respective positions is referred to as alignment. In the analysis of nucleotide sequences, in turn, both complementary strands and all three possible reading frames are to be considered, as well as the degeneracy of the genetic code and the organism-specific use of the codons (codon usage). Usually, sequence comparisons and alignments are created by computer programs.
  • homologous genes are genes that code for gene products with the same or similar function, for example, repressors of siderophore biosynthesis (Fur homologs) or enzymes that catalyze comparable reactions in the respective siderophore pathway Nucleotide sequences or partial sequences, so that a sequence comparison of the homologous genes in an alignment results in a minimum identity value as indicated above.
  • Homologous genes in other microorganisms can thus be determined in particular on the basis of sequence homologies by sequence comparisons and are included in the invention, especially in context An alternative or additional confirmation of the assignment of homologous genes on the basis of their functional correspondence is provided by a comparative experiment in which the two homologous genes in the microorganisms compared to one another in the same way e is changed and then it is determined whether in both microorganisms, the siderophore synthesis is changed in the same or similar manner. If this is the case, this is a confirmation of the fact that it is homologous genes
  • the microorganism is characterized in that the siderophore is selected from the group consisting of acinetobactin, achromobactin, acinetoferrin, aerobactin, albomycin, allreal, bisucaberin, agrobactin,reterobactin A,reterobactin B, amonabactin P, amonabactin T, Amphibactin G, Anguibactin, Anthrachelin, Aquachelin D, Arthrobactin, Azotobactin D, Azoverdine, Bacillibactin, Corynebactin, Basidiochrome, Brucebactin, Carboxymycobactin, Cepabactin, Chrysobactin, Coelichelin, Colibactin, Coprogen, Corrugatin, Desferrioxamine B, Desferrioxamine E, Desferrioxamine Et2, Desferrioxamine Et3, Dimerum
  • a fur-regulated (or by a respective Fur-equivalent) regulated biosynthesis of one of these siderophores can be improved according to the invention particularly advantageous.
  • the prefix "Desferri” denotes the iron-free form of the siderophore when the original name describes the iron-containing ("ferric") form of the same ligand. Therefore, for each given "Ferri” siderophore, the respective “Desferri” form is also included and, conversely, for each "Desferri" siderophore indicated, the respective "Ferri” siderophore.
  • the present invention is applicable in principle to all microorganisms, in particular to all fermentable microorganisms, and results in that siderophors can be produced by the use of such microorganisms, in particular by the fermentation of the microorganisms.
  • the only prerequisite is that the microorganism is basically capable of siderophore formation and the siderophore biosynthesis is regulated by For (or a respective equivalent thereof in the respective microorganism).
  • a microorganism according to the invention is a bacterium, preferably one selected from the genera Acinetobacter, Acinomadura, Actinomyces, Aerobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Alteromonas, Anabaena, Arthrobacter, Azomonas, Azotobacter, Bacillus, Bordetella, Brucella, Burkholderia, Corynebacterium, Cupriavidus (Alcaligenes, Wautersia), Erwinia (Pectinobacterium), Escherichia, Klebsiella, Marinobacter, Methylosinus, Microbacterium, Mycobacterium, Nannocystis, Neisseria, Nocardia, Paracoccus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodococcus, Saccharopolyspora, Salmonella, Typhimurium, Shewanella, Shigella, Staphylococcus, Stenotrophomon
  • ATCC 27898 Arthrobacter oxidans, Azomonas macrocytogenes, Azotobacter vinelandii, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus novalis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bordetella bronchiseptica, Brucella abortus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Burkholderia plantarii, Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator (Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha), Erwinia carotovora, Erwinia ch
  • Vibrio anguillarum Vibrio anguillarum serovar 02, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio salmonicida, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica and Yersinia ruckeri.
  • a particularly preferred bacterium is selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus novalis, Burkholderia glumae, Burkholderia plantarii, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Stenotrophomonas maltophilia, Rhizobium leguminosarum, Ralstonia solanacearum and Anabaena sp.
  • Such bacteria are characterized by short generation times and low demands on the cultivation conditions. As a result, inexpensive methods for siderophore production can be established. In addition, there is a wealth of experience for bacteria in the fermentation technology.
  • the most suitable bacterial strain for the production of a particular siderophore under the respective fermentation conditions must be determined separately for the respective conditions. Relevant parameters to be considered include, for example, the ability to synthesize the siderophore itself, the nature and availability of nutrient sources, fermentation volume, media composition, oxygenation, stirrer rate, product formation rate, time required, etc.
  • the microorganisms may have regard to their requirements of culture conditions be altered, have other or additional selection markers or express other products, such as proteins, in particular recombinant proteins.
  • microorganisms which, in addition to the siderophore, transgene express one or more enzymes that they advantageously secrete, like the siderophore, into the medium surrounding the microorganism.
  • the microorganisms according to the invention are cultivated and fermented in a manner known per se, for example in discontinuous or continuous systems.
  • a suitable nutrient medium is inoculated with the microorganisms (host cells) and the product, ie the siderophore, harvested from the medium after a period to be determined experimentally.
  • Continuous fermentations are characterized by achieving a flow equilibrium in which over a relatively long period of time cells partly die off but also regrow and at the same time product can be removed from the medium.
  • a microorganism according to the invention has enhanced expression of a gene selected from the group consisting of bli01183, bli01184, bliO1185, bli01 186, bliO1187, bli01 188 compared to the second microorganism, in particular bli01183 comprising a nucleic acid sequence, which corresponds to that shown in SEQ ID NO. 6 specified
  • Nucleic acid sequence is at least 10% identical, bliO1184 comprises a nucleic acid sequence corresponding to the in SEQ ID NO. 7 specified
  • Nucleic acid sequence is at least 10% identical, bliO1185 comprises a nucleic acid sequence corresponding to the in SEQ ID NO. 8 indicated
  • Nucleic acid sequence is at least 10% identical, bliO1186 comprises a nucleic acid sequence corresponding to the in SEQ ID NO. 9 indicated
  • Nucleic acid sequence is at least 10% identical, bliO1187 comprises a nucleic acid sequence corresponding to the in SEQ ID NO. 10 specified
  • Nucleic acid sequence is at least 10% identical, bliO1188 comprises a nucleic acid sequence corresponding to the in SEQ ID NO. 11 specified
  • Nucleic acid sequence is at least 10% identical.
  • the respective gene bliO1183, bliO1184, bliO1185, bliO1186, bliO1187 or bliO1188 comprises a nucleic acid sequence corresponding to the respective in
  • SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 or SEQ ID NO. 11 specified nucleic acid sequence to at least 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%,
  • the genes mentioned bliO1183 to bliO1188 refer to Bacillus licheniformis and are listed under SEQ ID NOs. 6 to 11 indicated. However, respective correspondences of these genes (homologous genes) also exist in other microorganisms of interest for siderophore production. This embodiment according to the invention is thus not limited to Bacillus licheniformis.
  • the genes corresponding to said Bacillus licheniformis genes in other microorganisms can be determined as described above on the basis of sequence homologies by sequence comparisons and / or by comparative experiments and are included within the scope of the minimum identity values given above in the invention.
  • the genes identified in Bacillus licheniformis have the highest similarity or identity to the genes of the rhb operon for the synthesis of rhizobactin 1021 from Sinorhizobium meliloti (see Persmark, M., P. Pittman, JS Buyer, B. Schwyn, PR GiII Jr., and JB Neilands (1993): Isolation and structure of rhizobactin 1021, a siderophore from the alfalfa symbiont Rhizobium meliloti 1021, J Am Chem Soc 115 (10): 3950-3956).
  • the gene products encoded by these genes are necessary for or involved in siderophore synthesis.
  • the operon comprises a Fur box in the gene regulatory sequence (operator region) of the operon, so that the siderophore synthesis, in particular Schizokinen synthesis, also in Bacillus licheniformis is under the control of the Fur protein and can be influenced according to the invention, for example by a deletion in the fur gene or by inactivation of the fur gene in general.
  • This operon thus forms part of the fur regulon.
  • the nucleic acid sequence of this fur box is shown in SEQ ID NO. 5 indicated.
  • a further subject of the invention is a process for the fermentative production of a siderophore by culturing a microorganism according to the invention. It has also surprisingly been found that Bacillus licheniformis is able to form siderophores, in particular schizokines, even without mutation of the fur gene. Another object of the invention is therefore a process for the fermentative production of a siderophore by culturing Bacillus licheniformis, in particular a siderophore, which is not Bacillibactin, preferably a Citrathydroxamates and most preferably Schizokinen. From the state of the art, so far no siderophore synthesis of Bacillus licheniformis is known.
  • O'Connell (2001): Genetic organization of the region encoding regulation, biosynthesis, and transport of rhizobactin 1021, a siderophore produced by Sinorhizobium meliloti, J Bacteriol 183 (8): 2576-2585, and Challis, GL (2005): A widely distributed bacterial pathway for siderophore biosynthesis independent of nonribosomal peptide synthetases, Chem. BioChem. 6: 601-611). In Bacillus licheniformis, therefore, no homologue to RhbG is present. In the rhizobactin 1021 synthesis pathway, this enzyme catalyzes the acetylation of 1, 3-diaminopropane.
  • a microorganism according to the invention is used in the process according to the invention.
  • Bacillus licheniformis can also be used directly, and in particular also Bacillus licheniformis can be modified by a mutation of the fur gene according to the invention, in order to further improve the siderophore production as described above.
  • Fermentation processes are known from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, ie the siderophore formed. All fermentation processes which are suitable for the production of the siderophore are embodiments of this subject matter of the invention. Such a process is considered suitable when a siderophore is formed.
  • the siderophore is preferably one of the abovementioned siderophores. Fermentation processes, which are characterized in that the fermentation is carried out by way of a strategy, come in particular into consideration. Here, the media components consumed by the ongoing cultivation are fed. As a result, increases in both the cell density and the dry biomass and / or the amount of siderophore of interest can be achieved.
  • the fermentation can alternatively or additionally be designed so that unwanted metabolic products are filtered out or neutralized by the addition of buffer or matching counterions.
  • buffer or matching counterions For each siderophore to be produced, a large number of possible combinations of process steps is possible. The optimal procedure has to be determined experimentally for each specific case.
  • a further embodiment of a method according to the invention is characterized in that the cultivation takes place in a medium which contains a constituent selected from the group consisting of plant flour, plant extract, protein hydrolyzate from plants, yeast extract, meat extract, in particular beef extract, casein hydrolyzate.
  • a further embodiment of a method according to the invention is characterized in that the cultivation in a medium 0.01-100 ⁇ M and more preferably 0.05-50 ⁇ M, 0.1-20 ⁇ M, 0.1-10 ⁇ M, 0.5-1 ⁇ M, 0.5-5 ⁇ M and 0.8-1.5 ⁇ M iron ions , preferably iron (III) ions, contains.
  • culture media may be solid or liquid, with solid media usually the analysis of the respective microorganisms in the foreground, in liquid media, however, the cultivation of microorganisms, even in larger quantities, takes place, for example for the production of biomass and / or for the microbial production of a product, especially in a fermentation.
  • Liquid media are therefore preferred according to the invention.
