WO2010076361A1 - Cuerpos de inclusión, células bacterianas y composiciones que los contienen y sus usos - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to inclusion bodies, bacterial cells and compositions containing them and their use as medicaments and cell proliferation stimulators and tissue regenerators.
- IBs Bacterial inclusion bodies
- IBs Bacterial inclusion bodies
- They are deposits of highly pure proteins produced in recombinant bacteria 1 . Being insoluble in water, they are observed as porous and highly hydrated amorphous particles in the size range of several hundred nanometers.
- the polypeptide chains that form the IBs are folded into an amyloid-like molecular structure compatible with their native structure, thereby maintaining the biological activities of the included polypeptides (eg, fluorescence or enzymatic activity). Therefore, after their proper handling, a wide spectrum of potential uses of IBs as functional and biocompatible materials arises. Although theoretically feasible by adjusting genetic and production conditions, the biophysical characteristics of these proteinaceous particles, such as activity and size, have never been manipulated.
- IBs nanoscale properties of IBs are characterized as new particulate materials and the extent to which the particles produced can be designed using simple strategies is explored.
- modified surfaces have been obtained with inclusion bodies that stimulate Significantly proliferating mammalian cells, demonstrating the potential of IBs in tissue manipulation and regenerative medicine among other promising biomedical applications.
- Many recombinant polypeptides produced in genetically modified bacteria aggregate as IBs. These protein deposits appear as highly hydrated particles found in bacterial cytoplasm 2 or, in some cases, in periplasm 3 .
- the IBs are chemically pure, since the recombinant protein itself is the main component - to about 95% of the total protein - 2 '4' 5.
- IBs RNA, DNA and lipids are trapped during the formation of IB and are present in smaller amounts 6 .
- the formation of IBs is a fast and efficient process, as observed after a few minutes of induction of gene expression. Several hours later, they can easily represent around 50% of the total cell biomass 5 .
- IBs were formed by unfolded or widely misfolded polypeptide chains and, therefore, biologically inert, recent observations, they present these particles as constituted by protein species that fold correctly and, therefore, , are biofunctional 8 .
- the molecular structure of IBs is based on a particular organization of amyloid - 9 '10 which allows cross - beta sheet interactions with coexisting domains correctly folded proteins 11.
- enzyme-formed IBs can be useful catalysts in different types of bioprocesses as recently observed for ⁇ -galactosidase, D-amino acid oxidase, maltodextrin phosphorylase, sialic acid aldolase and polyphosphate kinase 11 15 , among others.
- its in vivo formation which involves the deposition of proteins dependent on the sequence around nucleation centers, it is regulated by several cellular genes (which mainly encode proteases and chaperones that act as a functional network, which allows the manipulation of their nanoscale properties) 16 '".
- IBs determine the most relevant characteristics of IB as nanoparticles and test that can be designed by genetic manipulation and the appropriate process of the producing bacteria.As they are fully biocompatible and mechanically stable materials, IBs have also been used as nanoparticles to modify the roughness of the surfaces for the stimulation of mammalian cell proliferation Since essentially any species of protein can be produced as bacterial IBs and their nanoscale properties can be easily adjusted, the functional possibilities of these novel materials offer an unusual spectrum of biomedical applications Additional ics apart from those shown here in the context of tissue manipulation.
- the present invention relates to inclusion bodies, bacterial cells and compositions containing them and their use as cell proliferation stimulators and tissue regenerators.
- a first object of the present invention relates to an isolated inclusion body comprising a polypeptide characterized in that the inclusion body is in particulate form.
- a second object of the present invention relates to a bacterial cell comprising the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects.
- a third object of the present invention relates to a composition comprising the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects and a eukaryotic cell.
- a fourth object of the present invention relates to a composition comprising the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects and an animal or plant tissue.
- a fifth object of the present invention relates to the uses of the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural and dispositional aspects, such as medicaments and cell proliferation stimulators and tissue regenerators.
- FIG. 1 Morphological and functional characterization of IBs.
- A Confocal microscopy images of wild bacterial cells that produce IBs formed by a GFP fusion protein. From top to bottom, cell samples taken at 1 hour, 2 hours and 3 hours after induction of IB production.
- B Images of confocal microscopy using a Metamorf palette of wild bacterial cells, IbpAB, CIpA, CIpP and DnaK that produce IBs formed by a fusion GFP of 2 hours of formation (upper part). Confocal microscopy images of purified 3-hour IBs of these strains (lower part). The bars in A and B indicate 1 ⁇ m.
- C Confocal microscopy images of wild bacterial cells that produce IBs formed by a GFP fusion protein. From top to bottom, cell samples taken at 1 hour, 2 hours and 3 hours after induction of IB production.
- B Images of confocal microscopy using a Metamorf palette of wild bacterial cells, Ib
- D the growth of BHK cells at different incubation times on plates coated with IB (IB), on plates coated with vitronectin (V) and on control plates (C).
- E Growth of BHK cells in plates coated with different concentrations of IBs compared to vitronectin-coated plates (V) and control plates (C). The experiments were carried out in parallel on polystyrene plates treated for culture (black bars) and untreated (gray bars).
- G Images of the amino-terminated silicon surfaces stamped with 50 ⁇ m coated IBs taken by conventional microscopy (upper part) and confocal microscopy (middle part) and the distribution of BHK cells after 48 hours of growth on them (part lower) .
- inclusion body or also referred to in the present invention as “IB” is understood as indicated above in the background section or, more simply, an intracellular amorphous deposit comprising aggregate proteins found in the cytoplasm of a cell.
- a first object of the present invention relates to an isolated inclusion body comprising a polypeptide characterized in that the inclusion body is in particulate form.
- the particulate form has a particle size between 24 and 1500 nm. In a more preferred embodiment, the particle is in hydrated amorphous form.
- this may be a chimeric polypeptide comprising a viral protein fused translationally with a reporter protein.
- said viral protein is a capsid protein.
- the reporter protein is a fluorescent protein.
- said fluorescent protein is GFP (green fluorescent protein).
- the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects is deposited on a plate treated with tissue culture.
- the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects is deposited on a silicon substrate.
- the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects is incorporated into a three-dimensional scaffolding, whether synthetic or natural.
- a second object of the present invention relates to a bacterial cell comprising the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects.
- said bacterial cell is Escherichia CoIi (E. coli).
- said E. coli bacterial cell is a wild strain (WT) or is a mutant strain.
- a third object of the present invention relates to a composition comprising the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects and a eukaryotic cell.
- said eukaryotic cell is a mammalian cell.
- a fourth object of the present invention relates to a composition
- a composition comprising the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural aspects and an animal or plant tissue.
