WO2010062144A2 - 에타크리닉 산을 포함하는 트란스글루타미나제 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 그를 이용하는 트란스글루타미나제 관련 질환 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

에타크리닉 산을 포함하는 트란스글루타미나제 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 그를 이용하는 트란스글루타미나제 관련 질환 예방 또는 치료 방법 Download PDF

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이병일
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Definitions

  • the present invention relates to transglutaminase inhibitors comprising ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and more particularly, the action of transglutaminase involved in the pathological mechanism of disease in the case of aberrant expression.
  • a transglutaminase inhibitor comprising an ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof for inhibiting and a novel use thereof.
  • Transglutaminase is an enzyme that cross-links proteins and is widely distributed in nature such as animals, plants, and microorganisms. When transglutaminase acts on protein molecules, cross-links are formed by acyl exchange reactions, cross-reactions and deamination reactions, and these bonds have specific effects on gel formation, thermal stability and hydration ability of proteins. Transglutaminase is an enzyme that acts as a protective agent for blood clotting and wound healing under normal circumstances. However, if the expression is not being controlled has been known to play a major role in the pathologic mechanisms of many diseases (Review Soo-Youl Kim:. New Target Against Inflammatory Diseases: Transglutaminase 2. Archivum Immunologiae & Therapiae Experimentalis 52, 332- 337, 2004).
  • transglutaminase is increased in diseases with inflammation, and examples of such diseases include chronic inflammatory diseases such as degenerative arthritis, diabetes mellitus, autoimmune myositis, arteriosclerosis, stroke, cirrhosis, malignant breast cancer, Alzheimer's, Parkinson's disease, Huntington's disease, meningitis, inflammatory gastric ulcer and sepsis.
  • chronic inflammatory diseases such as degenerative arthritis, diabetes mellitus, autoimmune myositis, arteriosclerosis, stroke, cirrhosis, malignant breast cancer, Alzheimer's, Parkinson's disease, Huntington's disease, meningitis, inflammatory gastric ulcer and sepsis.
  • NF- ⁇ B and transglutaminase were observed in metastasis, chemo-resistance and radio-resistance of cancer.
  • transglutaminase 2 induces nitric oxide synthesis in BV-2 microglia Biochem Biophys Res Commun 323, 1055-1062, 2004;.. Jongmin Lee, Yoon-Seong Kim, Dong-Hee Choi, Moon S. Bang, Tay R. Han, Tong H. Joh, and Soo-Youl Kim.Transglutaminase 2 induces NF- ⁇ B activation via a novel pathway in BV-2 microglia.J. Biol. Chem. 279, 53725-53735, 2004).
  • NF- ⁇ B transcriptional substance
  • the pathway of activation of NF- ⁇ B was known to be the activation of kinase following the signal transduction system, but the activation of kinase inhibitors was reduced as it was confirmed that activation of NF- ⁇ B could occur without the help of kinase (Tergaonkar et al., IkappaB kinase-independent IkappaBalpha degradation pathway: functional NF-kappaB activity and implications for cancer therap.Mol Cell Biol. 2003 Nov; 23 (22): 8070-83).
  • transglutaminase can cross-link I- ⁇ B ⁇ to activate NF- ⁇ B without the help of kinases (IKK, NAK) (Jongmin Lee, et al. Transglutaminase 2 induces NF- ⁇ B activation via a novel pathway in BV-2 microglia.J. Biol. Chem. 279, 53725-53735, 2004).
  • transglutaminase is a calcium-dependent enzyme, NF- ⁇ B can be activated only by increasing calcium in cells.
  • NF- ⁇ B transcription factor which is the inflammatory factor including transglutaminase and its inhibitor, I- ⁇ B ⁇ , which normally inhibits NF- ⁇ B by I- ⁇ B ⁇ . No continuous activity occurs. However, NF- ⁇ B continues to be activated in chronic inflammatory diseases.
  • An interesting phenomenon is that the expression of transglutaminase is induced by the activity of NF- ⁇ B by TNF- ⁇ or lipopolysaccharide (LPS). Therefore, abnormally activated transglutaminase is expected to play a role in sustaining inflammation by directly activating NF- ⁇ B in inflammatory cells or by retaining more activated NF- ⁇ B. Suggested.
  • NF- ⁇ B activation of NF- ⁇ B is believed to produce I- ⁇ B ⁇ to inhibit NF- ⁇ B and induce transglutaminase inhibitors to prevent a vicious cycle of NF- ⁇ B activation by transglutaminase.
  • inflammation may be continuously induced by inflammatory cells due to continuous activation of NF- ⁇ B by transglutaminase.
  • these malignant circuits may cause cancer metastasis and drug resistance in cancer tissues (Jongmin Lee, et al. Transglutaminase 2 induces NF- ⁇ B activation via a novel pathway in BV-2 microglia. J. Biol Chem. 279, 53725-53735, 2004).
  • the inhibitor of transglutaminase may act as an important substance that breaks the continuous ring of NF- ⁇ B and may improve inflammatory disease, and the transglutata prepared by the present inventors with the peptide reported in the above-mentioned literature. It is assumed that the effect of replacing steroid agents with a minase inhibitor is based on this fact (Sohn, J., Kim, T.-I., Yoon, Y.-H., and kim, S.-Y. Transglutaminase Inhibitor: A New Anti-Inflammatory Approach in Allergic Conjunctivitis. J. Clin. Invest. 111, 121-8, 2003).
  • An amine compound is known as a substance that inhibits transglutaminase activity.
