WO2010061142A2 - Composition pour retarder l'initiation tumorale de cellules cancéreuses chez un mammifère a risque - Google Patents

Composition pour retarder l'initiation tumorale de cellules cancéreuses chez un mammifère a risque Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an antitumor preventive composition capable of preventing the development of cancers in a patient at risk.
  • the present invention also relates to a method for preventing the development of cancer in a mammal at risk, as well as a kit for preventing the development of cancers.
  • Healthy cells which are the building blocks of tissue, grow, divide and renew in an orderly fashion. This process allows the body to maintain its balance. Sometimes, however, some cells lose their ability to control growth and begin to divide too quickly and grow disordered. They can then cause excess tissue (which will form a tumor) or, in the case of leukaemias, invade the bone marrow and then circulate in the blood. Malignant tumors can invade surrounding healthy tissues and organs. In addition, by passing through the blood or the lymphatic system, they can spread to other parts of the body to form new tumors (called metastases). Even if an initial cancerous tumor is eliminated, the disease can re-offend. This ability to spread throughout the body makes it essential to detect as early as possible any tumor and whether it is malignant.
  • genome-modifying risk factors such as mutations, or external risk factors such as feeding, irradiation or induction by an infectious agent, etc.
  • a complex system of control repairs this altered DNA. When a repair of this altered DNA is not possible, it is destroyed and the cell dies spontaneously. We talk about apoptosis. However, the alteration of certain genes in the control system (oncogenic or anti-oncogenic genes) will render the cell immortal (there is no more apoptosis). The cell will then reproduce by transmitting its altered genes to form a tumor.
  • cancer is the result of a multi-stage transformation, where a healthy cell becomes malignant after accumulating a number of alterations in the heart of its genes over time. But in some families undoubtedly more often affected by cancer than the general population, this quota of alterations is reached faster. Because the father or the mother, or both, are carriers of an anomaly favoring the appearance of the cancer, that they are likely to transmit to their descendants. In those who inherit this anomaly, one of the steps leading to the disease is taken from birth. So we are talking about predisposition.
  • One known way to treat cancer is cytotoxic chemotherapy.
  • alkylating agents alkylating agents
  • antimetabolites plant alkaloids
  • topoisomerase inhibitors topoisomerase inhibitors
  • antitumor antibiotics All of these drugs affect at some point mitosis or the synthesis and function of I 1 DNA.
  • Some new agents do not act directly on DNA. This is the case of a tyrosine kinase inhibitor, mesatinib mesylate, which directly targets a molecular abnormality in certain types of cancer (leukemia, colon cancer).
  • Other drugs modify the behavior of the tumor cells without directly attacking the cells. Hormones are used for this kind of adjuvant therapy.
  • the dosage of chemotherapy can be very difficult: a too low dose will be ineffective against the tumor, while at excessive dose the toxicity will be intolerable for the patient.
  • the dosage is adjusted to the "body surface" of the patient, approximated by a calculation based on its size and weight.
  • An object of the present invention is to provide a composition which avoids all or part of the aforementioned drawbacks.
  • the invention relates to an anti-tumor preventive composition
  • a pharmaceutically effective amount of at least one angiotensin II AT2 receptor antagonist for its application as a medicament for preventing the development of cancers in a mammal at risk.
  • the renin angiotensin system (ARS) is involved in many regulations. This system consists of three components: renin secreted by the kidney, angiotensinogen by the liver and angiotensin-converting enzyme (ACE), allowing the synthesis of angiotensin II.
  • ACE angiotensin-converting enzyme
  • This angiotensin II is an octapeptide that exerts its action. through two receivers, AT1 and AT2.
  • AT1 receptor stimulation promotes vasoconstriction, cell proliferation, and decreased apoptosis
  • AT2 receptor stimulation promotes vasodilatation, antiproliferative property, apoptosis regulation, which would oppose it to AT1 (functional balance between the stimulation of AT1 and AT2 receptors of angiotensin II).
  • AT2 receptors have only 32% homology with the AT1 receptors.
  • AT2 receptors bind with different subunits of G proteins. Hs activate other intracellular signaling pathways explaining the effects often opposed to those of AT1 receptors.
  • the present applicants have unexpectedly discovered that the blocking of the AT2 receptor of angiotensin II by an antagonist allowed, not the proliferation of cancer cells, but on the contrary to prevent, in a patient at risk, the development of these cancer cells.
  • risky patient we mean any subject having a genetic predisposition to a cancer or a subject who is at risk of cancer recurrence.
  • said angiotensin II AT2 receptor antagonist is capable of to delay the tumor initiation of cancer cells in said at-risk mammal and to inhibit angiogenesis in the environment of said cells.
  • Tumor initiation is an irreversible and rapid process by which DNA damage is produced and will be transmitted to the daughter cells.
  • tumor cells induce angiogenic factors that participate in neovascularization in the immediate environment of said cells.
  • AT2 receptor blockade can influence the production of pro or antiangiogenic factors, such as VEGF, TGF- ⁇ and / or TSPi.
  • the AT2 receptor antagonist of angiotensin II is selected from the following list: PD 123319, PD13177, PD126055, EXP801, L-159686, L-161638 or a mixture thereof, which are receptor-specific antagonists AT2.
  • AT2 receptor antagonist of angiotensin II is PD123319.
  • This compound which is marketed by Sigma-Aldrich or Tocris, has the following formula:
  • the cancer is bladder cancer, breast cancer, thyroid cancer, throat cancer, brain cancer, colon cancer, endometrial cancer, cancer of the breast.
  • the antitumor preventive composition is administered to the mammal at risk orally and / or by injection (intravenous, intramuscular or intratumoral) and / or topically.
  • the composition according to the invention can be used for the prevention of tumors in any mammal at risk.
  • the mammal at risk may be a healthy human subject, a human subject already suffering from another form of cancer, a human subject in cancer remission or a human subject whose family and genetic risks of developing cancer have been demonstrated.
  • the antitumor preventive composition may be used alone or applied in combination with an anticancer chemotherapy.
  • AT2R antagonists can thus enter the chemotherapy-treated cancer treatment protocols, in order to prevent the appearance of new tumors or to slow down tumor development by acting on cell proliferation and on associated angiogenesis. a very early stage of tumor development.
  • the dosage used to treat the mammal at risk is of the order of 0.4 to 10 mg / kg, preferably 1 to 5 mg / kg and even more preferably 2 to 5 mg / kg.
  • the present invention also relates to a method for preventing the development of cancers in a high-risk mammal comprising the step of applying an angiotensin II AT2 receptor antagonist to cells capable of mutating irreversibly so as to form cancer cells.
  • Said method may comprise the prior step of determining the angiotensin II AT2 receptor expression profile, for example by quantitative PCR or proteomic assay.
  • This prior step may in particular comprise the determination of markers indicative of the stage of tumor development. Said markers are preferably chosen from the factors
  • a method for diagnosing a predisposition to cancer in a mammal which comprises determining the expression profile of the AT2 receptor, overexpression said AT2 receptor being an indication of a predisposition to develop cancer, particularly lung and / or colon cancer, as shown in the examples below.
  • the present invention also relates to a kit for preventing the development of cancers, comprising:
  • At least one container comprising, in a pharmaceutically effective amount, at least one angiotensin II AT2 receptor antagonist, so as to prevent the development of cancers in a mammal at risk, (ii) optionally a pharmacologically acceptable carrier , and
  • the above kit may also comprise (iv) reagents for assaying the expression of the AT2 receptor and / or reagents (v) for the determination of pro-angiogenic and / or anti-angiogenic factors, preferably for the assay of VRGF 3 11, -6, IL-1, FGF, angiopoietin, TGF- ⁇ , maspin, endostatin and / or TSPi factors.
  • reagents can be, in particular, enzymes, buffer solutions, nucleotides and magnesium salts, or antibodies, for the purpose of carrying out, for example respectively a quantitative PCR (in particular assay carried out by RT-PCR 7 real-time PCR). a proteomic assay, on tissues likely to evolve to a malignant phenotype.
  • kit described above can be used for determining the stage of tumor development in a mammal at risk, as a diagnostic aid.
  • the TNM classification is widely described and used. This is why monitoring the expression profile of the AT2R receptor and the different biological markers pro or anti-angiogenic, will facilitate actions at a very early stage to delay and limit tumor expansion and thus avoid the transition from stage T to other stages called poor prognosis.
