WO2010092223A1 - Cepa de beauveria bassiana y sus aplicaciones - Google Patents

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WO2010092223A1
WO2010092223A1 PCT/ES2010/070079 ES2010070079W WO2010092223A1 WO 2010092223 A1 WO2010092223 A1 WO 2010092223A1 ES 2010070079 W ES2010070079 W ES 2010070079W WO 2010092223 A1 WO2010092223 A1 WO 2010092223A1
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microorganism
plant
luteipes
spore
seed
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PCT/ES2010/070079
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Cándido SANTIAGO ÁLVAREZ
Enrique Quesada Moraga
Francisco Javier MUÑOZ LEDESMA
Original Assignee
Alcaliber, S.A.
Universidad de Córdoba
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the invention relates to a strain of Beauveria bassiana, with the ability to naturally infect larvae of the cynoid hymenoptera Iraella luteipes (Thompson), and its use in the systemic protection of Papaver somniferum plants against this phytophagus.
  • Opium poppy (Papaver somniferum L.) is one of the most important cultivated plants for the pharmaceutical industry, as it is the only source of alkaloids such as morphine, codeine and thebaine, which are widely used in medicine as analgesics, antitussives and antispasmodics.
  • the opium poppy is an annual herbaceous plant, with a distinctive vegetative phase characterized by large and numerous pinnate leaves that are distributed in the form of a rosette, and a reproductive stage during which the buds of the stems bloom.
  • the root is pivotal and deep, and the stem is erect, robust, slightly branched and up to 1.60 m tall.
  • the leaves hug the stem at its base and are alternate, sitting, large, lobed, hairless, light green and with prominent ribs on the underside.
  • the flowers are terminal and solitary, composed of a chalice of two hairless sepals that detach when the flower is opened, and by a corolla of four petals in the shape of a cross with numerous stamens and with a rounded or ovoid shaped pistil with several stigmas.
  • the petals are generally white, although they tend to have pink or violet tones, but always with a dark spot at the base.
  • Its fruits are globose and depressed capsules, topped by a lobed stigmatic crown and contain the seeds. These are very numerous and small, reniform and reticulated surface, and white to dark brown. The maturation of the capsules coincides with a high concentration of alkaloids.
  • opium poppy cultivation is carried out with two purposes: 1) to obtain straw, an important origin of pharmaceutical products; and 2) to obtain seed and oil both used in food and other industrial production processes.
  • the seed is marketed as The only product of local poppy cultivation.
  • both straw and seed have an important use and market value that increase the profitability of the crop.
  • Poppy plants also have a minor, though growing, importance as a decorative species and dried capsules are used in dried flower compositions, which has resulted in the development of specific cultivars for this purpose.
  • the females of /. Luteipes appear in the second half of March, and after sexual maturation, they place the poppy stalks during the month of April and beginning of May. After hatching, the larvae develop and feed in an endophytic manner inside the stems, causing serious damage to the vascular tissue, which leads to a reduction in production, and very often, in the weakening of the stem and the fall of plants. The larvae reach the state of pupa, and after harvesting, they remain in this state in the harvest remains, the main focus of infestation, until the following spring (Chevin H, Janvry GC, 1980. Phytoma 317, 20-21; Sedivy J , Chilar P. 2005. Plant Protect. Sci. 41,73-79).
  • Pest control The completely endophytic nature of eggs, larvae and pupae from /. Luteipes, which are not exposed during any stage in the external area of the plant, greatly limit the use of any control strategy, since it is necessary to access the interior of the plant, that is, to carry out systemic protection.
  • the possibility of using synthetic chemical insecticides of a systemic nature is very limited both economically and ecotoxicologically, and in the particular case of the opium poppy, the availability of such products is nil.
  • the chemical extraction processes of the alkaloids of interest in the harvested product require the absence of any trace of insecticides in the plant, which is complex when It is about systemic products. Therefore, because the chemical control of /. Luteipes is difficult, biological control methods are needed.
  • /. Luteipes is the phytophagous that causes the most important damage to the opium poppy (P. somniferum) in Spain.
  • the inventors have discovered an isolate of the fungus B. bassiana that, surprisingly, has the natural ability to endophytically colonize the plant, and within it, infect the larvae of /. luteipes and therefore can be used in the systemic protection of P. somniferum plants infested by the larvae of /. luteipes.
  • a culture of said B. bassiana isolate was deposited on July 30, 2008 in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with the accession number CECT 20744.
  • the present invention contributes not only to avoid problems environmental and economic associated with the use of systemic chemical insecticides, but also helps eliminate toxicological problems derived from the extraction of the alkaloids of interest from the crop, which require the absence of any trace of insecticides in the collected plant.
  • the invention relates to a microorganism of the Beauveria bassiana species, deposited in the CECT with the accession number CECT 20744 that has the ability to systemically protect the Papaver somniferum plant against insect attack. Iraella luteipes, or a mutant of said microorganism that maintains said ability to systemically protect a P. somniferum plant against the attack of /. luteipes.
  • a culture and a spore of said microorganism constitute a further aspect of this invention.
  • the invention relates to a composition comprising said microorganism in any of its forms.
  • the invention relates to a seed totally or partially coated with said microorganism in any of its forms.
  • the invention relates to a plant totally or partially coated with said microorganism in any of its forms.
  • the invention relates to the use of said microorganism in any of its forms to protect P. somniferum against /. luteipes.
  • the invention in another aspect, relates to a method of protecting a P. somniferum plant against /. luteipes, which comprises applying an effective amount of said microorganism in any of its forms, to the soil surrounding said plant or directly on the plant or on parts thereof.
  • the invention in another aspect, relates to a method of protecting P. somniferum against /. luteipes, which comprises sowing a seed of P. somniferum coated with any of the forms of said microorganism and cultivating it under conditions that allow the germination and development of the plant.
  • the invention in another aspect, relates to a method for reducing the larval population of /. luteipes, which comprises contacting said larva with an effective amount of said microorganism in any of its forms.
  • Figure IA is a photograph of a petri dish with larvae of /. B. bassiana infected luteipes.
  • Figure IB is a detail photograph of a larva of /. Luteipes infected by B. bassiana.