  • cystamine nature Genetics 18, 111-117, 1998; Nature Medicine 8, 143-149, 2002
  • Putrescine Putrescine. See also monodansylcadaverine (J.Med. Chem. 15, 674-675, 1972), w-dibenzylaminoalkylamine (J.Med. Chem. 18, 278-284,1975. ), 3-halo-4,5-dihydroisoxazole (Mol. Pharmacol. 35, 701-706,1989) have been developed. Toxicity is known to cause nonspecific inhibition of other enzymes.
  • Anti-flammin protein PHA2 inhibitor
  • protein called elafin a very powerful transglutaminase substrate, Nara, K., et al. 1994.
  • Elastase inhibitor elafin is a new type proteinase inhibitor which has a transglutaminase-mediated anchoring seuence termed "cememtoin”. J Biochem (Tokyo). 115: 441-448) was used to synthesize a peptide that mimics the transglutaminase catalytic site.
  • transglutaminase is increased in diseases with inflammation, and examples of such diseases are chronic inflammatory diseases such as degenerative arthritis, diabetes, autoimmune myositis, arteriosclerosis, stroke, liver cirrhosis, malignant breast cancer, and meningitis. , Inflammatory gastric ulcer and sepsis.
  • Ethacrynic acid (2- [2,3-dichloro-4- (2-methylidenebuanoyl) phenoxy] acetic acid) is a ring diuretic used for edema caused by hypertension, congestive heart failure, and liver and kidney failure. Unlike other ring diuretics, ethacrynic acid is not sulfonamide and is not related to sulfur allergic reactions. Ethacrynic acid is a phenoxyacetic acid derivative having a ketone group and a methylene group.
  • the present inventors attempted to select a drug whose mechanism is not well known among the drugs already recognized for safety and commercialized, to identify the mechanism and to find a new use using the same, and to screen useful substances among them as a transglutaminase inhibitor.
  • the activity of ethacrynic acid as a transglutaminase inhibitor was discovered and led to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating a disease caused by an increase in ethacrynic acid, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or transglutaminase activity using the same.
  • Another object of the present invention is to provide a method of treating a disease caused by an increase in transglutaminase activity using ethacrynic acid, a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • transglutaminase inhibitor and a method for inhibiting transglutaminase, comprising an ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the novel method of inhibiting transglutaminase using ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is a stable method for a subject with a disease in which transglutaminase is overexpressed, and is easily carried out without side effects. It can be applied to obtain the effect of inhibiting transglutaminase.
  • FIG. 1 shows transglutata of etacrynic acid, which measures transglutaminase binds [1,4, -14 C] putrescine to succinated casein and observed that ethacrynic acid inhibits its response. This is a graph of in vitro testing of the inhibition of aminase activity.
  • the present invention provides an activity of transglutaminase using ethacrynic acid, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a transglutaminase inhibitor using the same, and an ethacrynic acid as an active ingredient. It is about how to suppress.
  • Ethacrynic acid (2- [2,3-diclhlo-4- (2-methylidenebutanoyl) phenoxy] acetic acid), as described above, is a ring diuretic used for edema caused by hypertension and congestive heart failure, liver and kidney function do. Unlike other ring diuretics, ethacrynic acid is not sulfonamide and is not associated with sulfur allergic reactions. Ethacrynic acid is a phenoxyacetic acid derivative having a ketone group and a methylene group.
  • the molecular formula of the ethacrynic acid is C 13 H 12 Cl 2 O 4 , the molecular weight is 303.14 and the structural formula is as follows.
  • the ethacrynic acid used in the present invention may be synthesized, but the synthesis and the resulting separation purification can be obtained according to a known method. In addition to the manufacture of such ethacrynic acid, it is possible to use commercially available medicines and raw materials of medicines.
  • transglutaminase inhibitor according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable salt of ethacrynic acid.
  • transglutaminase binds [1,4, -14 C] putrescine to succinylate casein so that the ethacrynic acid reacts with it.
  • ethacrynic acid was added to the reaction of transglutaminase that binds 14 C-labeled putrescine with succinylated casein in vitro, the activity of transglutaminase was induced by ethacrynic acid. It decreased with increasing concentration of (Fig. 1).
  • the etacrynic acid is an inhibitor of transglutaminase, and it can be seen that the ethacrynic acid can be used to reduce the activity of the increased transglutaminase when the transglutaminase is overexpressed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating a disease caused by an increase in the activity of transglutaminase comprising ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and ethacrynic acid or a medicament thereof. It relates to a method of treating the disease using a pharmaceutically acceptable salt.
  • prevention refers to any drug that inhibits or delays the development of any disease due to an increase in the activity of transglutaminase by administration of a composition comprising ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • treatment means any action that ameliorates or beneficially alters all diseases resulting from increased activity of transglutaminase by administration of the pharmaceutical composition.
  • the disease caused by the increase of transglutaminase activity includes all diseases caused by increased activity such as overexpression of transglutaminase, but specifically includes neurological disease, inflammatory disease and cancer.
  • transglutaminase is increased in diseases with inflammation, such as chronic inflammatory diseases such as degenerative arthritis, autoimmune myositis, arteriosclerosis, stroke, liver cirrhosis, malignant breast cancer, meningitis, inflammatory gastric ulcer And sepsis.
  • chronic inflammatory diseases such as degenerative arthritis, autoimmune myositis, arteriosclerosis, stroke, liver cirrhosis, malignant breast cancer, meningitis, inflammatory gastric ulcer And sepsis.
