WO2010067611A1 - ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体 - Google Patents

ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体 Download PDF

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宮崎　修
耕平 田久保
俊祐 藏下
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積水メディカル株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that recognizes the N-terminal region of an unmodified hemoglobin ⁇ chain and a method for measuring hemoglobin A1c using the antibody.
  • hemoglobin A1c in which the N-terminal valine residue of the hemoglobin ⁇ chain is glycated with glucose is clinical.
  • HbA1c hemoglobin A1c in which the N-terminal valine residue of the hemoglobin ⁇ chain is glycated with glucose
  • hemolyzed erythrocytes are digested with protease to extract the N-terminal hexapeptide (VHLTPE) (SEQ ID NO: 1) of the hemoglobin ⁇ chain, and the ⁇ -chain N-terminal glycated hexapeptide (f) of the HbA1c in the extract (f -VHLTPE) and the amount of the non-modified hexapeptide (VHLTPE) (SEQ ID NO: 1) at the N-terminal of the ⁇ chain of hemoglobin A0 (hereinafter referred to as “HbA0”) were determined, and the HbA1c content (%) was calculated according to the following formula: It is to calculate.
  • an object of the present invention is to provide a general-purpose means capable of measuring the same HbA1c content (%) as in the IFCC compliant method.
  • the present inventor studied to develop an IFCC-compliant method in place of HPLC-MS and HPLC-capillary electrophoresis. As a result, the present inventors specifically reacted with the Hb ⁇ chain N-terminal hexapeptide VHLTPE (SEQ ID NO: 1). For the first time, an antibody that does not react with a peptide modified with a hexapeptide was successfully produced. By using this antibody and the HbA1c antibody, it was found that HbA1c and HbA0 can be quantified accurately and simply, and the HbA1c content (%) by IFCC-compliant method can be measured by simple immunological means, thereby completing the present invention. .
  • the present invention provides an antibody that reacts with a peptide or protein having the amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1) at the N-terminus and does not react with a peptide or protein in which the N-terminal valine of the peptide or protein is modified. is there.
  • HbA1c content rate (%) in the sample is calculated from the above, and a method for measuring the HbA1c content rate in the sample is provided.
  • the amount of HbA0 in the sample can be measured accurately and simply. Therefore, the HbA1c content (%) based on the IFCC standard method based on the amount of HbA0 and the amount of HbA1c in the sample can be simply and accurately. It becomes possible to measure.
  • a schematic diagram of a method for measuring HbA1c by immunochromatography is shown.
  • a schematic diagram of a method for measuring HbA1c by immunochromatography is shown.
  • mouth antiserum by antigen solid-phase ELISA method is shown.
  • the results of examining the reactivity of the antibody of the present invention to hemoglobin ⁇ -chain N-terminal peptide (VHLTPE) (SEQ ID NO: 1) and its glycated peptide (f-VHLTPE) by competitive ELISA are shown.
  • the result of having investigated the reactivity with respect to the hemoglobin beta chain N terminal peptide (VHLTPE) (sequence number 1) and alpha chain N terminal peptide (VLSPAD) (sequence number 10) of this invention antibody by a competition ELISA method is shown.
  • the result of having investigated the reactivity with respect to HbA1c and HbA0 of the antibody of the present invention and the anti-hemoglobin antibody by the antigen-immobilized ELISA method is shown.
  • separated by HPLC of this invention antibody, anti-hemoglobin antibody, and anti- HbA1c antibody by the antigen solid-phased ELISA method is shown.
  • the calibration curves in the HbA1c concentration measurement system and the HbA0 concentration measurement system by sandwich ELISA are shown.
  • the antibody of the present invention reacts with a peptide or protein having the amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1) at the N-terminus and the N-terminal valine is not modified, and the peptide or protein with the N-terminal valine modified It is an antibody that does not react with proteins.
  • Peptides having the amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1) at the N-terminus and the N-terminal valine not modified include an oligopeptide consisting of the amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1). Including polypeptides.
  • the protein having the amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1) at the N-terminus and the N-terminal valine not modified has a normal adult major Hb, hemoglobin A0 having an Hb ⁇ chain, and an Hb ⁇ chain Among hemoglobin A2 (hereinafter, referred to as “HbA2”), those in which the N-terminal of the ⁇ chain is not modified are mentioned, but HbA2 is a very small amount of component. Therefore, HbA0 is mentioned as main Hb which reacts with the antibody of the present invention.
  • examples of the peptide or protein in which the N-terminal valine is modified include a peptide or Hb that has the amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1) at the N-terminus and whose N-terminal valine is sugar-modified.
  • examples of the protein include HbA1c. Therefore, as a preferable form of the antibody of the present invention, it reacts with a peptide or Hb having the amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1) at the N-terminus and the N-terminal valine is not modified, Are modified peptides or antibodies that do not react with Hb.
  • a more preferred form is an antibody that reacts with HbA0 but does not react with HbA1c.
  • the antibody of the present invention preferably does not react with proteins other than Hb and does not react with Hb having no amino acid sequence VHLTPE (SEQ ID NO: 1), for example, HbF.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • HbA0 can be prepared by a conventional method using a peptide or protein having the amino acid sequence VHL (SEQ ID NO: 2) as an immunogen. it can.
  • immunogens include VHLC (SEQ ID NO: 3), VHLTC (SEQ ID NO: 4), VHLTPC (SEQ ID NO: 5), VHLTPEC (SEQ ID NO: 6), VHL (SEQ ID NO: 2), VHLT (SEQ ID NO: 7), VHLTP (SEQ ID NO: 8), VHLTPE (SEQ ID NO: 1), and antigens obtained by binding these peptides and carrier proteins.
  • Carrier proteins include ovalbumin (hereinafter referred to as “OVA”), bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”), cationized BSA (hereinafter referred to as “cBSA”), squash hemocyanin (hereinafter referred to as KLH), and the like. Can be mentioned.
  • OVA ovalbumin
  • BSA bovine serum albumin
  • cBSA cationized BSA
  • KLH squash hemocyanin
  • KLH squash hemocyanin
  • MBS method a method using an m-maleidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester
  • EDC method a method using a 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbohydride hydride method
  • the monoclonal antibody of the present invention can be prepared according to the method described in, for example, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988).
  • the animal used for immunization is not particularly limited, and examples thereof include mice and rats.
  • the immunization method can be performed according to a general method. For example, an immunogen suspended in a normal buffer or physiological saline, or a mixture of an immunogen and a replacement fluid such as complete Freund's adjuvant is administered subcutaneously, intradermally, or abdominally to an animal. After stimulation, the same operation is repeated as necessary.
  • the dose of the antigen is appropriately determined according to the administration route and the animal species, but the usual dose is preferably about 10 ⁇ g to 1 mg per dose.
