WO2010062279A1 - Способ получения рекомбинантного инсулина человека - Google Patents

Способ получения рекомбинантного инсулина человека Download PDF

Info

Publication number
WO2010062279A1
WO2010062279A1 PCT/UA2009/000025 UA2009000025W WO2010062279A1 WO 2010062279 A1 WO2010062279 A1 WO 2010062279A1 UA 2009000025 W UA2009000025 W UA 2009000025W WO 2010062279 A1 WO2010062279 A1 WO 2010062279A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
recombinant
insulin
polypeptide
encodes
plasmid dna
Prior art date
Application number
PCT/UA2009/000025
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Алексей Павлович ЛАЗАРЕВ
Владимир Романович ЛУЦИВ
Игорь Евгениевич КОСТЕЦКИЙ
Игорь Леонидович ЛИСОВСКИЙ
Игорь Павлович Лесик
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Mako"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Mako" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Mako"
Priority to CN2009801545154A priority Critical patent/CN102282260A/zh
Priority to EA201100781A priority patent/EA201100781A1/ru
Priority to EP09829420A priority patent/EP2374888A4/en
Priority to BRPI0920482-2A priority patent/BRPI0920482A2/pt
Priority to CA2746984A priority patent/CA2746984A1/en
Publication of WO2010062279A1 publication Critical patent/WO2010062279A1/ru
Priority to US13/116,822 priority patent/US20120058513A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the recombinant plasmid DNA site that encodes a hybrid polypeptide with the amino acid sequence of human proinsulin is part of plasmid pMUT12 and has the following structure:
  • the com site a polypeptide with the amino acid sequence of human proinsulin, is part of the plasmid pDIM07 and has the following structure:
  • the method is carried out as described below.
  • expression vectors may contain a promoter region, a translation start signal, human proinsulin cDNA with or without modifications introduced into the C-peptide sequence, and an optimized prepeptide separated from proinsulin by the trypsin recognition site.
  • Optimum for the present invention is recombinant plasmid DNA, which contains the integrated DNA as described above. Selected plasmids of the invention include pY-proins, pMUT12, pISYN2, and derivatives thereof.
  • the invention also describes a process for producing a recombinant DNA molecule. This process involves cloning the corresponding vector of the DNA insert, which encodes the full-sized form of proinsulin, as well as analogues, homologs and precursors of the polypeptide, which are converted to insulin.
  • the DNA sequence is cloned in the correct position and in the desired reading frame with the expression control sequence.
  • the bacterial cells are destroyed by lysis - in order to release inclusion bodies that contain the insulin precursor polypeptide.
  • bacterial cells are resuspended in a buffer solution at a pH of 6.0 to 9.0 and an ionic strength in the range of 0.0 IM to 2M. Any suitable salt, including NaCl, may be used. to maintain an appropriate level of ionic strength.
  • cell lysis is carried out under conditions in which cell fragments are sufficiently destroyed and do not accumulate in the sediment during low-speed centrifugation.
  • Cell lysis is carried out using commonly used methods, such as mechanical methods (in particular, cyclic freezing / thawing; use of a Microfludizer or Frepsh press; or an ultrasonic generator) or enzymatic methods (such as lysozyme treatment). In general, it is recommended that cells be lysed at a reduced temperature (i.e., less than 20 degrees C).
  • Inclusion bodies are separated from cell fragments using any convenient method (for example, centrifugation), then washed if necessary. Inclusion bodies are usually washed by resuspending them in a buffer with the addition of detergent (for example, Triton X-100), then the inclusion bodies are again collected. The washed inclusion bodies are then dissolved in a solubilization buffer that contains a high concentration of a chaotropic agent (for example, urea or guanidine hydrochloride) and a reducing reagent at an optimal pH value.
  • a chaotropic agent for example, urea or guanidine hydrochloride
  • the urea concentration in the solubilization buffer is between 6M and 8M, mainly 7M, and the concentration of guanidine hydrochloride is from 5 to 7M, preferably 6M.
  • the pH of the solubilization buffer varies from 7.5 to 11.0, mainly from 8.5 to 9.0. Any pH buffering agent (such as Tris, HEPES, MOPS, trisipe, etc.) can be used.
  • the pH buffering agent is added to the solubilization buffer at a concentration that provides an effective buffer capacity, for example, from 10 to about 100 mM, preferably 20 mM.
  • Reducing reagents are an integral part of the solubilization buffer - to restore disulfide bonds and to maintain cysteine residues in reduced form.
  • reducing agents are used: beta-mercaptoethanol, dithiothreitol, etc.
  • the optimal concentration of beta-mercaptoethanol is between 20 and 20OMM, mainly between 100 and 150mM.
  • Dissolution of inclusion bodies is generally carried out over a period of six hours to about 24 hours, preferably within 8 hours. Dissolution can be carried out at room temperature or lowered temperature, usually from 4 degrees to 24 degrees C, mainly at 20 degrees C. After the dissolution of inclusion bodies is completed, the solution of the recovered polypeptide is clarified to remove the insoluble residue. Clarification can be accomplished using high speed centrifugation.
  • the reconstituted proinsulin precursor is then diluted with refolding buffer. Dilution is carried out by adding a solution of inclusion bodies to the buffer for refolding or by simultaneously supplying a buffer and solution of inclusion bodies to the tank for refolding.
  • the inclusion Taurus solution can be diluted from about 10 to 200-fold, preferably 100-fold by refolding buffer.
  • the final concentration of the polypeptide after dissolution can be from about 0.01 mg / ml to 5 mr / ml, preferably 1 mg / ml.
  • the refolding buffer typically contains a pH buffering agent, a redox couple, a cationic chelator, free radical breakdown preservatives for the polypeptide and some other low molecular weight additives.
  • the refolding process is carried out at a temperature of approximately 4 to 24 degrees C, mainly at 10 degrees C.
  • the incubation time is generally from about 2 to 20 hours, preferably about 6 hours.
  • the main components of the refolding buffer include glycine in a concentration of from about 0.5 mM to 20 mM; EDTA from about 0.1 mM to 5 mM; glycerin - from about 1% to 20%.
  • a correctly laid insulin precursor can be concentrated, then purified, and the polypeptide can be treated with proteolytic enzymes, for example, trypsin and carboxypeptidase B, to produce the finished insulin.
  • Concentration of the refolded polypeptide can be carried out using any convenient technique, such as ultrafiltration or chromatography (e.g., ion exchange, hydrophobic or affinity chromatography) and the like.
  • the concentration process if desired, may also include a buffer replacement process.
  • the concentration is carried out at a reduced temperature (for example, about 4-10 degrees C).
  • Proteolytic cleavage of the insulin precursor is carried out either by simultaneous treatment with trypsin and carboxypeptidase B or by separate treatment with these two enzymes. Trypsin is used in a concentration of from about 1: 200 to 1: 20,000 (enzyme hubbrate, weight ratio), while carboxypeptidase B is used in a concentration of from about 1: 100 to 1: 5000.
  • Proteolytic cleavage is carried out in a buffer with a pH of approximately 7.5 to 11.0, preferably pH 10.5; the addition of Ca 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Mg ions can improve the reaction efficiency.
  • the incubation temperature ranges from 0 degrees C to about 30 degrees C, mainly about 6 degrees C, the incubation time from 1 to 24 hours, mostly about 14 hours.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Primer Pl coincides with the sequence of the B-chain of the human insulin gene, starting with Arg 22 of human preproinsulin, and contains the recognition site of the Ndel endonuclease (highlighted by a frame) necessary for cloning.
  • the reverse primer (P2) is complementary to the amino terminal fragment of the insulin A chain and contains an EcoRI region (outlined) for cloning purposes. PCR reaction was carried out in a solution that contained 25 pmol of each of these primers,
  • PCR fragment about 280 bp long was isolated from an agarose gel and cloned into a pTA cloning vector.
  • the ligase mixture was introduced into the Escherichia coli strain DH5alpha, transformants were selected on plates with LB agar medium containing ampicillin. Several individual colonies were grown in LB medium overnight, plasmid DNA was isolated with using the Wizard minipreps DNA kit isolatiop kit. Clone IK8 was selected for subsequent work because it had the correct DNA sequence.
  • plasmid DNA isolated from clone IK8 was digested with restriction endonucleases Ndel and EcoRI; DNA fragment about 270 bp long was isolated from an agarose gel and cloned into the plasmid pET28a, which was digested with the same enzymes and treated with alkaline phosphatase from the calf’s stomach.
  • the Escherichia coli DH5alpha strain was transformed with a ligase mixture and transformants were selected on LBA kanamycin plates. Plasmid DNA was isolated from some transformants and analyzed by restriction with Ndel and EcoRI. The correct clone has been identified and named pIK8-proins. This plasmid was subsequently introduced into Escherichia coli, for example, strain JMl 09 or BL21.
  • Plasmid DNA pIK8-proins was used as a template for targeted mutagenesis using PCR and the following primers:
  • PCR reaction conditions were as follows: 94 degrees C, 3 sec; 59 degrees C, ZOsek; 72 degrees C, 6 minutes and final synthesis at 72 degrees C in for 10 minutes.