  • Alzheimer's disease diseases related to the death or damage of nerve cells
  • diseases related to the death or damage of nerve cells in particular, Alzheimer's disease, multi-infarct dementia, a combination of Alzheimer's disease and multi-infarct dementia, Parkinson's disease, hypothyroidism, alcoholic dementia Alzheimer's, Huntington's disease, etc.
  • Central nervous system diseases due to damage and death of nervous system cells are representative.
  • the main symptoms of these diseases include disorders of cognitive function, language, judgment, abstraction, spatially perceptual gravity and other new skills acquisition, and symptoms of personality change, emotional instability, and eventually death.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for diseases in which the activity is increased, such as overexpression of transglutaminase in neural tissues.
  • ⁇ synuclein can be used in Parkinson's disease (PNAS, February 18, 2003. Vol. 100, no. 4, pp2047-2052), which is aggregated by transglutaminase, but is not limited thereto. It can be used for the treatment of any disease in which transglutaminase is overexpressed in nervous tissue.
  • transglutaminase In the case of cancer, the inhibition of transglutaminase is important in terms of cancer prevention and treatment, with a marked increase in the expression of transglutaminase in cancers having cancer metastasis, chemical resistance, and radiological resistance.
  • Specific cancers that can be prevented or treated using the pharmaceutical composition comprising the ethacrynic acid of the present invention are cancers in which an increase in transglutaminase is shown, specifically colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer, anal cancer, esophageal cancer , Pancreatic cancer, stomach cancer, kidney cancer, uterine cancer, breast cancer, lung cancer, lymph gland cancer, thyroid cancer, prostate cancer, leukemia, skin cancer, colon cancer, brain tumors, bladder cancer, ovarian cancer and gallbladder cancer, and the like.
  • compositions and methods of treatment comprising the ethacrynic acid of the present invention or pharmaceutically acceptable salts thereof include cows, horses, sheep, pigs, goats, humans, as well as humans who may develop diseases due to increased transglutaminase activity. It can also be used in mammals such as camels, antelopes, dogs and cats.
  • Ethacrynic acid of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a pharmaceutical composition using the same may be used as a single agent, or may be prepared and used as a complex including a recognized pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition comprising ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be prepared by filling the capsule comprising ethacrynic acid without excipients or uniformly and sufficiently in contact with the particulate solid carrier, liquid carrier or both. . Thereafter, if necessary, the product may be molded into a desired material.
  • suitable carrier excipients include starch, water, saline, ethanol, glycerol, Ringer's solution and dextrose solution, and the like, as disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, 19 th Ed., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA, et al. As can be formulated, it may be formulated into a suitable formulation known in the art.
  • the pharmaceutical composition comprising the ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention is applicable to any formulation containing ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, oral or parenteral. It can also be prepared for use.
  • the parenteral formulation may be in the form of a spray such as injectable, application or aerosol, preferably in the form of a spray such as injectable or aerosol, and oral formulations are also preferred.
  • Oral dosage forms comprising the pharmaceutical composition of the invention may be formulated, for example, in tablets, troches, lozenges, water-soluble or oily suspensions, prepared powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs. have.
  • binders such as cellulose or gelatin
  • excipients such as dicalcium phosphate, disintegrants such as corn starch or sweet potato starch, stearic acid
  • lubricating oils such as calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax, and in the case of capsules, it may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
  • parenteral administration is for injection such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, suppository injection method or aerosol for inhalation through the respiratory system.
  • the ethacrynic acid, its pharmaceutically acceptable salts or derivatives thereof are mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions which are formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • a composition for rectal administration such as suppositories or body enema including conventional suppository bases such as cocoa butter or other glycerides.
  • a propellant or the like may be combined with the additives to disperse the dispersed dispersion or wet powder.
  • compositions of the present invention may be administered in a conventional manner via rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, nasal, inhalation, intraocular or intradermal routes.
  • Parenteral administration means administration modes including intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, transdermal and intraarterial injection and infusion.
  • Parenteral administration of a pharmaceutical composition comprising an ethacrynic acid of the present invention may be carried out under the desired purity with a pharmaceutically acceptable carrier, i.e., a carrier which is nontoxic to the receptor and compatible with other formulation components at the concentrations and dosages employed. It is preferred to mix and formulate in dosage units.
  • the formulation preferably does not contain oxidizing agents and other compounds known to be harmful to the human body.
  • Ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention may be administered in a pharmaceutical composition together with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • a pharmaceutical composition together with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient may be based on the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet of the patient, time of administration, It is desirable to apply differently depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, the use of or with the specific composition, and various factors including drugs and similar factors well known in the pharmaceutical art. Suitable formulations known in the art are described in Remington's Pharmaceutical Science, 19 th Ed., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA. Therefore, the effective amount of ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the foregoing.
  • Transglutaminase measured the binding of [1,4, -14 C] putrescine to succinated casein and observed that ethacrynic acid inhibited the reaction.
  • Succinylated casein is purchased from Calbiochem (Cat. No. 573464), and 1 g of the powder is 50 ml of reaction buffer containing 5 mM DTT (0.1 M Tris-acetate, pH 8.0), 10 mM CaCl. 2 , 0.15 M NaCl, 1.0 mM EDTA). Store this solution in the Deep freezer before use.
  • [1,4,- 14 C] Putrescine dihydrochloride was purchased from GE HEalthcare (Cat. No. CFA301) and the stock solution was diluted with distilled water until the radiological dosage reached 5 ⁇ Ci / ml.
  • Transglutaminase 2 was purchased from Sigma-Aldrich (Cat. No.
  • ethacrynic acid was prepared by dissolving ethacrynic acid at a concentration of 10 mM in DMSO, and then diluted with DMSO to each concentration.