  • the immune cells used for cell fusion are preferably spleen cells removed 3 to 4 days after the final immunization.
  • myeloma cells various known cell lines that have already been established are preferable.
  • NS1 P3 / NSI / I-Ag4-1 in mice
  • SP2 / O-Ag14 Nature 276: 269 (1978)
  • P3-X63-Ag8.653 J. Immunol. 123: 1548 (1979)]
  • P3-X63-Ag8U P3-X63-Ag8U.
  • PEG polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • the method of cell fusion is the same as the usual method.
  • PEG having an average molecular weight of 1000 to 6000 is mixed at a concentration of 30 to 60% in a mixed pellet of myeloma cells and immune cells about 1 to 10 times the myeloma cells. Add dropwise and mix.
  • a normal selection medium for example, a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (hereinafter referred to as “HAT”) is used.
  • HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • the target antibody-producing strain reacts with a peptide or protein having VHLTPE (SEQ ID NO: 1) by, for example, ELISA or RIA, and does not react with the peptide or protein in which the N-terminal valine of the peptide or protein is modified It is obtained by selecting a hybridoma that produces an antibody. Specifically, first, the monoclonal antibody in the culture supernatant is reacted with the solid phase purified HbA0 antigen, and then the labeled anti-IgG antibody is reacted. A hybridoma producing a monoclonal antibody having high reactivity with HbA0 is screened by an antigen-immobilized ELISA method.
  • the obtained hybridoma culture supernatant was further subjected to a competitive ELISA method with VHLTPE (SEQ ID NO: 1) or glycated VHLTPE (f-VHLTPE) using a plate on which purified HbA0 antigen was immobilized, and VHLTPE ( A hybridoma producing a monoclonal antibody that reacts with SEQ ID NO: 1) and does not react with f-VHLTPE is selected.
  • VHLTPE SEQ ID NO: 1
  • f-VHLTPE glycated VHLTPE
  • the monoclonal antibody can be produced by culturing a hybridoma according to a conventional method and separating it from the culture supernatant, or by administering the hybridoma to a compatible mammal and collecting it as ascites.
  • the monoclonal antibody of the present invention thus obtained reacts with a peptide or protein whose Hb ⁇ chain N-terminus is not modified, and does not react with a peptide or protein whose Hb ⁇ chain N-terminus is modified. It is an antibody that reacts with HbA1c but does not react with HbA1c. Therefore, it is useful as an antibody for immunoassay by distinguishing HbA0 from HbA1c.
  • HbA1c content (%) (f-VHLTPE amount / (f-VHLTPE amount + VHLTPE amount)) ⁇ 100 (2)
  • any of HbA0 measurement method and HbA1c measurement method can be adopted as long as they are ordinary immunological measurement methods.
  • the immunological measurement method include a sandwich ELISA method, a competitive ELISA method, an immunochromatography method, a latex agglutination method, and a competitive latex agglutination method.
  • HbA0 and HbA1c can be measured, respectively.
  • HbA0 or HbA1c can be quantified by the following method using purified HbA0 or HbA1c as a standard. That is, a diluted specimen sample is added to and reacted with an ELISA plate on which the monoclonal antibody or anti-HbA1c antibody of the present invention is immobilized, and then reacted with an enzyme-labeled anti-hemoglobin antibody (hereinafter referred to as “anti-Hb antibody”).
  • anti-Hb antibody enzyme-labeled anti-hemoglobin antibody
  • HbA0 or HbA1c present in the sample can be specifically quantified.
  • the purified HbA0 or HbA1c can be quantified by the following method using a standard product. That is, at least one of the monoclonal antibody or anti-HbA1c antibody of the present invention is sensitized to latex particles as an insoluble carrier, and brought into contact with the specimen sample and the anti-Hb monoclonal antibody, whereby the antibody is mediated through HbA0 or HbA1c in the sample.
  • the HbA0 or HbA1c can be specifically quantified from the change in the aggregation degree.
  • the purified HbA0 or HbA1c can be quantified by the following method using a standard product.
  • the HbA0 or HbA1c can be specifically quantified from the change in the competitive inhibition.
  • the specimen sample is not particularly limited as long as it is a human body fluid containing HbA0 or HbA1c, and examples thereof include blood and a red blood cell fraction.
  • Latex particles in the latex agglutination method are not particularly limited as long as they are fine particle carriers generally used in immunological agglutination and agglutination inhibition reactions utilizing latex agglutination, but are industrially mass-produced.
  • Organic fine particles that can be used are preferred. Examples of such organic fine particles include homopolymers or copolymers of vinyl monomers such as styrene, vinyl chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, acrylic acid esters, and methacrylic acid esters; styrene-butadiene copolymers, methyl Examples thereof include butadiene copolymers such as methacrylate-butadiene copolymers.
  • reactive organic fine particles in which a functional group such as a carboxyl group, a primary amino group, a carbamoyl group, a hydroxyl group, or an aldehyde group is bonded to such organic fine particles can also be preferably used.
  • a functional group such as a carboxyl group, a primary amino group, a carbamoyl group, a hydroxyl group, or an aldehyde group
  • polystyrene latex particles such as polystyrene and styrene-butadiene copolymer are preferable because they have excellent antigen or antibody adsorptivity and can stably maintain biological activity for a long period of time.
  • the shape of the latex particles is not particularly limited, but the average particle size is preferably large enough to detect the aggregates formed as a result of the aggregation reaction between the protein on the latex particle surface and the substance to be measured visually or optically.
  • the average particle size is preferably 0.02 to 1.6 ⁇ m, particularly preferably 0.03 to 0.5 ⁇ m.
  • the method for sensitizing the latex particles with the monoclonal antibody or anti-HbA1c antibody of the present invention is not particularly limited, and known methods can be used. Examples thereof include a method of physically adsorbing on the surface of latex particles, a method of covalently bonding to the surface of latex particles having a functional group, and a method of sensitizing by immunological bonding.
  • HbA0 and HbA1c can be measured simultaneously, which is particularly preferable.
  • an immunochromatographic support in which the monoclonal antibody of the present invention and the anti-HbA1c antibody are immobilized at different sites A line and B line
  • the exposure process in FIG. 1 includes guanidine or a salt thereof and a nonionic surfactant, guanidine or a salt thereof and nitrite, guanidine or a salt thereof, nonionic surfactant and nitrite, or a conventionally known guanidine.
  • HbA0 and HbA1c-containing sample in which the epitope is exposed is dropped onto the sample pad.
  • the dropped sample is developed by capillary action, and when it reaches the A line, only HbA0 in the sample reacts, and when it reaches the B line, only HbA1c in the sample reacts. Other hemoglobin moves to the end pad without reacting.
  • HbA0 and HbA1c in the sample can be quantified by measuring the color density, reflection intensity, absorbance, etc. of the A line and B line with an immunochromatographic reader.
