WO2010067604A1 - 骨再生用材料およびその製造方法 - Google Patents

骨再生用材料およびその製造方法 Download PDF

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WO2010067604A1
WO2010067604A1 PCT/JP2009/006743 JP2009006743W WO2010067604A1 WO 2010067604 A1 WO2010067604 A1 WO 2010067604A1 JP 2009006743 W JP2009006743 W JP 2009006743W WO 2010067604 A1 WO2010067604 A1 WO 2010067604A1
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WO
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collagen
bone regeneration
bone
calcium phosphate
base material
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/006743
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English (en)
French (fr)
Inventor
梅田裕生
金丸眞一
中村達雄
年光昭夫
Original Assignee
国立大学法人京都大学
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/42—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having an inorganic matrix
    • A61L27/425—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having an inorganic matrix of phosphorus containing material, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a bone regeneration material that can effectively regenerate bone and has high affinity to a living body, and a method for producing the same.
  • Bone can be said to be a very important organ in supporting and protecting various parts of a living body.
  • the brain important for a living body is protected by being covered with a skull.
  • these bones may be damaged, for example, by receiving some excessive external force. At this time, in order to protect life, it is necessary to quickly and firmly regenerate damaged bone.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 bone regeneration materials containing collagen and hydroxyapatite have been used (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the bone regeneration material described in Non-Patent Document 1 is prepared by mixing 1 to 5% by weight of collagen solution and hydroxyapatite particles, and then repeating stirring and deaeration.
  • the bone regeneration material described in Non-Patent Document 2 is produced by mixing a collagen solution and hydroxyapatite particles and then freeze-drying the mixture.
  • the bone regeneration material described in Non-Patent Document 3 is prepared by mixing particulate ⁇ -TCP and collagen and then freeze-drying the mixture.
  • the bone regeneration material described in Non-Patent Document 4 is produced by mixing powdery ⁇ -TCP, collagen and a crosslinking agent (glutaraldehyde) under acidic conditions, and then freeze-drying the mixture. Yes.
  • the bone regeneration material described in Non-Patent Document 5 is produced by mixing powdery ⁇ -TCP, collagen, and a crosslinking agent (glutaraldehyde) under alkaline conditions, and then freeze-drying the mixture. .
  • Non-Patent Document 6 describes a bone regeneration material containing collagen and ⁇ -TCP and a bone regeneration material containing collagen and hydroxyapatite. These bone regeneration materials are prepared by mixing particulate ⁇ -TCP or hydroxyapatite and collagen, and then freeze-drying the mixture.
  • the conventional bone regeneration material has a problem that bone cannot be effectively regenerated.
  • the above conventional bone regeneration material effectively regenerates bone marrow and bones with poor blood flow (such as the skull) compared to long bones represented by limb bones. Has the problem of being unable to.
  • the conventional bone regeneration material uses a particulate or powdered scaffold material (for example, ⁇ -TCP or hydroxyapatite), the scaffold material is easily washed away in vivo. As a result, the conventional bone regeneration material has a problem that bone cannot be effectively regenerated. In addition, the conventionally well-known technique cannot inject
  • a particulate or powdered material was used as the scaffold material.
  • the conventional method using the bone marrow-derived stromal cells, stem cells, or regulatory factors together has a problem that they can adversely affect the living body.
  • bone marrow-derived stromal cells, stem cells, and regulatory factors are used on bone that is present near the lesion after excision of the neoplastic lesion, there is a problem that the neoplastic lesion can recur or worsen. is doing.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and an object of the present invention is to provide a bone regeneration material capable of effectively regenerating bone and a method for producing the same.
  • the present inventors have found that the method for producing a bone regeneration material of the present invention can inject collagen into the pores deep inside the calcium phosphate base material.
  • the present inventors have found that the bone regeneration material thus produced can effectively regenerate bone, and have completed the present invention.
  • the method for producing a bone regeneration material according to the present invention includes a first infiltration step in which a porous calcium phosphate substrate is immersed in a low-viscosity solution, and after the first infiltration step.
  • the calcium phosphate base material has a three-dimensional shape having a length of at least one side of 5 mm or more.
  • the collagen solution contains 0.5 wt% to 2 wt% collagen.
  • the hole diameter is preferably 50 ⁇ m to 400 ⁇ m.
  • the ultrasonic treatment includes ultrasonic waves having a frequency of 28 kHz, ultrasonic waves having a frequency of 31 kHz, ultrasonic waves having a frequency of 45 kHz, and ultrasonic waves having a frequency of 100 kHz. It is preferable to irradiate the calcium phosphate substrate with at least one ultrasonic wave selected from the group consisting of:
  • the pressure applied to the calcium phosphate base material is changed within a range of 50 hPa to atmospheric pressure in the pressure change treatment.
  • the bone regeneration material of the present invention is a bone regeneration material containing a porous calcium phosphate base material and collagen, wherein the collagen is injected into the pores.
  • the weight ratio of collagen injected into the hole to the bone regeneration material is 1% by weight or more.
  • the collagen is injected to a depth of at least 0.25 cm from the surface of the calcium phosphate base material.
  • the hole diameter is preferably 50 ⁇ m to 400 ⁇ m.
  • the bone to be regenerated is preferably a skull.
  • the method for producing a bone regeneration material according to the present invention includes a first infiltration step in which a porous calcium phosphate base material is immersed in a low viscosity solution, and the low viscosity solution after the first infiltration step.
  • a method of applying pressure change processing is performed on the calcium phosphate base material.
  • the bone regeneration material of the present invention is a bone regeneration material containing a porous calcium phosphate base material and collagen as described above, and the collagen is injected into the pores,
  • the weight ratio of collagen injected into the pores to the bone regeneration material is 1% by weight or more.
  • the present invention since collagen is injected deep into the pores, it is possible to maximize the cell adhesion ability, cell proliferation ability, and cell migration ability of collagen in the microenvironment within the pores. As a result, early angiogenesis can be effectively induced. Therefore, there is an effect that the bone can be effectively regenerated.
  • the present invention is effective for the regeneration of bone marrow and bones with poor blood flow (for example, skulls and the like).
  • the present invention has an effect that the scaffold can be effectively regenerated because the scaffold material is not easily washed away into the living body.
  • the present invention has an effect that bones can be regenerated quickly and widely.
  • the present invention has an effect that bones with high strength can be regenerated.
  • the present invention can provide a bone regeneration material having high biocompatibility, the present invention has an effect of effectively regenerating bone without adversely affecting the living body.
  • A is a schematic diagram showing a cross-sectional shape of a bone regeneration material observed with a scanning microscope
  • (b) is a scanning micrograph of a cross-section of a ⁇ -TCP base material not immersed in a collagen solution
  • (C) is a scanning micrograph of a cross section of a bone regeneration material prepared using a 1 wt% collagen solution.
  • FIG. 4 is a scanning photomicrograph in which a region passing through the central portion of the material is continuously photographed
  • (e) is a continuous photograph produced by superposing overlapping fields of view in (a) to (d).
  • (A) And (b) is a microscope picture which shows the regeneration effect of the bone regeneration material 6 months after transplanting the bone regeneration material. It is a graph which shows the regeneration effect of the material for bone regeneration 3 months after transplanting the material for bone regeneration. It is a graph which shows the regeneration effect of the material for bone regeneration 6 months after transplanting the material for bone regeneration.
  • the method for manufacturing a bone regeneration material according to the present embodiment includes a first infiltration step in which a porous calcium phosphate base material is immersed in a low viscosity solution.
  • the low-viscosity solution only needs to be a solution having a viscosity lower than that of the collagen solution described later, and its specific configuration is not particularly limited.
  • water, PBS (+) (Phosphate buffered saline (+)), PBS (-) (Phosphate buffered saline (-)), physiological saline, or the like can be used as the low viscosity solution.
  • PBS (+) is more preferable. If it is the said structure, a low-viscosity solution can be easily inject
  • the viscosity of the low-viscosity solution and the collagen solution described later can be appropriately measured by known methods and measuring instruments. Specifically, it can be measured by an analog viscometer manufactured by Brookfield. In addition, the specific measuring method should just follow the protocol attached to the said analog viscometer.
  • the calcium phosphate base material functions as a scaffold material (for example, a scaffold for differentiation and growth of osteoblasts) in a living body.
  • the calcium phosphate base material is porous.
  • the calcium phosphate base material is provided with pores leading to the surface of the calcium phosphate base material.
  • the hole diameter of the hole is not particularly limited, but it is preferably as small as possible.
  • the hole diameter is preferably 50 ⁇ m to 400 ⁇ m, and more preferably 100 ⁇ m to 400 ⁇ m.
  • the pore diameter is small, collagen can be retained in the pore for a long time, and cells involved in bone regeneration (for example, osteoblasts, etc.) can easily enter the pore. .
  • the said cell can be stably proliferated and differentiated on the scaffold material rich in collagen, as a result, bone can be regenerated effectively.
  • a porous calcium phosphate base material as described above, a commercially available product can be used as a porous calcium phosphate base material as described above.
  • Osferion manufactured by Olympus Terumo Biomaterials Co., Ltd. or Osferion 60 (registered trademark) can be used, and Apaceram (registered trademark) or Apaceram-AX (registered trademark) manufactured by Pentax Co., Ltd. Although it is also possible to use, it is not limited to these.
  • the calcium phosphate base material has pores therein.
  • the ratio of the pore volume to the total volume of the calcium phosphate base material is not particularly limited, but is preferably 50% or more, and more preferably 75% or more, for example.
  • the upper limit of the porosity is not particularly limited, but is preferably 90%, more preferably 95%, and most preferably 98%, for example. According to the above configuration, a large amount of collagen can be injected into the pores, and the strength of the calcium phosphate base material can be maintained high. As a result, bone can be effectively regenerated.
  • the specific material of the calcium phosphate base material is not particularly limited, but is, for example, ⁇ -TCP ( ⁇ -tricalcium phosphate), hydroxyapatite, ⁇ -TCP (( ⁇ -tricalcium phosphate)), or a mixture thereof. Is preferred. Since these materials have high biocompatibility, they are harmless to the living body. Furthermore, ⁇ -TCP and ⁇ -TCP are bone-replaceable bioabsorbable materials, and have the advantage that they themselves can become bone materials while being decomposed in vivo. That is, with ⁇ -TCP and ⁇ -TCP, these substances can be effectively regenerated without remaining in the living body.
  • Hydroxyapatite does not become a bone material but remains in the living body, but its strength is higher than ⁇ -TCP and ⁇ -TCP. This has the advantage that the shape can be maintained stably.
  • ⁇ -TCP, ⁇ -TCP and hydroxyapatite all have an activity of inducing bone regeneration. As described above, it can be said that the above three kinds of materials are preferable materials, but among these, ⁇ -TCP can regenerate bones most effectively.
  • the shape of the calcium phosphate base material is not particularly limited, but is preferably non-particulate or non-powdered, for example.
  • the term “particulate / powdered” is intended to mean particles having a particle diameter of 100 ⁇ m or less.
  • the particle diameter can be measured as an average particle diameter by a dynamic light scattering method.
  • a known apparatus for example, a dynamic light scattering photometer DLS-6000 manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.
  • the calcium phosphate substrate preferably has a three-dimensional shape with at least one side of 5 mm or more, and more preferably has a three-dimensional shape with at least one side of 1 cm or more.
  • the three-dimensional shape is preferably, for example, a cube, a rectangular parallelepiped, a cylinder, a substrate, a sphere, or an ellipsoid.
  • the solid shape is a cylinder
  • “one side” intends the height of the cylinder.
  • the three-dimensional shape is spherical, “one side” intends the diameter of the sphere.
  • the three-dimensional shape is an ellipsoid, “one side” is intended to be a short axis.
  • the method for manufacturing a bone regeneration material of the present embodiment includes a second infiltration step in which a calcium phosphate base material is immersed in a collagen solution having a higher viscosity than the low-viscosity solution after the first infiltration step.
  • the collagen solution only needs to be a solution containing collagen and having a higher viscosity than the low-viscosity solution, and its specific configuration is not particularly limited.
  • the collagen contained in the collagen solution is not particularly limited, and any known type of collagen can be used.
  • the origin of the collagen is not particularly limited.
  • the collagen is preferably type I collagen, type III collagen, or a mixture of type I collagen and type III collagen.
  • atelocollagen it is possible to use commercially available atelocollagen suitably.
  • NMP collagen PSN pig-derived atelocollagen
  • an acidic collagen solution for example, I-PC, I-AC, etc. manufactured by Koken Co., Ltd.
  • a neutral collagen solution for example, Eagle MEM, Hanks, DMEM, etc.
  • a collagen peptide for example, Nitta Gelatin Inc.
  • HDL series 800F
  • SCP series SCP series
  • LCP series LCP series
  • the collagen can be appropriately obtained by a known method, and the specific method for obtaining the collagen is not particularly limited. For example, it is possible to purify from a natural material (for example, pig skin) based on a known method. Alternatively, after producing an expression vector for a desired collagen based on a known method, the desired collagen is produced by introducing the expression vector into an appropriate host (eg, yeast, animal cells, insect cells, etc.). It is also possible.