  • the substrate solution was prepared by mixing 450 ⁇ l of succinylated casein solution and 50 ⁇ l of [1,4, -14 C] putrescine dihydrochloride solution. Each sample was prepared by mixing 96 ⁇ l of reaction buffer, 3 ⁇ l of ethacrynic acid stock solution and 1 ⁇ l of transglutaminase stock solution. After incubating the sample at 37 ° C. for 10 minutes, 500 ⁇ l of substrate solution ⁇ and 100 ⁇ l of sample solution were mixed well and these mixtures were incubated at 37 ° C. for 2 hours. 4.5 ml of cold (4 ° C.) 7.5% TCA was added to stop the reaction and the entire solution was stored at 4 ° C. for 1 hour.
  • the TCA-protein precipitate was filtered through a GF / glass fiber filter, washed with 25 ml of cold 5% TCA and dried. Radioactivity of the crosslinked protein was measured by beta ( ⁇ ) -Counter (Beckman Coulter) and corrected with the activity of DMSO-control as a standard. The measured value is shown as the activity of transglutaminase. This experiment (assay) was repeated three times under the same conditions and the values are shown in Table 1 below.
  • IC 50 values were calculated by the general nonlinear regression method, which was determined to be 4.0078 ( ⁇ 0.5479) ⁇ M.
  • the relative transglutaminase inhibitory activity measured according to the concentration of ethacrynic acid is shown in FIG. 1. As shown in Figure 1, it can be seen that the activity of transglutaminase is inhibited depending on the concentration of ethacrynic acid.
  • transglutaminase inhibitors comprising ethacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition and a method of treatment that are effective in the treatment of diseases such as neurological diseases or cancers that occur when abnormal expression of transglutaminase by inhibiting the activity of transglutaminase.
  • the method of inhibiting transglutaminase inhibitor and transglutaminase comprising an etacrynic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention is a disease that abnormally expresses transglutaminase Eggplant can be easily applied to the subject without side effects in a more stable manner to obtain the effect of inhibiting transglutaminase.

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Abstract

본 발명은 에타크리닉 산 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 트란스글루타미나제 억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이상 발현의 경우 질병의 병리적 기전에 관여하는 트란스글루타미나제의 작용을 억제하기 위한 에타크리닉 산, 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 트란스글루타미나제 억제제와 이들의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 에타크리닉 산, 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 활성성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스글루타미나제 억제제 및 트란스글루타미나제의 억제방법을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 에타크리닉 산, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 그를 포함하는 트란스글루타미나제 억제제 및 그를 이용한 트란스글루타미나제 억제 방법은 트란스글루타미나제가 이상 발현되는 질환을 가진 대상에게 안전한 방법으로 부작용없이 용이하게 적용되어 트란스글루타미나제를 억제하는 효과를 얻을 수 있다.

Description

에타크리닉 산을 포함하는 트란스글루타미나제 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 그를 이용하는 트란스글루타미나제 관련 질환 예방 또는 치료 방법
본 발명은 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 트란스글루타미나제 억제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이상 발현의 경우 질병의 병리적 기전에 관여하는 트란스글루타미나제의 작용을 억제하기 위한 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 트란스글루타미나제 억제제와 이들의 신규한 용도에 관한 것이다.
트란스글루타미나제(Transglutaminase)는 단백질들을 교차 결합하는 효소로동물, 식물, 미생물 등 자연계에 널리 분포되어 있다. 트란스글루타미나제가 단백질 분자 등에 작용할 경우, 아실 교환반응, 교차반응 및 탈아미노반응 등에 의해 교차결합이 형성되며 이 결합은 단백질의 겔 형성, 열 안정성 및 수화능력 등에 특이한 영향을 미친다. 트란스글루타미나제는 정상적인 상황에서는 혈액 응고나 상처 치유 등의 보호적 작용을 하는 효소이다. 그러나, 그 발현이 조절 받지 못하는 경우에는 많은 질병의 병리적 기전에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(종설. Soo-Youl Kim : New Target Against Inflammatory Diseases: Transglutaminase 2.　 Archivum Immunologiae & Therapiae Experimentalis 52, 332-337, 2004).
특히, 염증을 동반하는 질병들에서 트란스글루타미나제의 발현이 많이 증가되며, 이러한 질병의 예로는 퇴행성 관절염과 같은 만성 염증 질환, 당뇨병, 자가면역근육염, 동맥경화, 뇌졸중, 간경화, 악성유방암, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅턴병, 뇌막염, 염증성 위궤양 및 패혈증 등이 있다. 또한, 암의 전이(metastasis), 화학적 내성(chemo-resistance), 방사선 내성(radio-resistance)에서도 NF-κB의 발현 및 트란스글루타미나제의 발현 증가가 관찰되었다.(Soo-Youl Kim, Transglutaminase 2 in inflammation. Front Biosci. 11, 3026-3035,2006).
아직까지 암의 화학적 내성과 트란스글루타미나제가 어떻게 연관되어 있는지는 밝혀지지 않고 있으나, 화학적 내성을 가지는 유방암 세포주에 대해 트란스글루타미나제 발현을 억제하는 경우, 암세포가 항암제에 민감하게 반응하여 사멸되는 것으로 드러났다.(Antonyak et al., Augmentation of tissue tansglutaminase expression and activation by epidermal growth factor inhibit doxorubicin-induced apoptsis in human breast cancer cells. J Biol Chem. 2004 Oct 1; 279(40):41461-7.;Dae-Seok Kim et al. Reversal of Drug Resistance in Breast Cancer Cells by Transglutaminase 2 Inhibition and Nuclear Factor-KB Inactivation. Cancer Res. 2006. in press).