  • a color latex-bound anti-Hb antibody is impregnated on the sample pad in advance (FIG. 2).
  • the same exposure process as described above is used for the exposure process in FIG.
  • the exposed HbA1c-containing sample is dropped onto the sample pad.
  • Hb shown by an ellipse in FIG. 2 in the dropped sample reacts with the anti-Hb antibody and moves on the support.
  • a sandwich complex of anti-Hb antibody-HbA0-antibody of the present invention is formed.
  • an anti-Hb antibody-HbA1c-anti-HbA1c antibody sandwich complex is formed.
  • Other conjugates of Hb and anti-Hb antibody migrate to the end pad.
  • HbA0 and HbA1c in the sample can be quantified, respectively.
  • HbA1c (%) (B / (A + B)) ⁇ 100.
  • colloidal gold particles or the like can be used instead of the color latex.
  • the anti-HbA1c antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • those described in patent documents Japanese Patent Laid-Open Nos. 61-172064 and 6-66796) can be used.
  • an immunological measurement kit containing the antibody produced using the antibody of the present invention can be used.
  • the kit may contain general components used for immunoassay, for example, a label, a carrier, a support, a buffer, a stabilizer, a reactor, and the like.
  • Example 1 (Preparation of hybridoma and acquisition of antibody)
  • Materials and Methods (1) Preparation of purified HbA0 and purified HbA1c Bio-Rex70 described in non-patent literature (Melisenda J. McDonald et al, JBC, 253 (7), 2327-2332, 1978). HbA0 and HbA1c were purified by ion exchange chromatography using (Bio-Rad) and used in the subsequent experiments.
  • the molecular weight of each glycated peptide was confirmed by a mass spectrometer (MALDI-TOF) to be the same as the theoretical value, that is, the molecular weight obtained by adding 162 to the molecular weight of each peptide.
  • anti-Hb antibody and anti-HbA1c antibody As the anti-Hb antibody, a mouse monoclonal antibody prepared by a conventional method using the purified HbA0 of (1) above as an immunogen was used.
  • anti-HbA1c antibody a mouse monoclonal antibody prepared by a method described in a patent document (Japanese Patent Laid-Open No. 61-172064) was used. That is, the glycated peptide (f-VHLTPEEKYC) (SEQ ID NO: 9) synthesized in the above (2) was bound to KLH and used as an immunogen.
  • f-VHLTPEEKYC glycated peptide synthesized in the above (2) was bound to KLH and used as an immunogen.
  • the antigen for immunization was mixed 1: 1 with an adjuvant, and an emulsion was prepared using a linked syringe. This was injected subcutaneously into the back of female BALB / c mice (20-50 ⁇ g per mouse). This operation (immunization) was repeated 5 times every 2 weeks. Mouse antiserum was collected from the fundus of each mouse 6 weeks after the start of immunization, and the antibody titer in the antiserum was confirmed by the antigen-immobilized ELISA method described below. In any ELISA method, serum collected from the fundus of an unimmunized mouse was used as a control.
  • the spleen was extracted from a mouse whose high antibody titer was confirmed by the test blood collection, and cell fusion was performed by a conventional method using 50% -PEG1450 (manufactured by Sigma). As myeloma cells, SP2 / O was used. The obtained fused cells were suspended in RPMI 1640 medium containing HAT and 15% fetal calf serum so as to be 2.5 ⁇ 10 6 / mL as spleen cells, and 0.2 mL each was dispensed into a 96-well culture plate. This was cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • the supernatant was mixed with an equal amount of an adsorption buffer (3 mol / L NaCl, 1.5 mol / L Glycine-NaOH buffer, pH 8.5) and then filtered.
  • the filtrate is passed through a protein A sepharose column equilibrated with an adsorption buffer, and the antibody in the filtrate is adsorbed on the column and then eluted with 0.1 mol / L citrate buffer (pH 3.0). It was.
  • the eluate was neutralized with 1 mol / L Tris-HCl buffer (pH 8.0) and dialyzed with PBS to collect antibodies.
  • Antigen-immobilized ELISA method 50 ⁇ L / well of each mouse antiserum serially diluted with 1% BSA-PBST or culture supernatant of fused cells was dispensed to an ELISA plate and allowed to stand at room temperature for 1 hour. b. After washing 3 times with PBST, HRP-GtF (ab ′) 2 -Anti-Mouse Ig's (manufactured by Biosource) was diluted 5000 times with 1% BSA-PBST and dispensed at 50 ⁇ L / well at room temperature. Let stand for 1 hour. c.
  • a color developing solution containing orthophenylenediamine hydrochloride (orthophenylenediamine hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 2 mg / mL, hydrogen peroxide 0.02% and citric acid pH 5.0) (Dissolved in a buffer solution) (hereinafter referred to as “OPD color developing solution”) was dispensed (50 ⁇ L / well) and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. d. After stopping the reaction by dispensing 0.75 mol / L sulfuric acid at 50 ⁇ L / well, the absorbance at 492 nm was measured with a plate reader.
  • orthophenylenediamine hydrochloride orthophenylenediamine hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 2 mg / mL, hydrogen peroxide 0.02% and citric acid pH 5.0
  • OPD color developing solution Dissolved in a buffer solution
  • mice antiserum obtained in this example is composed of a human hemoglobin ⁇ -chain N-terminal peptide, which is an antigen for immunization, and a carrier protein, and an N-terminus of Hb ⁇ -chain, which is a common part in HbA0, which is a screening antigen. It was thought to include antibodies that specifically recognize the sequence.
  • Antibody number Accession number 85201: FERM BP-11187 85202: FERM BP-11188 85203: FERM BP-11189 85204: FERM BP-11190 85206: FERM BP-11191
  • Example 2 Specificity evaluation of monoclonal antibody produced by each hybridoma
  • Materials and Methods (1) Preparation of Reagents Each antigen and each antibody used for evaluation were prepared in the same manner as in (1) to (4) of Example 1.
  • HPLC fractions human erythrocyte hemolysate was separated by the KO500 method using a TSK-gel GlycoHSi column manufactured by Tosoh Corporation, and each fraction collected using a fraction collector was used. When added to the antigen-immobilized ELISA, each fraction was diluted 6-fold with PBS and used.
  • Example 3 (Measurement of HbA1c value by ELISA)
  • Materials and Methods (1) Preparation of anti-HbA1c antibody and anti-Hb antibody
  • the anti-HbA1c antibody and anti-Hb antibody used for the measurement were prepared in the same manner as in (I) (3) of Example 1.