  • the compositions of the nutrient medium and the culture conditions are in each case based on the microorganism to be cultivated. Defined media contain a precisely defined number and amount of ingredients that are often chemically purified to exclude traces of other substances. They are often used to select the growth of certain microorganisms.
  • Minimal media as a special form of the defined media contain only the minimum necessary substances for the growth of the microorganisms to be cultivated.
  • complex media include nutrients whose contents are not well defined, such as plant flour, plant extract, protein hydrolyzate from plants, yeast extract, meat extract, especially beef extract, casein hydrolyzate. They are most commonly used and allow the growth of almost all heterotrophic microorganisms.
  • a particularly preferred medium according to the invention is therefore a complex liquid medium with one or more of the abovementioned constituents. The use of such a medium for fermentative siderophore production, ie the siderophore production by microorganisms in a bioreactor, is significantly improved by the present invention.
  • Microorganisms according to the invention are therefore advantageously used in the described process according to the invention and are used in these processes to produce a substance. Consequently, another object of the invention is the use of a microorganism described above for the preparation of a siderophore, preferably for Production of Acinetobactin, Achromobactin, Acinetoferrin, Aerobactin, Albomycin, Alealigin, Bisucaberin, Agrobactin, Alterobactin A, Alterobactin B, Amonabactin P, Amonabactin T, Amphibactin G, Anguibactin, Anthrachelin, Aquachelin D, Arthrobactin, Azotobactin D, Azoverdine, Bacillibactin, Corynebactin , Basidiochrome, Brucebactin, Carboxymycobactin, Cepabactin, Chrysobactin, Coelichelin, Colibactin, Coprogen, Cor
  • Bacillus licheniformis is already suitable in its wild-type form for siderophore production
  • a further subject of the invention is the use of Bacillus licheniformis for producing a siderophore, preferably for the production of schizokines and / or bacillibactin.
  • Bacillus it would be possible to use Bacillus to prepare a siderophore as indicated above.
  • the Fur-protein coding region in Bacillus licheniformis was shortened by 404 base pairs in the fur gene (see also Figure 2).
  • the resulting fusion site has the sequence of the fusion primer (or its complementary strand) used according to SEQ ID NO. 3, wherein the deletion after position 15 according to SEQ ID NO. 3 is present.
  • Example 2 Improvement of siderophore production by mutation of the fur gene
  • the fur mutant of Bacillus licheniformis prepared in Example 1 was compared with the starting strain for its siderophore production in the CAS liquid and in the iron perchlorate test.
  • the fur mutant exhibits markedly improved siderophore production in the presence of 10 ⁇ M added ferric chloride (FIG. 3A) in comparison with a control batch without added iron in an iron-deficient medium (FIG. 3B).
  • the fur mutant has a higher end cell density, which is also advantageous in terms of siderophore yield.
  • Schizokines and bacillibactin correspond to:
  • Schizokines measured: m / z 421, 08 (M + H +), calculated monoisotopic mass of schizokines
  • FIG. 1 (A) Schizokinen synthesis pathway in Bacillus licheniformis.
  • the proteins indicated by the arrows show the enzymes of Bacillus licheniformis ("BLJ") as well as respective homologous enzymes of the aerobactin synthesis operon (above, for example "lue”) and the rhizobactin 1021 synthesis operon (in the middle, for example "Rhb”) catalyze the respective reaction.
  • B Preparation of the schizokin synthesis operon of Bacillus licheniformis.
  • Figure 2 Schematic representation of the fur deletion according to Example 1. Above: After transformation of Bacillus licheniformis with the vector (plasmid 1), the bacterium still contains the fur gene. Middle: After recombination, a portion of the fur gene was removed from the genomic DNA and integrated into plasmid 2. Bottom: Genome structure after deletion of the fur gene.
  • FIG. 3 Comparison of the siderophore production of the Bacillus licheniformis fur mutant with the Bacillus licheniformis starting strain in the presence of 10 ⁇ M iron (III) ions (A) or in a control batch without added iron in iron deficient medium (B).
  • the fur mutant exhibits significantly improved siderophore production in the presence of 10 ⁇ M added ferric chloride. Furthermore, the fur mutant has a higher end cell density, which is also advantageous in terms of siderophore yield.
  • FIG. 4 structural formulas of the siderophores produced by Bacillus licheniformis.
  • A schizokines.
  • B Bacillibactin.

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Abstract

Die Produktausbeute für Siderophore in einer mikrobiellen Fermentation wird verbessert, wenn die fermentierten Mikroorganismen eine verminderte Expression des fur-Gens aufweisen, insbesondere wenn die Fermentation nicht unter Eisenmangel erfolgt.

Description

Mikrowelle Siderophorsynthese
Die vorliegende Anmeldung betrifft Siderophor-bildende Mikroorganismen mit einem mutierten fur-Gen. Die vorliegende Anmeldung betrifft ferner Verfahren und Verwendungen zur Herstellung von Siderophoren mit solchen Mikroorganismen sowie mit Bacillus licheniformis.
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Herstellung von Siderophoren durch Fermentation von Mikroorganismen. Siderophore (Eisenträger) sind kleine Moleküle mit komplexbildenden Eigenschaften, die zu den Catecholaten, Hydroxamaten oder zu den α-Hydroxy/α- Ketocarbonsäuren gehören. Daneben existieren gemischt-funktionelle Siderophore, die auch Stickstoff- Liganden besitzen. Allen Siderophoren ist gemeinsam, dass sie einen mehrzähnigen Liganden enthalten, der ein Metallion mit sechs, selten vier Zentren bindet. Sie werden beispielsweise von aeroben Bakterien, Pilzen und Pflanzenwurzeln gebildet und üblicherweise in das den jeweiligen Organismus umgebende Medium ausgeschieden. Siderophore weisen eine hohe Affinität zu Eisen(Fe)(lll)-lonen auf und binden daher sehr selektiv Eisen(lll)-Ionen, die dann in die Zellen transportiert werden können. Trotz der großen Menge an in der Natur vorkommendem Eisen besitzt dieses eine sehr geringe Bioverfügbarkeit, die durch Siderophore oftmals ausgeglichen werden kann. Nach der Komplexierung der Eisen-Ionen werden die beladenen Siderophore von den Zellen der Siderophor-Produzenten über spezifische Transportsysteme wieder aufgenommen. Siderophore weisen üblicherweise eine molare Masse von 300 bis 2.000 Dalton auf. Die geringe Größe der Moleküle erlaubt es ihnen, die Zellwand von Bakterien, Pilzen oder Pflanzen zweimal durch relativ enge Kanäle zu durchqueren. Da die Komplexbindungskonstante der Siderophore für Fe(ll)-Ionen sehr viel geringer ist als für dreiwertiges Eisen, wird das Eisenion in der Zelle nach Reduktion zu Eisen(ll) aus dem Komplex gelöst. Alternative Freisetzungsmechanismen beruhen auf der hydrolytischen Spaltung des Siderophors und dadurch Aufhebung des Chelateffektes. Beispiele für Siderophore sind die Enterobactine, die von Enterobakterien hergestellt werden, die Ferrioxamine der Streptomyceten, die Ferrichrome der Pilze und die citrathaltigen Siderophore bei Pilzen und Bakterien.
Siderophore sind für verschiedene technische Anwendungen von Wert, zum Beispiel zur Entfernung von Metall-, insbesondere Eisenionen, die durch sie gebunden werden können, beispielsweise im Körper von Patienten, die unter freiem Eisen im Blut leiden, zur Rostentfernung oder zur Entfernung von Aluminium von hochreinen Siliziumoberflächen zur Halbleiterherstellung, zur probiotischen Beeinflussung von mikrobiellen Konsortien in Kosmetika, zur Unterdrückung mikrobiellen Wachstums eisenabhängiger Organismen, die das Siderophor-gebundene Eisen nicht verwerten können oder zur Herstellung von Siderophor-gekoppelten Antibiotika, die von den Siderophorproduzenten aufgenommen werden und dann in der Zelle ihre antibiotische Wirkung entfalten. Demzufolge sind Siderophore wertvolle Wirkstoffe, deren vielseitige Anwendbarkeit auch eine Vielfalt unterschiedlicher Siderophore in technisch relevanten Mengen erforderlich macht. Zu den besonders wertvollen Siderophoren zählt Schizokinen, u.a., da es zu den Siderophoren zählt, deren Metallkomplexe als Bleichkatalysator in Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden können.
Es ist bekannt, dass Siderophore und insbesondere Schizokinen mit Mikroorganismen hergestellt werden können. Beispiele für solche Mikroorganismen sind Bacillus megaterium ATCC 19213, Rhizobium leguminosarum IARI 917, Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum ATCC 1 1696 oder Anabaena sp. ATCC 27898. Allerdings ist die Siderophorproduktion bei Mikroorganismen abhängig von der Verfügbarkeit von Eisen für den Mikroorganismus. Ist ausreichend Eisen vorhanden, regulieren die Mikroorganismen die Siderophorproduktion herunter. Da die Siderophorproduktion von nicht gentechnisch oder in klassischen Zuchtverfahren optimierten Mikroorganismen somit nur unter sorgfältig eingestellten Eisenmangelbedingungen mit hinreichenden Ausbeuten gelingt, ist das Einstellen solcher Bedingungen schwierig, da die Eisenversorgung der Mikroorganismen insgesamt wachstumslimitierend für die Mikroorganismen ist. Weiterhin ist beim Einsatz komplexer Mediumsbestandteile, z.B. von Proteinhydrolysaten, eine genaue Einstellung des Eisengehaltes besonders schwierig, beispielsweise wegen Chargenschwankungen. Daher ist es besonders wünschenswert, einen Produktionsstamm verwenden zu können, der durch eine gewöhnlich hohe Eisenkonzentration im Medium, insbesondere komplexen Medium, nicht die Siderophorproduktion herunterreguliert.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Produktausbeute für Siderophore in einer Fermentation verbessert wird, wenn die fermentierten Mikroorganismen eine verminderte Expression des fur-Gens bzw. einer Entsprechung desselben aufweisen, insbesondere wenn die Fermentation nicht unter Eisenmangel erfolgt. Vorteilhafterweise wird durch eine möglichst weitgehende Inaktivierung des fur- Gens erreicht, dass der jeweilige Mikroorganismus vermehrt Siderophore synthetisiert, auch in Anwesenheit von ausreichend Eisen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Siderophor-bildender Mikroorganismus, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Mikroorganimus durch mindestens eine Mutation im fur-Gen eine verminderte Expression dieses Gens aufweist im Vergleich zu einem zweiten Mikroorganismus, der diese Mutation nicht aufweist.
Ein Siderophor-bildender Mikroorganismus ist ein Mikroorganismus, der befähigt ist, mindestens ein Siderophor zu synthetisieren, vorzugsweise unter Eisenmangel. Ein Eisenmangel liegt beispielsweise dann vor, wenn weniger als 10μM und zunehmend bevorzugt weniger als 5μM, 4μM, 3μM, 2μM, 1 μM, 0,5μM und 0,1 μM Eisen-Ionen in der Umgebung des Mikroorganismus, insbesondere in dem Kultumedium oder in dem Substrat, auf dem der Mikroorganismus wächst, vorhanden sind.
