WO2010070167A1 - Haptenos, usos y método inmunoquimico para la detección de bromopropilato - Google Patents

Haptenos, usos y método inmunoquimico para la detección de bromopropilato Download PDF

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Maria del Pilar MARCO COLÁS
Javier RAMÓN AZCÓN
Francisco José SANCHEZ-BAEZA
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07C57/52—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms containing halogen
    • C07C57/58—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms containing halogen containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07C233/51—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to various haptens derived from bromopropylate (BP), its uses for the synthesis of immunoreactive agents as well as an immunochemical method for the detection and / or quantification of bromopropylate (BP) and their respective kits.
  • BP bromopropylate
  • the chemical structure of the haptens used, both for the immobilization in the solid support and for the immunization of animals to obtain the respective polyclonal antibodies ⁇ has been designed to maximize the recognition of the bis-bromophenyl group of the BP by the antibodies generated.
  • the method of the present invention refers to an indirect immunochemical analysis capable of detecting BP with a threshold of 0.14 ⁇ g-L-1 and related pesticides containing a bis-halophenyl group in its structure.
  • the BP can be analyzed directly in wine samples.
  • Bromopropylate is a contact miticide that has been used extensively in agriculture against all stages of the mite life cycle, for example, of the Eriophyidae, Tenuipalpidae or Tetranychidae families.
  • the BP is a non-systemic and non-penetrating compound that remains in the fruit peel and does not migrate in the pulp.
  • BP is quite persistent in the environment in acidic media (50 days of half-life) and neutral (more than 3 years of half-life.
  • BP has low acute toxicity in rats and rabbits. effects of BP on humans are unknown
  • the INCHEM International program on chemical safety establishes an acceptable daily intake of between 0-0.03 mg / kg in humans humans.
  • the BP was first tested in 1966 for mite control.
  • the maximum temporary residue level (MRLs) in products such as wine grapes, citrus fruits and apples (2 mg-Kg-1) has been established in accordance with Directive 90/642 / EEC.
  • the BP is analyzed by chromatographic techniques such as high performance liquid chromatography (Martel and Zeggane (2002). J. Chromatog. A. 954 (1 -2): 173-180), gas chromatography (Lee and Kennedy (2001). J. AOAC Int. 84 (5): 1393-1406) or gas chromatography-mass spectrometry (Liapis et al. (2003). J. Chromato ⁇ . A. 996 (1 - 2): 181-187).
  • chromatographic techniques have detection limits around MRLs.
  • a major disadvantage of these procedures is that they require a complex extraction method such as liquid, solid extraction. phase or solid-phase micro ⁇ xtraction before analysis. Consequently, chromatographic techniques require considerable time, the necessary instruments are expensive and the personnel must be very specialized.
  • Immunoassays have been developed for the detection of pesticides and other environmental pollutants, such as organophosphorus insecticides (Lee et al. (1995). J. Agrie. Food Chem. 43 (6): 1730-1739). However, until now, there is no method or reagents necessary for the detection of BP by immunoassays. To achieve them, a complex and undescribed process of synthesis of those derivatives that may occur in nature is required so that they can be detected specifically and with a low detection threshold.
  • the present invention relates to a set of structurally related haptens, from the chemical point of view, with bromopropylate (BP) and other compounds of this family of pesticides and their synthesis and environmental degradation intermediates, their uses for the synthesis of immunoreactive as well as an immunochemical method for the detection and / or quantification of bromopropylate (BP).
  • the method of the present invention is based on the synthesis of BP derivatives (hereinafter, haptens) and specific polyclonal antibodies.
  • haptens BP derivatives
  • the method of the present invention refers to the indirect immunological detection and / or quantification capable of detecting BP with a threshold of 0.14 ⁇ g-L-1.
  • BP can be analyzed directly in wine samples without the need for a cleaning procedure to apply the method.
  • a first aspect of the present invention refers to a bromopropylate (BP) hapten of general formula I
  • Ri is selected from Cl, Br, OH or O- (CH 2 ) n -Rg;
  • Y is O or NH and when Y is O, R 2 is H or alkyl (CrC 4 ) and when Y is NH, R 2 is - (CH 2 ) n -Rg; where n takes values between 2 and 4 and Rg is selected from OH. CHO.
  • R 1 is O- (CH 2 ) n -Rg, Rg can also be
  • halogen means an atom of Bromo (Br), Chlorine (Cl), iodine (I) or fluorine (F).
  • the halogen is Br and more preferably, in the hapten of general formula (I), the halogen (X) is Br.
  • the substituents of the aryls (X) are preferably located in the position of both rings. Therefore, preferably, the haptens of the present invention have the general formula (II):
  • alkyl refers, in the present invention, to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 6 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, tere-butyl, sec-butyl, n-pentyl, n-hexyl, etc.
  • the alkyl group has between 1 and 4 carbon atoms. More preferably it is methyl or isopropyl (i-propyl).
  • Y is O and R 2 is a methyl or sopropyl group.
  • Y is NH and R 2 is - (CHbh-COOH.
  • the hapten of BP is selected from the list comprising: • 2,2-bis (4-bromophenyl) -N-2-hydroxyacetamide-butanoic acid,
  • a hapten is a chemical compound that, when it enters an animal body, does not induce itself the formation of antibodies due to its small size but, when it is covalently bound to a protein the resulting complex is capable of stimulating an immune response.
  • a hapten is the part of an antigen that by itself does not trigger immune response, but it does induce the desired specificity in the immune response.
  • the hapten can be covalently linked to the lysine groups of the proteins by the aldehyde groups or the carboxyl groups.
  • the hapten of the present invention is a compound structurally analogous to the analyte present in the sample.
  • the ideal hapten is one that preserves most of the steric and electronic characteristics of the compound and mimics the spatial geometry of the maximum possible chemical structure.
  • the BP hapten is conjugated with a protein or a polymer.
  • the polymer to which the BP hapten of the present invention remains conjugated can be, but not limited to, dextran (simple or modified), polypyrrole, polyaniline (heteropolymers with monoceres that support reactive functionalities) or polylysine.
  • the hapten of BP is conjugated to a protein that is selected from the list comprising mollusk hemocyanin (for example, HCH or KLH), serum albumin (for example, BSA, RSA), ovalbumin (OVA) or conalbumin (CONA).
  • mollusk hemocyanin for example, HCH or KLH
  • serum albumin for example, BSA, RSA
  • ovalbumin ovalbumin
  • CONA conalbumin
  • the hapten conjugated to a protein is called an antigen if the objective of this compound is binding to the specific antibody analyte or immunogen when used to trigger Ia immune response in an animal body.
  • the protein has a relative molecular mass greater than 15 KDa and comes from an animal other than the animal that is to be immunized (as described below).
  • the proteins bind to the hapten by means of the amino acids of their outer layer and accessible amino acids with side chains of the nucleophilic type, that is, the proteins have at least one reactive amino acid that is selected from the list comprising, but not limited to , cysteine, serine, tyrosine or lysine.
  • Another aspect of the present invention is the use of any of the haptens described, conjugated or not with a protein or polymer as described in the previous paragraphs, for the synthesis of immunoreactive agents. The competition for immunochemical detection techniques.
  • the immunoreactive is selected from the list comprising immunogen, antiserum, polyclonal antibody, monoclonal antibody, antigen, tracers for immunoassays or tracers for immunosensors.
  • the term "immunoreactive" as understood in the present invention refers to any molecule that can be used in immunochemical assays.
  • the immunogen is any conjugation of any of the haptens according to the first aspect of the present invention with a protein so as to generate an immunological response in the animal in which the antigen enters or to specifically bind the selective antibodies generated in which case it is called antigen or competitor.
  • the antiserum is the serum that is obtained from the blood of an animal that contains a mixture of antibodies that are synthesized as a result of the entry of the hapten conjugated with a protein in the body of the animal.
  • the antibody is the immunoglobulin that the animal has specifically synthesized against the hapten conjugated with a protein and that is free of residues of serum components.
  • the competitor is a hapten analogous to the analyte present in the sample that it is desired to detect and / or quantify and that is employed in the method of detection and / or quantification of an analyte
  • Another aspect of the present invention is a method for the detection and / or quantification in a sample of BP or an analyte derived from BP comprising: a. Immobilize a hapten as described above
  • (antigen) on a solid support b. mixing the sample and an anti-antigen antibody or antiserum in the solid support of section (a) to form a first complex, c. adding a second labeled antibody to the complex formed according to section (b) to form a second complex and d. detecting and / or quantifying the second complex obtained according to section (c) with a composition containing a chromogenic, fluorogenic and / or chemiluminescent indicator substrate.
  • solid support refers to a wide variety of materials, such as, for example, ion exchange resin or adsorption, glass, plastic, latex, nylon, gel, cellulose esters , paramagnetic spheres or the combination of some of them, but not limited to the materials mentioned above.
  • the solid support material is plastic and the support are standard plates for ELISA analysis.
  • the immobilization of the antigen on the surface of a support such as polystyrene plastic is directed by the surface chemistry. There are many factors that can modify the immobilization capacity of the antigens.
  • the time and temperature of incubation are very important. Generally, at a higher temperature less incubation time is necessary but it is preferable to use a temperature between 3 and 6 0 C for a time between 10 and 20 hours to immobilize the antigens to the surface of the solid support.
  • the immobilization step of an antigen includes blocking the spaces of the support that have not been occupied by the antigens since the binding to it is not selective and if the blockage is not carried out, other non-specific molecules could be bound.
  • the blocking is carried out by proteins or detergents, preferably non-ionic detergents.
  • the labeled antibody or antiserum as understood in the present invention is an antibody conjugated with a compound capable of reacting with some substrate, so that a chromogenic, fluorogenic and / or chemiluminescent detection is derived from it.
  • This compound can bind to the antibody directly, or through another component.
  • An example of a compound that can be detected is the enzyme peroxidase.