  • Figure 2 is a graph showing the flight curves of /. Luteipes from the end of March to the beginning of May during three agricultural campaigns (2005, 2006 and 2007).
  • Figure 3 is a graph showing the effect of the different forms of fungus inoculation in the plant on the number of larvae in the three agricultural campaigns.
  • the invention relates, in general, to a microorganism of the genus Beauveria (B. bassiana) with the ability to systemically protect the P. somniferum plant against insect attack.
  • luteipes which is the phytophagous that causes the most important damages in P. somniferum in Spain, due to the drilling activity of its larvae that live confined inside the plant's stem.
  • the invention relates to a microorganism, hereinafter microorganism of the invention, of the Beauveria bassiana species deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with access number CECT 20744, which has the ability to protect in a way systemic to the Papaver somniferum plant against Iraella luteipes or a mutant of said microorganism that maintains said ability to protect P. somniferum systemically against the attack of /. luteipes.
  • the expression "ability to systemically protect the P. somniferum plant against /. Luteipes" means that the microorganism of the invention is capable of attacking the larvae of said insect possibly present inside the plant. stem of a P.
  • the attack of the microorganism against larvae of /. Luteipes can be determined by any method that contacts the infective propagules of the fungus, conidia, with the phytophagous larvae, for example, obtaining a suspension of conidia of the fungus and submerging the larvae in different concentrations, as shown in Example 1
  • the ability of the microorganism of the invention to protect systemically to the P. somniferum plant against the attack of /. luteipes requires putting the microorganism in contact with the plant, either by applying it to the planting bed, either to the seeds, or to any phenological state of the P. somniferum culture and subsequently, at the time of collection, evaluate the number of larvae of /.
  • the microorganism of the invention is a mutant of said strain B. bassiana (CECT 20744) that maintains the ability to systemically protect the P. somniferum plant against insect attack. luteipes.
  • the term "mutant" includes any individual or organism resulting from a mutation or change in the DNA of a gene in an organism that results in a character (phenotype) that is not found in the wild type ( "wildype").
  • the microorganism of the invention has been isolated from a larva of /. Sick luteipes who had the characteristic symptoms associated with infection with myomoporeic asymptomatic asymptomatic. Briefly, the larva was superficially disinfested and placed in a humid chamber, with conditions of 100% relative humidity to promote the sapropophic growth epiapa of the fungus and the subsequent sporulation in the exerior of the larva. Later, we proceeded to isolate the fungus in the middle of malia-agar, from inoculum of the exerior of the larva, to promote its growth and development in plaque, in order to identify them by observation in the microscope of the characteristic structures that they form each type of fungus, as indicated in Example 1. The fungus identified was Beauveria bassiana and the isolate was deposited in the CECT, under the accession number CECT 20744.
  • a pure biologically culinary, as well as a spore of the microorganism of the invention, provides additional aspects of the present invention.
  • the invention relates to a composition, in advance, composition of the invention, comprising the microorganism of the invention, June with an acceptable agricultural vehicle.
  • Said composition of the invention may contain a population of microorganisms where at least one of them is the microorganism of the invention.
  • the composition of the invention can be used for the same purposes as the microorganism of the invention.
  • concentration of microorganism of the invention in the composition of the invention may vary within a wide range; however, in a particular embodiment it is preferred to use a conidia suspension of about 4 x 10 7 cfu / mi, although this aspect will largely depend on the type of application. In applications to the seed, it has been observed that a concentration ten times higher guarantees a greater number of seeds that receive fungal propagules.
  • the term "agriculturally acceptable vehicle” is used to indicate that said vehicle comprises a substance or combination of substances that can be used in the agricultural sector, and includes any liquid material or agriculturally acceptable solid that can be added and / or mixed with the microorganism of the invention, to put it in a simpler or improved application form, or with an applicable or desirable intensity of activation. Due to the nature of the active ingredient of the composition (the microorganism of the invention), said agriculturally acceptable vehicle must allow or not harm or compromise the viability of said microorganism.
  • the agricultural composition of the invention can be used either in solid form or in liquid form, for example, in the form of a wettable powder or an emulsifiable concentrate incorporating conventional diluents.
  • Such compositions can be obtained in a traditional manner, for example, by mixing the microorganism of the invention with a diluent and optionally with other formulation ingredients, such as those known to those skilled in the art.
  • the concentrated suspension could contain water (89.9%), wetting (0.1% w / w potassium soap), conidia of the microorganism of the invention (10% w / w) and the wettable powder would contain the conidia of the microorganism of the invention (10% w / w), kaolin (89.9%) and talc (0.1% w / w).
  • the agricultural composition of the invention can be formulated so as to be suitable for administration by spraying, dusting, or any other agricultural administration method known in the state of the art.
  • the agricultural composition of the invention could also contain other ingredients or constituents that are commonly used in the compositions. agricultural and that are known to the person skilled in the art, such as, but not limited to, solvents, active agents or pH regulators, fertilizers, etc., as long as they all allow or do not harm or compromise the viability of the microorganism provided by the present invention.
  • the invention relates to a seed of a plant totally or partially coated with the microorganism of the invention or with spores of the microorganism of the invention.
  • the seed is a seed of the P. somniferum plant.
  • the invention relates to a plant totally or partially coated with the microorganism of the invention or with spores of the microorganism of the invention.
  • the plant is a P. somniferum plant.
  • the invention relates to the use of the microorganism of the invention, its spores, a biologically pure culture of said microorganism of the invention or a composition of the invention, to protect P. somniferum against /. luteipes.
  • the invention in another aspect, relates to a method for the protection of a P. somniferum plant against /. luteipes, which comprises applying an effective amount of the microorganism of the invention, of a culture of said microorganism of the invention, of spores of the microorganism of the invention or of the composition of the invention, to the soil surrounding said plant, directly on the plant or on parts of it.
  • the application of said microorganism or composition is carried out by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the term "effective amount” refers to the amount sufficient to obtain the desired or beneficial results.
  • An effective amount can be administered at one time or in several administrations.
  • a "sufficient amount” is the amount necessary to alleviate, improve, stabilize, reverse, prevent, retard or delay the progression of plant growth stages of plant phytophages.