- a fifth object of the present invention relates to the uses of the inclusion body according to the first object of the invention and its different structural and layout aspects.
- a first use of said inclusion body is as a stimulator of eukaryotic cell proliferation.
- a second use of said inclusion body is as a tissue regenerator.
- a third use of said inclusion body is as medicine.
- such use as a medicine would take into account the observed advantages (see experimental part) in cell proliferation and tissue regeneration.
- IBs were produced in different strains of Escherichia coli, specifically MC4100 (wild strain with respect to protein folding and degradation, araD139 A (argF-lac) U169 rpsLl50 relAl flbB5301 deoCl ptsF25 rbsR) 1S and its derivatives JGT4 (deficient in co - CIpA protease, clpA :: kan), JGT17 (deficient in small heat shock proteins IbpAB, Aibp:: kan), JGT19 (deficient in co-protease CIpP, clpP:: cat) and JGT20 (deficient in chaperone main DnaK, dnak756 thr :: TnIO) 19 .
- MC4100 wild strain with respect to protein folding and degradation
- araD139 A argF-lac
- JGT17 deficient in small heat shock proteins IbpAB, Aibp::
- Nonidet P40 NP-40
- the DNA was extracted with 120 ⁇ l of 1 mg / ml DNase and 120 ⁇ l of 1 M Mg 2 SO 4 for 45 minutes at 37 ° C with stirring.
- the samples were centrifuged at 4 ° C at 15000 g for 15 minutes and the residue, which contained pure IBs, was washed with lysis buffer containing 0.5% Triton X-100 and stored at -20 ° C Until your analysis.
- the purified IBs were resuspended in PBS and sonicated for 4 minutes under 0.5 s cycles and analyzed by flow cytometry in a FACS Calibur (Becton Dickinson) system, using an 15 mW air cooled argon ion laser at excitation of a wavelength of 488 nm.
- the fluorescence emission of IB was measured in the FL-I channel (530/30 nm bandpass filter) using a logarithmic mode.
- Atomic force microscopy (AFM) analysis was performed in air with a commercial atomic force microscope (PicoScan / PicoSPM of Molecular Imaging
- volume size distributions of IB and Z potential were measured using a dynamic light scattering analyzer (DLS) at a wavelength of 633 nm, combined with a non-invasive backscattering technology (NIBS) (Zetasizer Nano ZS , Malvern Instruments Limited, Malvern, United Kingdom).
- Silicon substrates (100) 1x1 cm polished on one side were used for the preparation of amino-terminated monolayers. Prior to the formation of the monolayer, the substrates were treated with oxidizing RCAl solution (NH 4 OH / H 2 O 2 / H 2 O in a 1: 1: 5 ratio) for 30 minutes at 80 ° C and rinsed so Light with ultrapure water / MilliQ with a conductivity greater than 18.2 M ⁇ . Subsequently, the substrates were introduced in piranha solution for 15 minutes (concentrated H 2 SO 4 (Panreac) and 33% aqueous H 2 O 2 (Aldrich) in a 3: 1 ratio), rinsed thoroughly with ultrapure water and dried under a stream of nitrogen.
- oxidizing RCAl solution NH 4 OH / H 2 O 2 / H 2 O in a 1: 1: 5 ratio
- This treatment provides the substrates with a new hydroxyl-terminated surface for subsequent reactions.
- the amino-terminated monolayers were formed by exposure of the substrates under controlled atmosphere to a 5 mM solution of N- [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine / (TPEDA) (97% Aldrich) in anhydrous toluene for 3 hours. After the formation of the monolayer, the substrates were rinsed with toluene and ethanol to remove excess silane and dried under a stream of nitrogen.
- the contact angle of the amino-terminated substrate was measured with a drop of 3 ⁇ l of ultrapure water (MiIIiQ with 18.2 M ⁇ cm) in a 0CA15 + Contact Angle Measurement Instrument (Data Physics Instruments GMBH, Germany), equipped with a CCD camera and the SCA20 software for angle determination.
- the XPS spectra were obtained on a PHI ESCA-500 instrument (Perkin Elmer), equipped with a monochromatic Al Ka X-ray source operating at 350 W. The spectra referred to the main IC peak observed at 284.8 eV.
- the ⁇ CP of IBs on the amino-terminated silicon substrate was performed using PDMS stamping (Sylgard 184, Dow Corning, United States).
- the prints were manufactured by casting a 10: 1 (v / v) mixture of PDMS and curing agent (Sylgard 184, Dow Corning) against a silicon base with a photolithographic pattern, cured for 1 hour at 60 ° C and extracted at this cure temperature.
- PDMS prints were left in the oven at 60 ° C for at least 18 hours to ensure complete cure.
- PDMS prints were impregnated with a PBS buffer suspension with IB (pH 7.5) for 40 minutes, dried under a stream of nitrogen and placed on a clean substrate surface of finished silicon in amino. After a contact time of 1 minute was stamped with caution.
- the fluorescence of the printed samples was analyzed using a Leica TSC SPE confocal fluorescence microscope (Leica Microsystems Heidelberg GMBH, Manheim, Germany) after an excitation at a wavelength of 488 nm and recovered at an emission between 500 and 600 nm (x 10 air).
- IBs formed in DNak cells for 5 hours were diluted in PBS with bovine serum albumin (BSA) 10 g / 1 and sucrose 60 g / 1, in the presence of gentamicin 40 mg / 1, penicillin 100 U / ml and streptomycin 10 ⁇ g / ml, and aliquots were incubated at different temperatures (37 ° C, 25 ° C or 4 ° C). At different times, samples were frozen at -80 ° C until fluorescence determination. Fluorescence was recorded at 510 nm on a Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer (Variant, Inc., Palo Alto, CA) using an excitation wavelength of 450 nm.
- BSA bovine serum albumin
- results are referred to as the percentage of activity or fluorescence remaining with respect to control samples maintained at -80 ° C that were completely stable.
- Another group of samples were lyophilized in a Cryodos-80 lyophilizer, from Telstar, and stored at 4 ° C or 25 ° C until analysis.
- the inclusion bodies with isolated GFPs as described above were sterilized after 3 hours of production under exposure to a 253 nm UV light germicidal lamp for 4 hours. They were then resuspended in PBS and used.
- different amounts of IB protein specifically 0.08, 0.8 and 8 ⁇ g per well to coat 96-well Falcon 3072 polystyrene plates treated with tissue culture (Becton Dickinson) or untreated Costar 3370 plates, overnight 4 ° C Vitronectin (Calbiochem) was used as a reference at a concentration of 50 ng / cm 2 , following the manufacturer's instructions.