  • the indicator substrate is chromogenic, such as, for example, 3,3 ' , 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), azino-bis (3-ethylbenzothiazoline 6- sulfonic acid) or phenylenediamine, without limitation of using other substrates .
  • the presence of haptens of general formula I in the sample is evidenced by the appearance of a color whose intensity varies directly with the number of molecules bound to the Ad antibodies and their quantification can be carried out, for example, by means of spectophotometry. If a fluorogenic substrate is used, the detection and quantification is carried out by means of fluorimetry and if the substrate is chemiluminescent, the signal can be quantified by means of a luminometer.
  • a preferred embodiment of the detection and / or quantification method comprises: a. Immobilize a hapten according to any of claims 2 or 3 (antigen) on a solid support. b. add the sample and pre-incubated anti-antigen (Ad) antibodies to the immobilized antigen of section (a) and incubate, c. add anti-Ad (Ac2) antibodies conjugated with an enzyme, to the Ad antibodies of section (b) and incubate, d. wash after each of the steps (a), (b) and (c), e. add a substrate of the enzyme to the product obtained in section (c) and incubate, f. measure the absorbance of the product obtained in section (e) and g.
  • Ad antibodies are obtained as described in the corresponding example.
  • Obtaining the Ad includes; To conjugate a hapten of general formula I with a protein, introduce the product obtained from the conjugation into an animal and obtain the antibodies produced by the animal. Preferably the animal is a rabbit.
  • the preincubation consists in mixing the sample and anti-antigen (Ad) antibodies for a certain time, preferably less than 30 minutes, at a temperature between 20 and 4O 0 C. With incubations of more than 30 minutes the results are not improved.
  • the pre-incubated mixture is added to the immobilized antigen in the solid support and incubated under the same conditions as the pre-incubation for a time of between 5 and 60 minutes. In this way, the binding of Api and the haptens of the sample, recognized by the antibodies, to the antigens immobilized on the support is achieved.
  • Ad2 antibodies conjugated with an enzyme are added to the Ad antibodies of section (b) and incubated.
  • the Ac2 antibodies are obtained in a different animal from the one that has been used to produce the Ad antibodies by introducing Ad antibodies into the animal and obtaining the anti-Ad antibodies produced by the animal.
  • the animal is a goat.
  • the Ac2 antibodies are incubated the antigen-hapten complex of the Ad-immobilized sample on the solid support and incubated under the same conditions described for the previous step of the method.
  • Ac2 antibodies are bound (by conjugation) with an enzyme.
  • the enzyme is capable of reacting with a substrate so that a chromogenic, fluorogenic and / or chemiluminescent detection is derived therefrom.
  • the detection is chromogenic.
  • the enzyme is peroxidase and the substrate is 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB).
  • washings are carried out. They are carried out between 1 and 10 washes. Preferably they are made from 2 to 5 washes.
  • the washes have the purpose of eliminating all those haptens, antibodies, etc., that have not been immobilized or bound to the immobilized antigens, so that everything that is detected is specific and desired.
  • the washings are preferably done with a 10 mM PBS phosphate buffer solution (Phosphate-Buffered Saline), with a saline solution with a concentration of 0.8% (P / V) and pH of 7.5.
  • the washings can be done by means of PBST buffer, that is, PBS buffer with Tween 20 a non-ionic detergent, 0.05%. In the case of using PBST, the possible free spaces in the solid support are continuously blocked.
  • a substrate of the enzyme is added to the product obtained in section (c) and incubated.
  • the presence of the hapten object of the present invention is evidenced by the appearance of a color whose intensity varies directly with the number of hapten molecules present in the sample, bound to the specific antibodies. If a fluorogenic substrate is used, the detection and quantification is carried out by means of fluorimetry and if the substrate is chemiluminescent, the signal can be quantified by means of a luminometer.
  • the enzymatic reaction is inhibited after a while since the substrate was added, for this, the optimal operating conditions of the enzyme being used are changed.
  • absorbance refers to both the absorption of light by the product and its indirect calculation by means of the measurement of the transmittance or any other parameter that allows determining the concentration by means of comparison with reference curves of measurements taken with standards at different known concentrations of the analyte that it is desired to detect and / or quantify in the sample.
  • the absorbance measured in section (f) must be compared with the absorbance of the control and determine the analyte concentration of the sample.
  • the control is a set of solutions containing the analyte that it is desired to detect and / or quantify in the present invention, at known concentrations, so that the absorbance values and the concentration values maintain a linear relationship (Lambert-Beer Law ) in a range of absorbance allowing to create a line of calibration or linear regression.
  • the concentrations of the analyte present in the sample are quantified interpolating the absorbance values in the calibration line or linear regression line.
  • the sample is wine. More preferably the wine is white wine. Due to the complexity of the red wine sample (greater number of components than white wine), the detection and / or quantification of the haptens can be carried out with dilutions of, for example 1/40.
  • kits for the detection and / or quantification in a sample of BP or a BP-derived analyte comprising, Ad antibodies and, at least, one hapten as described in the first aspect of The present invention or any of its embodiments.
  • the kit further comprises Ac2 antibodies.
  • FIG. 1 Shows the avidity of antisera by competing conjugates
  • X axis competitors.
  • Each of the haptens 2, 4, 7 and 9 are conjugated with the BSA, CONA or OVA proteins.
  • 2-HCH is the hapene 2 conjugated with the HCH protein.
  • 6-HCH is hapene 6 conjugated with the HCH protein.
  • the figure represents the absorbances detected when using the antisera
  • FIG. 2 Shows the effect of preincubation time, detergent concentration, pH and conductivity and the IC50 of immunoassays.
  • FIG. 3 It shows the calibration curve of the 9-BSA / As174 optimized immunoassay response dependent on the concentration of bromopropylate (BP).
  • FIG 4. Shows the linear correlation between the measured BP concentration and the BP concentration added to fortified samples with a known amount of the compound.
  • FIG. 5 It shows the effect of the amount of ethanol added to the calibration sample on the maximum absorption and the IC50 of the 9-BSA / As174 immunoassay.
  • FIG. 6 It shows the Interference of the samples of white wine and red wine on the immunoassay 9-BSA / As174 depending on the dilution of the sample.
  • the curves represent the values relative to the absorbance of a sample of white wine (WW), a dilution V ⁇ of a sample of white wine (WW Vz) (A) and a sample of red wine and a dilution 1/40 of a sample of red wine (B), at different concentrations of BP.
  • This ester (900 mg, 2 mmol, 1 eq.) was dissolved in 1,3-propanediol (2 mL) heating to facilitate the process. Then CS 2 CO 3 (167 mg, 0.51 mmol, 0.2 eq.) was added to the solution and allowed to react 4 h at 120 0 C. The crude was dissolved in AcOEt, washed with a saturated NaCl solution, dried with MgSO 4. , filtered and evaporated under reduced pressure, to obtain the isopropyl 2- (3-hydroxypropoxy) -2,2-bis (4-bromophenyl) acetate ester (506 mg, 41% yield).
  • hapten 9 (96 mg,> 95% yield) obtained from methyl acetate 2- (3-hydroxypropoxy) -2,2-bis (4 -bromophenyl) (105 mg, 0.22 mmol, 1eq.) and PCC (97 mg, 0.45 mmol, 2 eq.).
  • conjugates were purified by dialysis against 10 mM PBS (5 liters, 4 times) and against miliQ water (5 liters, 1 time). Finally lyophilized and stored, dried to -4o 0 C. Aliquots of dissolved work were prepared in 10 mM (1 mg / ml, 50 ul) ⁇ PBS stored at 4 0 C .Método mixed anhydride (MA). Following established protocols, hapten 2 (15 ⁇ moles) was reacted with tributylamine (4 ⁇ L, 16.5 ⁇ moles) and isobutylchloroformate (3 ⁇ l, 18 ⁇ moles) in anhydrous dimethylformamide (DMF; 160 ⁇ l).
  • DMF dimethylformamide
  • the activated hapten was divided into two equivalent fractions, which were added dropwise over a solution of HCH and a solution of BSA (30 mg / each) in 0.2 M borate buffer (1.8 ml). Active ester method (AE). Following established protocols, haptens 2 and 4 (60 ⁇ moles / each) were activated with a freshly prepared solution of N-hydroxysuccinimide (NHS, 8.62 mg, 75 ⁇ moles) and dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 30.9 mg, 150 ⁇ moles) in DMF anhydrous (200 ⁇ l) for 2 h at room temperature and subsequently reacted with the BSA proteins; CONA, OVA (10 mg / each) and the enzyme horseradish peroxidase (HRP, 2mg) in borate buffer (1.8 ml) .
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • the conjugates were characterized by Maldi-TOF-MS spectra.
  • the samples were prepared by mixing 2 ⁇ l of the solution used as a matrix, recently prepared, with 2 ⁇ l of a solution of the conjugates or proteins.
  • a 10 mg / ml solution of the trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid in CH 3 CN / H 2 O 70:30 was made with 0.1% trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the conjugates were prepared in 10 mg / ml solution in the same solvent.
  • the calculation of the density of haptens was carried out by subtracting the molecular weight (PM) of the conjugated protein and the PM of the same unconjugated protein, and all divided by the PM of the hapten.
  • hap Hales of hapten per mole of protein are calculated by MALDI-TOF-MS.
  • the immunization protocol was carried out with female rabbits of the New Zealand variety, weighing 1-2 kg. Rabbits 174, 175 and 176 were immunized with 2-HCH and rabbits 177, 178, and 179 were immunized with 6-HCH using 100 ⁇ g of the corresponding hemocyanin conjugate (2-HCH and 6-HCH are used as immunogens). Immunizations were carried out every month for up to 6 months in total until an increase in antibody titer was observed. The corresponding antisera (As) were named according to the antibody number.
  • the evolution of the As titer was controlled by an affinity experiment with serial dilutions of the As in microplates treated with the hapten 2-BSA (AE) for As 174-176 and with the hapten 6-BSA (HC) for the As 177 -179.