  • the invention in another aspect, relates to a method for the protection of a P. somniferum plant against /. luteipes comprising sowing a seed totally or partially coated with the microorganism of the invention or with a spore of said microorganism of the invention and cultivate it under conditions that allow the germination and development of the plant.
  • the invention relates to a method for reducing the larval population of /. luteipes, which comprises contacting said larva with an effective amount of a microorganism of the invention, with a spore of said microorganism of the invention, with a culture of said microorganism of the invention or with a composition containing the microorganism of the invention .
  • microorganism of the invention can be applied in different ways.
  • said microorganism can be applied by inoculation of the seed, while, in another particular embodiment, the microorganism of the invention can be applied by spraying in any part of the plant or in the planting bed.
  • the microorganism of the invention can be applied by immersing the seed or the plant in a suspension containing said microorganism. Said application methods are known to the person skilled in the art.
  • the larva was treated as follows: (1) it was superficially disinfected in a 1% solution of sodium hypochlorite in sterile distilled water for 1 minute, and 2 times, also during 1 minute, in sterile water; (2) it was placed in a humid chamber, with 100% relative humidity conditions to promote stage of saprotrophic growth of the fungus and subsequent sporulation outside the larva; and (3) the fungus was isolated in the middle of malt-agar, from inoculum outside the larva, to promote its growth and development in plaque, for identification purposes by microscopic observation of the characteristic structures They form each type of fungus. The fungus identified in this case was Beauveria bassiana. The identification of B.
  • bassiana was carried out following the reference manual Barnett, HL and Hunter, BB 1987. 4th edition. Collier Macmillan Publishers. London pp 218. It was also molecularly verified and the sequence of the region used to confirm B. bassiana was recorded in the GenBank (DQ364698). This identification was further corroborated by one of the world's leading specialists in Entomopathogenic Fungi systematics, Dr. Stanislaw Balazy, of the Research Center for Agricultural and Forest Environment PAS (Bukowska str. 19, 60-809 Poznan, Poland).
  • a culture of the isolate of B. bassiana EABb 04/01-Tip was deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with access number 20744 on July 30, 2008.
  • a bioassay of pathogenicity of B. bassiana in larvae of /. luteipes was performed by immersing the larvae in solutions with different concentrations, to which agricultural wetting agent (Tween® 80 / Polysorbate 80) was added to 0.01%. Once the larvae were treated, they were placed in petri dishes next to a piece of moistened filter to maintain the degree of humidity and favor the fungus infection process.
  • the inoculum of the EABb 04/01-Tip isolate from B. bassiana was obtained by growth in a rice substrate. For this, 100 g of rice and 200 ml of distilled water were added in 190 mm diameter and 30 mm high glass petri dishes. Then the plates were sterilized (12O 0 C for 20 minutes) and inoculated with a conidia suspension of 10 8 conidia / ml, which were incubated at 25 0 C for 15 days, at which time the culture was well sporulated .
  • topical inoculation and seed inoculation have been shown to be the most effective methods of inoculation of B. bassiana in corn, while in others, such as in plantain, the most efficient was topical inoculation.
  • any method of inoculation could be used to reduce insect infection, although it seems that seed inoculation requires less inoculum, so that application costs and environmental impact are reduced.
  • the strain of the fungus B. bassiana EABb 04/01-Tip (CECT 20744) can be used alone or in combination with a chemical aimed at adult insects. The chemical could provide an immediate reduction of insect infection, while the fungal strain could provide continuous control.

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Abstract

La invención se relaciona con un microorganismo de la especie Beauveria bassiana con capacidad para proteger de forma sistémica a la planta Papaver somniferum frente al ataque del insecto Iraella luteipes o un mutante de dicho microorganismo que mantiene dicha capacidad de proteger de forma sistémica a una planta frente al ataque de I. luteipes.

Description

CEPA DE BEAUVERIA BASSIANA Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con una cepa de Beauveria bassiana, con capacidad para infectar de forma natural larvas del himenóptero cinípido Iraella luteipes (Thompson), y con su empleo en la protección sistémica de plantas de Papaver somniferum frente a este fitófago.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Papaver somniferum
La adormidera (Papaver somniferum L.) es una de las plantas cultivadas más importantes para la industria farmacéutica, ya que constituye la única fuente de alcaloides como la morfina, codeína y tebaína, que son ampliamente utilizados en medicina como analgésicos, antitusivos y antiespasmódicos.
La adormidera es una planta herbácea, anual, con una fase vegetativa distintiva caracterizada por grandes y numerosas hojas pinnadas que se distribuyen en forma de roseta, y una etapa reproductiva durante la que florecen los brotes de los tallos. La raíz es pivotante y profunda, y el tallo erguido, robusto, poco ramificado y de hasta 1,60 m de altura. Las hojas abrazan el tallo por su base y son alternas, sentadas, grandes, lobuladas, lampiñas, de color verde claro y con nervaduras prominentes en el envés. Las flores son terminales y solitarias, compuestas de un cáliz de dos sépalos lampiños que se desprenden al abrirse la flor, y por una corola de cuatro pétalos en forma de cruz con numerosos estambres y con un pistilo de forma redondeada u ovoidea con varios estigmas. Los pétalos son generalmente blancos, aunque suelen tener tonalidades rosas o violáceas, pero siempre con una mancha oscura en la base. Sus frutos son cápsulas globosas y deprimidas, rematadas por una corona estigmática lobulada y contienen a las semillas. Éstas son muy numerosas y pequeñas, reniformes y de superficie reticulada, y color blanco a pardo oscuro. La maduración de las cápsulas coincide con una elevada concentración de alcaloides. En países de la zona templada, el cultivo de la adormidera se realiza con dos propósitos: 1) para la obtención de paja, importante origen de productos farmacéuticos; y 2) para obtención de semilla y aceite ambos utilizados en alimentación y otros procesos industriales de producción. En algunos países, la semilla se comercializa como el único producto del cultivo local de adormidera. Sin embargo, tanto la paja como la semilla tienen un importante uso y valor de mercado que aumentan la rentabilidad del cultivo.
Las plantas de adormidera también tienen una importancia menor, aunque creciente, como especie decorativa y las cápsulas secas se usan en las composiciones de flores secas, lo que ha dado lugar al desarrollo de cultivares específicos para este fin.
