WO2010057447A1 - Vacunas unitemporales - Google Patents

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Oliver Germán Perez Martin
Elizabeth Gonzalez Aznar
Belkis Romeu Alvarez
Judith Mónica Del Campo Alonso
Reinaldo Acevedo Grogues
Miriam De San Juan Bosco Lastre Gonzalez
Caridad Zayas Vignier
Maribel Cuello Perez
Osmir Cabrera Blanco
Niurys NUÑEZ GUTIERREZ
Julio Antonio Balboa Gonzalez
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Instituto Finlay Centro De Investigacion Produccion De Sueros Y Vacunas
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Definitions

  • This invention relates to the field of new vaccines, specifically with the obtention and use of unitemporal vaccines for the treatment or prevention of infections of different nature, as well as for the treatment of tumors. More particularly, this is related to a unitemporal vaccine strategy that solves the problems of inefficient multidose vaccinations, when the absence or loss of the subjects occurs at successive doses and makes current parenteral vaccines more efficient by also inducing mucosal responses using combinations of efficient mucosal adjuvants and parenteral formulations with vaccine antigens included, conjugated or co-administered.
  • the nasopharyngeal route is not an alternative for the vaccination of intestinal germs, which is mainly the oral one (Brandtzaeg P et al. Immunol Today, 1999,20: 141-151). Therefore, understanding the mechanisms of mucosal immunity and the development of mucosal vaccines represents one of the biggest challenges in vaccinology.
  • the presence of innate mechanisms and systemic specific IgG are also involved in mucosal protection. So the parenteral route, without generally inducing IgAS protects against infectious diseases; but it does not eliminate bearer stages.
  • the carriers, when carrying the germ without generally suffering from the disease are those with the greatest epidemiological risk because they are constant disseminators of the infection.
  • Adjuvants are involved in: stimulating the innate response (Immunopotentiators); properly distribute the antigens (Delivery System) (Pashine A Valianti NM. Nat. Med. 2005,1 l: S63-68; Singh M and O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002,19 (6 ): 715-728) and direct the immune response towards the desired protective responses (Immunopolarization) (O Pérez, et al. PharmacologyOnline, 2006.3: 762-64).
  • the development of immunopotentiators or delivery systems that are effective by mucosal route is another main objective of the development of vaccines and of global pharmaceutical companies.
  • the alternative routes of immunization are based on the fact that parenteral immunization by requiring syringes and needles induces: fear in the recipient population, especially in prophylactic vaccines and the possibility of reusing needles in certain regions or groups, with the consequent increase of the risk of disease transmission.
  • Alternative routes include: oral, nasal, vaginal, rectal, transdermal and sublingual, among others.
  • the regionalization of the mucosal response has led to finding evidence that infections that occur through the airways are better protected by nasal immunizations, which also induce protection in the female genital tract (Brandtzaeg P, Pabst R. TRENDS in Immunology. 2004.25 (11): 570-577).
  • the mucosal immune response is generally the induction of Tolerance. It is carried out with responses of IgAS at the level of the mucous membranes and non-induction of systemic IgG that makes it effective against the multiple commensal germs that the organism has, in particular the human one.
  • induction of systemic specific IgG, in addition to IgAS, is an important pillar in mucosal immunization.
  • IgA contains a J chain and a secretory component involved in transport to the mucosal lumen, where it is known as IgAS.
  • IgA can be presented in monomeric or multimeric form and has two subclasses: IgAi and IgA 2 . The latter is more resistant to proteases produced by various microorganisms.
  • IgAS is almost exclusively induced by infections or mucosal immunizations and there is consensus that this antibody is the main protector of mucous membranes.
  • the IgA detected in saliva represents the best marker to measure the induction of immune response in the nasopharynx and it is desired to find a good marker for oral immunization (Brandtzaeg P. Int. J. Med. Microbiol. 2003,293: 3-15) .
  • Adjuvants are substances that enhance the specific immune response against an antigen causing a faster induction of the antigen and increasing its duration (Vogel FR. Dev. Biol. Stand. 1998,92: 241-248). Alumina continues to be the most commonly used adjuvant in parenteral vaccines. However, this is not a potent adjuvant that could help new vaccines by subunits. It is considered that it only has distribution system properties, although a new mechanism of action independent of ToI-like receptors that involves Nalp3 (Eisenbarth SC et al. Nature, 2008,453: 1122-1126) has recently been described. Its mucosal utility has also not been proven and it is assumed that it preferentially induces a Th2 response. Licensed vaccine adjuvants are scarce (MF59, ASO2, virosome, AFPLl, AFCoI,
  • ThI a preferential ThI response in murine and human by parenteral administration characterized by: IgG and ThI subclasses anti PL, production of interferon gamma (IFN ⁇ ), cytokine (IL) 12, tumor necrosis factor alpha (TNF ⁇ ), positive test of delayed hypersensitivity and additionally, the induction of cytotoxic T lymphocytes (CTL)
  • IFN ⁇ interferon gamma
  • IL cytokine
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • the vaccine, VA-MENGOC-BC ® based on the PL of N. meningitidis serogroup B has been applied in more than 60 million doses and has proven to be safe, non-reagenic and effective to protect against N. meningitidis serogroups B and C. It is also applied during breastfeeding safely and effectively, where it converts the T-independence of Polysaccharide C into a T-dependent antigen (Pérez O. et al. ThI response induced by the B component of VA-MENGOC-BC ® overcomes the thymus independence of polysaccharide C and primes for memory in toddler Applied Biotechnology 2002; 19 (l-2): 54).
  • This vaccine induces a pattern preferential ThI characterized by induction in human and animal lymphoproliferation; anti-PL IgG antibodies; IgG subclasses in humans and IgG2a in mice; IFN ⁇ , IL2 and IL12 in the field of messenger ribonucleic acid (mRNA) and proteins, non-induction of anti-PL IgE or increases in total IgE and non-production of IL-4 or IL-5 both at the level of ribonucleic acid messenger (mRNA) as a protein (Pérez O et al. Infec ⁇ Immun. 2001, 69 (72001): 4502-4508).
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • Proteoliposomes and derivatives thereof, such as cochleates, have also been used as adjuvants as disclosed in the certificate of the author of the invention OCPI 23313, 2008 Pérez Mart ⁇ n OG y cois, and WO / 2004/047805.
  • Chitosan is the most abundant biopolymer in nature after cellulose and is part of the exoskeleton of crustaceans and insects and the cell wall of some microorganisms such as yeasts and fungi.
  • alkaline deacetylation of chitin N-acetyl-D-glucosamine polymers of different molecular weights and different degrees of deacetylation are obtained, which gives it particular properties. Because it lacks toxicity and allergenicity, it has numerous applications in the pharmaceutical, medical and veterinary industries.
  • Chitosan is widely used in research as a transport system for drugs, peptides, proteins, vaccines and DNA, due to its natural mucoadhesive properties.
  • As a mucous adhesive multimeter it is used to increase the absorption of morphine and insulin through the epithelium of the nasal mucosa. Increases transepithelial transport of antigens to mucosal immune tissues through tight junctions and by decreased mucosyl movement. It induces immune system stimulating effects such as macrophage activation and cytokine induction.
  • the technical objective pursued is to increase vaccine coverage and induce combined mucosal and parenteral responses against heterologous (fungal, antigens). viral, protozoan, helminthic or carcinogenic) or own, especially inducing secretory IgA response (IgAS) involved in protections of mucous germs and cancers originally mucosal or that secondarily invade mucous membranes, also ensuring systemic response of specific IgG antibodies, also involved in mucosal protections.
  • IgA response secretory IgA response
  • Proteoliposomes and its derivatives (Cochleate [AFCoI] as adjuvants in formulations with heterologous (fungal, viral, bacterial, protozoal, helminthic or carcinogenic) antigens, inserted in their structure, conjugated or co-administered with these or the own antigens existing in the PL and its derivatives
  • These formulations extend the preferential response T type 1 (ThI) helper induced by the PL to the own or included antigens (Pérez O et al. Infec ⁇ Immun. 2001, 69 ( 7): 4502-4508), the preferential mucosal of the Cochleate (Pérez O et al.
  • the present invention has as its object the use of natural or genetically modified bacterial PLs (AFPLl), in particular those derived from N. meningitidis, or other gram-negative bacteria, as well as Cochleates derived therefrom, as new adjuvants or vaccinated / " I know to get unitemporal vaccines.
  • AFPLl natural or genetically modified bacterial PLs
  • Proteoliposome, PL it is understood that these are obtained from bacteria using any method known as: isolation without detergent; a process that includes detergent (such as deoxycholate, SDS, etc.) or the extraction from vesicles ("bleb") of crop supernatants and particularly those disclosed in US 5,597,572.
  • PLs contain different Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP), molecular structures conserved between pathogens capable of strongly stimulating the innate immune system and thereby inducing a powerful adaptive response.
  • PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns
  • PLs contain structures of the outer membrane of bacteria, but for the purposes of this patent, those extracted from other organisms such as viruses, fungi, protozoa, helminths or tumor cells are also considered.
  • AFPL is reserved for the use of PL as an adjuvant.
  • Cochleate is meant a derivative of a PL that therefore also contains several PAMPs as referred to in the patent (WO / 2004/047805), Pérez O et al. I infected Immun. 2001, 69 (7): 4502-4508 and Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004, 82: 603-610). Also, for the purposes of this patent, the concept of Cochleate extends to their production from combinations of synthetic lipids with the inclusion of PAMP that act synergistically, which radically differentiates them from other Cochleates produced from lipids. synthetic and not included in the patent referred to above.
  • This concept extends to other vaccines that use adjuvants other than those referred to (Proteoliposomes (AFPLs ⁇ and their derivatives (AFCos).) This concept excludes single-dose vaccines that are obviously also applied in a single time.
  • the mucous and parenteral system are organized differently and even the mucosal is more compartmentalized.
  • the induced responses in the upper respiratory tract are considered to be the best to protect against respiratory infections and that digestive ones require oral immunization. Therefore, it was unexpected to find that the simultaneous application by both routes, mucosal and parenteral are potentiated and even more, that responses enhanced by the application of formulations by several mucosal routes (nasal, oral, sublingual) next to the parenteral are achieved.
  • Parenteral and mucosal responses induced by immunization are independent. Both routes generally require several doses and induce cellular responses that result in generally different antibody responses.
  • the parenteral pathway induces systemic specific IgG responses and the mucosal pathway, particularly the nasal one, induces specific regional and distant IgAS responses (genitourinary tract) and also systemic specific IgG. Therefore, it was not surprising to find systemic specific IgG responses, as these could be the sum of the responses induced by both immunization routes; but it was surprising and unexpected that a single nasal dose was enhanced at the level of at least two nasal doses by parenteral application.
  • Unimmunogenic antigens such as Ovalbumine (Ova) or immunogenic such as tetanus toxoid were efficiently evaluated in this unitemporal strategy. These work incorporated or conjugated with the PL and then transformed into Cochleates or co-administered with them.
  • Ovalbumine Ova
  • immunogenic such as tetanus toxoid
  • Vaccine formulations of the present invention can be used to protect a mammal susceptible to infection or treat tumor diseases by administering said formulation unitemporally.
  • These applications may include injections by intramuscular, intraperitoneal, intradermal, subcutaneous or transcutaneous routes with oral, nasal, rectal, vaginal or sublingual mucosal administration, among others.
  • the number of doses is usually two or several by similar or different mucosal routes and one parenteral with single or combined antigens.
  • the mucosal and systemic immune response induced by similar simultaneous (unitemporal) applications or only one of the ways to amplify the initially induced memory response may be reinforced.
  • the novelty of the invention lies primarily in the simultaneous, unitemporal use of an immunization applied by two or more immunization routes.
  • an mucosal antigen oral, sublingual, vaginal, reacta ⁇ or nasal
  • parenteral subcutaneous, transdermal, intraperitoneal, intradermal or intramuscular
  • Another aspect of novelty is that the unitemporal application of an antigen mucosally and simultaneously parenterally, also induces a regional and distant mucosal immune response that is only achieved with at least 2 and better with 3 mucosal doses. For this potentiation there is no current explanation at the level of lymphocyte circulation guided by cytokine and chemokine signals.
  • Another novel aspect is that the unitemporal immunization strategy allows the use of several antigens by a single or several mucosal routes and the application of the corresponding antigens parenterally in a combined vaccine.
  • Mucosal administration (one or several) is combined with parenteral administration at the same time of vaccination, obtaining enhanced specific responses of mucosal IgAS and systemic IgG.
  • Two adjuvants with similar compositions or the same are used, instead of two different adjuvant systems or vectors applied in traditional sensitization-amplification assays.
  • AFPLl The effectiveness of the AFPLl, one of the proposed adjuvants is safe in children under one year of age, from 2 to 4 years old, in school children, adolescents and adults and the other one derived from it (AFCoI) has already passed the stability and toxicity tests preclinical and is intended to be used mucosally which is less reactive and does not even require sterility, but to ensure a controlled microbial load.
  • Example 1 Obtaining Proteoliposomes (PL). To obtain the PL a culture of N. meningitidis of any serogroup is carried out, particularly the B, Salmonella Typhi, Vibrio cholerae, Echerichia coli, Shiguella, Salmonella or Bordetella pertusus and the biomass collected by centrifugation is subjected to an extraction process with detergent, enzymes and ultrasound.
  • PL Proteoliposomes
  • the Proteoliposome thus obtained contains: porins (PorA and PorB); traces of bacterial DNA and less than 10% (in relation to proteins) of native LPS inserted in its structure; But never free.
  • the porins, the DNA and the LPS present are PAMP that interact with the pattern recognition receptors triggering the warning signals at the level of the cells involved in the innate response.
  • the final product is subjected to a set of biological and physical-chemical controls.
  • the antigen of interest can be increased up to at least 35% relative to the proteins.
  • a similar procedure to obtain liposomal structures enriched in outer membrane proteins has been used based on viruses and protozoa.
  • Example 2 Obtaining Cochleate derived from Proteoliposome. Starting from PL obtained by the methods described in EP 885900077.8 or US 5,597,572. These are resuspended in Tris-EDTA buffer solution with 0.5% sodium deoxycholate. The protein concentration of the suspension was determined using the Lowry methodology modified according to
  • the dialysis was performed by rotational agitation or tangential filtration for 24 h with continuous and slow change of the dialysis buffer in the first or several washes in the second.
  • This last solution consisted of 50-150 mM NaCl, 1-4 mM Imidazole, 3-5 mM HEPES and 2-7 mM CaCl in H 2 O prepared under sterility conditions that were preserved during all steps. Cochleate formation was verified by the formation of a white precipitate and subsequent microscopic observation, both optical and electronic. The protein and phospholipid concentration was again estimated and adjusted for subsequent tests.
  • the physicochemical properties of the proteins included in the Cochleate were checked and compared with those of the PL by electrophoresis in polyacrylamide gels stained with Coomassie Blue. Additionally, the structural integrity of these was checked and verified through the Western Blot methodology.
  • Example 3 The application of AFPLl, AFCoI or VA-MENGOC-BC ® intramuscularly induces specific response of serum IgG in mice.
  • AFPLl 50 ⁇ L of AFPLl, AFCoI or VA-MENGOC-BC ® (Va) by deep intramuscular puncture in one of the animal's hind limbs, with an interval of 14 days.