  • the product of the NDP reaction was purified by a Zumosleap kit and treated with 10 U restriction enzyme Dpl to remove the original matrix. After another purification cycle on a 2 ⁇ l column, an aliquot was introduced into Escherichia coli strain DH5alpha and transformants were selected on LB plates that contain kanamycin.
  • plasmid DNA was isolated using a set of Wizard mipers. Clone MUTl 2 was selected for subsequent work because it had the correct DNA sequence. For expression in Escherichia coli, this plasmid was subsequently introduced into Escherichia coli, for example, strain JMl 09 or BL21.
  • oligonucleotide seeds based on the published amino acid sequence of human insulin [10].
  • codons of nutleotid seeds corresponded to the presence of Escherichi coli genes with a high level of expression [11] and the level of tRNA in Escherichi coli [12]. These seeds also contained sites of recognition of endonucleases in various positions - for the purpose of cloning.
  • the mixture of primers Sl, S2, S3, S4 (final concentration of 2 ⁇ m each) in a PCR buffer solution containing 5U r ⁇ th polymerase DNA was heated to 94 degrees C for 1 minute, cooled to 62 degrees C and reacted at 72 degrees C for 2 minutes to fill the gaps.
  • the following 20 cycles of amplification were performed under the following conditions: 94 degrees C, 15 sec; 62 degrees C, 30 sec; 72 degrees C, 30 sec. 2 ⁇ l of the above mixture was used as a template for amplification of human proinsulin cDNA using Sl and S5 primers.
  • PCR fragment of approximately 180 bp in length was gel purified and cloned into a pTA-cloning vector. Clone IS2 was selected for subsequent work because it had the correct DNA sequence.
  • plasmid DNA isolated from clone IS2 was digested with restriction endonucleases Ndel and EcoRI; DNA fragment with a length of about 170 bp was isolated from an agarose gel and cloned into the plasmid pET28a, which was digested with the same enzymes and treated with alkaline phosphatase from the calf’s stomach.
  • the Escherichia coli DH5alpha strain was transformed with a ligase mixture and transformants were selected on LB kanamycin plates. Plasmid DNA was isolated from some transformants and analyzed by restriction with Ndel and EcoRI. The correct clones were identified and named pISYN2. This plasmid was subsequently introduced into Escherichia coli, for example, strain JM109 or BL21.
  • the plasmid DNA pMUT12 was used as a template for amplification of human pro-insulin cDImi-mi with a modified prepeptide. PCR reaction was carried out under the conditions described in example 1 using the following primers:
  • PCR product with a length of approximately 210 bp was isolated from agarose gel and cloned into a pTA vector.
  • the ligase mixture was transformed into an Escherichia coli strain DHZalpha and transformants were selected on LB plates that contain ampicillin. Clone CEM6 was selected as such that has the correct DNA sequence.
  • plasmid DNA isolated from clone CIM6 was treated with restriction endonucleases Ndel and HipdSh.
  • a DNA fragment of approximately 200 bp in length was isolated from the gel and cloned into the plasmid pET39a treated with the same enzymes.
  • the ligase mixture was transformed into Escherichia coli DH5alpha and transformants were selected on LB plates with kanamycin.
  • Plasmid DNA was isolated from several transformants and analyzed by cleavage of Ndel and Hipd ⁇ II. The correct clone has been identified and named pGMBL. This plasmid was transformed into Escherichia coli, for example, strain JMl 09 or BL21.
  • the plasmid DNA pMUT12 was used as a template for amplification of human proinsulin cDNAmshi with a modified prepeptide. PCR reaction was carried out under the conditions described in example 1 using the following primers: Primer D (direct):
  • plasmid DNA isolated from the DIMl clone was treated with restriction endonucleases Ncl and SchipdP.
  • a DNA fragment of approximately 200 bp in length was isolated from the gel and cloned into the plasmid pET28a treated with the same enzymes.
  • the ligase mixture was transformed into Escherichia coli DH5alpha and transformants were selected on LB plates with kanamycin.
  • Plasmid DNA was isolated from several transformants and analyzed by cleavage of Ncol and Hipd III. The correct clone has been identified and named pDIM07. This plasmid was transformed into Escherichia coli, for example, strain JMl 09 or BL21.
  • the bacterial culture was centrifuged at 4000 rpm for 15 min in order to obtain a pellet of E. coli cells.
  • Cells were lysed by heating to 95 degrees C for 5 min in the buffer for applying samples, lysates were analyzed by PAGE electrophoresis under denaturing conditions according to standard methods [13].
  • a flask with sterile LB medium supplemented with 30 ⁇ g / ml kanamycin or 50 ⁇ g / ml ampicillin was seeded with a culture bank and incubated for 15 hours on a shaker at 37 degrees C and approximately 250 rpm. If necessary, the following stages of cultivation were carried out in aerated fermenters with stirring.
  • the sterile medium in the fermenter was seeded with a bacterial culture from the flask (inoculum volume was 5-10% of the fermenter volume), incubation was carried out for 5-8 hours at 37 degrees C, pH 6.9 ⁇ 0.5 with stirring and aeration to maintain the level of dissolved oxygen above 20% saturation.
  • the production medium was seeded with a sowing crop (1-10% of the volume of the working fermenter) and incubated at 37 degrees C. Stirring-aeration was set at a level sufficient to maintain the level of dissolved oxygen above 20% saturation. The pH was maintained at 6.9 ⁇ 0.5 with NH 4 OH. Propinol B400 was used as an antifoam.
  • a sterile solution of 50% glucose was used as a carbon source. Once cell concentration reached OD ⁇ oo 30, inductor sterile solution, e.g. IPTG (final concentration 1 mM) was infused and the culturing was continued for 6 hours, cell concentration reached at approximately 50 OD b oo- The culture medium is then cooled and the cells harvested by centrifugation.
  • inductor sterile solution e.g. IPTG (final concentration 1 mM) was infused and the culturing was continued for 6 hours, cell concentration reached at approximately 50 OD b oo- The culture medium is then cooled and the cells harvested by centrifugation.
  • the bacterial mass was resuspended (in the ratio of the buffer solution 1:10) in a cold buffer solution, which contains 20 mm Tris, pH 7.5; IMM EDTA AND 100 mM NaCl.
  • a cell suspension was passed through a cell disruptor at 17,000 psi and inclusion bodies were collected by centrifugation.
  • the precipitate which contains inclusion bodies and bacterial fragments, was washed with a 20-fold volume of cold (+ 10 degrees C) buffer for washing, which contains 1.0% Tritop X100, 20 mm Tris-Hcl, pH 8.0; 2 mM EDTA, 100 mM NaCl.
  • the precipitate was collected by centrifugation at approximately 14,000 rpm. The washing step was repeated twice.
  • aqueous suspension of inclusion bodies with a volume of 60 l with a total protein content of 12 kg was treated with lysozyme (0.1 mg / ml), RNase (0.5 unit / ml) and DNase (0.5 unit / ml) for 3 hours at 25 ° C in a buffer that contains 20 mm Tris-Hcl, pH 7.5; 10 mM MgSO 4 . After treatment, the nucleic acid content was determined, which was 198 mr / l (656 mg / l - before treatment).
  • Inclusion bodies were washed from excess enzymes by centrifugation and dissolved in 100 L of a buffer solution that contains 8M urea, 20 mM glycine, pH 8.5; IMM EDTA, 150 mM ⁇ -mercaptoethanol. Incubation continued for 4 hours at room temperature. The solution was clarified by high speed centrifugation and the reconstituted insulin precursor was used for refolding.
  • Concentration of the refolded polypeptide is usually carried out by ultrafiltration or using absorption chromatography. Chromatographic column 450x500 mm. 30 l of polymer sorbent ⁇ mb Canalriquehr Albanym CG-300M was filled. The refolded reaction mixture was fed to the column at a flow rate of 4 L / min, and the column was washed with three volumes of equilibration buffer. The polypeptide was eluted with 20-40% 2-propanol solution. Then, the eluent was analyzed by high performance liquid chromatography, which showed the purity of the resulting preparation is more than 45%, and the yield is at least 96%.
  • the refolding tank was filled with buffer (10 mM glycine, IMM EDTA, 2 mM cystine, lg / l PEG1500, pH 11.2) and cooled to 1O 0 C. 50 l of the recovered hybrid protein was mixed with 5000 l of refolding buffer, the protein concentration in the tank for refolding is 0.5 g / l.
  • the insulin precursor in a solution of 50 mM Tris-Hcl, pH 8.0 was digested to human insulin by incubation with trypsin (1: 8000; weight ratio) and carboxypeptidase B (1: 2000; weight ratio) in the presence of l, 5mM Zn 2+ .
  • the reaction was carried out for 16 hours. at 8 degrees C and stopped by adjusting the pH to 2.5 with 6M HCl. High performance liquid chromatographic analysis showed that the purity of the resulting preparation was 69% or more. Insulin can be precipitated from the reaction mixture with ammonium sulfate or sodium chloride (final concentration of 20%).
  • insulin crystals were dissolved at pH 3.0 in a solution that contained 0.05 M sodium acetate and 10% 2-propanol and was filtered through a 0.2 ⁇ m filter.
  • the resulting solution at a rate of 0.8 l / min was applied to a 200x600 mm column filled with 19 l of sorbent, for example Diasogel SP-120-20-ODS-AP.
  • the column was pre-equilibrated with 40 L of application buffer (0.05 M sodium acetate, 10% 2-propanol, pH 3.0); the column was washed with the same buffer solution after insulin application. Elution of insulin was carried out by a linear gradient of 2-propanol (10-28%).
  • the column was washed with 50 L of a solution that contains 0.05 M potassium acetate, 50% 2-propanol, pH 3.0. Analysis showed that the purity of insulin was at least 98%.