Iraella luteipes
El himenóptero cinípido Iraella luteipes (Thompson) (=Timaspis papaveris Kieffer en "Goury and Guignon 1905") [Goury, G., and J. Guignon 1905. Feuill. J. Nat. 200-2003], es el fitófago que ocasiona los daños más importantes a la adormidera (Papaver somniferum) en España, debido a la actividad barrenadora de sus larvas que viven confinadas en el interior del tallo de la planta.
Las hembras de /. luteipes aparecen en la segunda mitad de marzo, y tras la maduración sexual, realizan la puesta en los tallos de la adormidera durante el mes de abril y comienzos de mayo. Tras la eclosión, las larvas se desarrollan y se alimentan de forma endófita en el interior de los tallos, causando graves daños en el tejido vascular, que desembocan en una reducción de producción, y con mucha frecuencia, en el debilitamiento del tallo y la caída de plantas. Las larvas alcanzan el estado de pupa, y tras la recolección, permanecen en este estado en los restos de cosecha, foco principal de infestación, hasta la primavera siguiente (Chevin H, Janvry GC, 1980. Phytoma 317, 20-21; Sedivy J, Chilar P. 2005. Plant Protect. Sci. 41,73-79).
Control de plagas La naturaleza completamente endófita de huevos, larvas y pupas de /. luteipes, que no se exponen durante ninguna etapa en la zona externa de la planta, limita enormemente el empleo de cualquier estrategia de control, pues es necesario acceder al interior de la planta, esto es, llevar a cabo una protección sistémica. La posibilidad de utilizar insecticidas químicos de síntesis de naturaleza sistémica esta muy limitada tanto desde el punto de vista económico, como ecotoxicológico, y en el caso particular de la adormidera, la disponibilidad de tales productos es nula. Además, los procesos de extracción química de los alcaloides de interés en el producto cosechado requieren la ausencia de cualquier traza de insecticidas en la planta, lo que es complejo cuando se trata de productos sistémicos. Por tanto, debido a que el control químico de /. luteipes es difícil, se necesitan métodos de control biológico. Entre los agentes más importantes para el control biológico de insectos fitófagos se encuentran los hongos entomopatógenos, entre los que destacan los ascomicetos mitospóricos, y dentro de ellos el género Beauveria, que se ha aislado de forma natural de un amplio número de géneros de insectos dañinos de gran importancia en Agricultura (Zimmermann, G. 2007. Biocontrol Sci. I cchn. 17: 553-596).
Trabajos previos han revelado la existencia de un aislado del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana, que infecta de forma natural a las larvas del cinípido /. luteipes. Técnicas microbio lógicas, moleculares y de microscopía electrónica mostraron que esta cepa del hongo B. bassiana era capaz de establecerse endofític amenté en la adormidera (Quesada-Moraga et al 2006; Mycopathologia 161(5):323-329). Aunque se ha revelado que B. bassiana puede colonizar endo ñucamente hasta catorce especies diferentes de plantas (Vega F, 2008. J. Invertebr. Pathol. 98: 277-279), hasta la fecha, el único caso real en condiciones de campo donde se ha constatado protección sistémica de un cultivo frente al ataque de fitófagos ha sido el maíz, donde una cepa de B. bassiana se mostró eficaz frente al ataque de barrenadores del tallo (Bing et al, 1991. Vuill. Environ. Entomol. 1207-1211; Cherry et al, 2004. Int. J. Pest Manag. 50: 67-73).
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Como se ha mencionado, /. luteipes es el fitófago que ocasiona los daños más importantes a la adormidera (P. somniferum) en España. Los inventores han descubierto un aislado del hongo B. bassiana que, sorprendentemente, posee la capacidad natural de colonizar endofíticamente a la planta, y dentro de ella, infectar a las larvas de /. luteipes y por tanto se puede emplear en la protección sistémica de las plantas de P. somniferum infestadas por las larvas de /. luteipes. Un cultivo de dicho aislado de B. bassiana fue depositado el día 30 de julio de 2008 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 20744. De este modo, la presente invención contribuye no sólo a evitar los problemas medioambientales y económicos asociados con el uso de insecticidas químicos sistémicos, sino que, además, contribuye a eliminar los problemas toxicológicos derivados de la extracción de los alcaloides de interés de la cosecha, que requieren la ausencia de traza alguna de insecticidas en la planta recogida.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo de la especie Beauveria bassiana, depositado en la CECT con el número de acceso CECT 20744 que tiene la capacidad de proteger de forma sistémica a la planta Papaver somniferum frente al ataque del insecto Iraella luteipes, o un muíante de dicho microorganismo que mantiene dicha capacidad de proteger de forma sistémica a una planta de P. somniferum frente al ataque de /. luteipes. Un cultivo y una espora de dicho microorganismo constituyen un aspecto adicional de esta invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende dicho microorganismo en cualquiera de sus formas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una semilla recubierta total o parcialmente con dicho microorganismo en cualquiera de sus formas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta recubierta total o parcialmente con dicho microorganismo en cualquiera de sus formas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicho microorganismo en cualquiera de sus formas para proteger P. somniferum frente a /. luteipes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para proteger una planta de P. somniferum frente a /. luteipes, que comprende aplicar una cantidad eficaz de dicho microorganismo en cualquiera de sus formas, al suelo que rodea dicha planta o directamente sobre la planta o sobre partes de la misma.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para proteger P. somniferum frente a /. luteipes, que comprende sembrar una semilla de P. somniferum recubierta con cualquiera de las formas de dicho microorganismo y cultivarla bajo condiciones que permiten la germinación y desarrollo de la planta.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para reducir la población larvaria de /. luteipes, que comprende poner en contacto dicha larva con una cantidad eficaz de dicho microorganismo en cualquiera de sus formas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura IA es una fotografía de una placa petri con larvas de /. luteipes infectadas por B. bassiana. La Figura IB es una fotografía del detalle de una larva de /. luteipes infectada por B. bassiana. La Figura 2 es una gráfica que muestra las curvas de vuelo de /. luteipes desde finales de marzo a principios de mayo durante tres campañas agrícolas (2005, 2006 y 2007).