  • an appropriate host eg, yeast, animal cells, insect cells, etc.
  • Collagen (or collagen solution) obtained by the above method can be directly used as a collagen solution used in the second infiltration step, or collagen (or collagen solution) obtained as described above. Is further dissolved in PBS (+) or the like to a desired concentration, and then the solution can be used as a collagen solution used in the second infiltration step.
  • the solvent for dissolving the collagen in the collagen solution is not particularly limited, and a desired solvent can be appropriately used.
  • a desired solvent can be appropriately used.
  • water, PBS (+), PBS ( ⁇ ), physiological saline, or the like can be used as a solvent, but is not limited thereto.
  • the pH of the solvent is not particularly limited, but is preferably acidic from the viewpoint of sufficiently dissolving collagen.
  • the specific pH value is not particularly limited, for example, it is preferably 5.0 or less, more preferably 4.0 or less, and most preferably 3.0 or less.
  • collagen in a neutral solvent, collagen has a triple-stranded helical structure and is hardly soluble in the solvent. Then, as the pH decreases, it is broken down into individual chains and solubilized.
  • the collagen can be easily injected into the pores of the calcium phosphate base material as the collagen is solubilized.
  • the concentration of collagen contained in the collagen solution used in the second infiltration step is not particularly limited, but is preferably 0.5% by weight to 2% by weight, and more preferably 1% by weight to 2% by weight. If it is the said structure, a collagen solution can be easily inject
  • the collagen solution used in the second infiltration step preferably contains the powdered calcium phosphate base material.
  • the material of the calcium phosphate base material is not particularly limited, but ⁇ -TCP is more preferable.
  • the origin of the powdery calcium phosphate base material is not particularly limited.
  • a powdered calcium phosphate base material that is generated when ultrasonic treatment is performed on the calcium phosphate base material in the first infiltration step may be included in the collagen solution.
  • the powder-form calcium phosphate base material produced separately may be contained in the collagen solution. According to the above configuration, a bone regeneration material having a higher bone regeneration effect can be produced.
  • the particle diameter of the powdery calcium phosphate base material at this time is not particularly limited, but it is preferably as small as possible. Further, the amount of the powdered calcium phosphate base material contained in the collagen solution is not particularly limited.
  • the pH of the solution solubilizing collagen is adjusted to be acidic (for example, pH 3.0).
  • ⁇ -TCP and the like are stable at pH 4.0 to pH 11.0, but are unstable at pH 3.0. Therefore, it is necessary to avoid exposing ⁇ -TCP to a strongly acidic solution for a long time.
  • the collagen solution can be easily and rapidly injected into the pores, so that deterioration of ⁇ -TCP under acidic conditions can be prevented.
  • the calcium phosphate base material is subjected to ultrasonic treatment and pressure change treatment.
  • the ultrasonic treatment and the pressure change treatment can be performed simultaneously or alternately.
  • ultrasonic processing and pressure change processing will be described.
  • the ultrasonic treatment is not particularly limited as long as the ultrasonic treatment can be applied to the calcium phosphate substrate in the low viscosity solution or the collagen solution.
  • the ultrasonic wave applied to the calcium phosphate base material is preferably an ultrasonic wave having a frequency of 28 kHz to 100 kHz.
  • at least one ultrasonic wave selected from the group consisting of an ultrasonic wave having a frequency of 28 kHz, an ultrasonic wave having a frequency of 31 kHz, an ultrasonic wave having a frequency of 45 kHz, and an ultrasonic wave having a frequency of 100 kHz is used. Is more preferable, and it is preferable to use a combination of a plurality of the above four types of ultrasonic waves.
  • ultrasonic treatment can be performed on the calcium phosphate base material stably and uniformly.
  • the time for performing the ultrasonic treatment is not particularly limited, but a shorter time is preferable.
  • the sonication time is preferably 30 minutes to 60 minutes. If the ultrasonic treatment is performed for 30 minutes or more, the collagen solution can be reliably injected into the pores of the calcium phosphate base material. Further, if the ultrasonic treatment is performed for 60 minutes or less, the calcium phosphate base material can be prevented from being damaged (for example, dissolved). Further, when using an ultrasonic wave having a frequency of 28 kHz, an ultrasonic wave having a frequency of 45 kHz, and an ultrasonic wave having a frequency of 100 kHz, the irradiation time ratio is set to be 1: 2: 2. It is preferable. According to the said structure, it can prevent that a calcium-phosphate base material is damaged.
  • the temperature of the collagen solution is preferably maintained at 25 ° C. or lower.
  • Collagen gelatinizes when the temperature rises to 30-40 ° C or higher.
  • cell adhesion effect, cell proliferation effect, cell differentiation effect and the like tend to decrease, and as a result, bone regeneration ability tends to decrease. Therefore, with the above configuration, gelatinization of collagen can be prevented, and thus a bone regeneration material having a high bone regeneration effect can be produced.
  • the pressure change treatment is not particularly limited as long as the pressure applied to the calcium phosphate base material in the low-viscosity solution or the collagen solution is changed.
  • the pressure applied to the calcium phosphate substrate varies within a range of 50 hPa to atmospheric pressure.
  • the atmospheric pressure can vary depending on various conditions, but is approximately 1013 hPa. According to the said structure, a low-viscosity solution and a collagen solution can be easily inject
  • the pressure change treatment and the ultrasonic treatment are preferably performed in a state where the calcium phosphate base material is completely immersed in a low viscosity solution or a collagen solution. According to the said structure, a collagen solution can be finally inject
  • a pusher integrated with the base of a 50 mL Terumo syringe (registered trademark) is cut out, inverted 180 degrees, and then inserted into the syringe as an internal valve. After 20 mL of PBS (+) and a porous calcium phosphate substrate are inserted into the syringe, another pusher is inserted into the syringe so that air does not enter.
  • a syringe having a syringe, an internal valve, and a pusher is referred to as a “hand-pressed negative pressure device”.
  • a negative pressure device With the negative pressure device, a negative pressure of about 0.2 atm can be stably applied to the calcium phosphate base material.
  • the hand-pressed negative pressure device is submerged in a flask filled with water, and the flask is placed in an ultrasonic bath.
  • the ultrasonic bath is filled with ice water, thereby preventing gelatin from being gelatinized due to heat rise.
  • an ultrasonic cleaning machine SUC-110 manufactured by Matsukaze Co., Ltd.
  • W-113MK2 manufactured by Nissan Electronics Co., Ltd.
  • step 3) 6 times.
  • the said process WHEREIN: The total time of an ultrasonic treatment will be 60 minutes.
  • a calcium phosphate base material protected by a protective net or the like and 20 mL of PBS (+) are placed in an eggplant type flask or a flat bottom flask (for example, manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.).
  • the protective net is for preventing the calcium phosphate base material and the flask from coming into contact with each other during the ultrasonic treatment to break the calcium phosphate base material, and its specific configuration is not particularly limited.
  • the protective net for example, a sample pack made of polyethylene or polypropylene can be used (for example, made by Eiken Equipment Co., Ltd.), but is not limited thereto.
  • the ultrasonic bath (ultrasonic cleaner) with ice water, and place the eggplant-shaped flask in the ultrasonic bath to perform ultrasonic treatment.
  • an ultrasonic cleaning machine W-113 (manufactured by Honda Electronics Co., Ltd.) can be used as the ultrasonic bath.
  • the frequency of the ultrasonic wave used for the ultrasonic treatment is 100 kHz, and the treatment time is 30 minutes.
  • the vacuum pump is set to generate a negative pressure continuously at 50 hPa, and the pressure change in the eggplant type flask is performed using a three-way cock. In addition, it is preferable to perform a pressure change alternately between the negative pressure for 1 minute and the atmospheric pressure for 1 minute.
  • a vacuum control unit NVC-2000 (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) can be used for controlling the vacuum pump. As described above, the ultrasonic processing and the pressure change processing are performed simultaneously.
  • the vacuum pump is set to generate a negative pressure continuously at 50 hPa, and the pressure change in the eggplant type flask is performed using a three-way cock. In addition, it is preferable to perform a pressure change alternately between the negative pressure for 1 minute and the atmospheric pressure for 1 minute.
  • a vacuum control unit NVC-2000 (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) can be used for controlling the vacuum pump. As described above, the ultrasonic processing and the pressure change processing are performed simultaneously.
  • Ultrasonic treatment and pressure change treatment can be configured as described above.
  • the method for manufacturing a bone regeneration material according to the present embodiment preferably includes a step of freeze-drying the bone regeneration material into which the collagen solution has been injected after the second infiltration step.
  • the specific method to freeze-dry is not specifically limited, A well-known method can be used suitably. Further, the longer the freeze-drying time, the better. According to the above configuration, unnecessary water contained in the bone regeneration material can be removed.
  • the method for producing a bone regeneration material according to the present embodiment includes thermal dehydration cross-linking with respect to a calcium phosphate base material into which collagen has been injected after the second infiltration step (more preferably, after the freeze-drying treatment). It is preferable to carry out the treatment.
  • Specific conditions for the thermal dehydration crosslinking treatment are not particularly limited.
  • collagen is injected at a temperature of 140 ° C. for 24 hours in a square vacuum constant temperature dryer (DP-31 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.). It is preferable to heat the calcium phosphate substrate.
  • poured in the hole of a calcium-phosphate base material is thermal dehydration bridge
  • the bone regeneration material in the method for producing a bone regeneration material of the present embodiment, it is preferable to sterilize the bone regeneration material after the second infiltration step (more preferably, after thermal dehydration crosslinking of the collagen).
  • the second infiltration step more preferably, after thermal dehydration crosslinking of the collagen.
  • it does not specifically limit as a sterilization method, For example, it is preferable to sterilize using ethylene oxide gas. According to the above configuration, the bone regeneration material can be sterilized without denaturing the collagen. As a result, a bone regeneration material that can regenerate bone more effectively can be produced.
  • the bone regeneration material of the present embodiment can be produced by the method for producing a bone regeneration material of the present invention.
  • the structure of the bone regeneration material will be described below.
  • the bone regeneration material of the present embodiment includes a porous calcium phosphate base material and collagen. And the said collagen is inject
  • the calcium phosphate base material functions as a scaffold material (for example, a scaffold for differentiation and growth of osteoblasts) in a living body.
  • the calcium phosphate base material is porous.
  • the calcium phosphate base material is provided with pores leading to the surface of the calcium phosphate base material.
  • the hole diameter of the hole is not particularly limited, but it is preferably as small as possible.
  • the hole diameter is preferably 50 ⁇ m to 400 ⁇ m, and more preferably 100 ⁇ m to 400 ⁇ m.
  • the pore diameter is small, collagen can be retained in the pore for a long time, and cells involved in bone regeneration (for example, osteoblasts, etc.) can easily enter the pore. .
  • the said cell can be stably proliferated and differentiated on the scaffold material rich in collagen, as a result, bone can be regenerated effectively.
  • a porous calcium phosphate base material as described above, a commercially available product can be used as a porous calcium phosphate base material as described above.
  • Osferion registered trademark
  • Osferion 60 registered trademark
  • Apaceram registered trademark
  • Apaceram-AX registered trademark
  • the calcium phosphate base material has pores therein.
  • the ratio of the pore volume to the total volume of the calcium phosphate base material is not particularly limited, but is preferably 50% or more, and more preferably 75% or more, for example.
  • the upper limit of the porosity is not particularly limited, but is preferably 90%, more preferably 95%, and most preferably 98%, for example. According to the above configuration, a large amount of collagen can be injected into the pores, and the strength of the calcium phosphate base material can be maintained high. As a result, bone can be effectively regenerated.
  • the specific material of the calcium phosphate base material is not particularly limited, but is, for example, ⁇ -TCP ( ⁇ -tricalcium phosphate), hydroxyapatite, ⁇ -TCP (( ⁇ -tricalcium phosphate)), or a mixture thereof. Is preferred. Since these materials have high biocompatibility, they are harmless to the living body. Furthermore, ⁇ -TCP and ⁇ -TCP are bone-replaceable bioabsorbable materials, and have the advantage that they themselves can become bone materials while being decomposed in vivo. That is, with ⁇ -TCP and ⁇ -TCP, these substances can be effectively regenerated without remaining in the living body.
  • Hydroxyapatite does not become a bone material but remains in the living body, but its strength is higher than ⁇ -TCP and ⁇ -TCP. This has the advantage that the shape can be maintained stably.
  • ⁇ -TCP, ⁇ -TCP and hydroxyapatite all have an activity of inducing bone regeneration. As described above, it can be said that the above three kinds of materials are preferable materials, but among these, ⁇ -TCP can regenerate bones most effectively.
  • the shape of the calcium phosphate base material is not particularly limited, but is preferably non-particulate or non-powdered, for example.
  • the term “particulate / powdered” is intended to mean particles having a particle diameter of 100 ⁇ m or less.