  • HbA0 amount (concentration) by sandwich ELISA a The specific antibody (85201) obtained in Example 1 was diluted with PBS to a concentration of 5 ⁇ g / mL. This was dispensed on an ELISA plate by 50 ⁇ L / well and allowed to stand overnight at 4 ° C. b. After washing 3 times with PBST (350 ⁇ L / well), 1% BSA-PBST was dispensed at 100 ⁇ l / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. c. After washing with PBST three times, the standard sample or specimen treated in (3) above was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. d.
  • HbA1c value (content of HbA1c) was obtained from the following formula.
  • HbA1c content (%) (HbA1c amount (concentration) / (HbA1c amount (concentration) + HbA0 amount (concentration))) ⁇ 100
  • the antibody of the present invention can be used for quantitative measurement of HbA0 amount (concentration), HbA1c amount (concentration), and HbA1c value (content of HbA1c).

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Abstract

　ＩＦＣＣ準拠法と同様のＨｂＡ１ｃ含有率を測定できる汎用の手段を提供する。 　Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はタンパク質と反応し、当該ポリペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体。

Description

ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体
　本発明は、未修飾のヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域を認識する抗体及び当該抗体を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。
　血中のヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）に糖が結合した糖化ヘモグロビンのうち、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリン残基がグルコースで糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「ＨｂＡ１ｃ」という）は、臨床的に過去１～２ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病の診断や糖尿病の経過観察に適した指標として広く使用されている。
　ＨｂＡ１ｃの測定法としては、ＨＰＬＣ法及び免疫学的測定法が用いられているが、ＨＰＬＣのカラムの種類や試薬メーカー間によって、測定対象が微妙に異なっており、測定の標準化が求められている。かかる観点から、ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）のＨｂＡ１ｃ標準化のワーキンググループは、基準測定法（以下、「ＩＦＣＣ準拠法」という）を定めた（非特許文献１）。その方法は、赤血球溶血液をプロテアーゼで消化してヘモグロビンβ鎖のＮ末端ヘキサペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）を抽出し、その抽出物中のＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端の糖化ヘキサペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ）と、ヘモグロビンＡ０（以下、「ＨｂＡ０」という）のβ鎖Ｎ末端の修飾されていないヘキサペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）の量を求め、下記式によりＨｂＡ１ｃ含有率（％）を算出するというものである。
　ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ量／（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ量＋ＶＨＬＴＰＥ量））×１００＝（ＨｂＡ１ｃ量／（ＨｂＡ１ｃ量＋ＨｂＡ０量））×１００
　しかしながら、この方法における糖化ヘキサペプチド含量の測定法は、ＨＰＬＣ－ＭＳ又はＨＰＬＣ－キャピラリー電気泳動を用いるものであることから、高価な装置を必要とし、特定の施設でしか測定することができない。また、この測定値は、従来法のＨｂＡ１ｃ値と大きく変わるという問題がある（非特許文献２）。
Clin. Chem. Lab. Med. 2002；40(1)：78-89 糖尿病４６巻９号(2003), 775～778頁
　従って本発明の課題は、ＩＦＣＣ準拠法と同様のＨｂＡ１ｃ含有率(％)を測定できる汎用の手段を提供することにある。
　そこで本発明者は、ＨＰＬＣ－ＭＳやＨＰＬＣ－キャピラリー電気泳動法に代わるＩＦＣＣ準拠法を開発すべく検討した結果、Ｈｂβ鎖Ｎ末端のヘキサペプチドＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）に特異的に反応し、このヘキサペプチドが修飾されたペプチドには反応しない抗体の作製に初めて成功した。この抗体とＨｂＡ１ｃ抗体とを用いれば、ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０とが正確かつ簡便に定量でき、簡便な免疫学的手段でＩＦＣＣ準拠法によるＨｂＡ１ｃ含有率（％）が測定できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有するペプチド又はタンパク質と反応し、当該ペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体を提供するものである。
　また、本発明は、上記抗体を用いて試料中のＨｂＡ０量を測定し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いて前記試料中のＨｂＡ１ｃ量を測定し、次式（１）
　ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ＨｂＡ１ｃ量／（ＨｂＡ１ｃ量＋ＨｂＡ０量））×１００（１）
から試料中のＨｂＡ１ｃ含有率（％）を算出することを特徴とする試料中のＨｂＡ１ｃ含有率の測定法を提供するものである。
　本発明の抗体を用いれば、試料中のＨｂＡ０量が正確かつ簡便に測定できることから、試料中のＨｂＡ０量とＨｂＡ１ｃ量とを基準とするＩＦＣＣ準拠法によるＨｂＡ１ｃ含有率（％）が簡便かつ正確に測定可能となる。
イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃの測定法概略図を示す。 イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃの測定法概略図を示す。 抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にてマウス抗血清中の抗体価を測定した結果を示す。 競合ＥＬＩＳＡ法にて本発明抗体のヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）及びその糖化ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ）に対する反応性を調べた結果を示す。 競合ＥＬＩＳＡ法にて本発明抗体のヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）及びα鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＬＳＰＡＤ）（配列番号１０）に対する反応性を調べた結果を示す。 抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて本発明抗体及び抗ヘモグロビン抗体のＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０に対する反応性を調べた結果を示す。 抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて本発明抗体、抗ヘモグロビン抗体、及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体のＨＰＬＣで分離したヘモグロビン亜分画に対する反応性を調べた結果を示す。 サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ１ｃ濃度測定系、及びＨｂＡ０濃度測定系における検量線を示す。
　本発明の抗体は、Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はタンパク質と反応し、当該ペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体である。
　Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチドとしては、アミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）からなるオリゴペプチド、及びアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を含むポリペプチドが挙げられる。Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないタンパクとしては、正常な成人の主要なＨｂであって、Ｈｂβ鎖を有するヘモグロビンＡ０、及びＨｂδ鎖を有するヘモグロビンＡ２（以下、「ＨｂＡ２」という）のうちδ鎖Ｎ末端が修飾されていないものが挙げられるが、ＨｂＡ２は、非常に微量な成分である。従って、本発明抗体と反応する主要なＨｂとしては、ＨｂＡ０が挙げられる。