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного инсулина человека, используемого для приготовления лекарственных препаратов при лечении сахарного диабета. Предложен ряд рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих искусственный ген, кодирующих предшественник инсулина человека. Биосинтез гибридного полипептида индуцируется изопропилтиогалактопиранозидом, его уровень после индукции составляет не менее 25% суммарного клеточного белка. Согласно предложенной схеме инсулин человека получают путем культивирования штамма-продуцента, содержащего одну из рекомбинантных плазмид, выделения телец включения, солюбилизапии и ренатурации гибридного белка, его ферментативного расщепления и хроматографической очистки. Изобретение упрощает технологический процесс получения рекомбинантного инсулина человека и увеличивает выход рекомбинантного инсулина человека.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине, и может быть использованным в производстве лекарственных препаратов, в частности препаратов для лечения сахарного диабета.
Инсулин - гормональный белок, который состоит из кислой А- цепи, которая содержит 21 аминокислотный остаток, и щелочной В-цепи из 30 аминокислот [1], эти цепи связаны тремя дисульфидами: одна связь находится внутри А-цепи (A6-Aп) и две межцепочечных связи (A7-B7 и A20- B19). В то время как отдельные А- и В-цепи инсулина могут быть успешно соединены iп vitrо [2], в естественных условиях обычно синтезируется единая полипептидная цепь (препроинсулин). Она содержит сигнальный пептид в амино терминальном участке В-цепи и С-пептид между А- и B- цепями. После отщепления N-концевой сигнальной последовательности на эндоплазматическом ретикулуме полученный полипептид упаковывается в секреторные гранулы в виде проинсулина [3]. Обработанный далее определенным набором протеаз, проинсулин затем превращается в инсулин и секретируется в кровоток для регуляции уровня сахара.
В промышленном масштабе, инсулин человека может быть произведен методом транспептидации, то есть замены аланинового остатка в 30-ом положении В-цепи инсулина свиньи на треонин [4]. Поскольку производство инсулина человека из инсулина свиньи является ограниченным из-за высокой себестоимости, научные исследования были направлены главным образом на разработку и внедрение методов генной инженерии для производства инсулина человека. На сегодня используются три основных метода для производства инсулина с применением микроорганизмов. Два из них включают использование бактерии Еsсhеriсhiа соli, при этом предшественник инсулина синтезируется как часть большого полипептида в виде телец включения или секретируется в периплазматичное пространство [5]. Третий метод основан на использовании дрожжей, где предшественник инсулина также может выделяться в окружающую среду [6] или формирует нерастворимые тельца включения [7].
Процесс получения инсулина человека с помощью методов генной инженерии включает в себя следующие стадии: синтез проинсулина в Еsсhеriсhiа соli в форме слитого полипептида, рефолдинг слитого полипептида с целью формирования правильных дисульфидных связей; протеолитическое расщепление рефолдированного полипептида трипсином и карбоксипептидазой В; очистка полученного продукта и получение инсулина. Разновидность данного подхода использует также сульфонирование слитого полипептида и его расщепление цианбромидом с целью получения проинсулина как промежуточного продукта производства инсулина [8]. Также, генетические манипуляции дают возможность производства слитого полипептида с разными аминокислотными последовательностями в проинсулине и/или С-пептиде рекомбинантного полипептида. Эти манипуляции направлены на увеличение выхода правильно рефолдированного проинсулина (препроинсулина). Однако, выход рефолдированного проинсулина, который имеет правильные дисульфидные связи, уменьшается с ростом концентрации проинсулина в буфере. Это происходит из-за неправильного фолдинга и роста процесса полимеризации. Таким образом, рефолдинг является критической стадией в процессе производства инсулина. Также, очистка инсулина на следующих стадиях производства часто является достаточно трудоемкой и дорогой. Учитывая все это, разработка новых подходов производства инсулина человека направлена не только на улучшение качества готовой продукции, но также и на сбережение ресурсов и уменьшение цены продукции для потребителей.
Известный способ получения рекомбинантного инсулина человека включает в себя конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует проинсулин [9], получение и культивирование штамма Еsсhеriсhiа соli - продуцента гибридного полипептида, выделение и дезинтеграцию клеток, выделение гибридного полипептида, его ферментативное расщепление с последующей очисткой и получением целевого продукта.
Однако, в этом способе используется только штамм Еsсhеriсhiа соli BL21/pIK8-proins, который характеризуется наличием плазмидной ДНК pJK8-proins, что ограничивает круг комбинаций хазяин/вектор экспрессии.
Кроме того, в этом способе перед ферментативним расщеплением гибридного полипептида проводят его обработку цитраконовым ангидридом, что предполагает дополнительную стадию очистки и количественно ограничивает выход целевого продукта.
В основу изобретения поставлена задача создания способа получения рекомбинантного инсулина человека, который гарантирует увеличение выхода гибридного полипептида и получение конечного продукта высокого качества.
Важным результатом способа является повышение эффективности получения целевого продукта, в определенной степени сокращение технологического процесса, количественное повышение выхода целевого продукта, повышения качества за счет расширения круга векторов экспрессии, оптимизации аминокислотного состава препептида, усовершенствование технологии разрушения бактериальных клеток и отмывки телец включения, а также оптимизации процесса рефолдинrа и усовершенствование технологии концентрации и очистки. Существует тесная причинно-следственная связь между всей совокупностью ^существенных признаков π техническим результатом, который достигается.
Данное изобретение касается улучшенного способа получения рекомбинатного инсулина человека путем культивирования прокариотичных клеток, трансформированных последовательностями ДНК, которая кодирует эти полипептиды. Рекомбинатний гибридный полипептид, который включает в себя лидерную последовательность присоединенную к проинсулину, синтезируется в клетках Еsсhеriсhiа соli. Инсулин человека образуется в результате обработки правильно рефолдированного гибридного полипептида трипсином и карбоксипептидазой В с последующей очисткой. Согласно этому изобретению рекомбинатный инсулин человека может быть получен с высокой воспроизводимостью, в то время как стадии выделения и очистки значительно усовершенствованы.
Разработка новых конструкций плазмидних ДНК позволяет расширить спектр используемых штаммов микроорганизмов и оптимизировать аминокислотный состав препептида.
Предложенная в способе технология концентрирования полипептида после рефолдинга путем поверхностно-адсорбционной хроматографии с использованием сорбента, который имеет высокие динамические и емкостные iшршстеристики, позволяет значительно улучшить результативность этой стадии.
Кроме того, в способе отсутствует подготовка полипептида к ферментативной конверсии (цитраконилирование). Предложена эффективная схема трипсинолиза при повышенных значениях рН, при которых минимизировано образование дез-треонина, позволяет количественно увеличить выход целевого продукта и исключить дополнительную стадию очистки от цитраконового ангидрида.
Оптимизированная схема очистки инсулина с использованием ионообменной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет получить высокоочищенньш препарат инсулина с чистотой 98- 99%.
Таким образом, поставленная задача решается за счет создания новых конструкций, усовершенствования технологии разрушения клеток и отмывки телец включения, оптимизации рефолдинга и концентрирования полипептида после рефолдинга с использованием поверхностно адсорбционной хроматографии, а также за счет отсутствия irøтраконилирования и осуществления трипсинолиза при повышенных значениях рН с целью уменьшения дез-треонина.
Так, в дополнение к ранее заявленной плазмидной ДНК (pIK8-proins) в данном способе заявляются другие плазмиды, которые имеют некоторые преимущества:
- укороченный С-пептид (плазмиды pMUT12, pISYN2, рСIМбl, pDIM07). В результате этой модификации увеличивается выход целевого продукта. При использовании плазмиды pIK8-proins инсулин составляет 47% от гибридного полипептида; при использовании pMUT12, pISYN2 инсулин составляет 68% от гибридного полипептида; при использовании рСIМбl, pDDVЮ7 - 82%.
- новые плазмиды кодируют разные гибридные полипептиды, которые отличаются последовательностью препептида. Аминокислотный состав препептида подобрано таким образом, что он изменяет заряд (и соответственно изоэлектрическую точку) гибридного полипептида, что позволяет использовать разные подходы к очистке белка.
ДНК, которая кодирует гибридный полипептид (плазмида pISYN2), получена путем химического синтеза с учетом распределения кодонов в Еsсhеriсhiа соli, что повышает эффективность синтеза гибридного полипептида приблизительно на 40% в сравнении с аналогичной кДНК с оригинальными кодонами.
В способе предложена высокоэффективная технология пресс- разрушения бактериальных клеток (эффективность разрушения составляет свыше 99%), в то время как эффективность разрушения с помощью ультразвука составляет приблизительно 40-50%. Кроме того, способ значительно дешевле, имеет более высокую производительность и позволяет получить на выходе более чистый препарат (тельца включения).
Подготовка гибридного полипептида для рефолдинга не содержит стадии сульфитолиза (эта стадия уменьшает выход целевого продукта и повышает его себестоимость). Заявленная схема прямого рефолдинга восстановленного полипептида проста в выполнении и позволяет проводить рефолдинг при концентрациях полипептида 0,5-1,0 мг/мл, в то время, как восстановление сульфитированного полипептида проводят при концентрации полипептида меньше 0,1 мг/мл. Таким образом, существенно уменьшаются объемы реакционной смеси, необходимые для ренатурации гибридного полипептида.
Суть изобретения объясняют графические изображения:
Рис. 1 - схематическая диаграмма плазмидной ДНК pIK8-proms, показаны также нуклеотидная и аминокислотная последовательности предшественника инсулина.
Рис. 2 - схематическая диаграмма плазмидной ДНК pMUT12, показаны также нуклеотидная и аминокислотная последовательности предшественника инсулина.
Рис. 3 - схематическая диаграмма плазмидной ДНК pISYN2, показаны также нуклеотидная и аминокислотная последовательности предшественника инсулина.