  • the calcium phosphate substrate preferably has a three-dimensional shape with at least one side of 5 mm or more, and more preferably has a three-dimensional shape with at least one side of 1 cm or more. More specifically, the three-dimensional shape is preferably, for example, a cube, a rectangular parallelepiped, a cylinder, a substrate, a sphere, or an ellipsoid.
  • the solid shape is a cylinder
  • “one side” intends the height of the cylinder.
  • “one side” intends the diameter of the sphere.
  • “one side” is intended to be a short axis. If it is the manufacturing method of the material for bone regeneration of this invention, even if it is a calcium-phosphate base material which has such a shape, collagen can be inject
  • collagen could not be injected into the pores existing in the deep part of the calcium phosphate base material.
  • the method for producing a bone regeneration material of the present invention it is possible to inject collagen into the pores existing deep in the calcium phosphate base material. Therefore, in the bone regeneration material of the present embodiment, it is preferable that collagen is injected into the pores existing at a depth of at least 0.25 cm from the surface of the calcium phosphate base material, and the depth is 0.5 cm. It is more preferable that collagen is injected into the holes existing in the hole, and it is most preferable that collagen is injected into the holes existing at a depth of 1 cm. According to the above configuration, bones can be regenerated more effectively.
  • Collagen is injected into the pores of the calcium phosphate base material.
  • the collagen is not particularly limited, and any known type of collagen can be used.
  • the origin of the collagen is not particularly limited, but for example, it is preferable to use atelocollagen derived from human, pig, or bovine.
  • the collagen is preferably type I collagen, type III collagen, or a mixture of type I collagen and type III collagen.
  • atelocollagen it is possible to use commercially available atelocollagen suitably.
  • NMP collagen PSN pig-derived atelocollagen manufactured by Nippon Ham Co. can be used, but is not limited thereto.
  • the said collagen can be suitably acquired by a well-known method,
  • the specific acquisition method is not specifically limited.
  • the desired collagen is produced by introducing the expression vector into an appropriate host (eg, yeast, animal cells, insect cells, etc.). It is also possible.
  • the weight ratio of collagen in the pores to the bone regeneration material is 1% by weight or more.
  • the weight ratio may be 1% by weight or more, more preferably 1.4% by weight or more, further preferably 1.6% by weight or more, and 1.8% by weight or more. Most preferred.
  • the upper limit of the said weight ratio is not specifically limited, It can prescribe
  • the upper limit of the weight ratio in the bone regeneration material of the present embodiment is the weight ratio when the pores are 100% filled with collagen.
  • the high weight ratio as in the bone regeneration material of the present embodiment is a value that cannot be realized by the conventional bone regeneration material, and because of having such a high weight ratio, the bone regeneration of the present invention is performed.
  • the material for use can effectively regenerate bone.
  • the weight ratio can be calculated according to the following steps 1) to 5).
  • the description is abbreviate
  • the surface of the bone regeneration material is thinly scraped off.
  • the thickness of the surface to be scraped is not particularly limited, but is preferably as thin as possible.
  • the method for scraping the surface is not particularly limited, and a known polishing means can be used as appropriate.
  • the measurement value at this time is Y (g).
  • the bone regeneration material at the time of production may contain a lot of moisture. In this case, an accurate weight ratio cannot be calculated. Therefore, in this case, it is preferable to remove excess water from the bone regeneration composition prior to the step 1).
  • the method for removing moisture is not particularly limited, but for example, moisture can be removed by freeze drying. As is apparent from this, the “weight ratio” in this specification is used interchangeably with “dry weight ratio”.
  • ⁇ -TCP substrate was used as the porous calcium phosphate substrate.
  • Osferion registered trademark provided by Olympus Biomaterials Inc.
  • the shape of the ⁇ -TCP base material is a cube having a side length of 1 cm, and the diameter of the hole formed in the ⁇ -TCP base material is 100 ⁇ m to 400 ⁇ m.
  • the porosity was 75%.
  • the ⁇ -TCP base material has a compressive strength of about 0.9 MPa to 3.0 MPa, and the ⁇ -TCP is stable at pH 4 to 11.
  • a ⁇ -TCP base material and PBS (+) Phosphate buffered saline (+) were placed in a flask.
  • PBS (+) Phosphate buffered saline (+)
  • the ⁇ -TCP substrate was placed in a protective net in order to prevent deformation (eg, loss) due to contact with the flask during sonication.
  • the 100 kHz ultrasonic wave was applied to the ⁇ -TCP substrate in the flask for 30 minutes.
  • the pressure change was performed every minute.
  • a pressure change that changes between 50 hPa and atmospheric pressure was applied to the ⁇ -TCP base material.
  • the flask was ice-cooled, and the temperature of ⁇ -TCP was maintained at 25 ° C. or lower.
  • the ⁇ -TCP base material contained in the protective net was immersed in a 0.5 wt%, 1 wt%, 2 wt%, or 3 wt% collagen solution in the flask.
  • the production method of each collagen solution is demonstrated easily below.
  • porcine-derived atelocollagen NMP collagen PSN manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • the atelocollagen was added to a small amount of distilled water (milliQ water) so as to obtain a desired weight% collagen solution.
  • 0.1N hydrochloric acid was added to adjust the pH of the collagen solution to 3.0.
  • distilled water was added to the collagen solution to adjust the volume, thereby adjusting each collagen solution to a desired collagen concentration.
  • the ultrasonic treatment was performed on the ⁇ -TCP base material in the flask. At this time, a total of 360 cycles (30 cycles in total) of ultrasonic treatment cycles consisting of ultrasonic treatment at 28 kHz for 1 second, ultrasonic treatment at 45 kHz for 2 seconds, and ultrasonic treatment at 100 kHz for 2 seconds. Minutes). During this time, a change in pressure varying between 50 hPa and atmospheric pressure was applied to the ⁇ -TCP base material. The pressure change was performed every minute. In addition, in order to prevent temperature change during the ultrasonic treatment, the flask was ice-cooled, and the temperature of ⁇ -TCP was maintained at 25 ° C. or lower (about 7-8 ° C.). In addition, gelatinization of collagen can be prevented by maintaining the temperature at 25 ° C. or lower.
  • the ⁇ -TCP base material was taken out from the collagen solution, and the ⁇ -TCP base material was frozen with dry ice or a (deep) freezer and then freeze-dried.
  • the ⁇ -TCP base material was heated at 140 ° C. for 24 hours under vacuum to effect thermal dehydration crosslinking of collagen.
  • the ⁇ -TCP base material was sterilized using ethylene oxide gas, and the ⁇ -TCP base material was used in various experiments described later as a bone regeneration material.
  • the bone regeneration material having a cubic shape with a side of 1 cm produced as described above was cut in half as shown in FIG. First, the central part of the cross section (the distance from the surface was about 0.5 cm) was observed with a scanning microscope.
  • FIG. 3 (b) shows the result of the ⁇ -TCP base material not immersed in the collagen solution
  • FIG. 3 (c) shows the result of the bone regeneration material prepared using the 1% by weight collagen solution. ing.
  • FIG. 3 (c) it was revealed that collagen was deeply injected into the bone regeneration material. In other words, it has become clear that collagen has been injected into the pores existing at a depth of at least 0.5 cm from the surface of the bone regeneration material.
  • the collagen has reached the center of the bone regeneration material as in FIG. Had been injected.
  • collagen did not enter the pores. This is thought to be because the 3 wt% collagen solution is too viscous.
  • FIGS. 4 (a) to 4 (d) show scanning micrographs obtained by continuously photographing the cross section from one surface of the bone regeneration material to the opposite surface.
  • FIG. 4 (e) is a continuous photograph created by superposing the overlapping fields of view in FIGS. 4 (a) to 4 (d).
  • 4 (a) to 4 (e) are scanning micrographs of a cross-section when the bone regeneration material is cut in half as in FIG. 3 (a), and pass through the central portion of the bone regeneration material. It is the scanning micrograph which observed the area
  • FIGS. 4 (a) to 4 (e) it was revealed that collagen was injected into the entire interior of the ⁇ -TCP substrate having a thickness of 1 cm.
  • FIGS. 4 (a) to 4 (e) show data for a bone regeneration material prepared using a 1% by weight collagen solution, but the 0.5% by weight collagen solution or 2% by weight. The same results were obtained for the bone regeneration material prepared using a 10% collagen solution.
  • the weight ratio was calculated for nine samples. That is, three bone regeneration materials (sample names: A-0.5, G-0.5, J-0.5) prepared using a 0.5 wt% collagen solution, 1 wt% collagen
  • Four bone regeneration materials (sample names: H-1, K-1, D (A) -1, G (A) -1) prepared using a solution, prepared using a 2% by weight collagen solution
  • the weight ratio of the two bone regeneration materials was calculated.
  • the surface of the bone regeneration material is removed in order to remove collagen that has simply adhered to the surface of the bone regeneration material (collagen not injected into the pores). Thinly scraped off. Then, the weight of the bone regeneration material after the surface was shaved was measured (see “Before removal” in Table 1).
  • each bone regeneration material was heated at 800 ° C. for 10 hours, whereby the collagen injected into the pores was incinerated and removed. Then, the weight of the bone regeneration material after incineration and removal of collagen was measured (see “after removal” in Table 1). The value obtained by subtracting the weight of the bone regeneration material after incineration / removal from the weight of the bone regeneration material before incineration / removal is the weight of collagen injected into the pores.
  • the compressive strength of each bone regeneration material was also measured.
  • the measurement of the said compressive strength used Shimadzu Corporation AUTO GRAPH 2000GE, and set the crosshead speed to 0.5 mm / min. Other measurement methods followed the protocol attached to the measuring instrument.
  • a large defect larger than CriticalCsize (CSD: a defect that does not spontaneously heal) is created in the skull, a) only ⁇ -TCP (cube with a side of 1 cm in length), b) simply surface with collagen A mixture of granular ⁇ -TCP and bone powder coated only with c, and c) the bone regeneration material of this example (prepared using a 1% collagen solution), after being embedded in the skull of the same experimental animal The difference in skull regeneration was examined.
  • the sample shown in b) above was prepared by mixing ⁇ -TCP and collagen so that the dry weight ratio was 98: 2, and then freeze-drying, thermal dehydration crosslinking, and sterilization of the mixture.
  • the transplantation method of each sample was performed based on a known method. Briefly explaining the method, when observing the bone regeneration effect 3 months and 4 months after transplanting the bone regeneration material, a 2 cm ⁇ 2 cm CSD is formed on the skull of a large animal, Four pieces (1 cm ⁇ 1 cm ⁇ 0.5 cm) of the bone regeneration material (cube having a side of 1 cm in length) cut in half were embedded in the CSD.
  • the bone regeneration material used was a bone regeneration material that was cut out from a cubic block having a side length of 1 cm so as to have a desired shape.
  • the shape is not particularly limited, but in this embodiment, a multi-stage shape in which a cylinder having a bottom surface and a top surface with a diameter of about 0.7 cm is connected to a cylinder having a bottom surface and a top surface with a diameter of about 1 cm is employed. did.
  • the bone regeneration material having a two-step shape is used, but the number of steps is not particularly limited.
  • the bone regeneration material was embedded in CSD from the cylinder side having a diameter of 0.7 cm. If it is the said shape, it can prevent that the bone regeneration material embedded in CSD slips out of CSD.
  • the bone regeneration effect was evaluated by the regenerated area of the skull, and the regenerated area was evaluated as follows. First, the part where bone should be regenerated in the part where each sample was transplanted was defined as 100%. Then, the area of the new bone and the remaining ⁇ -TCP in the above portion was subjected to image analysis of an image obtained using a microscope, and the ratio of these areas to the portion where the original bone should be regenerated was calculated. In addition, the area of the blood vessel in the part where the bone should be regenerated is also measured, and the ratio of the area of the blood vessel to the part where the bone should be regenerated is calculated. The bone regeneration effect was examined after 3 months, 4 months, and 6 months after transplanting the bone regeneration material.
  • FIGS. 5 (a) and 5 (b) show the observation results using a microscope 6 months after transplanting the bone regeneration material. More specifically, FIG. 5 (a) is a photomicrograph of a skull in which each sample is embedded, and FIG. 5 (b) shows a site where bone is regenerated and a site where ⁇ -TCP remains. It is the identified micrograph. In FIG. 5B, the white area is the area where the bone has been regenerated, and the black area is the area where ⁇ -TCP remains. Although the blood vessel is not shown in FIG. 5B, the blood vessel can be identified based on the form in the micrograph. In addition, the same microscopic observation was performed 3 months and 4 months after transplanting the bone regeneration material, and numerical data as described later was calculated.
  • Tables 2 to 4 show the results obtained by quantifying the data obtained by the microscopic observation as described above.
  • Table 2 shows the results 3 months after transplanting the bone regeneration material
  • Table 3 shows the results 4 months after transplanting the bone regeneration material. Shows the results 6 months after transplanting the bone regeneration material.
  • two values are shown for each item, and data of different parts of the skull are shown.
  • the bone regeneration material of this example was transplanted at 3 months, 4 months, and 6 months after transplantation.