  • FIG. 1 is a graph showing the percentage of two groups of mice, one of the wild-type type called “wild type” and one group deficient in the AT2 receptor, called “AT2 KO”, presenting a tumor after administration of 3-methylcholanthrene (MCA). ), as a function of time in days;
  • FIG. 2 is a graph showing the evolution of the volume size (mm 3 ) of the tumor of the mouse groups of FIG. 1 as a function of time in days;
  • FIG. 3 is a graph showing the evolution of the volume of a tumor, in two groups of mice, a group treated with
  • FIG. 4 is a graph showing the mass of the tumor of the groups of mice of FIG. 3 sacrificed after 14 days of treatment with PD 123319;
  • FIG. 5 represents a graph showing the volume of a tumor, in two groups of mice, a group treated with NaCl and a group treated with an AT2R antagonist, PD 123319, 14 days after inoculation of LL tumor cells. / 2, as a function of time;
  • FIG. 6 is a graph showing the mass of tumor of the groups of mice of FIG. 5 sacrificed after 14 days of treatment with PD 123319;
  • FIGS. 7 and 8 are graphs showing the expression of
  • FIG. 9 shows the effect of the AT2R agonist (CGP42112A) and antagonist (PD123319) on the expression profile of the ptpn ⁇ gene (FIG. 9A) and the expression profile of the SHP-I protein (FIG. 9B). after 24 hours of treatment;
  • FIG. 10 shows the effect of the AT2R agonist (CGP421 12A) and antagonist (PD123319) on the expression profile of the ptpn ⁇ gene (FIG. 10A) and the expression profile of the SHP-I protein (FIG. 10B). after 72 hours of treatment;
  • FIG. 12 is a graph representing the cell proliferation rate proportional to the optical density at 570 nm as a function of time in hours (MTT test), LL / 2 cells treated with PD 123319 or CGP42112A or untreated;
  • FIG. 13 is a graph showing the cell proliferation rate proportional to the optical density at 570 nm as a function of time in hours (at 24 and 72h) (MTT test), CT26 cells that have not been treated or treated with PD123319 or CGP421 12A ;
  • FIG. 14 is a graph representing the average of the pAkt / Akt (n ⁇ 6) ⁇ SEM ratios (* p ⁇ 0.05 in comparison with untreated controls) at 24 hours and 72 hours;
  • FIGS. 15 and 16 show the results of western blot analyzes of three proteins: ⁇ -actin, Akt and pAkt of LL / 2 cells treated with a control control, the antagonist PD123319 (10 -6 M) and / or angiotensin II (English) at the following concentrations: 10 "9 or 10 " 12 M for 24 hours ( Figure 15) or at 72 hours ( Figure 16) .
  • the symbols - PD and + PD mean, respectively, non-treated cells.
  • FIGS. 17 and 18 show the results of western blot analyzes of the expression profile of pErk and Erk of LL / 2 cells treated with a control control, the antagonist PD123319 (10 -6 M) and / or angiotensin II ( ⁇ ngll) at the following concentrations: 10 " or 10 " M respectively for 24 hours ( Figure 17) and 72 hours ( Figure 18).
  • the symbols -PD and + PD mean, respectively, cells not treated with PD 1233 19 and cells treated with PD 123319;
  • FIGS. 20A to 20B represent (A) segments of abdominal aortas of wild or AT2R deficient mice fixed in a solution of ECM gel ® and incubated in the presence or absence of PD123319 for five days. The images represent the formation of tubules at the end of the protocol. (B) co-culture of LL / 2 cells with aortic rings of wild-type or AT2R deficient mice is performed for five days. The images represent the formation of tubules at the end of the protocol according to the treatment conditions.
  • FIGS. 21A and 21B show the expression profile of CD31 on sections of tumors by immunohistochemistry after CD31 labeling on tumor sections, observed by visible microscopy.
  • Chart IB shows the average number of vessels per slice + SEM * p ⁇ 0.05: tumors treated with PD123319 vs NaCl-treated tumors.
  • FIGS. 22A and 22B respectively represent (A) segments of abdominal aortas of wild-type mice fixed in a solution of ECM gel® and co-cultured in the presence or absence of LL / 2 tumor cells for five days.
  • the images show the formation of tubules at the end of the protocol, (B) the evaluation of the average vascularization index observed from rings of aortes co-cultured in the presence, or not, of LL / 2 + tumor cells SEM ** ⁇ ⁇ 0.01: rings co-cultured in the presence of LL / 2 tumor cells vs control rings.
  • FIG. 22A and 22B respectively represent (A) segments of abdominal aortas of wild-type mice fixed in a solution of ECM gel® and co-cultured in the presence or absence of LL / 2 tumor cells for five days.
  • the images show the formation of tubules at the end of the protocol
  • FIG. 23 represents the expression profile of the various transcripts of VEGF, Fit 1, TGF- ⁇ , TSP-I observed by RT-PCR from cells derived from fibrosarcomas obtained on mouse AT2 KO or control after injection of 3- methylcholanthrene. ** ⁇ ⁇ 0.01: KO cells vs control cells; * p ⁇ 0.05: KO cells vs control cells.
  • FIG. 24 represents the expression profile of the various VEGF, FIt-I, TGF- ⁇ and TSP-I transcripts observed by RT-PCR from LL / 2 tumor cells treated or not treated with angiotensin II (Angll) and / or PC 123319 for 72 hours.
  • Angll angiotensin II
  • angiotensin II AT2 receptor antagonist PD123319 is from Toc ⁇ s (Bristol, UK), Sigma Aldrich receptor agonist CGP42112A (St. Louis, Missouri). USA) and angiotensin TT and ECM gel solution ® by Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Trypsin comes from Lonza (Basel, Switzerland). Finally, the primers for PCR come from Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
  • LL / 2 cells are tumor cells derived from murine lung carcinoma obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). These cells were cultured in DMEM (Life Technologies) containing 10% fetal calf serum, 1% L-glutamine, 10 ⁇ l / ml of a mixture of penicillin and streptomycin, in an incubator at 37 ° C. under 5 minutes. % of CO 2 .
  • ATCC American Type Culture Collection
  • CT26 cells are tumor cells of murine colon carcinoma. They were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) and were grown in RPMI 1640 (Life Technologies, Redford, Mass.) Containing 10% fetal bovine serum, 1% L-glutamine 10 ⁇ l / ml of a mixture of penicillin and streptomycin, in an incubator at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • ATCC American Type Culture Collection
  • RPMI 1640 Life Technologies, Redford, Mass.
  • mice come from Laboratoires Charles River (L'Arbresle, France). The following studies involving mice have been approved by the Regional Committee for Ethics in Animal Experiments.
  • Test 1 The absence of AT2 receptor, said for the rest of the description "AT2R", protects mice from the development of fibrosarcomas
  • A2 KO (six per group), 20 ⁇ g of 3-MCA (3-methylcholanthrene) diluted in 200 ⁇ l of peanut oil.
  • the results presented in FIGS. 1 and 2 correspond to the averages of tumor volumes (in mm 3 ) ⁇ SEM. Significant differences are determined by a Student's test (** p ⁇ 0.02).
  • Test 2 PD123319 pharmacological blockade slows down tumor development
  • subcutaneous injections are made into female mice
  • mice are either treated daily with an angiotensin II AT2 receptor antagonist: PD123319, or with NaCl (control group).
  • an angiotensin II AT2 receptor antagonist PD123319
  • NaCl control group
  • the LL / 2 tumor cells induce observable tumors seven days after their injection (FIGS. 3 to 6).
  • the results presented correspond to the average tumor volumes (in mm 3 ) ⁇ SEM. Significant differences are determined by a Student's test (*** /? ⁇ 0.02).
  • no significant difference in tumor mass was observed for PD123319-treated mice after 14 days after injection of LL / 2 tumor cells, compared to untreated mice.
  • AT2R control group treated with NaCl
  • the curves substantially overlap in FIG. 5.
  • FIG. 6 shows that the tumor volume of the control mice treated with NaCl and mice treated with PD123319 is substantially the same after 14 days (the mice of each group have been sacrificed and their tumor removed in order to be weighed and analyzed).
  • FIG. 3 shows a significant difference when the mice are treated with PD123319 7 days after inoculation of the LL / 2 tumor cells compared to the NaCl-treated control group.
  • the control group has a tumor size of the order of 200 mm 3
  • the group treated with PD 123319 has a tumor size less than 40 mm.
  • FIG. 4 shows that, after 14 days, the tumor volume of the mice treated with PD 123319 is four times smaller than the tumor volume of the control group (again, the mice of each group were sacrificed and their tumor removed in order to be weighed and analyzed).
  • Test 3 Study of the In Vitro Expression Profile of AT2R in Tumor Cell Models.
  • LL / 2 and CT26 cells are treated with a specific agonist AT2R, CGP421 12A (10 "7 M) or an antagonist PD123319 (10 ' 6 M) for 24 or 72 hours ( Figures 7 and 8).
  • AT2R expression was first evaluated in LL / 2 and CT26 cell lines. Then, protein extracts were recovered and analyzed by immunoprecipitation followed by a western blot revealed by the anti-AT2R antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc.). The results are normalized to untreated cells and mean ⁇ SEM are plotted (* p ⁇ 0.05 compared to untreated cells).
  • Test 4 Control of the effective blockade of AT2R by studying the expression of SHP-I
  • the expression pattern of SHP-I (Src homology phosphatase-1), a protein kinase directly related to AT2R and involved in the AT2R signaling cascade is analyzed by quantitative RT-PCR ( analysis of TARN 111 of the ptpn ⁇ gene) and by western blot from LL / 2 cells treated with different molecules for 24 or 72 hours. Quantification of the ptpn ⁇ -encoding TARN 111 was performed using ABIprism (Applied Biosystems) with SyBrGreen technologies. Subsequent amplifications of the cDNA encoding ptpn ⁇ were performed using 100 ng of a mixture of a reverse transcript.
  • the primers of SHP-I are as follows: ptpn ⁇ , sense primer: GGC CCA TCA TTG TGC ATT, antisense primer: CTG ATC GAT ATAT GTC ACA GTC TAG.