트란스글루타미나제의 분자적 병리기전이 최근에 밝혀짐으로써 트란스글루타미나제 억제에 대한 타당성이 한층 더 구체화되고 있다(Key Chung Park, Kyung Cheon Chung, Yoon-Seong Kim, Jongmin Lee, Tong H. Joh, and　 Soo-Youl Kim. Transglutaminase 2 induces nitric oxide synthesis in BV-2 microglia.　 Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 1055-1062, 2004; Jongmin Lee, Yoon-Seong Kim, Dong-Hee Choi, Moon S. Bang, Tay R. Han , Tong H. Joh, and Soo-Youl Kim. Transglutaminase 2 induces NF-κB activation via a novel pathway in BV-2 microglia.　 J. Biol. Chem. 279, 53725-53735, 2004).
염증의 복잡한 메커니즘이 완전히 밝혀지지는 않았지만 지금까지 알려진 바에 따르면 염증의 주반응경로는 NF-κB라는 전사 물질의 활성화에 기인한다. NF-κB의 활성경로는 신호 전달체계를 따르는 카이네이즈들의 활성화인 것으로 알려져 있었으나, 카이네이즈의 도움 없이도 NF-κB의 활성화가 일어날 수 있는 것으로 확인되면서 카이네이즈 억제제들의 실효성이 감소하게 되었다(Tergaonkar et al., IkappaB kinase-independent IkappaBalpha degradation pathway: functional NF-kappaB activity and implications for cancer therap. Mol Cell Biol. 2003 Nov;23(22):8070-83).
본 발명자는 NF-κB와 트란스글루타미나제의 발현이 염증에서도 증가하는 것을 발견하였고 염증 모델에서 그 메커니즘을 밝혀내게 되었다. 그 주요 메커니즘은 트란스글루타미나제가 카이네이즈들(IKK, NAK)의 도움없이 I-κBα를 교결합하여 NF-κB를 활성화시킬 수 있다는 것이다(Jongmin Lee, et al. Transglutaminase 2 induces NF-κB activation via a novel pathway in BV-2 microglia. J.Biol. Chem. 279, 53725-53735, 2004). 또한, 트란스글루타미나제는 칼슘의존성 효소이기 때문에 세포 내에서 칼슘의 증가만으로도 NF-κB는 활성화될 수 있다.
염증 반응에서 NF-κB 전사인자의 활성에 의해 처음으로 만들어지는 것은 트란스글루타미나제를 포함하는 염증성 인자들과 그 억제제인 I-κBα이므로, 정상적인 경우에는 I-κBα에 의해 NF-κB가 억제되어 연속적인 활성이 일어나지 않게 된다. 그러나 만성 염증질환에서는 NF-κB가 계속 활성화된다. 흥미로운 현상은 TNF-α나 LPS(lipopolysaccharide) 등에 의한 NF-κB의 활성으로 트란스글루타미나제의 발현이 유도된다는 사실이다. 따라서 비정상적으로 활성화된 트란스글루타미나제가 염증 세포에서 NF-κB를 직접 활성화시키거나, 활성화된 NF-κB를 더 유지시킴으로써 염증을 지속시키는 역할을 할 것으로 예상되며 이러한 가설을 토대로 하는 악순환의 고리를 제안하였다. 일반적으로 NF-κB의 활성화는 I-κBα를 생산하여 NF-κB를 억제하고 트란스글루타미나제 억제제를 유도하여 트란스글루타미나제에 의한 NF-κB 활성화의 악순환을 방지하는 것으로 추측된다. 하지만 이러한 항상성이 깨어진 경우에는 트란스글루타미나제에 의한 계속적인 NF-κB의 활성화로 인하여 염증세포에 의해 계속 염증이 유발될 수 있다. 또한, 이러한 악성 회로는 암 조직에서는 암의 전이와 약물저항성을 유발하는 원인이 될 수 있다(Jongmin Lee, et al. Transglutaminase 2 induces NF-κB activation via a novel pathway in BV-2 microglia. J.Biol. Chem. 279, 53725-53735, 2004).
따라서, 트란스글루타미나제의 억제제는 NF-κB의 연속 고리를 끊는 중요한 물질로 작용하여 염증 질환을 개선할 수 있을 것으로 보이며, 본 발명자에 의해 상기한 문헌에서 보고된 펩티드로 제조한 트란스글루타미나제 억제제의 스테로이드 제제를 대체할 만한 효과는 바로 이러한 사실에 근거한 것으로 추정된다(Sohn, J., Kim, T.-I., Yoon, Y.-H., and kim, S.-Y.: Transglutaminase Inhibitor: A New Anti-Inflammatory Approach in Allergic Conjunctivitis.J.Clin.Invest. 111, 121-8, 2003).
트란스글루타미나제 활성을 억제하는 물질로는 아민 화합물(amine compound)이 알려져 있으며, 대표적으로 시스타민(cystamine, nature Genetics 18, 111-117, 1998; Nature Medicine 8, 143-149, 2002)과 푸트레신(putrscine)이다. 또한 모노단실카다베린(monodansylcadaverine)(J.Med.Chem.15, 674-675, 1972),w-디벤질아미노알킬아민(w-dibenzylaminoalkylamine)(J.Med.Chem.18, 278-284,1975), 3-할로-4,5-디하이드로이소자졸(3-halo-4,5-dihydroisoxazole)(Mol.Pharmacol. 35, 701-706,1989)등의 화학적 억제제들이 개발되어 있으나, 모두 생체내에서 비특이적으로 다른 효소의 억제를 유발하는 독성이 알려져 있다.