  • Blood extraction and processing method to obtain the serum Blood collection was performed 21 days after the last dose by puncturing the retroorbital plexus using heparinized capillaries. Blood samples obtained were incubated for 1 h at 37 0 C, then centrifuged at 2000 g for 10 min to extract serum. Detection of anti PL IgG by ELISA: Reagents and Solutions:
  • Coating buffer solution 11 mM Na 2 CO 3 , 35 mM NaHCO 3 (pH 9.6) Phosphate Buffered Saline (SSTF) 0.15 M (pH 7.2) Blocking solution (SSTF / 1% SAB): SSTF 0.15 M (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine (w / v)
  • wash solution (SSTF, 0.1% Tween 20): SSTF, 0.1% Tween 20 (v / v), pH 7.4)
  • Sample dilution solution (SSTF, 1% SAB, 0 to 20 Tween , 1%) Anti-mouse IgG conjugated to peroxidase (Sigam, St. Louis, MO, USA)
  • Substrate buffer solution, STS Na 2 HPO 4 52 mM and citric acid 25 mM (pH 5.6)
  • Stop solution H 2 SO 4 2 M.
  • Standard antibody serum A curve made with double serial dilutions of a hyperimmune mouse serum, obtained from a reference serum for meningo serogroup B, from the Atlanta Center for Disease Control, in English "Center for Disease Control (CDC) "Methodology:
  • the Standard Antibody Serum and the sera to be evaluated are diluted 1: 100 in sample dilution solution. 100 ⁇ L / well are applied in duplicate of the dilutions of the individual sera and the reference serum and incubate 2 h at 37 ° C
  • the reaction is stopped by adding 50 ⁇ L of a stop solution.
  • the optical density absorbance (OD) measurement is performed at 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus)
  • the parallel behavior between the curves was evaluated and the linear fit equation was calculated, as well as the coefficient R 2 .
  • the standard CDC 1992 serum was defined as the independent variable (x) and the standard Finlay serum as the dependent variable (y).
  • the final concentration was determined by substituting in the formula obtained by the values of the 1992 CDC standard for specific IgG.
  • 5000 U / mL of anti-PL IgG antibodies were assigned to the maximum point of the curve and 31.25
  • AChleate applied intramuscularly induced similar specific IgG responses as the vaccine, VA-MENGOC-BC ® and these were significantly superior to those induced by Proteoliposome (AFPLl).
  • Example 4 The application of AFPLl, AFCoI or VA-MENGOC-BC ® intramuscularly does not induce specific secretory IgA response in mouse saliva.
  • mice were immunized with two doses of 12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L of AFPLl, AFCoI or VA-MENGOC-BC ® (Va) by deep intramuscular puncture in one of the animal's hind limbs, with an interval of 14 days
  • Coating buffer solution 11 mM Na 2 CO 3 , 35 mM NaHCO 3 (pH 9.6) Phosphate Buffered Saline (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
  • Blocking solution 1% SSTF / SAB: 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine
  • Washing solution (SSTF, 0.1% Tween 20): SSTF, 0.1% Tween 20 (v / v), pH 7.4) Sample dilution solution (SSTF, 1% SAB, 0.1% Tween 20)
  • Anti-IgA R5-140 of biotinylated peroxidase-conjugated mouse (Sigma, St. Louis, MO, USA) Streptavidin-peroxidase (Sigama, St. Louis, MO, USA)
  • Standard Antibody Saliva As an internal antibody standard, for the IgA anti PL assays, a curve made with saliva samples from hyperimmune mice was used. Methodology:
  • Standard Antibody Saliva and saliva to be evaluated were diluted 1: 2 in. Sample dilution solution. 100 ⁇ L / well is applied in duplicate of the dilutions of the individual sera and the reference serum and incubated 2 h at 37 ° C.
  • Example 5 Cochleate (AFCoI) intranasally induces specific IgA response in saliva superior to Proteoliposome (AFPL1) in mice.
  • mice were immunized with AFPLl or AFCoI intranasally (IN).
  • IN route three doses were administered with a 7-day interval between them, each dose with a concentration of 50 ⁇ g of total proteins for both formulations in a total volume of 25 ⁇ L per mouse, and applied directly to the nostrils with an automatic pipette and sterile tips (12.5 ⁇ L per pit).
  • Method of Extraction and processing of saliva Proceed as described in example 4.
  • Immunization Protocol Balb / c mice were immunized with AFPLl or AFCoI intranasally (IN).
  • IN route three doses were administered with a 7-day spacing between them, each dose with a concentration of 50 ⁇ g of total proteins in both formulations in a total volume of 25 ⁇ L per mouse, and applied directly to the nostrils with an automatic pipette and sterile tips (12.5 ⁇ L per pit)
  • Example 7 The intramuscular route requires two doses of Proteoliposome (AFPLl) or Cochleate (AFCoI) to induce a good serum specific IgG response in mice.
  • AFPLl Proteoliposome
  • AFCoI Cochleate
  • mice were immunized with AFPLl or AFCoI intramuscularly (IM) by deep puncture in one of the animal's hind limbs. Each formulation was administered using two immunization schedules of one and two doses respectively per group, the latter with an interval of 14 days. The dose used had a concentration of 12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L for each formulation.
  • Method of Extraction and processing of blood to obtain serum The procedure was as described in example 3.
  • Fig-5 Summary: The intramuscular application of Proteoliposome (AFPLl) or Cochleate (AFCoI) requires at least two doses to induce significant systemic specific IgG responses.
  • Example 8 The intranasal route requires three doses with Cochleate (AFCoI) or Proteoliposome (AFPLl) to induce high levels of specific IgA in saliva in mice.
  • Immunization Protocol Balb / c mice were immunized with AFPLl or AFCoI intranasally using three immunization schedules of one, two and three doses respectively of each formulation per group. Each dose was administered at an interval of 7 days at a concentration of 50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril as described in example 5.
  • Both AFCoI and AFPLl applied by the nasal route require two doses to induce specific positive IgA responses in saliva. However, with three doses, superior responses are obtained. In all cases, the AFCoI induced higher responses than the AFPLl.
  • Example 9 The intranasal route requires three doses with Cochleate (AFCoI) or Proteoliposome (AFPLl) to induce high levels of serum specific IgG in mice.
  • AFCoI Cochleate
  • AFPLl Proteoliposome
  • mice were immunized with AFPLl or AFCoI intranasally using three immunization schedules of one, two and three doses respectively of each formulation per group. Each dose was administered at an interval of 7 days at a concentration of 50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril as described in example 5.
  • AFPLl Simultaneous intramuscular proteoliposome (AFPLl) (STVS) induces higher specific IgG responses than three doses of nasal AFCoI and similar to two doses of parenteral AFPLl, maintaining similar proportions of serum IgG subclasses in mice.
  • mice were distributed in three immunized groups and one control.
  • a first group were immunized with three doses (0, 7, 14 days) of APCoI intranasally at a concentration of 50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril.
  • a second group immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl intramuscularly at a concentration of 12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L per animal.
  • the third group was immunized with AFCoI (100 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L for each nostril) intranasally and simultaneously with AFPLl (STVS) (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • AFCoI 100 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L for each nostril
  • Coating lamp solution Na 2 CO 3 11 mM, NaHCO 3 35 mM (pH 9.6)
  • Blocking solution 1% SSTF / SAB: 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine
  • Example 11 Immunization of a dose of simultaneous intramuscular Cochleate (AFCoI) and simultaneous intramuscular Proteoliposome (AFPLl) (STVS) induces high levels of anti PL IgA in saliva, feces and vaginal lavage in immunized mice.
  • AFCoI simultaneous intramuscular Cochleate
  • AFPLl simultaneous intramuscular Proteoliposome
  • mice Female Balb / c mice were distributed in three immunized groups and one control. A first group was immunized with three doses (0, 7, 14 days) of AFCoI intranasally at a concentration of 50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril. A second group was immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl intramuscularly at a concentration of 12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L per animal. The third group was immunized with a dose of AFCoI (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time.
  • AFCoI 100 ⁇ g in 25 ⁇ L
  • AFPLl 12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L
  • Saliva extraction and processing method in this example saliva extraction was performed 7 and 14 days after immunization and the rest was performed as indicated in example 4.
  • Stool extraction and processing method stool extraction was performed 14 days after the last dose. Three fecal pellets were collected per animal. The feces were weighed by subtracting the value of the weight of the vials. These pellets were resuspended in a solution of PBS with protease inhibitors (1 mM PMSF and 5 ⁇ g of Aprotinin per mL), using a dilution of 20 ⁇ L per mg of feces. The resuspended samples were vigorously agitated using a magnetic stirrer (vorter), discarding the insoluble material by centrifugation (40,000 rpm, 20 minutes at 4 ° C) and storing the supernatant for further analysis.
  • a magnetic stirrer vorter
  • vaginal lavage samples were collected 21 days after the last dose as well as serum. These were obtained by applying 100 ⁇ L of sterile PBS into the animal's vagina, aspirating the vaginal wash and collecting it in vials. They were then centrifuged at 14000 rpm, 15 minutes at 4 ° C, keeping the supernatant for further analysis.
  • Example 12 Immunization of a dose of intranasal Ovalbumin (AFCol-Ova) Cochleate and simultaneous intramuscular Ova (AFPLl-Ova) Proteoliposome (STVS) induces high levels of anti-Ova IgG in mice.
  • AFCol-Ova intranasal Ovalbumin
  • AFPLl-Ova simultaneous intramuscular Ova
  • STVS Proteoliposome
  • mice were distributed in four immunized groups and one control.
  • a first group was immunized with three doses (0, 7, 14 days) of AFCol-Ova intranasally at a concentration of 50 ⁇ g / 20 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril.
  • a second group was immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl-Ova intramuscularly at a concentration of 12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L per animal.
  • the third group was immunized with a dose of AFCol-Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril) intranasally and a simultaneous dose of AFPLl-Ova (12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in
  • the fourth group was immunized with two doses (0.14 days) of Ova intramuscularly at a concentration of 10 ⁇ g in 50 ⁇ L per animal.
  • Coating buffer solution 11 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3 (pH 9.6) Phosphate Buffered Saline (SSTF) 0.15 M (pH 7.2) Blocking solution (SSTF / 1% SAB): 0.15 M SSTF (pH 7.2 ), 1% Bovine Seroalbumine (w / v)
  • wash solution (SSTF, Tween 20 0.1%): SSTF, Tween 20 0.1% (v / v), pH 7.4) Sample dilution solution (SSTF, SAB 1%, Tween 20 0.1%) Anti-IgG mouse conjugated to peroxidase (Sigma, St. Louis, MO, USA) Substrate buffer solution, STS (52 mM Na2HPO4 and 25 mM citric acid (pH 5.6))
  • the sera to be evaluated were diluted 1: 100 in Sample dilution solution. 100 ⁇ L / well are applied in duplicate of the dilutions of the individual sera and the reference serum and incubate 2 h at 37 ° C.
  • the reaction is stopped by adding 50 ⁇ L of a stop solution.
  • the absorbance measurement (OD) is performed at a reading of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • AFCol-Ova Intranasal
  • AFPLl-Ova simultaneous intramuscular Ova
  • STVS Proteoliposome
  • mice Balb / c mice were distributed in five immunized groups and one control. A first and a second group were immunized with three (0, 7, 14 days) and 2
  • AFPLl-Ova intramuscularly at a concentration of 12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L per animal.
  • the fourth group was immunized with AFCol-Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril) intranasally and simultaneously AFPLl-Ova (STVS) (12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly .
  • STVS AFPLl-Ova
  • Saliva Extraction and Processing Method In this example saliva extraction was performed 7 and 14 days after immunization the rest was performed as indicated in example 4.
  • Coating buffer solution 11 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3 (pH 9.6) Phosphate Buffered Saline (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
  • Blocking solution 1% SSTF / SAB: 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine
  • Washing solution (SSTF, Tween 20 0.1%): SSTF, Tween 20 0.1% (v / v), pH 7.4)
  • Substrate buffer solution STS (52 mM Na2HPO4 and 25 mM citric acid (pH 5.6))
  • Stop Solution H2SO42 M. Standard Antibody Saliva: As an internal antibody standard, for the testing of
  • IgA anti-PL a curve made with saliva samples from hyper immune mice was used.
  • the saliva to be evaluated is diluted 1: 2 in Sample dilution solution. 100 ⁇ L / well is applied in duplicate of the dilutions of the individual sera and the reference serum and incubated 2 h at 37 ° C.
  • a second conjugate (streptavidin peroxidase) is added in a 1: 2000 dilution in Sample Dilution Solution and incubated 30 min at 37 ° C
  • the reaction is stopped by adding 50 ⁇ L of a stop solution.
  • intranasal AFCoI -Ova and intramuscular AFPLl -Ova induces significant anti-Ova IgA responses in saliva. These are superior to those induced by two doses of AFCoI -Ova or 3 doses of intranasal Ova and not induced by two doses of
  • Cochleate (AFCoI) and Proteoliposome (AFPLl) can be efficiently used by both immunization routes (intranasal and intramuscular) in the unitemporal strategy.
  • mice were distributed in four immunized groups and one control.
  • a first group was immunized with a dose of AFCoI (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time
  • the second with a dose of AFCoI (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and a dose of AFCoI (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time
  • the third with a dose of AFPLl (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time.
  • As a positive control a group with three doses (0, 7, 14 days) of AFCoI intranasally at a concentration of 50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostri
  • Cochleate (AFCoI) and Proteoliposome (AFPLl) containing Ovalbumin (AFCol-Ova and AFPLl-Ova) can be efficiently used by both immunization routes (Intranasal and Intramuscular) in the unitemporal strategy.
  • mice were distributed in five immunized groups and one control.
  • a first group was immunized with a dose of AFCol-Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and a dose of AFPLl-Ova (12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time.
  • AFCol-Ova 100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L
  • AFPLl-Ova 12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L
  • the second group was immunized with a dose of AFCoI-Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and a dose of AFCol-Ova (12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time and the third with a dose of AFPLl-Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and a dose of AFPLl-Ova (12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time.
  • a group with three doses (0, 7, 14 days) of AFCol-Ova was used intranasally at a concentration of 50 ⁇ g / 25 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril and another with three intranasal Ova dose (25 ⁇ g / 25 ⁇ L) per animal
  • the Unitemporal Vaccination Strategy also includes the administration of a dose of AFCoI by other mucosal routes (oral or sublingual) and AFPLl intramuscularly, respectively at the same time (STVS) inducing high levels of specific IgA in feces and vaginal lavage .
  • mice were distributed in six immunized groups and one control. The first three groups were immunized with a dose of AFCoI intranasally (IN) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), oral (IG) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or sublingual (Sl) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), respectively and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time.
  • AFCoI intranasally 100 ⁇ g in 25 ⁇ L
  • IG oral
  • Sl sublingual
  • AFPLl AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L
  • IM intramuscularly
  • Detection of anti PL IgA by ELISA Proceed as described in Example 4. Conclusion of the results: a dose of Intramuscular AFPLl combined with a dose of oral or sublingual AFCoI in a single time (STVS) induces high levels of anti IgA PL in feces and vaginal lavage, compared with those induced by the three doses of AFCoI administered orally or sublingually (Fig. 17 and 18).
  • Example 17 Unitemporal administration of a dose of AFCoI orally or sublingually and AFPLl intramuscularly respectively (STVS) induces high levels of serum-specific IgG in mice.
  • mice were distributed in six immunized groups and one control. The first three groups were immunized with a dose of AFCo.l intranasally (IN) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), oral (IG) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or sublingual (Sl) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) , respectively and one dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time.
  • AFCo.l intranasally 100 ⁇ g in 25 ⁇ L
  • IG oral
  • Sl sublingual
  • the remaining three groups were immunized with three doses (0, 7, 14) of AFCoI IN (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), IG (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or Sl (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), respectively.