La Figura 3 es una gráfica que muestra el efecto de las diferentes formas de inoculación del hongo en la planta sobre el número de larvas en las tres campañas agrícolas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona, en general, con un microorganismo del género Beauveria (B. bassiana) con capacidad para proteger de forma sistémica a la planta P. somniferum frente al ataque del insecto /. luteipes, que es el fitófago que ocasiona los daños más importantes en P. somniferum en España, debido a la actividad barrenadora de sus larvas que viven confinadas en el interior del tallo de la planta.
En un aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo, en adelante microorganismo de la invención, de la especie Beauveria bassiana depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 20744, que tiene la capacidad de proteger de forma sistémica a la planta Papaver somniferum frente a Iraella luteipes o un muíante de dicho microorganismo que mantiene dicha capacidad de proteger de forma sistémica a P. somniferum frente al ataque de /. luteipes. Tal como aquí se utiliza, la expresión "capacidad de proteger de forma sistémica a la planta P. somniferum frente a /. luteipes" significa que el microorganismo de la invención es capaz de atacar a las larvas de dicho insecto eventualmente presentes en el interior del tallo de una planta de P. somniferum y provocar la muerte de dichas larvas, reduciéndose de este modo el número de larvas viables y, en consecuencia, protegiendo a la planta de P. somniferum, en su conjunto, frente a dicho insecto /. luteipes, tal como se pone de manifiesto en la Tabla 1 (Ejemplo 1), en la que se muestra la relación directa entre dosis del hongo y mortalidad de larvas de /. luteipes, que osciló entre el 65,0% y el 97,5%.
El ataque del microorganismo frente a larvas de /. luteipes puede determinarse por cualquier método que ponga en contacto los propágulos infectivos del hongo, conidias, con las larvas del fitófago, por ejemplo, obteniendo una suspensión de conidias del hongo y sumergiendo las larvas en diferentes concentraciones, tal como se muestra en el Ejemplo 1. La capacidad del microorganismo de la invención de proteger de forma sistémica a la planta P. somniferum frente al ataque de /. luteipes requiere poner en contacto el microorganismo con la planta, bien mediante su aplicación al lecho de siembra, bien a las semillas, o bien a cualquier estado fenológico del cultivo de P. somniferum y posteriormente, en el momento de la recolección, evaluar el número de larvas de /. luteipes presentes en los tallos. Como se pone de manifiesto en el Ejemplo 2(c), el tratamiento con B. bassiana tuvo un efecto significativo en la disminución del número de larvas por planta, provocando una reducción comprendida entre el 36,5% y el 73,4%, dependiendo del tipo de aplicación del hongo y de la campaña agrícola, pues la población del fitófago creció a lo largo de las tres campañas de estudio. En una realización particular, el microorganismo de la invención, es un muíante de dicha cepa B. bassiana (CECT 20744) que mantiene la capacidad de proteger de forma sistémica a la planta P. somniferum frente al ataque del insecto /. luteipes. Tal como aquí se utiliza, el término "muíante" incluye a cualquier individuo u organismo resultaníe de una muíación o cambio en el ADN de un gen de un organismo que da como resulíado un carácíer (fenotipo) que no se encueníra en el tipo salvaje ("wild- íype").
El microorganismo de la invención ha sido aislado a partir de una larva de /. luteipes enferma que preseníaba los síntomas caracíerísíicos asociados a la infección con ascomiceíos miíospóricos eníomopaíógenos. Brevemeníe, la larva fue desinfesíada superficialmeníe y colocada en una cámara húmeda, con condiciones de 100% de humedad relaíiva para promover la eíapa de crecimienío sapróírofo del hongo y la posíerior esporulación en el exíerior de la larva. Posíeriormeníe, se procedió a aislar el hongo en medio de malía-agar, a partir de inoculo del exíerior de la larva, para promover su crecimienío y desarrollo en placa, con el fin de identificarlos medianíe la observación en el microscopio de las estructuras caracíerísíicas que forman cada íipo de hongos, íal como se indica en el Ejemplo 1. El hongo identificado fue Beauveria bassiana y el aislado fue deposiíado en la CECT, bajo el número de acceso CECT 20744.
Un culíivo biológicameníe puro, así como una espora del microorganismo de la invención consíiíuyen aspectos adicionales de la preseníe invención.
En oíro aspecto, la invención se relaciona con una composición, en adelaníe, composición de la invención, que comprende el microorganismo de la invención, junio con un vehículo agrícolameníe acepíable. Dicha composición de la invención puede contener una población de microorganismos donde, al menos, uno de ellos es el microorganismo de la invención. La composición de la invención puede ser utilizada para los mismos fines que el microorganismo de la invención.
La concentración de microorganismo de la invención en la composición de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular se prefiere utilizar una suspensión de conidias de alrededor de 4 x 107 u.f.c/ mi, aunque este aspecto dependerá en gran medida del tipo de aplicación. En aplicaciones a la semilla, se ha observado que una concentración diez veces superior garantiza un mayor número de semillas que reciben propágulos fúngicos. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "vehículo agríco lamente aceptable" se utiliza para indicar que dicho vehículo comprende una sustancia o combinación de sustancias que puede(n) ser utilizada(s) en el sector agrícola, e incluye cualquier material líquido o sólido agrícolamente aceptable que pueda añadirse y/o mezclarse con el microorganismo de la invención, para ponerlo en una forma de aplicación más sencilla o mejorada, o bien con una intensidad de activación aplicable o deseable. Debido a la naturaleza del ingrediente activo de la composición (el microorganismo de la invención), dicho vehículo agrícolamente aceptable tiene que permitir o no perjudicar ni comprometer la viabilidad de dicho microorganismo.
La composición agrícola de la invención puede emplearse bien en forma sólida o bien en forma líquida, por ejemplo, en forma de un polvo humectable o de un concentrado emulsionable que incorpora los diluyentes convencionales. Dichas composiciones pueden obtenerse de manera tradicional, por ejemplo, mezclando el microorganismo de la invención con un diluyente y opcionalmente con otros ingredientes de formulación, como los conocidos por el experto en la materia. Preferiblemente, la suspensión concentrada podría contener agua (89,9%), mojante (jabón potasio 0,1% p/p), conidias del microorganismo de la invención (10% p/p) y el polvo humectable contendría las conidias del microorganismo de la invención (10% p/p), caolín (89,9%) y talco (0,1% p/p).