  • the PCR reactions were performed in a volume of 15 .mu.l using SYBR ® Green JumpStart Taq TM Readymix (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) according to manufacturer's instructions.
  • the cycle parameters were 95 ° C. for 2 min, then 40 denaturation cycles at 95 ° C. for 30 s, amplification at 60 ° C. for 60 s and extension at 72 ° C. for 30 s.
  • LL / 2 cells are treated with PD123319 or CGP42112A for 24 or 72 hours.
  • the effect of these treatments on the expression of TARN 111 of the ptpn ⁇ gene and on the SHP-I protein is analyzed. Results are normalized to untreated cells and mean ⁇ SEM are represented graphically (* p ⁇ 0.05 compared to untreated cells).
  • the ptpn 6 transcript is significantly decreased in the PD123319-treated cells, both at 24 h (FIG. 9A) and at 72 h (FIG. 10A), compared with the CGP421 12A-treated cells, for which the expression of the transcript is increased. .
  • Test 5 Influence of the pharmacological blockade of AT2R on cell proliferation.
  • AT2R While in vivo studies suggest that AT2R would be involved in tumor development, proliferation and cell viability analysis was performed by cell counting after trypan blue staining of the living cell plasma membrane.
  • the LL / 2 and CT26 cells were inoculated into a plate, allowed to stand for 24 hours and then treated for 24 or 72 hours with PD 123319 or CGP42112A.
  • the LL / 2 cells are incubated for 24 or 72 ( Figure 1 1 results for LL / 2), in the presence of PD 123319 (10 "6 M) or CGP421 12A (10" 7 M).
  • the cell count makes it possible to observe a proliferation decrease of 30% and 50%, respectively, at 24 and 72h for the cells treated with the AT2R antagonist (PD 123319), whereas the results obtained with CGP421 agonist 12A are not significant.
  • a second murine cell line of colon carcinoma (CT26 cells) is incubated according to the same protocol and during the same periods.
  • CT26 cells a second murine cell line of colon carcinoma
  • Test 6 Evaluation of the Expression Profile of Survival Markers, Migration and Cell Proliferation Some markers of survival (pAkt / Akt) and cell proliferation (pErk / Erk) were studied.
  • the LL / 2 cells were processed for 24 (FIG. 17) or 72h (FIG. 18) by PD 123319 or CGP42112A. Protein analysis was performed by western blot. 36
  • the MAPK / Erk pathway is part of an intracellular signaling network that transmits signals from the membrane to the nucleus to induce different cellular responses to cell division or differentiation. Therefore, the study of the expression of this protein will bring additional information to those presented until now.
  • the expression of Erk is not modified by the different treatments at 24h or 72h. A decrease in the ratio is confirmed in the presence of angiotensin II and PD 123319. This is shown in the graphs (FIG.
  • Test 7 The pharmacological blockade of AT2R or the absence of this receptor inhibits angiogenesis induced in an ex vivo aortic ring model. Tumor growth is usually explained by an increase in cell proliferation and uncontrolled vascularization at the origin of the metastatic process. Also, in order to verify the influence of AT2R in angiogenesis, the influence of pharmacological blockade of AT2R or its absence on tubule formation in an ex vivo model of aortic rings included in an ECM solution gel ® has been tested. The rings taken from the mice were placed standing in ECM solution ® gel and grown in complete medium for five days to stimulate tubule formation.
  • the rings After five days of treatment, the rings are observed by light microscopy (FIG. 20A) and the presence of neovessels, the intensity of which varies according to the type of treatment, is observed.
  • the rings of aortes from AT2-deficient mice just like those from wild-type mice treated with PD 123319, have very small amounts of neovessels, and are preferentially located at the periphery of the ring. Rings from wild-type AT2-expressing mice have large, localized neovales at the periphery and extending well beyond, covering a large area of the culture dish (left picture - Figure 20A).
  • Test 8 The pharmacological blocking of the AT2 receptor, by PD123319, reduces tumor angiogenesis.
  • Test 9 Influence of soluble proangiogenic factors, in particular VEGF, produced by tumor cells, on angiogenesis in a model of aorta rings.
  • the applicant To determine whether the AT2 receptor may be involved in regulating the production of pro-angiogenic factor, the applicant first found on a co-culture model 5 that the vascularization index is significantly increased for aortic rings co-cultured in the presence of tumor cells, compared to the control rings. These results suggest that one or more soluble factor (s) produced by the tumor cells in culture is (are necessary to potentiate the angiogenic process.) VEGF is known to be a pro-angiogenic factor. Thus, in order to verify its influence in the regulation of neovascularization tumor and pei-tumor, the applicant was interested in the influence of this factor in the regulation of the formation of new vessels.
  • aorta taken from wild-type C57 / BL6 mice are included in 1 ECM gel ® , co-cultured in the presence of tumor cells treated with VEGF-targeting antibody or its type 1 receptor (VEGF-R1 / Fit1). case, a significant decrease in the vascularization index was observed for the rings co-cultured in the presence of anti-VEGF and anti-VEGFR1 treated cells compared to control aortic rings ( Figures 22A and 22B). ).
  • VEGF produced by LL / 2 tumor cells is necessary to promote neovascularization in an ex-vivo model of angiogenesis, both at the tumor level and in the peripheral environment. tumor.
  • Test 10 Influence of the AT2 Receptor in the Regulation of the Expression of Pro and Antiangiogenic Factors in Tumor Cell Models.
  • proangiogenic soluble factors such as VEGF, TGF- ⁇ , .VEGF-R1 and anti-angiogenic (thrombospondin; TSP-I)
  • RT-PCR Real-time PCR
  • FIG. 23 shows that the deletion of AT2R induces a decrease in the expression of VEGF-TGF- ⁇ proangiogenic transcripts and of its type-1 receptor.
  • the absence of AT2R induces an increase in the expression of anti-angiogenic factors such as TSP-I.
  • compositions used comprising an agent which is both antitumor and anti-angiogenic, can thus be used alone or in combination with other molecules having a therapeutic role, and also as complementary adjuvants, for example during multidrug therapy, without major side effects.
  • Composition 1 according to the invention administrable orally
  • a composition suitable for oral administration in an adult subject may contain, in addition to an angiotensin II AT2R antagonist, in a dosage of 0.1 to 10 mg / kg, for example an antifolic such as methotrexate (0). , 1 mg / kg), or an antipurical drug such as 6-mercaptopurine (100 mg / m 2 ) and azathioprine (3 to 5 mg / kg), or an inhibitor of ribonucleotide reductase such as hydroxyurea ( 10 to 50 mg / kg), or nitrogen mustard derivatives, such as chlorambucil (0.1 to 0.2 mg / kg) or nitrosoureas, such as lomustine
  • composition 2 administrable by the venous route
  • a composition suitable for being administered by the venous route may contain, in addition to an AT2R antagonist of angiotensm II (in a dosage of 0.1 to 10 mg / kg), for example a such as cladribine (90 mg / kg / day), fludarabine (25 mg / m 2 / day), pyrimidine base analogs such as 5-fluorotacil (200-500 mg / m 2 / day according to the protocol considered), 5-cytarabine (10 mg / mVday), gemcitabine (1 g / m 2 ), topoisomerase I or II inhibitors, such as topotecan (1.5 mg / m 2 ), irinotecan ( 350 mg / m 2 ), platinum derivatives, such as cisplatin (20 to 100 mg / m 2 / day), carboplatin (300 to 400 mg / m 2 ), oxaliplatin (130 mg /
  • compositions 1 and 2 are cytotoxic agents used in particular protocols depending on the types of tumors. These molecules may also be associated with anti-angiogenic agents such as bevacizurnab, especially in metastasized forms. Cytotoxic / antiangiogenic associations may be further coupled to AT2R antagonists thus potentiating the effects against cell proliferation as well as tumor angiogenesis.

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Abstract

La présente invention concerne une composition préventive antitumorale comprenant une quantité pharmaceutiquement efficace d'au moins un antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II pour son application comme médicament afin de prévenir le développement de cancers chez un mammifère à risque. La présente invention concerne également un procédé de prévention du développement de cancer chez un mammifère à risque, ainsi qu'un kit de prévention du développement de cancers.

Description

COMPOSITION POUR RETARDER L'INITIATION TUMORALE DE CELLULES CANCÉREUSES CHEZ UN MAMMIFÈRE À RISQUE
Domaine de l'invention : La présente invention se rapporte à une composition préventive antitumorale apte à prévenir le développement des cancers chez un patient à risque.
La présente invention se rapporte également à un procédé permettant de prévenir Ie développement de cancer chez un mammifère à risque, ainsi qu'un kit de prévention de développement de cancers.