  • a dose of intramuscular AFPLl combined with a dose of oral or sublingual AFCoI in a single time induces as high levels of serum anti PL IgG, as those induced by the three doses of oral or sublingual administered AFCoI (Fig. 19).
  • Example 18 In the strategy of Unitemporal Vaccination the administration of AFCoI by several mucosal routes at the same time in combination and AFPLl by intramuscular route at the same time (STVS) induces high levels of specific IgA in feces, in mice.
  • Immunization Protocol Balb / c mice were distributed in thirteen immunized groups and one control.
  • the first three groups were immunized with a dose of AFCoI intranasally (IN) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), oral (IG) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or sublingual (Sl) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), respectively and one dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time.
  • AFCoI intranasally 100 ⁇ g in 25 ⁇ L
  • IG oral
  • Sl sublingual
  • AFPLl intramuscularly
  • Three other groups were immunized with AFCoI by combining two of the previous mucosal pathways and one dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) by IM in a single time, IN-IG-IM, IN-Sl-IM or IG-Sl- IM.
  • the remaining three groups were immunized with three doses (0, 7, 14) of AFCoI IN (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), IG (100 ⁇ g in 2O ⁇ ' ⁇ L) or Sl (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), respectively.
  • Detection of anti PL IgA by ELISA Proceed as described in Example 4. Conclusion of the results: one dose of intramuscular AFPLl at the same time (STVS) with one dose of AFCoI by several combined mucosal induces high levels of anti IgA PL in feces and vaginal lavage, compared with those induced by the three doses of AFCoI administered intranasally, orally or sublingually. These responses are synergized by the simultaneous application of two mucosal pathways (Fig. 20-22).
  • Example 19 Immunization with diphtheria toxoid (TT) tetanus toxoid (TD) or cellular pertussis (P), co-administered with the Cocleate intranasally, sublingually and orally, respectively simultaneously with the DPT vaccine (absorbed in alumina ) added intramuscularly induces significant systemic IgG responses against all antigens.
  • Immunization Protocol Balb / c mice were distributed in seven immunized groups and one control.
  • the first three groups were immunized with AFCol + TT (100 ⁇ g / 10 LF (flocculation units) in 25 ⁇ L) intranasally (IN), AFCoI-TD (100 ⁇ g / 25 LF in 25 ⁇ L) sublingually (Sl ) or AFCoI-P (100 ⁇ g / 16 UO (opacity units) in 25 ⁇ L) orally (IG) and simultaneously intramuscular DPT (IM).
  • Groups 4, 5 and 6 were immunized with 3 doses in simulated concentrations of AFCol + TT, AFCoI-TD or AFCoI-P by IN, SL or IG routes respectively.
  • Another group was immunized with two doses of IM DPT.
  • TT anti-Tetanus Toxoid
  • ELISA Reagents and Solutions: Tetanus Toxoid: ATPE- Lot 8005 Finlay Institute, c (808LF / mL)
  • Blocking solution 1% SSTF / SAB: 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine
  • the sera to be evaluated were diluted 1: 100 in Sample dilution solution. 100 ⁇ L / well are applied in duplicate of the dilutions of the individual sera and the reference serum and incubate 2 h at 37 ° C.
  • Diphtheria Toxoid ADPE- Lot 8001 Finlay Institute, c (1200LF / mL) Coating buffer solution (STR): Na 2 CO 3 11 raM, NaHCO 3 35 mM (pH 9.6)
  • Blocking solution 1% SSTF / SAB: 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine
  • Substrate buffer solution STS (52 mM Na 2 HPO 4 and 25 mM citric acid (pH 5.6))
  • the sera to be evaluated were diluted 1: 100 in Sample dilution solution. 100 ⁇ L / well are applied in duplicate of the dilutions of the individual sera and the reference serum and incubate 2 h at 37 ° C. • Wash three times with Wash Solution • 100 ⁇ L / well of the Anti IgG conjugate diluted 1: 2000 in solution of
  • PC Cellular Pertussis
  • Blocking solution 1% SSTF / SAB: 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine
  • the sera to be evaluated were diluted 1: 100 in Sample dilution solution. 100 ⁇ L / well are applied in duplicate of the dilutions of the individual sera and the reference serum and incubate 2 h at 37 ° C. • Wash three times with Wash Solution
  • Example 20 The single dose immunization with the intramuscular Cochleate (AFCoI) and the simultaneous intramuscular Proteoliposome (AFPLl) (STVS) induces demonstrated memory response after a booster dose administered at 4 months after immunization.
  • AFCoI intramuscular Cochleate
  • AFPLl simultaneous intramuscular Proteoliposome
  • mice were distributed in two immunized groups and one control.
  • a first group immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl intramuscularly at a concentration of 12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L per animal.
  • the second group was immunized with a dose of AFCoI (50 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril) by route intranasally and simultaneously (STVS) AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • AFCoI 50 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril
  • Method of Extraction and processing of blood to obtain serum The procedure was as described in example 3, adding that the extractions were performed at 21 days, 70, 90 and 120 days after the last dose administered, as well as at 21 days after the challenge.
  • the unitemporal immunization strategy not only induces responses at the effector level but also induces a good memory response appreciated after administering a booster dose 4 months after immunization.
  • Example 22 Immunization with the Cochleate containing Ova (AFCol-Ova) Intranasal and the simultaneous intramuscular Ova (AFPLl-Ova) Proteoliposome (STVS) induces anti-Ova memory response after a dose of Ova booster administered at 4 months after immunization
  • mice were distributed in three immunized groups and one control.
  • a first group immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl-Ova intramuscularly at a concentration of 12.5 ⁇ g / lO ⁇ g at 50 ⁇ L per animal.
  • the second group was immunized with a dose of AFCol-Ova (50 ⁇ g / 25 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril) intranasally and simultaneously (STVS) a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g / lO ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • a third group immunized with two doses Ova (10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscular.
  • Ova 10 ⁇ g in 50 ⁇ L
  • an intranasal challenge was performed with 25 ⁇ g of Ova included in AFCoI in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L for each nostril in groups 1 and 2 or only intramuscular Ova in group
  • the unitemporal immunization strategy with Ova as an incorporated antigen not only induces responses at the effector level but also induces an anti-Ova memory response appreciated after administering an intranasal Ova booster dose at 4 months after immunization.
  • the unitemporal immunization strategy with Ova as an incorporated antigen not only induces responses at the effector level but also induces an anti-Ova memory response appreciated after administering an intranasal Ova booster dose at 4 months after immunization.
  • Example 23 The Unitemporal Immunization Strategy also works using other mucosal adjuvants such as cholera toxin (CT).
  • CT cholera toxin
  • mice were distributed in two immunized groups and one control.
  • a first group was immunized with a dose of APCol-Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and simultaneously a dose of AFPLl-Ova (25 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • a second group was immunized with a dose of CT-Ova (5 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and simultaneously a dose of CT-Ova (5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • Method of Extraction and processing of blood to obtain the serum The procedure was as described in example 3.
  • Method of Extraction and processing of vaginal lavage The procedure was carried out as described in example 11.
  • Detection of anti-Ova IgG by ELISA Proceed as described in example 14.
  • Detection of anti-Ova IgA by ELISA Proceed as described in example 15.
  • FIG. 1 Anti-PL IgG response in serum induced by AFCoI, AFPLl or VA-MENGOC-BC ® administered intramuscularly.
  • Balb / c mice were immunized with 2 doses (0, 14 days) of AFCoI, AFPLl or VA-MENGOC-BC ® Intramuscularly (12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L).
  • the serum samples extracted 21 days after the last dose were used for the evaluation of anti PL IgG levels. The determination was made through a
  • IgG ELISA anti PL The figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (U / mL) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test
  • FIG. 1 Anti-PLA IgA response in saliva induced by AFCoI, AFPLl or VA-MENGOC-BC ® administered intramuscularly.
  • Balb / c mice were immunized with two doses (0.14 days) of AFCoI, AFPLl or VA-MENGOC-BC ® Intramuscularly (12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L).
  • For the evaluation of anti PL IgA levels saliva samples extracted 7 days after the last immunized dose were used. The determination was made by an anti PLA IgA ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (UAJmL) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 3 Anti-PLA IgA response in saliva induced by AFCoI or AFPLl administered intranasally.
  • Balb / c mice were immunized with three doses (0, 7, 14 days) of AFCoI or AFPLl intranasally (50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril).
  • saliva samples extracted 7 days after the last dose were used. The determination was made by an anti PLA IgA ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (AU / mL) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • Anti-PL IgG response in serum induced by AFCoI or AFPLl administered intranasally Balb / c mice were immunized with three doses (0, 7, 14 days) of AFCoI or AFPLl intranasally (50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril).
  • AFCoI or AFPLl intranasally 50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril.
  • the determination was made by means of an anti PL IgG ELISA.
  • the graph shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (U / mL) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 1 Serum anti PL IgG response induced by one and two doses of AFCoI or AFPH administered intramuscularly.
  • Balb / c mice were immunized with one or two doses of AFCoI or AFPLl Intramuscularly (12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L).
  • the serum samples extracted 21 days after the last dose were used for the evaluation of anti PL IgG levels.
  • the determination was made by an anti PL IgG ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (U / mL) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 6 Anti PLA IgA response in saliva induced by one, two or three doses of AFCoI or AFPLl administered intranasally.
  • Balb / c mice were immunized with one, two or three doses of AFCoI or AFPLl intranasally (50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril).
  • saliva samples extracted 7 days after the last dose were used. The determination was made by an anti PLA IgA ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (AU / mL) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • AFCoI or AFPLl administered intranasally Balb / c mice were immunized with one, two or three doses of AFCoI or AFPLl intranasally (50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril).
  • anti PL IgG levels serum samples taken 21 days after the last dose. The determination was made by an anti PL IgG ELISA.
  • the figure shows the means and standard deviation of the mathematical relationship of the values (LVmL) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 8 Serum anti PL IgG response induced by unitemporal immunization (STVS) of Intranasal AFCoI and Intramuscular AFPLl.
  • Balb / c mice were distributed in three immunized groups and one as a control.
  • a first group immunized with three doses (0, 7, 14 days) of AFCoI (50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril) intranasally (IN).
  • a second group immunized with two doses (0, 14 days) of AFPLl (12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L per animal) Intramuscularly (IM).
  • FIG. 9 Response of IgGl and IgG2a anti PL in serum induced by unitemporal immunization (STVS) of Intranasal AFCoI and Intramuscular AFPLl.
  • Balb / c mice were distributed in three immunized groups and one as a control.
  • a first group immunized with three doses (0, 7, 14 days) of AFCoI (50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril) intranasally (IN).
  • a second group immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl (12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L per animal) Intramuscularly (IM).
  • AFPLl 12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L
  • AFCoI 100 ⁇ g / 25 ⁇ L
  • mice were distributed in four immunized groups and one as a control.
  • a first group immunized with three doses (0, 7, 14 days) of AFCoI (50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal) by Intranasal route (IN).
  • IM intramuscularly
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (UA / mL) of the saliva extracted at 7 days for the AFCoI, AFPLl groups and at 14 days for the STVS group in 3 independent experiments in which The answers were the maximum.
  • Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 11 Anti-PLA IgA response in feces, induced by simultaneous immunization of Intramuscular AFPLl and Intranasal AFCoI in a single time (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in three immunized groups and one control.
  • a first group was immunized with a dose of intramuscular (IM) AFPLl (12.5 ⁇ g / 50 ⁇ L) and intranasal (IN) AFCoI (100 ⁇ g / 25 ⁇ L) in a single time and a second group immunized with three doses (0, 7 , 14 days) of AFCoI (50 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal) via IN.
  • IM intramuscular
  • IN intranasal
  • Balb / c mice were distributed in three immunized groups and one control.
  • IM intramuscular
  • AFCoI 100 ⁇ g / 25 ⁇ L
  • IN route intranasal
  • FIG. 13 Serum anti Ova IgG response induced by unitemporal immunization (STVS) of Intranasal AFCol-Ova and Intramuscular AFPL-Ova.
  • Balb / c mice were distributed in four immunized groups and one as a control.
  • a first group immunized with three doses (0, 7, 14 days) of AFCol-Ova (50 ⁇ g / 25 ⁇ g / 25 ⁇ L per animal, 12.5 ⁇ L per nostril) intranasally (IN).
  • a second group immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl-Ova (12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g / 50 ⁇ L per animal) intramuscularly (IM).
  • Ova 10 ⁇ g / 50 ⁇ L per animal
  • FIG. 14 Anti Ova IgA response in saliva induced by unitemporal immunization (STVS) of Intranasal AFCoI and Intramuscular AFPLl.
  • STVS unitemporal immunization
  • Balb / c mice were distributed in four immunized groups and one as a control.
  • IM intramuscularly
  • FIG. 15 Anti PL IgG response induced by simultaneous immunization of intramuscular AFCoI and intranasal AFCoI in a single time or intramuscular AFPLl and intranasal AFPLl in a single time (homologous STVS).
  • Balb / c mice were distributed in four immunized groups and one control.
  • a first group was immunized with a dose of AFCoI (lOO ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally (IN) and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time, the second with a dose of AFCoI (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) by IN route and a dose of AFCoI (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) by IM in a single time and the third with a dose of AFPLl (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) by IN route and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly in a single time.
  • FIG. 16 Anti Ova IgG response induced by simultaneous immunization of Intramuscular AFCol-Ova and Intranasal AFCol-Ova in a single time or Intramuscular AFPLl-Ova and Intranasal AFPLl-Ova in a single time (STVS homologue).
  • Balb / c mice were distributed in six immunized groups and one control.
  • a first group immunized with a dose of AFCol-Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally (IN) and a dose of AFPLl-Ova (12.5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) In a single time.
  • serum samples taken 21 days after the last dose were used for the evaluation of anti-Ova IgG levels.
  • FIG. 1 IgA response in feces induced by unitemporal administration of one dose of AFCoI orally or sublingually and AFPLl intramuscularly, respectively at the same time (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in six immunized groups and one control. The first three groups were immunized with a dose of AFCoI intranasally (IN) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), oral (IG) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or sublingual (Sl) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) respectively and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time.
  • the remaining three groups were immunized with three doses (0, 7, 14) of AFCoI IN (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), IG (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or Sl (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), respectively .
  • AFCoI IN 50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal
  • IG 100 ⁇ g in 200 ⁇ L
  • Sl 50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal
  • FIG. 18 IgA response in vaginal lavage induced by unitemporal administration of one dose of AFCoI orally or sublingually and AFPLl intramuscularly, respectively at the same time (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in six immunized groups and one control. The first three groups were immunized with a dose of AFCoI intranasally (IN) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), oral (IG) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or sublingual (Sl) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) respectively and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time.
  • the remaining three groups were immunized with three doses (0, 7, 14) of AFCoI IN (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), IG (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or Sl (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), respectively .
  • AFCoI IN 50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal
  • IG 100 ⁇ g in 200 ⁇ L
  • Sl 50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal
  • FIG. 19 Serum IgG response induced by unitemporal administration of one dose of AFCoI orally or sublingually and AFPLl intramuscularly at the same time (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in six immunized groups and one control. The first three groups were immunized with a dose of AFCoI intranasally (IN) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), oral (IG) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or sublingual (Sl) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), respectively and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time.
  • IM intramuscularly
  • the remaining three groups were immunized with three doses (0, 7, 14) of AFCoI IN (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), IG (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or Sl (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal), respectively .
  • the serum samples extracted 21 days after the last dose were used for the evaluation of anti PL IgG levels.
  • the determination was made by an anti PL IgG ELISA.