Рис. 4 - схематическая диаграмма плазмидной ДНК рСIМбl, показаны также нуклеотидная и аминокислотная последовательности предшественника инсулина.
Рис. 5 - схематическая диаграмма плазмидной ДНК pDIM07, показаны также нуклеотидная и аминокислотная последовательности предшественника инсулина. Рис. 6 - отображает первичную структуру инсулина человека.
Способ заключается в том, что получают рекомбинантную ДНК, кодирующую предшественник инсулина человека, который экспрессируется в клетках-хозяевах Еsсhеriсhiа соli в виде телец включения с последующей очисткой рекомбинантного полипептида и ренатурацией в условиях, которые приводят к правильному формированию дисульфидних связей между остатками цистеина. В дальнейшем рекомбинантный полипептид протеолитически расщепляют и очищают.
Способ получения рекомбинантного инсулина включает следующие стадии: а) трансформация клеток Еsсhеriсhiа соli рекомбинантной ДНК, кодирующей предшественник инсулина с участками распознавания трипсина в последовательности рекомбинантного полипептида; б) культивирование трансформированных клеток-хозяев в условиях, которые приводят к экспрессии рекомбинантной ДНК и продукции телец включения; в) разрушение клеток и выделение продуктов экспрессии; г) растворение рекомбинантного полипептида в присутствии денатурантов и восстанавливающего агента с последующим рефолдингом; д) расщепление гибридного полипептида трипсином и карбоксипептидазой В для получения инсулина; е) выделение и очистка инсулина.
Суть изобретения заключается в том, что в способе получения рекомбинантного инсулина человека путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует проинсулин, получения и культивирования штамма-продуцента гибридного полипептида Еsсhеriсhiа соli, выделения и дезинтеграции клеток, выделения гибридного полипептида, его ферментативного расщепления с последующей очисткой и получением целевого продукта, в соответствии с изобретением участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, находится в составе экспрессирующих векторов pIK8-proins, или pMUT12, или pISYN2, или рСIМбl, или pDIM07, или являет собой последовательность ДНК, которая гибридизируется с одной из вышеуказанных ДНК вставок и которые кодируют экспрессию предшественника проинсулина человека, а участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью плазмиды pIK8-proins и имеет следующую структуру:
i АТGGGСАGСАGССАТСАТСАТСАТСАТСАСАGСАGСGGССТGGТGССGСGСGGСАGССАТ
1 М G S S Н Н Н Н Н Н S S G L V Р R G S Н
61 АТGСGСТТТGТGААССААСАССТGТGСGGСТСАСАССТGGТGGААGСТСТСТАССТАGТG
21 М R F V N Q Н L С G S Н L V Е А L Y L V
121 TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAG
41 С G Е R G F F Y Т Р К Т R R Е А Е D L Q
181 GТGGGGСАGGТGGАGСТGGGСGGGGGСССТGGТGСАGGСАGССТGСАGСССТТGGСССТG
61 V G Q V Е L G G G Р G А G S L Q Р L А L
241 GАGGGGТСССТGСАGААGСGТGGСАТТGТGGААСААТGСТGТАССАGСАТСТGСТСССТС
81 Е G S L Q К R G I V Е Q С С Т S I С S L
301 ТАССАGСТGGАGААСТАСТGСААСТАG
101 Y Q L E N Y C N * ,
участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью плазмиды pMUT12 и имеет следующую структуру:
1 АТGGGСАGСАGССАТСАТСАТСАТСАТСАСАGСАGСGGССТGGТGССGСGСGGСАGССАТ 1 М G S S Н Н Н Н Н Н S S G L V Р R G S Н 61 ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTG
21 М R F V N Q Н L С G S Н L V Е А L Y L V
121 ТGСGGGGААСGАGGСТТСТТСТАСАСАСССААGАССААGСGТGGСАТТGТGGААСААТGС
41 С G Е R G F F Y Т Р К Т К R G I V Е Q С
181 ТGТАССАGСАТСТGСТСССТСТАССАGСТGGАGААСТАСТGСААСТАG
61 С Т S I С S L Y Q L Е N Y С N * ,
участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью плазмиды pISYN2 и имеет следующую структуру:
1 АТGGGСАGСАGССАТСАТСАТСАТСАТСАСАGСАGСGGССТGGТGССGСGСGGСАGССАТ
1 М G S S Н Н Н Н Н Н S S G L V Р R G S Н
61 АТGСGСТТТGТGААССАGСАТСТGТGТGGСАGССАССТGGТGGАТIGСGС'ГСТАТТТАGТG
21 М R F V N Q Н L С G S Н L V Е А L Y L V
121 ТGСGGСGАGСGТGGСТТСТТТТАТАССССGААААССАААСGТGGСАТТGТGGААСАGТGТ
41 С G Е R G F F Y Т Р К Т К R G I V Е Q С
181 ТGСАССАGТАТТТGТАGССТGТАТСАGСТGGААААТТАСТGСАΆСТАА
61 С Т S I С S L Y Q L Е N Y С N * ,
участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека;, является частью плазмиды рСIМбl и имеет следующую структуру:
1 АТGСGАААGААGСGGААGААGААGСGТТТТGТGААССАGСАТСТGТGТGGСАGССАССТG
1 М R К К R К К К R F V N Q Н L С G S Н L
61 GТGGААGСGСТGТАТТТАGТGТGСGGСGАGСGТGGСТТСТТТТАТАССССGААААССААА
21 V Е А L Y L V С G Е R G F F Y Т Р К Т К
121 СGТGGСАТТGТGGААСАGТGТТGСАССАGТАТТТGТАGССТGТАТСАGСТGGАΆΆАТТАС
41 R G I V Е Q С С Т S I С S L Y Q L Е N Y
181 TGCAACTAA
61 C N * . участок ком , полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью плазмиды pDIM07 и имеет следующую структуру:
1 АТGGЖТGiШGΑСGΑGGЖТGШiGСЖСG^СТТТGТGiffiССЖGСЖТСТGТGТGGСЙGССΑССТG
1 М D Е D Е D Е А R F V N Q Н L С G S Н L
бi GТGGААGСGСТGТАТТТАGТGТGСGGСGАGСGТGGСТТСТТТТАТАССССGААААССААА
21 V Е А L Y L V С G Е R G F F Y Т Р К Т К
121 СGТGGСЙТТGТGGΑΑгаGТGТТGСАСгаGта^
41 R G I V Е Q С С Т S I С S L Y Q L Е N Y
181 ТGСААСТДА
61 C N * .
Создание штаммов Еsсhеriсhiа соli осуществляют с использованием шiазмидних векторов, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько рекомбинантних полипептидов, при этом транскрипция указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует один или несколько полипептидов, находится под контролем индуцируемой системы экспрессии, затем осуществляют культивирование трансформированных штаммов Еsсhеriсhiа соli и индуцирование системы экспрессии для синтеза рекомбинатного полипептида или полипептидов в клетках Еsсhеriсhiа соli, и выделение рекомбинантного полипептида или продуцируемых полипептидов.
Выделение синтезированного продукта осуществляют путем разрушения бактериальной клетки или фрагментов клеток, сепарации с одновременным отмыванием осадка неионным детергентом, а последующая его конверсия включает растворение в буферном растворе с денатурирующим реагентом, обработку гибридного полипептида восстанавливающим агентом, рефолдинг гибридного полипептида и его концентрацию методом абсорбционной хроматографии или ультрафильтрации. Ферментативное расщепление гибридного полипептида осуществляют трипсином и карбоксипептидазой В одновременно или последовательно с использованием преимущественно очистки продуктов ферментативной конверсии с помощью ионообменной хроматографии и/или высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Способ осуществляют как описано далее.
В заявленной системе экспрессии рекомбинантной ДНК может использоваться целый ряд комбинаций хозяин/вектор экспрессии, что обеспечивает оптимальную продукцию инсулина человека. Например, векторы экспрессии могут содержать промоторный участок, сигнал начала трансляции, кДНК проинсулина человека с или без модификаций, введенных в последовательность С-пептида, и оптимизированного препептида, отделенного от проинсулина сайтом распознавания трипсина. Оптимальной для данного изобретения является рекомбинантная плазмидная ДНК, которая содержит интегрированную ДНК, которая описана выше. Выбранные плазмиды данного изобретения включают pЮ-proins, pMUT12, pISYN2 и их производные.
Также в данном изобретении описан процесс получения рекомбинантной молекулы ДНК. Этот процесс включает в себя клонирование в соответствующий вектор ДНК-вставки, которая кодирует полноразмерную форму проинсулина, а также аналогов, гомологов и предшественников полипептида, которые превращаются в инсулин.
Преимущественно указана последовательность ДНК клонированная в правильном положении и в нужной рамке считывания с последовательностью контроля экспрессии.
В последующем, согласно с данным изобретением, клетки-продуценты трансформируются одной из рекомбинантних молекул ДНК, которые способны к экспрессии полноразмерной, модифицированной или редуцированной формы предшественников инсулина человека или полипептида, который имеет подобную иммунологическую или биологическую активность к инсулину.
В качестве экспрессирующих клеток-хозяев используют известные штаммы прокариот, которые включают штаммы Еsсhеriсhiа соlц такие как Еsсhеriсhiа соli HBlOl, Еsсhеriсhiа соli Xl 776, Еsсhеriсhiа соli X2282, Еsсhеriсhiа соli DH5α, Еsсhеriсhiа соli JMl 03, Еsсhеriсhiа соli BL21, но не только их.
Для производства полипептида предшественника инсулина бактериальные клетки-продуценты культивируются в жидкой питательной среде в условиях, оптимальных для клеток-хозяев и вектора экспрессии. Преимущественно, клетки-продуценты культивируются в бактериальном ферментере для широкомасштабного производства, однако допускаются другие удобные методы культивирования (например, в колбе на шейкере, когда необходимо культивирование в объемах менее 1 литра). Точные условия роста, выбор времени и добавки среды, рН культуральной среды, температура и уровень растворенного кислорода, добавление индуцирующего агента (при необходимости) подбираются согласно каждого штамма-продуцента и экспресирующего конструкта.
После того, как бактериальные клетки-продуценты были выращены до желаемой плотности и была проведена необходимая индукция экспрессии, клетки собирают. Сбор обычно выполняется центрифугированием среды культивирования, хотя может быть использована любая другая удобная техника типа ультрафильтрации. На этом этапе собранные бактериальные клетки-продуценты могут быть сразу использованы в соответствии с изобретением, или могут быть заморожены для переработки позже.
В таком случае бактериальные клетки разрушают путем лизиса - чтобы высвободить тельца включения, которые содержат полипептид- предшественник инсулина. Для этого бактериальные клетки ресуспендируют в буферном растворе при рН от 6,0 до 9,0 и ионной силе в диапазоне от 0,0 IM до 2M. Любая подходящая соль, включая NaCl, может использоваться для поддержки соответствующего уровня ионной силы. Преимущественно, лизис клеток проводят в условиях, при которых клеточные фрагменты достаточно разрушены и не накапливаются в осадке при низко скоростном центрифугиронании. Лизис клеток проводят общеупотребляемыми методами, такими как механические методы (в частности, циклическое замораживание/оттаивание; использование прибора Мiсrоfludizеr или Frепсh рrеss; или ультразвукового генератора) или энзиматичные методы (такие как обработка лизоцимом). В целом, рекомендуется проводить лизис клеток при пониженной температуре (то есть, меньше чем 20 градусов С).
Тельца включения отделяют от фрагментов клеток, используя любой удобный метод (например, центрифугирование), потом отмывают, если необходимо. Тельца включения обычно промывают ресуспендируя их в буфере с добавлением детергента (например, Тритон X-100), потом опять собирают тельца включения. Отмытые тельца включения потом растворяют в солюбилизационном буфере, который содержит высокую концентрацию хаотропного агента (например, мочевина или гуанидин гидрохлорид) и восстанавливающий реагент при оптимальном значении рН.