Problématique et art antérieur :
Les cellules saines, qui sont l'élément de base des tissus, poussent, se divisent et se renouvellent d'une façon ordonnée. Ce processus permet à l'organisme de conserver son équilibre. Il arrive cependant que certaines cellules perdent leur capacité de croissance contrôlée et se mettent à se diviser trop rapidement et à croître de façon désordonnée. Elles peuvent alors être à l'origine de tissu excédentaire (qui formera une tumeur) ou, dans le cas des leucémies, envahir la moelle osseuse, puis circuler dans le sang. Les tumeurs malignes peuvent envahir les tissus et les organes sains avoisinants. De plus, en passant dans le sang ou dans le système lymphatique, elles peuvent se diffuser dans d'autres parties de l'organisme pour y former de nouvelles tumeurs (appelées métastases). Même si une tumeur cancéreuse initiale est éliminée, la maladie peut de ce fait récidiver. Cette capacité de diffusion dans tout l'organisme fait qu'il est essentiel de détecter le plus tôt possible toute tumeur et savoir si elle est maligne.
Différents facteurs peuvent altérer l'ADN : des facteurs de risques modifiant le génome tels que les mutations, ou des facteurs de risques externes comme l'alimentation, l'irradiation ou l'induction par un agent infectieux, etc. Un système complexe de contrôle répare cet ADN altéré. Quand une réparation de cet ADN altéré n'est pas possible, celui-ci est détruit et la cellule meurt spontanément. On parle d'apoptose. Toutefois, l'altération de certains gènes du système de contrôle (gènes oncogènes ou anti-oncogènes) va rendre la cellule immortelle (il n'y a plus d'apoptose). La cellule va alors se reproduire en transmettant ses gènes altérés jusqu'à former une tumeur.
D'après l'Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC), 5 à 10% des cancers seraient liés à une prédisposition génétique. Comme susmentionné, le cancer est le fruit d'une transformation en plusieurs étapes, où une cellule saine devient maligne après avoir accumulé au fil du temps un certain nombre d'altérations au cœur de ses gènes. Mais dans certaines familles indubitablement plus souvent touchées par le cancer que la population générale, ce quota d'altérations est atteint plus vite. Car le père ou la mère, voire les deux, sont porteurs d'une anomalie favorisant l'apparition du cancer, qu'ils sont susceptibles de transmettre à leurs descendants. Chez ceux qui héritent de cette anomalie, l'une des étapes menant à la maladie est franchie dès la naissance. On parle donc de prédisposition. Une façon connue de traiter le cancer est la chimiothérapie cytotoxique. T, a majorité des médicaments utilisés dans ce cas peuvent se subdiviser en : agents alkylants, anti-métabolites, alcaloïdes végétaux, inhibiteurs de la topoisomérase, et antibiotiques antitumoraux. Tous ces médicaments affectent à un certain point la mitose ou la synthèse et la fonction de I1ADN. Certains nouveaux agents n'agissent pas directement sur l'ADN. C'est le cas d'un inhibiteur de la tyrosine kinase : mésyîate dïmatinib, qui cible directement une anormalité moléculaire dans certains types de cancer (leucémie, cancer du côlon). D'autres médicaments modifient le comportement des cellules tumorales sans pour autant attaquer directement les cellules. Des hormones sont utilisées pour ce genre de thérapie adjuvante.
Le dosage de chimiothérapie peut être très difficile : une dose trop faible sera inefficace contre la tumeur, alors qu'à dose excessive la toxicité sera intolérable pour le patient. En général, le dosage est ajusté à la « surface corporelle » du patient, approximée par un calcul à partir de sa taille et de son poids.
En conclusion, il subsiste un besoin dans le développement de médicament ou de composition permettant de traiter le cancer de manière préventive, notamment chez les sujets à risque (hérédité, risque de récidive). Un but de la présente invention est de fournir une composition qui évite tout ou partie des inconvénients précités.
Résumé de l'invention : A cet effet, l'invention concerne une composition préventive antitumorale comprenant une quantité pharmaœutiquement efficace d'au moins un antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II pour son application comme médicament afin de prévenir le développement de cancers chez un mammifère à risque. Le système rénine angiotensine (SRA) est impliqué dans de nombreuses régulations. Ce système comprend trois composants : la rénine sécrétée par le rein, l'angiotensinogène par le foie et l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA), permettant la synthèse d'angiotensine IL Cette angiotensine II est un octapeptide qui exerce son action par le biais de deux récepteurs, ATl et AT2. Des études ont montré que la stimulation du récepteur ATl favorisait la vasoconstriction, la prolifération cellulaire et diminuerait l'apoptose, tandis que la stimulation du récepteur AT2 favoriserait au contraire la vasodilatation, la propriété anti-proliférative, la régulation de l'apoptose, ce qui l'opposerait à ATl (balance fonctionnelle entre la stimulation des récepteurs ATl et AT2 de l'angiotensine II). En effet, les récepteurs AT2 ne présentent que 32% d'homologie avec les récepteurs ATl . Les récepteurs AT2 se lient avec des sous-unités différentes de protéines G. Hs activent d'autres voies de signalisation intracellulaire expliquant les effets souvent opposés à ceux des récepteurs ATl.
Or, les présents demandeurs ont découvert de manière inattendue que le blocage du récepteur AT2 de l'angiotensine II par un antagoniste permettait, non pas la prolifération de cellules cancéreuses, mais au contraire de prévenir, chez un patient à risque, le développement de ces cellules cancéreuses.
Par patient à risque, on entend tout sujet ayant une prédisposition génétique à un cancer ou un sujet qui présente des risques de récidive de cancers. En particulier, le demandeur a constaté de manière surprenante que ledit antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II est apte à la fois à retarder l'initiation tumorale de cellules cancéreuses chez ledit mammifère à risque et à inhiber l'angiogénèse dans l'environnement desdites cellules.
L'initiation tumorale consiste en un processus irréversible et rapide par lequel une lésion de l'ADN est produite et sera transmise aux cellules filles.
Par ailleurs, pour leur développement, les cellules tumorales induisent des facteurs angiogéniques qui participent à une néovascularisation dans l'environnement immédiat desdites cellules. Le demandeur a également constaté, de manière intéressante, que le blocage du récepteur AT2 permettait d'influer sur la production des facteurs pro- ou anti-angiogéniques, tels que VEGF, TGF-β et/ou TSPi.
De préférence, l'antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II est choisi parmi la liste suivante : PD 123319, PD13177, PD126055, EXP801, L-159686, L-161638 ou un de leurs mélanges, qui sont des antagonistes spécifiques du récepteur AT2.
Plus particulièrement, l'antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II est PD123319. Ce composé qui est notamment commercialisé par la société Sigma-Aldrich ou la société Tocris, présente la formule suivante :
Figure imgf000006_0001
Avantageusement, le cancer est le cancer de la vessie, la cancer du sein, le cancer de la thyroïde, le cancer de la gorge, le cancer du cerveau, le cancer du colon, le cancer de l'endomètre, le cancer de l'œsophage, le cancer du poumon, le cancer du foie, le cancer colorectal, le cancer de la prostate, le cancer des os, le cancer pancréatique, le cancer de la peau, le cancer ovarien, le cancer rénal, le lymphome, le mélanome, les cancers du col de l'utérus et la leucémie. De manière préférentielle, la composition préventive antitumorale est administrée au mammifère à risque par voie orale et/ou par voie injectable (intraveineuse, intramusculaire ou intra-tumorale) et/ou par voie topique. La composition selon l'invention peut être utilisée pour la prévention de tumeurs chez tout mammifère à risque. En particulier, le mammifère à risque peut être un sujet humain sain, un sujet humain déjà atteint d'une autre forme de cancer, un sujet humain en rémission de cancer ou un sujet humain dont les risques familiaux et génétiques de développer un cancer ont été démontrés.
T -a composition préventive antitumorale peut être utilisée seule ou appliquée en association avec une polychimiothérapie anticancéreuse.
Les antagonistes d'AT2R peuvent ainsi entrer dans les protocoles de traitement de cancers traités par chimiothérapie et ce, afin de prévenir l'apparition de nouvelles tumeurs ou de ralentir le développement tumoral en agissant sur Ia prolifération cellulaire et sur l'angiogenèse associée, à un stade très précoce de développement tumoral.
De préférence, la posologie utilisée pour traiter le mammifère à risque est de l'ordre de 0,4 à 10 mg/kg, de préférence de 1 à 5 mg/kg et encore plus de préférence de 2 à 5 mg/kg
La présente invention a également pour objet un procédé pour prévenir le développement de cancers chez un mammifère à risque comprenant l'étape consistant à appliquer un antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II sur des cellules susceptibles de muter de manière irréversible de sorte à former des cellules cancéreuses.
Ledit procédé peut comprendre l'étape préalable consistant à déterminer le profil d'expression du récepteur AT2 de l'angiotensine II, par exemple par PCR quantitative ou dosage protéomique. Cette étape préalable peut notamment comprendre la détermination de marqueurs indicatifs du stade de développement tumoral. Lesdits marqueurs sont de préférence choisis parmi les facteurs
Figure imgf000007_0001
Ainsi, il est possible d'envisager une méthode de diagnostic d'une prédisposition au cancer chez un mammifère, qui comprend Ia détermination du profil d'expression du récepteur AT2, la surexpression dudit récepteur AT2 étant une indication d'une prédisposition à développer un cancer, en particulier un cancer du poumon et/ou du colon, comme présenté dans les exemples ci-après.
La présente invention se rapporte aussi à un kit de prévention de développement de cancers, comprenant :
(i) au moins un contenant comprenant, en une quantité pharmaceutiquement efficace, au moins un antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II, de sorte à prévenir le développement de cancers chez un mammifère à risque, (ii) éventuellement un support pharmacologiquement acceptable, et
(iii) des instructions d'utilisation.