La composición agrícola de la invención puede formularse de manera que resulte apta para su administración por pulverización, espolvoreo, o cualquier otro procedimiento de administración agrícola conocido en el estado de la técnica.
La composición agrícola de la invención podría contener, además, otros ingredientes o constituyentes que son empleados habitualmente en las composiciones agrícolas y que son conocidas por el experto en la materia, tales como, pero no limitadas a, solventes, agentes activos o reguladores de pH, fertilizantes, etc., siempre y cuando todos ellos permitan o no perjudiquen ni comprometan la viabilidad del microorganismo proporcionado por la presente invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con una semilla de una planta recubierta total o parcialmente con el microorganismo de la invención o con esporas del microorganismo de la invención. En una realización particular, la semilla es una semilla de la planta P. somniferum.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con una planta recubierta total o parcialmente con el microorganismo de la invención o con esporas del microorganismo de la invención. En una realización particular, la planta es una planta de P. somniferum.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del microorganismo de la invención, sus esporas, un cultivo biológicamente puro de dicho microorganismo de la invención o una composición de la invención, para proteger P. somniferum frente a /. luteipes.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la protección de una planta de P. somniferum frente a /. luteipes, que comprende aplicar una cantidad eficaz del microorganismo de la invención, de un cultivo de dicho microorganismo de la invención, de esporas del microorganismo de la invención o de la composición de la invención, al suelo que rodea a dicha planta, directamente sobre la planta o sobre partes de la misma. La aplicación de dicho microorganismo o composición se lleva a cabo por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad suficiente para obtener los resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una sola vez o en varias administraciones. En términos de tratamiento y protección, una "cantidad suficiente" es la cantidad necesaria para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, impedir, retardar o retrasar la progresión de estadios de desarrollo de los fitófagos de las plantas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la protección de una planta de P. somniferum frente a /. luteipes que comprende sembrar una semilla recubierta total o parcialmente con el microorganismo de la invención o con una espora de dicho microorganismo de la invención y cultivarla bajo condiciones que permitan la germinación y el desarrollo de la planta. Estas etapas se llevan a cabo por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
El insecto /. luteipes es causante de grandes pérdidas en la cosecha de la adormidera (P. somniferum), debido a la actividad de sus larvas que viven confinadas en el interior del tallo de la planta. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para reducir la población larvaria de /. luteipes, que comprende poner en contacto dicha larva con una cantidad eficaz de un microorganismo de la invención, con una espora de dicho microorganismo de la invención, con un cultivo de dicho microorganismo de la invención o con una composición que contenga el microorganismo de la invención.
El microorganismo de la invención puede ser aplicado de distintas maneras. En una realización particular, dicho microorganismo se puede aplicar por inoculación de la semilla, mientras que, en otra realización particular el microorganismo de la invención de puede aplicar por pulverización en cualquier parte de la planta o en el lecho de siembra. Asimismo, en otra realización particular, el microorganismo de la invención se puede aplicar por inmersión de la semilla o de la planta en una suspensión que contiene dicho microorganismo. Dichos métodos de aplicación son conocidos por el experto en la materia. A continuación se describen algunos ejemplos ilustrativos que ponen de manifiesto las características y ventajas de la invención; no obstante, no se deben considerar como limitativos del objeto de la invención.
EJEMPLO 1 Aislamiento y caracterización de B. bassiana EABb 04/01-Tip (CECT 20744)
En la campaña agrícola 2003/2004, se observó en restos de adormidera recogidos en la finca "El Pino" en el término de Écija (Sevilla) una larva de /. luteipes enferma que presentaba los síntomas característicos asociados a la infección con ascomicetos mitospóricos entomopatógenos. Con el fin de esclarecer el agente causante de tal sintomatología, la larva fue tratada de la siguiente forma: (1) fue desinfestada superficialmente en una disolución al 1% de hipoclorito sódico en agua destilada estéril durante 1 minuto, y 2 veces, también durante 1 minuto, en agua estéril; (2) se colocó en una cámara húmeda, con condiciones de 100% de humedad relativa para promover la etapa de crecimiento saprótrofo del hongo y la posterior esporulación en el exterior de la larva; y (3) se procedió a aislar el hongo en medio de malta-agar, a partir de inoculo del exterior de la larva, para promover su crecimiento y desarrollo en placa, a efectos de identificación mediante la observación en el microscopio de las estructuras características que forman cada tipo de hongos. El hongo identificado en este caso fue Beauveria bassiana. La identificación de B. bassiana fue llevada a cabo siguiendo el manual de referencia Barnett, H. L. y Hunter, B. B. 1987. 4th edition. Collier Macmillan Publishers. London. pp 218. Asimismo, fue constatado molecularmente y la secuencia de la región utilizada para confirmar B. bassiana fue registrada en el GenBank (DQ364698). Dicha identificación fue corroborada además por uno de los mayores especialistas mundiales en sistemática de Hongos Entomopatógenos, el Dr. Stanislaw Balazy, del Research Centre for Agricultural and Forest Environment PAS (Bukowska str. 19, 60-809 Poznan, Polonia).
Un cultivo del aislado de B. bassiana EABb 04/01-Tip fue depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso 20744 el día 30 de julio de 2008.
Para determinar la respuesta del insecto a la acción del hongo (postulados de Koch), se planteó la realización de un bioensayo de patogeneicidad de B. bassiana en larvas de /. luteipes. En primer lugar, se procedió a la obtención de una suspensión de conidias procedentes del aislado obtenido de la larva original de /. luteipes enferma. La suspensión se tituló utilizando el método de la cámara de Malassez. A partir de la suspensión madre se obtuvieron las diferentes dosis empleadas en el bioensayo. En dicho bioensayo se utilizaron larvas procedentes de plantas atacadas por el insecto sin determinar su estadio. La administración del hongo se realizó sumergiendo las larvas en las soluciones con distintas concentraciones, a las cuales se les añadió mojante agrícola (Tween® 80/ Polisorbato 80) al 0,01%. Una vez tratadas las larvas, éstas se colocaron en placas petri junto a un trozo de filtro humedecido para mantener el grado de humedad y favorecer el proceso de infección del hongo.