따라서, 안전하고 효과적인 트란스글루타미나제 특이적인 억제제의 개발이 요구되고 있다. 최근에 손 등은 기니픽에서 꽃가루를 이용하여 유발한 눈 알러지 모델에서 펩티드로 만든 트란스글루타미나제 억제제를 투여해 스테로이드에 견줄 만한 효과를 얻는데 성공했다(Sohn, J., Kim, T.-I., Yoon, Y.-H., and Kim, S.-Y.; Transglutaminase inhibitor: A New Anti-Inflammatory Aproach in Allergic Cojunctivitis. J. Clin. Invest. 111, 121-8, 2003). 안티플라민(anti-flammin)단백질(PLA2 억제제)과 엘라핀(elafin)이라는 단백질(아주 강력한 트란스글루타미나제 기질, Nara, K., et al.1994. Elastase inhibitor elafin is a new type proteinase inhibitor which has a transglutaminase-mediated anchoring seuence termed "cememtoin". J Biochem(Tokyo).115:441-448)에서 트란스글루타미나제 촉매 부위를 흉내내어 합성한 펩타이드를 사용하였다. 특히 염증을 동반하는 질병들에서 트란스글루타미나제의 발현이 많이 증가 되며, 이러한 질병의 예로서 퇴행성 관절염과 같은 만성 염증 질환, 당뇨병, 자가 면역 근육염, 동맥경화, 뇌졸증, 간경화, 악성유방암, 뇌막염, 염증성 위궤양 및 패혈증 등이 있다.
상기한 화합물들 외에도 다른 화학적 억제제들이 개발되었지만 모두 생체적으로 이용되는 경우 비특이적인 다른 효소의 억제를 유발하는 독성이 알려지고 있는 실정이다. 본 발명자에 의해 이전에 제조된 펩티드 억제제가 트란스글루타미나제의 억제제로 유효하나(대한민국 특허출원 제10-2006-98921), 비용과 안전성면에서 실용화하는 데에는 여전히 해결해야 할 문제점들이 많이 남아 있다.
에타크리닉 산 (2-[2,3-dichloro-4-(2-methylidenebuanoyl) phenoxy]acetic acid)은 고리 이뇨제로서 고혈압과 울혈성 심장 기능 상실, 간장 및 신장 기능 상실에 의한 부종에 사용된다. 다른 고리 이뇨제들과는 달리 에타크리닉 산(ethacrynic acid)는 설폰아마이드(sulfonamide)가 아니므로 황에 의한 알레르기 반응과는 관련이 없다. 에타크리닉 산은 케톤기 및 메칠렌 기를 가지는 페녹시아세틱 산 유도체이다.
이에 본 발명자는 이미 안전성이 인정되어 상용화되고 있는 약물 중에서 메커니즘이 잘 알려지지 않은 의약품들을 선정하여 그 메커니즘을 규명하고 이를 이용하여 새로운 용도를 찾고자 시도하였고 이들 중에서 트란스글루타미나제 억제제로서 유용한 물질들을 스크리닝 한 결과, 에타크리닉 산의 트란스글루타미나제 억제제로서의 활성을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스글루타미나제 억제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 활성 성분으로 에타크리닉 산, 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 트란스글루타미나제의 억제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에타크리닉 산, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 그를 이용한 트란스글루타미나제 활성의 증가에 의해 초래되는 질병을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에타크리닉 산, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 을 사용하여 트란스글루타미나제 활성의 증가에 의해 초래되는 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 트란스글루타미나제 억제제 및 트란스글루타미나제의 억제 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 이용하여 트란스글루타미나제를 억제하는 신규한 방법은 트란스글루타미나제가 이상 발현되는 질환을 가진 대상에게 안정한 방법으로 부작용 없이 용이하게 적용되어 트란스글루타미나제를 억제하는 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 트란스글루타미나제가 [1,4,-14C]푸트레신을 숙시닐레이티드 카제인에 결합시키는 것을 측정하여, 에타크리닉 산이 그 반응을 억제하는 것을 관찰한 에타크리닉 산의 트란스글루타미나제 활성도 억제의 in vitro 시험에 대한 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 에타크리닉 산, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 그를 이용한 트란스글루타미나제 억제제와 활성 성분으로 에타크리닉 산을 사용하여 트란스글루타미나제의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
에타크리닉 산(2-[2,3-diclhlo-4-(2-methylidenebutanoyl)phenoxy]acetic acid)은 앞서 설명한 것처럼 고리 이뇨제로서 고혈압과 울혈성 심장 기능 상실, 간장 및 신장 기능 상실에 의한 부종에 사용된다. 다른 고리 이뇨제들과는 달리 에타크리닉 산은 설폰아마이드(sulfonamide)가 아니어서 황에 의한 알레르기 반응과는 관련이 없다. 에타크리닉 산은 케톤기와 메칠렌 기를 가지는 페녹시아세틱 산 유도체이다.
상기 에타크리닉 산의 분자식은 C13H12Cl2O4이며 분자량은 303.14이고 그 구조식은 다음과 같다.