Le kit ci-dessus peut également comprendre (iv) des réactifs pour le dosage de l'expression du récepteur AT2 et/ou des réactifs (v) pour le dosage des facteurs pro-angiogéniques et/ou anti-angiogéniques, de préférence pour le dosage des facteurs VRGF3 11,-6, IL-I , FGF, angiopoïétines, TGF-β, maspin, endostatine et/ou TSPi.
Ces réactifs peuvent être en particulier des enzymes, solutions tampons, nucléotides et sels de magnésium, ou des anticorps, en vue de la réalisation, par exemple respectivement d'une PCR quantitative (notamment dosage effectué par RT-PCR7 PCR en temps réel) on d'un dosage protéomique, sur des tissus susceptibles d'évoluer vers un phénotype malin.
Ainsi le kit décrit ci-dessus peut être utilisé pour la détermination du stade de développement tumoral chez un mammifère à risque, en tant qu'aide au diagnostic.
La classification usuelle TNM (T=caractères de tumeur primitive, N=extension ganglionnaire, M=métastases) permet la graduation croissante de l'évolution tumorale T>N>M. Ainsi, l'analyse du profil d'expression du récepteur AT2 et/ou le dosage des facteurs biologiques pro- ou anti-angiogéniques cités précédemment permettra de déterminer le stade d'évolution de la pathologie.
Par exemple, pour les cancers du sein, la classification TNM est largement décrite et utilisée. C'est pourquoi Ie suivi du profil d'expression du récepteur AT2R et des différents marqueurs biologiques pro- ou anti-angiogéniques, faciletera les actions à un stade très précoce pour retarder et limiter l'extension tumorale et évitera ainsi, le passage du stade T vers les autres stades dits de mauvais pronostic.
Description détaillée de l'invention :
L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'exemples de composition pour la prévention de cancers et d'essais expérimentaux, en référence aux figures suivantes :
- la figure 1 est un graphique présentant le pourcentage de deux groupes de souris, un de type sauvage appelé « type sauvage » et un groupe déficient en récepteur AT2, appelé « AT2 KO », présentant une tumeur après administration de 3-méthylcholanthrène (MCA), en fonction du temps en jours ;
- la figure 2 est un graphique présentant l'évolution de la taille en volume (mm3) de la tumeur des groupes de souris de la figure 1 en fonction du temps en jours ;
- la figure 3 est un graphique présentant l'évolution du volume d'une tumeur, chez deux groupes de souris, un groupe traité avec du
NaCl et un groupe traité avec un antagoniste du AT2R, du PD 123319, 7 jours après inoculation de cellules tumorales LL/2, en fonction du temps ;
- la figure 4 est un graphique représentant la masse de la tumeur des groupes de souris de la figure 3 sacrifiées au bout de 14 jours de traitement par PD 123319;
- la figure 5 représente est un graphique présentant le volume d'une tumeur, chez deux groupes de souris, un groupe traité avec du NaCl et un groupe traité avec un antagoniste du AT2R, du PD 123319, 14 jours après inoculation de cellules tumorales LL/2, en fonction du temps ;
- la figure 6 est un graphique représentant la masse de la tumeur des groupes de souris de la figure 5 sacrifiées au bout de 14 jours de traitement par PD 123319; - les figures 7 et 8 sont des graphiques montrant l'expression de
AT2R dans une lignée cellulaire murinc LL/2 après ajout de PD 123319 ou de CGP421 12A, agoniste d'AT2R par rapport à un contrôle au bout de 24 heures (figure 7) ou au bout de 72 heures (figure 8) de traitement ;
- Ia figure 9 présente l'effet des agoniste (CGP42112A) et antagoniste (PD123319) d'AT2R sur le profil d'expression du gène ptpnô (figure 9A) et du profil d'expression de la protéine SHP-I (figure 9B) au bout de 24 heures de traitement ;
- la figure 10 présente l'effet des agoniste (CGP421 12A) et antagoniste (PD123319) d'AT2R sur le profil d'expression du gène ptpnô (figure 10A) et du profil d'expression de la protéine SHP-I (figure 10B) au bout de 72 heures de traitement ;
- la figure 1 1 est un graphique montrant les moyennes du nombre de cellules LL/2 et CT26 dans différentes conditions de traitements ± SEM (n=6), c'est-à-dire avec ajout de PD123319, CGP421 12A ou sans ajout (contrôle) au bout de 24h et de 72 h ; - la figure 12 est un graphique représentant le taux de prolifération cellulaire proportionnel à la densité optique à 570 nm en fonction du temps en heure (test MTT), des cellules LL/2 traité avec PD 123319 ou CGP42112A ou non traitées ;
- la figure 13 est un graphique représentant le taux de prolifération cellulaire proportionnel à la densité optique à 570 nm en fonction du temps en heures (à 24 et 72h) (test MTT), des cellules CT26 non traitées ou traitées avec PD123319 ou CGP421 12A ;
- la figure 14 est un graphique représentant la moyenne des rapports pAkt/Akt (n≈6) ± SEM (*p<0.05 en comparaison avec les témoins non traités), à 24 heures et 72 heures ;
- les figures 15 et 16 représentent les résultats d'analyses par western blot de trois protéines: β actine, Akt et pAkt des cellules LL/2 traitées par un témoin contrôle, l'antagoniste PD123319 (10"6M) et/ou de l'angiotensine II (Anglï) aux concentrations suivantes : 10"9 ou 10"12M pendant 24 heures (figure 15) ou à 72 heures (figure 16). Les symboles - PD et +PD signifient, respectivement, cellules non traitées par PD123319 et cellules traitées par PD 123319 ;
- les figures 17 et 18 représentent les résultats d'analyses par western blot du profil d'expression de pErk et Erk de cellules LL/2 traitées par un témoin contrôle, l'antagoniste PD123319 (10"6M) et/ou de l'angiotensine II (Λngll) aux concentrations suivantes : 10" ou 10" ' M respectivement pendant 24 heures (figure 17) et 72 heures (figure 1 8). Les symboles -PD et +PD signifient, respectivement, cellules non traitées par PD 1233 19 et cellules traitées par PD 123319 ;
- la figure 19 est un graphique représentant la moyenne des rapports pErk/Erk (n=6) ± SEM (*p<0.05 cellules NaCl/72h en comparaison avec cellules NaCl/24h ; § ρ<0.05 cellules traitées en comparaison avec les témoins non traités) ;
- les figures 2OA à 2OB représentent (A) des segments d'aortes abdominales de souris sauvages ou déficientes en AT2R fixés dans une solution d'ECM gel® et incubés en présence, ou non, de PD123319 pendant cinq jours. Les images représentent la formation de tubules en fin de protocole. (B) une co-culture de cellules LL/2 avec des anneaux aortiques de souris sauvages ou déficientes en AT2R est réalisée pendant cinq jours. Les images représentent la formation de tubules en fin de protocole selon les conditions de traitement.
- les figures 21A et 21B montre le profil d'expression de CD31 sur des coupes de tumeurs par immunohistochimie après marquage CD31 sur les coupes de tumeurs, observées en microscopie visible. Le graphique 2 IB représente la moyenne du nombre de vaisseaux par coupes + SEM *p<0,05 : tumeurs traitées par PD123319 vs tumeurs traitées par NaCI.
- les figures 22 A et 22B représentent respectivement (A) des segments d'aortes abdominales de souris sauvages fixées dans une solution d'ECM gel® et co-cultivés en présence ou non de cellules tumorales LL/2 pendant cinq jours. Les images montrent la formation de tubules en fin de protocole, (B) l'évaluation de l'index moyen de vascularisation observé à partir d'anneaux d'aortes co-cultivés en présence, ou non, de cellules tumorales LL/2 + SEM **ρ<0,01 : anneaux co-cultivés en présence de cellules tumorales LL/2 vs anneaux contrôle. - la figure 23 représente le profil d'expression des différents transcrits de VEGF, Fit 1 , TGF-β, TSP-I observés par RT-PCR à partir de cellules dérivées de fibrosarcomes obtenues sur souris AT2 KO ou contrôle après injection de 3-méthylcholanthrène. **ρ<0,01 : cellules KO vs cellules contôle ; *p<0,05 : cellules KO vs cellules contrôle. - la figure 24 représente le profil d'expression des différents transcrits VEGF, FIt-I , TGF-β, TSP-I observés par RT-PCR à partir de cellules tumorales LL/2 traitées ou non par de l'angiotensine II (Angll) et/ou du PC 123319 durant 72h.
Pour les essais exposés ci-dessous, l'antagoniste PD123319 du récepteur AT2 de l'angiotensine II provient de la société Tocπs (Bristol, Royaume-Unis), l'agoniste CGP42112A du récepteur AT2 de Sigma Aldrich (Saint-Louis, Missouri, Etats-Unis) et l'angiotensine TT et la solution d'ECM gel® de Sigma Aldrich (Saint-Louis, Missouri, Etats- Unis). La trypsine provient de la société Lonza (Basel, Suisse). Enfin, les amorces pour la PCR proviennent de la société Sigma-Aldrich (Saint- Louis, Missouri, Etats-Unis).