Cuatro grupos de 40 larvas (divididos en 4 repeticiones de 10 larvas) fueron tratados con dosis crecientes del hongo: l ,5xlθ4 conidias/ml; l,5xlθ5 conidias/ml; 1,5x106 conidias/ml y 1,5x107 conidias/ml. Otro grupo de 40 larvas (dividido en 4 repeticiones de 10 larvas) se utilizó como testigo, tratándose únicamente con agua y el mojante (Tween® 80/ Polisorbato 80). Como se observa en las Figuras IA y IB, el hongo posee capacidad para infectar las larvas de /. luteipes. En la Tabla 1 se muestra la relación directa dosis-mortalidad, que osciló del 65,0% al 97,5%, e inversa dosis-tiempo letal, que osciló entre 2 y 3 días.
Tabla 1. Evolución de la mortalidad de larvas de Iraella luteipes causada por el aislado EABb 04/01-Tip de B. bassiana (CECT 20744)
Dosis Hongo Repetición Mortalidad por días
(conidias/ml) 10/6/04 11/6/04 13/6/04 14/6/04
Testigo 1 0 0 1 0
2 0 0 0 0
3 0 0 1 0
4 0 0 0 0 l,5xlθ4 1 0 0 6 2
2 0 0 3 1
3 0 0 7 0
4 0 0 6 1 l,5xlθ5 1 0 0 2 0
2 0 0 10 0
3 0 0 8 0
4 0 0 6 0
1,5x10° 1 1 0 5 2
2 0 0 10 0
3 0 0 10 0
4 0 1 8 0
1,5x10' 1 0 1 6 2
2 0 4 6 0
3 0 1 9 0
4 0 4 6 0
EJEMPLO 2 Control de /. luteipes en P. somniferum mediante B. bassiana EABb 04/01-Tip
(CECT 20744)
1. MATERIALES Y MÉTODOS (a) Producción de conidias
El inoculo del aislado EABb 04/01-Tip de B. bassiana (CECT 20744) se obtuvo mediante crecimiento en un sustrato de arroz. Para ello, se añadieron 100 g de arroz y 200 mi de agua destilada en placas petri de cristal de 190 mm de diámetro y 30 mm de alto. A continuación, las placas se esterilizaron (12O0C durante 20 minutos) y se inocularon con una suspensión de conidias de 108 conidias/ml, que se incubaron a 250C durante 15 días, momento en el que el cultivo estaba bien esporulado. Llegado este momento se eliminó la humedad de las placas mediante exposición a 150C y 60% de humedad relativa, y cuando se detectó que las placas estaban secas, se procedió a recolectar las conidias del hongo con la ayuda de una espátula, lo que proporcionó un producto pulverulento, que constituyó la base para la posterior inoculación de las semillas de P. somniferum. La suspensión de conidias usadas para el ensayo se ajustó diluyendo las conidias en Tween® 80 (Polisorbato 80) al 0,01% hasta una concentración final de 4,IxIO7 u.f.c./ml (unidades formadoras de colonias/ mi)
(b) Inoculación de semillas de P. somniferum La inoculación de las semillas de P. somniferum se realizó mediante el empleo de una máquina de tratamiento de semillas vía húmeda, donde se obtuvo una suspensión de conidias de B. bassiana EABb 04/01-Tip (CECT 20744) en agua de 1x108 conidias/ml aproximadamente, que se aplicó por vía húmeda a las semillas en una tratadora-mezcladora de laboratorio nebulizando con aerógrafo directamente la suspensión sobre las semillas de P. somniferum en movimiento, de manera que la aplicación fuera lo más homogénea posible.
(c) Evaluación de la protección de P. somniferum
Diseño experimental Para evaluar la protección de plantas de P. somniferum frente a /. luteipes por acción de B. bassiana EABb 04/01-Tip (CECT 20744), las conidias de B. bassiana se pusieron en contacto con las plantas de P. somniferum. El ensayo consistió en 4 tratamientos con diferentes maneras de aplicación del hongo: (i) por incorporación al suelo antes de la siembra, (ii) por aplicación a las semillas, (iii) por pulverización de la planta en estado de roseta y (iv) testigo sin tratamiento (Tabla 2). Los ensayos se llevaron a cabo en la finca "La Proveedora", en Écija (Sevilla), siendo la unidad experimental elegida una parcela rectangular de 20 m2 (2 m x 10 m) de superficie. Se realizaron 4 repeticiones por tratamiento y testigo, con disposición en bloques al azar. El experimento se repitió tres veces durante las tres campañas agrícolas 2004/05, 2005/06 y 2006/07. Tabla 2. Tratamientos con B. bassiana EABb 04/01-Tip en la campañas 2004/2005;
2005/2006 y 2006/2007 Tratamiento Dosis (esporas/ml) Descripción
Testigo 0 Sembradora manual a chorrillo
Suelo 1,3 x 107 Pulverizador Europulvé volumen y presión controlados
Semilla 1,05 x 10 Pulverización vía húmeda con aerógrafo
Roseta (2-4 hojas
6,IxIO7 Pulverizador Europulvé volumen y presión controlados verdaderas)
Monitorización de la población de /. luteipes Con el fin de detectar la presencia del fitófago y la evolución de sus poblaciones, se colocaron cinco trampas cromáticas con una solución que contenía un detergente al 1%, dispuestas en los cuatro vértices y en el centro de la parcela. De acuerdo con estudios anteriores (Goerlich et al., 1997. Trabajo Profesional Fin de Carrera. Universidad de Córdoba), el comienzo del periodo de vuelo del insecto tiene lugar aproximadamente durante la última semana de Marzo. Por ello, las trampas se colocaron el día 1 de Marzo. Se recogieron muestras de las trampas cada dos días y se procedió a la cuantificación del número de larvas de /. luteipes.
Recolección de datos El efecto del tratamiento en la incidencia de la infección se analizó recogiendo muestras de 20 plantas al azar. Los tallos se cortaron longitudinalmente y se contaron el número de larvas total por planta. Los datos recogidos del número de larvas, así como el de insectos adultos, se analizaron estadísticamente utilizando un programa informático (ANOVA).