  • the angiogenesis part and the bone regeneration effect were both higher in the part.
  • QCT Quantitative Computed Tomography
  • the “Ca average immediately after surgery” shown in Tables 5 and 6 is the amount of calcium present at the site where the bone regeneration material is transplanted at the time of transplantation of the bone regeneration material (in other words, the bone regeneration material itself is The amount of calcium contained), and “Ca average” indicates the amount of calcium present at the site of transplanting the bone regeneration material 4 months after transplantation.
  • ⁇ -TCP and ⁇ -TCP are bone-replaceable bioresorbable materials that themselves become bone materials while being decomposed and absorbed in vivo.
  • ⁇ -TCP and a part of calcium contained in ⁇ -TCP are taken into the bone, but some calcium is lost by diffusion into the living body. Therefore, the “Ca average” described above can be considered as a total amount of calcium obtained by adding calcium derived from the bone regeneration material and calcium newly taken into the regenerated bone.
  • bone can be effectively regenerated, so that it can be used as a bone filling agent.
  • the present invention can effectively regenerate a skull that has been difficult to regenerate in the past, it can be used particularly as a skull filler.
  • the present invention is not limited to a collagen solution, and can be widely used as a technique for injecting a highly viscous solution into pores.

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Abstract

　低粘性溶液内に多孔質のリン酸カルシウム基材を浸す第１浸潤工程と、第１浸潤工程の後で、低粘性溶液よりも粘性が高いコラーゲン溶液内にリン酸カルシウム基材を浸す第２浸潤工程と、を含み、第１浸潤工程および前記第２浸潤工程では、リン酸カルシウム基材に対して、超音波処理を施すとともに圧変化処理を施すことによって、骨を効果的に再生し得る骨再生用材料、およびその製造方法を提供する。

Description

骨再生用材料およびその製造方法
　本発明は、骨を効果的に再生することができるとともに生体に対して親和性が高い骨再生用材料、およびその製造方法に関するものである。
　骨は、生体の様々な部位を支持および保護する上で、非常に重要な器官であるといえる。例えば、生体にとって重要な脳は、頭蓋骨によって覆われることによって保護されている。しかしながら、これらの骨は、例えば何らかの過剰な外力を受けることによって損傷を受ける場合がある。このとき、生命を守るためには、損傷を受けた骨を速やかに、かつ強固に再生する必要がある。
　そこで、従来から、骨を再生するための様々な骨再生用材料、および骨再生方法が開発されている。従来から整形外科領域で臨床応用されている骨再生用材料（例えば、四肢骨再生用材料）の原料としては、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ（β－tricalcium phosphate）、α－ＴＣＰ（α－tricalcium phosphate）などのリン酸カルシウムを挙げることができ、現在までに、これらリン酸カルシウムを用いた様々な骨再生用材料が開発されている。
　具体的には、従来から、コラーゲンおよびハイドロキシアパタイトを含む骨再生用材料が用いられている（例えば、非特許文献１、２参照）。非特許文献１に記載の骨再生用材料は、１～５重量％のコラーゲン液とハイドロキシアパタイト粒子とを混合した後、攪拌と脱気とを繰り返すことによって作製されている。非特許文献２に記載の骨再生用材料は、コラーゲン液とハイドロキシアパタイト粒子とを混合させた後に、当該混合物を凍結乾燥させることによって作製されている。
　また、従来から、コラーゲン、β－ＴＣＰおよび自家骨を含む骨再生用材料が、頭蓋骨などの再生に用いられている（例えば、非特許文献３、４、５参照）。上記非特許文献３に記載の骨再生用材料は、粒子状のβ－ＴＣＰとコラーゲンとを混合した後に、当該混合物を凍結乾燥させることによって作製されている。上記非特許文献４に記載の骨再生用材料は、酸性条件下にて粉末状のβ－ＴＣＰ、コラーゲンおよび架橋剤（グルタルアルデヒド）を混合した後に、当該混合物を凍結乾燥させることによって作製されている。上記非特許文献５に記載の骨再生用材料は、アルカリ性条件下において粉末状のβ－ＴＣＰ、コラーゲンおよび架橋剤（グルタルアルデヒド）を混合した後に、当該混合物を凍結乾燥させることによって作製されている。
　非特許文献６には、コラーゲンとβ－ＴＣＰとを含む骨再生用材料、および、コラーゲンとハイドロキシアパタイトとを含む骨再生用材料が記載されている。これらの骨再生用材料は、粒子状のβ－ＴＣＰまたはハイドロキシアパタイトと、コラーゲンとを混合した後に、当該混合物を凍結乾燥させることによって作製されている。
　また、上述したようなコラーゲン、β－ＴＣＰおよび自家骨を含む骨再生用材料と、骨髄由来間質細胞、幹細胞または調節因子とを併用して頭蓋骨を再生する技術も、従来から用いられている（例えば、非特許文献７参照）。
　また、上述した技術以外にも、生体用粉体材料および液体材料（リン酸カルシウムおよびコラーゲンを含む）を噴射装置によって複数回噴射することによって、複数の層からなる人工骨を形成する方法も、従来から用いられている（例えば、特許文献１参照）。
日本国公開特許公報「特開２００４－２０２１２６号公報（公開日：平成１６年７月２２日）」
Denys A. Wahl et al., J Mater Sci: Mater Med（2007）18:201-209 Shunji Yunoki et al., Journal of Biomedical Materials Research Part B:Applied Biomaterials, Published online 9 June 2006 in Wiley InterScience（www.interscience.wiley.com）DOI:10.1002/jbm.b.30581 Masanao Kishimoto et al., Laryngoscope 116:212-216, February 2006 Chao Zou et al., Biomaterials 26（2005）5276-5284 Chao Zou et al., Journal of Biomedical Materials Research Part A, Published online 13 December 2007 in Wiley InterScience（www.interscience.wiley.com）DOI:10.1002/jbm.a.31686 Shinji Kamakura et al., Journal of Biomedical Materials Research Part A, Published online 8 June 2007 in Wiley InterScience（www.interscience.wiley.com）DOI:10.1002/jbm.a.31332 Hiroo Umeda et al., Laryngoscope 117:997-1003 2007
　しかしながら、上記従来の骨再生用材料では、骨を効果的に再生することができないという問題点を有している。
　更に具体的には、上記従来の骨再生用材料は、四肢の骨などに代表される長管骨に比べて骨髄および血流に乏しい骨（例えば、頭蓋骨など）を、効果的に再生することができないという問題点を有している。
　また、上記従来の骨再生用材料は、粒子状または粉末状の足場材料（例えば、β－ＴＣＰまたはハイドロキシアパタイトなど）を用いているので、生体内で当該足場材料が流失し易い。その結果、上記従来の骨再生用材料は、骨を効果的に再生することができないという問題点を有している。なお、従来公知の技術は、足場材料が有する細孔中に粘度の高いコラーゲンを注入することができなかった。それ故に、足場材料としては、上述したように粒子状・粉末状のものを用いていた。
　また、上記従来の骨髄由来間質細胞、幹細胞、または調節因子を併用する方法は、これらが生体に対して悪影響を与え得るという問題点を有している。例えば、骨髄由来間質細胞、幹細胞、および調節因子を、腫瘍性病変を切除した後の病巣近傍に存在する骨に使用した場合には、腫瘍性病変を再発・悪化させ得るという問題点を有している。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、骨を効果的に再生し得る骨再生用材料、およびその製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、本願発明の骨再生用材料の製造方法であれば、リン酸カルシウム基材の内部深くの細孔にまでコラーゲンを注入することができることを見出すとともに、このようにして作製した骨再生用材料であれば骨を効果的に再生し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の骨再生用材料の製造方法は、上記課題を解決するために、低粘性溶液内に、多孔質のリン酸カルシウム基材を浸す第１浸潤工程と、前記第１浸潤工程の後で、前記低粘性溶液よりも粘性が高いコラーゲン溶液内に、前記リン酸カルシウム基材を浸す第２浸潤工程と、を含み、前記第１浸潤工程および前記第２浸潤工程では、前記リン酸カルシウム基材に対して、超音波処理を施すとともに圧変化処理を施すことを特徴としている。
　本発明の骨再生用材料の製造方法では、前記リン酸カルシウム基材は、少なくとも１辺の長さが５ｍｍ以上の立体形状を有していることが好ましい。
　本発明の骨再生用材料の製造方法では、前記コラーゲン溶液は、０．５重量％～２重量％のコラーゲンを含むことが好ましい。
　本発明の骨再生用材料の製造方法では、前記孔の孔径は、５０μｍ～４００μｍであることが好ましい。
　本発明の骨再生用材料の製造方法では、前記超音波処理は、２８ｋＨｚの周波数を有する超音波、３１ｋＨｚの周波数を有する超音波、４５ｋＨｚの周波数を有する超音波、および１００ｋＨｚの周波数を有する超音波からなる群より選択される少なくとも１つの超音波を、前記リン酸カルシウム基材に対して照射することが好ましい。
　本発明の骨再生用材料の製造方法では、前記圧変化処理では、前記リン酸カルシウム基材に対してかけられる圧力が５０ｈＰａ～大気圧の範囲内で変化することが好ましい。
　本発明の骨再生用材料は、上記課題を解決するために、多孔質であるリン酸カルシウム基材と、コラーゲンとを含む骨再生用材料であって、前記コラーゲンは、前記孔内に注入されており、前記孔内に注入されているコラーゲンの骨再生用材料に対する重量比が、１重量％以上であることを特徴としている。
　本発明の骨再生用材料では、前記コラーゲンは、前記リン酸カルシウム基材の表面から、少なくとも０．２５ｃｍの深さにまで注入されていることが好ましい。
　本発明の骨再生用材料では、前記孔の孔径は、５０μｍ～４００μｍであることが好ましい。
　本発明の骨再生用材料は、再生対象の骨が、頭蓋骨であることが好ましい。