- the wells were washed in PBS and blocked with 3% BSA in PBS for 1 hour at 37 ° C.
- DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
- cell proliferation was determined using the EZ4U kit (Biomedica, GMBH) following the manufacturer's instructions and analyzed in the V ⁇ CTOR 3 V 1420 multibrand reader (Perkin Elmer). The reading absorbances were 450 nm and 620 nm as a reference and the values obtained were standardized with respect to the wells containing only medium. A pre-test was carried out to select the incubation time before saturation with the kit reagents; The optimal times were 3 hours for 24-hour crops, 2 hours for 48-hour crops and 30 minutes for 72-hour crops. All trials were performed in triplicate.
- the cells were incubated with 5 ⁇ g / ml of Hoechst 33342 and 5 ⁇ g / ml of CellMask (both of Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, United States), respectively, for 5 minutes at room temperature and washed twice before confocal detection.
- the Z series of 22 optical sections were collected in a range of 0.6 ⁇ m.
- the Z layers were obtained with LAS AF software (Leica Microsystems) and three-dimensional models were generated using the Imaris software (Bitplane, Zürich, Switzerland). Results and Discussion
- IBs formed by green fluorescent protein (GFP) are very convenient models for a kinetic and functional analysis of their biological production, since they are highly fluorescent 20 .
- GFP green fluorescent protein
- the appropriate combination between the collection time during the production process (which determines the stage of growth of IB) and the producing strain (which determines both the biological activity and the upper size limit) define the specific particle and fluorescence dimensions that could be more suitable for different applications.
- the IBs obtained in CIpA and CIpP cells, with a very similar particle size (0.435 and 0.459 nm, respectively) showed different levels of fluorescence emission (71 and 184 average FLl units per particle, respectively).
- the mapping of the fluorescence of IBs with GFP was comparable in all strains, showing a common homogeneous central fluorescent pattern (Figure IB).
- silica and ceramic nanoparticles between 24 and 1500 nm in diameter affect cell growth functions and can positively modulate cell proliferation on decorated surfaces 24 '26 . Since we question whether bacterial IBs that appear in this size range could also be useful for surface nanomanipulation, the effect of IBs with GFP was tested, once deposited in polystyrene plates treated with tissue culture (Figure 3A) , at BHK21 cell growth ( Figure 3B, C). At a density of 0.05 particles / ⁇ m 2 , the IBs showed a mean square root roughness (RMS) of 55.9 nm.
- RMS mean square root roughness
- FIG. 3G shows the surface of silicon stamped with IBs at a density of 0.04 Ibs / ⁇ m 2 and an RMS roughness of 32.4 nm, as well as the consequent stimulation of cell proliferation in regions linearly decorated with IBs. This indicates the preference for cell growth induced by IBs and the ability of these nanoparticles to stimulate cell proliferation on surfaces initially not suitable for cell growth.
- IBs produced in bacteria can be precisely designed during biological production with respect to important nanoscale-level characteristics and are intriguing nanoparticulate materials produced through economic processes by biological systems. Being biofunctional by nature and given that the protein that forms them can be selected and that their biological activity can be modulated by the genetic modification of the producer cell, the manipulation of IBs could have wide and deep implications in different nanomedical fields. In particular, and as the first proof of concept of biomedical applicability, IBs effectively functionalize surfaces thereby significantly favoring the proliferation of bound mammalian cells.
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Abstract
La presente invención se refiere a un cuerpo de inclusión aislado que comprende un polipéptido caracterizado porque el cuerpo de inclusión está en forma particulada. La presente invención también se refiere a una célula bacteriana que comprende dicho cuerpo de inclusión. La presente invención se refiere además a una composición que comprende dicho cuerpo de inclusión y una célula eucariota. La presente invención se refiere también a una composición que comprende dicho cuerpo de inclusión y un tejido de animal o planta. La presente invención se refiere también a los usos de dicho cuerpo de inclusión como medicamentos y estimuladores de la proliferación celular y regeneradores de tejido.
Description
CUERPOS DE INCLUSIÓN, CÉLULAS BACTERIANAS Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN Y SUS USOS
Campo de la invención
La presente invención se refiere a cuerpos de inclusión, a células bacterianas y composiciones que los contienen y a su uso como medicamentos y estimuladores de la proliferación celular y regeneradores de tejido.
Antecedentes de la invención
Los cuerpos de inclusión bacterianos (IBs) son depósitos de proteínas altamente puros producidos en bacterias recombinantes1. Siendo insolubles en agua, se observan como partículas amorfas porosas y altamente hidratadas en el rango de tamaño de varios cientos de nanómetros. Las cadenas polipeptídicas que forman los IBs se pliegan en una estructura molecular de tipo amiloide compatible con su estructura nativa, manteniendo de este modo las actividades biológicas de los polipéptidos incluidos (por ejemplo, fluorescencia o actividad enzimática) . Por lo tanto, tras la debida manipulación de los mismos, surge un amplio espectro de usos potenciales de los IBs como materiales funcionales y biocompatibles . Aunque teóricamente viable mediante el ajuste de condiciones genéticas y de producción, nunca se han manipulado las características biofísicas de estas partículas proteináceas, tales como la actividad y el tamaño. En este estudio, se caracterizan las propiedades a nanoescala de IBs como nuevos materiales particulados y se explora en qué grado las partículas producidas se pueden diseñar mediante estrategias simples. Además, como prueba de concepto destacada, se han obtenido superficies modificadas con cuerpos de inclusión que estimulan de
manera significativa la proliferación de células de mamífero, demostrando el potencial de los IBs en la manipulación de tejidos y la medicina regenerativa entre otras aplicaciones biomédicas prometedoras. Muchos polipéptidos recombinantes producidos en bacterias modificadas genéticamente agregan como IBs. Estos depósitos de proteínas aparecen como partículas altamente hidratadas que se encuentran en el citoplasma bacteriano2 o, en algunos casos, en el periplasma3. Los IBs son químicamente puros, ya que la propia proteína recombinante es el componente principal - hasta alrededor de un 95% de la proteína total - 2'4'5. Otras moléculas celulares, tales como ARN, ADN y lípidos resultan atrapados durante la formación de IB y están presentes en cantidades menores6. La formación de IBs es un proceso rápido y eficaz, tal como se observa después de unos minutos de la inducción de la expresión génica. Varias horas más tarde, pueden representar fácilmente alrededor del 50% de la biomasa celular total5. Aunque en el pasado se creía que los IBs estaban formados por cadenas polipeptídicas no plegadas o ampliamente mal plegadas y, por lo tanto, biológicamente inertes, recientes observaciones, presentan estas partículas como constituidas por especies de proteínas que se pliegan correctamente y que, por tanto, son biofuncionales8. La estructura molecular de IBs se basa en una organización particular de tipo amiloide 9'10 que permite interacciones de lámina beta cruzada que coexisten con dominios de proteínas correctamente plegadas11. Por lo tanto, los IBs formados por enzimas pueden ser catalizadores útiles en diferentes tipos de bioprocesos tal como se ha observado recientemente para la β-galactosidasa, D-aminoácido oxidasa, maltodextrina fosforilasa, ácido siálico aldolasa y polifosfato quinasa11 15, entre otras. Por otro lado, su formación in vivo, que implica la deposición de proteínas
dependiente de la secuencia alrededor de centros de nucleación, está regulada por varios genes celulares (que codifican principalmente proteasas y chaperones que actúan como una red funcional, lo que permite la manipulación de sus propiedades a nanoescala)16'". En la presente invención se determinan las características más relevantes de IB como nanopartículas y prueba que pueden diseñarse mediante una manipulación genética y del proceso apropiada de las bacterias productoras. Al ser materiales totalmente biocompatibles y mecánicamente estables, se ha utilizado además los IBs como nanopartículas para modificar la rugosidad de las superficies para la estimulación de la proliferación de células de mamífero. Dado que esencialmente cualquier especie de proteína se puede producir como IBs bacterianos y sus propiedades a nanoescala se pueden ajustar fácilmente, las posibilidades funcionales de estos materiales novedosos ofrecen un espectro inusual de aplicaciones biomédicas adicionales aparte de las mostradas aquí en el contexto de la manipulación de tejidos.