2. RESULTADOS
El vuelo de /. luteipes en la finca "La Proveedora" se inició a mediados de Abril en el año 2005, a principios de Abril en 2006 y a finales de Marzo en 2007 (Figura 2). La progresión del brote del insecto no fue uniforme durante las tres campañas, con diferencias importantes en la duración del periodo de despunte del himenóptero, que duró 16, 20 y 41 días en 2005, 2006 y 2007 respectivamente (Figura 2). Además, la población del himenóptero aumentó de forma sucesiva durante las tres campañas agrícolas, con el máximo número de adultos capturados en el año 2007 (Figura 2). El aumento progresivo en la población de /. luteipes a lo largo de las tres campañas se correspondía con un aumento en paralelo de la infestación de las larvas en la planta, con una media de número de larvas por planta en las plantas control de 4,1 ± 0,6 en 2005, 25,9 ± 1,8 en 2006 y 119,8 ± 4,0 en 2007 (Figura 3). Sin embargo, en las tres campañas, el tratamiento con B. bassiana tuvo un efecto significativo en la disminución del número de larvas por planta, presentando un número más pequeño de larvas las plantas inoculadas que el control (Figura 3). En la campaña de 2005, los tres métodos de inoculación fueron estadísticamente similares en cuanto a la reducción del número de larvas por planta, con una reducción de entre el 36,5% y el 58,5% con respecto a los controles. En la campaña de 2006, la inoculación en suelo, en la semilla y la aplicación tópica en el estado de roseta fueron equivalentes, mostrando reducciones de 64,4% -73,4%, comparando con las plantas control. Sin embargo, las tres formas de aplicación fueron mejores que la aplicación tópica en el tallo. Finalmente, en la campaña de 2007, todos los métodos de inoculación fueron estadísticamente similares en la reducción del número de larvas por planta, con una reducción con respecto a los controles de 51,9%- 57,2% (Figura 3).
En general, no se observaron efectos adversos por la inoculación de B. bassiana ni en los parámetros de crecimiento de la plantas ni en los parámetros de rendimiento.
3. CONCLUSIONES
Este ejemplo pone de manifiesto que el tratamiento de las plantas de adormidera con el aislado EABb 04/01-Tip de B. bassiana (CECT 20744), durante las tres campañas agrícolas estudiadas, redujo considerablemente el número de larvas de /. luteipes, lo que confirma el potencial uso como agente de control biológico de dicho microorganismo en P. somniferum.
Los resultados de este estudio indican que la aplicación de B. bassiana EABb
04/01-Tip (CECT 20744), tanto en el suelo, en la semilla, como en la planta en estado de roseta, fueron estadísticamente equivalentes, reduciendo el número de larvas comparado con el control, con reducciones del 36,5- 58,5%, 64,4- 73,4% y 51,9- 57,2% en 2005, 2006 y 2007, respectivamente.
En algunos casos, la inoculación tópica y la inoculación de semillas han mostrado ser los métodos más efectivos de inoculación de B. bassiana en maíz, mientras que en otros, como en el plátano, la más eficiente fue la inoculación tópica. En el caso de la invención, se puede concluir que cualquier método de inoculación se podría utilizar para reducir la infección del insecto, aunque parece ser que la inoculación de la semilla requiere menor cantidad de inoculo, de manera que se reducen los costes de la aplicación y el impacto ambiental. Dependiendo de la incidencia de la infección y del valor económico, la cepa del hongo B. bassiana EABb 04/01-Tip (CECT 20744) se puede utilizar sola o en combinación con un producto químico dirigido a los insectos adultos. El producto químico podría proporcionar una reducción inmediata de la infección del insecto, mientras que la cepa fúngica podría proporcionar un control continuo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo de la especie Beauveria bassiana depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso 20744, con capacidad para proteger de forma sistémica a la planta Papaver somniferum frente al ataque del insecto Iraella luteipes o un muíante de dicho microorganismo que mantiene dicha capacidad de proteger de forma sistémica a una planta frente al ataque de /. luteipes.
2. Un cultivo biológicamente puro de un microorganismo según la reivindicación 1.
3. Una espora de un microorganismo según la reivindicación 1.
4. Una composición que comprende un microorganismo según la reivindicación 1, un cultivo según la reivindicación 2, o una espora según la reivindicación 3, y un vehículo agrícolamente aceptable.
5. Una semilla recubierta total o parcialmente con un microorganismo según la reivindicación 1 o con una espora según la reivindicación 3.
6. Semilla según la reivindicación 5, en donde dicha semilla es una semilla de Papaver somniferum.
7. Una planta recubierta total o parcialmente con un microorganismo según la reivindicación 1 o con una espora según la reivindicación 3.
8. Planta según la reivindicación 7, en donde dicha planta es una planta de Papaver somniferum.
9. Uso de un microorganismo según la reivindicación 1, de un cultivo según la reivindicación 2, de una espora según la reivindicación 3, o de una composición según la reivindicación 4, para proteger Papaver somniferum frente a Iraella luteipes.
10. Un método para proteger una planta de Papaver somniferum frente a Iraella luteipes, que comprende aplicar una cantidad eficaz de un microorganismo según la reivindicación 1, de un cultivo según la reivindicación 2, de una espora según la reivindicación 3, o de una composición según la reivindicación 4 al suelo que rodea dicha planta o directamente sobre la planta o partes de la misma.
11. Un método para proteger una planta de Papaver somniferum frente a Iraella luteipes, que comprende sembrar una semilla según la reivindicación 6 y cultivarla bajo condiciones que permiten la germinación y desarrollo de la planta.
12. Un método para reducir la población larvaria de Iraella luteipes, que comprende poner en contacto dicha larva con una cantidad eficaz de un microorganismo según la reivindicación 1 , de un cultivo según la reivindicación 2, de una espora según la reivindicación 3, o de una composición según la reivindicación 4.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 12, en el que la aplicación de dicho microorganismo según la reivindicación 1, de un cultivo según la reivindicación 2, de una espora según la reivindicación 3, o de una composición según la reivindicación 4, se realiza mediante inoculación, pulverización o inmersión.
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