Les cellules LL/2 sont des cellules tumorales issues de carcinome pulmonaire murin, obtenues auprès de l' American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ces cellules ont été cultivées dans du DMEM (Life Technologies) contenant 10% de sérum de veau fœtal, 1% de L-glutamine, lOOUI/mL d'un mélange de pénicilline et de streptomycine, dans un incubateur à 370C sous 5% de CO2.
Les cellules CT26 sont des cellules tumorales de carcinome du colon murin. Elles ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) et ont été cultivées dans du RPMI 1640 (Life Technologies, Redford, MA) contenant 10% de sérum de fœtus bovin, 1% de L-glutamine, lOOUI/mL d'un mélange de pénicilline et de streptomycine, dans un incubateur à 37°C sous 5% de CO2.
Les souris proviennent des Laboratoires Charles River (L'Arbresle, France). Les études ci-dessous faisant intervenir les souris ont été approuvées par le Comité Régional d'éthique en matière d'expérimentation animale.
Essai 1 : L'absence de récepteur AT2, dit pour la suite de la description « AT2R », protège les souris du développement de fibrosarcomes
On injecte par voie sous-cutanée et sur le flanc droit, à des souris de type sauvages et à des souris déficientes pour le gène AT2R, dit
« AT2 KO » (six par groupe), 20 μg de 3-MCA (3-méthylcholanthrène) dilué dans 200μL d'huile d'arachide. Le développement des tumeurs est observé chaque semaine à partir du 28eme jour. La croissance tumorale est évaluée par mesure du volume des tumeurs selon la formule V=L x I2 x 0.52 où L est le grand diamètre et 1 le petit. Les résultats présentés sur les figures 1 et 2 correspondent aux moyennes des volumes tumoraux (en mm3) ± SEM. Les différences significatives sont déterminées par un test de Student (**p < 0.02).
Cette expérience a été menée afin de vérifier si l'activation d'AT2R pouvait être associée au développement de tumeurs induites par un carcinogène chimique, ici le 3-MCA qui est apte à induire le développement de fibrosarcomes. Ce dernier est injecté à forte dose (20mg/kg).
Le résultat est le suivant : 66% des souris de type sauvages (groupe témoin) développent des tumeurs après 28 jours, alors que la même proportion de souris déficientes en AT2R ne développe des tumeurs qu'après 56 jours (figure 2). De même, un décalage de 28 jours est observé dans le développement tumoral entre les souris déficientes en AT2R, c'est-à-dire le groupe AT2 KO et les souris de type sauvages (figure 1). Les tumeurs ne sont visibles au bout de 56 jours pour AT2 KO et 28 jours pour les souris de type sauvage.
Bn conclusion, l'absence d'AT2R retarde significativement l'initiation de tumeurs induites par un puissant carcinogène, le 3- méthylcholanthrène (3-MCA).
Essai 2 : Le blocage pharmacologique par PD123319 ralentit le développement tumoral Afin de confirmer le rôle d'AT2R dans le développement tumoral, on injecte en sous-cutané à des souris femelles appelée
C57/BL6 de six semaines, 2.5 x 105 de cellules LL/2.
Au bout de sept jours (Figures 3 et 4) ou quatorze jours (Figures
5 et 6) jours après l'inoculation des cellules tumorales LL/2, ces souris sont soit traitées quotidiennement par un antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II : PD123319, soit par du NaCl (groupe témoin). Pour cela, des mini-pompes délivrant PD 123319 (20mg/kg/jour) ou NaCl sont implantées sur le dos de ranimai.
Les cellules tumorales LL/2 induisent des tumeurs observables sept jours après leur injection (figures 3 à 6). Pour les essais ci-dessous, la croissance tumorale est évaluée par mesure du volume des tumeurs selon la formule V=L x P x 0.52 où L est le grand diamètre et 1 le petit. Les résultats présentés correspondent aux moyennes des volumes tumoraux (en mm3) ± SEM. Les différences significatives sont déterminées par un test de Student (***/? < 0.02). Comme le montre la figure 5, aucune différence significative de masse tumorale n'est observée pour les souris traitées par PD123319 au bout de 14 jours après l'injection de cellules tumorales LL/2, par rapport à des souris non traitées pas un antagoniste de AT2R (groupe témoin traité au NaCl). Les courbes se chevauchent sensiblement sur la figure 5. De plus, la figure 6 montre que le volume tumoral des souris témoins traitées avec du NaCl et des souris traitées avec PD123319 est sensiblement le même au bout de 14 jours (les souris de chaque groupe ont été sacrifiées et leur tumeur prélevée afin de pouvoir être pesée et analysée). Alors qu'au contraire, la figure 3 montre une différence significative lorsque les souris sont traitées avec du PD123319 7 jours après inoculation des cellules tumorales LL/2 par rapport au groupe témoin traité au NaCl. En effet, au bout de 14 jours, le groupe témoin présente une tumeur de grosseur de l'ordre de 200 mm3, alors que Ie groupe traité avec du PD 123319 présente une tumeur de grosseur inférieure à 40 mm . La figure 4 montre que, au bout de 14 jours, le volume tumoral des souris traitées avec du PD 123319 est quatre fois moins important que le volume tumoral du groupe témoin (là aussi, les souris de chaque groupe ont été sacrifiées et leur tumeur prélevée afin de pouvoir être pesée et analysée).
Ces résultats indiquent que le blocage pharmacologique d'AT2R ne ralentit la croissance tumorale que s'il est administré relativement précocement.
Essai 3 : Etude du profil d'expression in vitro d'AT2R dans des modèles de cellules tumorales.
Afin de déterminer l'impact de diverses molécules sur l'expression d'AT2R, les cellules LL/2 et CT26 sont traitées par un agoniste spécifique d'AT2R, CGP421 12A (10"7M) ou un antagoniste, PD123319 (10'6M) durant 24 ou 72 heures (figures 7 et 8). L'expression d'AT2R a d'abord été évaluée dans les lignées cellulaires LL/2 et CT26. Puis, des extraits protéiques ont été récupérés et analysés par immunoprécipitation suivie d'un western blot révélé par l'anticorps anti-AT2R (Santa Cruz Biotechnology Inc). Les résultats sont normalisés par rapport aux cellules non traitées et les moyennes ± SEM sont représentées graphiquement (*p < 0.05 en comparaison avec les cellules non traitées).
Les résultats illustrés sur les figures 7 et 8 confirment que ni PD123319, ni CGP421 1A ne modifie le profil d'expression d'AT2R à 24h ou 72h.
Essai 4 : Contrôle du blocage effectif d'AT2R en étudiant l'expression de SHP-I
Afin de confirmer le blocage du récepteur AT2R, le profil d'expression de SHP-I (Src homology phosphatase-1), protéine kinase directement reliée à AT2R et impliquée dans la cascade de signalisation d'AT2R est analysé par RT-PCR quantitative (analyse de TARN111 du gène ptpnό) et par western blot à partir de cellules LL/2 traitées par différentes molécules durant 24 ou 72h. La quantification de TARN111 codant pour ptpnό a été réalisée en utilisant ABIprism (Applied Biosystems) avec les technologies SyBrGreen. Les amplifications subséquentes de l'ADNc codant ptpnβ ont été réalisées en utilisant 100 ng d'un mélange d'un transcrit inverse. Les amorces de SHP-I sont les suivantes : ptpnό, amorce sens : GGC CCA TCA TTG TGC ATT, amorce anti-sens : CTG GAT ATC AAT GTC ACA GTC TAG. Les réactions de PCR ont été réalisées dans un volume de 15 μL en utilisant SYBR® Green JumpStart Taq ReadyMix™ (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA) selon les instructions du fabricant. Les paramètres de cycle étaient de 95°C pendant 2 min, puis 40 cycles de dénaturation à 95°C pendant 30 s, amplification à 600C pendant 60 s et extension à 720C pendant 30 s.
Les cellules LL/2 sont traitées par PD123319 ou CGP42112A durant 24 ou 72h. L'effet de ces traitements sur l'expression de TARN111 du gène ptpnό et sur la protéine SHP-I est analysé. Les résultats sont normalisés par rapport aux cellules non traitées et les moyennes ± SEM sont représentées graphiquement (*p < 0.05 en comparaison avec les cellules non traitées).
Le transcrit ptpn 6 est significativement diminué dans les cellules traitées par PD123319, aussi bien à 24h (figure 9A) qu'à 72h (figure 10A), en comparaison avec les cellules traitées par CGP421 12A, pour lesquelles l'expression du transcrit est augmentée.
De plus, le traitement par PD123319 diminue l'expression de la protéine SHP-I (figure 9B) alors que le traitement par l'agoniste CGP421 12A l'augmente (Figure 10B). Ces résultats confirment qu'en dépit d'une variation d'expression d'AT2R (telle que présentée dans l'essai 3), le traitement par PD 123319 induit un blocage effectif du récepteur.
Essai 5 : Influence du blocage pharmacologique d'AT2R sur la prolifération cellulaire.
Alors que les études in vivo suggèrent qu'AT2R interviendrait dans le développement tumoral, l'analyse de la prolifération et de la viabilité cellulaire a été réalisée par numération cellulaire après coloration au bleu Trypan de la membrane plasmique des cellules vivantes.