Descripción resumida de la invención
La presente invención se refiere a cuerpos de inclusión, a células bacterianas y composiciones que los contienen y a su uso como estimuladores de la proliferación celular y regeneradores de tejido.
Un primer objeto de la presente invención se refiere a un cuerpo de inclusión aislado que comprende un polipéptido caracterizado porque el cuerpo de inclusión está en forma particulada.
Un segundo objeto de la presente invención se refiere a una célula bacteriana que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales.
Un tercer objeto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y una célula eucariota. Un cuarto objeto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y un tejido de animal o planta . Un quinto objeto de la presente invención se refiere a los usos del cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y de disposición, como medicamentos y estimuladores de la proliferación celular y regeneradores de tejido.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Caracterización morfológica y funcional de IBs. A. Imágenes de microscopía confocal de células bacterianas salvajes que producen IBs formados por una proteína GFP de fusión. De arriba abajo, muestras de células tomadas a 1 hora, 2 horas y 3 horas después de la inducción de la producción de IB. B. Imágenes de microscopía confocal utilizando una paleta Metamorf de células bacterianas salvajes, IbpAB , CIpA , CIpP y DnaK que producen IBs formados por una GFP de fusión de 2 horas de formación (parte superior) . Imágenes de microscopía confocal de IBs de 3 horas de formación purificados de estas cepas (parte inferior) . Las barras en A y B indican 1 μm. C. Curvas de distribución del tamaño de partícula medidas mediante dispersión de luz dinámica de IBs de 3 horas de formación producidos por diferentes cepas bacterianas. Los IBs de células deficientes en IbpAB se excluyeron de este estudio debido a su particular
tendencia por agregarse como complejos supraparticulados (resultados no mostrados) . Las curvas se representan en términos del porcentaje en volumen de partícula. Las distribuciones del tamaño volumétrico de partícula se 5 describen mediante D[v,0,5], que es el diámetro de partícula (nm) por debajo del cual existe un 50% del volumen total del sistema. D[v,0,5] es el diámetro medio de partícula en volumen (nm) . El índice de polidispersidad (PdI) se define como [D (v, 0, 1 ) /D (v, 0, 9 ) ] • 100. D. 10 Fluorescencia emitida por IBS analizada mediante citometría de flujo, para partículas purificadas de las cepas de E. coli IbpAB , CIpA, CIpP y DnaK .
Figura 2. Estructura fina y estabilidad de IBs con
15 GFP. En las imágenes superiores, caracterización por AFM de IBs formados por una GFP de fusión, de 3 horas de formación. A. Imagen topográfica de 2,5 x 2,5 μm de IBs depositados sobre la superficie de forma aleatoria. B. Imagen tridimensional de 600 x 600 nm que muestra dos IBs
20 de la imagen del panel A. C. Sección transversal topográfica de una partícula de IB aislada (indicada como una línea azul en A) , que indica la existencia de una cierta rugosidad RMS intrínseca en la superficie de IB de 1,89 nm, como consecuencia de la estructura interna que da
25 lugar a una textura de superficie fina. En D, las imágenes SEM de IBs de 3 horas de formación producidos en células salvajes (parte superior) y en células DnaK (parte inferior) . Las barras blancas indican 500 nm. En E, se muestran las estabilidades de IBs en tampón acuoso a 37°C,
30 25°C y 4°C, o liofilizados (L) y guardados posteriormente a 25°C ó 4°C. F. Imágenes de microscopía confocal de IBs purificados mantenidos en tampón durante un mes a 25°C, 4°C y -80°C, y después de liofilización/reconstitución (L) .
35 Figura 3. Proliferación de células de mamífero
estimuladas por IB. Imagen confocal de una placa de poliestireno de 35 mm recubierta con 240 μg de IBS con GFP producidos en células naturales. B. Para el mismo campo, el recubrimiento de células BHK de la sección de 0,6 μm 75 horas después de la deposición celular y una proyección xzy de IBs formados por una GFP de fusión (parte superior) y el recubrimiento celular (parte inferior) . C. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst 33342 y las membranas celulares con CellMask inmediatamente antes de ser analizadas mediante microscopía confocal de rastreo láser de tres canales secuenciales . En D, el crecimiento de células BHK a diferentes tiempos de incubación en placas recubiertas de IB (IB), en placas recubiertas de vitronectina (V) y en placas control (C) . E. Crecimiento de células BHK en placas recubiertas con diferentes concentraciones de IBs en comparación con placas recubiertas de vitronectina (V) y placas control (C) . Los experimentos se llevaron a cabo en paralelo en placas de poliestireno tratadas para cultivo (barras negras) y no tratadas (barras grises) . F. Apilamiento xyz confocal de 22 secciones procesadas con software Imaris 3D mediante la aplicación del módulo Isosurface. G. Imágenes de las superficies de silicio terminadas en amino estampadas con IBs recubiertos de 50 μm tomadas mediante microscopía convencionales (parte superior) y microscopía confocal (parte media) y la distribución de células BHK después de 48 horas de crecimiento sobre las mismas (parte inferior) .