Концентрация мочевины в солюбилизационном буфере находится в пределах между 6M и 8M, преимущественно 7M, и концентрация гуанидина гидрохлорида — от 5 до 7M, iфеимущественно 6M. рН солюбилизационного буфера варьирует от 7.5 до 11.0, преимущественно от 8.5 до 9.0. Можно использовать любой рН буферный агент (такой как Тris, HEPES, MOPS, triсiпе и т.п.). рН буферный агент добавляется к солюбилизационному буферу при концентрации, которая обеспечивает эффективную буферную емкость, например, от 10 до приблизительно 100 мМ, преимущественно 20 мМ.
Восстанавливающие реагенты являются составной частью солюбилизационного буфера - для восстановления дисульфидных связей и для поддержания остатков цистеина в восстановленной форме. На практике используются такие восстанавливающие реагенты: бета-меркаптоэтанол, дитиотреитол и т.п.. Оптимальная концентрация бета-меркаптоэтанола - между 20 и 20OMM, преимущественно между 100 и 150мM.
Оптимально солюбилизационный буфер содержит дополнительные компоненты типа катионного комплексона подобно EDTA. EDTA добавляется в солюбилизационный буфер в концентрации приблизительно 0,5 до 5 мМ, преимущественно - IMM до 2мM. Кроме того, глицин (или другие аминокислоты) добавляются в буфер для предотвращения разрушения полипептида свободными радикалами. Концентрация глицина варьирует от 5 до 100 мМ, преимущественно от 10 до 20 мМ.
Растворение телец включения в основном проводится за период от шести часов до приблизительно 24 часов, преимущественно в течение 8 часов. Растворение может быть проведено при комнатной температуре или пониженной температуре, обычно от 4 градусов до 24 градусов С, преимущественно при 20 градусах С. После того, как растворение телец включения завершено, раствор восстановленного полипептида осветляется для удаления нерастворимого остатка. Осветление может быть выполнено путем использования высокоскоростного центрифугирования.
Восстановленный предшественник проинсулина затем разбавляется буфером для рефолдинга. Разведение проводится путем добавления раствора телец включения в буфер для рефолдинга или путем одновременной подачи в емкость для рефолдинга буфера и раствора телец включения. Раствор телец включения может быть разведен приблизительно от 10 до 200-кратно, преимущественно 100-кратно буфером для рефолдинга. Конечная концентрация полипептида после растворения может составлять приблизительно от 0.01 мг/мл до 5 мr/мл, преимущественно 1 мг/мл.
Буфер для рефолдинга как правило содержит рН буферный агент, окислительно-восстановительную пару, катионний хелатор, реагенты- предохранители свободно-радикального разрушения полипептида и некоторые другие низкомолекулярные добавки. Процесс рефолдинга проводится при температуре приблизительно от 4 до 24 градусов С, преимущественно при 10 градусах С. Время инкубации в общем составляет приблизительно от 2 до 20 часов, преимущественно около 6 часов. Главные компоненты буфера для рефолдинга включают глицин в концентрации приблизительно от 0,5 мМ до 20 мМ; EDTA приблизительно от 0,1 мМ к 5мM; глицерин - приблизительно от 1 % до 20 %.
По окончании процесса рефолдинга правильно уложенный предшественник инсулина может быть сконцентрирован, потом очищен, и полипептид может быть обработан протеолитическими ферментами, например, трипсином и карбоксипептидазой В для производства готового инсулина. Концентрирование рефолдированного полипептида может проводиться с использованием любой удобной методики, типа ультрафильтрации или хроматографии (например, ионнообменной, гидрофобной или афинной хроматографии) и т.п. Процесс концентрирования, при желании, может также включать процесс замены буфера. Преимущественно концентрирование проводится при пониженной температуре (например, приблизительно 4-10 градусов С).
Протеолитическое расщепление предшественника инсулина проводится или одновременной обработкой трипсином и карбоксипептидазой В или раздельной обработкой этими двумя ферментами. Трипсин используется в концентрации от приблизительно 1:200 до 1:20,000 (ферментхубстрат, весовое соотношение), в то время как карбоксипептидаза В используется в концентрации от приблизительно 1:100 до 1:5000. Протеолитическое расщепление проводится в буфере с рН приблизительно 7,5 до 11,0, преимущественно рН 10,5; добавление ионов Ca2+, Zn2+, Mn2+, Mg может улучшать эффективность реакции. Температура инкубации варьирует от 0 градусов С до приблизительно 30 градусов С, преимущественно - около 6 градусов С, время инкубации - от 1 до 24 часов, преимущественно приблизительно 14 часов.
После протеолитического расщепления биологически активный инсулин очищают. Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение. Следует понимать, что эти примеры - только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться в любом случае как ограничение этого изобретения.
Пример 1.
Конструирование плазмиды pIK8-proins.
С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК инсулина человека была амплифицирована на матрице одноцепочечной кДНК поджелудочной железы человека, используя праймери Pl и P2: праймер Pl (прямой праймер)
S'-GССАТАТGСGАТТТGТGААССААСАССТGТG-З' праймер P2 (обратный праймер)
5'-TGGAATTCCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGC-3'
Праймер Pl совпадает с последовательностью В-цепи гена инсулина человека, начиная с Аrg22 препроинсулина человека, и содержит участок распознавания эндонуклеазы Ndеl (выделен рамкой), необходимый для клонирования. Обратный праймер (P2) является комплементарным амино- терминальному фрагменту А-цепи инсулина и содержит ЕсоRI участок (выделен рамкой) для целей клонирования. ПЦР реакцию проводили в растворе, который содержал 25 пмоль каждого из указанных праймеров,
1 хПЦР буфер, 200 мкМ каждого из четырех нуклеотидов (dА, dС, dG и dТ),
2 нанограмма одноцепочечной кДНК, 5,0 единиц Таq полимеразы. Условия ПЦР реакции были такими: 95 градусов С, 3 минуты, потом 35 циклов (95 градусов С, 1 минута; 65 градусов С, 30 секунд; 72 градуса С, 30 секунд), затем - 5 минут, 72 градуса С. ПЦР фрагмент длиной около 280 п.н. был выделен из агарозного геля и клонирован в рТА клонирующий вектор. Лигазную смесь было введено в штамм Еsсhеriсhiа соli DH5alpha, трансформанты отобраны на чашках с агаризованной LB средой, которая содержит ампицилин. Несколько отдельных колоний были выращены в LB среде на протяжении ночи, плазмидная ДНК была выделена с использованием набора Wizаrd minipreps DNA isоlаtiоп кit. Клон IK8 был выбран для последующей работы, поскольку он имел правильную последовательность ДНК.
Для экспрессии в Еsсhеriсhiа соli плазмидная ДНК, выделенная из клона IK8, была расщеплена эндонуклеазами рестрикции Ndеl и ЕсоRI; ДНК фрагмент длиной около 270 п.н. был выделен из агарозного геля и клонирован в плазмиду pET28a, которая была расщеплена теми же ферментами и обработана щелочной фосфатазой из желудка теленка. Лигазной смесью был трансформирован штамм Еsсhеriсhiа соli DH5alpha и трансформанты отобраны на LBA канамицинових чашках. Плазмидная ДНК была выделена из некоторых трансформантов и проанализирована рестрикцией Ndеl и ЕсоRI. Правильный клон был идентифицирован и назван pIK8-proins. Эта плазмида была в дальнейшем введена в Еsсhеriсhiа соli, например, штамм JMl 09 или BL21.
Пример 2.
Конструирование плазмиды pMUT12.
Плазмидна ДНК pIK8-proins использовалась в качестве матрицы для направленного мутагенеза с использованием ПЦР и следующих праймеров:
Ml: 5Λ - СТТСТАСАСАСССААGАССААGСGТGGСАТТGТGGААС
AATGCTG -3'
M2: 5^ - САGСАТТGТТССАСААТGССАСGСТТGGТСТТGGGТGТ
GTAGAAG -3'
После денатурации ДНК при 96 градусах С в течении 3 минут было проведено 30 циклов ПЦР с использованием 5 единиц гТth ДНК полимеразы. Условия ПЦР реакции были такими: 94 градуса С, ЗОсек; 59 градусов С, ЗОсек; 72 градуса С, 6 минут и завершающий синтез при 72 градуса С в течение 10 минут. Продукт ПНР реакции был очищен набором Zуmосlеап и обработан 10 U рестриктазы Dрпl - для удаления оригинальной матрицы. После еще одного цикла очистки на колонке 2мкл аликвота была введена в Еsсhеriсhiа соli штамм DH5alpha и трансформанты отобраны на LB чашках, которые содержат канамицин. Несколько отдельных колоний были выращены в LB среде на протяжении ночи, плазмидная ДНК была выделена с использованием набора Wizаrd miпiрrерs. Клон MUTl 2 был выбран для последующей работы, поскольку он имел правильную последовательность ДНК. Для экспрессии в Еsсhеriсhiа соli эта плазмида была в дальнейшем введена в Еsсhеriсhiа соli, например штамм JMl 09 или BL21.
Пример 3.
Конструкция плазмиды pISYN2
Для создания pISYN2 мы сначала синтезировали 5 олигонуклеотидных затравок, опираясь на опубликованную аминокислотную последовательность инсулина человека [10]. При этом кодоны нутслеотидньrх затравок отвечали присутцим для Еsсhеriсhiа соli генам с высоким уровнем экспрессии [11] и уровнем тРНК в Еsсhеriсhiа соli [12]. Эти затравки также содержали участки распознавания эндонуклеаз в разнообразных положениях - для целей клонирования.
Последовательности праймеров:
Sl: 5'- CATATGCGCTTTGTGAACCAG-3'
S2: 5'-AAGCCACGCTCGCCGCACACTAAATACAGCGCTTCCA ССАGGТGGСТGССАСАСАGАТGСТGGТТСАСАААGСGСАТАТG-З'
SЗ: 5'-CGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAA СGТGGСАТТGТGGААСАGТGТТGСАССАGТАТТТGТАGССТGТ-З'
S4: 5'-CAGGCGTGAATTCTTAGTTGCAGTAATTTTCCAGCTG АТАСАGGСТАСААА TACTGGTGC-3*
S5: 5'- CAGGCGTGAATTCTTAGTTGC-3'
Смесь праймеров Sl, S2, SЗ, S4 (конечная концентрация 2 мкм каждого) в ПЦР буферном растворе содержащем 5U rТth ДНК полимеразы нагревали до 94 градусов С в течение 1 минуты, охлаждали до 62 градусов С и проводили реакцию при 72 градусах С в течение 2 минут для заполнения разрывов. Следующие 20 циклов амплификации были выполнены при следующих условиях: 94 градуса С, 15 сек; 62 градуса С, 30 сек; 72 градуса С, 30 сек. 2мкл вышеупомянутой смеси использовали в качестве матрицы для амплификации кДНК проинсулина человека с использованием праймеров Sl и S5. ПЦР фрагмент длиной приблизительно 180 п.н. был очищен из геля и клонирован в рТА-клонирующий вектор. Клон IS2 был выбран для последующей работы, поскольку он имел правильную последовательность ДНК.
Для экспрессии в Еsсhеriсhiа соli плазмидная ДНК, выделенная из клона IS2, была расщеплена ендонуклеазами рестрикции Ndеl и ЕсоRI; ДНК фрагмент длиной около 170 п.н. был выделен из агарозного геля и клонирован в плазмиду pET28a, которая была расщеплена теми же ферментами и обработана щелочной фосфатазой из желудка теленка. Лигазной смесью был трансформирован штамм Еsсhеriсhiа соli DH5alpha и трансформанты отобраны на LB канамицинових чашках. Плазмидная ДНК была выделена из некоторых трансформантов и проанализирована рестрикцией Ndеl и ЕсоRI. Правильные клоны были идентифицированы и названы pISYN2. Эта плазмида была в дальнейшем введена в Еsсhеriсhiа соli, например штамм JM109 или BL21.