화학식 1
Figure PCTKR2009007057-appb-C000001
본 발명에서 사용되는 에타크리닉 산은 합성된 것을 사용할 수도 있는데, 합성과 그에 따른 분리 정제는 공지의 방법에 따라 수득 될 수 있다. 또한, 이러한 에타크리닉 산은 직접 제조하는 것 외에 시판되는 의약품 및 의약품의 원료의 사용이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 트란스글루타미나제 억제제는 에타크리닉 산의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 트란스글루타미나제가 [1,4,-14C] 푸트레신(putrescine)을 숙시닐레이티트 카제인에 결합시키는 것을 측정하여, 에타크리닉 산이 그 반응을 억제하는 것을 관찰하였다. 시험관 내(in vitro)에서 14C로 표지된 푸트레신을 숙시닐레이티드 카제인과 결합시키는 트란스글루타미나제의 반응에 에타크리닉 산을 첨가하였을 때, 트란스글루타미나제의 활성은 에타크리닉 산의 농도가 증가할수록 감소 되었다(도 1). 따라서, 에타크리닉 산이 트란스글루타미나제의 억제제임을 알 수 있으며, 트란스글루타미나제가 과발현될 때 에타크리닉 산을 사용하여 증가 된 트란스글루타미나제의 활성을 줄일 수 있음을 알 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 트란스글루타미나제의 활성의 증가에 의한 질병을 예방, 치료하기 위한 약제학적 조성물과 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 사용하여 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 투여로 트란스글루타미나제의 활성의 증가로 인한 모든 질병의 발병을 억제시키거나 발생을 지연하는 모든 행위를 말하며, "치료"란 상기 약제학적 조성물의 투여로 트란스글루타미나제의 활성의 증가로 인한 모든 질병을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 트란스글루타미나제 활성의 증가에 의한 질병은 트란스글루타미나제가 과발현되는 등 그 활성이 증가 되어 초래되는 모든 질병을 포함하나, 구체적으로는 신경계 질환 및 염증 질환과 암을 포함한다.
염증을 동반하는 질병들에서 트란스글루타미나제의 발현이 많이 증가되며, 이러한 질병의 예로서 퇴행성 관절염과 같은 만성 염증 질환, 자가면역 근육염, 동맥경화, 뇌졸증, 간경화, 악성 유방암, 뇌막염, 염증성 위궤양 및 패혈증 등이 있다.
신경계 질환의 경우, 신경 세포의 사망 또는 손상과 관련된 질환으로 특히, 알츠하이머 질환, 다경색 치매, 알츠하이머 질환과 다경색 치매의 혼합형, 파킨슨씨 질환, 저갑상선증, 알코올성 치매 알츠하이머, 헌팅턴 병 등의 중추신경계 세포의 손상 및 사망에 따른 중추신경계 질환이 대표적이다. 이런 질병의 주요 증상은 인지 기능의 장애와 언어, 판단, 추상력, 공간지각적 중력 및 기타 새로운 기술 습득의 장애 등을 포함하며, 성격변화, 정서적 불안정 등의 증세가 나타나며 종국적으로는 사망에 이르게 된다. 이 중 본 발명의 약제학적 조성물은 신경 조직에서 트란스글루타미나제가 과발현되는 등 그 활성이 증가 된 질병에 쓰일 수 있는데, 구체적으로는 뇌에서 트란스글루타미나제가 과발현되는 헌팅턴 병(Nature Medicine, Vol 8.Number 2, February 2002 pp143-149), 소뇌와 대뇌 피질에서 트란스글루타미나제가 과발현되는 알츠하이머병(The Journal Chemistry, Vol. 274. No.43.Issue Of October 22, pp 30715-30721), α시누클레인(α synuclein)이 트란스글루타미나제에 의해 응집되는 파킨슨씨 병(PNAS, February 18, 2003.Vol. 100, no.4, pp2047-2052)등에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 신경조직에서 트란스글루타미나제가 과발현되는 모든 질병의 치료에 사용될 수 있다.
암의 경우, 암의 전이, 화학적 내성, 방사성 내성을 가지는 암에서 트란스글루타미나제의 현저한 발현 증가가 확인되면서, 트란스글루타미나제의 억제는 암 예방 및 치료 측면에서도 중요하다. 본 발명의 에타크리닉 산을 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 구체적 암은 트란스글루타미나제의 증가가 나타나는 암, 구체적으로는 대장암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 유방암, 폐암, 임파선암, 갑상선암,전립선암, 백혈병, 피부암, 결장암, 뇌종양, 방광암, 난소암 및 담낭암 등을 포함하고, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물 및 치료방법은 인간뿐만 아니라 트란스글루타미나제 활성의 증가로 인한 질병이 발생할 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 및 고양이 등의 포유동물에게도 사용될 수 있다.
본 발명의 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 그를 이용한 약제학적 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 약학 조성물을 포함하여 복합제로 제조하여 사용할 수도 있다.
에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물은 에타크리닉 산을 포함하는 캡슐에 부형제 없이 충전하거나 미립된 고체 담체, 액체 담체 또는 그 양자와 균일하게 충분히 접촉시켜 제조할 수 있다. 그 후에 필요한 경우 생성물을 바람직한 제재로 성형하여 사용할 수 있다. 적합한 담체 부형제의 예로서, 전분, 물, 식염수, 에탄올, 글리세롤, 링거액 및 덱스트로스 용액 등을 들 수 있으며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA)등에 개시되어 있는 바에 따라 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물은 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용으로도 제조할 수 있다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있으며, 바람직하게는 주사용 또는 에어로졸 등의 스프레이 형태이고, 경구용 제형 또한 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 경구 투여용 제형으로는 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화될 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물을 비경구로 투여하는 경우, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화 할 수 이싸. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 에타크리닉 산, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 그의 유도체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제한다. 좌제로 주입하기 위해서는 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장 투여용 조성물로 제제화 할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다. 본 발명의 에타크리닉 산을 포함하는 약제학적 조성물의 비경구 투여는 바람직한 순도 하에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 즉 사용되는 농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 담체와 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하는 것이 바람직하다. 특히 제제는 산화제 및 인체에 유해한 것으로 알려진 기타 다른 화합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 인간 환자에게 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물의 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해서 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용외는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19thEd., 1995, Mack Publishing Company, Easton PA)에 기재되어 있다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 하기 실시 예를 참조하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 한정되지는 않는다.