　本発明の骨再生用材料の製造方法は、以上のように、低粘性溶液内に、多孔質のリン酸カルシウム基材を浸す第１浸潤工程と、前記第１浸潤工程の後で、前記低粘性溶液よりも粘性が高いコラーゲン溶液内に、前記リン酸カルシウム基材を浸す第２浸潤工程と、を含み、前記第１浸潤工程および前記第２浸潤工程では、前記リン酸カルシウム基材に対して、超音波処理を施すとともに圧変化処理を施す方法である。
　また、本発明の骨再生用材料は、以上のように、多孔質であるリン酸カルシウム基材と、コラーゲンとを含む骨再生用材料であって、前記コラーゲンは、前記孔内に注入されており、前記孔内に注入されているコラーゲンの骨再生用材料に対する重量比が、１重量％以上であるものである。
　本発明では、細孔の深部にまでコラーゲンが注入されているので、コラーゲンが有する細胞接着能、細胞増殖能、および細胞遊走能を細孔内の微小環境下において最大限発揮させることが可能となり、その結果、早期の血管新生を効果的に誘導することができる。それ故に、骨を効果的に再生することができるという効果を奏する。特に、本願発明は、骨髄および血流に乏しい骨（例えば、頭蓋骨など）の再生に効果的である。
　また、本発明は足場材料が生体内に流失し難いので、骨を効果的に再生することができるという効果を奏する。
　また、本発明は、速やか、かつ、広範に骨を再生することができるという効果を奏する。
　また、本発明は、強度の高い骨を再生することができるという効果を奏する。
　また、本発明は、生体親和性の高い骨再生用材料を提供することができるので、生体に悪影響を与えることなく効果的に骨を再生することができるという効果を奏する。
超音波処理と圧変化処理とを交互に行って、リン酸カルシウム基材の孔内にコラーゲンを注入する方法を示す模式図である。 超音波処理と圧変化処理とを同時に行って、リン酸カルシウム基材の孔内にコラーゲンを注入する方法を示す模式図である。 （ａ）は、走査顕微鏡にて観察した骨再生用材料の断面形状を示す模式図であり、（ｂ）は、コラーゲン溶液に浸していないβ－ＴＣＰ基材の断面の走査顕微鏡写真であり、（ｃ）は、１重量％のコラーゲン溶液を用いて作製した骨再生用材料の断面の走査顕微鏡写真である。 （ａ）～（ｄ）は、骨再生用材料を半分に切断したときの断面の走査顕微鏡写真であって、骨再生用材料の一表面から反対側の表面に向かう領域であって骨再生用材料の中央部を通る領域を連続的に撮影した走査顕微鏡写真であり、（ｅ）は、（ａ）～（ｄ）において重複した視野を重ね合わせて作製した連続写真である。 （ａ）および（ｂ）は、骨再生用材料を移植してから６ヵ月後の、骨再生用材料の再生効果を示す顕微鏡写真である。 骨再生用材料を移植してから３ヵ月後の、骨再生用材料の再生効果を示すグラフである。 骨再生用材料を移植してから６ヵ月後の、骨再生用材料の再生効果を示すグラフである。
　本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　〔１．骨再生用材料の製造方法〕
　本願発明の骨再生用材料の製造方法では、はじめに、低粘性溶液によってリン酸カルシウム基材の孔内の気相（例えば、孔内の空気）を液相に置換し、次いで、当該孔内の低粘性溶液を高粘性溶液に置換する。これによって、低粘性溶液が充填されていない孔内に高粘性溶液を注入する場合と比較して、高粘性溶液を容易に孔内に注入することが可能になる。以下に、本実施の形態の骨再生用材料の製造方法について説明する。
　本実施の形態の骨再生用材料の製造方法は、低粘性溶液内に多孔質のリン酸カルシウム基材を浸す第１浸潤工程を含んでいる。
　上記低粘性溶液は、後述するコラーゲン溶液よりも粘度が低い溶液であればよく、その具体的な構成は特に限定されない。例えば、上記低粘性溶液としては、水、ＰＢＳ（＋）（Phosphate buffered saline（＋））、ＰＢＳ（－）（Phosphate buffered saline（－））、または生理食塩水等を用いることが可能である。また、これらの中では、ＰＢＳ（＋）が更に好ましい。上記構成であれば、リン酸カルシウム基材の孔の中に容易に低粘性溶液を注入することができる。そして、その結果、後述する第２浸潤工程において、容易にコラーゲン溶液を孔内に注入することができる。
　上記低粘性溶液および後述するコラーゲン溶液の粘度は、適宜公知の方法および測定機器によって測定することができる。具体的には、ブルックフィールド社製のアナログ粘度計などによって測定することができる。なお、具体的な測定方法は、上記アナログ粘度計に添付のプロトコールに従えばよい。
　上記リン酸カルシウム基材は、生体内において足場材料（例えば、骨芽細胞が分化・成育する場合の足場）として機能するものである。
　上記リン酸カルシウム基材は多孔質である。換言すれば、上記リン酸カルシウム基材の内部には、当該リン酸カルシウム基材の表面へと通じる細孔が備えられている。
　上記孔の孔径（孔の横断面の直径）は特に限定されないが、小さいほど好ましい。例えば、孔の孔径は、５０μｍ～４００μｍであることが好ましく、１００μｍ～４００μｍであることが更に好ましい。上記構成によれば、孔径が小さいのでコラーゲンを孔内に長期間保持することができるとともに、孔内に骨の再生に関与する細胞等（例えば、骨芽細胞など）が容易に入り込むことができる。そして、上記細胞はコラーゲンに富んだ足場材料上で安定的に増殖・分化することができるので、その結果、効果的に骨を再生することができる。なお、上述したような多孔質のリン酸カルシウム基材としては市販のものを用いることが可能である。例えば、オリンパステルモバイオマテリアル株式会社製のオスフェリオン（登録商標）、またはオスフェリオン６０（登録商標）を用いることが可能であり、ペンタックス株式会社製のアパセラム（登録商標）、またはアパセラム－ＡＸ（登録商標）を用いることも可能であるが、これらに限定されない。
　上述したように、リン酸カルシウム基材は、その内部に孔を有している。リン酸カルシウム基材の全体積に対する孔の体積の割合（気孔率）は、特に限定されないが、例えば、５０％以上であることが好ましく、７５％以上であることが更に好ましい。気孔率の上限値は特に限定されないが、例えば、９０％であることが好ましく、９５％であることが更に好ましく、９８％であることが最も好ましい。上記構成によれば、孔の内部に多量のコラーゲンを注入することができるとともに、リン酸カルシウム基材の強度を高く維持することができる。そして、その結果、効果的に骨を再生することができる。
　上記リン酸カルシウム基材の具体的な材質としては特に限定されないが、例えば、β－ＴＣＰ（β－tricalcium phosphate）、ハイドロキシアパタイト、α－ＴＣＰ（（α－tricalcium phosphate））、またはこれらの混合物であることが好ましい。これらの材質は生体親和性が高いので、生体に対して無害である。更に言えば、α－ＴＣＰおよびβ－ＴＣＰは骨置換型生体吸収性材料であって、生体内で分解されながら、自身が骨の材料となり得るという利点を有している。つまり、α－ＴＣＰおよびβ－ＴＣＰであれば、これらの物質が生体内に残留することなく、効果的に骨を再生することができる。また、ハイドロキシアパタイトは、自身が骨の材料となることはなく生体内に残留するが、α－ＴＣＰおよびβ－ＴＣＰと比較して強度が高いので、生体内という過酷な環境下においても、その形状を安定に維持することができるという利点を有している。また、α－ＴＣＰ、β－ＴＣＰおよびハイドロキシアパタイトの何れもが、骨再生を誘導する活性を有している。以上のように、上記３種類の材質はそれぞれ好ましい材質であるといえるが、これらの中では、β－ＴＣＰが最も効果的に骨を再生することができる。
　上記リン酸カルシウム基材の形状としては特に限定されないが、例えば、非粒子状・非粉末状であることが好ましい。なお、本明細書中において粒子状・粉末状とは、粒子径が１００μｍ以下のものを意図する。なお、当該粒子径は、動的光散乱法によって、平均粒子径として測定することができる。当該測定には、公知の装置（例えば、大塚電子株式会社製のダイナミック光散乱光度計ＤＬＳ－６０００）を用いればよい。更に具体的には、上記リン酸カルシウム基材は、少なくとも１辺が５ｍｍ以上の立体形状を有していることが好ましく、少なくとも１辺が１ｃｍ以上の立体形状を有していることが更に好ましい。更に具体的には、上記立体形状としては、例えば、立方体、直方体、円柱、基板状、球状、または楕円球状であることが好ましい。なお、立体形状が円柱である場合には、「１辺」とは、円柱の高さを意図する。また、立体形状が球状である場合には、「１辺」とは、球の直径を意図する。また、立体形状が楕円球状である場合には、「１辺」とは、短軸を意図する。本実施の形態の骨再生用材料の製造方法であれば、このような形状を有するリン酸カルシウム基材であっても、基材深部の孔内にまでコラーゲンを注入することができる。また、上記形状であれば、生体内でリン酸カルシウム基材が流失することを防ぐことができる。それ故、上記構成であれば、より効果的に骨を再生することができる。
　本実施の形態の骨再生用材料の製造方法は、上記第１浸潤工程の後に、上記低粘性溶液よりも粘性が高いコラーゲン溶液内に、リン酸カルシウム基材を浸す第２浸潤工程を含んでいる。
　上記コラーゲン溶液は、コラーゲンを含んでいるとともに、上記低粘性溶液よりも粘度が高い溶液であればよく、その具体的な構成は特に限定されない。
　例えば、上記コラーゲン溶液に含有されるコラーゲンとしては特に限定されず、公知のあらゆる型のコラーゲンを用いることが可能である。また、上記コラーゲンの由来としては特に限定されず、例えば、ヒト、ブタ、またはウシ由来のアテロコラーゲンを用いることが好ましい。例えば、上記コラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、または、Ｉ型コラーゲンとIII型コラーゲンの混合物であることが好ましい。なお、上記アテロコラーゲンとしては適宜市販のアテロコラーゲンを用いることが可能である。例えば、日本ハム社製のＮＭＰコラーゲンＰＳＮ（ブタ由来のアテロコラーゲン）を用いることが可能であるが、これに限定されない。また、株式会社　高研製のコラーゲン酸性溶液（例えば、Ｉ－ＰＣ、Ｉ－ＡＣなど）またはコラーゲン中性溶液（例えば、イーグルＭＥＭ、ハンクス、ＤＭＥＭなど）、新田ゼラチン株式会社製のコラーゲンペプチド（例えば、ＨＤＬシリーズ、８００Ｆ、ＳＣＰシリーズ、ＬＣＰシリーズなど）などを用いることも可能である。
　また、上記コラーゲンは、適宜公知の方法によって入手することが可能であり、その具体的な入手方法は特に限定されない。例えば、天然素材（例えば、ブタの皮膚）から公知の方法に基づいて精製することが可能である。または、公知の方法に基づいて所望のコラーゲンの発現ベクターを作製した後、当該発現ベクターを適切な宿主（例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞など）に導入することによって、所望のコラーゲンを作製することも可能である。
　上記方法にて入手したコラーゲン（または、コラーゲン溶液）を、直接、第２浸潤工程にて用いるコラーゲン溶液として使用することも可能であるし、以上のようにして入手したコラーゲン（または、コラーゲン溶液）を更にＰＢＳ（＋）などに所望の濃度に溶解した後、当該溶液を第２浸潤工程にて用いるコラーゲン溶液として使用することも可能である。
　上記コラーゲン溶液においてコラーゲンを溶解させるための溶媒としては特に限定されず、適宜所望の溶媒を用いることが可能である。例えば、水、ＰＢＳ（＋）、ＰＢＳ（－）、または生理食塩水等を溶媒として用いることが可能であるが、これらに限定されない。溶媒のｐＨは特に限定されないが、コラーゲンを十分に溶解させるという観点からは酸性であることが好ましい。具体的なｐＨの値は特に限定されないが、例えば、５．０以下であることが好ましく、４．０以下であることが更に好ましく、３．０以下であることが最も好ましい。通常、中性溶媒中では、コラーゲンは三本鎖からなる螺旋構造をとっており、溶媒に対して難溶性である。そして、ｐＨが低下するにしたがって個々の鎖に分解されて、可溶化する。本実施の形態の骨再生用材料の製造方法では、コラーゲンが可溶化しているほど、容易にリン酸カルシウム基材の孔内にコラーゲンを注入することができる。
　第２浸潤工程に用いるコラーゲン溶液内に含まれるコラーゲンの濃度は特に限定されないが、０．５重量％～２重量％であることが好ましく、１重量％～２重量％であることが更に好ましい。上記構成であれば、リン酸カルシウム基材の孔内に容易にコラーゲン溶液を注入することができる。なお、後述する実施例にも記載しているが、３重量％のコラーゲンを含有するコラーゲン溶液を用いると、０．５重量％～２重量％の場合と比較して、孔内にコラーゲンを注入し難くなる。
　第２浸潤工程に用いるコラーゲン溶液内には、粉末状になった上記リン酸カルシウム基材が含まれていることが好ましい。なお、当該リン酸カルシウム基材の材質としては特に限定されないが、β－ＴＣＰであることが更に好ましい。上記粉末状のリン酸カルシウム基材の由来は、特に限定されない。例えば、第１浸潤工程にてリン酸カルシウム基材に対して超音波処理を施した際に発生する粉末状のリン酸カルシウム基材が、コラーゲン溶液内に含まれていてもよい。また、別途作製した粉末状のリン酸カルシウム基材が、コラーゲン溶液内に含まれていてもよい。上記構成によれば、更に骨再生効果が高い骨再生用材料を作製することができる。なお、このときの粉末状のリン酸カルシウム基材の粒子径は特に限定されないが、小さいほど好ましい。また、コラーゲン溶液中に含まれる粉末状のリン酸カルシウム基材の量も、特に限定されない。