Les cellules LL/2 et CT26 ont été ensemencées en plaque, mises au repos durant 24h puis traitées pendant 24 ou 72h par PD 123319 ou CGP42112A.
Ainsi, les cellules LL/2 sont incubées durant 24 ou 72h (figure 1 1, résultat pour LL/2), en présence de PD 123319 (10"6M) ou de CGP421 12A (10"7 M).
Comme le montre la figure 11 , la numération cellulaire permet d'observer une diminution de prolifération de 30 et 50% respectivement à 24 et 72h pour les cellules traitées par l'antagoniste d'AT2R (PD 123319), alors que les résultats obtenus avec l'agoniste CGP421 12A ne sont pas significatifs .
Afin de confirmer que les résultats obtenus ne sont pas dépendants de la lignée cellulaire étudiée, une seconde lignée murine de carcinome du côlon (cellules CT26), est incubée selon le même protocole et durant les mêmes périodes. De la même manière, une diminution significative de la prolifération cellulaire est observée lorsque les cellules sont traitées par PD 123319 (figure 1 1, résultat pour CT26).
De manière à confirmer les précédentes observations, un test MTT
(numérisation de cellules vivantes et de leur activité métabolique en présence de sel de tétrazolium (bromure de 3-(4,5-diméthyl thioazol-2- yl)-2,5-diphenyl tétrazolium)), dont l'intensité de couleur varie selon le pourcentage de cellules encore viables dans le milieu, est réalisé. Les résultats obtenus pour les cellules LL/2 (figure 12) et CT26 (figure 13) montrent une diminution significative de la prolifération cellulaire en présence de PD123319 et une augmentation lors d'un traitement par
CGP421 12A.
Essai 6 : Evaluation du profil d'expression de marqueurs de survie, de migration et de prolifération cellulaire Quelques marqueurs de survie (pAkt/Akt), et de prolifération cellulaire (pErk/Erk) ont été étudiés.
Profil d'expression de pAkt/Akt
L'analyse de l'expression du couple pAkt/Akt donne des informations sur la survie cellulaire. Ainsi, les cellules LL/2 sont traitées durant 24 ou 72h avec les différents agents ph a rm a co logiques et les protéines extraites sont analysées par western blot. Des derniers confirment une absence de modification de l'expression d'Akt lorsque les cellules sont incubées en présence de PD123319, aussi bien à 24h qu'à 72h. de plus, aucune différence significative n'est observée pour la forme phosphorylée d'Akt quelque soient les traitements et le temps d'incubation, ce qui explique l'absence de variations significatives du rapport pAkt/Akt selon les conditions de traitement (figures 14, 15 et 16). Ces résultats confirment que les traitements considérés ne modifient pas la survie cellulaire.
Profil d'expression de pErk/Erk
Pour l'essai montré aux figures 17 à 19, les cellules LL/2 ont été traitées pendant 24 (figure 17) ou 72h (figure 18) par PD 123319 ou CGP42112A. L'analyse des protéines a été effectuée par western blot. 36
La voie MAPK/Erk fait partie d'un réseau de signalisation intracellulaire qui permet de transmettre des signaux de la membrane jusqu'au noyau afin d'induire différentes réponses cellulaires de division cellulaire ou de différenciation. C'est pourquoi, l'étude de l'expression de cette protéine apportera des informations complémentaires à celles présentées jusqu'alors. L'expression de Erk ne se trouve pas modifiée par les différents traitements aussi bien à 24h, qu'à 72h. Une diminution du rapport est confirmée en présence d'angiotensine II et de PD 123319. Ceci se retrouve sur les graphiques (figure 19) représentant les rapports pErk/Erk puisqu'ils présentent des valeurs significativement diminuées pour les cellules incubées en présence de l'antagoniste d'AT2R en particulier pour de faible concentration d'angiotensine IL Ainsi, le blocage pharmaco logique d'AT2R inhibe l'activité de Erk et donc la prolifération cellulaire, confirmant les résultats obtenus au cours de l'essai 5.
Essai 7 : Le blocage pharmacologique d'AT2R ou l'absence de ce récepteur inhibe l'angiogenèse induite dans un modèle d'anneaux aortiques ex vivo. La croissance tumorale s'explique généralement par une augmentation de la prolifération cellulaire et une vascuiarisation incontrôlée à l'origine du processus de métastases. Aussi, afin de vérifier l'influence d'AT2R dans l'angiogenèse, l'influence du blocage pharmacologique d'AT2R ou de son absence sur la formation de tubules dans un modèle ex vivo d'anneaux aortiques inclus dans une solution d'ECM gel® a été testée. Les anneaux prélevés sur les souris ont été déposés debout dans une solution d'ECM gel ® et cultivés dans un milieu complet pendant cinq jours, afin de stimuler la formation de tubules.
Après cinq jours de traitement, les anneaux sont observés en microscopie optique (figure 20A) et l'on observe la présence de néovaisseaux dont l'intensité varie suivant le type de traitement. Ainsi, les anneaux d'aortes provenant de souris déficientes en AT2, tout comme ceux provenant de souris sauvages et traités par PD 123319, présentent des néovaisseaux en très faible quantité, et localisés préférentiellement en périphérie de l'anneau. Les anneaux provenant de souris sauvages exprimant AT2 présentent des néovaiεseaux en grande quantité, localisés en périphérie et qui s'étendent bien au-delà, couvrant une surface importante de la boîte de culture (photo de gauche - figure 20A).
De plus, afin de comprendre l'influence des cellules tumorales et de leur production de facteurs de croissance durant leur prolifération, une étude de co-culture d'anneaux aortiques de souris et de cellules tumorales T J 72 est réalisée. Il a été constaté que la prolifération des cellules malignes augmente significativement le développement de vaisseaux néo-formés ou de tubules dans l'ECM gel® en comparaison avec les anneaux cultivés en absence de cellules tumorales (cf. figure 20B). Néanmoins, les anneaux aortiques issus de souris déficientes en récepteurs AT2R présentent une diminution de formation de tubuleε par rapport aux anneaux issus de souris sauvages. Ces résultats confirment que l'absence d'AT2R ou le blocage pharmacologique d'AT2R retarde significativement le développement de l'angiogénèse. Ces expériences montrent donc que AT2R module l'angiogénèse dans un modèle ex vivo, suggérant un rôle délétère dans l'angiogénèse tumorale.
Essai 8 : Le blocage pharmacologique du récepteur AT2, par PD123319, diminue l'angiogénèse tumorale.
Afin de vérifier le rôle du récepteur AT2 dans la régulation de la vascularisation tumorale, nous avons étudié l'influence de ce récepteur sur la densité microvasculaire à partir de coupes de tumeurs. Ainsi, des coupes de tumeurs incluses en paraffine ont été traitées par un anticorps anti-CD31, ciblant spécifiquement les cellules endothéliales vasculaires, et une observation microscopique a été réalisée à l'issue de l'incubation par cet anticorps. Lorsque le traitement pharmacologique par PD 123319 est initié 7 jours après l'injection de cellules tumorales, la quantité de cellules endothéliales marquées par CD31 est significativement diminuée dans les tumeurs provenant de souris traitées par PD 123319 par rapport aux souris contrôle. Cependant, lorsque le traitement par PD 123319 est débuté au 14eme jour suivant l'injection de cellules tumorales, aucune différence dans le nombre de cellules marquées par CD31 n'est observée entre les souris traitées et les souris contrôle (Figures 21 A et 21B). Ces résultats mettent en évidence que le blocage pharmacologique du récepteur AT2R par PD123319 inhibe Ia πéo-vascularisation tumorale, en particulier lorsque le traitement est initié précocement.
Essai 9 : Influence des facteurs pro-angiogéniques solubles, en particulier VEGF, produits par les cellules tumorales, sur Pangiogenèse dans un modèle d'anneaux d'aorte.
Afin de déterminer si le récepteur AT2 pouvait être impliqué dans la régulation de la production de facteur pro-angiogénique, le demandeur à tout d'abord constaté, sur un modèle de co-culture5 que l'index de vascularisation est significativement augmenté pour des anneaux d'aorte co -cultivés en présence de cellules tumorales, par rapport aux anneaux contrôle. Ces résultats suggèrent qu'un ou plusieurs facteur(s) soluble(s) produit(s) par les cellules tumorales en culture est (sont nécessaire(s) pour potentialiser le processus angiogénique. Le VEGF est connu pour être un facteur pro-angiogénique essentiel. Ainsi, afin de vérifier son influence dans la régulation de la néo-vascularisation tumorale et péiï-tumorale, le demandeur s'est intéressés à l'influence de ce facteur dans la régulation de la formation de nouveaux vaisseaux. Des anneaux d'aorte prélevés sur des souris C57/BL6 sauvages sont inclus dans de I1ECM gel®, co-cultivés en présence de cellules tumorales traitées par iin anticorps ciblant VEGF ou son récepteur de type 1 (VEGF-Rl /Fit 1). Dans ce cas, une diminution significative de l'index de vascularisation a été observée pour les anneaux co-cultivés en présence de cellules traitées par l'anticorps anti- VEGF et anti- VEGFRl par comparaison avec des anneaux d'aortes contrôles (Figures 22A et 22B).