  • AE hapten 2-BSA
  • HC hapten 6-BSA
  • the animals were bled and the blood was collected in vacutainers tubes with serum separation gel.
  • Antisera were obtained after centrifugation and stored at - 40 0 C with 0.02% NaN3.
  • the antibody fraction from the above antisera was purified using the precipitation methods with ammonium sulfate and subsequent affinity purification against protein A or G.
  • EXAMPLE 4 Specific immunochemical method for the detection and / or quantification of BP and compounds of its chemical family.
  • microplates were upholstered with the properly diluted antigens (100 ⁇ l / well in upholstery buffer) overnight at 4 0 C. The next day, the plates were washed 4 times with PBST and the diluted Ace was added appropriately (100 ⁇ l / well with PBST buffer). After 30 minutes at room temperature, the plates were washed again as previously. A solution of antilgG-HRP (antibodies against rabbit G immunoglobins, developed in goats) was added to the wells (1/6000 in PBST, 100 ⁇ l / well) and allowed to incubate another 30 minutes at room temperature. The plates were washed 4 times and the substrate solution (100 ⁇ l / well) was added. After 30 minutes at room temperature and when protected from light, the enzymatic reaction was stopped with HbSO 4 4N (50 ⁇ l / well) and the absorbances were read.
  • HbSO 4 4N 50 ⁇ l / well
  • the previous combinations were subjected to an optimization process to determine the best conditions to carry out the test and which are those collected in the indicated procedure.
  • the characteristics of the final test are shown in Table 3.
  • the well microplates were treated with the 9-BSA conjugate (0.5 ⁇ g mi "1 in upholstery buffer, 100 ⁇ l / well) overnight at 4 0 C and covered during process with protective adhesives. The next day, the plates were washed with PBST (four times, 300 ⁇ l / well).
  • the calibration curves were prepared using serial solutions in DMSO (1075 10 3 nM - 34 nM), diluted 200 times (5375 nM - 0.17 nM) in 10 mM PBS and added to the microplates (50 ⁇ l / well), followed by As 174 (1/1000 in 10 mM PBS, 50 ⁇ l / well). After 15 minutes of incubation at room temperature, the plates were washed again as described above and a solution of antilgG-HRP (1/6000 in PBST) was added (100 ⁇ l / well) and incubated again 30 minutes more at room temperature. The plates were washed again, and the solution was added with the substrate (100 ⁇ l / well). The color development was stopped after 30 min.
  • the parameters are derived from the adjustment of the response to a four-parameter logistic equation.
  • the data is the average of 8 calibration curves performed in 5 different days.
  • EXAMPLE 5 Determination of cross reactivity. Standard solutions of different pesticides, herbicides and fungicides were prepared in DMSO at a concentration of 1mM. Calibration curves were prepared for each analyte in PBST (5375 nM - 0.17 nM) and measured by immunoassay. The value of the IC50 for each of the analytes could be obtained from the adjustment equations. The percentage of cross reactivity was calculated according to the following formula, (IC 50 BP / IC-5oComposite) x100.
  • Cross-reactivity is expressed as% of IC50 for the compound considered with respect to IC50 for bromopropylate.
  • IC50 is given in concentration nMschreib
  • EXAMPLE 6 Method for the detection of BP (and compounds of its chemical family) in wine samples.
  • Samples of white wine and red wine (commercially available) were used to study the optimized trial.
  • the samples were buffered by adjusting the pH to 7.5 and used to prepare the standard BP curves. He The test was carried out following the protocol described above and the absorbances obtained were adjusted to the equation of 4 parameters to compare the results with the curve in the absence of wine.

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Abstract

La presente invención se refiere a varios haptenos derivados de bromopropilato(BP), sus usos para Ia síntesis de inmunoreactivos así como un método inmunoquímico para Ia detección y/o cuantificación de bromopropilato (BP) y sus respectivos kits. La estructura química de los haptenos empleados, tanto para Ia inmovilización en el soporte sólido como para Ia inmunización de animales para obtener los respectivos anticuerpos policlonales, se ha diseñado para maximizar el reconocimiento del grupo bis-bromofenil del BP por parte de los anticuerpos generados. El método de Ia presente invención se refiere a un análisis inmunoquímico indirecto capaz de detectar BP con un umbral de 0.14 μg-L-1 y pesticidas relacionados que contienen un grupo bis-halofenil en su estructura. Además, el BP se puede analizar directamente en muestras de vino.

Description

HAPTENOS. USOS Y MÉTODO [NMUNOQUflVlICO PARA LA DETECCIÓN
DE BROMOPROPILATO.
La presente invención se refiere a varios haptenos derivados de bromopropilato (BP), sus usos para Ia síntesis de inmunoreactivos así como un método inmunoquímico para Ia detección y/o cuantificación de bromopropilato (BP) y sus respectivos kits. La estructura química de los haptenos empleados, tanto para Ia inmovilización en el soporte sólido como para Ia inmunización de animales para obtener los respectivos anticuerpos policlonales^ se ha diseñado para maximizar el reconocimiento del grupo bis-bromofenil del BP por parte de los anticuerpos generados. El método de Ia presente invención se refiere a un análisis inmunoquímico indirecto capaz de detectar BP con un umbral de 0.14 μg-L-1 y pesticidas relacionados que contienen un grupo bis-halofenil en su estructura. Además, el BP se puede analizar directamente en muestras de vino.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
En los últimos años se viene detectando Ia presencia de residuos de pesticidas en frutas y verduras. El consumo de estos alimentos supone un claro peligro potencial sobre los seres humanos y el ambiente.
El bromopropilato (BP) es un miticida de contacto que se ha utilizado extensivamente en agricultura contra todas las etapas del ciclo de vida de los ácaros, por ejemplo, de las familias Eriophyidae, Tenuipalpidae o de Tetranychidae. El BP es un compuesto no sistémico y no penetrante que permanece en Ia cascara de frutas y no emigra en Ia pulpa. Por otra parte, el BP es bastante persistente en el ambiente en medios ácidos (50 días de vida media) y neutrales (más de 3 años de vida media. El BP tiene toxicidad aguda baja en las ratas y los conejos. Sin embargo, los efectos del BP sobre seres humanos son desconocidos. El INCHEM (International programme on chemical safety) establece una ingesta diaria aceptable de entre 0-0.03 mg/kg en seres humanos. El BP fue probado en primer lugar en 1966 para el control de ácaros. Hoy en día, el uso de BP ha sido prohibido en el Reino Unido. En varios Estados de Ia Unión Europea se permite mantener el uso autorizado de BP hasta 2008, mientras que se buscan alternativas (regulación 2076/2002/EC). El nivel de residuo máximo temporal (MRLs) en productos tales como uvas para vinificación, cítricos y manzanas (2 mg-Kg-1) se ha establecido de acuerdo con Ia Directiva 90/642/EEC. Sin embargo, los datos de Ia Comisión Europea demuestran que todavía hay un uso continuo de BP en viñedos ya que se han encontrado residuos de BP en Noruega, Islandia, Dinamarca, Italia y Lichtenstein en uvas de mesa con los niveles de residuo que excedían los MRLs (COMMUNITIES, C. O. T. E., Monitoring of Pesticide Residues in Products of Plant Origin in the European Union, Norway, iceland, Denmark, Italy and Liechtenstein. En DOCUMENT, C. S. W., Ed. 2005).
El procedimiento clásico usado para detectar y/o para cuantificar este tipo de compuestos incluye su extracción y separación de otras sustancias potencialmente de interferencia de Ia muestra biológica y Ia cuantificación posterior por análisis instrumental. Aunque los métodos analíticos convencionales ofrecen límites de detección a nivel de partes por billón (ppb), requieren de instrumentación cara y personal especializado para poder llevar a cabo las detecciones y/o cuantificaciones. Además, este tipo de métodos pueden sufrir pérdidas en Ia recuperación del compuesto que se desea analizar.
Para garantizar Ia calidad de Ia fruta y verdura, se analiza el BP mediante técnicas cromatográficas tales como cromatografía líquida de alto rendimiento (Martel y Zeggane (2002). J.Chromatog. A. 954(1 -2): 173-180), cromatografía de gas (Lee y Kennedy (2001). J. AOAC Int. 84(5): 1393-1406) o cromatografía gaseosa-espectrometría de masa (Liapis et al. (2003). J. Chromatoα. A. 996(1- 2): 181 -187). Estas técnicas tienen límites de detección alrededor de los MRLs. Sin embargo, una desventaja importante de estos procedimientos es que requieren un método de extracción complejo tal como extracción líquida, sólido- fase o microθxtracción sólido-fase antes del análisis. Consecuentemente, las técnicas cromatográficas requieren un tiempo considerable, el instrumental necesario es caro y el personal debe estar muy especializado.
Se han desarrollado immunoensayos para Ia detección de pesticidas y otros agentes contaminantes ambientales, tales como insecticidas organofosforados (Lee et al. (1995). J. Agrie. Food Chem. 43(6): 1730-1739). No obstante, hasta el presente, no existe ningún método ni los reactivos necesarios para Ia detección de BP mediante inmunoensayos. Para conseguirlos se requiere un complejo y no descrito proceso de síntesis de aquellos derivados que puedan presentarse en Ia naturaleza de forma que se puedan detectar de forma específica y con un bajo umbral de detección.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un conjunto de haptenos estructuralmente relacionados, desde el punto de vista químico, con el bromopropilato (BP) y otros compuestos de esta familia de pesticidas y sus intermedios de síntesis y de degradación medioambiental, sus usos para Ia síntesis de inmunoreactivos así como un método inmunoquímico para Ia detección y/o cuantificación de bromopropilato (BP). El método de Ia presente invención está basado en Ia síntesis de derivados de BP (en adelante, haptenos) y anticuerpos policlonales específicos. La estructura química de los haptenos empleados, tanto para Ia inmovilización en el soporte sólido como para Ia inmunización de animales para obtener los respectivos anticuerpos policlonales, fue diseñada para maximizar el reconocimiento del grupo bis-halofenilmetilen del BP. Para producir respuesta inmunológica en el animal, se conjugaron los diferentes haptenos sintetizados a diversas proteínas. Por tanto, el método de Ia presente invención se refiere a Ia detección y/o cuantificación inmunológica indirecta capaz de detectar BP con un umbral de 0.14 μg-L-1. Los estudios en Ia selectividad de este immunoensayo han demostrado un alto reconocimiento de los pesticidas relacionados que contienen un grupo bis-halofenilmetilen en su estructura. Otros pesticidas no interfieren en el análisis de BP usando esta técnica inmunoquímica. Además, tal como se demuestra en el ejemplo correspondiente, el BP se puede analizar directamente en muestras de vino sin Ia necesidad de un procedimiento de limpieza de aplicar el método.