　コラーゲンを個々の分子として溶液中に安定に維持するためには、コラーゲンを可溶化する溶液のｐＨを酸性（例えば、ｐＨ３．０）に調整することが好ましい。β－ＴＣＰなどはｐＨ４．０～ｐＨ１１．０では安定とされているが、ｐＨ３．０では不安定とされている。それ故、β－ＴＣＰを長時間、強酸性溶液に曝すことを避ける必要がある。本願発明の骨再生用材料の製造方法であれば、容易かつ迅速に孔内にコラーゲン溶液を注入することができるので、酸性条件下でβ－ＴＣＰが劣化することを防ぐことができる。
　また、上記第１浸潤工程および上記第２浸潤工程では、リン酸カルシウム基材に対して、超音波処理が施されるとともに圧変化処理が施される。なお、上記超音波処理と上記圧変化処理とは、同時に行うことも可能であるし、交互に行うことも可能である。以下に、超音波処理および圧変化処理について説明する。
　上記超音波処理は、低粘性溶液またはコラーゲン溶液中のリン酸カルシウム基材に対して超音波を照射することができればよく、その具体的な構成は特に限定されない。例えば、リン酸カルシウム基材に対して照射される超音波としては、２８ｋＨｚ～１００ｋＨｚの周波数を有する超音波であることが好ましい。また、２８ｋＨｚの周波数を有する超音波、３１ｋＨｚの周波数を有する超音波、４５ｋＨｚの周波数を有する超音波、および、１００ｋＨｚの周波数を有する超音波からなる群より選択される少なくとも１つの超音波を用いることが更に好ましく、上記４種類の超音波のうちの複数を組み合わせて用いることが好ましい。複数の超音波を組み合わせて用いれば、安定かつ均一に、リン酸カルシウム基材に対して超音波処理を施すことができる。なお、様々な周波数を有する超音波を、上記リン酸カルシウム基材に対して同時に照射することも可能であるし、交互に照射することも可能である。
　粘度の高いコラーゲン溶液中にリン酸カルシウム基材を浸すのみでは、孔内に粘度の高いコラーゲン溶液を注入することは困難である。しかしながら、上述したように超音波処理を行うことによって、孔内に容易に低粘性溶液を侵入させることができるとともに、その後、孔内に容易にコラーゲン溶液を注入することができる。そして、その結果、細孔内に多量のコラーゲンが注入された骨再生用材料を容易に作製することができる。
　上記超音波処理を行う時間としては特に限定されないが、短いほど好ましいといえる。例えば、超音波処理を行う時間は、３０分間～６０分間であることが好ましい。超音波処理を３０分間以上行えば、リン酸カルシウム基材の孔内に確実にコラーゲン溶液を注入することができる。また、超音波処理を６０分間以下の時間で行えば、リン酸カルシウム基材が破損（例えば、溶解）することを防止することができる。また、２８ｋＨｚの周波数を有する超音波、４５ｋＨｚの周波数を有する超音波、および１００ｋＨｚの周波数を有する超音波を用いる場合には、その照射時間の比が、１：２：２になるように設定することが好ましい。上記構成によれば、リン酸カルシウム基材が損傷することを防止することができる。
　上記超音波処理を行っている間、上記コラーゲン溶液の温度は、２５℃以下に維持されていることが好ましい。コラーゲンは、温度が３０～４０℃以上に上昇すれば、ゼラチン化する。そして、コラーゲンがゼラチン化することによって、細胞の接着効果、細胞の増殖効果、細胞の分化効果などが低下する傾向を示し、その結果、骨再生能力が低下する傾向を示す。したがって、上記構成であれば、コラーゲンのゼラチン化を防止することができるので、骨再生効果が高い骨再生用材料を作製することができる。
　上記圧変化処理は、低粘性溶液またはコラーゲン溶液中のリン酸カルシウム基材に対してかけられる圧力が変化すればよく、その具体的な構成は特に限定されない。例えば、上記リン酸カルシウム基材に対してかけられる圧力が５０ｈＰａ～大気圧の範囲内で変化することが好ましい。なお、大気圧は各種条件によって変化し得るが、凡そ１０１３ｈＰａである。上記構成によれば、低粘性溶液およびコラーゲン溶液を、容易に孔内に注入することができる。
　上記圧変化処理および超音波処理は、リン酸カルシウム基材が低粘性溶液中またはコラーゲン溶液中に完全に浸かった状態で行うことが好ましい。上記構成によれば、リン酸カルシウム基材中に、最終的に均一かつ多量にコラーゲン溶液を注入することができる。
　なお、上記超音波処理および圧変化処理の更に具体的な例を以下に示すが、本願発明は、これに限定されない。
　　（１－１．超音波処理と圧変化処理とを交互に行う方法）
　超音波処理と圧変化処理とを交互に行う方法は、例えば、以下の１）～７）に従って行うことができる。なお、当該方法の概略を図１に示す。
　１）まず、５０ｍＬのテルモシリンジ（登録商標）の基部と一体となった押し子を切り取り、１８０度反転させた後に、内部弁としてシリンジ内に挿入する。２０ｍＬのＰＢＳ（＋）と多孔質のリン酸カルシウム基材とをシリンジ内に挿入した後、空気が入らないように、別の押し子をシリンジ内に挿入する。
　上記内部弁、および押し子に多孔質材料が接触しないようにしながら、上記内部弁がシリンジ先端の部分に至るまで、押し子を押す。この状態で、シリンジの先端をパラフィルム（登録商標）にて密閉する。当該処理によって、シリンジをフラスコ内の水に完全に浸しても、シリンジ内に水が流入することを防止することができるとともに、シリンジ内のリン酸カルシウム基材の表面に均等に超音波を照射することができる。
　なお、シリンジ、内部弁、押し子を有するシリンジを「手押し陰圧器」と呼ぶ。当該陰圧器によって、０．２気圧前後の陰圧を安定的にリン酸カルシウム基材に対してかけることができる。
　２）水を満たしたフラスコ内に上記手押し陰圧器を沈めるとともに、当該フラスコを超音波バス内に配置する。なお、上記超音波バス内には氷水を満たし、これによって、熱上昇に伴うコラーゲンのゼラチン化を防止する。なお、上記超音波バスとしては、例えば、超音波洗浄機ＳＵＣ－１１０（株式会社松風製）、またはＷ－１１３ＭＫ２（本多電子株式会社製）を用いることができる。
　３）手押し陰圧器の押し子を、２秒間かけて６０ｍＬを示す目盛りまで引き上げ、シリンジ内部に陰圧をかけ、その後、１秒間かけてシリンジ内部を大気圧に戻す操作を５回行う。そして、その後、超音波バスによって、シリンジ内のリン酸カルシウム基材に対して２４ｋＨｚの周波数を有する超音波と３１ｋＨｚの周波数を有する超音波とを交互に１０分間照射する。なお、手押し陰圧器の押し子を６０ｍＬを示す目盛りにまで引き上げることによって、シリンジ内の圧力を、約０．２気圧に設定することが可能である。
　４）上記３）の処理を６回繰り返す。なお、当該処理によって、超音波処理の合計時間は６０分間となる。
　５）手押し陰圧器のシリンジの先端からパラフィルム（登録商標）を取り除いて、当該シリンジの先端からＰＢＳ（＋）を除去する。その後、シリンジ内に２０ｍＬのコラーゲン溶液（例えば、ｐＨ３．０、０．５重量％～２重量％）を注入する。次いで、空気が入らないように押し子をシリンジ内に挿入するとともに、シリンジの先端をパラフィルム（登録商標）によって密閉する。
　６）上記３）および４）の処理を繰り返す。
　７）手押し陰圧器からリン酸カルシウム基材を取り出す。なお、当該リン酸カルシウム基材の孔内には、コラーゲンが注入されている。
　　（１－２．超音波処理と圧変化処理とを同時に行う方法）
　超音波処理と圧変化処理とを同時に行う方法は、例えば、以下の１）～６）に従って行うことができる。なお、当該方法の概略を図２に示す。
　１）ナス型フラスコまたは平底フラスコ（例えば、旭テクノガラス株式会社製）内に防護ネット等によって保護したリン酸カルシウム基材、および２０ｍＬのＰＢＳ（＋）を入れる。なお、上記防護ネットは、超音波処理の最中にリン酸カルシウム基材とフラスコとが接触してリン酸カルシウム基材が破損することを防止するためのものであって、その具体的な構成は特に限定されない。例えば、上記防護ネットとしては、例えばポリエチレン製またはポリプロピレン製などのサンプルパック（例えば、栄研器材製）を用いることができるが、これに限定されない。
　２）上記ナス型フラスコを三方活栓に接続するとともに、ゴムチューブを経由して、真空ポンプと接続する。なお。コラーゲンが酸（例えば、塩酸）に溶解されている場合には、真空ポンプとナス型フラスコとの間に、水酸化ナトリウムを含有するフィルターを設けることが好ましい。
　３）超音波バス（超音波洗浄機）を氷水で満たし、上記ナス型フラスコを超音波バス内に配置して超音波処理を行う。なお、超音波バスとしては、超音波洗浄機Ｗ－１１３（本多電子株式会社製）を用いることが可能である。超音波処理に用いる超音波の周波数は１００ｋＨｚとし、処理時間を３０分間とする。また、真空ポンプの設定は５０ｈＰａにて持続的に陰圧を発生させる設定とし、ナス型フラスコ内における圧変化は、三方活栓を用いて行う。なお、１分間の陰圧と１分間の大気圧との間で、交互に圧変化を行うことが好ましい。また、真空ポンプの制御には、真空制御ユニットＮＶＣ－２０００（東京理化器械株式会社製）を使用することが可能である。以上のようにして、超音波処理と圧変化処理とを同時に行う。
　４）次いで、２０ｍＬのコラーゲン溶液が入ったフラスコ内に、１）～３）の処理を施したリン酸カルシウム基材を入れる。
　５）超音波バス（超音波洗浄機）を氷水で満たし、上記４）のナス型フラスコを超音波バス内に配置して超音波処理を行う。このとき、２８ｋＨｚにて１秒間の超音波処理、４５ｋＨｚにて２秒間の超音波処理、および、１００ｋＨｚにて２秒間の超音波処理からなる超音波処理サイクルを、合計３６０サイクル（合計３０分間）行う。また、真空ポンプの設定は５０ｈＰａにて持続的に陰圧を発生させる設定とし、ナス型フラスコ内の圧変化は、三方活栓を用いて行う。なお、１分間の陰圧と１分間の大気圧との間で、交互に圧変化を行うことが好ましい。また、真空ポンプの制御には、真空制御ユニットＮＶＣ－２０００（東京理化器械株式会社製）を使用することが可能である。以上のようにして、超音波処理と圧変化処理とを同時に行う。
　６）ナス型フラスコからリン酸カルシウム基材を取り出す。なお、当該リン酸カルシウム基材の孔内には、コラーゲンが注入されている。
　超音波処理と圧変化処理とは、以上のように構成することも可能である。
　本実施の形態の骨再生用材料の製造方法は、上記第２浸潤工程の後に、コラーゲン溶液が注入された骨再生用材料を凍結乾燥させる工程を含むことが好ましい。なお、凍結乾燥させる具体的な方法は特に限定されず、適宜、公知の方法を用いることが可能である。また、凍結乾燥させる時間は、長いほど好ましい。上記構成によれば、骨再生用材料に含まれる不要な水を除去することができる。
　また、本実施の形態の骨再生用材料の製造方法は、上記第２浸潤工程の後（より好ましくは、上記凍結乾燥処理後）に、コラーゲンが注入されたリン酸カルシウム基材に対して熱脱水架橋処理を行うことが好ましい。上記熱脱水架橋処理の具体的な条件は特に限定されないが、例えば、角型真空定温乾燥器（ヤマト科学株式会社製のＤＰ－３１）にて１４０℃の温度にて２４時間、コラーゲンが注入されたリン酸カルシウム基材を加熱することが好ましい。上記構成によれば、リン酸カルシウム基材の孔内に注入されたコラーゲンが熱脱水架橋される。そして、その結果、孔内に、より安定的に長期間コラーゲンが保持されるとともに、より効果的に骨を再生することができる骨再生用材料を作製することができる。
　また、本実施の形態の骨再生用材料の製造方法は、上記第２浸潤工程の後（より好ましくは、上記コラーゲンの熱脱水架橋後）に、骨再生用材料を滅菌することが好ましい。なお、滅菌方法としては特に限定されないが、例えば、エチレンオキサイドガスを用いて滅菌することが好ましい。上記構成によれば、コラーゲンを変性させることなく骨再生用材料を滅菌することができる。そして、その結果、より効果的に骨を再生することができる骨再生用材料を作製することができる。
　〔２．骨再生用材料〕
　本実施の形態の骨再生用材料は、本願発明の骨再生用材料の製造方法によって作製することができる。以下に、骨再生用材料の構成について説明する。
　本実施の形態の骨再生用材料は、多孔質であるリン酸カルシウム基材と、コラーゲンとを含んでいる。そして、上記コラーゲンは、リン酸カルシウム基材に形成されている孔の内部に注入されている。以下に、各構成に関して説明する。
　上記リン酸カルシウム基材は、生体内において足場材料（例えば、骨芽細胞が分化・成育する場合の足場）として機能するものである。
　上記リン酸カルシウム基材は多孔質である。換言すれば、上記リン酸カルシウム基材の内部には、当該リン酸カルシウム基材の表面へと通じる細孔が備えられている。