　一方、前記Ｎ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質としては、Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、そのＮ末端バリンが糖修飾されたペプチド又はＨｂが挙げられる。当該タンパク質としては、ＨｂＡ１ｃが挙げられる。
　従って、本発明の抗体の好ましい形態としては、Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はＨｂと反応し、当該ペプチド又はＨｂのＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はＨｂと反応しない抗体が挙げられる。さらに好ましい形態としては、ＨｂＡ０と反応し、ＨｂＡ１ｃと反応しない抗体である。
　さらに、本発明の抗体は、Ｈｂ以外のタンパク質とは反応せず、さらにアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有さないＨｂ、例えばＨｂＦとは反応しないものであるのが好ましい。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であるのが特に好ましい。
　本発明の抗体は、ＨｂＡ０がβ鎖Ｎ末端にＶＨＬ（配列番号２）を有することから、アミノ酸配列ＶＨＬ（配列番号２）を有するペプチド又はタンパク質を免疫原として用い、常法により作製することができる。免疫原の例としては、ＶＨＬＣ（配列番号３）、ＶＨＬＴＣ（配列番号４）、ＶＨＬＴＰＣ（配列番号５）、ＶＨＬＴＰＥＣ（配列番号６）、ＶＨＬ（配列番号２）、ＶＨＬＴ（配列番号７）、ＶＨＬＴＰ（配列番号８）、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）、及びこれらのペプチドとキャリアタンパクとが結合した抗原が挙げられる。キャリアタンパクとしてはオボアルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）、陽イオン化ＢＳＡ（以下、「ｃＢＳＡ」という）、スカシ貝ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）等が挙げられる。ペプチドとキャリアタンパクとの結合方法は、ＭＢＳ法（ｍ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒを用いる方法）及びＥＤＣ法（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを用いる方法）等が挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体は、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）に記載の方法に準じて作製することができる。
　免疫に用いる動物は特に限定されないが、例えばマウス、ラットなどが挙げられる。免疫方法は、一般的な手法に従って行うことができる。例えば、免疫原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁させたもの、あるいは免疫原と完全フロイントアジュバンドなどの補液との混合物を、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ～１ｍｇ程度が好ましい。
　細胞融合に用いる免疫細胞は、最終免疫の３～４日後に摘出した脾臓細胞が好適である。また、前記免疫細胞と融合させる骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ細胞」という）としては、既に確立されている公知の各種細胞株が好ましく、例えばマウスにおけるＮＳ１（Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ－Ａｇ４－１）［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１－５１９（１９７６）］、ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４［Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９（１９７８）］、Ｐ３-Ｘ６３－Ａｇ８．６５３［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８（１９７９）］、Ｐ３-Ｘ６３－Ａｇ８Ｕ．１［Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１（１９７８）］等や、ラットにおけるＹ３－Ａｇ１．２．３．［Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１３１－１３３（１９７９）］、ＹＢ２／Ｏ（ＹＢ２／３ＨＬ／Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０）［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ：１（１９８１）］等が挙げられる。
　細胞融合には、通常用いられるポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。細胞融合の手法は通常の方法と同様であり、例えばミエローマ細胞とミエローマ細胞に対して約１～１０倍の免疫細胞との混合ペレットに、平均分子量１０００～６０００のＰＥＧを３０～６０％の濃度で滴下し、混合する。ハイブリドーマの選択は、通常の選択培地、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（以下、「ＨＡＴ」という）を含む培地を使用する。ＨＡＴ培地で培養して得られたハイブリドーマを用いて、通常の限界希釈法により、目的とする抗体産生株の検索及び単一クローン化を行えばよい。
　目的とする抗体産生株は、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有するペプチド又はタンパク質に反応し、当該ペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。
　具体的には、まず培養上清中のモノクローナル抗体を、固相化した精製ＨｂＡ０抗原と反応させ、次いで標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により、ＨｂＡ０に対し高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。得られたハイブリドーマの培養上清について、さらに、精製ＨｂＡ０抗原を固相化したプレートを用い、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）又は糖化ＶＨＬＴＰＥ（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ）との間で競合ＥＬＩＳＡ法を行い、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）に反応し、ｆ－ＶＨＬＴＰＥに反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
　当該モノクローナル抗体は、常法に従いハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、前記ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により製造できる。
　このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、Ｈｂβ鎖Ｎ末端が修飾されていないペプチド又はタンパク質と反応し、かつＨｂβ鎖のＮ末端が修飾されたペプチド又はタンパク質とは反応しないことから、ＨｂＡ０と反応し、ＨｂＡ１ｃと反応しない抗体である。従って、ＨｂＡ０をＨｂＡ１ｃと区別して免疫測定するための抗体として有用である。
　本発明の抗体を用いれば、ＩＦＣＣ準拠法と同様のＨｂＡ１ｃ測定が可能になる。すなわち、本発明の抗体を用いて試料中のＨｂＡ０量を測定し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いて前記試料中のＨｂＡ１ｃ量を測定し、次式（１）
　　ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ＨｂＡ１ｃ量／（ＨｂＡ１ｃ量＋ＨｂＡ０量））×１００（１）
から試料中のＨｂＡ１ｃ含有率（％）を算出すれば、試料中のＨｂＡ１ｃ含有率が測定できる。
　また、前記式（１）は、本発明モノクローナル抗体の認識部位を考慮すれば、次式（２）で表わすこともできる。
　ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ量／（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ量＋ＶＨＬＴＰＥ量））×１００（２）
　本発明方法における、ＨｂＡ０の測定法及びＨｂＡ１ｃの測定法は、通常の免疫学的測定法であればいずれも採用できる。ここで免疫学的測定法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、競合ラテックス凝集法等が挙げられる。
　従来の任意の免疫学的測定法に本発明のモノクローナル抗体を適用することにより、ＨｂＡ０とＨｂＡ１ｃとをそれぞれ測定することができる。
　例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定する場合には、精製したＨｂＡ０、又はＨｂＡ１ｃを標準品として次のような方法でＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを定量できる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体又は抗ＨｂＡ１ｃ抗体を固定化したＥＬＩＳＡプレートに、希釈した検体試料を添加し反応させた後、酵素標識した抗ヘモグロビン抗体（以下、「抗Ｈｂ抗体」という）を反応させ、発色後の吸光度の変化から試料中に存在するＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