En este sentido, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un hapteno de bromopropilato (BP) de fórmula general I
Figure imgf000005_0001
(I) Donde X es un halógeno seleccionado de entre Cl, Br, I ó F;
Ri se selecciona de entre Cl, Br, OH ó O-(CH2)n-Rg;
Y es O ó NH y cuando Y es O, R2 es H o alquilo (CrC4) y cuando Y es NH, R2 es -(CH2)n-Rg; donde n toma valores de entre 2 a 4 y Rg se selecciona de entre OH. CHO.
COOH, NH2 o SH. Cuando R1 es O-(CH2)n-Rg, Rg también puede ser
- OCOCH2I.
En Ia presente invención se entiende por "halógeno" un átomo de Bromo (Br), Cloro (Cl), yodo (I) o flúor (F). Preferiblemente el halógeno es Br y más preferiblemente, en el hapteno de fórmula general (I), el halógeno(X) es Br. Los sustituyentes de los arilos (X) están preferiblemente situados en posición para de ambos anillos. Por Io que preferiblemente, los haptenos de Ia presente invención presentan Ia fórmula general (II):
Figure imgf000006_0001
El término "alquilo" se refiere, en Ia presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n- hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 4 átomos de carbono. Más preferiblemente es metilo o isopropilo (i-propilo).
Según otra realización preferida, Y es O y R2 es un grupo metil o ¡sopropilo.
En otra realización preferida, Y es NH y R2 es -(CHbh-COOH.
Según una realización preferida, el hapteno de BP se selecciona de Ia lista que comprende: • ácido 2,2-bis(4-bromofenil)-N-2-hidroxiacetamida-butanoico,
• ácido 4-(2,2-bis(4-bromofenil)-2-cloroacetamido)butanoico,
• 2-¡odoacetato de propilo 3-((isopropoxicarbonil)bis(4- bromofenil)metoxi),,
• acetato de isopropil 2-(2-formiletoxi)-2,2-b¡s(4-bromofenil), o • acetato de metil 2-(2-formiletoxi)-2,2-bis(4-bromofenil).
Un hapteno es un compuesto químico que, cuando ingresa en un cuerpo animal, no induce por sí mismo Ia formación de anticuerpos debido a su pequeño tamaño pero, cuando está unido covalentemente a una proteína el complejo resultante es capaz de estimular una respuesta inmunitaria. En resumen un hapteno es Ia parte de un antígeno que por sí sola no dispara respuesta inmune, pero sí induce Ia especificidad deseada en Ia respuesta inmune. Preferentemente el hapteno puede unirse de forma covalente a los grupos lísina de las proteínas mediante los grupos aldehido o los grupos carboxilo.
El hapteno de Ia presente invención es un compuesto análogo estructuralmente al analito presente en Ia muestra. El hapteno ideal es aquel que preserva Ia mayoría de las características estéricas y electrónicas del compuesto y mimetiza Ia geometría espacial de Ia estructura química Io máximo posible.
Según otra realización preferida, el hapteno de BP se conjuga con una proteína o un polímero. El polímero al que permanece conjugado el hapteno de BP de Ia presente invención puede ser, pero sin limitarse, el dextrano (simple o modificado), polipirrol, polianilina (heteropolímeros con monoceros que soportan funcionalidades reactivas) o polilisina.
Según otra realización más preferida el hapteno de BP está conjugado con una proteína que se selecciona de Ia lista que comprende hemocianina de molusco (por ejemplo, HCH o KLH), seroalbúmina (por ejemplo, BSA, RSA), ovalbúmina (OVA) o conalbúmina (CONA).
Tal como se entiende en Ia presente invención, el hapteno conjugado a una proteína se denomina antígeno si el objetivo de ese compuesto es unirse a los anticuerpos específicos contra el analito o inmunógeno si se utiliza para desencadenar Ia ^ respuesta inmunológica en un organismo animal. Preferiblemente Ia proteína tiene una masa molecular relativa mayor de 15 KDa y procede de un animal distinto del animal que se desea inmunizar (según se describe más adelante). Las proteínas se unen al hapteno por medio de los aminoácidos de su capa exterior y aminoácidos accesibles con cadenas laterales de tipo núcleofilo, es decir, las proteínas tienen, al menos, un aminoácido reactivo que se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, cisteína, serina, tirosina o lisina. Otro aspecto de Ia presente invención es el uso de cualquiera de los haptenos descritos, conjugados o no con una proteína o polímero tal como se ha descrito en los párrafos anteriores, para Ia síntesis de inmunoreactivos. Los de competición para las técnicas inmunoquímicas de detección.
Según una realización más preferida del uso del hapteno de BP, el inmunoreactivo se selecciona de Ia lista que comprende inmunógeno, antisuero, anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, antígeno, trazadores para inmunoensayos o trazadores para inmunosensores.
El término "inmunoreactivos" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a cualquier molécula que pueda ser empleada en ensayos inmunoquímicos. El inmunógeno es cualquier conjugación de cualquiera de los haptenos según el primer aspecto de Ia presente invención con una proteína de forma que genere una respuesta inmunológica en el animal en el que ingresa el antígeno o para unir específicamente los anticuerpos selectivos generados en cuyo caso se denomina antígeno o competidor. El antisuero es el suero que se obtiene de Ia sangre de un animal que contiene una mezcla de anticuerpos que son sintetizados como consecuencia del ingreso del hapteno conjugado con una proteína en el cuerpo del animal. El anticuerpo es Ia inmunoglobulina que el animal ha sintetizado de forma específica contra el hapteno conjugado con una proteína y que está libre de restos de componentes del suero. El competidor es un hapteno análogo al analito presente en Ia muestra que se desea detectar y/o cuantificar y que es empleado en el método de detección y/o cuantificación de un analito derivado de BP tal como se describe más adelante.
Otro aspecto de Ia presente invención es un método para Ia detección y/o cuantificación en una muestra de BP o de un analito derivado de BP que comprende: a. Inmovilizar un hapteno tal y como se ha descrito anteriormente
(antígeno) en un soporte sólido, b. mezclar Ia muestra y un anticuerpo o antisuero anti-antígeno en el soporte sólido del apartado (a) para formar un primer complejo, c. añadir un segundo anticuerpo marcado al complejo formado según el apartado (b) para formar un segundo complejo y d. detectar y/o cuantificar el segundo complejo obtenido según el apartado (c) con una composición que contenga un sustrato indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente.
El término "soporte sólido" tal como se entiende en Ia presente invención, se refiere a una gran variedad de materiales, como por ejemplo, Ia resina de intercambio iónico o adsorción, el vidrio, plástico, látex, nylon, gel, esteres de celulosa, esferas paramagnéticas o Ia combinación de algunos de ellos, pero sin limitarse a los materiales mencionados anteriormente. Preferiblemente el material del soporte sólido es plástico y el soporte son placas estándar para análisis ELISA.
La inmovilización del antígeno en Ia superficie de un soporte como el plástico de poliestireno es dirigido por Ia química de Ia superficie. Hay muchos factores que pueden modificar Ia capacidad de inmovilización de los antígenos. El tiempo y Ia temperatura de incubación son muy importantes. Generalmente a mayor temperatura menos tiempo de incubación es necesario pero es preferible utilizar una temperatura de entre 3 y 6 0C durante un tiempo de entre 10 y 20 horas para inmovilizar los anntígenos a Ia superficie del soporte sólido.
El paso de inmovilización de un antígeno incluye el bloqueo de los espacios del soporte que no hayan sido ocupados por los antígenos ya que Ia unión al mismo no es selectiva y de no llevarse a cabo el bloqueo se podrían unir otras moléculas no específicas. El bloqueo se lleva a cabo mediante proteínas o detergentes, preferiblemente detergentes no iónicos.
El anticuerpo o antisuero marcado tal como se entiende en Ia presente invención es un anticuerpo conjugado con un compuesto capaz de reaccionar con algún sustrato, de forma que se derive de ello una detección cromogénica, fluorogénica y/o quimioluminiscente. Este compueesto puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro componente. Un ejemplo de compuesto susceptible de ser detectado es Ia enzima peroxidasa. Preferiblemente el sustrato indicador es cromogénico, como por ejemplo, Ia 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), el ácido azino-bis(3-etilbenzotiazolina 6- sulfónico) o Ia fenilendiamina, sin limitación de utilizar otros sustratos. En el caso de emplear un sustrato cromogénico, Ia presencia de haptenos de fórmula general I en Ia muestra se evidencia por Ia aparición de un color cuya intensidad varía directamente con el número de moléculas unidas a los anticuerpos Ad y su cuantificación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por medio de espectcofotometría. Si se emplea un sustrato fluorogénico Ia detección y cuantificación se realiza por medio de fluorimetría y si el sustrato es quimioluminiscente, Ia señal se puede cuantificar por medio de un luminómetro.