Ein Siderophor im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Molekül mit komplexbildenden Eigenschaften, welches mindestens einen mehrzähnigen (polydentalen oder auch multidentalen) Liganden enthält, der eine hohe Affinität zu Eisen(Fe)(lll)-lonen aufweist und ein Eisen(Fe)(lll)-lon bevorzugt mit sechs, selten vier Zentren bindet, insbesondere eines, das zugehörig ist zu den Catecholaten, Hydroxamaten oder zu den α-Hydroxy/α-Ketocarbonsäuren oder welches einen Stickstoff- Liganden besitzt. Bevorzugte Siderophore weisen ferner Eigenschaften auf wie einleitend beschrieben.
Für die Siderophor-Synthese durch viele Mikroorganismen ist neben Genen, die für Enzyme des Siderophor-Biosyntheseweges codieren, das fur-Gen (bzw. eine jeweilige Entsprechung desselben) von Bedeutung, da das von ihm codierte Genprodukt, das Fur-Protein („ferric uptake regulator"), die Siderophor-Biosynthese reguliert. Die Produktion der Siderophore wird üblicherweise an die Eisenkonzentration innerhalb der Zelle gekoppelt. Das Protein Für bindet Zink(ll)- und Eisen(ll)-Ionen (zweiwertiges Eisen). In Anwesenheit von ausreichend Eisen(ll)-Ionen in der Zelle bindet Für mit gebundenem zweiwertigen Eisen an bestimmte Gensequenzen, so genannte Fur-Boxen, wodurch die Transkription (als Voraussetzung der Genexpression) von Genen, die für die Biosynthese des Siderophors notwendig sind, blockiert und damit vermindert oder unterdrückt wird. Für ist somit ein trankriptioneller Repressor (Fur-Repressor). Ist in der Zelle nicht mehr genügend zweiwertiges Eisen vorhanden, so verliert das Fur-Protein sein gebundenes zweiwertiges Eisen, wodurch Für nicht mehr an die jeweilige Fur-Box bindet, so dass die Transkription bzw. Expression der für die Siderophor-Synthese notwendigen Gene ermöglicht wird. In der Folge wird die Siderophor-Produktion angeregt und die ZeII- Transportkanäle für Eisen werden geöffnet. Ein Eisenmangel bewirkt somit eine verstärkte Siderophor- Produktion. Das fur-Regulon ist demnach die Gesamtheit aller Gene bzw. Operons, die von Fur-reguliert, insbesondere reprimiert, werden. Insbesondere umfasst das fur-Regulon Gene bzw. Operons, die eine Fur-Box umfassen. Als Beispiel für eine Fur-Box ist die Consensus-Sequenz der Fur-Box von Bacillus subtilis in SEQ ID NO. 4 angegeben. Ein Operon (Gencluster) ist eine Funktionseinheit der DNA von Prokaryoten, bestehend aus Promotor, Operator(en) und mehreren (Struktur-) Genen, die für Proteine mit typischerweise verwandten Funktionen codieren. Die Gene für die Biosynthese eines Siderophors sind bei vielen Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, in einem oder mehreren Operons zusammengefasst. Je nach Operon können verschiedene regulatorische Proteine (Repressoren bzw. Aktivatoren), abhängig von ihrer Wechselwirkung mit von der Zelle aufgenommenen oder in der Zelle gebildeten Stoffen (Liganden oder Effektormolekülen), mit den Operatoren in Wechselwirkung treten und dadurch die Transkription der Gene im Operon an- oder abschalten. Auf diese Weise wird die Synthese der betreffenden mRNA (messenger-RNA) und damit indirekt der codierten Genprodukte, also Proteine, aktiviert oder gehemmt. Alle Gene eines Operons werden daher koordiniert gesteuert. Bezogen auf das Fur-Protein ist eine Fur-Box daher ein Operator beispielsweise in einem Siderophor-Biosynthese-Operon, der durch das Fur-Protein gesteuert wird.
Eine Mutation ist eine Veränderung in einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz. Eine solche Veränderung kann beispielsweise durch bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden, betreffend Nukleinsäuren kann sie jedoch auch im lebenden Organismus durch Umwelteinflüsse oder während Nukleinsäure-Syntheseprozessen entstehen. Eine im Vergleich mit einer Ausgangssequenz veränderte Sequenz kann daher als mutierte Sequenz betrachtet werden. Je nach Art der Änderung sind beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen (bei Nukleinsäuren oftmals auch als Punktmutationen bezeichnet) bekannt oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert werden. Jeweils bezogen auf eine Ausgangssequenz ist eine Substitution eine Veränderung an einer Nukleotid- oder Aminosäureposition, d.h. ein Nukleotid- oder Aminosäureaustausch, bei einer Insertion ist an bzw. nach der jeweiligen Sequenzposition ein oder mehrere zusätzliche(s) Nukleotid(e) bzw. Aminosäure(n) vorhanden, und bei einer Deletion fehlt mindestens ein oder mehrere Nukleotid(e) bzw. Aminosäure(n). Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Betreffend Nukleinsäuren werden die Begriffe Nukleotid und Basenpaar in der vorliegenden Anmeldung synonym verwendet: Der Begriff Nukleotid bezeichnet einen Nukleinsäure-Baustein, also eine der Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin bzw. Uracil mit ihrem Zuckerphosphatrest und bezieht sich somit eher auf eine einzelsträngige Nukleinsäure. Da DNA-Moleküle doppelsträngig sind, ist eine Deletion eines Nukleotids in einem DNA-Strang daher gleichzusetzten mit der Deletion des ganzen Basenpaares, da dann auch auf dem hybridisierenden Strang das korrespondierende Nukleotid entfernt wird. Daher ist mit der Formulierung „Nukleotid" betreffend RNA-Molekülen das einzelne Nukleotid gemeint, betreffend DNA-Moleküle das Basenpaar, sofern an der jeweiligen Stelle nichts anderes angegeben ist. Unter Fragmenten werden alle Nukleinsäuren bzw. Proteine oder Peptide verstanden, die kürzer sind als ihre vollständigen Entsprechungen, insbesondere beispielsweise die jeweilige Wildtyp- Nukleinsäure oder das jeweilige Wildtyp-Protein. Unter Wildtyp ist zu verstehen, dass die Nukleinsäure oder das Protein in einem natürlich vorkommenden Organismus bzw. in einem Organismus aus einem natürlichen Habitat vorhanden ist und aus diesem isoliert werden kann. Fragmente sind daher Teilsequenzen einer jeweiligen Ausgangssequenz. Aufgrund ihrer Sequenz können sie den jeweiligen vollständigen Nukleinsäuren bzw. Proteinen zugeordnet werden, beispielsweise in einem Alignment. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder enzymatische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines bestimmten Substrats. Deletionsmutierte Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Fragmente sind prinzipiell gleichartig dadurch, dass ein oder mehrere Nukleotide im Vergleich zu einer Ausgangssequenz fehlen; während Fragmente üblicherweise kleine Stücke einer Ausgangssequenz umfassen, fehlen deletionsmutierten Nukleinsäuren üblicherweise nur kurze Bereiche. Als Folge der Deletion kann nach der Translation der aus der DNA entstandenen mRNA ein Protein entstehen, das seine ursprüngliche Funktion nicht mehr ausüben kann. Durch die Deletion von Nukleotiden kann eine Leserasterverschiebung hervorgerufen sein, wenn eine Anzahl von Nukleotiden entfernt wurde, die nicht durch drei teilbar ist. Die Deletion von einem oder mehreren ganzen Codons/Basentripletts führt meistens ebenfalls zu einem fehlerhaften Protein, da dann mindestens eine Aminosäure fehlt -jedoch wird das Leseraster nicht verschoben. Im letzteren Fall ist es möglich, das das entstandene Protein noch teilfunktionsfähig ist und einen schwächeren Phänotyp hervorruft als eine Nullmutante. Insertionen sind wie Deletionen nicht auf einzelne Nukleotide oder Aminosäuren beschränkt. Vielmehr können auch mehrere Nukleotide bzw. Aminosäuren oder ganze Fragmente oder selbst ganze Nukleinsäuren oder Proteine in eine entsprechende Ausgangssequenz eingefügt sein oder mit einer Ausgangssequenz fusioniert sein. Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren Nukleinsäure- oder Proteinabschnitten, also Fragmenten, mit anderen Nukleinsäuren oder Proteinen. Unter der Expression eines Gens wird dessen Übersetzung in das bzw. die von diesem Gen codierte(n) Genprodukt(e) verstanden, also in ein Protein bzw. in mehrere Proteine. In der Regel umfasst die Genexpression die Transkription, also die Synthese einer Ribonukleinsäure (mRNA) anhand der DNA (Desoxyribonukleinsäure )-Sequenz des Gens und deren Translation in die entsprechende Polypeptidkette. Die Expression eines Gens führt zur Bildung des entsprechenden Genproduktes, das seine jeweilige Funktion ausübt. Diese Funktion kann eine physiologische Aktivität sein und/oder eine solche bewirken und/oder ein Beitrag zu einer übergeordneten physiologischen Aktivität sein, an der mehrere verschiedene Genprodukte beteiligt sind. Eine bevorzugte physiologische Aktivität im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die enzymatische Katalyse einer Reaktion der Siderophor-Biosynthese, die übergeordnete physiologische Aktivität ist entsprechend die Siderophor-Biosynthese insgesamt. Die Expression eines Gens ist erhöht, sofern mehr Genprodukt gebildet wird und/oder die durch das Genprodukt bewirkte physiologische Aktivität und/oder übergeordnete physiologischen Aktivität, an der mehrere verschiedene Genprodukte beteiligt sind, verstärkt wird oder verstärkt auftritt. Die Expression eines Gens ist vermindert, sofern weniger Genprodukt gebildet wird und/oder die durch das Genprodukt bewirkte physiologische Aktivität und/oder übergeordnete physiologischen Aktivität, an der mehrere verschiedene Genprodukte beteiligt sind, vermindert wird oder vermindert auftritt. Die Messung der Genexpression erfolt durch fachübliche Routinemethoden der Molekularbiologie. Sie kann beispielsweise erfolgen durch die Messung der RNA Konzentration in den Zellen durch Northern Blotting, SAGE, RT- PCR, Microarray-Techniken, usw. Alternativ kann sie auch erfolgen durch Messung der Konzentration des Genproduktes, also des von dem jeweiligen Gen codierten Proteins, in den Zellen oder durch Messung der durch das Genprodukt bewirkten physiologischen Aktivität und/oder übergeordneten physiologischen Aktivität. Im Falle des fur-Gens ist eine solche Aktivität beispielsweise die Siderophorsynthese. Daher kann die Expression eines solchen Gens auch ermittelt werden durch Bestimmung der Siderophorsynthese, wobei sich eine verminderte Genexpression bevorzugtermaßen in einer verstärkten Siderophorsynthese in Anwesenheit von ausreichend Eisen(lll)-Ionen im Kulturmedium manifestiert.