  • the figure shows the means and standard deviations of the mathematical relationship of the values (LVmL) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 20 Anti-PLA IgA response in feces, induced by simultaneous immunization of intramuscular AFPLl and intranasal-oral AFCoI combined in a single time
  • mice Balb / c mice were distributed in five immunized groups and one control. The first two groups were immunized with a dose of AFCoI intranasally (IN) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) or oral (IG) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L), respectively and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time. Another group immunized with a dose of AFCoI by IN route (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) and IG (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) in combination and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) by IM route in a single time.
  • AFCoI intranasally 100 ⁇ g in 25 ⁇ L
  • IG oral
  • AFPLl intramuscularly
  • Another group immunized with a dose of AFCoI by IN route (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) and IG (100
  • FIG. 21 Anti-PLA IgA response in feces, induced by the simultaneous immunization of Intramuscular AFPLl and intranasal-sublingual AFCoI combined in a single time (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in five immunized groups and one control. The first two groups were immunized with a dose of AFCoI intranasally (ESi) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L) or sublingual (Sl) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L), respectively and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time.
  • ESi AFCoI intranasally
  • Sl sublingual
  • AFPLl AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L
  • IM intramuscularly
  • Two remaining groups were immunized with three doses (0, 7, 14) of AFCoI IN (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal) or sublingual (50 ⁇ g in 25 ⁇ L), respectively.
  • IgA levels against PL stool samples taken 14 days after the last immunized dose were used. The determination was made by means of an IgA ELISA against PL.
  • the graph shows the means and standard deviations of the mathematical relationship of the values (UAJmL) of IgA in feces extracted at 21 days in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG 22 Anti-PLA IgA response in feces, induced by simultaneous immunization of intramuscular AFPL1 and oral-sublingual AFCoI combined in a single time (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in five immunized groups and one control. The first two groups were immunized with a dose of AFCoI orally (IG) (100 ⁇ g in 200 ⁇ L) or sublingual (Sl) (100 ⁇ g in 25 ⁇ L), respectively and a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) in a single time.
  • IG AFCoI orally
  • Sl sublingual
  • AFPLl AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L
  • IM intramuscularly
  • the remaining two groups were immunized with three doses (0, 7, 14) of AFCoI Sl (50 ⁇ g in 25 ⁇ L per animal) or IG (100 ⁇ g in 200 ⁇ L).
  • IG 100 ⁇ g in 200 ⁇ L
  • the graph shows the means and standard deviations of the mathematical relationship of the values (UA / mL) of fecal IgA extracted at 21 days in 3 independent experiments.
  • FIG 23 Anti-PL memory response induced by simultaneous immunization of intranasal AFCoI and intramuscular AFPLl (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in two immunized groups and one control.
  • a first group immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl intramuscularly (IM) at a concentration of 12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L per animal.
  • the second group was immunized with a dose of AFCoI (50 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril) intranasally (IN) and simultaneously a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly (IM) ( STVS).
  • an intranasal challenge was performed with 50 ⁇ g of each antigen in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril.
  • serum samples taken 21, 70, 90 and 120 days after the last immunization dose were used, as well as 14 and 21 days after the challenge.
  • the determination was made by an anti PL IgG ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 24 Anti-Ova memory response induced by the simultaneous immunization of intranasal AFCol-Ova and intramuscular AFPL-Ova (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in three immunized groups and one as a control.
  • a first group immunized with two doses (0.14 days) of AFPLl-Ova intramuscularly (IM) at a concentration of 12.5 ⁇ g / lO ⁇ g at 50 ⁇ L per animal.
  • IM AFPLl-Ova intramuscularly
  • the second group was immunized with a dose of AFCol-Ova (50 ⁇ g / 25 ⁇ g in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril) intranasally (IN) and simultaneously (STVS) a dose of AFPLl (12.5 ⁇ g / lO ⁇ g in 50 ⁇ L) via IM.
  • a third group immunized with two doses Ova (10 ⁇ g in 50 ⁇ L) IM.
  • a challenge was performed intranasally with AFCol-Ova (50 ⁇ g / 25 ⁇ g) in 25 ⁇ L, 12.5 ⁇ L per nostril.
  • a first group was immunized with a dose of APCoI -Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and simultaneously a dose of AFPLl -Ova (25 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • a second group was immunized with a dose of CT-Ova (5 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and simultaneously a dose of CT-Ova (5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • anti-Ova IgG levels serum samples taken 21 days after the last dose were used. The determination was made by an anti-Ova IgG ELISA. The figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 26 Anti Ova IgA response in vaginal lavage induced by unitemporal administration of a dose of CT-Ova intranasally and CT-Ova intramuscularly at the same time (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in two immunized groups and one control.
  • a first group was immunized with a dose of AFCoI -Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and simultaneously a dose of AFPLl -Ova (25 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • a second group was immunized with a dose of CT-Ova (5 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and simultaneously a dose of CT-Ova (5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • CT-Ova 5 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L
  • CT-Ova 5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L
  • intramuscularly For the evaluation of anti-Ova IgA levels, vaginal lavage samples taken at 21 days after the last dose were used. The determination was made using an anti-Ova IgA ELISA. The figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of the vaginal lavage extracted at 21 days in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 27 Anti-Ova IgA response in feces induced by the unitemporal administration of a dose of CT-Ova intranasally and CT-Ova intramuscularly at the same time (STVS).
  • Balb / c mice were distributed in two immunized groups and one control.
  • a first group was immunized with a dose of AFCoI -Ova (100 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and simultaneously a dose of AFPLl-Ova (25 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • a second group was immunized with a dose of CT-Ova (5 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L) intranasally and simultaneously a dose of CT-Ova (5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L) intramuscularly.
  • a dose of CT-Ova 5 ⁇ g / 50 ⁇ g in 25 ⁇ L
  • a dose of CT-Ova 5 ⁇ g / 10 ⁇ g in 50 ⁇ L
  • intramuscularly For the evaluation of the levels of anti-Ova IgA, stool samples taken 14 days after the last dose were used. The determination was made using an anti-Ova IgA ELISA. The figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of the feces extracted at 14 days in 3 independent experiments. Different p denote significant differences according to Tukey test (p ⁇ 0.05).

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de las vacunas y, en concreto, con una formulación vacunal que contiene el proteoliposoma derivado de la membrana externa de Neisseria meningitidis serogrupo B (AFPLl) o su derivado el cocleato (AFCoI), solos o junto con uno o más antígenos microbianos o tumor ales, así como con el uso de dicha formulación vacunal en la prevención y tratamiento de infecciones o enfermedades tumorales mediante su administración simultánea por dos vías de administración, mucosal y parenteral.

Description

VACUNAS UNITEMPORALES
Memoria Descriptiva
Rama de la Técnica
Esta invención se relaciona con el campo de nuevas vacunas, específicamente con la obtención y uso de vacunas unitemporales para el tratamiento o prevención de infecciones de diferente naturaleza, así como para el tratamiento de tumores. Más particularmente, ésta se relaciona con una estrategia vacunal unitemporal que resuelve los problemas de vacunaciones multidosis ineficientes, cuando se produce la inasistencia o pérdida de los sujetos a las dosis sucesivas y hace a las vacunas parenterales actuales más eficientes al inducir también, respuestas mucosales usando combinaciones de eficientes adyuvantes mucosales y formulaciones parenterales con antígenos vacunales incluidos, conjugados o co- administrados.
Estado del arte
Las infecciones por hongos, virus, bacterias, protozoos y helmintos causan patologías frecuentes en todo el mundo. La inmensa mayoría de éstas invaden al organismo o se establecen en el tejido mucosal (Brandtzaeg P and Pabst R. TRENDS in Immunology, 2004,25(11):570-577). Existe consenso en que la IgAS es el principal protector de las mucosas y sólo se induce por inmunizaciones o desafíos por vía mucosal. No obstante, la inmunización nasal claramente aparece como preferible contra los patógenos respiratorios y pueden, hasta cierto punto, proteger el tracto genital femenino. Los anticuerpos de clase IgAS en saliva pueden reflejar una respuesta mucosal del tejido linfoide asociado a la nasofaringe (NALT) inducida en las vías aéreas. No obstante, la vía nasofaríngea no es una alternativa para la vacunación de gérmenes intestinales, la cual principalmente, es la oral (Brandtzaeg P et al. Immunol Today, 1999,20:141-151). Por lo que, entender los mecanismos de inmunidad mucosal y el desarrollo de vacunas mucosales representa uno de los mayores desafíos en la vaccinología. La pfesencia de mecanismos innatos y la IgG específica sistémica también están involucradas en la protección mucosal. Por lo que la vía parenteral, sin inducir generalmente IgAS protege contra las enfermedades infecciosas; pero no elimina los estadios de portador. Los portadores, al acarrear el germen sin generalmente padecer la enfermedad, son los de mayor riesgo epidemiológico por ser constantes diseminadores de la infección.
Los adyuvantes están involucrados en: estimular la respuesta innata (Inmunopotenciadores); distribuir adecuadamente los antígenos (Sistema de Reparto ('Delivery')) (Pashine A Valianti NM. Nat. Med. 2005,1 l:S63-68; Singh M y O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002,19(6):715-728) y dirigir la respuesta inmune hacia las respuestas protectoras deseadas (Immunopolarización) (O Pérez, et al. PharmacologyOnline, 2006,3:762-64). El desarrollo de inmunopotenciadores o sistemas de reparto que sean efectivos por vía mucosal es otro objetivo principal del desarrollo de vacunas y de las compañías farmacéuticas mundiales. Estas se han centrado en buscar Sistemas de Adyuvantes que combinen uno o varios inmunopotenciadores con un adecuado sistema de reparto. Nosotros, por el contrario, partimos de una sustancia que tiene varios Inmunopotenciadores que actúan sinérgicamente, que a la vez tiene capacidades de reparto y que polariza la respuesta inmune hacia respuestas preferenciales ThI con la inducción también de respuestas CTL (Pérez O, et al. Scand J Immunology 2007,66:271-77; certificado de autor de invención OCPI 23313, 2008 Pérez Martín OG y cois; WO/2004/047805; WO/2003/094964 y EP1716866)
De manera general podemos decir que existen diferentes tipos de vacunas que se aplican hoy en día a nivel mundial. En el caso de las vacunas combinadas significan, la aplicación de diferentes antígenos vacunales en la misma formulación. Estas pueden incorporase durante su producción o mezclarse a la hora de la inmunización. Esto conlleva a reducir el número de inyecciones que se aplican. Las vacunas concurrentes significan la aplicación simultánea de más de un antígeno vacunal, en el mismo tiempo; pero en lugares diferentes. Estas se basan en la regionalización del sistema inmune que permite inducir respuestas diferentes en cada región, aún frente a desafíos simultáneos.
En el caso de las vacunas unidosis significan lograr inmunizaciones con una sola dosis. Esto generalmente se logra con vacunas de organismos vivos atenuados que al replicarse en el organismo, garantizan la inducción de una adecuada respuesta inmune con una sola dosis. Una estrategia reciente unidosis para vacunas de Influenza nasales ha sido reportada (F. Martin y cois. EP1878424). La Organización Mundial de la Salud incluye en su plan estratégico 2006-2009 obtener vacunas que requieran menos dosis para alcanzar el nivel de inmunorespuesta deseado. Las vías alternativas de inmunización están basadas en que, la inmunización parenteral al requerir jeringuillas y agujas, induce: miedo en la población receptora, sobre todo en las vacunas profilácticas y la posibilidad de reutilización de agujas en determinadas regiones o grupos, con el consiguiente incremento del riesgo de transmisión de enfermedades. Las vías alternativas incluyen la: oral, nasal, vaginal, rectal, transdérmica y sublingual, entre otras. La regionalización de la respuesta mucosal ha conllevado a encontrar evidencias de que las infecciones que ocurren por las vías aéreas sean mejor protegidas por inmunizaciones nasales, las que además, inducen protección en el tracto genital femenino (Brandtzaeg P, Pabst R. TRENDS in Immunology. 2004,25(11):570-577). Por el contrario, la vía oral es la aconsejada para proteger contra las infecciones del tracto gastrointestinal. No obstante, sólo las vacunas orales son un hecho, aunque recientemente Medlmmune licenció una vacuna nasal contra la influenza (FluMisT, Belshe RB, Mendelman PM, Treanor J, King J, Gruber WC, Piedra P, et al. NEJM 1998,338:11405-12).
La respuesta inmune mucosal es generalmente la inducción de Tolerancia. Esta cursa con respuestas de IgAS a nivel de las mucosas y no inducción de IgG sistémica que la hace efectiva contra los múltiples gérmenes comensales con que cuenta el organismo, en particular el humano. No obstante, la inducción de IgG específica sistémica, además de la IgAS, es un pilar importante en la inmunización mucosal. La IgA contiene una cadena J y un componente secretor involucrado en el transporte hacia el lumen mucosal, donde se le conoce como IgAS. La IgA se puede presentar en forma monomérica o multimérica y presenta dos subclases: la IgAi y la IgA2. Esta última es más resistente a las proteasas producidas por varios microorganismos. La IgAS se induce casi exclusivamente por infecciones o inmunizaciones mucosales y existe consenso de que este anticuerpo es el principal protector de las mucosas.
La IgA detectada en saliva representa el mejor marcador para medir la inducción de respuesta inmune en la nasofaringe y se desea encontrar un buen marcador para la inmunización oral (Brandtzaeg P. Int. J. Med. Microbiol. 2003,293:3-15).
Los adyuvantes son sustancias que potencian la respuesta inmune específica contra un antígeno provocando una inducción más rápida de ésta y aumentando su duración (Vogel FR. Dev. Biol. Stand. 1998,92:241-248). La Alúmina continúa siendo el adyuvante más usado en las vacunas parenterales. No obstante, éste no es un potente adyuvante que pudiera ayudar a las nuevas vacunas por subunidades. Se considera que sólo posee propiedades de sistema de reparto, aunque recientemente se ha descrito un nuevo mecanismo de acción independiente de los receptores parecidos a ToIl que involucra al Nalp3 (Eisenbarth SC et al. Nature, 2008,453:1122-1126). Su utilidad mucosal tampoco ha sido probada y se asume que induce preferentemente una respuesta Th2. Los adyuvantes vacunales licenciados son escasos (MF59, ASO2, virosoma, AFPLl, AFCoI,
Proteollin, MPL, etc.) y pocos son los de aplicación mucosal (CTB, mutantes de LT (LT63K,
LTR72), CpG, Quitosana, ISCOM y AFCoI) (Singh M y O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002, 19(6):715-728, Pérez O et al. Immunology and CeIl Biology. 2004,82:603-610).
Su uso en las formulaciones vacunales permite reducir la cantidad de antígeno necesaria, dirigir la respuesta hacia un patrón deseado y disminuir el número de dosis requeridas. Nosotros contamos con una plataforma de Adyuvantes basada en el PL derivado de Neisseria meningitidis serogrupo B (AF 'Adjuvant Finlay' PLl), su derivado el Cocleato (Co) (AFCoI) y similares de otros microorganismos para usar en vacunas parenterales o mucosales. Estos adyuvantes inducen una respuesta preferencial ThI en murinos y humanos por administración parenteral caracterizada por: IgG y subclases ThI anti PL, producción de interferón gamma (IFNγ), citocina (IL) 12, factor de necrosis tumoral alfa (TNF α), prueba positiva de hipersensibilidad retardada y adicionalmente, la inducción de linfocitos T citotóxicos (CTL) (Pérez O et al. Infecí Immun. 2001,69(7):4502'-4508; Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004,82:603-610; Rodríguez, T et al. Vaccine 2005, 26:1312-21; Pérez O, et al. Scand J Immunology 2007,66:271-77). La acción mucosal del AFCoI y el AFPLl también ha sido demostrada por aplicaciones nasales, orales, vaginales y rectales y su producción ha sido extendida a similares derivados de otros microorganismos.