Пример 4.
Создание плазмиды рСIМбl Плазмидная ДНК pMUT12 использовалась как матрица для амплификации кДIЖmiпi проинсулина человека с модифицированным препептидом. ПЦР реакцию проводили в условиях описанных в примере 1 с использованием следующих праймеров:
Праймер С (прямой):
5 - GССАТАТGСGАААGААGСGGААGААGААGСGТТТТGТG AACACCTGTG-3' Праймер IL4 (обратный):
S -ССGСААGСТТТТАGТТGСАGТАGТТСТССАGСТGG-З^
ПЦР продукт длиной приблизительно 210 п.н. было выделено из агарозноrо геля и клонировано в рТА вектор. Лигазная смесь была трансформирована в Еsсhеriсhiа соli штамм DНЗаlрhа и трансформанты отобраны на LB чашках, которые содержат ампициллин. Клон CEM6 был отобран как таковой, что имеет правильную ДНК последовательность.
Для экспрессии в Еsсhеriсhiа соli, плазмидную ДНК выделенную из клона CIM6, было обработано ендонуклеазами рестрикции Ndеl и НiпdШ. Фрагмент ДНК длиной приблизительно 200 п.н. было выделено из геля и клонировано в плазмиду pET39a, обработанную теми же ферментами. Лигазная смесь была трансформирована в Еsсhеriсhiа соli DH5alpha и трансформанты отобраны на LB чашках с канамицином. Плазмидную ДНК было выделено из нескольких трансформантов и проанализировано расщеплением Ndеl и НiпdΙII. Правильный клон был идентифицирован и назван рGМбl. Эта плазмида была трансформирована в Еsсhеriсhiа соli, например штамм JMl 09 или BL21.
Пример 5.
Создание плазмиды pDПУЮ7
Плазмидная ДНК pMUT12 использовалась в качестве матрицы для амплификации кДНКmшi проинсулина человека с модифицированным препептидом. ПЦР реакцию проводили в условиях, описанных в примере 1 с использованием следующих праймеров: Праймер D (прямой):
5 -ТАССАТGGАТGААGАСGАGGАТGААGСАСGСТТТGТGАА CCAACACCTGTG-3'
Праймер IL4 (обратный):
S -ССGСААGСТТТТАGТТGСАGТАGТТСТССАGСТGG-З^
ПЦР продукт, длиной приблизительно 210 п.н., был выделен из агарозного геля и клонирован в рТА вектор. Лигазная смесь была трансформирована в ЕsсhеriсЫа соli штамм DH5alpha и трансформанты, отобраны на LB чашках, которые содержат ампициллин. Клон DIMl был отобран как таковой, который имеет правильную ДНК последовательность.
Для экспрессии в ЕsсhеriсЫа соli плазмидную ДНК, выделенную из клона DIMl, обработали эндонуклеазами рестрикции Nсоl и ШiпdΙП. Фрагмент ДНК длиной приблизительно 200 п.н. было выделено из геля и клонировано в плазмиду pET28a, обработанную теми же ферментами. Лигазная смесь была трансформирована в ЕsсhеriсЫа соli DH5alpha и трансформанты отобраны на LB чашках с канамицином. Плазмидную ДНК было выделено из нескольких трансформантов и проанализировано расщеплением Nсоl и НiпdШ. Правильный клон был идентифицирован и назван pDIM07. Эта плазмида была трансформирована в ЕsсhеriсЫа соli, например штамм JMl 09 или BL21.
Пример 6.
Экспрессия полипептидов -предшественников инсулина Плазмиды, в которых подтверждено наличие ДНК фрагмента, который кодирует последовательность предшественника инсулина (pIK8-proins, pMUT12, рСIМбl, pISYN2, pDIM07 и др.), использовались для трансформации клеток E. соli BL21(DEЗ) в соответствии с процедурами, которые описаны выше, и клетки колоний трансформированные плазмидными ДНК pIK8-proins, pISYN2 и рСЕViбl были помещены в Украинский Центр Микроорганизмов с номерами доступа соответственно IMB B-7169, IMB B-7230 и IMB B-7251, а также депонированы в Чешской Коллекции Микроорганизмов с номерами доступа соответственно CCM 7511, CCM 7568 и CCM 7567 согласно условиям Будапештского Соглашения относительно Международного договора по размещению микроорганизмов с целью патентования.
Колонии, отобранные как описано выше, были инокулированы в 1 мл LB среды (10 г бакто триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl на л) и потом культивировались при 37 градусах С в течение не менее 12 часов. Культура была перенесена в колбу с 50 мл LB среды, которая содержит 30 мкг/мл канамицина, и после достижения культурой оптической плотности в пределах от 0,5 до 0,8 была индуцирована добавлением IPTG (изопропил-β- D-тиогалактопиранозид) в культуру до конечной концентрации 1 мМ. Выращивание продолжалось при 37 градусах С в течение 4 час при интенсивном перемешивании (200 об/мин). После индукции бактериальную культуру центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин для того, чтобы получить осадок клеток E. соli. Клетки были лизированы нагреванием до 95 градусов С в течение 5 мин в буфере для нанесения образцов, лизаты были проанализированы с помощью ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях согласно стандартной методики [13].
Пример 7.
Ферментация и условия выращивания
1. Рабочий банк.
Единичная колония Еsсhеriсhiа соli штамма BL21, который содержит одну из выше указанных плазмид, выращивалась в среде LB (Юг/л бакто пептон, 5г/л дрожжевой экстракт и 5г/л NaCl) или ее аналоге с добавлением соответствующего антибиотика. Культуры были потом разбавлены средой для криоконсервации и хранились при температуре -80 градусов С или -170 градусов С.
2. Посев. Колба со стерильной средой LB с добавлением 30 мкг/мл канамицина или 50 мкг/мл ампициллина была засеяна культурой из рабочего банка и инкубирована в течение 15 час на шейкере при 37 градусах С и приблизительно 250 об/мин. При необходимости следующие этапы выращивания проводили в аэрируемых ферментерах с перемешиванием. Стерильная среда в ферментере была засеяна бактериальной культурой из колбы (объем инокулята составлял 5-10% от объема ферментера), инкубация проводилась в течение 5-8 часов при 37 градусах С, рН 6.9±0.5 с перемешиванием и аэрацией для поддержания уровня растворенного кислорода выше 20% насыщения.
3. Выращивание
Производственная среда была засеяна посевной культурой (1-10% от объема рабочего ферментера) и инкубировалась при 37 градусах С. Перемешивание-аерация были выставлены на уровне достаточном, чтобы поддерживать уровень растворенного кислорода выше 20% насыщения. Показатель рН поддерживался на уровне 6,9±0,5 с помощью NH4OH. Пропинол Б400 использовался в качестве пеногасителя.
Производственная среда:
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Раствор микроэлементов:
Figure imgf000026_0002
Стерильный раствор 50% глюкозы использовали в качестве источника углерода. Как только концентрация клеток достигла ОDβоо 30, стерильный раствор индуктора, например IPTG (конечная концентрация 1 мМ) был инфузирован и культивирование продолжали в течение 6 час, концентрация клеток достигала приблизительно 50 при ОDбоо- Культуральную среду после этого охлаждали и клетки собирали центрифугированием.
Пример 8.
Очистка телец включения
Бактериальную массу ресуспендировали (в соотношении к буферному раствору 1:10) в холодном буферном растворе, который содержит 20 мМ Тris, рН 7,5; IMM ЕДТА И 100 мМ NaCl. Клеточная суспензия была пропущена через разрушитель клеток при 17000 рsi и тельца включения собирали центрифугированием.
Осадок, который содержит тельца включения и фрагменты бактерий, был отмыт 20-кpaтним объемом холодного (+10 градусов С) буфера для отмывания, который содержит 1,0 % Тritоп X100, 20 мМ Тris-НСl, рН 8,0; 2 мМ ЕДТА, 100 мМ NaCl. Осадок был собран центрифугированием приблизительно при 14000 об/мин. Стадия отмывания была повторена дважды.
1,5 кг влажных телец включения, которые содержат приблизительно 1,0 кг гибридного полипептида (определено за методом Бредфорда) были растворены в 15 л буферного раствора, который содержит 8 M мочевины, 50 мМ глицина, рН 8,0; 2мM ЕДТА, 150 мМ β-меркаптоетанола. Инкубация продолжалась в течение 6 час при комнатной температуре. Раствор был осветлен высокоскоростным центрифугированием и восстановленный предшественник инсулина был использован для рефолдинга.
Пример 9.
Очистка телец включения
Водная суспензия телец включения объемом 60 л с общим содержимым белка 12 кг была обработана лизоцимом (0,1 мг/мл), РНКазой (0,5 eд.aкт./мл) и ДНКазой (0,5 eд.aкт./мл) в течение 3 час при 25 °C в буфере, который содержит 20 мМ Тris-НСl, рН 7,5; 10 mМ MgSO4. После обработки было проведено определение содержания нуклеиновых кислот, которое составляло 198 мr/л (656 мг/л - до обработки).
Тельца включения были отмыты от избытка ферментов центрифугированием и растворены в 100 л буферного раствора, который содержит 8M мочевины, 20 мМ глицина, рН 8,5; IMM ЕДТА, 150 мМ β- меркаптоэтанола. Инкубация продолжалась в течение 4 час при комнатной температуре. Раствор был осветлен высокоскоростным центрифугированием и восстановленный предшественник инсулина был использован для рефолдинга.
Пример 10.
Рефолдирование гибридного полипептида Емкость для рефолдинга была наполнена буфером (50 мМ глицин, 2 мМ ЕДТА, 5 мМ цистин, 10% глицерол, рН 11,2) и охлаждена до 5 градусов С. Потом осветленный полипептидный раствор и буфер для рефолдинга быстро смешивают в пропорции 1 :70 (об/об) путем подачи этих растворов в камеру смешивания. Реакционную смесь переносят в емкость для рефолдинга на 10 час при 5 градусах С и при медленном перемешивании. Концентрация полипептида в емкости для рефолдинга составляет приблизительно 1,0 г/л, как определено по методу Бредфорда.
Концентрирование
Концентрирование рефолдированного полипептида обычно выполняется путем ультрафильтрации или с использованием абсорбционнной хроматографии. Хроматоrрафическая колонка размером 450x500 мм. была заполнена 30 л полимерного сорбента Аmbеrсhrоm CG- 300M. Рефолдированная реакционная смесь подавалась на колонку при скорости потока 4 л/мин, колонка была отмыта тремя объемами буфера для уравновешивания. Полипептид элюировали 20- 40% раствором 2-пpoпaнoлa. Потом элюент был проанализирован методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, что показало чистоту полученного препарата больше 45%, а выход составляет не менее 96%.
Пример 11.
Рефолдирование гибридного полипептида
Емкость для рефолдинга была наполнена буфером (10 мМ глицин, IMM ЕДТА, 2 мМ цистин, lг/л ПEГ1500, рН 11.2) и охлаждена до 1O0C. 50 л восстановленного гибридного белка смешали с 5000 л буфера для рефолдинга, концентрация белка в емкости для рефолдинга составляет 0,5 г/л.
Через 6 час в рефолдинг буфер было внесено Zn2+ в концентрации 3 мМ и доведено рН до 6,2. Суспензия высажденного белка была подана на самовыгружной сепаратор, и получено приблизительно 150 л водной суспензий аморфного осадка белка, который был растворен путем добавления мочевины до 6M.
Пример 12.
Ферментативная конверсия