　ラテックス凝集法で測定する場合には、精製したＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを標準品として次のような方法で定量することができる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体又は抗ＨｂＡ１ｃ抗体の少なくとも１種を不溶性担体であるラテックス粒子に感作し、検体試料及び抗Ｈｂモノクローナル抗体に接触させることにより、試料中のＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを介して抗体感作ラテックス粒子同士が架橋し凝集を生じるため、この凝集度の変化から当該ＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
　あるいは競合ラテックス凝集法で測定する場合には、精製したＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを標準品として次のような方法で定量することができる。すなわち、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）又はｆ－ＶＨＬＴＰＥの少なくとも１種を不溶性担体であるラテックス粒子に感作し、検体試料、及び本発明のモノクローナル抗体又は抗ＨｂＡ１ｃ抗体の少なくとも１種を接触させることにより、ペプチド感作ラテックス粒子と抗体による凝集反応に対して検体試料中のＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃが競合阻害を示すため、この競合阻害の変化から当該ＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
　検体試料としては、ＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを含有するヒト体液であれば特に制限されず、例えば血液、赤血球画分等が挙げられる。
　ラテックス凝集法等におけるラテックス粒子としては、ラテックス凝集反応を利用した免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体であれば特に制限されないが、工業的に大量生産することができる有機系微粒子が好ましい。このような有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単独重合体又は共重合体；スチレン－ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート－ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げられる。また、このような有機系微粒子に、カルボキシル基、第一級アミノ基、カルバモイル基、水酸基、アルデヒド基等の官能基が結合した反応性有機系微粒子も好ましく使用することができる。上記のラテックス粒子の中では、抗原又は抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる点から、ポリスチレン、スチレン－ブタジエン共重合体等のポリスチレン系ラテックス粒子が好ましい。
　ラテックス粒子の形状は特に制限されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の蛋白質と測定対象物質との凝集反応の結果生じる凝集体が肉眼又は光学的に検出できるに充分な大きさが望ましい。好ましい平均粒子径としては０．０２～１．６μｍであり、特に０．０３～０．５μｍが好ましい。
　ラテックス粒子に本発明のモノクローナル抗体又は抗ＨｂＡ１ｃ抗体を感作する方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、ラテックス粒子表面に物理的に吸着させる方法、官能基を有するラテックス粒子表面に共有結合させる方法、及び免疫学的結合によって感作する方法などが挙げられる。
　イムノクロマト法で測定する場合には、ＨｂＡ０とＨｂＡ１ｃとが同時に測定できるので特に好適である。例えば図１に示す如く、本発明モノクローナル抗体及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体とをそれぞれ別の部位（Ａライン及びＢライン）に固定化したイムノクロマト支持体を用いる。図１中の露出化処理には、グアニジン又はその塩と非イオン性界面活性剤、グアニジン又はその塩と亜硝酸塩、グアニジン又はその塩と非イオン性界面活性剤と亜硝酸塩、もしくは従来公知のグアニジン、チオシアン酸、チオシアン酸リチウム、フェリシアニド、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等を用いることができる。エピトープが露出化されたＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃ含有試料をサンプルパットに滴下する。滴下された試料は、毛細管現象により展開され、Ａラインに到達すると試料中のＨｂＡ０のみが反応し、Ｂラインに到達すると試料中のＨｂＡ１ｃのみが反応する。その他のヘモグロビンは反応せずにエンドパッドまで移動する。Ａライン及びＢラインの色の濃さ、反射強度、又は吸光度等をイムノクロマトリーダーで測定すれば、試料中のＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃがそれぞれ定量できる。ここで、ＨｂＡ０の定量値をＡ、ＨｂＡ１ｃの定量値をＢとすると、ＨｂＡ１ｃ（％）＝（Ｂ／（Ａ＋Ｂ））×１００として、ＨｂＡ１ｃ（％）を求めることも出来る。
　また、上記イムノクロマト支持体において、予めサンプルパッド上にカラーラテックス結合抗Ｈｂ抗体を含浸させておく（図２）。図２中の露出化処理は、上記と同じものが用いられる。露出化処理されたＨｂＡ１ｃ含有試料をサンプルパットに滴下する。滴下された試料中のＨｂ（図２中だ円で示す）が抗Ｈｂ抗体と反応し、支持体上を移動する。Ａラインにおいては、抗Ｈｂ抗体－ＨｂＡ０－本発明抗体のサンドイッチ複合体が形成される。一方、Ｂラインにおいては、抗Ｈｂ抗体－ＨｂＡ１ｃ－抗ＨｂＡ１ｃ抗体のサンドイッチ複合体が形成される。その他のＨｂと抗Ｈｂ抗体との結合物はエンドパッドまで移動する。形成された前記のサンドイッチ複合体量を、Ａライン及びＢラインの色の濃さ、反射強度、又は吸光度等をイムノクロマトリーダーで測定すれば、試料中のＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃがそれぞれ定量できる。ここで、ＨｂＡ０の定量値をＡ、ＨｂＡ１ｃの定量値をＢとすると、ＨｂＡ１ｃ（％）＝（Ｂ／（Ａ＋Ｂ））×１００として、ＨｂＡ１ｃ（％）を求めることも出来る。
　なお、カラーラテックスの代わりに金コロイド粒子等も使用可能である。
　ここで抗ＨｂＡ１ｃ抗体としては、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、例えば特許文献（特開昭６１－１７２０６４号公報、特開平６－６６７９６号公報）記載のもの等が使用可能である。
　なお、上記免疫学的測定法を実施するにあたって、本発明の抗体を使用して製造された当該抗体を含む免疫学的測定用キットを用いることができる。当該キットは、免疫学的測定法に用いる一般的な構成要素、例えば、標識物、担体、支持体、緩衝液、安定化剤、反応器等を含んでいてもよい。
　次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１（ハイブリドーマの作製と抗体の獲得）
（Ｉ）材料と方法
（１）精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃの調製
　ヒト赤血球溶血液を非特許文献（Ｍｅｌｉｓｅｎｄａ　Ｊ．ＭｃＤｏｎａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、ＪＢＣ、２５３（７）、２３２７－２３３２、１９７８）記載のＢｉｏ－Ｒｅｘ７０（バイオラッド社）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、ＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃを精製し、以降の実験に用いた。
（２）各種ペプチド及び糖化ペプチドの調製
　各配列のペプチドは、ペプチド自動合成装置を用いＦｍｏｃ法により合成、及び精製した。各ペプチドの純度はＨＰＬＣで、９５％以上であることを確認した。また、分子量は、質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）にて理論値と同じであることを確認した。糖化ペプチドは、特許文献（特開昭６１－１７２０６４号公報）記載の方法にて合成及び精製した。すなわち、各配列のペプチドとグルコースを無水ピリジン中で反応させＨＰＬＣで精製した。各糖化ペプチドの分子量は、質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）で理論値、すなわち各ペプチドの分子量に１６２を加算した分子量と同じであることを確認した。
（３）抗Ｈｂ抗体、及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体の調製
　抗Ｈｂ抗体は、上記（１）の精製ＨｂＡ０を免疫原として定法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、特許文献（特開昭６１－１７２０６４号公報）記載の方法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。すなわち、上記（２）で合成した糖化ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ）（配列番号９）をＫＬＨに結合させ、これを免疫原とした。ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃと反応し、且つ精製ＨｂＡ０と反応しない株を選択した。
（４）免疫用抗原の調製
　ａ．ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチドのＣ末端側にシステインを結合させた各配列のペプチド（ＶＨＬＣ（配列番号３）、ＶＨＬＴＣ（配列番号４）、ＶＨＬＴＰＣ（配列番号５）、ＶＨＬＴＰＥＣ（配列番号６））を上記（２）のように調製した。これらを０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ含有２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．２（以下、「ＰＢＳ」という）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。