La vacuna, VA-MENGOC-BC® basada en el PL de N. meningitidis serogrupo B ha sido aplicada en más de 60 millones de dosis y ha demostrado ser segura, no reactogénica y eficaz para proteger contra N. meningitidis serogrupos B y C. Es además, aplicada durante la lactancia de forma segura y efectiva, donde convierte la T-independencia del Polisacárido C en un antígeno T-dependiente (Pérez O. et al. ThI response induced by the B component of VA-MENGOC-BC® overcomes the thymus independence of polysaccharide C and primes for memory in toddler. Biotecnología Aplicada 2002; 19(l-2):54). Esta vacuna induce un patrón preferencial ThI caracterizado por la inducción en humanos y animales de linfoproliferación; anticuerpos IgG anti-PL; subclases IgGl en humanos e IgG2a en ratones; IFNγ, IL2 e IL12 en el ámbito de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y proteínas, no-inducción de IgE anti-PL ni incrementos en la IgE total y no-producción de IL-4 ni IL-5 tanto a nivel de ácido ribonuléico mensajero (ARNm) como proteico (Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(72001):4502-4508). Los Proteoliposomas y derivados de éstos como son los cocleatos, también se han empleado como adyuvantes como es revelado en certificado de autor de invención OCPI 23313, 2008 Pérez Martín OG y cois, y WO/2004/047805.
La quitosana es el biopolímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa y forma parte del exoesqueleto de crustáceos e insectos y de la pared celular de algunos microorganismos como levaduras y hongos. Por deacetilación alcalina de la quitina se obtienen polímeros de N-acetil-D-glucosamina de distintos pesos moleculares y diferente grado de deacetilación lo que le confiere propiedades particulares. Debido a que carece de toxicidad y alergenicidad posee numerosas aplicaciones en la industria farmacéutica, la medicina y en veterinaria.
La quitosana es ampliamente utilizada en investigación como sistema de transporte de drogas, péptidos, proteínas, vacunas y ADN, debido a sus propiedades mucoadhesivas naturales. Como polímetro mucos adhesivo, es usado para incrementar de la absorción de la morfina y la insulina a través del epitelio de la mucosa nasal. Incrementa el transporte transepitelial de antígenos a los tejidos inmunes mucosales a través de las uniones estrechas y por disminución del movimiento mucosiliar. Induce efectos estimulantes del sistema inmune como la activación de macrófagos e inducción de citocinas.
A nivel del epitelio intestinal incrementa el transporte paracelular y aumenta la captación de antígenos del lumen. El mayor ingreso de antígenos favorece el contacto con el sistema inmune lo que aumenta la respuesta inmune local y sistémica: antígenos co-administrados o encapsulados con Quitosana inducen mayores niveles de anticuerpos aunque el mecanismo involucrado no ha sido descrito. Este polisacárido también se ha utilizado como fibra dietética produciendo cambios en la flora intestinal y en el microambiente de la mucosa.
El objetivo técnico que se persigue es incrementar las coberturas vacunales e inducir respuestas combinadas mucosales y parenterales contra antígenos heterólogos (fúngicos, virales, protozoarios, helmínticos o cancerígenos) o propios, especialmente inducir respuesta de IgA secretoria (IgAS) involucrada en las protecciones de gérmenes mucosales y cánceres originalmente mucosales o que secundariamente invadan las mucosas, garantizando además, respuesta sistémica de anticuerpos IgG específicos, también involucrados en las protecciones mucosales. Esto se extiende a una mejor aceptación de las inmunizaciones, por reducción del número de dosis y una o varias aplicadas por una vía más aceptada y menos reactogénica, la mucosal. Estos resultados conducirán al desarrollo de formulaciones vacunales unitemporales terapéuticas o profilácticas.
En este sentido se plantea el uso de Proteoliposomas (PL) y sus derivados (Cocleato [AFCoI] como adyuvantes en formulaciones con antígenos heterólogos (fúngicos, virales, bacterianos, protozoarios, helmínticos o cancerígenos), insertados en su estructura, conjugados o coadministrados con éstos o los antígenos propios existentes en el PL y sus derivados. Estas formulaciones extienden la respuesta preferencial T auxiliadora de tipo 1 (ThI) inducida por el PL a los antígenos propios o incluidos (Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(7):4502- 4508), la mucosal preferencial del Cocleato (Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004, 82: 603-610); pero también inducida por el Proteoliposoma y las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) (Pérez O, et al. Scand J Immunology 2007,66:271-77) a esta aplicación unitemporal de ambos o los mismos por diferentes vías de administración contra dichos antígenos.
Divulgación d ela invención
La presente invención tiene como objeto el empleo de los PLs (AFPLl) bacterianos naturales o modificados genéticamente, en particular aquellos derivados de N. meningitidis, u otras bacterias gram negativas, así como los Cocleatos derivados de éstos, como nuevos adyuvantes o vacunaste/" se para obtener vacunas unitemporales.
Por "Proteoliposoma, PL" se entiende que estos son obtenidos de bacterias usando cualquier método conocido como puede ser: su aislamiento sin detergente; un proceso que incluya detergente (como desoxicolato, SDS, etc.) o la extracción a partir de vesículas ("bleb") de sobrenadantes de cultivos y particularmente los revelados en US 5,597,572. Los PL contienen diferentes Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMP), estructuras moleculares conservadas entre patógenos capaces de estimular fuertemente al sistema inmunitario innato y con ello inducir una potente respuesta adaptativa. Los PL contienen estructuras de la membrana externa de bacterias, pero para los efectos de esta patente también se consideran los extraídos de otros organismos tales como virus, hongos, protozoos, helmintos o células tumorales. El término AFPL se reserva para el uso del PL como adyuvante.
Por "Cocleato" se entiende un derivado de un PL que por lo tanto también contiene varios PAMP según se refiere en la patente (WO/2004/047805), Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(7):4502-4508 y Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004, 82:603-610). También, para los efectos de esta patente, el concepto de Cocleato se extiende a la producción de los mismos a partir de combinaciones de lípidos sintéticas con la inclusión de PAMP que actúen sinérgicamente, los que los diferencia radicalmente de otros Cocleatos producidos a partir de lípidos sintéticos y no incluidos en la patente referida anteriormente.
Por vacunas "unitemporales" se entiende que, la aplicación simultánea de una o más dosis mucosales y una dosis parenteral, permite lograr inmunizaciones efectivas contra uno o varios antígenos vacunales logrando así, reducir el número de dosis, de encuentros con el sujeto o animal a inmunizar y con ello, aumentar las coberturas de vacunación, al eliminar las pérdidas por no concurrencia de los sujetos a las dosis sucesivas. Este concepto se extiende a cualquier combinación simultánea de antígenos adyuvados o no, aplicados por diferentes de rutas de inmunización, sean estas mucosales o parenterales aunque preferiblemente es de interés en las combinaciones de ambas rutas y con la aplicación de varias rutas mucosales. Este concepto se extiende a otros vacunas que usen adyuvantes diferentes a los referidos (Proteoliposomas (AFPLs^ y sus derivados (AFCos). Este concepto excluye a las vacunas unidosis que evidentemente son aplicadas también en un solo tiempo.
La mayoría de las vacunas requieren dos o más dosis y se aplican generalmente, por la misma vía de inmunización. Por ello, fue sorprendente encontrar que la aplicación simultánea de una dosis mucosal y una parenteral indujeran elevadas respuestas de IgG específica sistémica al igual que dos dosis intramusculares o aún tres dosis mucosales.
En nuestro caso empleando el Cocleato, requerimos de al menos tres dosis nasales para obtener elevadas respuestas mucosales, aunque con dos se obtienen respuestas positivas. Por ello, sorprendente también ha sido encontrar que con una sola dosis mucosal, unitemporal con la parenteral se induzca también respuestas positivas mucosales regionales y a distancia. La estrategia de estimulación-desafío ('prime-boost'), que surgió para resolver la poca inmunogenicidad inducida por las promisorias vacunas de DNA desnudo, consiste en estimular con el DNA de interés y desafiar posteriormente, con un vector diferente que exprese el antígeno de interés o el antígeno purificado para evitar interferencias de los mismos. Sorprendente fue también encontrar que, sólo una transformación estructural de PL a Cocleato que contiene los mismos PAMP, proteínas y fosfolípidos, lograra inducir respuestas potenciadas reduciendo ambas inoculaciones a una dosis por cada vía. Adicionalmente también fue sorprendente, que las mismas estructuras también funcionaran por ambas vías en la misma aplicación unitemporal.
El sistema mucoso y el parenteral están organizados de forma diferente e incluso el mucosal esta más compartimentalizado. Se considera que las respuestas inducidas en el tracto respiratorio superior son las mejores para proteger contra las infecciones respiratorias y que las digestivas requieren de inmunización oral. Por ello, fue inesperado encontrar que la aplicación simultánea por ambas vías, mucosal y parenteral se potencien y más aún, que se logre respuestas potenciadas por la aplicación de formulaciones por varias vías mucosales (nasal, oral, sublingual) junto a la parenteral.
Una de las propiedades importantes de los adyuvantes en las vacunas es su capacidad de reparto, al actuar como depósitos y dirigir los antígenos hacia los lugares donde se concentran las células T para permitir que los inmunopotenciadores estimulen la respuesta innata. Esto garantiza que se produzcan liberaciones por varios días o que éstos sean adquiridos por las células presentadoras de antígenos por tiempos prolongados y sean así acarreados hacia las zonas T de los órganos linfoides periféricos. Lo que conlleva a que las segundas dosis sean espaciadas, al menos en humanos, generalmente varias semanas entre ellas. Por ello, fue inesperado observar que se lograran respuestas sistémicas similares sin espaciamiento entre las dosis. Más inesperado aún fue encontrar respuestas también a nivel mucosal, lo que garantiza que con dos aplicaciones (una mucosal y la otra parenteral simultáneas) se logren respuestas mucosales y sistémicas. Adicionalmente, fue sorprenderte observar también que al potenciar el sistema de reparto para la aplicación parenteral usando alúmina, quitosana o formulaciones en aceites también se potenciaba la respuesta unitemporal. Fue también inesperado que la aplicación simultánea por dos o más vías mucosales de dos o más antígenos y la aplicación parenteral de los mismos en una formulación de vacuna combinada también indujera respuestas unitemporales eficientes.
Más sorprendente fue encontrar que estas formulaciones aplicadas unitemporalmente indujeran respuesta de memoria que fue evidenciada por incrementos inmunes típicos de una respuesta secundaria (memoria) por la aplicación de un refuerzo mucosal varios meses después de la inmunización inicial.
Las respuestas parenterales y mucosales inducidas por la inmunización son independientes. Ambas rutas requieren generalmente, varias dosis e inducen respuesta celulares que se traducen en respuestas de anticuerpos generalmente diferentes. La vía parenteral induce respuestas de IgG específicas sistémicas y la vía mucosal, particularmente la nasal, induce respuestas específicas de IgAS regional y a distancia (tracto genitourinario) y también IgG específica sistémica. Por ello, no fue sorprendente encontrar respuestas de IgG específicas sistémicas, pues éstas pudieran ser la sumatoria de las respuestas inducidas por ambas rutas de inmunización; pero fue sorprendente e inesperado que una sola dosis nasal fuese potenciada al nivel de al menos dos dosis nasales por la aplicación parenteral.
También forma parte de la presente invención la obtención de diferentes formulaciones vacunales que aprovechan la capacidad de los PL y sus derivados (Cocleatos) de inducir respuestas ThI con actividad CTL, obtenidas también en esta estrategia unitemporal.
Antígenos poco inmunogénicos como la Ovalbumina (Ova) o bien inmunogénicos como el toxoide tetánico fueron eficientemente evaluados en esta estrategia unitemporal. Estos funcionan incorporados o conjugados con el PL y luego transformados en Cocleatos o coadministrados con ellos.
Las formulaciones vacunales de la presente invención pueden ser usadas para proteger un mamífero susceptible a la infección o tratar enfermedades tumorales por medio de la administración de dicha formulación de forma unitemporal. Estas aplicaciones pueden incluir inyecciones por rutas intramusculares, intraperitoneales, intradérmica, subcutánea o transcutánea con administración mucosal por vía oral, nasal, rectal, vaginal o sublingual, entre otras. El número de dosis generalmente son dos o varios por similares o diferentes rutas mucosales y una parenteral con antígenos únicos o combinados. Adicionalmente se podrá reforzar la respuesta inmune mucosal y sistémica inducida por aplicaciones similares simultáneas (unitemporales) o sólo uno de las vías para amplificar la respuesta de memoria inducida inicialmente.
La novedad de la invención radica primeramente, en el uso unitemporal, simultáneo, de una inmunización aplicada por dos o más vías de inmunización.
Es particularmente novedoso, que la aplicación unitemporal de un antígeno por vía mucosal (oral, sublingual, vaginal, reactaí o nasal) y simultáneamente parenteral (subcutánea, transdérmica, intraperitoneal, intradérmica o intramuscular) induzca similar respuesta inmune sistémica que dos dosis parenterales espaciadas al menos 14 días o al menos dos dosis mucosales espaciadas 7 días requeridas para inducir buenas respuestas por ambas rutas.
Otro aspecto de novedad radica en que la aplicación unitemporal de un antígeno por vía mucosal y simultáneamente por vía parenteral, induzca también una respuesta inmune mucosal regional y a distancia que sólo se logra con al menos 2 y mejor con 3 dosis mucosales. Para esta potenciación no existe explicación actual a nivel de la circulación de los linfocitos guiados por señales de citocinas y quemocinas.
Otro aspecto novedoso es que la estrategia de inmunización unitemporal permite emplear varios antígenos por una sola o varias rutas mucosales y la aplicación de los correspondientes antígenos por la vía parenteral en una vacuna combinada.
La solución propuesta tiene las siguientes ventajas:
• Se extiende el concepto de estimulación-amplificación ('prime-boost') de las inmunizaciones, entre las que median semanas o meses para inducir una respuesta secundaria amplificada, a novedosas vacunas unitemporales.
• Se combina la administración mucosal (una o varias) con la parenteral en el mismo momento de la vacunación obteniéndose respuestas específicas potenciadas de IgAS en las mucosas y de IgG sistémica. • Se emplean dos adyuvantes con similares composiciones o el mismo, en vez de dos sistemas adyuvantes o de vectores diferentes aplicados en los ensayos de sensibilización- amplificación tradicionales.
• Se logra incrementar las coberturas de vacunación por las pérdidas ocurridas por la no concurrencia a las dosis sucesivas de los esquemas multidosis de inmunización. Esto conlleva paralelamente y significativamente a la disminución de recursos necesarios para realizar las inmunizaciones.
• Se logra reducir el número de dosis vacunal al menos a la mitad (vacunas de dos dosis) o en un tercio (vacunas de tres dosis) sin afectar la calidad de la respuesta inmune sistémica, adicionándose la respuesta mucosal, esencial para la gran mayoría de las infecciones que ocurren particularmente en humanos.
• La efectividad del AFPLl, uno de los adyuvantes propuestos es seguro en niños menores de un año, de 2 a 4 años, en escolares, adolescentes y adultos y el otro derivado de éste (AFCoI) ya ha pasado las pruebas de estabilidad y toxicidad preclínica y se pretende usar por vía mucosal que es menos reactogénica e incluso no requiere de esterilidad, sino garantizar una carga microbiana controlada.
• Se induce por el AFCoI y el AFPLl respuestas específicas de IgAS, subclases de IgG ThI, con actividad CTL al ser aplicados por vías mucosales o parenterales.