Eine verminderte Expression des fur-Gens wird im Sinne der vorliegenden Anmeldung durch jede Art von Modifikation oder Mutation des Gens erreicht, wonach die Menge und/oder Funktion des von dem Gen codierten Genproduktes, im Falle des fur-Gens also des Fur-Proteins, im Hinblick auf dessen Fähigkeit, die Siderophor-Synthese zu verringern oder gänzlich zu unterdrücken, vermindert oder vorteilhafterweise möglichst vollständig unterbunden wird. Dazu gehören die Ausgestaltungen, dass ein praktisch vollständiges, aber inaktives Protein gebildet wird, dass inaktive Teile eines solchen Proteins in der Zelle vorliegen, dass das zugehörige Gen nicht mehr translatiert oder transkribiert wird oder sogar vollständig oder teilweise deletiert ist. Alternativ können auch Substitutionsmutationen oder Insertionen vorliegen, die Vorstehendes bewirken. Durch solche Veränderungen auf genetischer Ebene wird erreicht, dass das jeweilige Gen ausgeschaltet oder zumindest hinsichtlich seiner Expression negativ beeinflusst wird. Somit kommt das entsprechende Genprodukt, also das Fur-Protein, in dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus nicht mehr auf seine natürliche Weise zur Wirkung.
Die verminderte Expression des mutierten fur-Gens wird gegenüber einem zweiten Mikrorganismus bestimmt, der diese Mutation nicht aufweist. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus und der zweite Mikroorganismus können grundsätzlich zwei beliebige Mikroorganismen sein. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus ist auf Grund seiner Mutation im fur-Gen befähigt, in einer Kultur und/oder Fermentation im Vergleich zu dem zweiten Mikroorganismus in Anwesenheit von ausreichend Eisen(lll)-Ionen, bevorzugt in Anwesenheit von mindestens 10μM Eisen(lll)-Ionen, vermehrt Siderophore zu bilden, da die Siderophor-Synthese in diesem Mikroorganismus durch ein Genprodukt des fur-Gens nicht unterdrückt wird. Die vermehrte Siderophor-Bildung ist dabei bezogen auf die Einzelzelle oder die gleiche Zellzahl. Als Maß für die Zellzahl kann neben der absoluten Zellzahl selbst auch die optische Dichte der Kultur bei 600nm Wellenlänge (OD600) verwendet werden. Die Siderophorproduktion wird durch einen CAS- Flüssig- und/oder Eisenperchlorat-Test gemessen, wie er weiter unten beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganimus ein nicht natürlicher Mikroorganismus ist. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Mikroorganismus ein natürlicher Mikroorganismus ist. Nicht natürlich bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Mikroorganismus in dieser Form nicht in der Natur vorkommt, der Mikroorganismus also kein Wildtyp ist. Dies betrifft insbesondere die Nukleinsäuresequenz des fur-Gens. Das bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenz keine ursprüngliche Sequenz des Mikroorganismus ist, d.h. in der Wildtyp-Form des Mikroorganismus nicht in dieser Form vorhanden ist bzw. aus diesem isoliert werden kann. Eine natürliche Nukleinsäuresequenz wäre daher im Genom des betrachteten Mikroorganismus per se, also in dessen Wildtyp-Form, vorhanden. In erfindungsgemäße Mikroorganismen dagegen wurde eine solche Sequenz eingebracht bzw. in diesen erzeugt, beispielsweise mit Hilfe gentechnologischer Verfahren. Ein solcher Mikroorganismus weist daher vorzugsweise eine genetisch modifizierte Nukleinsäuresequenz, insbesondere ein genetisch modifiziertes fur-Gen, auf. Diese Sequenz war somit nicht natürlicherweise in dem jeweiligen Mikroorganismus vorhanden, so dass der Mikroorganismus um diese modifizierte Sequenz bereichert wurde. Diese Ausführungsformen betreffen daher den Sachverhalt, dass ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus bevorzugt durch gentechnologische Verfahren aus einem Vorläufer- Mikroorganismus erzeugt wird, wobei der Vorläufer-Mikroorganismus ein Wildtyp sein kann oder ein Mikroorganismus, der bereits genetische Veränderungen im Vergleich zu seiner Ursprungsform (Wildtyp) aufweist.
Hierfür kann eine für ein nichtaktives Fur-Protein codierende Nukleinsäure eingesetzt werden, beispielsweise eine, die eine oder mehrere Substitutionen oder eine oder mehrere Deletionen oder eine oder mehrere Insertionen oder Kombinationen hiervon aufweist. Ferner kann eine Nukleinsäure eingesetzt werden, die in einem Bereich verändert ist, der nicht für das Protein selbst codiert, aber beispielsweise für dessen Expression eine regulatorische Funktion innehat (genregulatorische Sequenz), beispielsweise einer Promotor-Sequenz, einer Enhancer-Sequenz, einem Operator oder allgemein einer Sequenz mit einer Steuerungsfunktion der Expression dieses Gens. Denn um die Expression eines Gens zu beeinflussen, insbesondere zu vermindern bzw. zu inaktivieren, ist es nicht zwingend notwendig, den proteincodierenden Bereich zu manipulieren. Vielmehr lässt sich eine Beeinflussung der Genaktivität auch durch Manipulation genregulatorischer Sequenzen erreichen. Häufig befinden sich solche Sequenzen in benachbarten Sequenzabschnitten zu dem für ein Protein codierenden Nukleinsäureabschnitt, den sogenannten flankierenden Bereichen. Die flankierenden Bereiche können dabei ausgehend von den bekannten Sequenzen über an sich bekannte Methoden, beispielsweise mithilfe nach außen gerichteter PCR-Primer und einer Präparation genomischer DNA als Matrize ermittelt werden (anchored PCR). Alternativ zu diesem experimentellen Ansatz können derartige Bereiche für viele Mikroorganismen bzw. mit diesen verwandten Spezies aus Datenbankeinträgen entnommen werden, beispielsweise der Datenbank SubtiList des Institut Pasteur, Paris, Frankreich (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/index.html), insbesondere für Bakterien der Gattung Bacillus, beispielsweise Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis.
Derartige Nukleinsäuren können über an sich bekannte Verfahren zur Veränderung von Nukleinsäuren erzeugt werden. Solche sind beispielsweise in einschlägigen Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis, „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, dargestellt. Zudem stehen hierfür inzwischen zahlreiche kommerzielle Systeme, sogenannte Kits, zur Verfügung, etwa das QuickChange®-Kit der Firma Stratagene, La JoIIa, USA. Dessen Prinzip besteht darin, daß Oligonukleotide mit einzelnen Austauschen (Mismatch-Primer) synthetisiert und mit dem einzelsträngig vorgelegten Gen hybridisiert werden; anschließende DNA- Polymerisation ergibt dann eine entsprechende Nukleinsäure, die die gewünschte Mutation aufweist. Oftmals wird für die Verminderung der Expression eines Gens eine Nukleinsäure mit einer oder mehreren Deletions- oder Insertionsmutationen oder Kombinationen hiervon eingesetzt. Beispielsweise können Deletionen die 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs betreffen.
Somit ist es möglich, die Expression des fur-Gens durch einen Mikroorganismus, insbesondere einem in einer Fermentation als Wirtszelle eingesetzten Mikroorganismus, dadurch zu verhindern bzw. zu vermindern, dass eine aktivitätsveränderte, vorteilhafterweise inaktive Kopie des betreffenden Gens oder eines Teiles hiervon in den Mikroorganismus transformiert wird, wo über eine - bis dahin noch mögliche - homologe Rekombination das aktive Gen bzw. der entsprechende Teil des aktiven Gens gegen die aktivitätsveränderte, vorteilhafterweise inaktive Kopie ausgetauscht wird. Auch solche Verfahren sind dem Fachmann an sich vertraut. Zuvor wird die aktivitätsveränderte, vorteilhafterweise inaktive Kopie des Gens hierfür üblicherweise in einen entsprechenden Transformationsvektor eingebracht. Im Falle von Insertionsmutationen kann lediglich das intakte Gen unterbrochen werden oder es kann anstelle eines Genteils ein anderes Gen, beispielsweise ein Selektionsmarker eingefügt werden. Hierüber ist das Mutationsereignis in bekannter Weise phänotypisch überprüfbar. Analog kann selbstverständlich auch ein genregulatorischer Abschnitt durch einen entsprechend modifizierten Abschnitt ersetzt werden, so dass die genregulatorische Wirkung dieser Sequenz verändert ist, insbesondere die expressionsstimulierende Wirkung einer solchen regulatorischen Sequenz vermindert bzw. nicht mehr vorhanden ist. Genauso kann eine Insertion einer Sequenz, beispielweise eines Selektionsmarkers, in eine solche genregulatorische Sequenz erfolgen. Um die jeweils notwendigen Rekombinationsereignisse zwischen dem in die Zelle eingeführten inaktiven Gen und dem endogen vorhandenen intakten Gen zu ermöglichen, ist es nach dem derzeitigen Wissensstand vorteilhaft, dass die jeweiligen Randsequenzen (flankierende Regionen) des eingeführten Genabschnitts und des endogenen Genabschnitts in einer ausreichenden Anzahl von zusammenhängenden Nukleinsäure-positionen, vorteilhafterweise in mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen, übereinstimmen. Ein solches Maß an Übereinstimmung unterstützt das Eintreten der homologen Rekombinationsereignisse, die einen Austausch der Genabschnitte (intakter Abschnitt gegen inaktiven Abschnitt) bewirken.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass er aus dem zweiten Mikroorganismus durch mindestens eine Deletion und/oder mindestens eine Insertion und/oder Substitution von mindestens einem Nukleotid im fur-Gen erhalten werden kann. In diesem bevorzugten Fall ist der zweite Mikroorganismus daher der Vorläufer- Mikroorganismus, wobei er ein Wildtyp sein kann oder ein Mikroorganismus, der bereits genetische Veränderungen im Vergleich zu seiner Ursprungsform (Wildtyp) aufweist. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wird dann aus diesem zweiten Mikroorganismus erhalten durch eine entsprechende genetische Veränderung des fur-Gens, also durch eine Deletion und/oder eine Insertion und/oder Substitution von mindestens einem Nukleotid bzw. Basenpaar. Gemäß dieser Ausgestaltung kann ein Mikroorganismus, der mindestens ein Siderophor unter Eisenmangel synthetisieren kann - also der Ausgangs- bzw. der zweite Mikroorganismus -, daher erfindungsgemäß so modifiziert werden, dass der Mikroorganismus das Siderophor auch in Abwesenheit eines Eisenmangels und somit in Anwesenheit von ausreichend Eisen, insbesondere Eisen(lll)-Ionen, synthetisiert. Solche Mikroorganismen sind für die fermentative Siderophor-Produktion bevorzugt, da sie höhere Produktausbeuten in Anwesenheit von Eisen, insbesondere Eisen(lll)-Ionen, ermöglichen, wie es beispielsweise in Vollmedien oder komplexen Medien vorhanden ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus in Gegenwart von mindestens 0,1 μM und zunehmend bevorzugt von mindestens 0,5μM, 1 μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM und 10μM Eisen(lll)-Ionen eine gegenüber dem zweiten Mikroorganismus gesteigerte Siderophor-Synthese aufweist. Die gesteigerte Siderophor- Synthese ist dabei wiederum bezogen auf die Einzelzelle oder die gleiche Zellzahl. Als Maß für die Zellzahl kann neben der absoluten Zellzahl selbst auch die optische Dichte der Kultur bei 600nm Wellenlänge (OD600) verwendet werden. Bevorzugt erfolgt die Messung der Siderophorproduktion im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch einen CAS-Flüssig-Test und/oder Eisenperchlorat-Test wie nachstehend beschrieben: 1. CAS-Flüssig-Test: Zur quantitativen Erfassung von Siderophoren in Lösungen und Kulturüberständen wird der CAS-Flüssig-Test nach Schwyn & Neilands (1987; Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores; Anal Biochem 160: 47-56) in geringfügig modifizierter Art durchgeführt.