　上記孔の孔径（孔の横断面の直径）は特に限定されないが、小さいほど好ましい。例えば、孔の孔径は、５０μｍ～４００μｍであることが好ましく、１００μｍ～４００μｍであることが更に好ましい。上記構成によれば、孔径が小さいのでコラーゲンを孔内に長期間保持することができるとともに、孔内に骨の再生に関与する細胞等（例えば、骨芽細胞など）が容易に入り込むことができる。そして、上記細胞はコラーゲンに富んだ足場材料上で安定的に増殖・分化することができるので、その結果、効果的に骨を再生することができる。なお、上述したような多孔質のリン酸カルシウム基材としては市販のものを用いることが可能である。例えば、オリンパステルモバイオマテリアル株式会社製のオスフェリオン（登録商標）、またはオスフェリオン６０（登録商標）を用いることが可能であるし、ペンタックス株式会社製のアパセラム（登録商標）、またはアパセラム－ＡＸ（登録商標）などを用いることが可能であるが、これに限定されない。
　上述したように、リン酸カルシウム基材は、その内部に孔を有している。リン酸カルシウム基材の全体積に対する孔の体積の割合（気孔率）は、特に限定されないが、例えば、５０％以上であることが好ましく、７５％以上であることが更に好ましい。気孔率の上限値は特に限定されないが、例えば、９０％であることが好ましく、９５％であることが更に好ましく、９８％であることが最も好ましい。上記構成によれば、孔の内部に多量のコラーゲンを注入することができるとともに、リン酸カルシウム基材の強度を高く維持することができる。そして、その結果、効果的に骨を再生することができる。
　上記リン酸カルシウム基材の具体的な材質としては特に限定されないが、例えば、β－ＴＣＰ（β－tricalcium phosphate）、ハイドロキシアパタイト、α－ＴＣＰ（（α－tricalcium phosphate））、またはこれらの混合物であることが好ましい。これらの材質は生体親和性が高いので、生体に対して無害である。更に言えば、α－ＴＣＰおよびβ－ＴＣＰは骨置換型生体吸収性材料であって、生体内で分解されながら、自身が骨の材料となり得るという利点を有している。つまり、α－ＴＣＰおよびβ－ＴＣＰであれば、これらの物質が生体内に残留することなく、効果的に骨を再生することができる。また、ハイドロキシアパタイトは、自身が骨の材料となることはなく生体内に残留するが、α－ＴＣＰおよびβ－ＴＣＰと比較して強度が高いので、生体内という過酷な環境下においても、その形状を安定に維持することができるという利点を有している。また、α－ＴＣＰ、β－ＴＣＰおよびハイドロキシアパタイトの何れもが、骨再生を誘導する活性を有している。以上のように、上記３種類の材質はそれぞれ好ましい材質であるといえるが、これらの中では、β－ＴＣＰが最も効果的に骨を再生することができる。
　上記リン酸カルシウム基材の形状としては特に限定されないが、例えば、非粒子状・非粉末状であることが好ましい。なお、本明細書中において粒子状・粉末状とは、粒子径が１００μｍ以下のものを意図する。更に具体的には、上記リン酸カルシウム基材は、少なくとも１辺が５ｍｍ以上の立体形状を有していることが好ましく、少なくとも１辺が１ｃｍ以上の立体形状を有していることが更に好ましい。更に具体的には、上記立体形状としては、例えば、立方体、直方体、円柱、基板状、球状、または楕円球状であることが好ましい。なお、立体形状が円柱である場合には、「１辺」とは、円柱の高さを意図する。また、立体形状が球状である場合には、「１辺」とは、球の直径を意図する。また、立体形状が楕円球状である場合には、「１辺」とは、短軸を意図する。本願発明の骨再生用材料の製造方法であれば、このような形状を有するリン酸カルシウム基材であっても、基材深部の孔内にまでコラーゲンを注入することができる。また、上記形状であれば、生体内でリン酸カルシウム基材が流失することを防ぐことができる。それ故、上記構成であれば、より効果的に骨を再生することができる。
　従来の技術では、リン酸カルシウム基材の深部に存在する孔の内部にまでコラーゲンを注入することができなかった。一方、本願発明の骨再生用材料の製造方法を用いれば、リン酸カルシウム基材の深部に存在する孔の内部にまでコラーゲンを注入することが可能である。したがって、本実施の形態の骨再生用材料では、リン酸カルシウム基材の表面から少なくとも０．２５ｃｍの深さに存在する孔の内部にまでコラーゲンが注入されていることが好ましく、０．５ｃｍの深さに存在する孔の内部にまでコラーゲンが注入されていることが更に好ましく、１ｃｍの深さに存在する孔の内部にまでコラーゲンが注入されていることが最も好ましい。上記構成によれば、より効果的に骨を再生することができる。
　上記リン酸カルシウム基材の孔の内部には、コラーゲンが注入されている。上記コラーゲンとしては特に限定されず、公知のあらゆる型のコラーゲンを用いることが可能である。また、上記コラーゲンの由来としては特に限定されないが、例えば、ヒト、ブタ、またはウシ由来のアテロコラーゲンを用いることが好ましい。例えば、上記コラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、または、Ｉ型コラーゲンとIII型コラーゲンの混合物であることが好ましい。なお、上記アテロコラーゲンとしては適宜市販のアテロコラーゲンを用いることが可能である。例えば、日本ハム社製のＮＭＰコラーゲンＰＳＮ（ブタ由来のアテロコラーゲン）を用いることが可能であるが、これに限定されない。
　なお、上記コラーゲンは、適宜公知の方法によって入手することが可能であり、その具体的な入手方法は特に限定されない。例えば、天然素材（例えば、ブタの皮膚）から公知の方法に基づいて精製することが可能である。または、公知の方法に基づいて所望のコラーゲンの発現ベクターを作製した後、当該発現ベクターを適切な宿主（例えば、酵母、動物細胞、昆虫細胞など）に導入することによって、所望のコラーゲンを作製することも可能である。
　本実施の形態の骨再生用材料では、コラーゲンが、リン酸カルシウム基材に設けられている孔の内部深くにまで注入されている。換言すれば、本実施の形態の骨再生用材料では、コラーゲンが、リン酸カルシウム基材の中心部に向かって深く注入されている。そして、その結果、本願発明の骨再生用材料では、骨再生用材料に対する孔内のコラーゲンの重量比が、１重量％以上である。なお、当該重量比は１重量％以上であればよいが、１．４重量％以上であることが更に好ましく、１．６重量％以上であることが更に好ましく、１．８重量％以上であることが最も好ましい。また、上記重量比の上限は特に限定されず、用いるリン酸カルシウム基材の気孔率に基づいて規定され得る。つまり、本実施の形態の骨再生用材料における重量比の上限は、孔内がコラーゲンによって１００％満たされたときの重量比となる。本実施の形態の骨再生用材料のように高い重量比は、従来の骨再生用材料では実現することができない値であるとともに、このように高い重量比を有するが故に、本願発明の骨再生用材料は、効果的に骨を再生することが可能となる。
　なお、本願発明の骨再生用材料を作製する工程では、リン酸カルシウム基材の表面（孔内ではない部分）にもコラーゲンが付着する。そして、上記重量比を算出する場合には、このような単に表面に付着したのみのコラーゲンを除外する必要がある。そこで、以下に、上記重量比の算出方法について説明する。なお、以下に説明する重量比の算出方法は単なる一例であって、当該方法に限定されない。
　上記重量比は、以下の１）～５）の工程に従って算出することができる。なお、骨再生用材料自体を作製する工程に関しては、既に説明したので、ここではその説明を省略する。
　　１）作製された時点の骨再生用材料は、表面全体にコラーゲンが付着している。そこで、まず、骨再生用材料の表面を薄く削り取る。なお、削り取る表面の厚さは特に限定されないが、できるだけ薄いことが好ましい。また、表面を削り取る方法としても特に限定されず、適宜公知の研磨手段を用いることが可能である。
　　２）表面を削り取った骨再生用材料の重量を測定する。例えば、この時の測定値をＸ（ｇ）とする。
　　３）重量を測定した後の骨再生用材料を加熱処理する。当該処理によって、孔内に注入されたコラーゲンが、焼却・除去される。なお、当該加熱処理の具体的な条件は特に限定されないが、加熱温度は、８００℃であることが好ましく、加熱時間は、１０時間であることが好ましい。なお、上記加熱処理に用いる具体的な加熱装置は特に限定されず、適宜公知の装置を用いることができる。
　　４）加熱処理後の骨再生用材料の重量を測定する。例えば、この時の測定値をＹ（ｇ）とする。
　　５）コラーゲンの骨再生用材料に対する重量比Ｚ（％）は、以下の計算式によって算出される。
　　　　Ｚ＝〔（Ｘ－Ｙ）／Ｘ〕×１００
　以上、重量比の算出方法の一例を説明したが、算出方法はこれに限定されない。
　なお、作製された時点の骨再生用材料は多くの水分を含んでいる場合がある。この場合には、正確な重量比を算出することができない。そこで、この場合には、上記１）の工程に先立って、骨再生用組成物から余分な水分を除去することが好ましい。なお、水分を除去するための方法としては特に限定されないが、例えば、凍結乾燥によって水分を除去することができる。そして、このことからも明らかなように、本明細書における「重量比」とは、「乾燥重量比」と交換可能に用いられている。
　〔実施例〕
　〔１．骨再生用材料の作製〕
　以下の実験では、多孔質のリン酸カルシウム基材として、多孔質のβ－ＴＣＰ基材を用いた。なお、当該β－ＴＣＰ基材としては、オリンパスバイオマテリアル株式会社より提供を受けたオスフェリオン（登録商標）を用いた。なお、当該β－ＴＣＰ基材の形状は１辺の長さが１ｃｍの立方体であり、当該β－ＴＣＰ基材に形成されている孔の径は１００μｍ～４００μｍであり、β－ＴＣＰ基材における気孔率は７５％であった。また、当該β－ＴＣＰ基材の圧縮強度は凡そ０．９ＭＰａ～３．０ＭＰａであるとともに、当該β－ＴＣＰは、ｐＨ４～１１にて安定であるものを用いた。
　まず、フラスコに、β－ＴＣＰ基材およびＰＢＳ（＋）（Phosphate buffered saline（＋））を入れた。なお、β－ＴＣＰ基材は、超音波処理時にフラスコと接触して変形（例えば、欠損）することを防ぐために、防護ネットに入れた。
　上記フラスコ内のβ－ＴＣＰ基材に対して、１００ｋＨｚの超音波を３０分間かけた。なお、圧変化は１分毎に行った。圧変化としては、β－ＴＣＰ基材に対して、５０ｈＰａと大気圧との間で変化する圧変化を加えた。また、超音波処理時の温度変化を防止するために、フラスコを氷冷して、β－ＴＣＰの温度を２５℃以下に維持した。
　次いで、防護ネットに入ったβ－ＴＣＰ基材を、フラスコ内の０．５重量％、１重量％、２重量％、または３重量％のコラーゲン溶液中に浸した。なお、各コラーゲン溶液の作製方法を、以下に簡単に説明する。コラーゲンとしてはブタ由来のアテロコラーゲン（日本ハム社製のＮＭＰコラーゲンＰＳＮ）を用いた。所望の重量％のコラーゲン溶液となるように、上記アテロコラーゲンを少量の蒸留水（ｍｉｌｌｉＱ水）に加えた。次いで、０．１Ｎ塩酸を加えて、コラーゲン溶液のｐＨを３．０に調節した。最後に、当該コラーゲン溶液に蒸留水を加えて体積を調節し、これによって、各コラーゲン溶液を所望のコラーゲン濃度に調節した。
　上記フラスコ内のβ－ＴＣＰ基材に対して、超音波処理を行った。なお、このとき、２８ｋＨｚにて１秒間の超音波処理、４５ｋＨｚにて２秒間の超音波処理、および、１００ｋＨｚにて２秒間の超音波処理からなる超音波処理サイクルを、合計３６０サイクル（合計３０分間）行った。また、この間、β－ＴＣＰ基材に対して、５０ｈＰａと大気圧との間で変化する圧変化を加えた。なお、圧変化は１分毎に行った。また、超音波処理時の温度変化を防止するために、フラスコを氷冷して、β－ＴＣＰの温度を２５℃以下（約７～８℃）に維持した。なお、２５℃以下の温度に維持することによって、コラーゲンのゼラチン化を防止することができる。
　次いで、β－ＴＣＰ基材をコラーゲン溶液から取り出し、当該β－ＴＣＰ基材をドライアイスまたは（ディープ）フリーザーで冷凍した後、凍結乾燥させた。
　凍結乾燥後、β－ＴＣＰ基材を真空下条件下で１４０℃にて２４時間加熱し、コラーゲンの熱脱水架橋を行った。
　最後に、エチレンオキサイドガスを用いて上記β－ＴＣＰ基材を滅菌し、当該β－ＴＣＰ基材を、骨再生用材料として後述する各種実験に用いた。
　〔２．骨再生用材料の物性検討－１〕
　上述したβ－ＴＣＰ基材の孔の内部にコラーゲンが注入されているか否かを、走査顕微鏡にて観察した。以下に、その方法と結果とを説明する。
　上述したように作製した１辺が１ｃｍの立方体の形状をした骨再生用材料を、図３（ａ）に示すように半分に切断した。そして、まず断面の中央部分（表面からの距離が約０．５ｃｍ）を走査顕微鏡にて観察した。
　観察結果を、図３（ｂ）および図３（ｃ）に示す。なお図３（ｂ）は、コラーゲン溶液に浸していないβ－ＴＣＰ基材の結果を示し、図３（ｃ）は、１重量％のコラーゲン溶液を用いて作製した骨再生用材料の結果を示している。
　図３（ｃ）からも明らかなように、上記骨再生用材料の内部にまで深くコラーゲンが注入されていることが明らかになった。換言すれば、上記骨再生用材料の表面から少なくとも０．５ｃｍの深さに存在する孔の中にまで、コラーゲンが注入されていることが明らかになった。