Una realización preferida del método de detección y/o cuantificación comprende: a. Inmovilizar un hapteno según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 (antígeno) en un soporte sólido. b. añadir Ia muestra y anticuerpos anti-antígeno (Ad) preincubados, al antígeno inmovilizado del apartado (a) e incubar, c. añadir anticuerpos anti-Ad (Ac2) conjugados con una enzima, a los anticuerpos Ad del apartado (b) e incubar, d. lavar después de cada uno de los pasos (a), (b) y (c), e. añadir un sustrato de Ia enzima al producto obtenido en el apartado (c) e incubar, f. medir Ia absorbancia del producto obtenido en el apartado (e) y g. comparar Ia absorbancia medida en el apartado (f) con Ia absorbancia del control y determinar Ia concentración del analito de Ia muestra. Después de Ia inmovilización del antígeno del apartado (a), se añade Ia muestra y anticuerpos anti-antígeno (Ad) preincubados, al antígeno inmovilizado del apartado (a) e incubar. La muestra contiene el hapteno que se desea detectar. Los anticuerpos Ad se obtienen tal como se describe en el ejemplo correspondiente. La obtención de los Ad comprende; Conjugar un hapteno de fórmula general I con una proteína, introducir el producto obtenido de Ia conjugación en un animal y obtener los anticuerpos producidos por el animal. Preferiblemente el animal es un conejo.
La preincubación consiste en mezclar Ia muestra y anticuerpos anti-antígeno (Ad) durante un tiempo determinado, preferiblemente menos de 30 minutos, a una temperatura de entre 20 y 4O0C. Con incubaciones de más de 30 minutos no se mejoran los resultados. La mezcla preincubada se añade al antígeno inmovilizado en el soporte sólido y se incuba en las mismas condiciones que Ia preincubación durante un tiempo de entre 5 y 60 minutos. De esta manera se consigue Ia unión de Api y los haptenos de Ia muestra, reconocidos por los anticuerpos, a los antígenos inmovilizados en el soporte.
Después se añaden anticuerpos anti-Ad (Ac2) conjugados con una enzima, a los anticuerpos Ad del apartado (b) y se incuban. Los anticuerpos Ac2 se obtienen en una animal diferente del que se ha empleado para producir los anticuerpos Ad mediante Ia introducción de anticuerpos Ad en el animal y Ia obtención de los anticuerpos anti-Ad producidos por el animal.
Preferiblemente el animal es una cabra. Los anticuerpos Ac2 se incuban el complejo antígeno-hapteno de Ia muestra-Ad inmovilizado en el soporte sólido y se incuba en las mismas condiciones descritas para el paso anterior del método. Los anticuerpos Ac2 se conjugan con un enzima
Los anticuerpos Ac2 están unidos (mediante conjugación) con una enzima. La enzima es capaz de reaccionar con un sustrato de forma que se derive de ello una detección cromogénica, fluorogénica y/o quimioluminiscente. Preferiblemente la detección es cromogénica. Preferiblemente Ia enzima es peroxidasa y el sustrato es 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).
Después de cada uno de los pasos anteriores (a), (b) y (c) se llevan a cabo lavados. Se llevan a cabo entre 1 y 10 lavados. Preferiblemente se hacen de entre 2 a 5 lavados. Los lavados tienen Ia finalidad de eliminar todos aquellos haptenos, anticuerpos, etc., que no se hayan inmovilizado o unido a los antígenos inmovilizados, de forma que todo aquello que sea detectado sea específico y deseado. Los lavados se hacen preferiblemente con una solución de tampón fosfato PBS (Phosphate-Buffered Saliné) 10 mM, con una solución salina con una concentración del 0,8% (P/V) y pH de 7,5. Además, los lavados pueden hacerse mediante tampón PBST, es decir, tampón PBS con Tween 20 un detergente no-iónico, al 0,05%. En el caso de usar PBST se bloquean de forma continua los posibles espacios libres en el soporte sólido.
A continuación se añade un sustrato de Ia enzima al producto obtenido en el apartado (c) y se incuba. La presencia del hapteno objeto de Ia presente invención se evidencia por Ia aparición de un color cuya intensidad varía directamente con el número de moléculas de hapteno presentes en Ia muestra, unidas a los anticuerpos específicos. Si se emplea un sustrato fluorogénico Ia detección y cuantificación se realiza por medio de fluorimetría y si el sustrato es quimioluminiscente, Ia señal se puede cuantificar por medio de un luminómetro.
La reacción enzimática es inhibida pasado un tiempo desde que se añadió el sustrato, para ello, se cambian las condiciones óptimas de funcionamiento de Ia enzima que se esté utilizando.
Cuando Ia reacción enzimática ya ha tenido lugar, se mide Ia absorbancia del producto obtenido en el apartado (e). El término "absorbancia" hace referencia tanto a Ia absorción de luz por parte del producto como a su cálculo indirecto mediante Ia medida de Ia transmitancia o cualquier otro parámetro que permita determinar Ia concentración mediante Ia comparación con curvas de referencia de medidas tomadas con patrones a diferentes concentraciones conocidas del analito que se desea detectar y/o cuantificar en Ia muestra.
Se debe comparar Ia absorbancia medida en el apartado (f) con Ia absorbancia del control y determinar Ia concentración del analito de Ia muestra. El control es un conjunto de soluciones que contiene el analito que se desea detectar y/o cuantificar en Ia presente invención, a concentraciones conocidas, de modo que los valores de absorbancia y los valores de concentración mantienen una relación lineal (Ley de Lambert-Beer) en un rango de absorbancia permitiendo crear una recta de calibrado o de regresión lineal. Las concentraciones del analito presente en Ia muestra son cuantificadas interpolando los valores de absorbancia en Ia recta de calibrado o recta de regresión lineal.
Otra realización preferida es el método en el que Ia muestra es vino. Más preferiblemente el vino es vino blanco. Debido a Ia complejidad de Ia muestra de vino tinto (mayor número de componentes que el vino blanco), Ia detección y/o cuantificación de los haptenos se puede llevar a cabo con diluciones de, por ejemplo 1/40.
Otro aspecto de Ia presente invención es un kit para Ia detección y/o cuantificación en una muestra de de BP o de un analito derivado de BP que comprende, anticuerpos Ad y, al menos, un hapteno según se ha descrito en el primer aspecto de Ia presente invención o cualquiera de sus realizaciones.
Según una realización preferida, el kit comprende además anticuerpos Ac2.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Muestra Ia avidez de los antisueros por los conjugados competidores
Eje X: competidores. Cada una de los haptenos 2, 4, 7 y 9 se conjugan con las proteínas BSA, CONA u OVA.
2-HCH es el hapeno 2 conjugado con Ia proteína HCH.
6-HCH es el hapeno 6 conjugado con Ia proteína HCH. La figura representa las absorbancias detectadas al utilizar los antisueros
As174 a 179 y los respectivos competidores. Se utiliza una dilución 1/2000 de antisueros y una concentración de competidor de 1 μg-mL'1.
FIG. 2. Muestra el efecto del tiempo de preincubación, concentración de detergente, pH y conductividad y el IC50 de los inmunoensayos.
FIG. 3. Muestra Ia curva de calibración de Ia respuesta del inmunoensayo optimizado 9-BSA/As174 dependiente de Ia concentración de bromopropilato (BP).
FIG 4. Muestra Ia correlación lineal entre Ia concentración de BP medida y Ia concentración de BP añadida a muestras fortificadas con una cantidad conocida del compuesto.
FIG. 5. Muestra el efecto de Ia cantidad de etanol añadido a Ia muestra de calibración sobre Ia absorción máxima y el IC50 del inmunoensayo 9- BSA/As174. FIG. 6. Muestra la Interferencia de las muestras de vino blanco y vino tinto sobre el inmunoensayo 9-BSA/As174 en function de Ia dilución de Ia muestra.
Las curvas representan los valores relativos a Ia absorbancia de una muestra de vino blanco (WW), una dilución V≥ de una muestra de vino blanco (WW Vz) (A) y una muestra de vino tinto y una dilución 1/40 de una muestra de vino tinto (B), a diferentes concentraciones de BP.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen Ia síntesis de algunos de los haptenos de bromopropilato, Ia generación de anticuerpos policlonales con ellos y el método inmunoquímico de detección y/o cuantificación de bromopropilato (BP).
EJEMPL0 1. Síntesis de haptenos de BP.
1.1. Ácido 212-bis(4-bromofenil)-N-2-hidroxiacetamida-butanoico (hapteno 2).