Lösungen: a) 2mM CAS-Stammlösung: 121 mg Chromazurol S („CAS", Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) wird in 100ml entionisiertem Wasser gelöst. b) HDTMA-Lösung: 21 ,9mg Hexadecyltrimethylammoniumbromid wird unter vorsichtigem Rühren in 50ml entionisiertem Wasser gelöst. c) Piperazin-Puffer: 4,307g Piperazin (wasserfrei) werden in 30ml entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 5,6 mit konzentrierter Salzsäure eingestellt. d) CAS-Testlösung: 1 ,5ml I mmol/I Eisen(lll)chlorid in 10mmol/l Salzsäure werden mit 7,5ml CAS- Stammlösung gemischt und langsam unter leichtem Rühren in die HDTMA-Lösung gegossen. Der Piperazin-Puffer wird unter leichtem Rühren hinzugegeben, dann wird mit entionisiertem Wasser auf 100ml Volumen aufgefüllt. Anschließend wird mit 50g/100ml Natriumhydroxidlösung auf pH 6,3 eingestellt und im Anschluss mit entionisiertem Wasser auf 125ml Volumen aufgefüllt.
Der Test selbst wird in 96er Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 100μl Probe pro Vertiefung durchgeführt. Je 10Oμl CAS-Testlösung werden zügig zu allen Proben gegeben und die Platte für zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgt die Messung der Extinktion E bei 630nm Wellenlänge in einem Mikrotiterplattenlesegerät. Als Referenz („Referenz 1") dient eine Probe aus 10Oμl entionisiertem Wasser, die gleich behandelt wurde. Vorteilhafterweise werden Duplikate oder Triplikate jeder Probe gemessen und die entsprechenden Ergebnisse gemittelt. Da der lineare Bereich des Tests bis ca. 70% CAS-Einheiten (s.u.) reicht, werden Proben über 70% CAS-Einheiten entsprechend verdünnt und erneut gemessen. Der Siderophorgehalt wird nach folgender Formel aus den Extinktionen E ermittelt: CAS- Einheiten in % = (EReferenz 1 - EProbe) * 100.
Aufgrund der Farbentwicklung im Kulturüberstand werden die jeweiligen Ergebnisse jedoch folgendermaßen korrigiert: Da die Referenz 1 (Wasser) die Färbung des Mediums nicht wiederspiegelt, wird eine weitere Probe („Referenz 2") nach obiger Prozedur gemessen, welche aus der zu messenden Probe (ggf. gleichsam verdünnt) versetzt mit 100μl entionisiertem Wasser anstelle CAS-Testlösung besteht. Die Extinktion für die korrigierte Referenz wird somit wie folgt bestimmt:
EReferenz = EReferenz 1 + EReferenz 2 - E|eere Vertiefung und anschließend in die obige Formel eingesetzt, womit sich ergibt: CAS-Einheiten in % = (EReferenz - EProbe) * 100.
2. Eisenperchlorat-Test: Die Quantifizierung von Hydroxamat-Siderophoren in Kulturüberständen kann ferner mit dem Eisenperchlorat-Test nach Varma (1998; Mycorrhiza Manual, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Deutschland) erfolgen.
Lösungen: a) Perchlorsäure-Lösung: 15ml 60% Perchlorsäure werden mit entionisiertem Wasser auf 45ml aufgefüllt b) Saure Eisen(lll)-Lösung: 1 ,351g Eisen(lll)chlorid-Hexahydrat werden in 45ml der Perchlorsäurelösung aufgelöst. c) Testlösung: die saure Eisen(lll)-Lösung wird mit entionisiertem Wasser auf 11 aufgefüllt.
Für die Messung werden 100μl Probe und 10Oμl Testlösung in einer Mikrotiterplatte gemischt und 10min ohne Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Extinktion E bei 480nm Wellenlänge gemessen. Die Hintergrundextinktion der Probe wird mit entionisiertem Wasser statt der Testlösung analog gemessen, sie spiegelt die bereits in der Probe bestehenden Eisen-Hydroxamatsiderophor- Komplexe wieder. Die Addition der beiden Extinktionen (mit Abzug der Eigenextinktion der leeren Vertiefung) spiegelt dann die Summe von eisenhaltigem und eisenfreien Hydroxamatsiderophoren in der
Probe Wieder. tgesamt — tprobe mit Testlosung "*" tprobe mit Wasser "" Meere Vertiefung
Dies ist nur bei Verwendung farbloser (Mineral-)Medien möglich, die keine zusätzliche Eigenextinktion bei 480nm aufweisen. Die so ermittelte Gesamtextinktion dient als Maß für die Hydroxamatsiderophor- Konzentration der Probe.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass das fur-Gen eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 50% identisch ist. Bevorzugt umfasst das fur-Gen eine Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. Die zugehörige Aminosäuresequenz des Fur-Proteins ist in SEQ ID NO. 2 angegeben. Diese erfindungsgemäße Ausgestaltung bezieht sich auf die Nukleinsäuresequenz von Bacillus licheniformis. Wie die Beispiele der vorliegenden Anmeldung belegen, können Mikroorganimen der Art Bacillus licheniformis besonders vorteilhaft erfindungsgemäß verändert werden, um die Siderophorbildung auch in Gegenwart von ausreichend Eisen, insbesondere Eisen(lll)-Ionen, zu verbessern. Gleiches gilt auch für Mikroorganismen, die eine zur fur-Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 von Bacillus licheniformis entsprechend ähnliche Nukleinsäuresequenz besitzen, also die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz zu den angegebenen Prozentsätzen identisch ist. Solche Mikroorganismen besitzen daher eine Fur-Entsprechung, also ein zu für homologes Gen.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- (oder auch Aminosäure-)Sequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Solch ein Vergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotidsequenzen (oder auch Aminosäuresequenzen) einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen, ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Verwendung der Codons (Codon-Usage). Üblicherweise werden Sequenzvergleiche und Alignments über Computerprogramme erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise Clustal (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500) oder T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) sowie BLAST oder FASTA für die Datenbanksuche, beziehungsweise Programme, die auf diesen Programmen bzw. Algorithmen basieren. In der vorliegenden Patentanmeldung wurden Sequenzvergleiche und Alignments mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 7.0 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Default- Parametern erstellt.
Solch ein Vergleich erlaubt eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Ein weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.
Homologe Gene („Entsprechungen") sind Gene, die für Genprodukte mit gleicher oder ähnlicher Funktion codieren, beispielsweise für Repressoren der Siderophor-Biosynthese (Fur-Homologe) oder für Enzyme, die vergleichbare Reaktionen im jeweiligen Siderophor-Syntheseweg katalysieren. Sie weisen oftmals ähnliche Nukleotidsequenzen oder Teilsequenzen auf, so dass ein Sequenzvergleich der homologen Gene in einem Alignment einen wie vorstehend angegebenen Mindest-Identitätswert ergibt. Homologe Gene in anderen Mikroorganismen können damit insbesondere auf Grund von Sequenzhomologien durch Sequenzvergleiche ermittelt werden und sind in die Erfindung eingeschlossen, insbesondere im Rahmen der jeweils angegebenen Mindest-Identitätswerte. Eine alternative oder zusätzliche Bestätigung der Zuordnung homologer Gene auf Grund ihrer funktionellen Entsprechung liefert ein Vergleichsversuch, bei dem die beiden homologen Gene in den miteinander verglichenen Mikroorganismen auf die gleiche Weise verändert werden und dann ermittelt wird, ob bei beiden Mikroorganismen die Siderophor- Synthese auf gleiche oder ähnliche Weise verändert wird. Ist dieses der Fall, so ist hierin eine Bestätigung des Sachverhaltes zu sehen, dass es sich um homologe Gene handelt. Auch solche funktionellen Entsprechungen sind in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Mikroorganismus dadurch gekennzeichnet, dass das Siderophor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acinetobactin, Achromobactin, Acinetoferrin, Aerobactin, Albomycin, Alealigin, Bisucaberin, Agrobactin, Alterobactin A, Alterobactin B, Amonabactin P, Amonabactin T, Amphibactin G, Anguibactin, Anthrachelin, Aquachelin D, Arthrobactin, Azotobactin D, Azoverdin, Bacillibactin, Corynebactin, Basidiochrom, Brucebactin, Carboxymycobactin, Cepabactin, Chrysobactin, Coelichelin, Colibactin, Coprogen, Corrugatin, Desferrioxamin B, Desferrioxamin E, Desferrioxamin Et2, Desferrioxamin Et3, Dimerumsäure, Enterobactin, Enterochelin, Erythrobactin, Exochelin MN, Exochelin MS, Ferrichrom A, Ferrichrom C, Ferrichrome, Ferrichrysin, Ferricrocin, Ferrioxamin B, Ferrioxamin E, Ferrioxamine A1 , A2, C, D1 , D2, Fm G, H oder I, Ferrirhodin, Ferrirubin, Ferrithiocin, Fluvibactin, Fusarin C, Fusarin PM, Fusarin X, Fusarin Z, Fusigen, FusarininC, Gallichrom, Gonobactin, Hexahydroferrirhodin, Maduraferrin, Marinobactin E, Marinobactine, Meningobactin, Methanobactin, Mugineinsäure, Mycobactin, Mycobactin J, Mycobactin P, Mycobactin S, Mycobactin T, Myxochelin A oder B, Nannochelin A, Nannochelin B, Nannochelin C, Neocoprogen I, Neocoprogen II, Nocobactin NA, Nocardamin, Ornibactin, Ornibactin C4, C6 oder C8, L-Parabactin, Petrobactin, Pseudobactin, Pseudobactin 7NSK2, Pseudobactin 7SR1 , Pseudobactin A, Pseudobactin A 214, Pseudobactin M114, Pseudobactin PSB3, Pseudobactin St3, Pseudobactin , Pseudomonin, Putrebactin, Pyochelin A, Pyoverdin, Pyoverdin Pf12, Quinolobactin, Rhizobactin 1021 , Rhizobactin DM4, Rhodotorulsäure, Rhizoferrin, Rhodobactin, Ruckerbactin, Salmochelin, Salmycin, Schizokinen, Staphylobactin, Staphyloferrin A, Staphyloferrin B, Tenacibactin A, B, C oder D, Triacetylfusarinin, Triacetylfusarinin C, Tetraglycylferrichrom, Thioquinolobactin, Vanchrobactin, Vibriobactin, Vibrioferrin, Vulnibactin, Yersiniabactin. Eine Fur-regulierte (bzw. von einer jeweiligen Fur-Entsprechung) regulierte Biosynthese von einem dieser Siderophore lässt sich erfindungsgemäß besonders vorteilhaft verbessern. Üblicherweise kennzeichnet das Präfix „Desferri-" die eisenfreie Form des Siderophors, wenn der ursprüngliche Name die eisenhaltige („Ferri-") Form desselben Liganden beschreibt. Daher ist für jedes angegebene „Ferri"-Siderophor auch die jeweilige „Desferri"-Form mit umfasst und umgekehrt für jedes angegebene „Desferri"-Siderophor das jeweilige „Ferri'-Siderophor.
Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen Siderophore herstellen lassen, insbesondere durch die Fermentation der Mikroorganismen. Voraussetzung ist lediglich, dass der Mikroorganismus grundsätzlich zur Siderophorbildung befähigt ist und die Siderophor-Biosynthese durch Für (bzw. eine jeweilige Entsprechung desselben in dem jeweiligen Mikroorganismus) reguliert ist. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus ein Bakterium, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Acinetobacter, Acinomadura, Actinomyces, Aerobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Alteromonas, Anabaena, Arthrobacter, Azomonas, Azotobacter, Bacillus, Bordetella, Brucella, Burkholderia, Corynebacterium, Cupriavidus (Alcaligenes, Wautersia), Erwinia (Pectinobacterium), Escherichia, Klebsiella, Marinobacter, Methylosinus, Microbacterium, Mycobacterium, Nannocystis, Neisseria, Nocardia, Paracoccus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodococcus, Saccharopolyspora, Salmonella, Typhimurium, Shewanella, Shigella, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptomyces, Tenacibaculum, Vibrio und Yersinia, und weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Acinomadura madurae, Actinomyces subtropicus, Aerobacter, Aeromonas hydrophila, Agrobacterium tumefaciens, Alteromonas haloplanktis, Alteromonas luteoviolacea, Anabaena sp. ATCC 27898, Arthrobacter oxidans, Azomonas macrocytogenes, Azotobacter vinelandii, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus novalis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bordetella bronchiseptica, Brucella abortus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Burkholderia plantarii, Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator (Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha), Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi (Pectinobacterium chrysanthemi), Escherichia coli, Klebsiella planticola, Marinobacter hydrocarbonoclasticus, Methylosinus trichosporium, Microbacterium flavescens, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Nannocystis exedens, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas B10, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas corrugata, Ralstonia leguminosarum, Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum, Ralstonia pickettii, Rhizobium meliloti, Rhodococcus rhodochrous, Saccharopolyspora erythaea, Salmonella enterica serovar, Typhimurium, Shewanella putrefaciens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus carnosus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces olivaceus, Streptomyces pilosus, Tenacibaculum sp. A4K-17, Vibrio anguillarum, Vibrio anguillarum serovar 02, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio salmonicida, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica und Yersinia ruckeri. Ein besonders bevorzugtes Bakterium ist ausgewählt aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus novalis, Burkholderia glumae, Burkholderia plantarii, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Stenotrophomonas maltophilia, Rhizobium leguminosarum, Ralstonia solanacearum und Anabaena sp.
Solche Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren zur Siderophorherstellung etabliert werden. Zudem ist für Bakterien in der Fermentationstechnik ein reichhaltiger Erfahrungsschatz vorhanden. Der für die Produktion eines bestimmten Siderophors unter den jeweiligen Fermentationsbedingungen am besten geeignete Bakterienstamm muss für die jeweiligen Bedingungen gesondert ermittelt werden. Relevante zu berücksichtigende Parameter sind beispielsweise die Fähigkeit zur Synthese des Siderophors selbst, die Art und Verfügbarkeit von Nährstoffquellen, das Fermentationsvolumen, die Medienzusammensetzung, die Sauerstoffversorgung, die Rührergeschwindigkeit, die Produktbildungsrate, der Zeitbedarf, usw. Die Mikroorganismen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere Produkte, beispielsweise Proteine, insbesondere rekombinante Proteine, exprimieren. Es kann sich insbesondere um solche Mikroorganismen handeln, die neben dem Siderophor transgen eines oder mehrere Enzyme exprimieren, das/die sie vorteilhafterweise wie das Siderophor in das den Mikroorganismus umgebende Medium sezernieren. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Mikroorganismen (Wirtszellen) beimpft und das Produkt, also das Siderophor, nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform weist ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus im Vergleich zu dem zweiten Mikroorganismus eine verstärkte Expression eines Gens auf, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bli01183, bli01184, bliO1185, bli01 186, bliO1187, bli01 188, insbesondere wobei bli01183 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1184 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1185 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 8 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1186 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1187 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1188 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist. Bevorzugt umfasst das jeweilige Gen bliO1183, bliO1184, bliO1185, bliO1186, bliO1187 bzw. bliO1188 eine Nukleinsäuresequenz, die zu der jeweiligen in
SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 bzw. SEQ ID NO. 11 angegebenen Nukleinsäuresequenz zu mindestens 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%,
60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
Die genannten Gene bliO1183 bis bliO1188 beziehen sich auf Bacillus licheniformis und sind unter SEQ ID NOs. 6 bis 11 angegeben. Jedoch existieren jeweilige Entsprechungen dieser Gene (homologe Gene) auch in anderen Mikroorganismen, die für die Siderophorproduktion von Interesse sind. Diese erfindungsgemäße Ausgestaltung ist somit nicht auf Bacillus licheniformis beschränkt. Die den genannten Bacillus licheniformis-Genen entsprechenden Gene in anderen Mikroorganismen können wie vorstehend beschrieben auf Grund von Sequenzhomologien durch Sequenzvergleiche und/oder durch Vergleichsversuche ermittelt werden und sind im Rahmen der vorstehend angegebenen Mindest- Identitätswerte in die Erfindung eingeschlossen. Die in Bacillus licheniformis identifizierten Gene weisen die höchste Ähnlichkeit bzw. Identität auf zu den Genen des rhb Operons für die Synthese von Rhizobactin 1021 von Sinorhizobium meliloti (vgl. Persmark, M., P. Pittman, J. S. Buyer, B. Schwyn, P. R. GiII jr., and J.B. Neilands (1993): Isolation and structure of rhizobactin 1021 , a siderophore from the alfalfa symbiont Rhizobium meliloti 1021 , J Am Chem Soc 115 (10): 3950-3956). Die von diesen Genen codierten Genprodukte sind notwendig für bzw. beteiligt an der Siderophor-Synthese. Daher ist es ergänzend möglich, durch die verstärkte Expression eines oder mehrerer dieser Gene die Siderophor- Synthese weiter zu steigern. In Mikroorganismen der Art Bacillus licheniformis sind die von diesen Genen codierten Genprodukte beispielsweise an der Synthese von Schizokinen beteiligt, so dass es möglich ist, durch die verstärkte Expression von einem oder mehreren dieser Gene die Synthese von Schizokinen in Bacillus licheniformis oder anderen Schizokinen-bildenden Mikroorganismen weiter zu steigern. In Bacillus licheniformis bilden diese Gene einen Gencluster (Operon). Das Operon umfasst eine Fur-Box in der genregulatorischen Sequenz (Operator-Region) des Operons, so dass die Siderophor-Synthese, insbesondere Schizokinen-Synthese, auch in Bacillus licheniformis unter der Kontrolle des Fur-Proteins steht und erfindungsgemäß beeinflusst werden kann, beispielsweise durch eine Deletion im fur-Gen bzw. durch eine Inaktivierung des fur-Gens allgemein. Dieses Operon bildet somit einen Teil des Fur- Regulons. Die Nukleinsäuresequenz dieser Fur-Box ist in SEQ ID NO. 5 angegeben.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt ein Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Siderophors durch Kultivierung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus dar. Ferner wurde überraschend festgestellt, dass Bacillus licheniformis selbst ohne Mutation des fur-Gens befähigt ist, Siderophore, insbesondere Schizokinen, zu bilden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Siderophors durch Kultivierung von Bacillus licheniformis, insbesondere eines Siderophors, das nicht Bacillibactin ist, bevorzugt eines Citrathydroxamates und ganz besonders bevorzugt um Schizokinen. Aus dem Stand der Technik ist bislang keine Siderophor-Synthese von Bacillus licheniformis bekannt. Lediglich ein Gencluster (Operon) wurde mit einer möglichen Synthese von Bacillibactin spekulativ in Verbindung gebracht, wobei dieses Operon nicht als funktionell offenbart ist. Eine reale Siderophor-Synthese von Bacillus licheniformis ist daher aus dem Stand der Technik nicht bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun aber ein Gencluster (Operon) identifiziert für die Synthese eines Siderophors, insbesondere eines, welches nicht Bacillibactin ist, insbesondere eines Citrathydroxamates, insbesondere Schizokinen, das die vorstehend beschriebenen Gene bli01183 bis bli01188 umfasst. Auf Grund ihrer Ähnlichkeit der Gene bli01183 bis bliO1188 zu den Genen des rhb Operons für die Synthese von Rhizobactin 1021 von Sinorhizobium meliloti wurde ein Syntheseweg für ein Rhizobactin 1021-ähnliches Siderophor in Bacillus licheniformis identifiziert, wobei der Syntheseweg keine Reaktion umfasst, die von einem Enzym katalysiert wird, das der Acetyltransferase RhbG im Rhizobactin 1021 -Syntheseweg (vgl. Lynch, D., J. O'Brien, T. Welch, P. Clarke, P.O. Cuiv, J. H. Crosa, and M. O'Connell (2001 ): Genetic organization of the region encoding regulation, biosynthesis, and transport of rhizobactin 1021 , a siderophore produced by Sinorhizobium meliloti, J Bacteriol 183 (8):2576-2585, sowie Challis, G. L. (2005): A widely distributed bacterial pathway for siderophore biosynthesis independent of nonribosomal peptide synthetases, Chem BioChem 6: 601- 611 ) entspricht. In Bacillus licheniformis ist daher kein Homolog zu RhbG vorhanden. Im Rhizobactin 1021 -Syntheseweg katalysiert dieses Enzym die Acetylierung von 1 ,3-Diaminopropan. In Bacillus licheniformis wird 1 ,3-Diamoniopropan somit lediglich durch ein RhbD-Homolog modifiziert, so dass das synthetisierte Siderophor symmetrisch und somit Schizokinen ist. Somit führt ein in Bacillus licheniformis modifizierter Rhizobactin 1021 -Syntheseweg zur Synthese von Schizokinen (vgl. Figur 1 ). Ferner wurde für Bacillus licheniformis eine Synthese von Bacillibactin gefunden.