　なお、０．５重量％のコラーゲン溶液、または２重量％のコラーゲン溶液を用いて作製した骨再生用材料に関しても、図３（ｃ）と同様に、骨再生用材料の中央部にまでコラーゲンが注入されていた。一方、３重量％のコラーゲン溶液を用いて作製した骨再生用材料の場合には、コラーゲンが孔の中に侵入していなかった。これは、３重量％のコラーゲン溶液は、粘度が高すぎるためであると考えられる。
　また、圧変化と超音波処理とを同時ではなく交互に行えば、同時に行う場合と比較して多少時間は長くなるものの（例えば、１時間（圧変化）＋１時間（超音波処理）＝２時間）、コラーゲンを孔内に入れ込むことが可能であることも確認できた。
　また、図４（ａ）～図４（ｄ）に、上記骨再生用材料の一表面から反対側の表面に向かって、その断面を連続的に撮影した走査顕微鏡写真を示す。また、図４（ｅ）は、図４（ａ）～図４（ｄ）において重複した視野を重ね合わせて作成した、連続写真である。なお、図４（ａ）～（ｅ）は、図３（ａ）と同様に骨再生用材料を半分に切断したときの断面の走査顕微鏡写真であって、骨再生用材料の中央部を通る領域を観察した走査顕微鏡写真である。図４（ａ）～図４（ｅ）から明らかなように、厚さ１ｃｍのβ－ＴＣＰ基材の内部全体にコラーゲンが注入されていることが明らかになった。なお、図４（ａ）～図４（ｅ）は、１重量％のコラーゲン溶液を用いて作製された骨再生用材料のデータを示しているが、０．５重量％のコラーゲン溶液または２重量％のコラーゲン溶液を用いて作製された骨再生用材料も同様の結果であった。
　〔３．骨再生用材料の物性検討－２〕
　上述した骨再生用材料の孔内に注入されているコラーゲンの量を測定するとともに、骨再生用材料の孔内に注入されているコラーゲンの重量比を算出した。以下に、その方法と結果とを説明する。
　本実施例では、９つのサンプルについて重量比を算出した。つまり、０．５重量％のコラーゲン溶液を用いて作製された３つの骨再生用材料（サンプル名：Ａ－０．５、Ｇ－０．５、Ｊ－０．５）、１重量％のコラーゲン溶液を用いて作製された４つの骨再生用材料（サンプル名：Ｈ－１、Ｋ－１、Ｄ（Ａ）－１、Ｇ（Ａ）－１）、２重量％のコラーゲン溶液を用いて作製された２つの骨再生用材料（サンプル名：Ｌ－２、Ｐ－２）について、重量比を算出した。
　上述したように各骨再生用材料を作製した後、当該骨再生用材料の表面に単に付着したのみのコラーゲン（孔内に注入されていないコラーゲン）を取り除くために、骨再生用材料の表面を薄く削り取った。そして、表面を薄く削り取った後の骨再生用材料の重量を測定した（表１の「除去前」参照）。
　次いで、各骨再生用材料を８００℃にて１０時間加熱し、これによって、孔内に注入されたコラーゲンを焼却・除去した。そして、コラーゲンを焼却・除去した後の骨再生用材料の重量を測定した（表１の「除去後」参照）。なお、焼却・除去する前の骨再生用材料の重量から焼却・除去した後の骨再生用材料の重量を引いた値が、孔内に注入されたコラーゲンの重量である。
　上述した実測値から、骨再生用材料に対する、孔内に注入されたコラーゲンの重量比を算出した。なお当該重量比（重量％）を、表１に示す。
　また、本実施例では、各骨再生用材料の圧縮強度も測定した。なお、当該圧縮強度の測定には、島津製作所製のＡＵＴＯ　ＧＲＡＰＨ　２０００ＧＥを用い、クロスヘッドスピードを０．５ｍｍ／分に設定した。なお、その他の測定方法は、当該測定器に添付のプロトコールにしたがった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１からも明らかなように、本実施の形態の骨再生用材料では、コラーゲンの重量比が１重量％以上であることが明らかになった。
　〔４．骨再生用材料の骨再生効果〕
　本実施例の骨再生用材料の骨再生効果を検証するために、大型動物の頭蓋骨再生実験を行った。なお、大型動物を用いた理由は、１）本実施例の骨再生用材料の素材は、それぞれヒトにも用いられており、その安全性が確立されていること、２）よりヒトに近いモデルを用いて頭蓋骨再生効果を検討することによって、上記材料をヒトに用いた場合の効果をより正確に検証できること、である。
　頭蓋骨にCritical size defect（ＣＳＤ：自然治癒しない大きさの欠損）以上の、大きな欠損を作製し、ａ）β－ＴＣＰ（１辺の長さが１ｃｍの立方体）のみ、ｂ）単にコラーゲンにて表面をコートしたのみの顆粒状β－ＴＣＰと骨粉との混合物、ｃ）本実施例の骨再生用材料（１％コラーゲン溶液を用いて作製したもの）、を同一の実験動物の頭蓋骨に埋め込んだ後、頭蓋骨の再生の違いを検討した。なお、上記ｂ）に示すサンプルは、乾燥重量比が９８：２になるようにβ－ＴＣＰとコラーゲンとを混合した後、当該混合物を凍結乾燥、熱脱水架橋、および滅菌して作製した。
　各サンプルの移植方法は公知の方法に基づいて行った。当該方法を簡潔に説明すれば、骨再生用材料を移植してから３ヶ月後、４ヶ月後に骨再生効果を観察する場合には、大型動物の頭蓋骨に２ｃｍ×２ｃｍのＣＳＤを形成し、当該ＣＳＤ内に上記骨再生用材料（１辺の長さが１ｃｍの立方体）を半分に切断したもの（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）を４つ埋め込んだ。
　一方、骨再生用材料を移植してから６ヶ月後に骨再生効果を観察する場合には、６角形のＣＳＤ（１辺が約２ｃｍ）を形成し、６角形の各頂点上に上記骨再生用材料を埋め込んだ。なお、この時の骨再生用材料は、１辺の長さが１ｃｍの立方体のブロックから所望の形状になるように削りだした骨再生用材料を用いた。なお、当該形状としては特に限定されないが、本実施例では、底面および上面の直径が約１ｃｍの円柱上に、底面および上面の直径が約０．７ｃｍの円柱が連結している多段形状を採用した。なお、本実施例では２段形状の骨再生用材料を用いたが、段の数は特に限定されない。上記骨再生用材料を、直径０．７ｃｍの円柱側からＣＳＤ内に埋め込んだ。上記形状であれば、ＣＳＤ内に埋め込まれた骨再生用材料がＣＳＤから抜けることを防止することができる。
　骨再生効果は、頭蓋骨の再生面積によって評価し、再生面積は、以下のように評価した。まず、各サンプルを移植した部分において本来骨が再生されるべき部分を１００％と規定した。そして、上記部分における新生骨および残存β－ＴＣＰの面積を、顕微鏡を用いて得た画像を画像解析し、上述した本来骨が再生されるべき部分に対するこれらの面積の割合を算出した。また、本来骨が再生されるべき部分における血管の面積も測定し、本来骨が再生されるべき部分に対する血管の面積の割合も算出した。なお、骨再生効果は、骨再生用材料を移植後、３ヶ月後、４ヵ月後、６ヵ月後に検討した。
　まず、図５（ａ）および図５（ｂ）に、骨再生用材料を移植してから６ヵ月後の、顕微鏡を用いた観察結果を示す。更に具体的には、図５（ａ）は、各サンプルを埋め込んだ頭蓋骨の顕微鏡写真であり、図５（ｂ）は、骨が再生された部位とβ－ＴＣＰが残存している部位とを識別した顕微鏡写真である。なお、図５（ｂ）において、白色領域が、骨が再生された領域であり、黒色領域が、β－ＴＣＰが残存している領域である。なお、図５（ｂ）には血管を図示していないが、血管は、顕微鏡写真中の形態に基づいて識別することができる。なお、骨再生用材料を移植してから３ヵ月後、４ヵ月後においても、同様の顕微鏡観察を行い、後述するような数値化データを算出した。
　以上のような顕微鏡観察によって得たデータを数値化した結果を、表２～表４に示す。なお、表２は、骨再生用材料を移植してから３ヶ月後の結果を示しており、表３は、骨再生用材料を移植してから４ヶ月後の結果を示しており、表４は、骨再生用材料を移植してから６ヶ月後の結果を示している。なお、表２～表４では各項目ごとに２つの値を示しており、それぞれ、頭蓋骨の異なる箇所のデータを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、表２および表４の結果をグラフ化したデータを、それぞれ、図６および図７に示す。
　表２～表４、図６、および図７からも明らかなように、移植してから３ヵ月後、４ヵ月後、および６ヵ月後の何れにおいても、本実施例の骨再生用材料を移植した部分の方が、血管新生効果および骨再生効果の両方が高かった。
　骨再生用材料を移植してから４ヶ月後に、ＱＣＴ（Quantitative Computed Tomography）によって、骨再生効果に関して更に詳細に検討した。なお、ＱＣＴとは、ＣＴ装置を用いて骨量（Ｃa量）を測定する方法である。なお、実際の測定には、ＣＴ装置としては、東芝メディカルシステムズ株式会社製のＡｑｕｉｌｉｏｎ　１６を用い、ファントムとしては、株式会社京都科学製のファントムを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５および表６に示す「手術直後のＣａ平均」とは、骨再生用材料の移植時に、骨再生用材料を移植した場所に存在するカルシウムの量（換言すれば、骨再生用材料自体が含有しているカルシウムの量）を示し、「Ｃａ平均」とは、移植４ヵ月後に、骨再生用材料を移植した場所に存在するカルシウムの量を示している。
　α－ＴＣＰおよびβ－ＴＣＰは骨置換型生体吸収性材料であって、生体内で分解・吸収されながら、自身が骨の材料となる。そして、骨を形成する過程において、α－ＴＣＰおよびβ－ＴＣＰが含んでいるカルシウムの一部分は、骨中に取り込まれるが、生体内に拡散などして失われるカルシウムもある。したがって、上述した「Ｃａ平均」とは、骨再生用材料由来のカルシウムと、再生された骨中に新たに取り込まれたカルシウムとを足し合わせた、カルシウムの合計量と考えることが可能である。
　表５に示すように、β－ＴＣＰのみを用いた場合には、「手術直後のＣａ平均」の値と比較して、「Ｃａ平均」の値が減少していた。このことは、生体内に拡散などして失われるカルシウムの量と比較して、再生された骨内に取り込まれたカルシウムの量が少ないことを示しているとともに、骨密度が低いことを示唆している。
　一方、表５および表６に示すように、コラーゲン溶液を用いて作製された骨再生用材料を用いた場合には、「手術直後のＣａ平均」の値と比較して、「Ｃａ平均」の値が増加していた。このことは、生体内に拡散などして失われるカルシウムの量と比較して、再生された骨内に取り込まれたカルシウムの量が多いことを示しているとともに、骨密度が高いことを示唆している。
　本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以上のように本発明では効果的に骨を再生することができるので、骨補填剤として利用することが可能である。また、本発明は、従来再生が困難であった頭蓋骨をも効果的に再生することができるので、特に、頭蓋骨補填剤として利用することが可能である。また、本発明はコラーゲン溶液に限らず、粘性の高い溶液を細孔内に注入する技術として、広く利用することが可能である。

Claims (10)

  1. 　低粘性溶液内に、多孔質のリン酸カルシウム基材を浸す第１浸潤工程と、
    　前記第１浸潤工程の後で、前記低粘性溶液よりも粘性が高いコラーゲン溶液内に、前記リン酸カルシウム基材を浸す第２浸潤工程と、を含み、
    　前記第１浸潤工程および前記第２浸潤工程では、前記リン酸カルシウム基材に対して、超音波処理を施すとともに圧変化処理を施すことを特徴とする骨再生用材料の製造方法。
  2. 　前記リン酸カルシウム基材は、少なくとも１辺の長さが５ｍｍ以上の立体形状を有していることを特徴とする請求項１に記載の骨再生用材料の製造方法。
  3. 　前記コラーゲン溶液は、０．５重量％～２重量％のコラーゲンを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の骨再生用材料の製造方法。
  4. 　前記孔の孔径は、５０μｍ～４００μｍであることを特徴とする請求項１～３の何れか１項に記載の骨再生用材料の製造方法。
  5. 　前記超音波処理は、２８ｋＨｚの周波数を有する超音波、３１ｋＨｚの周波数を有する超音波、４５ｋＨｚの周波数を有する超音波、および１００ｋＨｚの周波数を有する超音波からなる群より選択される少なくとも１つの超音波を、前記リン酸カルシウム基材に対して照射することを特徴とする請求項１～４の何れか１項に記載の骨再生用材料の製造方法。
  6. 　前記圧変化処理では、前記リン酸カルシウム基材に対してかけられる圧力が５０ｈＰａ～大気圧の範囲内で変化することを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載の骨再生用材料の製造方法。
  7. 　多孔質であるリン酸カルシウム基材と、コラーゲンとを含む骨再生用材料であって、
    　前記コラーゲンは、前記孔内に注入されており、
    　前記孔内に注入されているコラーゲンの骨再生用材料に対する重量比が、１重量％以上であることを特徴とする骨再生用材料。
  8. 　前記コラーゲンは、前記リン酸カルシウム基材の表面から、少なくとも０．２５ｃｍの深さにまで注入されていることを特徴とする請求項７に記載の骨再生用材料。
  9. 　前記孔の孔径は、５０μｍ～４００μｍであることを特徴とする請求項７または８に記載の骨再生用材料。
  10. 　再生対象の骨が、頭蓋骨であることを特徴とする請求項７～９の何れか１項に記載の骨再生用材料。
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