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a cuerpos de inclusión, a células bacterianas y composiciones que los contienen y a su uso como estimuladores de la proliferación celular y regeneradores de tejido.
Por "cuerpo de inclusión" o también denominado en la presente invención como "IB" se entiende lo indicado anteriormente en la sección de antecedentes o, de forma más simplificada, un depósito amorfo intracelular que comprende proteínas agregadas que se hallan en el citoplasma de una célula.
Un primer objeto de la presente invención se refiere a un cuerpo de inclusión aislado que comprende un polipéptido caracterizado porque el cuerpo de inclusión está en forma particulada.
En una realización preferente, la forma particulada tiene un tamaño de partícula entre 24 y 1500 nm. En una realización más preferente, la partícula está en forma amorfa hidratada.
Con respecto al polipéptido comprendido en el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la presente invención, éste puede ser un polipéptido quimérico que comprende una proteína viral fusionada de manera traduccional con una proteína informadora.
En una realización preferente, dicha proteína viral es una proteína de cápside.
Además, en otra realización preferente, la proteína informadora es una proteína fluorescente. En particular, dicha proteína fluorescente es GFP (proteína verde fluorescente) .
En una realización particular, el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales se deposita sobre una placa tratada con cultivo de tejido.
En otra realización particular, el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales se deposita sobre un sustrato de silicio.
En aún otra realización particular, el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales se incorpora dentro de un andamiaje tridimensional, ya sea de tipo sintético o natural .
Un segundo objeto de la presente invención se refiere a una célula bacteriana que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales.
En una realización preferente, dicha célula bacteriana es Escherichia CoIi (E. coli) .
En una realización más preferente, dicha célula bacteriana de E. coli es una cepa salvaje (WT) o es una cepa mutante.
Un tercer objeto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y una célula eucariota.
En una realización preferente, dicha célula eucariota es una célula de mamifero.
Un cuarto objeto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y un tejido de animal o planta .
Un quinto objeto de la presente invención se refiere a los usos del cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y de disposición.
Un primer uso de dicho cuerpo de inclusión es como estimulador de la proliferación de células eucariotas.
Un segundo uso de dicho cuerpo de inclusión es como regenerador de tejido.
Un tercer uso de dicho cuerpo de inclusión es como medicamento. En particular, dicho uso como medicamento tendria en cuenta las ventajas observadas (ver parte experimental) en la proliferación celular y la regeneración de tejidos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.
Materiales y métodos
Células bacterianas, plásmidos y producción de cuerpos de inclusión
Los IBs se produjeron en diferentes cepas de Escherichia coli, concretamente MC4100 (cepa salvaje con respecto al plegamiento y degradación de proteínas, araD139 A(argF-lac) U169 rpsLl50 relAl flbB5301 deoCl ptsF25 rbsR) 1S y sus derivados JGT4 (deficiente en la co- proteasa CIpA, clpA::kan), JGT17 (deficiente en las proteínas de choque térmico pequeñas IbpAB, Aibp: :kan) , JGT19 (deficiente en la co-proteasa CIpP, clpP : : cat) y JGT20 (deficiente en la chaperona principal DnaK, dnak756 thr :: TnIO)19. Estas cepas productoras se transformaron con el vector de expresión pTVPIGFP (ApR) que codifica una proteína verde fluorescente (GFP) fusionada en el extremo amino a VPl, la proteína de la cápside en forma de pentámero del virus de la fiebre aftosa20. Esta proteína viral, al ser altamente hidrofóbica, dirige la deposición de proteínas de fusión como IBs9. El gen recombinante se expresó bajo el control de un promotor trc inducible por isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) . Las células bacterianas se cultivaron en medio
rico en LB18 y el gen de fusión se expresó bajo condiciones estándar tal como se ha descrito anteriormente". Los IBs se detectaron claramente después de 1 h de adición de IPTG (figura IA) .
Purificación de los cuerpos de inclusión
Se centrifugaron muestras de 200 mi de cultivos bacterianos a 4°C a 5000 g durante 5 minutos y se resuspendieron en 50 mi de tampón de lisis (Tris HCl 50 mM pH = 8,1, NaCl 100 mM y EDTA 1 mM) . Las muestras envueltas en hielo se sonicaron (durante 25 a 40 minutos) a un 40% de amplitud bajo ciclos de 0,5s. Una vez sonicadas, se añadieron 28 μl de fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF) 100 mM y 23 μl de lisozima 50 mg/ml a muestras que se incubaron a 37°C bajo agitación durante 45 minutos. A continuación, se añadieron 40 μl de Nonidet P40 (NP-40) y la mezcla se mantuvo durante 1 hora a 4°C durante la agitación. Se extrajo el ADN con 120 μl de DNasa 1 mg/ml y 120 μl de Mg2SO4 1 M durante 45 minutos a 37°C bajo agitación. Finalmente, las muestras se centrifugaron a 4°C a 15000 g durante 15 minutos y el residuo, que contenia IBs puros, se lavó con tampón de lisis que contenia Tritón X-100 al 0,5% y se guardó a -20°C hasta su análisis.
Análisis por microscopio de bacterias e IBs
Se analizaron muestras utilizando un microscopio de fluorescencia confocal Leica TSC SP2 AOBS (Leica Microsystems Heidelberg GMBH, Manheim, Alemania) después de una excitación a una longitud de onda de 488 nm y las imágenes se registraron a longitudes de emisión entre 500 y 600 nm (63X (NA 1,4 aceite) utilizando un objetivo Plan- Apochromat (zoom 8; 1024 por 1024 pixels) . Para el análisis de las células bacterianas que producen IBs
fluorescentes, se fijaron muestras tomadas 1, 2 ó 3 horas después de la inducción por IPTG con formaldehído al 0,2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se guardaron a 4°C hasta su uso. Los IBs aislados se resuspendieron en 20 mi de PBS. Para la microscopía electrónica de barrido (SEM), se analizaron muestras mediante procedimientos convencionales utilizando un FEG (pistola de emisión de campo) -ESEM (microscopía electrónica de barrido ambiental) .
Citometría de flujo
Los IBs purificados se resuspendieron en PBS y se sonicaron durante 4 minutos bajo ciclos de 0,5 s y se analizaron mediante citometría de flujo en un sistema FACS Calibur (Becton Dickinson) , utilizando un láser de iones argón enfriado al aire de 15 mW a una excitación de una longitud de onda de 488 nm. La emisión por fluorescencia de IB se midió en el canal FL-I (filtro de paso de banda de 530/30 nm) utilizando un modo logarítmico.