• La inducción de potentes respuestas está dada no sólo contra antígenos propios y no relacionados (heterólogos) incorporados o conjugados, sino también a antígenos co- administrados tanto por vía mucosal como parenteral, lo que extiende las capacidades de este sistema unitemporal a múltiples vacunas.
• Se puede emplear varios antígenos por una sola o varias rutas mucosales y la aplicación de los correspondientes antígenos por la vía parenteral en una vacuna combinada, lo que conlleva al desarrollo de vacunas múltiples unitemporales. a presente invención será descrita a través de los siguientes ejemplos específicos. Ejemplo 1. Obtención de Proteoliposomas (PL). Para la obtención del PL se realiza un cultivo de N. meningitidis de cualquier serogrupo, particularmente el B, Salmonella Typhi, Vibrio cholerae, Echerichia coli, Shiguella, Salmonella o Bordetella pertusus y la biomasa colectada mediante centrifugación se somete a un proceso de extracción con detergente, enzimas y ultrasonido. Los restos celulares son removidos mediante centrifugación y el sobrenadante es sometido entonces a digestión con nucleasas para eliminar los ácidos nucleicos. El extracto es recuperado mediante ultracentrifugación, resuspendido en solución con detergente y purificado del resto de los componentes de bajo y mediano peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular. El Proteoliposoma así obtenido contiene: porinas (PorA y PorB); trazas de DNA bacteriano y menos del 10% (en relación a las proteínas) de LPS nativo insertado en su estructura; pero nunca libres. Las porinas, el DNA y el LPS presente son PAMP que interactúan con los receptores de reconocimiento de patrones desencadenando las señales de peligro a nivel de las células involucradas en la respuesta innata. El producto final es sometido a un conjunto de controles biológicos y físico-químicos. En el caso de que el LPS sea, además de un PAMP, el antígeno de interés este puede incrementarse hasta al menos 35% con relación a las proteínas. Similar procedimiento para obtener estructuras liposomales enriquecidas en proteínas de membrana externa se ha empleado partiendo de virus y protozoos.
Ejemplo 2. Obtención de Cocleato derivado de Proteoliposoma. Se partió de PL obtenido por los métodos descritos en EP 885900077.8 o US 5,597,572. Estas son resuspendidas en solución buffer de Tris-EDTA con 0.5% de desoxicolato de sodio. La concentración de proteínas de la suspensión se determinó usando la metodología de Lowry modificado según
Peterson (Analyt. Biochem. 83, 346, 1977). El contenido de fosfolípidos que forman el PL fue determinado mediante la cuantifϊcación del fósforo inorgánico (Bartlett, J Biol. Chem. 234, 466, 1959). Tanto la concentración de proteínas como la concentración de fosfolípidos fueron empleadas para establecer las condiciones óptimas y las cantidades de detergentes necesarios para la formación del Cocleato. Se preparó una solución con el PL ajustado a una concentración final proteica de 5-6 mg/mL en tampón Tris-EDTA conteniendo desoxicolato de sodio en una cantidad de 6 a 15 veces la cantidad total de proteínas. Esta solución fue filtrada directamente en el dispositivo de diálisis a través de un filtro con tamaño de poro de
0,2 μm. La diálisis fue realizada por agitación rotacional o filtración tangencial durante 24 h con cambio continuo y lento del tampón de diálisis en el primero o varios lavados en el segundo. Esta última solución consistió en NaCl 50-150 mM, Imidazol 1-4 mM, HEPES 3-5 mM y CaCl 2-7 mM en H2O preparada bajo condiciones de esterilidad que fueron conservadas durante todos los pasos. La formación del Cocleato fue comprobada por la formación de un precipitado blanco y posterior observación microscópica tanto óptica como electrónica. La concentración de proteínas y fosfolípidos fue nuevamente estimada y ajustada para los posteriores ensayos. Las propiedades físico-químicas de las proteínas incluidas en el Cocleato fueron chequeadas y comparadas con las del PL mediante electroforesis en geles de poliacrilamida teñidos con Azul de Coomassie. Adicionalmente, la integridad estructural de estas fue chequeada y comprobada por medio de la metodología de Western Blot.
Ejemplo 3. La aplicación de AFPLl, AFCoI o VA-MENGOC-BC® por vía intramuscular induce respuesta específica de IgG sérica en ratones.
Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c fueron inmunizados con dos dosis de 12.5 μg /
50 μL de AFPLl, AFCoI o VA-MENGOC-BC® (Va) mediante punción intramuscular profunda en una de las extremidades posteriores del animal, con un intervalo de 14 días. Método de Extracción y procesamiento de la sangre para Ia obtención del suero: La extracción de sangre se realizó a los 21 días después de la última dosis mediante punción del plexo retroorbital utilizando capilares heparinizados. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 370C, posteriormente se centrifugaron a 2000 g durante 10 min para extraer el suero. Detección de IgG anti PL por ELISA: Reactivos y Soluciones:
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2CO3 11 mM, NaHCO3 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2) Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1% (p/v)
Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0,1%): SSTF, Tween 20 al 0,1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las muestras (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0,1%) Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigam, St. Louis, MO, EUA) Solución tampón Sustrato, STS (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6)) Solución de detención: H2SO4 2 M. Suero estándar de anticuerpos: Curva elaborada con diluciones dobles seriadas de un suero de ratón hiper inmune, obtenido a partir de un suero de referencia para el serogrupo B de meningo, proveniente del Centro para el Control de las Enfermedades de Atlanta, en inglés "Center for Disease Control (CDC)" Metodología:
• Se añade 100 μL/pozo de PL a una concentración de 20 μg/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 40C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF « Se añade 100 μL/pozo de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda
• Se lava tres veces con solución de lavado
• El Suero Estándar de Anticuerpos y los sueros a evaluar se diluyen 1:100 en solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μL/pozo por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia e incuban 2 h a 37°C
• Se lava tres veces con Solución de lavado
• Se adicionan 100 μL/pozo del conjugado Anti IgG diluido 1:2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con Solución de lavado • Se añade 100 μL/pozo de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno orthorfemlendiamma (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención. La medición de absorbancia en densidad óptica (DO) se realiza a 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus)
Resultados: Expresión y Cálculo
Se evaluó el comportamiento paralelo entre las curvas y se calculó la ecuación de ajuste lineal, así como el coeficiente R2. El suero estándar CDC 1992 se definió como la variable independiente (x) y el suero estándar del Finlay como la variable dependiente (y). Se determinó la concentración final sustituyendo en la fórmula obtenida por los valores del estándar CDC 1992 para IgG específica. Mediante el empleo de la curva sigmoidal estándar, se le asignaron 5000 U/mL de anticuerpos IgG anti-PL al máximo punto de la curva y 31,25
U/mL al punto mínimo. Los resultados de IgG anti-PL se calcularon interpolando la DO obtenida en cada uno de los sueros con la curva patrón elaborada con el suero de referencia y se expresaron, en U/mL. El límite de detección de este ensayo, menor cantidad de IgG específica que puede ser detectada bajo nuestras condiciones experimentales, fue de 26.9 U/mL (Fig. 1).
Resumen:
El Cocleato (AFCoI) aplicado por vía intramuscular indujo similares respuestas de IgG específicas que la vacuna, VA-MENGOC-BC® y éstas fueron significativamente superiores a las inducidas por el Proteoliposoma (AFPLl).
Ejemplo 4. La aplicación de AFPLl, AFCoI o VA-MENGOC-BC® por vía intramuscular no induce respuesta específica de IgA secretoria en saliva de ratones.
Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c fueron inmunizados con dos dosis de 12.5 μg / 50 μL de AFPLl, AFCoI o VA-MENGOC-BC® (Va) mediante punción intramuscular profunda en una de las extremidades posteriores del animal, con un intervalo de 14 días
Método de Extracción y procesamiento de Ia saliva: La extracción de saliva se realizó a los 7 días después de la última dosis. Para la toma de muestras de saliva, se estimuló la salivación en los animales con la aplicación intraperitoneal de 50 μL por ratón de pilocarpina al 0.5% (Imefa, Cuba). Las muestras se mantuvieron sobre hielo durante la extracción y se inactivaron inmediatamente a 56°C durante 15 min. Seguidamente fueron centrifugadas a 14000 g durante 15 min a 4°C, se colectó el sobrenadante y se almacenaron a -700C hasta su uso.
Detección de IgA anti PL por ELISA:
Reactivos y Soluciones:
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2CO3 11 mM, NaHCO3 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1%
(p/v)
Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0.1%): SSTF, Tween 20 al 0.1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las Muestra (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0.1%)
Anti-IgA (R5-140) de ratón biotinilado conjugado a peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA) Estreptavidina-peroxidasa (Sigama, St. Louis, MO, EUA)
Solución tampón Sustrato, STS (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6)) Solución de detención: H2SO4 2 M.
Saliva Estándar de Anticuerpos: Como estándar interno de anticuerpos, para los ensayos de IgA anti PL, se empleó una curva elaborada con muestras de saliva de ratones hiper inmunes. Metodología:
• Se añade 100 μL/pozo de PL a una concentración de 20 μg/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 40C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF.
• Se añade 100 μL/pozo de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda. • Se lava tres veces con Solución de lavado.
• La Saliva Estándar de Anticuerpos y las salivas a evaluar se diluyeron 1 :2 en. Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μL/pozo por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia y se incuban 2 h a 37°C.
• Se lava tres veces con Solución de lavado. • Se adicionan 100 μL/pozo del conjugado anti IgA a una concentración de 2 μg/mL en
Solución de Dilución de las muestras y se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Posteriormente, se añade un segundo conjugado (estreptavidina-peroxidasa) en una dilución 1:2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 30 min a 37°C • Se lava cinco veces con Solución de lavado
• Se añade 100 μL/pozo de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno σrt/ío-fenilendiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min.
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención • La medición de la absorbancia (DO) se realiza a una lectura de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus). Resultados: Expresión y Cálculo
Mediante el empleo de la curva sigmoidal estándar, se emplearon diluciones dobles seriadas y se le asignaron 2000 unidades arbitrarias (UA) de anticuerpos IgA anti PL al máximo punto de la curva y 62.5 UA al punto mínimo. Los resultados de IgA anti PL se calcularon interpolando la DO obtenida en cada uno de las muestras con la curva patrón elaborada con la saliva de referencia y se expresan en UA. Las muestras se consideraron positivas cuando los valores del título se encuentran por encima de 250 UA, este valor de corte se calculó después de evaluar las muestras de 100 animales sin inmunizar y se estableció el rango como el promedio de estas muestras por 2 desviaciones estándar (Fig. T). Resumen:
Como puede observarse ninguna de las formulaciones aplicadas por vía intramuscular indujo respuesta de IgA específica.
Ejemplo 5. El Cocleato (AFCoI) por vía intranasal induce respuesta específica de IgA en saliva superiores al Proteoliposoma (AFPLl) en ratones.
Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c fueron inmunizados con AFPLl o AFCoI por vía intranasal (IN). Para la vía IN se administraron tres dosis con un intervalo de 7 días entre ellas, cada dosis con una concentración de 50 μg de proteínas totales para ambas formulaciones en un volumen total de 25 μL por ratón, y se aplicó directamente en las fosas nasales con una pipeta automática y puntas estériles (12.5 μL por cada fosa). Método de Extracción y procesamiento de la saliva: Se procedió según se describe en el ejemplo 4.
Detección de IgA anti PL por ELISA: Se procedió según se describe en el ejemplo 4
(Fig. 3)
Resumen: Tanto el AFCoI como el AFPLl aplicados por vía nasal indujeron respuestas de IgA específica en saliva aunque el primero indujo respuestas significativamente superiores.
Ejemplo 6. El Cocleato (AFCoI) por vía intranasal induce respuesta específica de IgG sérica superiores al Proteoliposoma (AFPLl) en ratones. Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c fueron inmunizados con AFPLl o AFCoI por vía intranasal (IN). Para la vía IN se administró tres dosis con un espaciamiento de 7 días entre ellas, cada dosis con una concentración de 50 μg de proteínas totales en ambas formulaciones en un volumen total de 25 μL por ratón, y se aplicó directamente en las fosas nasales con una pipeta automática y puntas estériles (12.5 μL por cada fosa)
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 3.
Detección de IgG anti PL por ELISA: Se procedió según se describe en el ejemplo 3 (Fig.
4). Resumen:
Tanto el AFCoI como el AFPLl aplicados por vía nasal indujeron respuestas de IgG específica en saliva aunque el primero indujo respuestas significativamente superiores.
Ejemplo 7. La vía intramuscular requiere de dos dosis de Proteoliposoma (AFPLl) o Cocleato (AFCoI) para inducir una buena respuesta de IgG específica sérica en ratones.
Protocolo de Inmunización Ratones Balb/c fueron inmunizados con AFPLl o AFCoI por vía intramuscular (IM) mediante punción profunda en una de las extremidades posteriores del animal. Cada formulación se administró utilizando dos esquemas de inmunización de una y dos dosis respectivamente por grupo, esta última con un intervalo de 14 días. La dosis empleada presentaba una concentración de 12.5 μg / 50 μL para cada formulación. Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 3.
Detección de IgG anti PL por ELISA: Se procedió según se describe en el ejemplo 3
(Fig- 5). Resumen: La aplicación intramuscular de Proteoliposoma (AFPLl) o Cocleato (AFCoI) requiere de al menos dos dosis para inducir significativas respuestas de IgG específicas sistémicas.
Ejemplo 8. La vía intranasal requiere de tres dosis con Cocleato (AFCoI) o Proteoliposoma (AFPLl) para inducir altos niveles de IgA específica en saliva en ratones. Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c fueron inmunizados con AFPLl o AFCoI por vía intranasal utilizando tres esquemas de inmunización de una, dos y tres dosis respectivamente de cada formulación por grupo. Cada dosis se administro con un intervalo de 7 días a una concentración de 50 μg en 25 μL por animal, 12.5μL por cada fosa nasal como se describe en el ejemplo 5.
Método de Extracción y procesamiento de la saliva: Se procedió según se describe en el ejemplo 4.
Detección de IgA anti PL por ELISA: Se procedió según se describe en el ejemplo 4 (Fig.
6). Resumen:
Tanto el AFCoI cómo el AFPLl aplicados por vía nasal requieren de dos dosis para inducir respuestas positivas de IgA específicas en saliva. No obstante con tres dosis se obtienen superiores respuestas. En todos los casos el AFCoI indujo superiores respuestas que el AFPLl.
Ejemplo 9. La vía intranasal requiere de tres dosis con Cocleato (AFCoI) o Proteoliposoma (AFPLl) para inducir altos niveles de IgG específica sérica en ratones.
Protocolo de Inmunización Ratones Balb/c fueron inmunizados con AFPLl o AFCoI por vía intranasal utilizando tres esquemas de inmunización de una, dos y tres dosis respectivamente de cada formulación por grupo. Cada dosis se administro con un intervalo de 7 días a una concentración de 50 μg en 25 μL por animal, 12.5μL por cada fosa nasal como se describe en el ejemplo 5.
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 3.
Detección de IgG anti PL por ELISA: Se procedió según se describe en el ejemplo 3 (Fig. 7).
Resumen:
Tanto el AFCoI como el AFPLl por vía nasal indujeron significativas respuestas séricas de IgG específica con dos dosis. No obstante, tres dosis fueron muy superiores. Siempre el AFCoI fue superior al AFPLl. Ejemplo 10. La inmunización de una dosis de Cocleato (AFCoI) intranasal y de
Proteoliposoma (AFPLl) intramuscular simultáneos (STVS) induce superiores respuestas de IgG específica que tres dosis de AFCoI nasal y similares a dos dosis de AFPLl parenteral, manteniendo similares proporciones de las subclases de IgG en suero de ratones.
Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c se distribuyeron en tres grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14 días) de APCoI por vía intranasal a una concentración de 50 μg en 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal. Un segundo grupo inmunizados con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl por vía intramuscular a una concentración de 12.5 μg en 50 μL por animal. El tercer grupo fue inmunizado con AFCoI (100 μg en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía intranasal y simultáneamente con AFPLl (STVS) (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular.
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 3. Detección de IgG anti PL por ELISA: Se procedió según se describe en el ejemplo 3
Resumen:
La inmunización unitemporal induce superiores respuestas de IgG específica sérica que 3 dosis de AFCoI nasal y similares que 2 dosis intramusculares de AFPLl. (Fig. 8).
Detección de Subclases IgGl e IgG2a anti PL por ELISA:
Reactivos y Soluciones:
Solución lampón de recubrimiento (STR): Na2CO3 11 mM, NaHCO3 35 mM (pH 9.6)
Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1%
(P/V) Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0.1%): SSTF, Tween 20 al 0.1% (v/v), pH 7,4) Solución de dilución de las Muestra (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0.1%) AcM de carnero anti IgGl y anti IgG2a de ratón biotinilado (Amersham, LIFE SCIENCE) Estreptavidina-peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA) Solución tampón Sustrato, STS (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6)) Solución de detención: H2SO4 2 M.
Metodología:
• Se añade 100 μL/pozo de PL a una concentración de 20 μg/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 40C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF.
• Se añade 100 μL/pozo de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado. • Los sueros a evaluar se diluyen 1:100 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μL/pozo por duplicado de las diluciones de los sueros y se incuban 2 h a 37°C.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Se adicionan 100 μL/pozo del conjugado anti IgGl de ratón o anti IgG2a diluido 1 :2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Posteriormente, se añade un segundo conjugado (estreptavidina-peroxidasa) en una dilución 1:2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incubó 30 min a 37°C • Se lava cinco veces con Solución de lavado
• Se añade 100 μL/pozo de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y del cromógeno oríAo-fenilendiamina (OPD) 0,6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min.
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención • La medición de absorbancia (DO) se realiza a una lectura de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus). Resultados: Expresión y Cálculo
Los resultados de IgGl e IgG2a anti PL fueron expresados como densidad óptica (DO). En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor 0.25 de DO Resumen: La aplicación unitemporal mantiene las mismas proporciones de subclases que las inducidas por tres dosis de AFCoI nasal o 2 dosis de AFPLl intramuscular (Fig. 9).
Ejemplo 11. La inmunización de una dosis de Cocleato (AFCoI) Intranasal y el Proteoliposoma (AFPLl) intramuscular simultáneos (STVS) induce altos niveles de IgA anti PL en saliva, heces y lavado vaginal en ratones inmunizados.
Protocolo de Inmunización: ratones Balb/c hembras se distribuyeron en tres grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI por vía intranasal a una concentración de 50 μg en 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal. Un segundo grupo fue inmunizado con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl por vía intramuscular a una concentración de 12.5 μg en 50 μL por animal. El tercer grupo fue inmunizado con una dosis de AFCoI (100 μg en 25 μL) por vía intranasal y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo.
Método de extracción y procesamiento de la saliva: en este ejemplo se realizó la extracción de saliva a los 7 y 14 días después de la inmunización y lo demás se realizó como se indica en el ejemplo 4.
Método de extracción y procesamiento de las heces: la extracción de las heces se realizó a los 14 días después de la última dosis. Fueron colectados tres 'pellet' fecales por animal. Las heces se pesaron restándoles el valor del peso de los viales. Estos pellets se resuspendieron en una solución de PBS con inhibidores de proteasas (1 mM PMSF y 5 μg de Aprotinina por mL), usando una dilución de 20 μL por mg de heces. Las muestras resuspendidas fueron vigorosamente agitados utilizando un agitador magnético (vorter), desechando el material insoluble por centrifugación (40000 rpm, 20 minutos a 4°C) y guardando el sobrenadante para su posterior análisis.
Método de extracción y procesamiento del lavado vaginal: las muestras de lavado vaginal fueron colectadas a los 21 días después de la última dosis al igual que el suero. Estas fueron obtenidas aplicando 100 μL de PBS estéril dentro de la vagina del animal, aspirando el lavado vaginal y colectándolo en viales. Luego se centrifugaron a 14000 rpm, 15 minutos a 4°C, guardando el sobrenadante para su posterior análisis.
Detección de IgA anti PL por ELISA. Se procedió según se describe en el ejemplo 4. Resumen: la inmunización a un solo tiempo (STVS) de una dosis de AFPLl Intramuscular y una de AFCoI Intranasal induce altos niveles de IgA anti PL en saliva, heces fecales y lavado vaginal, comparados con los inducidos por la administración de tres dosis de AFCoI intranasal (Fig. 10-12).
Ejemplo 12. La inmunización de una dosis de Cocleato conteniendo Ovalbúmina (AFCol-Ova) intranasal y el Proteoliposoma conteniendo Ova (AFPLl-Ova) intramuscular simultáneos (STVS) induce altos niveles de IgG anti Ova en ratones.
Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c se distribuyeron en cuatro grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCol-Ova por vía intranasal a una concentración de 50 μg / 20 μg en 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal. Un segundo grupo fue inmunizado con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl-Ova por vía intramuscular a una concentración de 12.5 μg / 10 μg en 50 μL por animal. El tercer grupo fue inmunizado con una dosis de AFCol-Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía intranasal y una dosis simultánea de AFPLl-Ova (12.5 μg / 10 μg en
50 μL) por vía intramuscular (STVS). El cuarto grupo fue inmunizado con dos dosis (0, 14 días) de Ova por vía intramuscular a una concentración de 10 μg en 50 μL por animal.
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para Ia obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 3.
Detección de IgG anti Ova por ELISA:
Reactivos y Soluciones: Ovalbúmina, grado de pureza V, Sigma
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2CO3 11 mM, NaHCO3 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2) Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1% (p/v)
Solución de lavado (SSTF, Tween 20 0.1%): SSTF, Tween 20 al 0.1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las Muestra (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0.1%) Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA) Solución tampón Sustrato, STS (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6))
Solución de detención: H2SO4 2 M.
Metodología:
• Se añade 100 μL / pozo de Ova a una concentración de 10 μg / mL diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 40C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF.
• Se afíade 100 μL / pozo de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda. • Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Los sueros a evaluar se diluyeron 1:100 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μL / pozo por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia y incuban 2 h a 37°C.
• Se lava tres veces con Solución de lavado. • Se adicionan 100 μL / pozo del conjugado Anti IgG diluido 1:2000 en Solución de
Dilución de las muestras y se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Se añade 100 μL / pozo de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno ort/zσ-fenilendiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min.
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención.
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una lectura de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Resultados: Expresión y Cálculo Los resultados de IgG anti Ova fueron expresados como densidad óptica (DO). En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor 0.25 de DO
Resumen:
La aplicación unitemporal de AFCoI -Ova intranasal y AFPLl -Ova intramuscular induce significativas respuestas de IgG anti Ova en suero. Estas son superiores a las inducidas por tres dosis de AFCol-Ova intranasales y dos dosis de AFPLl-Ova intramuscular (Fig. 13). Ejemplo 13. La inmunización de una dosis de Cocleato conteniendo Ovalbúmina
(AFCol-Ova) intranasal y una dosis de Proteoliposoma conteniendo Ova (AFPLl-Ova) intramuscular simultáneos (STVS) induce altos niveles de IgA anti Ova en ratones.
Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c se distribuyeron en cinco grupos inmunizados y uno control. Un primer y un segundo grupo fueron inmunizados con tres (0, 7, 14 días) y 2
(0, 7 días) dosis de AFCol-Ova por vía intranasal a una concentración de 50 μg / 20 μg en 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal. Un tercer grupo fue inmunizado con dos dosis (0,
14 días) de AFPLl-Ova por vía intramuscular a una concentración de 12.5 μg / 10 μg en 50 μL por animal. El cuarto grupo fue inmunizado con AFCol-Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía intranasal y simultáneamente AFPLl-Ova (STVS) (12.5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular. El quinto grupo fue inmunizado con dos dosis (0,
14 días) de Ova a una concentración 10 μg en 50 μL por vía intramuscular por animal.
Método de Extracción y procesamiento de la saliva: En este ejemplo se realizó la extracción de saliva a los 7 y 14 días después de la inmunización el resto se realizó como se indica en el ejemplo 4.
Detección de IgA anti Ova por ELISA: Reactivos y Soluciones:
Ovalbúmina, grado de pureza V, SIGMA
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2CO3 11 mM, NaHCO3 35 mM (pH 9,6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1%
(p/v)
Solución de lavado (SSTF, Tween 20 0,1%): SSTF, Tween 20 0,1% (v/v), pH 7,4)
Solución de dilución de las Muestra (SSTF, SAB 1%, Tween 20 0,1%) Anti-IgA (R5-140) de ratón biotinilado (SIGMA, St. Louis, MO, EUA) conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA)
Estreptavidina-peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA)
Solución tampón Sustrato, STS (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5,6))
Solución de Parada: H2SO42 M. Saliva Estándar de Anticuerpos: Como estándar interno de anticuerpos, para los ensayos de
IgA anti-PL, se empleó una curva elaborada con muestras de saliva de ratones hiper inmunes. Metodología:
• Se añade 100 μL / pozo de Ova a una concentración de 10 μg / mL diluida en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 40C en cámara húmeda • Se lava tres veces con SSTF.
• Se afiader 100 μL / pozo de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Las salivas a evaluar se diluyen 1:2 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μL / pozo por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia y se incuban 2 h a 37°C.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Se adicionan 100 μL / pozo del conjugado anti IgA a una concentración de 2 μg/mL en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda. « Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Posteriormente, se añade un segundo conjugado (estreptavidina-peroxidasa) en una dilución 1 :2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 30 min a 37°C
• Se lava cinco veces con Solución de lavado
• Se añade 100 μL / pozo de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y del cromógeno ortho-femlondiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min.
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención.
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una lectura de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus). Resultados: Expresión y Cálculo
Los resultados de IgA anti Ova fueron expresados como densidad óptica (DO). En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor 0.25 de DO
Resumen:
La aplicación unitemporal de AFCoI -Ova intranasal y AFPLl -Ova intramuscular induce significativas respuestas de IgA anti Ova en saliva. Estas son superiores a las inducidas por dos dosis de AFCoI -Ova ó 3 dosis de Ova intranasales y no se induce por dos dosis de
AFPLl -Ova aplicadas por vía intramuscular (Fig. 14).
Ejemplo 14. El Cocleato (AFCoI) y el Proteoliposoma (AFPLl) pueden ser eficientemente utilizados por ambas vías de inmunización (intranasal e intramuscular) en la estrategia unitemporal.
Protocolo de Inmunización: ratones Balb/c se distribuyeron en cuatro grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con una dosis de AFCoI (100 μg en 25 μL) por vía intranasal y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo, el segundo, con una dosis de AFCoI (100 μg en 25 μL) por vía intranasal y una dosis de AFCoI (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo y el tercero con una dosis de AFPLl (100 μg en 25 μL) por vía intranasal y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo. Como control positivo un grupo con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI por vía intranasal a una concentración de 50 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal.
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: se procedió según se describe en el ejemplo 3.
Detección de IgG anti PL por ELISA: se procedió según se describe en el ejemplo 3.
Conclusión de los resultados: una dosis de AFPLl intramuscular combinada con una dosis de AFPLl intranasal en un solo tiempo o AFCoI intramuscular combinada con una dosis de AFCoI intranasal . en un solo tiempo, induce altos niveles de IgG anti PL en suero, comparados con los inducidos por las tres dosis de AFCoI administrados intranasal (Fig. 15). Estos resultados permiten afirmar que ambos estructuras pueden ser usadas en ambas vías de inmunización en las vacunas unitemporales.
Ejemplo 15. El Cocleato (AFCoI) y el Proteoliposoma (AFPLl) conteniendo Ovalbúmina (AFCol-Ova y AFPLl-Ova) pueden ser eficientemente utilizados por ambas vías de inmunización (Intranasal e Intramuscular) en la estrategia unitemporal.
Protocolo de Inmunización: ratones Balb/c se distribuyeron en cinco grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con una dosis de AFCol-Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y una dosis de AFPLl-Ova (12.5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo. El segundo grupo fue inmunizado con una dosis de AFCoI- Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y una dosis de AFCol-Ova (12.5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo y el tercero con una dosis de AFPLl-Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y una dosis de AFPLl-Ova (12.5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo. Como control positivo se empleó un grupo con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCol-Ova por vía intranasal a una concentración de 50 μg / 25 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal y otro con tres dosis de Ova intranasal (25 μg / 25 μL) por animal
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: se procedió según se describe en el ejemplo 3.
Detección de IgG anti Ova por ELISA: se procedió según se describe en el ejemplo 12.
Conclusión de los resultados: una dosis de AFPLl intramuscular combinada con una dosis de AFPLl intranasal en un solo tiempo o AFCoI intramuscular combinada con una dosis de AFCoI intranasal en un solo tiempo, ambos conteniendo Ova en sus estructuras, inducen altos niveles de IgG anti Ova en suero, comparados con los inducidos por las tres dosis de AFCol- Ova administrado por vía intranasal. No obstante, el empleo del AFCoI por ambas vías indujo respuestas de IgG anti Ova superiores (Fig. 16).
Ejemplo 16. La Estrategia de Vacunación Unitemporal también incluye la administración de una dosis de AFCoI por otras vías mucosales (oral o sublingual) y AFPLl por vía intramuscular, respectivamente al mismo tiempo (STVS) induciendo altos niveles de IgA específica en heces y lavado vaginal.
Protocolo de Inmunización: ratones Balb/c se distribuyeron en seis grupos inmunizados y uno control. Los tres primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCoI por vía intranasal (IN) (100 μg en 25 μL), oral (IG) (100 μg en 200 μL) o sublingual (Sl) (100 μg en 25 μL), respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. Los tres restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI IN (50 μg en 25 μL por animal), IG (100 μg en 200 μL ) o Sl (50 μg en 25 μL por animal), respectivamente. Método de extracción y procesamiento de las heces y lavado vaginal: se realizó la extracción de heces y lavado vaginal como se indica en el ejemplo 11.
Detección de IgA anti PL por ELISA: se procedió según se describe en el ejemplo 4. Conclusión de los resultados: una dosis de AFPLl Intramuscular combinada con una dosis de AFCoI oral o sublingual en un solo tiempo (STVS) induce altos niveles de IgA anti PL en heces y lavado vaginal, comparados con los inducidos por las tres dosis de AFCoI administrado oral o sublingual (Fig. 17 y 18).
Ejemplo 17. La administración unitemporal de una dosis de AFCoI por vía oral o sublingual y AFPLl por vía intramuscular respectivamente al mismo tiempo (STVS) induce altos niveles de IgG específica en suero, en ratones.
Protocolo de Inmunización: ratones Balb/c se distribuyeron en seis grupos inmunizados y un control. Los tres primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCo.l por vía intranasal (IN) (100 μg en 25 μL), oral (IG) (100 μg en 200 μL) o sublingual (Sl) (100 μg en 25 μL), respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo. Los tres restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI IN (50 μg en 25 μL por animal), IG (100 μg en 200 μL ) o Sl (50 μg en 25μL por animal), respectivamente.