Предшественник инсулина в растворе 50 мМ Тris-НСl, рН 8,0 был расщеплен до инсулина человека путем инкубации с трипсином (1:8000; весовое соотношение) и карбоксипептидазой В (1:2000; весовое соотношение) в присутствии l,5mM Zn2+. Реакцию вели в течение 16 час. при 8 градусах С и останавливали путем коррекции рН до 2,5 с помощью 6M HCl. Высокоэффективный жидкостной хроматографический анализ показал, что чистота полученного препарата составляла 69% или больше. Инсулин может быть высажден из реакционной смеси сульфатом аммония или хлоридом натрия (конечная концентрация 20%).
Пример 13.
Ионообменная хроматография
300 г инсулина было растворено в 19 л буферного раствора, который содержит 50 мМ Тris-НСI, 1 мМ ЕДТА, рН 8,3; 32% 2-пpoпaнoлa. Раствор инсулина фильтровали через 0,5 мкм фильтр и подавали на колонку для ионообменной хроматографии при скорости потока 320 мл/мин. Колонка была заполнена 19 л сорбента Маtrех PEI-300. После адсорбции инсулина колонка была отмыта двумя объемами буфера для уравновешивания. Полипептид был элюирован градиентом (0-0,3 M) концентрации NaCl. Потом фракции элюента, которые собраны в пределах 0,1-0,2 M NaCl были проанализированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ показал, что чистота препарата составляла не менее 85%, а выход продукта - не менее 91%.
Пример 14. Высокоэффективная жидкостная хроматографическая очистка инсулина
Кристаллы инсулина после ионообменной хроматографии растворяли при рН 3,0 в растворе, который содержал 0,05 M ацетата натрия и 10 % 2- пропанола и фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Полученный раствор со скоростью 0,8 л/мин подавали на колонку размером 200x600 мм, заполненную 19 л сорбента, например Diаsоgеl SP-120-20-ODS-AP. Предварительно колонку уравновешивали 40 л буфера для нанесения (0,05 M натрия ацетата, 10% 2-пpoпaнoлa, рН 3,0); этим же буферным раствором промывали колонку после нанесения инсулина. Элюцию инсулина проводили линейным градиентом 2-пpoпaнoлa (10-28%). Для регенерации сорбента колонку промывали 50 л раствора, который содержит 0,05 M ацетата калия, 50% 2-пpoпaнoлa, рН 3,0. Анализ показал, что чистота инсулина составляла не менее 98% .
Источники информации
1. Brandenburg D, Wоllmеr А. Iпsuliп: сhеmistrу, stгасturе, and function оf iпsuliп апd rеlаtеd hоrmопеs : рrосееdiпgs оf thе Second Intemational Insulin Sуmроsiшп, Аасhеп, Gеrmапу, Sерtеmbеr 4-7, 1979. Рublishеr: Nеw Yоrk : W. dе Gгауtеr, 1980.
2. Fisсhеr M, Fуtlоvitсh S, Аrøit В, Wоrtzеl А, Весk Y. А сопstitutivе ехрrеssiоп vесtоr sуstеm drivеп bу thе dео P1P2 рrоmоtеrs оf Еsсhеriсhiа соli. Аррl Мiсrоbiоl Вiоtесhпоl. 1990, 33: 424-8.
3. Dаvidsоп HW, Rhоdеs CJ, Hutton JC. Iпtrаоrgапеllаr саlсium апd рН сопtrоl рrоiпsuliп сlеаvаgе iп thе рапсrеаtiс bеtа сеll viа twо distiпсt sitе-sресifiс епdорерtidаsеs. Nаturе, 1988,333 :93-96.
4. Маrkussеп J. Ншпап iпsuliп bу trурtiс trапsрерtidаtiопs оf роrсiпе iпsuliп апd biоsупthеtiс рrесursоrs. Воstоп : MTP Рrеss, 1987.
5. Сhапсе RE, Кrоеff EP, Hoftmann JA, Frапk BH. Сhеmiсаl, рhуsiсаl, апd biоlоgiс рrореrtiеs оf biоsупthеtiс hшпап iпsuliп. Diаbеtеs Саге, 1981,2:147-54. 6. ТЫm L, Hansen MT, Nоrris К, Ноеgh I, Воеl E, Fоrstrоm J, Аmmеrеr G, and Fiil NP. Secretion and Processing of Insulin Рrесursоrs iп Yеаst. PNAS, 1986, 83: 6766-6770.
7. Cousens LS, Shustеr JR, Gаllеgоs С, Ku LL, Stempien MM, Urdеа MS, Sапсhеz-Реsсаdоr R, Тауlоr А, Текаmр-Оlsоп P. Нigh lеvеl ехрrеssiоп оf рrоiпsuliп iп thе уеаst, Sассhаrоmусеs сеrеvisiае. Gепе, 1987, 61:265-275.
8. Соwlеу DJ, Маскiп RB. Ехрrеssiоп, рurifiсаtiоп апd сhаrасtеrizаtiоп оf rесоmbiпапt hшпап рrоiпsuliп. FEBS Lеttеrs, 1997, 402: 124-130
9. Лазарев ОП, Лесик Ш, Костецький IG, Лiсовський IЛ, Рибачук BM, Стадник BI. Спосiб одержання рекомбiнантного iнсулiну людини Патент Украϊни JVfо 76661, C12N 15/17, C12N 1/21, публ. 2006.
10. Le Lау J, Маtsuоkа ТА, Henderson and Stein R. Idепtifiсаtiоп оf а поvеl PDX-I biпdiпg sitе iп thе humап iпsuliп gепе епhапсеr J. Вiоl. Сhеm., 2004, 279: 22228-22235.
11. Grапthаm R, Gаutiеr С, Gоuу M. Соdоп frеquепсiеs iп 119 iпdividuаl gепеs сопfirm сопsistепt сhоiсеs оf dеgепеrаtе bаsеs ассоrdiпg tо gепоmе tуре. Nuсlеiс Асids Res.,1980, 8:1893-1912.
12. Ikеmurа T T. Соrrеlаtiоп bеtwееп thе аbuпdапсе оf Еsсhеriсhiа соli trапsfеr RNAs апd thе оссurrепсе оf thе rеsресtivе соdопs iп its рrоtеiп gепеs: а рrороsаl fоr а sупопуmоus соdоп сhоiсе thаt is орtimаl fоr thе E. соli trапslаtiопаl sуstеm. J. MoI. Вiоl., 1981, 151:389-409.
13. Sаmbrооk J, Fritsсh E F апd Мапiаtis T. Моlесulаr Сlопiпg: А Lаbоrаtоrу Мапuаl, 2пd еditiоп, CoId Sрriпg Наrbоr Lаbоrаtоrу Рrеss, 1989.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения рекомбинантного инсулина человека путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует проинсулин, получения и культивирования штама-продуцента гибридного белка Еsсhеriсhiа соli, выделения и дезинтеграции клеток, выделения гибридного полипептида, его ферментативного расщепления со следующей очисткой и получением целевого продукта, который отличается тем, что участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, есть в составе експрессирующих векторов pIK8-proins, или pMUT12, или pISYN2, или рСIМбl, или pDIM07, или представляет собой последовательность ДНК, которая гибридизирует с одной из вышеуказанных ДНК вставок и которые кодируют экспрессию предшественника проинсулина человека, а участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный белок с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью пдазмиды pIK8-proins и имеет следующую структуру:
ι АТGGGСАGСАGССАТСАТСАТСАТСАТСАСАGСАGСGGССТGGТGССGСGСGGСАGССАТ
1 М G S S Н Н Н Н Н Н S S G L V Р R G S Н
61 АТGСGСТТТGТGААССААСАССТGТGСGGСТСАСАССТGGТGGААGСТСТСТАССТАGТG 21 М R F V N Q Н L С G S Н L V Е А L Y L V
121 ТGСGGGGААСGАGGСТТСТТСТАСАСАСССААGАСССGССGGGАGGСАGАGGАССТGСАG 41 С G Е R G F F Y Т Р К Т R R Е А Е D L Q
181 GТGGGGСАGGТGGАGСТGGGСGGGGGСССТGGТGСАGGСАGССТGСАGСССТТGGСССТG 61 V G Q V Е L G G G Р G А G S L Q Р L А L
241 GАGGGGТСССТGСАGААGСGТGGСАТТGТGGААСААТGСТGТАССАGСАТСТGСТСССТС 81 Е G S L Q К R G I V Е Q С С Т S I С S L
301 ТАССАGСТGGАGААСТАСТGСААСТАG 101 Y Q L E N Y C N * , участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный белок с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью плазмиды pMUT12 и имеет следующую структуру:
1 АТGGGСАGСАGССАТСАТСАТСАТСАТСАСАGСАGСGGССТGGТGССGСGСGGСАGССАТ 1 М G S S Н Н Н Н Н Н S S G L V Р R G S Н
61 АТGСGСТТТGТGААССААСАССТGТGСGGСТСАСАССТGGТGGААGСТСТСТАССТАGТG 21 М R F V N Q Н L С G S Н L V Е А L Y L V
121 ТGСGGGGААСGАGGСТТСТТСТАСАСАСССААGАССААGСGТGGСАТТGТGGААСААТGС 41 С G Е R G F F Y Т Р К Т К R G I V Е Q С
181 ТGТАССАGСАТСТGСТСССТСТАССАGСТGGАGААСТАСТGСААСТАG 61 С Т S I С S L Y Q L Е N Y С N * ,
участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный белок с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью плазмиды pISYN2 и имеет следующую структуру:
1 АТGGGСАGСАGССАТСАТСАТСАТСАТСАСАGСАGСGGССТGGТGССGСGСGGСАGССАТ 1 М G S S Н Н Н Н Н Н S S G L V Р R G S Н
61 АТGСGСТТТGТGААССАGСАТСТGТGТGGСАGССАССТGGТGGААGСGСТGТАТТТАGТG 21 М R F V N Q Н L С G S Н L V Е А L Y L V
121 ТGСGGСGАGСGТGGСТТСТТТТАТАССССGААААССАААСGТGGСАТТGТGGААСАGТGТ 41 С G Е R G F F Y Т Р К Т К R G I V Е Q С
181 ТGСАССАGТАТТТGТАGССТGТАТСАGСТGGААААТТАСТGСААСТАА 61 С Т S I С S L Y Q L Е N Y С N * ,
участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный белок с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью плазмиды рСIМбl и имеет следующую структуру:
1 АТGСGАААGААGСGGААGААGААGСGТТТТGТGААССАGСАТСТGТGТGGСАGССАССТG 1 М R К К R К К К R F V N Q Н L С G S Н L
61 GТGGААGСGСТGТАТТТАGТGТGСGGСGАGСGТGGСТТСТТТТАТАССССGААААССААА 21 V Е А L Y L V С G Е R G F F Y Т Р К Т К 121 CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTAC
41 R G I V Е Q С С Т S I С S L Y Q L Е N Y
181 TGCAACTAA
61 C N * ,
участок рекомбинантной плазмидной ДНК, которая кодирует гибридный белок с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, является частью плазмиды pDIM07 и имеет следующую структуру:
1 АТGGАТGААGАСGАGGАТGААGСАСGСТТТGТGААССАGСАТСТGТGТGGСАGССАССТG 1 М D Е D Е D Е А R F V N Q Н L С G S Н L
61 GТGGААGСGСТGТАТТТАGТGТGСGGСGАGСGТGGСТТСТТТТАТАССССGААААССААА 21 V Е А L Y L V С G Е R G F F Y Т Р К Т К
121 СGТGGСАТТGТGGААСАGТGТТGСАССАGТАТТТGТАGССТGТАТСАGСТGGААААТТАС 41 R G I V Е Q С С Т S I С S L Y Q L Е N Y
181 TGCAACTAA 61 C N * .
2. Способ по п. 1, который отличается тем, что стадию создания штаммов Еsсhеriсhiа соli осуществляют с использованием плазмидних векторов, что содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует один или несколько рекомбинантных полипептидов, при этом транскрипция указанной нуклеотидной последовательности, которая кодирует один или несколько полипептидов, находится под контролем индуктируемой системы экспрессии, потом осуществляют культивирование трансформируемых штаммов Еsсhеriсhiа соli но индуктирование системы экспрессии для синтеза рекомбинатноrо полипептида или полипептидов в клетках Еsсhеriсhiа соli, и выделение рекомбинантного полипептида или продуцируемых полипептидов.
3. Способ по п. I9 который отличается тем, что выделение и дезинтеграция клеток, выделение гибридного полипептида осуществляют путем разрушения бактериальной клетки или фрагментов клеток, сепарации с одновременным отмыванием осадка неионним детергентом, а выделение гибридного полипептида включает растворение с денатурирующим реагентом, обработку гибридного полипептида восстанавливающим агентом, рефолдинг гибридного полипептида и его концентрирования методом абсорбционной хроматографии или ультрафильтрации.
4. Способ по п. I9 который отличается тем, что ферментативное расщепление гибридного полипептида осуществляют трипсином и карбоксипептидазой одновременно или последовательно с использованием преимущественно очистки продуктов ферментативной конверсии с помощью ионообменной хроматографии.
5. Способ по п. 1, который отличается тем, что очистку инсулина после ферментативного расщепления осуществляют с помощью ионообменной хроматографии и/или высокоэффективной жидкостной хроматографии.
зз
PCT/UA2009/000025 2008-11-26 2009-06-16 Способ получения рекомбинантного инсулина человека WO2010062279A1 (ru)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009801545154A CN102282260A (zh) 2008-11-26 2009-06-16 用于制备人重组胰岛素的方法
EA201100781A EA201100781A1 (ru) 2008-11-26 2009-06-16 Способ получения рекомбинантного инсулина человека
EP09829420A EP2374888A4 (en) 2008-11-26 2009-06-16 PROCESS FOR PRODUCING RECOMBINANT HUMAN INSULIN
BRPI0920482-2A BRPI0920482A2 (pt) 2008-11-26 2009-06-16 método para produção de insulina recombinante humana
CA2746984A CA2746984A1 (en) 2008-11-26 2009-06-16 Method for preparing of human recombinant insulin
US13/116,822 US20120058513A1 (en) 2008-11-26 2011-05-26 Method for producing human recombinant insulin