Caracterización de microscopía de fuerza atómica
El análisis de la microscopía de fuerza atómica (AFM) se realizó en aire con un microscopio de fuerza atómica comercial (PicoScan/PicoSPM de Molecular Imaging
Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) operando en modo acústico. Los IBs resuspendidos en tampón fosfato
0,1 M a pH 7,4 se depositaron sobre una superficie de mica y se secaron al aire antes de la medición. Para las mediciones en modo acústico, se utilizó una punta de silicio monolítico PPP-NHC (Nanosensors, Inc.), con una constante elástica nominal de 42 N/m y una frecuencia de resonancia de 330 kHz .
Mediciones de dispersión de luz dinámica
Se midieron las distribuciones de tamaño en volumen de IB y el potencial Z utilizando un analizador de la dispersión de luz dinámica (DLS) a una longitud de onda de 633 nm, combinado con una tecnología de retrodispersión no invasiva (NIBS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Limited, Malvern, Reino Unido) . Las dispersiones de IBs de 3 horas de vida en tampón fosfato 0,1 M a pH = 7,4 (500 ng/μl) se prepararon mediante una breve sonicación (1 minuto a temperatura ambiente) . Se midieron alícuotas de 3 mi de la dispersión resultante a 20°C sin filtrar antes de la medición. Los datos de intensidad se normalizaron utilizando tampón fosfato 0,1 M a pH 7,4 como patrón de referencia. El valor promedio de tres mediciones diferentes se tomó como el diámetro hidrodinámico promedio de IB.
Preparación de monocapas terminadas en amino
Se utilizaron sustratos de silicio (100) 1x1 cm pulidos por una cara para la preparación de monocapas terminadas en amino. Antes de la formación de la monocapa, los sustratos se trataron con solución RCAl oxidante (NH4OH/H2O2/H2O en una proporción 1:1:5) durante 30 minutos a 80°C y se aclararon de manera ligera con agua ultrapura/MilliQ con una conductividad superior a 18,2 MΩ. Posteriormente, los sustratos se introdujeron en solución de piraña durante 15 minutos (H2SO4 concentrado (Panreac) y H2O2 acuoso al 33% (Aldrich) en una proporción 3:1), se aclararon abundantemente con agua ultrapura y se secaron bajo una corriente de nitrógeno. Este tratamiento proporciona a los sustratos una nueva superficie terminado en hidroxilo para reacciones posteriores. Las monocapas terminadas en amino se formaron mediante la exposición de
los sustratos bajo atmósfera controlada a una solución 5 mM de N- [3- (trimetoxisilil) propil] etilendiamina/ (TPEDA) (97% Aldrich) en tolueno anhidro durante 3 horas. Tras la formación de la monocapa, los sustratos se aclararon con tolueno y etanol para eliminar el exceso de silano y se secaron bajo una corriente de nitrógeno. El ángulo de contacto del sustrato terminado en amino se midió con una gota de 3 μl de agua ultrapura (MiIIiQ con 18,2 MΩ cm) en un Instrumento de Medición del Ángulo de Contacto 0CA15+ (Data Physics Instruments GMBH, Alemania), equipado con una cámara CCD y el software SCA20 para la determinación del ángulo. Los espectros XPS se obtuvieron en un instrumento PHI ESCA-500 (Perkin Elmer) , equipado con una fuente de rayos X Al Ka monocromática que operaba a 350 W. Los espectros hacían referencia al pico principal CIs observado a 284,8 eV.
Impresión por microcontacto (μCP) de IBs en el sustrato de silicio terminado en amino
La μCP de IBs sobre el sustrato de silicio terminado en amino se realizó utilizando estampaciones de PDMS (Sylgard 184, Dow Corning, Estados Unidos) . Las estampaciones se fabricaron mediante la fundición de una mezcla 10:1 (v/v) de PDMS y agente de curación (Sylgard 184, Dow Corning) contra una base de silicio con un patrón fotolitográfico, se curaron durante 1 hora a 60°C y se extrajeron a esta temperatura de curación. Las estampaciones de PDMS se dejaron en el horno a 60°C durante por lo menos 18 horas para asegurar una curación completa. Para los IBs impresos con μCP, las estampaciones de PDMS se impregnaron con una suspensión de tampón PBS con IB (pH 7,5) durante 40 minutos, se secaron bajo una corriente de nitrógeno y se colocaron en una superficie de sustrato limpio de silicio terminado en amino. Después de
un tiempo de contacto de 1 minuto se extrajo la estampación con precaución.
La fluorescencia de las muestras impresas se analizó utilizando un microscopio de fluorescencia confocal Leica TSC SPE (Leica Microsystems Heidelberg GMBH, Manheim, Alemania) después de una excitación a una longitud de onda de 488 nm y se recuperó a una emisión entre 500 y 600 nm (x 10 aire) .
Análisis de estabilidad
Los IBs formados en células DNak durante 5 horas se diluyeron en PBS con albúmina de suero bovino (BSA) 10 g/1 y sacarosa 60 g/1, en presencia de gentamicina 40 mg/1, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 10 μg/ml, y se incubaron las alícuotas a diferentes temperaturas (37°C, 25°C ó 4°C) . A diferentes tiempos, se congelaron las muestras a -80°C hasta la determinación de la fluorescencia. La fluorescencia se registró a 510 nm en un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse (Variant, Inc., Palo Alto, CA) utilizando una longitud de onda de excitación de 450 nm. Los resultados se refieren como el porcentaje de actividad o fluorescencia remanente con respecto a las muestras de control mantenidas a -80°C que eran completamente estables. Otro grupo de muestras se liofilizaron en un liofilizador Cryodos-80, de Telstar, y se guardaron a 4°C ó 25°C hasta su análisis.
Ensayo de proliferación celular
Los cuerpos de inclusión con GFP aislados tal como se ha descrito anteriormente se esterilizaron después de 3 horas de producción bajo la exposición a una lámpara germicida de luz UV de 253 nm durante 4 horas. A continuación, se resuspendieron en PBS y se utilizaron
diferentes cantidades de proteína IB, concretamente 0,08, 0,8 y 8 μg por pocilio para recubrir placas de poliestireno Falcon 3072 de 96 pocilios tratadas con cultivo de tejido (Becton Dickinson) o placas Costar 3370 no tratadas, durante toda la noche a 4°C. Se utilizó Vitronectina (Calbiochem) como referencia a una concentración de 50 ng/cm2, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los pocilios se lavaron en PBS y se bloquearon con BSA al 3% en PBS durante 1 hora a 37°C. A continuación, se añadieron por pocilio l,5-102 células de una línea celular de riñon de hámster recién nacido (BHK) y se incubaron en Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con aminoácidos no esenciales, suero de ternera fetal al 5%, gentamicina y antimicóticos a 37°C a tiempos diferentes. Los pocilios para blancos siguieron exactamente el tratamiento descrito anteriormente, pero se mantuvieron siempre sin IBs.