En una solución 1 M de NaOH (5 mi) se añadió una solución de BP (1g, 2 mmoles, 1eq.) en MeOH (5 mi). La mezcla fue agitada durante 1 h a temperatura ambiente hasta que se apreció Ia desaparición del producto de partida. El crudo de Ia reacción fue limpiado con hexano, acidificado con HCI y extraído con AcOEt. La fase orgánica fue secada con MgSO4, filtrada y evaporada bajo presión reducida para obtener el ácido bis(4-bromofenil)-2-hidrox¡acético (930 mg, 92% rendimiento). 1H NMR (300MHz, DMSO-d6); δ: 7.25 (d, J=8.4Hz, 4H, Ar meta), 7.53 (d, J=8.6Hz, 4H1 Ar orto). 13C NMR (75MHz1 DMSO-d6); δ: 122.3 (q), 129.0 (s), 131.2 (s), 140.6 (q), 172.9 (q). A continuación, se mezcló el ácido (660 mg, 1.72 mmoles, 1eq.) y 1 ',1 '-carbonildiimidazol (CDI) (337 mg, 2.07 mmoles, 1.2 eq.) diluidos en CH2CI2 (10 mi) anhidro. Una solución del clorohidrato de metil 3-aminopropanoato (256 mg, 1.72 mmoles, 1eq.) en CH2CI2 anhidro (2 mi) fue añadido lentamente bajo atmósfera de Ar a Ia mezcla anterior. Se dejó reaccionar Ia mezcla durante 24 horas a temperatura ambiente. Se evaporó CH2CI2 y el crudo de reacción fue disuelto en Etθ2 y lavado con NaHCθ3. La fase orgánica fue secada con MgSO4, filtrada y evaporada. Finalmente el crudo de reacción fue purificado para obtener el ester de metil 2,2-bis(4-bromofenil)-N-2-hidroxiacetamida-butanoato (380 mg, 42% rendimiento). 1H NMR (300MHz, CDCI3); δ: 1.85 (q, J=6.9Hz J=6.7Hz, 2H1 -CH2-), 2.32 (t, J=6.9Hz, 2H, -CH2-), 3.36 (dt, J=6.7 J=6.2Hz ,2H1 -CH2-), 3.64 (s, 1H, -CH3), 7.28 (d, J=8.6Hz, 4H, Ar meta), 7.46 (d, J=8.6Hz, 4H, Ar orto). 13C NMR (125MHz, CDCI3); δ: 24.2 (dV31.1 (d), 38.9 (d), 51.6 (t), 80.3 (q), 122.3 (q), 129.0 (s), 131.2 (s), 141.4 (q), 172.5 (q), 173,5 (q). Este ester (140 mg, 0.41 mmoles, 1 eq.) fue hidrolizado con una solución acuosa 1 M de NaOH (5 mi) en MeOH (5 mi) a temperatura ambiente hasta Ia completa desaparición del ester de partida. El crudo de Ia reacción fue lavado con HCI y extraído con AcOEt. La fase orgánica fue secada con MgSθ4 filtrado y evaporado hasta Ia sequedad bajo presión reducida par obtener el hapteno 2 (126 mg, 95 % de rendimiento). MS, m/z (%) 469.9(100), 467.9(M+, 42), 396.8(10).[Found (by mass spectrometry): M, 467.944060. C18Hi6Br2NO requires M, 467.944605]. 1H NMR (300MHz, CDCI3); δ: 1.77 (q, J=6.6Hz J=6.4Hz, 2H, -CH2-), 2.28 (t, J=6.6Hz, 2H, -CH2-), 3.36 (dt, J=6.4 J=6.2Hz ,2H, -CH2-), 7.14 (d, J=8.6Hz, 4H, Ar meta), 7.38 (d, J=8.6Hz, 4H, Ar orto). 13C NMR (75MHz, CDCI3); δ: 24.2 (d), 31.3 (d), 39.0 (d), 80.6 (q), 122.4 (q), 129.2 (s),
131.3 (s), 141.2 (q)Λi72.9 (q), 178,2 (q). IR, v (KBr, crrf1); 3387 (-OH), 1707 (C=O), 1655 (C=O). HRMS: encontrado 467.944060, C18H16Br2NO4 467.944605 (Ruta 1).
Figure imgf000017_0001
Ruta 1. Ruta de síntesis de los haptenos 2 y 4.
1.2. Ácido 4-(2,2-bis(4-bromofenil)-2-cloroacetamido)butanoico (hapteno 4).
Al éster de metil 2,2-b¡s(4-bromofenil)-N-2-hidroxiacetamida-butanoato (112 mg, 0.23 mmoles, 1 eq.) se Ie añadió SOCI2 (165 μL, 2.2 mmoles, 10 eq.) gota agota y Ia mezcla fue calentada hasta reflujo durante 1 hora. El crudo de reacción se diluyó en hexano, se lavά con 1M NaOH y se extrajo con AcOEt. La fase orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se evaporó con presión reducida para obtener el ester de metil 4-(2,2-bis(4-bromofenil)-2-cloroacetamido)butanoato (59 mg, 50% rendimiento). 1H NMR (500MHz, CDCI3); δ: 1.81 (q, J=5.4Hz J=5.1Hz, 2H1 -CH2-), 3.31 (t, J=5.4Hz, 2H, -CH2-), 3.78 (s, 1H, -CH3), 3.84 (m, 2H, -CH2-), 7.26 (d, J=8.3Hz, 4H, Ar meta), 7.46 (d, J=8.3Hz, 4H, Ar orto). 13C NMR (125MHz, CDCI3); δ: 32.3 (s), 53.2 (d), 60.6 (d), 63.5 (t), 86.1 (q), 122.9 (q), 130.3 (s), 131.4 (s), 139.3 (q), 172.1 (q), 178.2 (q). A continuación este ester (59 mg, 0.11 mmoles. 1 eq.) fue hidrolizado con una solución acuosa 1M de NaOH, siguiendo el mismo protocolo descrito anteriormente, para obtener finalmente el hapteno 4 (50 mg, 90% rendimiento). 1H NMR (300MHz, CDCI3); δ: 1.77 (q, J=6.6Hz J=6.4Hz, 2H, -CH2-), 2.3 (t, J=6.6Hz, 2H, -CH2-), 3.19 (dt, J=6.4 J=6.2Hz ,2H, -CH2-), 7.14 (d, J=8.6Hz, 4H, Ar meta), 7.38 (d, J=8.6Hz, 4H, Ar orto). 13C NMR (125MHz, CDCI3); δ: 24.2 (d), 31.3 (d), 39.0 (d), 80.6 (q), 122.4 (q), 129.2 (s), 131.2 (s), 141.2 (q), 172.9 (q), 178.2 (q). IR, v (KBr, crrf1); 2929 (-OH), 1727 (C=O)1 1658 (C=O) (Ruta 1). 1.3. 3-iodopropionato de 3-((isopropoxicarbonil)bis(4-bromofenil)metoxi)propil (hapteno 6).
Se añadió SOCI2 (700 μl_, 9.3 mmoles, 4 eq.) gota a gota bajo atmósfera de Ar a BP (1g, 2.3 mmoles, 1 eq.) y se dejó reaccionar media hora hasta Ia completa desaparición del producto de partida . El crudo de Ia reacción fue disuelto en hexano, lavado con NaOH 1 M y extraído con AcOEt. La fase orgánica se secó a continuación con MgSO4, filtrado y evaporado bajo presión reducida para obtener el ester de isopropil 2,2-bis(4-bromofenil)-2-cloroacetato (0.93 g, 90 % de rendimiento). 1H NMR (300MHz, CDCI3); δ: 1.24 (d, J=5.9Hz, 6H, (-CH3J2), 5.13 (m, J=6.6, 1H, -CH-), 7.26 (d, J=7.9Hz, 4H, Ar meta), 7.48 (d, J=7.9Hz, 4H, Ar orto). 13C NMR (75MHz1 CDCI3); δ: 21.7 (t), 71.9 (s), 75.9 (q), 123.3 (q), 130.4 (s), 131.7 (s), 139.8 (q), 168.3 (q). Este ester (900 mg, 2 mmoles, 1 eq.) fue disuelto en 1,3- propandiol (2 mi) calentando para facilitar el proceso. A continuación CS2CO3 (167 mg, 0.51 mmoles, 0.2 eq.) fue añadido a Ia solución y se dejó reaccionar 4 h a 120 0C. El crudo fue disuelto en AcOEt, lavado con una solución saturada de NaCI, secado con MgSO4, filtrado y evaporado bajo presión reducida, para obtener el ester de isopropil 2-(3-hidroxipropoxi)-2,2-bis(4-bromofenil)acetato (506 mg, 41% de rendimiento). 1H NMR (300MHz, CDCI3); δ: 1.19 (d, J=6.2Hz, 6H, (-CH3)2), 3.29 (t, J=5.5, 2H, -CH2-), 3.86 (t, J=5.5, 2H, -CH2-), 5.11 (m, J=6.2, 1H, -CH-), 7.26 (d, J=7.9Hz, 4H, Ar meta), 7.48 (d, J=7.9Hz, 4H, Ar orto).A continuación, a una solución de este ester en CH2CI2 (2 mi) fue añadido bajo atmósfera de Ar ácido iodoacético (338 mg, 1.8 mmoles, 3 eq.). La mezcla reaccionó 24 h a 50 0C. El crudo de Ia reacción se diluyó en AcOEt, se lavó con una solución saturada de NaCI, se secó con MgSO4, se filtró y se evaporó. A continuación este crudo se purificó mediante cromatografía flash usando como fase móvil hexano: AcOEt (4:1) para obtener el hapteno 6 (204 mg, 62% de rendimiento). 1H NMR (500MHz, CDCI3); δ: 1.19 (d, J=6.3Hz, 6H, (-CH3)2), 1.93 (tt, J=6.4 J=5.9Hz, 2H, -CH2-), 3.33 (t, J=5.9, -CH2-), 3.62 (s, 2H, -CH2-), 4.27 (t, J=6.4Hz, 2H, -CH2-), 5.08 (m, J=6.3Hz, 1 H, -CH-), 7.26 (d, J=7.9Hz, 4H, Ar meta), 7.48 (d, J=7.9Hz, 4H, Ar orto). 13C NMR (125MHz, CDCI3); δ: -5.11(d), 21.8 (t), 29.17 (d), 61.8 (d), 63.6 (d), 70.0 (s), 85.9(q), 123.0 (q), 130.4 (s), 131.3 (s), 140.0 (q), 168.9 (q), 170.3 (q). IR, v (KBr1 cnrf1); 1705 (C=O)1 1656 (C=O). HRMS: encontrado 650.884798, C22H22Br2IO4 650.887798 (Ruta 2).