　ｂ．市販（ＰＩＥＲＣＥ社製）のマレイミド活性型の各キャリアタンパク（ＯＶＡ、ＢＳＡ、ｃＢＳＡ、ＫＬＨ）を精製水に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。
　ｃ．上記ペプチド溶液とキャリアタンパク溶液を１対１で混和後、室温で緩やかに回転させながら２時間インキュベートした。
　ｄ．その後、４℃で２日間、ＰＢＳ中にて透析を行った。
　ｅ．透析後の液を回収し、各免疫用抗原として使用した。
（５）免疫と試験採血
　前記免疫用抗原をアジュバントと１：１で混合後、連結シリンジを用いてエマルジョンを作製した。これを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に注入した（１匹当たり２０～５０μｇ）。この操作（免疫）を２週間毎に５回繰り返した。免疫開始６週間後に各マウスの眼底からマウス抗血清を採取し、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて該抗血清中の抗体価を確認した。なお、いずれのＥＬＩＳＡ法においても、免疫していないマウスの眼底から採取した血清をコントロールとして用いた。
（６）細胞融合
　前記試験採血にて高い抗体価が確認されたマウスから脾臓を摘出し、５０％－ＰＥＧ１４５０（シグマ社製）を用いた常法により細胞融合を行った。ミエローマ細胞はＳＰ２／Ｏを用いた。得られた融合細胞は、脾臓細胞として２．５×１０6／ｍＬになるようにＨＡＴ及び１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴培養プレートに０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて培養した。
（７）スクリーニング
　細胞融合１０日後に１次スクリーニングとして、培養上清を用いて後記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を行い、精製ＨｂＡ０に対し高い反応性を示したｗｅｌｌを１次陽性ｗｅｌｌとして選別した。該１次陽性ｗｅｌｌ中の細胞は、２４穴プレートにおいて継代した。
　継代２日後、２次スクリーニングとして、培養上清を用いて後記競合ＥＬＩＳＡ法を行い、ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）に対し高い反応性を示し、且つ同じアミノ酸配列の糖化ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ）に反応を示さなかったｗｅｌｌを２次陽性ｗｅｌｌとして選択した。
（８）クローニング及びイムノグロブリン（抗体）採取
　２次スクリーニングで選別した５株のハイブリドーマを、限界希釈法にてクローニングした。次いで、各ハイブリドーマが産生するイムノグロブリン（抗体）を採取するため、２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ハイブリドーマを細胞数０．５×１０6個の量で腹腔内に投与した。１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１．５ｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡセファロースカラムに通し、ろ液中の抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。該溶出液を、１ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和後、ＰＢＳで透析を行い、抗体を採取した。
（９）ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
　ＰＢＳに溶解して１μｇ／ｍＬの濃度に調製した精製ＨｂＡ０をスクリーニング用抗原として、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに固相化し、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ（以下、「１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ」という）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。該ＥＬＩＳＡ用プレートは、ＰＢＳＴで３回洗浄後、各試薬を添加して実施例記載の各ＥＬＩＳＡ法試験に用いた。
（１０）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
　ａ．ＥＬＩＳＡ用プレートに、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴにより段階希釈した各マウス抗血清、あるいは融合細胞の培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｂ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ－ＧｔＦ（ａｂ’）2－Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　Ｉｇ’ｓ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｃ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン塩酸塩を含む発色液（オルトフェニレンジアミン塩酸塩（東京化成社製）を２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を０．０２％の濃度でｐＨ５．０のクエン酸緩衝液に溶解）(以下、「ＯＰＤ発色液」という)を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１０分間静置した。
　ｄ．０．７５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止した後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
（１１）競合ＥＬＩＳＡ法
　ａ．ＥＬＩＳＡ用プレートにヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）、又は同じアミノ酸配列の糖化ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ）を１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで適当な濃度に希釈した溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
　ｂ．次いで、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで適当な濃度に希釈した融合細胞の培養上清を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　以降の操作は、前記（１０）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の工程イ～エと同様に行った。
（ＩＩ）結果
（１）試験採血における抗原固相化ＥＬＩＳＡ法試験の結果
　試験採血を行い、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により各マウス抗血清中抗体の精製ＨｂＡ０に対する反応性を調べた結果、６種のマウス抗血清全てにおいてＨｂＡ０に対する反応性が確認された（図３）。本実施例で得られた各マウス抗血清は、免疫用抗原であるヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチドとキャリアタンパクの複合体、及びスクリーニング用抗原であるＨｂＡ０中の共通部分であるＨｂβ鎖のＮ末端配列を特異的に認識する抗体を含むと考えられた。
（２）スクリーニング
　１次スクリーニングで固相化された精製ＨｂＡ０に高い反応性を示した株を選択し、さらにその選択株について２次スクリーニングを実施した結果、５種の抗体（８５２０１、８５２０２、８５２０３、８５２０４、及び８５２０６）は、ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）に対し高い反応性を示し、且つ同じアミノ酸配列の糖化ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ）に反応性を示さないことが判明した。
（３）クローニング及びイムノグロブリン（抗体）採取
　２次スクリーニングで選択された５種についてクローニングを実施し、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを独立行政法人産業技術総合研究所（２００８年１１月２８日付け、日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託した。受託番号は以下のとおりである。
　抗体番号：受託番号
８５２０１：ＦＥＲＭ　　ＢＰ－１１１８７
８５２０２：ＦＥＲＭ　　ＢＰ－１１１８８
８５２０３：ＦＥＲＭ　　ＢＰ－１１１８９
８５２０４：ＦＥＲＭ　　ＢＰ－１１１９０
８５２０６：ＦＥＲＭ　　ＢＰ－１１１９１
実施例２（各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の特異性評価）
（Ｉ）材料と方法
（１）試薬の調製
　評価に用いた各抗原及び各抗体は、実施例１の（１）から（４）と同様の操作で調製した。また、ＨＰＬＣフラクションは、ヒト赤血球溶血液を東ソー社製のＴＳＫ－ｇｅｌ　ＧｌｙｃｏＨＳｉカラムを用いたＫＯ５００法により分離し、フラクションコレクターを用い回収した各フラクションを用いた。抗原固相化ＥＬＩＳＡに添加するときは、各フラクションをＰＢＳで６倍希釈して使用した。
（２）特異性の評価
　実施例１の抗原固相化ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡ法と同様に行った。但し、用いた抗体は精製ＩｇＧ（モノクローナル抗体：０．２μｇ／ｍＬ）である。
（ＩＩ）結果