Después de la incubación, se determinó la proliferación celular utilizando el kit EZ4U (Biomedica, GMBH) siguiendo las instrucciones del fabricante y se analizó en el lector multimarcaje VÍCTOR3 V 1420 (Perkin Elmer) . Las absorbancias de lectura fueron 450 nm y 620 nm como referencia y los valores obtenidos se estandarizaron con respecto a los pocilios que contenían sólo medio. Se llevó a cabo un pre-test para seleccionar el tiempo de incubación antes de la saturación con los reactivos del kit; los tiempos óptimos fueron 3 h para cultivos de 24 horas, 2 h para cultivos de 48 horas y 30 min para cultivos de 72 horas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Los datos se expresaron como la media ± SEM de los valores de los tres experimentos llevados a cabo por cada condición y se evaluaron estadísticamente utilizando un test ANOVA, seguido de análisis post-hoc de Bonferroni . El nivel de significancia fue p < 0,05. Para un crecimiento celular en silicio. Las superficies con
injertos de IB se cortaron en los tamaños apropiados, se irradiaron con UV y se depositaron en placas de poliestireno Falcon de 24 pocilios con medio de cultivo tejido donde se inocularon y se cultivaron las células bajo procedimientos convencionales.
Análisis por microscopía confocal de cultivos celulares
Los cultivos celulares se examinaron utilizando un microscopio Leica TCS SP5 AOBS confocal espectral (Leica Microsystems, Mannheim, Alemania) utilizando una lente Plan-Apochromat 63X 1,4 N. A. Todas las imágenes se obtuvieron de células vivas crecidas en Placas de Base de Vidrio (Mat Tek Corporation, Ashland, MA, Estados Unidos) . Las células se sembraron a una densidad de 4 x loVpocillo en cuerpos de inclusión con GFP, 72 horas antes de la obtención y cultivo en DMEM + Glutamax 1 (Gibco) complementado con suero de albúmina fetal al 10%. Para el mareaje de la membrana nuclear y plasmática, las células se incubaron con 5 μg/ml de Hoechst 33342 y 5 μg/ml de CellMask (ambos de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, Estados Unidos), respectivamente, durante 5 minutos a temperatura ambiente y se lavaron dos veces antes de la detección confocal. Los núcleos se excitaron con un haz de diodo láser a 405 nm y se detectaron a 414-461 nm (canal azul); la membrana plasmática se detectó mediante la excitación con luz de un láser de helio y neón a 633 nm y se detectó la fluorescencia a 656-789 nm (canal rojo lejano) ; finalmente, se utilizó una linea de 488 nm de un láser de argón para obtener imágenes de IBs (canal verde, emisión = 500-537 nm) . Las series Z de 22 secciones ópticas se recogieron en un intervalo de 0,6 μm. Las capas en Z se obtuvieron con el software LAS AF (Leica Microsystems) y se generaron modelos tridimensionales utilizando el software Imaris (Bitplane, Zürich, Suiza) .
Resultados y discusión
Los IBs formados por proteína verde fluorescente (GFP) son modelos muy convenientes para un análisis cinético y funcional de su producción biológica, ya que son altamente fluorescentes20. Después de la adición en el cultivo bacteriano de IPTG, análogo de la lactosa, los IBs eran claramente visibles mediante microscopía confocal 1 hora después de la inducción de la expresión de gen GFP (figura IA) y crecieron volumétricamente hasta alrededor de 3 horas durante la síntesis de GFP recombinante, permitiendo la recogida de IBs en un amplio espectro de tamaños. Bajo condiciones estándar de crecimiento bacteriano en el laboratorio sin ningún esfuerzo por mejorar, la producción fue superior a 5 mg/L después de 3 horas (resultado no mostrado) , un dato muy prometedor para un escalado práctico. Además, diferentes cepas de E. coli, deficientes en chaperonas o proteasas, producen IBs de diferente tamaño (figura IB) con los mismos rendimientos, debido a la diferente dinámica de la deposición de proteínas in vivo en las mismas 16-17 ^ Aunque los IBs maduros purificados de células naturales mostraron un diámetro promedio de 340 nm (compatible con estimaciones independientes21) , dicho valor se puede incrementar progresivamente mediante el uso de células mutantes hasta más de 500 nm (en células deficientes Dnak ) (figura IC) , con un índice de polidispersión relativamente bajo en todas las muestras analizadas. La emisión de fluorescencia por partícula también se determinó en IBs purificados mediante citometría de flujo y se observó un intervalo definido desde nanopartículas con fluorescencia baja (cepa natural) hasta nanopartículas con fluorescencia elevada (cepa mutante CIpP ) (figura ID) . A continuación, la combinación apropiada entre el tiempo de recogida durante
el proceso de producción (que determina la etapa de crecimiento de IB) y la cepa productora (que determina tanto la actividad biológica como el limite de tamaño superior) definirla las dimensiones de partícula y fluorescencia concretas que podrían ser más adecuadas para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, los IBs obtenidos en Células CIpA y CIpP , con un tamaño de partícula muy similar (0,435 y 0,459 nm, respectivamente), mostraron diferentes niveles de emisión de fluorescencia (71 y 184 unidades FLl promedio por partícula, respectivamente) . Sin embargo, el mapeo de la fluorescencia de IBs con GFP era comparable en todas las cepas, mostrando un patrón fluorescente central homogéneo común (figura IB) .
Para caracterizar adicionalmente la morfología de IBs a nivel de nanoescala, se investigó mediante AFM y SEM. Tal como se observa en la figura 2 A, B, C, la AFM de IBs con GFP naturales muestra la presencia de partículas aisladas de forma esférica o cilindrica con tamaños promedio de 300 nm de longitud, 170 nm de diámetro y 200 nm de altura. Las mediciones de sección transversal realizadas confirmaron los datos estadísticos obtenidos a partir de las mediciones de DLS (figura IC) . Las observaciones de SEM estaban en la linea de las imágenes de AFM, revelando una superficie de IB rugosa y acentuando la diferencia de tamaño entre IBs obtenidos en células naturales y DnaK (figura 2D) . Las mediciones de potencial Z realizadas en una suspensión de IB recién preparada mostraron un valor de potencial Z de -9,8 mV que es indicativo de la superficie cargada de forma ligeramente negativa y está de acuerdo con la tendencia de las proteínas de formar agregados. Por otro lado, se investigó la estabilidad de IBs bajo condiciones de almacenamiento utilizadas habitualmente para muestras biológicas. Se observó que los IBs eran completamente estables durante largos periodos de tiempo con respecto tanto a la emisión
de fluorescencia como a la estructura a -80°C, 4°C, 25°C y también a 37°C (figura 2E,F), lo cual permite no sólo la conservación, sino también el uso conveniente y la manipulación de IBs bajo condiciones de ensayo fisiológico. De forma interesante, los IBs eran también mecánica y funcionalmente estables durante la liofilización (y bajo condiciones de almacenamiento diferentes adicionales, figura 2F) y sonicación (no mostrado) , expandiendo sus potenciales usos bajo diversas condiciones experimentales.