1.4. Acetato de isopropil 2-(2formiletoxi)-2,2-bis(4-bromofenil) (hapteno 7).
A una solución de clorocromato de piridinio (PCC) (4.14 mg, 1.9 mmoles, 2 eq.) en CH2CI2 anhidro (4 mi) se Ie añadió el ester de isopropil 2-(3-hidroxipropoxi)-2,2- bis(4-bromofenil)acetato (467 mg, 0.96 mmoles, 1 eq.) bajo atmósfera de Ar. La mezcla reaccionó 2 h a temperatura ambiente, a continuación se diluyó en AcOEt, se filtró a través de^zeolita y se concentró hasta Ia sequedad. El crudo se purificó mediante cromatografía flash usando hexano: AcOEt (4:1) como fase móvil para obtener el hapteno 7 (278 mg, 60% rendimiento). 1H NMR (500MHz, CDCI3); δ: 1.19 (d, J=6.4Hz, 6H, (-CH3)2), 2.66 (td, J=6.1 J=2.0Hz, 2H, -CH2-), 3.33 (t, J=6.1Hz, -CH2-), 5.09 (m, J=6.4Hz, 1H, -CH-), 5.08 (m, J=6.3Hz, 1H, -CH-), 7.27 (d, J=8.8Hz, 4H, Ar meta), 7.46 (d, J=8.6Hz, 4H1 Ar orto), 9.8 (t, J=2.0Hz, 1H). 13C NMR (125MHz, CDCI3); δ: 21.8 (t), 44.1 (d), 60.0 (d), 63.6 (d), 70.0 (s), 86.1 (q), 122.8 (q), 130.3 (s), 131.4 (s), 139.6 (q), 170.1 (q), 201.6 (q). IR, v (KBr, cm"1); 1727 (C=O), 1587 (C=O). HRMS: encontrado 498.9586, C20H20 Br2O5 498.9580 (Ruta 2).
Figure imgf000019_0001
Hapteno 5 Hapteno 6
Figure imgf000019_0002
Ruta 2. Ruta de síntesis de los haptenos 6, 7 y 9.
1.5. Acetato de metil 2-(2-formiletoxi)-2,2-bis(4-bromofenil) (hapteno 9).
Una solución de acetato de isopropil 2-(3-hidroxipropoxi)-2,2-bis(4-bromofenil) (500 mg, 1.03 mmoles, 1 eq.) en MeOH (2 mi) fue hidrolizada con 1M de NaOH (2 mi) siguiendo el protocolo descrito con anterioridad para obtener el ácido de 2-(3- hidroxipropoxi)-2,2-bis(4-bomofenil)acético (324 mg, 71% rendimiento). 1H NMR (500MHz, CDCI3); δ: 1.70 (tt, J=5.5H J=5.3Hz, 2H, -CH2-), 3.24 (t, J=5.5HZ, 2H, - CH2-), 3.91 (t, J=5.3Hz, 2H, -CH2-), 7.30 (d, J=8.6Hz, 4H, Ar meta), 7.45 (d, J=8.4Hz, 4H, Ar orto). A una solución de este ácido (100 mg, 0.96 mmoles) en MeOH anhidro (2 mi) se Ie añadió gota a gota SOCI2 (200 μl_, 2.6 mmoles, 4 eq.) bajo atmósfera de Ar. La mezcla fue llevada a reflujo durante 30 min., a continuación fue diluida con hexano, lavada con NaOH 1M y extraída con AcOEt. La fase orgánica fue secada con MgSO4, filtrada y evaporada. El crudo de Ia reacción se purificó mediante cromatografía flash usando hexano:AcOEt (4:1) como fase móvil para obtener acetato de metil 2-(3-hidroxipropoxi)-2,2-bis(4- bromofenil) (105 mg, 32% rendimiento). 1H NMR (500MHz, CDCI3); δ: 1.81 (t, J=5.4Hz, 2H, -CH2), 3.31 (t, J=5.4HZ, -CH2-), 3.78 (s, 3H, -CH3), 7.26 (d, J=8.3Hz, 4H, Ar meta), 7.46 (d, J=8.3Hz, 4H, Ar orto). 13C NMR (125MHz, CDCI3); δ: 32.3 (t), 53.6 (d), 60.6 (d), 63.5 (d), 86.1 (q), 122.9 (q), 130.3 (s), 131.4 (s), 139.3 (q), 172.1 (q). El mismo protocolo descrito previamente para Ia preparación del hapteno 7 fue aplicado en Ia preparación del hapteno 9 (96 mg, >95% rendimiento) obtenido a partir del acetato de metil 2-(3-hidroxipropoxi)-2,2-bis(4-bromofenil) (105 mg, 0.22 mmoles, 1eq.) y de PCC (97 mg, 0.45 mmoles, 2 eq.). 1H NMR (500MHz, CDCI3); δ: 2.66 (td, J=5.9 J=2.0Hz, 2H, -CH2-), 3.61 (t, J=5.9Hz, -CH2-), 3.77 (s, 3H, -CH3), 7.25 (d, J=8.3Hz, 4H, Ar meta), 7.46 (d, J=8.3Hz, 4H, Ar orto), 9.8 (t, J=2.0Hz, 1H). 13C NMR (125MHz1XDCI3); δ: 43.6 (t), 52.3 (d), 60.0 (d), 63.6 (d), 85.7 (q), 122.4 (q), 129.7 (s), 131.0 (s), 138.9 (q), 170.8 (q), 201.0 (q). IR, v (KBr, cnrf1); 1757 (C=O), 1580 (C=O). HRMS: encontrado 470.9247, Ci8Hi6Br2O5 470.9267 (Ruta 2). EJEMPLO 2. Preparación de los conjugados 2-HCH y 6-HCH y otros inmunoreactivos.
Los conjugados se purificaron por diálisis contra PBS 10 mM (5 litros, 4 veces) y contra agua miliQ (5 litros, 1 vez). Finalmente se liofilizaron y se almacenaron, secos a -4O0C. Se prepararon alícuotas de trabajo disueltas en PBS 10 mM (1 mg/ml, 50 μl) que ^se almacenaron a 4 0C .Método del anhídrido mixto (MA). Siguiendo protocolos ya establecidos, el hapteno 2 (15 μmoles) se Ie hizo reaccionar con tributilamina (4 μL, 16.5 μmoles) e isobutilcloroformiato (3 μl, 18 μmoles) en dimetilformamida (DMF; 160 μl) anhidra. El hapteno activado fue dividido en dos fracciones equivalentes, que fueron añadidas gota a gota sobre una solución de HCH y una solución de BSA (30 mg/cada una) en tampón borato 0.2 M (1.8 mi). Método del ester activo (AE). Siguiendo protocolos ya establecidos, los haptenos 2 y 4 (60 μmoles/cada uno) fueron activados con una solución recien preparada de N-hidroxisuccinimida (NHS, 8.62 mg, 75 μmoles) y diciclohexilcarbodiimida (DCC, 30.9 mg, 150 μmoles) en DMF anhidro (200 μl) durante 2 h a temperatura ambiente y posteriormente se les hizo reaccionar con las proteínas BSA;CONA, OVA (10 mg/cada una) y Ia enzima peroxidasa de rábano picante (HRP, 2mg) en tampón borato (1.8 mi). Método de conjugación mediante un aldehido (AC). Siguiendo un método ya descrito, haptenos 7 y 9 (10 μmoles) disueltos en DMF anhidrose mezclaron con BSA, CONA, OVA (10 mg/de cada una) y AD (16.4 mg, 5 μmoles de grupos amino) en una solución tamponada de borato (800 μl). A continucación se añadió NaCNBHs (100 μmoles) disuelto en 10 mM de solución tamponada de PBS (100 μl). Los reactivos se dejaron reaccionar toda Ia noche a 4 0C, de spués de este tiempo se añdió 100 μmoles extra de NaCNBH3 y se dejó que reaccionara 30 min. más a temperatura ambiente. Las soluciones de las macromoléculas conjugadas (AD y BSA) fueron centrifugadas y el precipitado descartado. Los rendimientos fueron del 20% y del 55% para AD y BSA resperectivamente. Método de conjugación mediante halógenos (HC). Siguiendo un protocolo ya descrito, el hapteno 6 (10 μmoles) se disolvió en DMF (100 μl) y se añadió gota a gota a unas soluciones tamponadas de borato (1.8 mi) con BSA y HCH disueltas (30mg/cada una). Las proteínas habían sido tratadas previamente con hidrocloruro de 2-iminot¡olano y purificadas mediante columna de exclusión molecular Hi-Trap con Sephadex G-25. Ia reacción se dejó 24 h a temperatura ambiente. Los conjugados proteicos fueron purificados mediante columna Hi-Trap con Sephadex G-25.
Los conjugados se caracterizaron mediante los espectros de Maldi-TOF-MS. Las muestras se prepararon mezclando 2 μl de Ia solución utilizada como matriz, preparada recientemente, con 2 μl de una solución de los conjugados o proteínas. Para Ia preparación de Ia matriz se hizo una solución 10 mg/ml del ácido trans-3,5- dimetoxi-4-hidroxicinámico en CH3CN/H2O 70:30 con 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Los conjugados se prepararon en solución de 10 mg/ml en el mismo disolvente. El cálculo de Ia densidad de haptenos se realizó restando el peso molecular (PM) de Ia proteína conjugada y el PM de Ia misma proteína sin conjugar, y dividido todo por el PM del hapteno. PMconj-PMprot/ PMHapteno-
Tabla 1. Densidad de hapteno en los conjugados de BSAa
Figure imgf000022_0001
aLas densidades están calculadas por MALDI-TOF-MS. ύMoles de hapteno por mol de proteina.
0No se prepararon. dNo fue possible el análisis por MALDI-TOF-MS. EJEMPLO 3. Obtención del anticuerpo poiiclonal con los inmunógenos selectivos para BP.
El protocolo de inmunización fue llevado a cabo con conejos hembra de Ia variedad Nueva Zelanda, pesando 1-2 kg. Los conejos 174, 175 y 176 fueron inmunizados con 2-HCH y los conejos 177, 178, y 179 fueron inmunizados con 6-HCH usando 100 μg del correspondiente conjugado de hemocianina (2-HCH y 6-HCH se emplean como inmunógenos). Las inmunizaciones se llevaron a cabo cada mes hasta 6 meses en total hasta que se observó un incremento del título del anticuerpo. Los correspondientes antisueros (As) fueron nombrados según el número del anticuerpo. La evolución del título del As fue controlada mediante un experimento de afinidad con diluciones seriadas del As en microplacas tratadas con el hapteno 2-BSA (AE) para los As 174-176 y con el hapteno 6-BSA (HC) para los As 177-179. Después de observar un título adecuado los animales fueron desangrados y Ia sangre fue colectada en tubos vacutainers con gel de separación de sueros. Los antisueros fueron obtenidos después de centrifugar y guardados a - 400C con 0.02% de NaN3. La fracción de anticuerpos procedente de los antisueros anteriores fue purificada utilizando los métodos de precipitación con sulfato amónico y posterior purificación por afinidad contra proteína A o G.