Ces résultats indiquent, clairement, que le VEGF produit par les cellules tumorales LL/2 est nécessaire pour promouvoir la néo- vascularisation dans un modèle d'angiogenèse ex-vivo, aussi bien au niveau de la tumeur, que dans l' environnement péri-tumoral.
Essai 10 : Influence du récepteur AT2 dans la régulation de l'expression de facteurs pro- et anti-angiogéniques dans des modèles de cellules tumorales. Afin de vérifier si le récepteur AT2R pouvait influencer la production de facteurs solubles pro-angiogéniques, tels que le VEGF, TGF-β,.VEGF-Rl et anti-angiogéniques (thrombospondine ; TSP- I), p ailes cellules tumorales, le profil d'expression des transcrits de ces différents médiateurs de l'angiogenèse a été déterminé par RT-PCR (RT- PCR en temps réel) dans des cellules LL/2 traitées par PD 123319 ou dans des cellules déficientes en gène codant pour AT2R.
Une diminution significative des transcrits de VEGF et de VEGF-Rl a été mise en évidence dans les cellules déficientes en gène codant pour AT2R par rapport aux cellules contrôle. De plus, la figure 23 montre que la délétion d'AT2R induit une diminution de l'expression des transcrits pro-angiogéniques de TGF-β de VEGF et de son récepteur de type 1. A l'inverse, l'absence d'AT2R induit une augmentation de l'expression de facteurs anti-angiogéniques tels que TSP-I.
Le traitement des cellules tumorales par de l'angiotensine II augmente l'expression des transcrits de VEGF et de son récepteur de type 1 ainsi que celle du TGF-β, tandis qu'une diminution de ces mêmes transcrits est vérifiée dans ies cellules traitées par PDl 7.3319. De plus, le blocage pharmacologique par PD 123319 induit une augmentation significative de TSP-I , comme le montre la figure 24.
L'ensemble de ces résultats met en évidence que le récepteur AT2R est impliqué dans le contrôle de l'expression, par la cellule tumorale, de facteurs impliqués dans la formation de néo-vaisseaux. De façon très intéressante, ces essais montrent que malgré les effets directs d'AT2R sur les vaisseaux, ce récepteur est capable de réduire, voire empêcher Ia communication entre les cellules tumorales et vasculaires.
Les études présentées dans les essais 1 à 10 ci-dessus montrent que le blocage d'AT2R par un antagoniste de AT2R de l'angiotensine II retarde l'initiation tumorale et permet simultanément de bloquer la croissance tumorale en inhibant à la fois la prolifération de cellules malignes et l'angiogenèse associée.
Les compositions mises en œuvre, comportant un agent qui est à la fois antitumorales et anti-angiogéniques, peuvent ainsi être utilisées seules ou en association avec d'autres molécules ayant un rôle thérapeutique, et également en tant qu'adjuvants complémentaires, par exemple lors de polychimiothérapie, et ceci sans effets secondaires majeurs. Composition 1 selon l'invention administrable par voie orale
Une composition convenant pour être administrable par voie orale chez un sujet adulte peut renfermer, outre un antagoniste de AT2R de l'angiotensine II, selon une posologie de 0, 1 à 10 mg/Kg, par exemple un antifolique tel que du méthotrexate (0,1 mg/Kg), ou un antipurique tel que la 6-mercaptopurine (100 mg/m2) et l'azathioprine (3 à 5 mg/Kg), ou un inhibiteur de la ribonucléotide réductase tel que de l'hydroxyurée (10 à 50 mg/Kg), ou des dérivés des moutardes à l'azote, telles que du chlorambucil (0,1 à 0,2 mg/Kg) ou des nitroso-urées, tel que la lomustine
(75 à 130 mg/m2), ou un mélange de plusieurs de ces molécules (les chiffres entre parenthèses sont des exemples de posologie).
Composition 2 selon l'invention administrable par voie veineuse Une composition convenant pour être administrable par voie veineuse peut renfermer, outre un antagoniste de AT2R de l 'angiotensme II (selon une posologie de 0,1 à 10 mg/Kg), par exemple un antipurique tel que la cladribine (90 mg/Kg/jour), la fludarabine (25 mg/m2/jour), des analogues des bases pyrimidiques tels que Ie 5-fluorouτacile (200 à 500 mg/m2/ jour selon le protocole envisagé), la 5-cytarabine (10 mg/mVjour), la gemcitabine (1 g/m2), des inhibiteurs de topoisomérases I ou II , tels que le topotécan (1 ,5 mg/m2), l'irinotécan (350 mg/m2), des dérivés du platine, tels que Ie cisplatine (20 à 100 mg/m2/jour), le carboplatine (300 à 400 mg/m2), l'oxaliplatine (130 mg/m2), ou des alcaloïdes de pervenche, tels que la vinblastine (10 mg/m2), la vincristine (50 à 150 m g/Kg) on encore des taxanes comme le docétaxel (100 mg/m2) et le paclitaxel (175 mg/m2), ou un mélange de plusieurs de ces molécules (les chiffres entre parenthèses sont des exemples de posologie).
Les composants de ces exemples des compositions 1 et 2 sont des cytotoxiques utilisés dans des protocoles particuliers suivant les types de tumeurs. Ces molécules pourront aussi être associées à des anti- angiogéniques tels que le bevacizurnab, notamment dans les formes métastasées. Les associations cytotoxiques/antiangiogéniques pourront être en outre couplées à des antagonistes d'AT2R potentialisant ainsi les effets à rencontre de la prolifération cellulaire ainsi que sur l'angiogenèse tumorale.
Bien que l'invention ait été décrite en relation avec un mode de réalisation particulier, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition préventive antitumorale comprenant une quantité pharmaceutiquement efficace d'au moins un antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II pour son application comme médicament afin de prévenir le développement de cancers chez un mammifère à risque, caractérisée en ce que l'antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II est apte à la fois à retarder l'initiation tumorale de cellules cancéreuses chez ledit mammifère à risque, et à inhiber l'angiogénèse dans l'environnement desdites cellules.
2. Composition préventive antitumorale selon la revendication 1, dans laquelle l'antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II est choisi parmi la liste suivante : PD123319, PD13177, PD126055, EXP801, L- 159686, L-161638 ou un de leurs mélanges.
3. Composition préventive antitumorale selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le cancer est le cancer de la vessie, la cancer du sein, le cancer de la thyroïde, le cancer de la gorge, le cancer du cerveau, le cancer du colon, le cancer de l'endomètre, le cancer de l'œsophage, le cancer du poumon, le cancer du foie, le cancer colorectal, le cancer de la prostate, le cancer des os, le cancer pancréatique, le cancer de la peau, le cancer ovarien, le cancer rénal, le lymphome, le mélanome, les cancers du col de l'utérus et la leucémie.
4. Composition préventive antitumorale selon l'une des revendications précédentes, apte à être administrée au mammifère à risque par voie orale et/ou par voie injectable et/ou par voie topique.
5. Composition préventive antitumorale selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le mammifère à risque est un sujet humain sain, un sujet humain atteint d'un cancer, un sujet humain en rémission de cancer ou un sujet humain dont les risques familiaux et génétiques de développer un cancer ont été démontrés.
6. Composition préventive antitumorale selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'elle est appliquée en association avec une polychimiothérapie anticancéreuse.
7. Composition préventive antitumorale selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la posologie utilisée pour traiter le mammifère à risque est de l'ordre de 0,4 à 10 mg/kg, de préférence de 1 à 5 mg/kg et encore plus de préférence de 2 à 5 mg/kg.
8. Procédé pour prévenir le développement de cancers chez un mammifère à risque comprenant l'étape consistant à appliquer un antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II sur des cellules susceptibles de muter de manière irréversible de sorte à former des cellules cancéreuses.
9. Procédé selon la revendication 8 comprenant l'étape préalable consistant à déterminer le profil d'expression du récepteur AT2 de l'angiotensine II desdites cellules.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape préalable comprend la détermination de marqueurs indicatifs du stade du développement tumoral.
1 1. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les marqueurs sont choisis parmi les facteurs VEGF, TGF-β et/ou TSP[.
12. Kit de prévention de développement de cancers, comprenant :
(i) au moins un contenant comprenant, en une quantité pharmaceutiquement efficace, au moins un antagoniste du récepteur AT2 de l'angiotensine II, de sorte à prévenir le développement de cancers chez un mammifère à risque, et à inhiber l'angîogénèse,
(ii) éventuellement un support phamiacologiquement acceptable, et
(iii) des instructions d'utilisation.
13. Kit de prévention selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend également (iv) des réactifs, pour le dosage de l'expression du récepteur AT2.
14. Kit de prévention selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en qu'il comprend (v) des réactifs pour le dosage des facteurs pro- angiogéniques et/ou anti-angiogéniques.
15. Kit selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend (v) des réactifs pour le dosage des facteurs VEGF, TGF-β, IL- 6, IL-I , FGF, angiopoïétines, endostatines, maspin et/ou TSPi.
16. Kit selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que le dosage est effectué par RT-PCR.
17. Utilisation du kit selon l'une des revendications pour la détermination du stade de développement tumoral chez un mammifère à risque, en tant qu'aide au diagnostic.
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