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAA200813678 2008-11-26
UAA200813678A UA91281C2 (ru) 2008-11-26 2008-11-26 Способ получения рекомбинантного инсулина человека

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/116,822 Continuation US20120058513A1 (en) 2008-11-26 2011-05-26 Method for producing human recombinant insulin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010062279A1 true WO2010062279A1 (ru) 2010-06-03

Family

ID=42225939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/UA2009/000025 WO2010062279A1 (ru) 2008-11-26 2009-06-16 Способ получения рекомбинантного инсулина человека

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20120058513A1 (ru)
EP (1) EP2374888A4 (ru)
CN (1) CN102282260A (ru)
BR (1) BRPI0920482A2 (ru)
CA (1) CA2746984A1 (ru)
EA (1) EA201100781A1 (ru)
UA (1) UA91281C2 (ru)
WO (1) WO2010062279A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2447149C1 (ru) * 2011-03-24 2012-04-10 Винсорт Менеджемент Инк РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pMSIN4, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД - ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ BL21(DE3)/pMSIN4-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
WO2012152439A1 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 Glucometrix Ag Comprehensive buffer system for renaturing human proinsulin or proinsulin derivatives

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014099577A1 (en) * 2012-12-17 2014-06-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for purifying insulin and analogues thereof
BR112015031277A2 (pt) 2013-06-14 2017-09-19 Harvard College Moduladores do receptor de insulina de polipeptídeos estabilizados, análogos de insulina, composições farmacêuticas compreendendo os referidos polipeptídeos e métodos de preparação e usos dos mesmos
WO2015066345A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 NorthStar Medical Radioisotopes LLC Separator cartridge for radionuclide
CN103694339B (zh) * 2013-12-04 2017-10-13 珠海联邦制药股份有限公司 一种甘精胰岛素前体的复性方法
WO2016144658A1 (en) * 2015-03-10 2016-09-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for preparing recombinant insulin using microfiltration
US20180291077A1 (en) * 2015-09-24 2018-10-11 Hanmi Pharm. Co., Ltd Method of insulin production

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA76661C2 (en) 2005-04-06 2006-08-15 Omakooe Ltd Liability Company A method for producing recombinant humanæs insulin

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
KR100253916B1 (ko) * 1997-12-29 2000-05-01 김충환 사람 인슐린 전구체의 제조방법
US20060035316A1 (en) * 2002-11-12 2006-02-16 Sang-Yong Lee Plasmids expressing human insulin and the preparation method for human insuling thereby

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA76661C2 (en) 2005-04-06 2006-08-15 Omakooe Ltd Liability Company A method for producing recombinant humanæs insulin

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRANDENBURG D, WOLLMER A: "Second International Insulin Symposium, Aachen, Germany", 4 September 1979, W. DE GRUYTER, article "Insulin: chemistry, structure, and function of insulin and related hormones"
CHANCE RE, KROEFF EP, HOFFMANN JA, FRANK BH: "Chemical, physical, and biologic properties of biosynthetic human insulin", DIABETES CARE, vol. 2, 1981, pages 147 - 54
COUSENS LS, SHUSTER JR, GALLEGOS C, KU LL, STEMPIEN MM, URDEA MS, SANCHEZ-PESCADOR R, TAYLOR A: "Tekamp-Olson P. High level expression of proinsulin in the yeast, Saccharomyces cerevisiae", GENE, vol. 61, 1987, pages 265 - 275
COWLEY DJ, MACKIN RB: "Expression, purification and characterization of recombinant human proinsulin", FEBS LETTERS, vol. 402, 1997, pages 124 - 130
DAVIDSON HW, RHODES CJ, HUTTON JC: "Intraorganellar calcium and pH control proinsulin cleavage in the pancreatic beta cell via two distinct site- specific endopeptidases", NATURE, vol. 333, 1988, pages 93 - 96
FISCHER M, FYTLOVITCH S, AMIT B, WORTZEL A, BECK Y: "A constitutive expression vector system driven by the deo P1P2 promoters of Escherichia coli", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 33, 1990, pages 424 - 8
GRANTHAM R, GAUTIER C, GOUY M: "Codon frequencies in 119 individual genes confirm consistent choices of degenerate bases according to genome type", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 8, 1980, pages 1893 - 1912
IKEMURA T T: "Correlation between the abundance of Escherichia coli transfer RNAs and the occurrence of the respective codons in its protein genes: a proposal for a synonymous codon choice that is optimal for the E. coli translational system", J. MOL. BIOL., vol. 151, 1981, pages 389 - 409
LE LAY J, MATSUOKA TA, HENDERSON, STEIN R: "Identification of a novel PDX-1 binding site in the human insulin gene enhancer", J. BIOL. CHEM., vol. 279, 2004, pages 22228 - 22235
MARKUSSEN J.: "Human insulin by tryptic transpeptidations of porcine insulin and biosynthetic precursors", 1987, MTP PRESS
SAKODYNSKY K.I. ET AL.: "Analiticheskaya khromatografiya", M., KHIMIYA, 1993, pages 195 - 205 *
SAMBROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP2374888A4 *
SKOUPS R.: "Metody ochistki belkov", M., "MIR", 1985, pages 237 - 239 *
THIM L, HANSEN MT, NORRIS K, HOEGH I, BOEL E, FORSTROM J, AMMERER G, FIIL NP: "Secretion and Processing of Insulin Precursors in Yeast", PNAS, vol. 83, 1986, pages 6766 - 6770

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2447149C1 (ru) * 2011-03-24 2012-04-10 Винсорт Менеджемент Инк РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pMSIN4, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД - ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ BL21(DE3)/pMSIN4-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
WO2012152439A1 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 Glucometrix Ag Comprehensive buffer system for renaturing human proinsulin or proinsulin derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0920482A2 (pt) 2019-09-24
CA2746984A1 (en) 2010-06-03
UA91281C2 (ru) 2010-07-12
EP2374888A4 (en) 2012-06-06
CN102282260A (zh) 2011-12-14
US20120058513A1 (en) 2012-03-08
EP2374888A1 (en) 2011-10-12
EA201100781A1 (ru) 2012-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2010062279A1 (ru) Способ получения рекомбинантного инсулина человека
CA2605140C (en) Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein
CN111072783B (zh) 一种采用大肠杆菌表达串联序列制备glp-1或其类似物多肽的方法
US8298789B2 (en) Orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH) (1-34)
JP2008521415A (ja) カルボキシ末端をアミド化したペプチドの製造方法
AU607973B2 (en) Process for production of physiologically active peptide containing cysteine residue
CN113105536B (zh) 一种新甘精胰岛素原及其制备甘精胰岛素的方法
WO2020051812A1 (zh) 一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法
US10000544B2 (en) Process for production of insulin and insulin analogues
WO2007112677A1 (fr) Procédé de préparation d'hormone parathyroïdienne humaine 1-34
JP2637393B2 (ja) プロインシュリンおよびプレプロインシュリン産生暗号を有するヒト遺伝子
CN111303275A (zh) 一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用
EP1001980A1 (en) Recombinant expression of insulin c-peptide
WO1997001627A1 (en) High-level expression and efficient recovery of ubiquitin fusion proteins from escherichia coli
Liu et al. Large scale preparation of recombinant human parathyroid hormone 1–84 from Escherichia coli
CN106749615A (zh) 一种大菱鲆生长催乳素sl基因、重组蛋白及其制备方法
CN113249288B9 (zh) 一种表达glp-1类似物的重组菌及其应用
RU2447149C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pMSIN4, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД - ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ BL21(DE3)/pMSIN4-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
CN114933658A (zh) 一种短肽元件及其应用方法
WO2009054754A1 (fr) Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine
JP4886654B2 (ja) ヒト成長ホルモンの効率化された製造方法
WO2020053875A1 (en) Process for producing recombinant peptides
CN116217699A (zh) 一种高效表达羊生长激素的方法
WO2016034534A1 (en) Lysine rich basic pre-sequences

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980154515.4

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09829420

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009829420

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2746984

Country of ref document: CA

Ref document number: 201100781

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2617/KOLNP/2011

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 001387-2011

Country of ref document: PE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: PI0920482

Country of ref document: BR

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01D

Ref document number: PI0920482

Country of ref document: BR

Free format text: O PRESENTE PEDIDO FOI DEPOSITADO ATRAVES DO PCT/UA2009/000025 EM 16/06/2009, DANDO ENTRADA NA FASE NACIONAL EM 26/07/2011, APESAR DO PRAZO EXPIRAR EM 26/05/2011 (30 MESES CONTADOS DA DATA DE PRIORIDADE QUE E 26/11/2008). O DEPOSITANTE SOLICITOU CONCESSAO DE PRAZO ADICIONAL OU RESTABE NA FORMA DA RESOLUCAO 254 DE 13 DE JULHO DE 2010, JUSTIFICANDO QUE POR MOTIVO TOTALMENTE IMPREVISTO, ALHEIO A VONTADE DA PARTE, NAO FOI POSSIVEL REALIZAR O DEPOSITO DENTRO DO PRAZO. O REQUERENTE ALEGA QUE, "DEVIDO A PESSIMAS CONDICOES CLIMATICAS E DE UM FURACAO QUE CAUSOU A PERDA DE ENERGIA ELETRICA EM DIVERSAS REGIOES DA UCRANIA, NAO FOI POSSIVEL DEPOSITAR O PEDIDO NO PRAZO LEGAL". COM BASE NO CODIGO CIVIL E NO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0920482

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20110726