Mit erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Siderophore mit Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, herzustellen, insbesondere in einer biotechnologischen Fermentation und insbesondere auch in Abwesenheit eines Eisenmangelzustands, also in Anwesenheit von ausreichend Eisen, insbesondere Eisen(lll)-Ionen. Dadurch ermöglicht ein solches Verfahren eine verbesserte Siderophorausbeute in einer Fermentation, da die Fermentation unter nicht limitierenden Wachstumsbedingungen erfolgen kann. Vorteilhafterweise kommt in erfindungsgemäßen Verfahren ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus zum Einsatz. Bacillus licheniformis kann auch direkt eingesetzt werden, wobei insbesondere auch Bacillus licheniformis durch eine Mutation des fur-Gens erfindungsgemäß modifiziert werden kann, um die Siderophor-Produktion weiter zu verbessern wie vorstehend beschrieben. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Mikroorganismen beschrieben sind, sind auch auf die erfindungsgemäßen Verfahren anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.
Fermentationsverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, also des gebildeten Siderophors. Alle Fermentationsverfahren, die zur Herstellung des Siderophors geeignet sind, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar. Als geeignet ist ein solches Verfahren dann zu betrachten, wenn ein Siderophor gebildet wird. Bevorzugt ist das Siderophor eines der vorstehend genannten Siderophore. Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zu lauf Strategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Dadurch können Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Biotrockenmasse und/oder der Menge des interessierenden Siderophors erreicht werden. Ferner kann die Fermentation alternativ oder ergänzend auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechsel produkte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden. Für jedes herzustellende Siderophor sind eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten möglich. Das optimale Verfahren muss für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.
Eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in einem Medium erfolgt, das einen Bestandteil enthält, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pflanzenmehl, Pflanzenextrakt, Proteinhydrolysat aus Pflanzen, Hefeextrakt, Fleischextrakt, insbesondere Rindfleisch-Extrakt, Caseinhydrolysat. Eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in einem Medium erfolgt, das 0,01-100μM und zunehmend bevorzugt 0,05-50μM, 0,1-20μM, 0,1-10μM, 0,5-1 μM, 0,5-5μM und 0,8-1 ,5μM Eisenionen, bevorzugt Eisen(lll)-Ionen, enthält.
Diese Ausführungsformen betreffen insbesondere den Einsatz komplexer Medien in erfindungsgemäßen Verfahren. Grundsätzlich können Kulturmedien fest oder flüssig sein, wobei bei Festmedien üblicherweise die Analyse der jeweiligen Mikroorganismen im Vordergrund steht, bei Flüssigmedien dagegen die Kultivierung der Mikroorganismen, auch in größeren Mengen, erfolgt, beispielsweise zur Erzeugung von Biomasse und/oder zur mikrobiellen Herstellung eines Produktes, insbesondere in einer Fermentation. Flüssigmedien sind daher erfindungsgemäß bevorzugt. Die Zusammensetzungen des Nährmediums sowie die Kulturbedingungen richten sich jeweils nach dem zu kultivierenden Mikroorganismus. Definierte Medien beinhalten eine genau bestimmte Anzahl und Menge an Inhaltsstoffen, die oftmals chemisch gereinigt werden, um Spuren von anderen Stoffen auszuschließen. Sie dienen häufig zur Selektion des Wachstums bestimmter Mikroorganismen. Minimalmedien als Sonderform der definierten Medien beinhalten nur die minimal nötigen Stoffe für das Wachstum der zu kultivierenden Mikroorganismen. Komplexe Medien umfassen dagegen Nährstoffe, deren Inhalte nicht genau bestimmt sind, wie zum Beispiel Pflanzenmehl, Pflanzenextrakt, Proteinhydrolysat aus Pflanzen, Hefeextrakt, Fleischextrakt, insbesondere Rindfleisch-Extrakt, Caseinhydrolysat. Sie werden am häufigsten verwendet und erlauben das Wachstum fast aller heterotrophen Mikroorganismen. Ein erfindungsgemäß besonders bevorzugtes Medium ist daher ein komplexes Flüssigmedium mit einem oder mehreren der vorstehend genannten Bestandteile. Der Einsatz eines solchen Mediums für die fermentative Siderophorproduktion, also die Siderophorproduktion durch Mikroorganismen in einem Bioreaktor, wird durch die vorliegende Erfindung signifikant verbessert. Bislang war es notwendig, die Mikroorganismen unter sorgfältig eingestellten Eisenmangelbedingungen zu kultivieren, um eine hinreichenden Produktausbeute zu erhalten, wobei gerade das Einstellen solcher Bedingungen schwierig ist. Erstens ist die Eisenversorgung der Mikroorganismen selbst wachstumslimitierend, so dass zwar ein Eisenmangelzustand erzeugt werden muss, aber dennoch so viel Eisen zur Verfügung gestellt werden muss, dass ein noch ausreichendes Wachstum der Mikroorganismen erfolgt. Zweitens ist beim Einsatz komplexer Medien bzw. Mediumsbestandteile eine genaue Einstellung des Eisengehaltes besonders schwierig, z.B. wegen Chargenschwankungen. Diese Nachteile werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung überwunden, so dass eine verbesserte Produktausbeute an Siderophoren auch in komplexen Medien und/oder auch in Anwesenheit von Eisen, insbesondere Eisen(lll)-Ionen, erreicht werden kann. Beispielsweise zeigen die Mikroorganismen in komplexen Medien ohne Eisenmangel ein gutes Wachstum und regulieren die Siderophorproduktion trotz dieser guten Wachstumsbedingungen nicht herunter.
Erfindungsgemäße Mikroorganismen werden daher vorteilhaft in den beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt und werden in diesen Verfahren verwendet, um einen Stoff herzustellen. Konsequenterweise ist demnach ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines vorstehend beschriebenen Mikroorganismus zur Herstellung eines Siderophors, vorzugsweise zur Herstellung von Acinetobactin, Achromobactin, Acinetoferrin, Aerobactin, Albomycin, Alealigin, Bisucaberin, Agrobactin, Alterobactin A, Alterobactin B, Amonabactin P, Amonabactin T, Amphibactin G, Anguibactin, Anthrachelin, Aquachelin D, Arthrobactin, Azotobactin D, Azoverdin, Bacillibactin, Corynebactin, Basidiochrom, Brucebactin, Carboxymycobactin, Cepabactin, Chrysobactin, Coelichelin, Colibactin, Coprogen, Corrugatin, Desferrioxamin B, Desferrioxamin E, Desferrioxamin Et2, Desferrioxamin Et3, Dimerumsäure, Enterobactin, Enterochelin, Erythrobactin, Exochelin MN, Exochelin MS, Ferrichrom A, Ferrichrom C, Ferrichrome, Ferrichrysin, Ferricrocin, Ferrioxamin B, Ferrioxamin E, Ferrioxamine A1 , A2, C, D1 , D2, Fm G, H oder I, Ferrirhodin, Ferrirubin, Ferrithiocin, Fluvibactin, Fusarin C, Fusarin PM, Fusarin X, Fusarin Z, Fusigen, FusarininC, Gallichrom, Gonobactin, Hexahydroferrirhodin, Maduraferrin, Marinobactin E, Marinobactine, Meningobactin, Methanobactin, Mugineinsäure, Mycobactin, Mycobactin J, Mycobactin P, Mycobactin S, Mycobactin T, Myxochelin A oder B, Nannochelin A, Nannochelin B, Nannochelin C, Neocoprogen I, Neocoprogen II, Nocobactin NA, Nocardamin, Ornibactin, Ornibactin C4, C6 oder C8, L-Parabactin, Petrobactin, Pseudobactin, Pseudobactin 7NSK2, Pseudobactin 7SR1 , Pseudobactin A, Pseudobactin A 214, Pseudobactin M114, Pseudobactin PSB3, Pseudobactin St3, Pseudobactin , Pseudomonin, Putrebactin, Pyochelin A, Pyoverdin, Pyoverdin Pf12, Quinolobactin, Rhizobactin 1021 , Rhizobactin DM4, Rhodotorulsäure, Rhizoferrin, Rhodobactin, Ruckerbactin, Salmochelin, Salmycin, Schizokinen, Staphylobactin, Staphyloferrin A, Staphyloferrin B, Tenacibactin A, B, C oder D, Triacetylfusarinin, Triacetylfusarinin C, Tetraglycylferrichrom, Thioquinolobactin, Vanchrobactin, Vibriobactin, Vibrioferrin, Vulnibactin, Yersiniabactin, ganz besonders bevorzugt zur Herstellung von Schizokinen. Da ferner Bacillus licheniformis bereits in seiner Wildtyp-Form zur Siderophor-Produktion geeignet ist, ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Bacillus licheniformis zur Herstellung eines Siderophors, vorzugsweise zur Herstellung von Schizokinen und/oder Bacillibactin. Alternativ oder ergänzend wäre es möglich, Bacillus zur Herstellung eines Siderophors wie vorstehend angegeben zu verwenden.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Mikroorganismen bzw. erfindungsgemäße Verfahren beschrieben sind, sind auch auf erfindungsgemäße Verwendungen anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verwendungen gilt. Beispiele:
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme, Baukästen (Kits) und Geräte wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1 : Herstellung einer Derepressionsmutante für Siderophorproduktion
Mithilfe molekularbiologischer Standardverfahren wurde in Bacillus licheniformis der für das Fur-Protein codierende Bereich im fur-Gen um 404 Basenpaare verkürzt (vgl. auch Figur 2). Die entstandene Fusionsstelle weist die Sequenz des verwendeten Fusionsprimers (bzw. seines Gegenstranges) gemäß SEQ ID NO. 3 auf, wobei die Deletion nach Position 15 gemäß SEQ ID NO. 3 vorhanden ist.
Beispiel 2: Verbesserung der Siderophorproduktion durch Mutation des fur-Gens Die in Beispiel 1 hergestellte fur-Mutante von Bacillus licheniformis wurde vergleichend zum Ausgangsstamm hinsichtlich ihrer Siderophorproduktion im CAS-Flüssig- und im Eisenperchlorat-Test untersucht. Wie Figur 3 verdeutlicht weist die fur-Mutante eine deutlich verbesserte Siderophorproduktion auf in Anwesenheit von 10 μM zugesetztem Eisen(lll)chlorid (Figur 3 A) im Vergleich mit einem Kontrollansatz ohne zugesetztes Eisen in Eisenmangelmedium (Figur 3 B). Ferner weist die fur- Mutante eine höhere Endzelldichte auf, was hinsichtlich der Siderophor-Ausbeute ebenfalls vorteilhaft ist.
Beispiel 3: Siderophorproduktion mit Bacillus licheniformis Wildtyp-Stämmen
Zwei Bacillus licheniformis Stämme wurden in Eisenmangelmedium analog zu May et al. (vgl. May, JJ. ,
T.M. Wendrich, and M.A. Marahiel (2001 ): The dhb Operon of Bacillus subtilis encodes the biosynthetic template for the catecholic siderophore 2,3-dihydroxybenzoate-glycine-threonine trimeric ester bacillibactin, J Biol Chem 276 (10): 7209-7217) herangezogen und bis in die stationäre Phase wachsen gelassen. Der zellfreie Überstand nach Ernte wurde mehrfach mit Butanol im Scheidetrichter extrahiert, die vereinigten Butanolphasen im Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit einem kleinen Volumen Methanol digeriert. Die methanolische Lösung wurde zur massenspektrometrischen Untersuchung eingesetzt, und es wurden Massensignale erhalten, die dem
Schizokinen sowie dem Bacillibactin entsprechen:
Schizokinen gemessen: m/z= 421 ,08 (M+H+), berechnete monoisotopische Masse von Schizokinen
420,19;
Bacillibactin gemessen: m/z=882,94, berechnete monoisotopische Masse für Bacillibactin 882,26.