실시예1. 트란스글루타미나제 활성도 억제 in vitro 실험
트란스글루타미나제가 [1,4,-14C] 푸트레신을 숙시닐레이티드 카제인에 결합시키는 것을 측정하여 에타크리닉 산이 그 반응을 억제하는 것을 관찰하였다.
숙시닐화된 카제인은 Calbiochem(Cat.No.573464)로부터 구입하고, 상기 분말 1g을 5mM DTT를 포함하는 반응 완충용액 50ml(0.1M Tris-acetate(pH 8.0), 10mM CaCl2, 0.15M NaCl, 1.0mM EDTA)에 용해시켰다. 이 용액은 사용 전에 Deep freezer에 보관한다. [1,4,-14C] 푸트레신 디하이드로클로라이드는 GE HEalthcare(Cat. No. CFA301)로부터 구입했고, 그 스톡 용액(stock solution)을 방사선적 용량(radiological dosage)이 5μCi/ml에 달할 때까지 증류수로 희석하였다. 트란스글루타미나제 2는 Sigma-Aldrich(Cat.No.T5398)로부터 구입했고, 최종 농도가 1unit/ml가 되게 증류수로 희석했다. 에타크리닉 산의 스톡 용액은 에타크리닉 산을 DMSO에 10mM 농도로 녹여서 제조한 후 이를 DMSO로 희석하여 각각의 농도로 제조하였다.
기질 용액은 450μl의 숙시닐화된 카제인 용액 및 [1,4,-14C]푸트레신 디하이드로클로라이드 용액 50μl를 혼합하여 제조하였다. 각 샘플을 96μl의 반응 완충액, 3μl의 에타크리닉 산의 스톡 용액 및 1μl의 트란스글루타미나제 스톡 용액을 혼합하여 제조하였다. 10분 동안 37℃에서 샘플을 인큐베이션 한 후에, 기질 용액 β 500μl 및 샘플 용액 100μl을 잘 혼합하였고, 이들 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 4.5ml의 차가운(4℃) 7.5% TCA를 부가하여 반응을 정지시키고 전체 용액을 1시간 동안 4℃에서 보관하였다. TCA-단백질 침전물을 GF/유리섬유 필터로 여과하여 차가운 5% TCA 25ml로 세척하고 건조하였다. 가교된 단백질의 방사능을 베타(β)-카운터(Beckman Coulter)로 측정하고 표준으로서 DMSO-대조군의 활성을 가지고 보정하였다. 측정된 수치를 트란스글루타미나제의 활성으로 나타내었다. 동일한 조건 하에서 이러한 실험(어세이)을 세 번 반복하였으며 그 값은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
표 1
농도 어세이1 어세이2 어세이3 평균 SD(표준편차)
0.0μM 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.0000
5μM 0.5667 0.4572 0.4148 0.4796 0.0783
10μM 0.4319 0.3654 0.3281 0.3752 0.0526
25μM 0.2337 0.1812 0.1656 0.1935 0.0357
50μM 0.0763 0.0799 0.0645 0.0736 0.0080
또한, 그 평균값을 에타크리닉 산의 농도에 대하여 도시하였다. IC50 수치는 일반 비선형 회귀법에 의해 계산되었으며 이는 4.0078(±0.5479)μM로 결정되었다.
에타크리닉 산의 농도에 따라 측정된 상대적인 트란스글루타미나제 억제 활성을 도 1에 나타내었다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 트란스글루타미나제의 활성은 에타크리닉 산의 농도에 의존적으로 억제되는 것을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 트란스글루타미나제 억제제에 관한 것이다. 상기 발명은 트란스글루타미나제의 활성을 억제하여 트란스글루타미나제의 이상 발현시 나타나는 신경계 질환 또는 암 등과 같은 질병의 치료에 효과적인 약제학적 조성물 및 치료 방법을 제공하는 것이다. 따라서 본 발명에 따른 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 트란스글루타미나제 억제제 및 트란스글루타미나제의 억제방법 및 이에 따른 치료방법은 트란스글루타미나제가 이상 발현되는 질환을 가지는 대상에게 보다 안정한 방법으로 부작용 없이 용이하게 적용되어 트란스글루타미나제를 억제하는 효과를 얻을 수 있다.

Claims (11)

  1. 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 트란스글루타미나제의 활성 증가에 의해 초래되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 질병은 염증 질환, 암 또는 신경계 질환임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 암 전이 억제 효과가 있는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 염증 질환은 퇴행성 관절염과 같은 만성 염증 질환, 패혈증 및 자가면역 근육염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 신경계 질환은 알츠하이머 병, 헌팅턴 병 및 파킨슨씨 병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  6. 에타크리닉 산 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 이용하여 트란스글루타미나제의 활성을 억제하는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 트란스글루타미나제의 활성 증가에 의해 초래되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 질병은 염증 질환, 암 또는 신경계 질환임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 암전이 억제 효과가 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 염증 질환은 퇴행성 관절염과 같은 만성 염증 질환, 패혈증 및 자가면역 근육염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 신경계 질환은 알츠하이머 병, 헌팅턴 병 및 파킨슨씨 병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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