EJEMPLO 4. Método inmunoquímico específico para Ia detección y/o cuantificacϊón de BP y compuestos de su familia química.
Mediante el método ¡nmunoquímico de Ia presente invención sin optimizar se midió Ia respuesta competitiva entre el BP y los conjugados competidores respecto a los antisueros obtenidos con los haptenos 2 y 6 conjugados ambos con Ia proteína HCH. Los mejores resultados se recogen el Ia tabla 2.
Las microplacas se tapizaron con los antígenos diluidos adecuadamente (100 μl/pozo en tampón de tapizado) una noche entera a 40C. Al día siguiente, se lavaron las placas 4 veces con PBST y se añadió el As diluido apropiadamente (100 μl/pozo con tampón PBST). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, las placas se lavaron de nuevo tal y como se había hecho anteriormente. Una solución de antilgG-HRP (anticuerpos contra inmunoglobinas G de conejo, desarrollados en cabras) se adicionó a los pocilios (1/6000 en PBST, 100 μl/pozo) y se dejó incubar 30 minutos más a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4 veces y se añadió Ia solución de substrato (100 μl/pozo). Después de 30 minutos a temperatura ambiente y al resguardo de Ia luz, se paró Ia reacción enzimática con HbSO44N (50 μl/pozo) y se leyeron las absorbancias.
Tabla 2. Parámetros de ajuste de Ia respuesta de los mejores ensayos competitivos obtenidos con los antisueros resultantes de Ia inmunización con 2- HCH (AS174 a 176) y 6-HCH (As 177 a 179).a
Figure imgf000024_0001
a Solo se indican los ensayos que mostraron buenas características y con IC5O menores de 200 μg L"1. 0 IC5O esta expresado en μg L"1.
Las combinaciones anteriores se sometieron a un proceso de optimización para determinar las mejores condiciones para realizar el ensayo y que son las recogidas en el procedimiento indicado. Las características del ensayo final se recogen en Ia tabla 3. Las microplacas de pocilios fueron tratadas con el conjugado 9-BSA (0.5 μg mi"1 en tampón de tapizado, 100 μl/pocillo) durante una noche a 40C y cubiertas durante proceso con adhesivos protectores. Al día siguiente, las placas fueron lavadas con PBST (cuatro veces, 300 μl/pocillo). Las curvas de calibrado fueron preparadas mediante soluciones seriadas en DMSO (1075 103 nM - 34 nM), diluidas 200 veces (5375 nM - 0.17 nM) en PBS 10 mM y añadidas a las microplacas (50 μl/pocillo), seguido del As 174 (1/1000 en PBS 10 mM, 50 μl/pocillo). Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas de nuevo como se describe anteriormente y una solución de antilgG-HRP (1/6000 en PBST) fue añadida (100 μl/pocillo) e incubada de nuevo 30 minutos más a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas de nuevo, y se añadió Ia solución con el sustrato (100 μl/pocillo). El desarrollo de color fue parado después de 30 min. a temperatura ambiente y a resguardo de Ia luz con H2SO44N (50 μl/pozo) y se leyeron las absorbancias a 450 nm. Los datos se ajustaron a una ecuación de cuatro parámetros, Y = [(A-B)/1 - (x/C)D]+B.
Tabla 3. Parámetros de los inmunoensayos optimizados 9-BSA/As174 and 9- AD/As174a
Figure imgf000025_0001
aLos parámetros se derivan del ajuste de Ia respuesta a una ecuación logística de cuatro parámetros. \os datos son el promedio de 8 curvas de calibración realizadas en 5 dias diferentes.
EJEMPLO 5. Determinación de Ia reactividad cruzada. Soluciones patrón de diferentes pesticidas, herbicidas y fungicidas fueron preparadas en DMSO a una concentración de 1mM. Las curvas de calibrado fueron preparadas para cada analito en PBST (5375 nM - 0.17 nM) y medidos mediante el inmunoensayo. De las ecuaciones de ajuste se pudo obtener el valor de Ia IC50 para cada uno de los analitos. El porcentaje de reactividad cruzada se calculó de acuerdo con Ia siguiente formula, (IC50BP/ IC-5oCompuesto)x100.
Tabla 4. Interferencia de otros pesticidas en Ia determinación de bromopropilato mediante el inmunoensayo que utilize el conjugado 9-BSA y el antisuero 174, expresada como porcentaje de reactividad cruzadaa.
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
La reactividad cruzada se expresa como el % del IC50 para el compuesto considerado respecto al IC50 para el bromopropilato. b IC50 esta dado en concentración nM „
Exactitud. Con el ELISA desarrollado se ensayaron diversas muestras fortificadas, para conocer el grado de exactitud de los inmunoensayos. Se procesaron las placas siguiendo, en cada formato, el protocolo general descrito anteriormente. En total se midieron 9 muestras fortificadas con el analito que se midieron por triplicado (FIG. 4).
EJEMPLO 6. Método para Ia detección de BP (y compuestos de su familia química) en muestras de vino.
Muestras de vino blanco y vino tinto (disponibles comercialmente) fueron utilizadas para el estudio del ensayo optimizado. Las muestras fueron tamponadas ajustándose el pH a 7.5 y utilizándose para preparar las curvas estándar de BP. El ensayo fue llevado a cabo siguiendo el protocolo descrito con anterioridad y las absorbancias obtenidas fueron ajustadas a Ia ecuación de 4 parámetros para comparar los resultados con Ia curva en ausencia de vino.
Disoluciones de PBS con diferentes proporciones de EtOH (v/v) (0, 1, 2, 5, 10 y 20%) fueron usadas para preparar las curvas de calibrado estándar (FIG. 5), y se realizó un ensayo ELISA siguiendo el protocolo para el ensayo optimizado del hapteno 9-BSA/As 174 descrito anteriormente. El resto de Ia interferencia de Ia matriz se eliminó diluyendo Ia muestra 40 veces (FIG. 6). En estas condiciones Ia sensibilidad queda reducida pero el límite de detección resultante para el BP queda en 5.6 ppb Io cual aún es suficiente según los límites admitidos

Claims

REIVINDICACIONES
1. Hapteno de bromopropilato (BP) de fórmula general I
Figure imgf000029_0001
Donde X es un halógeno seleccionado de entre Cl, Br, I ó F; Ri se selecciona de entre Cl, Br, OH ó 0-(CHa)n-Rg; Y es O ó NH y * cuando Y es O, R2 es H o alquilo (C1-C4) y cuando Y es NH, R2 es -(CH2)n-Rg; donde n toma valores de entre 2 a 4 y Rg se selecciona de entre OH, CHO, COOH1 NH2 O SH.
2. Hapteno de BP según Ia reivindicación 1 donde X es Br.
3. Hapteno de BP según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde Y es O y R2 es un grupo metil o isopropilo.
4. Hapteno de Bromopropilato (BP) según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde Y es NH y R2 es -(CH2)3-COOH.
5. Hapteno de BP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se selecciona de Ia lista que comprende:
• ácido 2,2-bis(4-bromofenil)-N-2-hidroxiacetamida-butanoico, • ácido 4-(2,2-bis(4-bromofenil)-2-cloroacetamido)butano¡co, • 3-iodopropionato de 3-((isopropoxicarbonil)bis(4- bromofen¡l)metoxi)propil,
• acetato de isopropil 2-(2formiletoxi)-2,2-bis(4-bromofenil), o
• acetato de metil 2-(2-formiletoxi)-2,2-bis(4-bromofenil).
6. Hapteno de BP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 conjugado con una proteína o un polímero.
7. Hapteno de BP según Ia reivindicación 6 donde Ia proteína se selecciona de Ia lista que comprende hemocianina de lapa (HCH), seroalbúmina bovina (BSA), ovalbúmina (OVA) o conalbúmina (CONA).
8. Uso del hapteno de BP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para Ia síntesis de inmunoreactivos.
9. Uso del hapteno de BP según Ia reivindicación 8 donde el inmunoreactivo se selecciona de Ia lista que comprende antisuero, anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, antígeno, trazador para inmunoensayos o trazador para inmunosensores.
10. Método para Ia detección y/o cuantificación en una muestra de BP o de un analito derivado de BP que comprende:
a. Inmovilizar un hapteno según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7 (antígeno) en un soporte sólido b. mezclar Ia muestra y un anticuerpo o antisuero anti-antígeno en el soporte sólido del apartado (a) para formar un primer complejo, c. añadir un segundo anticuerpo marcado al complejo formado según el apartado (b) para formar un segundo complejo y d. detectar y/o cuantificar el segundo complejo obtenido según el apartado (c) con una composición que contenga un sustrato indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente.
11. Método según Ia reivindicación 10 que comprende:
a Inmovilizar un hapteno según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7
(antígeno) en un soporte sólido, b añadir Ia muestra y anticuerpos Ad preincubados, al antígeno inmovilizado del apartado (a) e incubar, c añadir anticuerpos anti-Ad (Ac2) conjugados con una enzima, a los anticuerpos Ad del apartado (b) e incubar, d lavar después de cada uno de los pasos (a), (b) y (c), e añadir un sustrato de Ia enzima al producto obtenido en el apartado
(c) e incubar, f medir Ia absorbancia del producto obtenido en el apartado (e) y g comparar Ia absorbancia medida en el apartado (f) con Ia absorbancia del control y determinar Ia concentración del analito de Ia muestra.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde Ia muestra es vino.
13. Kit para Ia detección y/o cuantificación en una muestra de BP o de un analito derivado de BP que comprende, anticuerpos Ad y, al menos, un hapteno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
14. Kit según Ia reivindicación 13 que además comprende anticuerpos Ac2.
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