（１）ペプチド及び糖化ペプチドに対する反応性
　まず、図４に示すように、競合ＥＬＩＳＡにおいて試験に用いた特異抗体（８５２０１、８５２０２）はともにヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）に対してのみに反応し、同じアミノ酸配列の糖化ペプチド（ｆ－ＶＨＬＴＰＥ）には反応しないことが確認された。また、図５に示すように、ヒトヘモグロビンα鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＬＳＰＡＤ）には反応しないことが確認された。他の３種の特異抗体（８５２０３、８５２０４、８５２０６）についても同様に試験した結果、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）に対してのみ反応し、且つｆ－ＶＨＬＴＰＥ及びＶＬＳＰＡＤ（配列番号１０）には反応しないことが確認された。
（２）精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃに対する反応性
　図６に示すように、抗原固相化ＥＬＩＳＡにおいて、まず、対照として用いた抗Ｈｂ抗体は精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃに対し同等に反応した。これに対し、試験に用いた特異抗体（８５２０１）はＨｂＡ１ｃには反応せず、ＨｂＡ０に対してのみ反応した。他の４種の特異抗体（８５２０２、８５２０３、８５２０４、及び８５２０６）についても同様に試験した結果、精製ＨｂＡ０に対してのみ反応し、精製ＨｂＡ１ｃには反応しないことが確認された。
（３）ＨＰＬＣフラクションに対する反応性
　図７に示すように、抗原固相化ＥＬＩＳＡにおいて、まず、対照として用いた抗Ｈｂ抗体は、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の両方に反応し、また、同じく対照として用いた抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、ＨｂＡ１ｃのピークのみに反応しＨｂＡ０のピークには反応しなかった。これに対し、試験に用いた３種の特異抗体（８５２０１、８５２０２、８５２０６）はＨｂＡ１ｃには反応せず、ＨｂＡ０に対してのみ反応した。他の２種の特異抗体（８５２０３、８５２０４）についても同様に試験した結果、ＨｂＡ０に対して反応し、ＨｂＡ１ｃには反応しないことが確認された。
　以上の結果から、試験に用いた５種の特異抗体はＨｂＡ１ｃには反応せず、ＨｂＡ０に対してのみ反応すること、また、これらの抗体は、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ヘキサペプチド配列（ＶＨＬＴＰＥ）(配列番号１)を検出できることが確認された。
実施例３（ＥＬＩＳＡによるＨｂＡ１ｃ値の測定）
（Ｉ）材料と方法
（１）抗ＨｂＡ１ｃ抗体、及び抗Ｈｂ抗体の調製
　測定に用いた抗ＨｂＡ１ｃ抗体及び抗Ｈｂ抗体は、実施例１の（Ｉ）（３）と同様に調製した。
（２）ビオチン標識抗Ｈｂ抗体の調製
　上記（１）の抗Ｈｂ抗体を市販のビオチン標識試薬（ＰＩＥＲＣＥ社、ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ）を用い、次のように標識した。１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解したビオチン標識試薬０．０５ｍＬを１ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｈｂ抗体液１ｍＬに添加し、室温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳで透析し測定に使用した。
（３）検体及び標準試料の調製
　社内ボランティアよりＥＤＴＡ－２Ｎａ入りの真空採血管（積水メディカル社製）に採血し、遠心分離により赤血球を分離した。この赤血球４μＬと抗原処理液（１％Ｔｗｅｅｎ２０－１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＮＯ2－３ｍｏｌ／Ｌ　グアニジン塩酸塩－５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ、ｐＨ６．０）０．２ｍＬを混和した。２５℃で１０分間放置後、その混合液を３％スキムミルク－ＰＢＳＴで段階希釈し、下記サンドイッチＥＬＩＳＡの検体として使用した。尚、標準試料は、下記ＨＰＬＣ法により予めＨｂＡ１ｃ濃度及びＨｂＡ０濃度を求めておいた別人の検体を用いた。
（４）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ０量（濃度）の測定
　ａ．実施例１で獲得した特異抗体（８５２０１）をＰＢＳで５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。これをＥＬＩＳＡプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で１夜静置した。
　ｂ．ＰＢＳＴ（３５０μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｃ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、上記（３）で処理した標準試料又は検体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｄ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈したビオチン標識抗Ｈｂ抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　ｅ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で３０分間静置した。
　ｆ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１０分間静置した。
　ｇ．０．７５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止した後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
　ｈ．各濃度の標準試料の吸光度をもとに検量線を作成し、それを用い検体の濃度を求めた。
（５）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ１ｃ量（濃度）の測定
　上記（４）と同様の方法で、特異抗体（８５２０１）の代わりに抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。
（６）ＨｂＡ１ｃ値の算出
　上記（４）及び（５）で求めたＨｂＡ０濃度及びＨｂＡ１ｃ濃度をもとに下記式よりＨｂＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃの含有率）を求めた。
　ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ＨｂＡ１ｃ量（濃度）／（ＨｂＡ１ｃ量（濃度）＋ＨｂＡ０量（濃度）））×１００
（７）ＨＰＬＣ法によるＨｂＡ１ｃ値の測定
　東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３Ｇ８を用い、全ヘモグロビン中のＨｂＡ１ｃの含有率を測定した。
（ＩＩ）結果
（１）検量線
　標準試料を用い、ＨｂＡ０濃度測定系、及びＨｂＡ１ｃ濃度測定系の検量線を作成した。図８に示すように、両測定系ともに各抗原濃度依存的に吸光度の上昇が確認された。
（２）ＨＰＬＣ法による測定値との比較
　本発明抗体を用い上記サンドイッチＥＬＩＳＡで求めたＨｂＡ１ｃ値とＨＰＬＣ法で求めたＨｂＡ１ｃ値を比較した。健常者５名より採取した検体を用い両方法でそれぞれＨｂＡ１ｃ値を求めた。その結果、表１に示すように、両方法で求めたＨｂＡ１ｃ値は概ね同じような値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果から、本発明の抗体がＨｂＡ０量（濃度）、ＨｂＡ１ｃ量（濃度）、及びＨｂＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃの含有率）の定量測定に使用できることが確認された。

Claims (7)

  1. 　Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はタンパク質と反応し、当該ペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体。
  2. 　Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないヘモグロビンと反応し、当該ヘモグロビンのＮ末端バリンが修飾されたヘモグロビンと反応しないものである請求項１記載の抗体。
  3. 　ヘモグロビンＡ０と反応し、ヘモグロビンＡ１ｃと反応しないものである請求項１又は２記載の抗体。
  4. 　Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有さないヘモグロビンと反応しないものである請求項１～３のいずれか１項記載の抗体。
  5. 　モノクローナル抗体である請求項１～４のいずれか１項記載の抗体。
  6. 　Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬ（配列番号２）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はタンパク質を免疫原として用いる請求項１～５のいずれか１項記載の抗体の製造法。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項記載の抗体を用いて試料中のヘモグロビンＡ０量を測定し、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を用いて前記試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量を測定し、次式（１）
    　ヘモグロビンＡ１ｃ含有率（％）＝（ヘモグロビンＡ１ｃ量／（ヘモグロビンＡ１ｃ量＋ヘモグロビンＡ０量））×１００
    から試料中のヘモグロビンＡ１ｃ含有率（％）を算出することを特徴とする試料中のヘモグロビンＡ１ｃ含有率の測定法。
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