Mit einem käuflich erworbenen Schizokinenstandard (Fa. EMC Microcollections, Tübingen) wurde das gleiche Ergebnis für Schizokinen gefunden.
Die methanolische Lösung wurde eingedampft, der Rückstand in Wasser aufgenommen und im CAS- Flüssig-Test sowie im Hydroxamat-Test untersucht. Beide Reaktionen verliefen positiv, wodurch eine Hydroxamat-Siderophorsynthese nachgewiesen wurde. Ferner ergaben die Stämme auf CAS-Agar (vgl. Schwyn & Neilands (1987)) einen typischen gelb-orangen HaIo als weiteren Siderophorsynthesenachweis.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 : (A) Darstellung des Schizokinen-Syntheseweges in Bacillus licheniformis. Die über den Pfeilen angegebenen Proteine zeigen die Enzyme von Bacillus licheniformis („BLJ") sowie jeweilige hierzu homologe Enzyme des Aerobactin-Syntheseoperons (oben, beispielsweise „lue") sowie des Rhizobactin 1021-Syntheseoperons (mittig, beispielsweise „Rhb"), die die jeweilige Reaktion katalysieren. (B) Darstellung des Schizokinen-Syntheseoperons von Bacillus licheniformis.
Figur 2: Schematische Darstellung der fur-Deletion gemäß Beispiel 1. Oben: Nach Transformation von Bacillus licheniformis mit dem Vektor (Plasmid 1 ) enthält das Bakterium noch das fur-Gen. Mitte: Nach erfolgter Rekombination wurde ein Abschnitt des fur-Gens aus der genomischen DNA entfernt und in das Plasmid 2 integriert. Unten: Genomstruktur nach erfolgter Deletion des fur-Gens.
Figur 3: Vergleich der Siderophor-Produktion der Bacillus licheniformis fur-Mutante mit dem Bacillus licheniformis-Ausgangsstamm in Anwesenheit von 10 μM Eisen(lll)-Ionen (A) beziehungsweise in einem Kontrollansatz ohne zugesetztes Eisen in Eisenmangelmedium (B). Die fur-Mutante weist eine deutlich verbesserte Siderophor-Produktion auf in Anwesenheit von 10 μM zugesetztem Eisen(lll)chlorid. Ferner weist die fur-Mutante eine höhere Endzelldichte auf, was hinsichtlich der Siderophor-Ausbeute ebenfalls vorteilhaft ist.
Figur 4: Strukturformeln der von Bacillus licheniformis produzierten Siderophore. (A) Schizokinen. (B) Bacillibactin.
Sequenzprotokoll - freier Text:
Betreffend SEQ ID NO. 3: entstandene Fusionsstelle gemäß Beispiel 1.

Claims

Patentansprüche
1. Siderophor-bildender Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganimus durch mindestens eine Mutation im fur-Gen eine verminderte Expression dieses Gens aufweist im Vergleich zu einem zweiten Mikroorganismus, der diese Mutation nicht aufweist.
2. Mikroorganismus nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganimus ein nicht natürlicher Mikroorganismus ist.
3. Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Mikroorganismus ein natürlicher Mikroorganismus ist.
4. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er aus dem zweiten Mikroorganismus durch mindestens eine Deletion und/oder mindestens eine Insertion und/oder Substitution von mindestens einem Basenpaar im fur-Gen erhalten werden kann.
5. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass er in Gegenwart von mindestens 0,1 μM und zunehmend bevorzugt von mindestens 0,5μM, 1 μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM und 10μM Eisen(lll)-Ionen eine gegenüber dem zweiten Mikroorganismus gesteigerte Siderophor-Synthese aufweist.
6. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das fur-Gen eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 50% identisch ist.
7. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Siderophor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acinetobactin, Achromobactin, Acinetoferrin, Aerobactin, Albomycin, Alealigin, Bisucaberin, Agrobactin, Alterobactin A, Alterobactin B, Amonabactin P, Amonabactin T, Amphibactin G, Anguibactin, Anthrachelin, Aquachelin D, Arthrobactin, Azotobactin D, Azoverdin, Bacillibactin, Corynebactin, Basidiochrom, Brucebactin, Carboxymycobactin, Cepabactin, Chrysobactin, Coelichelin, Colibactin, Coprogen, Corrugatin, Desferrioxamin B, Desferrioxamin E, Desferrioxamin Et2, Desferrioxamin Et3, Dimerumsäure, Enterobactin, Enterochelin, Erythrobactin, Exochelin MN, Exochelin MS, Ferrichrom A, Ferrichrom C, Ferrichrome, Ferrichrysin, Ferricrocin, Ferrioxamin B, Ferrioxamin E, Ferrioxamine A1 , A2, C, D1 , D2, Fm G, H oder I, Ferrirhodin, Ferrirubin, Ferrithiocin, Fluvibactin, Fusarin C, Fusarin PM, Fusarin X, Fusarin Z, Fusigen, FusarininC, Gallichrom, Gonobactin, Hexahydroferrirhodin, Maduraferrin, Marinobactin E, Marinobactine, Meningobactin, Methanobactin, Mugineinsäure, Mycobactin, Mycobactin J, Mycobactin P, Mycobactin S, Mycobactin T, Myxochelin A oder B, Nannochelin A, Nannochelin B, Nannochelin C, Neocoprogen I, Neocoprogen II, Nocobactin NA, Nocardamin, Ornibactin, Ornibactin C4, C6 oder C8, L-Parabactin, Petrobactin, Pseudobactin, Pseudobactin 7NSK2, Pseudobactin 7SR1 , Pseudobactin A, Pseudobactin A 214, Pseudobactin M114, Pseudobactin PSB3, Pseudobactin St3, Pseudobactin , Pseudomonin, Putrebactin, Pyochelin A, Pyoverdin, Pyoverdin Pf12, Quinolobactin, Rhizobactin 1021 , Rhizobactin DM4, Rhodotorulsäure, Rhizoferrin, Rhodobactin, Ruckerbactin, Salmochelin, Salmycin, Schizokinen, Staphylobactin, Staphyloferrin A, Staphyloferrin B, Tenacibactin A, B, C oder D, Triacetylfusarinin, Triacetylfusarinin C, Tetraglycylferrichrom, Thioquinolobactin, Vanchrobactin, Vibriobactin, Vibrioferrin, Vulnibactin, Yersiniabactin.
8. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, er ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Acinetobacter, Acinomadura, Actinomyces, Aerobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Alteromonas, Anabaena, Arthrobacter, Azomonas, Azotobacter, Bacillus, Bordetella, Brucella, Burkholderia, Corynebacterium, Cupriavidus (Alcaligenes, Wautersia), Erwinia (Pectinobacterium), Escherichia, Klebsiella, Marinobacter, Methylosinus, Microbacterium, Mycobacterium, Nannocystis, Neisseria, Nocardia, Paracoccus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodococcus, Saccharopolyspora, Salmonella, Typhimurium, Shewanella, Shigella, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptomyces, Tenacibaculum, Vibrio und Yersinia.
9. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass er im Vergleich zu dem zweiten Mikroorganismus eine verstärkte Expression eines Gens aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bli01183, bli01 184, bli01185, bli01186, bli01187, bli01188, insbesondere wobei bli01183 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bli01184 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1185 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 8 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1186 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1 187 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist, bliO1188 eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen
Nukleinsäuresequenz zu mindestens 10% identisch ist.
10. Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Siderophors durch Kultivierung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Siderophors durch Kultivierung von Bacillus licheniformis.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in einem Medium erfolgt, das einen Bestandteil enthält, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pflanzenmehl, Pflanzenextrakt, Proteinhydrolysat aus Pflanzen, Hefeextrakt, Fleischextrakt, insbesondere Rindfleisch-Extrakt, Caseinhydrolysat.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in einem Medium erfolgt, das 0,01-100μM und zunehmend bevorzugt 0,05-50μM, 0,1-20μM, 0,1-10μM, 0,5-1 μM, 0,5-5μM und 0,8-1 ,5μM Eisenionen, bevorzugt Eisen(lll)-Ionen, enthält.
14. Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Siderophors, vorzugsweise zur Herstellung von Acinetobactin, Achromobactin, Acinetoferrin, Aerobactin, Albomycin, Alealigin, Bisucaberin, Agrobactin, Alterobactin A, Alterobactin B, Amonabactin P, Amonabactin T, Amphibactin G, Anguibactin, Anthrachelin, Aquachelin D, Arthrobactin, Azotobactin D, Azoverdin, Bacillibactin, Corynebactin, Basidiochrom, Brucebactin, Carboxymycobactin, Cepabactin, Chrysobactin, Coelichelin, Colibactin, Coprogen, Corrugatin, Desferrioxamin B, Desferrioxamin E, Desferrioxamin Et2, Desferrioxamin Et3, Dimerumsäure, Enterobactin, Enterochelin, Erythrobactin, Exochelin MN, Exochelin MS, Ferrichrom A, Ferrichrom C, Ferrichrome, Ferrichrysin, Ferricrocin, Ferrioxamin B, Ferrioxamin E, Ferrioxamine A1 , A2, C, D1 , D2, Fm G, H oder I, Ferrirhodin, Ferrirubin, Ferrithiocin, Fluvibactin, Fusarin C, Fusarin PM, Fusarin X, Fusarin Z, Fusigen, FusarininC, Gallichrom, Gonobactin, Hexahydroferrirhodin, Maduraferrin, Marinobactin E, Marinobactine, Meningobactin, Methanobactin, Mugineinsäure, Mycobactin, Mycobactin J, Mycobactin P, Mycobactin S, Mycobactin T, Myxochelin A oder B, Nannochelin A, Nannochelin B, Nannochelin C, Neocoprogen I, Neocoprogen II, Nocobactin NA, Nocardamin, Ornibactin, Ornibactin C4, C6 oder C8, L-Parabactin, Petrobactin, Pseudobactin, Pseudobactin 7NSK2, Pseudobactin 7SR1 , Pseudobactin A, Pseudobactin A 214, Pseudobactin M114, Pseudobactin PSB3, Pseudobactin St3, Pseudobactin , Pseudomonin, Putrebactin, Pyochelin A, Pyoverdin, Pyoverdin Pf12, Quinolobactin, Rhizobactin 1021 , Rhizobactin DM4, Rhodotorulsäure, Rhizoferrin, Rhodobactin, Ruckerbactin, Salmochelin, Salmycin, Schizokinen, Staphylobactin, Staphyloferrin A, Staphyloferrin B, Tenacibactin A, B, C oder D, Triacetylfusarinin, Triacetylfusarinin C, Tetraglycylferrichrom, Thioquinolobactin, Vanchrobactin, Vibriobactin, Vibrioferrin, Vulnibactin, Yersiniabactin
15. Verwendung von Bacillus licheniformis zur Herstellung eines Siderophors, vorzugsweise zur Herstellung von Schizokinen und/oder Bacillibactin.
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