Dado que los IBs bacterianos muestran una fácil capacidad de manipulación y son materiales totalmente biocompatibles, se investigó su potencial aplicabilidad para fines biomédicos mediante la realización de un ejercicio sencillo. En la generación de tejidos para medicina regenerativa, la unión y proliferación celular se pueden estimular a través de la modificación topográfica de las propiedades de la superficie del material mediante grabado, litografía y procedimientos similares, dependiendo de la naturaleza del propio material. Recientemente, otras estrategias basadas en la funcionalización de superficies con materiales 22'23'24'25 o en su decoración con nanopartículas también permitían un ajuste fino de la textura de la superficie y la rugosidad independientemente de la naturaleza del material utilizado para estimular la unión celular 26'27. En este contexto, las nanopartículas de sílica y cerámicas de entre 24 y 1500 nm de diámetro afectan a las funciones de crecimiento celular y pueden modular de manera positiva la proliferación celular en superficies decoradas24'26. Dado que nos cuestionamos si los IBs bacterianos que aparecen en este intervalo de tamaños podrían también ser útiles para la nanomanipulación de superficies, se ensayó el efecto de IBs con GFP, una vez depositados en placas de poliestireno tratadas con cultivo de tejido (figura 3A), en el
crecimiento de células BHK21 (figura 3B, C) . A una densidad de 0,05 particulas/μm2, los IBs mostraron una rugosidad de raíz media cuadrada (RMS) de 55,9 nm. En dicha superficie modificada, las células BHK21 crecieron intimamente unidas a los IBs con GFP depositados, tal como se observa mediante la aparición de tinción en la membrana celular (marca roja) y fluorescencia de IB (marca verde) , dando lugar a señales amarillentas (figura 3B) . Curiosamente, en la superficie de poliestireno, que está ampliamente optimizada para la adhesión y el crecimiento celular, un agente de unión celular convencional, tal como la vitronectina, no presentaba efectos detectables en la proliferación celular (Figura 3D,E) . Sin embargo, bajo dichas condiciones favorables, los IBs aún estimulaban de manera significativa la proliferación celular (figura 3 D) dependiendo de la dosis (Figura 3E) , hasta más de dos veces. Este efecto era mucho más pronunciado y biológicamente significativo que los ligeros o nulos efectos observados con otras nanoparticulas, que a tamaños definidos y para algunas lineas celulares parecen mostrar efectos inhibidores en lugar de efectos estimuladores 26,28,29 De forma interesante, no se observaron efectos citopáticos ni síntomas de toxicidad en las células cultivadas después de crecer en superficies tratadas con IB. Un análisis 3D de imágenes confocales (figura 3F) mostró IBs unidos a poliestireno totalmente integrados en las membranas celulares, indicando una interacción intima entre las superficies celulares y las nanoparticulas de IB que decoran la superficie del crecimiento celular. Con el fin de demostrar adicionalmente la validez de los IBs como estimuladores de la proliferación celular, se realizó una microestructuración de los IBs en un sustrato de silicio terminado en amino 30'31 utilizando la técnica de impresión por microcontacto (μCP) que implica la impregnación de una estampación elastomérica con una
suspensión de los IBs. La figura 3G muestra la superficie de silicio estampada con IBs en una densidad de 0,04 Ibs/μm2 y una rugosidad RMS de 32,4 nm, asi como la consecuente estimulación de la proliferación celular en las regiones linealmente decoradas con IBs. Esto indica la preferencia por un crecimiento celular inducido por IBs y la capacidad de estas nanoparticulas para estimular la proliferación celular en superficies inicialmente no adecuadas para el crecimiento celular. En resumen, los IBs producidos en bacterias se pueden diseñar con precisión durante la producción biológica con respecto a importantes características a nivel de nanoescala y son materiales nanoparticulados fascinantes producidos mediante procesos económicos por los sistemas biológicos. Al ser biofuncionales por naturaleza y dado que la proteina que los forma se puede seleccionar y que la su actividad biológica puede ser modulada mediante la modificación genética de la célula productora, la manipulación de IBs podría tener amplias y profundas implicaciones en diferentes campos nanomédicos. En particular, y como primera prueba de concepto de aplicabilidad biomédica, los IBs funcionalizan de manera eficaz superficies favoreciendo de este modo de manera significativa la proliferación de células de mamífero unidas .
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Claims
1.- Cuerpo de inclusión aislado que comprende un polipéptido caracterizado porque el cuerpo de inclusión está en forma particulada.
2. -Cuerpo de inclusión aislado según la reivindicación 1, en el que la forma particulada tiene un tamaño de partícula entre 24 y 1500 nm.
3.- Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la partícula está en forma amorfa hidratada.
4.- Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polipéptido es un polipéptido quimérico que comprende una proteina viral fusionada de manera traduccional con una proteina informadora .
5.- Cuerpo de inclusión aislado según la reivindicación 4, en el que la proteina viral es una proteina de la cápside.
6.- Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en el que la proteina informadora es una proteina fluorescente.
7.- Composición que comprende el cuerpo de inclusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y una célula eucariota.
8.- Composición según la reivindicación 7, en la que la célula eucariota es una célula de mamífero.
9.- Composición que comprende el cuerpo de inclusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un tejido de animal o planta.
10.- Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el cuerpo de inclusión se deposita sobre una placa tratada con cultivo de tejido.
11.- Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el cuerpo de inclusión se deposita sobre un sustrato de silicio.
12.- Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el cuerpo de inclusión se incorpora dentro de un andamiaje tridimensional de tipo sintético o natural.
13.- Uso del cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 10-12, como estimulador de la proliferación de células eucariotas.
14.- Uso del cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 10-12, como regenerador de tejido.
15.- Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 10-12, para su uso como medicamento .
16.- Célula bacteriana que comprende el cuerpo de inclusión tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
17.- Célula bacteriana según la reivindicación 16, en la que la célula bacteriana es Escherichia CoIi.
18.- Célula bacteriana según la reivindicación 17, en la que E. coli se selecciona entre E. coli de cepa salvaje o una cepa mutante.
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