Método de extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: se procedió según se describe en el ejemplo 3 Detección de IgG anti PL por ELISA: se procedió según se describe en el ejemplo 3
Conclusión de los resultados: una dosis de AFPLl intramuscular combinada con una dosis de AFCoI oral o sublingual en un solo tiempo (STVS) induce tan altos niveles de IgG anti PL en suero, como los inducidos por las tres dosis de AFCoI administrado oral o sublingual (Fig. 19). Ejemplo 18. En la estrategia de Vacunación Unitemporal la administración de AFCoI por varias vías mucosales a la vez de forma combinada y AFPLl por vía intramuscular al mismo tiempo (STVS) induce altos niveles de IgA específica en heces, en ratones. Protocolo de Inmunización: ratones Balb/c se distribuyeron en trece grupos inmunizados y un control. Los tres primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCoI por vía intranasal (IN) (100 μg en 25 μL), oral (IG) (100 μg en 200 μL) o sublingual (Sl) (100 μg en 25 μL), respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. Otros tres grupos fueron inmunizados con AFCoI combinando dos de las vías mucosales anteriores y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía IM en un solo tiempo, IN-IG-IM, IN-Sl-IM u IG-Sl-IM. Los tres restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI IN (50 μg en 25 μL por animal), IG (100 μg en 2Oθ' μL ) o Sl (50 μg en 25 μL por animal), respectivamente.
Método de extracción y procesamiento de las heces y lavado vaginal: se realizo la extracción de heces y lavado vaginal como se indica en el Ejemplo 11.
Detección de IgA anti PL por ELISA: se procedió según se describe en el ejemplo 4. Conclusión de los resultados: una dosis de AFPLl intramuscular en un mismo tiempo (STVS) con una dosis de AFCoI por varias mucosales combinadas induce altos niveles de IgA anti PL en heces y lavado vaginal, comparados con los inducidos por las tres dosis de AFCoI administrado intranasal, oral o sublingual. Estas respuestas son sinergizadas por la aplicación simultánea de dos vías mucosales (Fig. 20-22).
Ejemplo 19: La inmunización con toxoide tetánico toxoide (TT) diftérico (TD) o pertusis celular (P), co-administrados con el Cocleato por vía intranasal, sublingual y oral, respectivamente en forma simultánea con la vacuna de DPT (absorbida en alúmina) adicionado por vía intramuscular induce significativas respuestas de IgG sistémicas contra todos los antígenos. Protocolo de Inmunización: ratones Balb/c se distribuyeron en siete grupos inmunizados y un control. Los tres primeros grupos fueron inmunizados con AFCol+TT (100 μg /10 LF (unidades de floculación) en 25 μL) por vía intranasal (IN), AFCoI-TD (100 μg /25 LF en 25 μL) por vía sublingual (Sl) o AFCoI-P (100 μg /16 UO (unidades de opacidad) en 25 μL) por vía oral (IG) y simultáneamente DPT intramuscular (IM). Los grupos 4, 5 y 6 fueron inmunizados con 3 dosis en simulares concentraciones de AFCol+TT, AFCoI-TD o AFCoI- P por vías IN, SL o IG respectivamente. Otro grupo fue inmunizado con dos dosis de DPT IM.
Método de extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: se procedió según se describe en el ejemplo 3. Método de Extracción y procesamiento de Ia saliva: se procedió según se describe en el ejemplo 4.
Detección de IgG anti Toxoide Tetánico (TT) por ELISA: Reactivos y Soluciones: Toxoide Tetánico: ATPE- Lote 8005 Instituto Finlay, c (808LF/mL)
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2CO3 11 mM, NaHCO3 35 mM (pH 9.6)
Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1%
(p/v) Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0,1%): SSTF, Tween 20 al 0,1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las muestras (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0,1%) Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigam, St. Louis, MO, EUA) Solución tampón Sustrato, STS (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6)) Solución de detención: H2SO4 2 M. Metodología:
• Se añade 100 μL/pozo de TT a una concentración de 10 LF/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 40C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF • Se añade 100 μL/pozo de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda
• Se lava tres veces con solución de lavado
• Los sueros a evaluar se diluyeron 1:100 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μL / pozo por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia y incuban 2 h a 37°C.
• Se lava tres veces con Solución de lavado
• Se adicionan 100 μL/pozo del conjugado Anti IgG diluido 1:2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con Solución de lavado • Se añade 100 μL/pozo de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno ortΛo-fenilendiamma (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min • La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención. La medición de absorbancia en densidad óptica (DO) se realiza a 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus)
Resultados: Expresión y Cálculo Los resultados de IgG anti TT fueron expresados como densidad óptica (DO). En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor del control.
Detección de IgG anti Toxoide Diftérico (TD) por ELISA:
Reactivos y Soluciones:
Toxoide Diftérico: ADPE- Lote 8001 Instituto Finlay, c (1200LF/mL) Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2CO3 11 raM, NaHCO3 35 mM (pH 9.6)
Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1%
(p/v)
Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0,1%): SSTF, Tween 20 al 0,1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las muestras (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0,1%)
Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigam, St. Louis, MO, EUA)
Solución tampón Sustrato, STS (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6))
Solución de detención: H2SO4 2 M.
Metodología: • Se añade 100 μL/pozo de TD a una concentración de 25 LF/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 40C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF
• Se añade 100 μL/pozo de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda
• Se lava tres veces con solución de lavado
• Los sueros a evaluar se diluyeron 1:100 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μL / pozo por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia y incuban 2 h a 37°C. • Se lava tres veces con Solución de lavado • Se adicionan 100 μL/pozo del conjugado Anti IgG diluido 1:2000 en Solución de
Dilución de las muestras y se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con Solución de lavado
• Se añade 100 μL/pozo de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno ortΛσ-fenilendiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención. La medición de absorbancia en densidad óptica (DO) se realiza a 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus) Resultados: Expresión y Cálculo
Los resultados de IgG anti DT fueron expresados como densidad óptica (DO). En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor del control.
Detección de IgG anti Pertussis Celular (PC) por ELISA: Reactivos y Soluciones: Pertussis Células Enteras (PC): Lote 8006 Instituto Finlay, c (756UO/mL)
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2CO3 11 mM, NaHCO3 35 mM (pH 9.6)
Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1%
(p/v) Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0,1%): SSTF, Tween 20 al 0,1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las muestras (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0,1%) Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigam, St. Louis, MO, EUA) Solución tampón Sustrato, STS (Na2HPO4 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6)) Solución de detención: H2SO4 2 M. Metodología:
• Se añade 100 μL/pozo de PC a una concentración de 16 UO/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 40C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF « Se añade 100 μL/pozo de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda • Se lava tres veces con solución de lavado
• Los sueros a evaluar se diluyeron 1:100 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μL / pozo por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia y incuban 2 h a 37°C. • Se lava tres veces con Solución de lavado
• Se adicionan 100 μL/pozo del conjugado Anti IgG diluido 1:2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 1 h a 370C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con Solución de lavado
• Se añade 100 μL/pozo de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno ort/zo-fenilendiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención. La medición de absorbancia en densidad óptica (DO) se realiza a 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus) Resultados: Expresión y Cálculo
Los resultados de IgG anti PC fueron expresados como densidad óptica (DO). En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor del control.
Resumen:
Se demuestra que la aplicación simultánea de diferentes antígenos por varias vías mucosales y la aplicación de la vacuna combinada (DPT) por vía intramuscular en la estrategia unitemporal es efectiva para la inducción de respuesta inmune.
Ejemplo 20. La inmunización unidosis con el Cocleato (AFCoI) Intranasal y el Proteoliposoma (AFPLl) intramuscular simultáneos (STVS) induce respuesta de memoria demostrada tras una dosis de refuerzo administrada a los 4 meses de la inmunización.
Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c se distribuyeron en dos grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo inmunizados con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl por vía intramuscular a una concentración de 12.5 μg en 50 μL por animal. El segundo grupo fue inmunizado con una dosis de AFCoI (50 μg en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía intranasal y simultáneamente (STVS) AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular. A los
120 días (4 meses) se le realizó un desafío con AFCoI por vía intranasal con 50 μg en 25 μL,
12.5 μL por cada fosa nasal.
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para Ia obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 3, añadiendo que las extracciones fueron realizadas a los 21 días, 70, 90 y 120 días después de la última dosis administrada, así como a los 21 días después del desafío.
Detección de IgG anti PL por ELISA: se procedió según se describe en el ejemplo 3 (Fig. 23).
Resumen:
La estrategia de inmunización unitemporal no solo induce respuestas a nivel efector sino que induce también buena respuesta de memoria apreciada tras administrar una dosis de refuerzo a los 4 meses de la inmunización.
Ejemplo 22. La inmunización con el Cocleato conteniendo Ova (AFCol-Ova) Intranasal y el Proteoliposoma conteniendo Ova (AFPLl-Ova) intramuscular simultáneos (STVS) induce respuesta de memoria anti Ova tras una dosis de refuerzo de Ova administrada a los 4 meses de la inmunización.
Protocolo de Inmunización: ratones Balb/c se distribuyeron en tres grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo inmunizados con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl-Ova por vía intramuscular a una concentración de 12.5 μg / lOμg en 50 μL por animal. El segundo grupo fue inmunizado con una dosis de AFCol-Ova (50 μg / 25 μg en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía intranasal y simultáneamente (STVS) una dosis de AFPLl (12.5 μg / lOμg en 50 μL) por vía intramuscular. Un tercer grupo inmunizado con dos dosis Ova (10 μg en 50 μL) intramuscular. A los 120 días (4 meses) se le realizó un desafío por vía intranasal con 25 μg de Ova incluida en AFCoI en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal en los grupos 1 y 2 o solo Ova intramuscular en el grupo 3.
Método de Extracción y procesamiento de Ia sangre para la obtención del suero: se procedió según se describe en el ejemplo 3, añadiendo que las extracciones fueron realizadas a los 21 días, 70, 90 y 120 días después de la última dosis administrada, así como a los 21 días después del desafío. Detección de IgG anti Ova por ELISA: se procedió según se describe en el ejemplo 12
(Fig. 24). Resumen:
La estrategia de inmunización unitemporal con Ova como antígeno incorporado no solo induce respuestas a nivel efector sino que induce respuesta de memoria anti Ova apreciada tras administrar una dosis de refuerzo de Ova intranasal a los 4 meses de la inmunización.
La estrategia de inmunización unitemporal con Ova como antígeno incorporado no solo induce respuestas a nivel efector sino que induce respuesta de memoria anti Ova apreciada tras administrar una dosis de refuerzo de Ova intranasal a los 4 meses de la inmunización.
Ejemplo 23. La Estrategia de Inmunización Unitemporal funciona también empleando otros adyuvantes mucosales como la toxina de cólera (CT).
Protocolo de Inmunización: Ratones Balb/c se distribuyeron en dos grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con una dosis de APCol-Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y simultáneamente una dosis de AFPLl -Ova (25 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular. Un segundo grupo fue inmunizado con una dosis de CT-Ova (5 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y simultáneamente una dosis de CT-Ova (5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular.
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 3. Método de Extracción y procesamiento del lavado vaginal: Se procedió según se describe en el ejemplo 11.
Método de Extracción y procesamiento de las heces: Se procedió según se describe en el ejemplo 11.
Detección de IgG anti Ova por ELISA: Se procedió según se describe en el ejemplo 14. Detección de IgA anti Ova por ELISA: Se procedió según se describe en el ejemplo 15.
Resumen:
CT-Ova aplicado según la estrategia de Vacunas Unitemporales, induce significativas respuestas de IgG anti Ova en suero e IgA en lavado vaginal y en heces. Por ello, la estrategia de inmunización unitemporal funciona también con otros adyuvantes mucosales ( Fig 25, 26,
27)
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Respuesta de IgG anti PL en suero inducida por el AFCoI, AFPLl o VA- MENGOC-BC® administrados por vía intramuscular. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis (0, 14 días) de AFCoI, AFPLl o VA-MENGOC-BC® por vía Intramuscular (12.5 μg / 50 μL). Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un
ELISA de IgG anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (U/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey
(p<0.05).
Figura 2. Respuesta de IgA anti PL en saliva inducida por el AFCoI, AFPLl o VA- MENGOC-BC® administrados por vía intramuscular. Ratones Balb/c fueron inmunizados con dos dosis (0, 14 días) de AFCoI, AFPLl o VA-MENGOC-BC® por vía Intramuscular (12.5 μg / 50 μL). Para la evaluación de los niveles de IgA anti PL se emplearon las muestras de saliva extraídas 7 días después de la última dosis inmunizada. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (UAJmL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 3. Respuesta de IgA anti PL en saliva inducida por el AFCoI o AFPLl administrados por vía intranasal. Ratones Balb/c fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI o AFPLl por vía Intranasal (50 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal). Para la evaluación de los niveles de IgA anti PL se emplearon las muestras de saliva extraídas 7 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (UA/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05). Figura 4. Respuesta de IgG anti PL en suero inducida por el AFCoI o AFPLl administrados por vía intranasal. Ratones Balb/c fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI o AFPLl por vía Intranasal (50 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal). Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti PL. En el gráfico se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (U/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 5. Respuesta de IgG anti PL en suero inducida por una y dos dosis de AFCoI o AFPH administrados por vía intramuscular. Ratones Balb/c fueron inmunizados con una o dos dosis de AFCoI o AFPLl por vía Intramuscular (12.5 μg / 50 μL). Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (U/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 6. Respuesta de IgA anti PL en saliva inducida por una, dos o tres dosis de AFCoI o AFPLl administrados por vía intranasal. Ratones Balb/c fueron inmunizados con una, dos o tres dosis de AFCoI o AFPLl por vía Intranasal (50 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal). Para la evaluación de los niveles de IgA anti PL se emplearon las muestras de saliva extraídas 7 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (UA/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 7. Respuesta de IgG anti PL en suero inducida por una, dos o tres dosis de
AFCoI o AFPLl administrados por vía intranasal. Ratones Balb/c fueron inmunizados con una, dos o tres dosis de AFCoI o AFPLl por vía Intranasal (50 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal). Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (LVmL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 8. Respuesta de IgG anti PL en suero inducida por la inmunización unitemporal (STVS) de AFCoI Intranasal y AFPLl Intramuscular. Ratones Balb/c fueron distribuidos en tres grupos inmunizados y uno como control. Un primer grupo inmunizados con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI (50 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía Intranasal (IN). Un segundo grupo inmunizados.con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl (12.5 μg / 50 μL por animaL) por vía Intramuscular (IM). Un tercer grupo inmunizados con una dosis de AFPLl (12.5 μg / 50 μL) IM y simultáneamente una de AFCoI (100 μg / 25 μL) IN (STVS). Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (U/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 9. Respuesta de IgGl e IgG2a anti PL en suero inducida por la inmunización unitemporal (STVS) de AFCoI Intranasal y AFPLl Intramuscular. Ratones Balb/c fueron distribuidos en tres grupos inmunizados y uno como control. Un primer grupo inmunizados con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI (50 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía Intranasal (IN). Un segundo grupo inmunizado con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl (12.5 μg / 50 μL por animaL) por vía Intramuscular (IM). Un tercer grupo inmunizado con una dosis de AFPLl (12.5 μg / 50 μL) IM y simultáneamente AFCoI (100 μg / 25 μL) IN STVS. Para la evaluación de los niveles de subclases de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de subclases de IgG anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores de densidad óptica (DO) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes de cada formulación. Figura 10. Respuesta de IgA anti PL en saliva inducida por la inmunización unitemporal
(STVS) de AFCoI Intranasal y AFPLl Intramuscular. Ratones Balb/c fueron distribuidos en cuatro grupos inmunizados y uno como control. Un primer grupo inmunizado con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI (50 μg / 25 μL por animal) por vía Intranasal (IN). Un segundo grupo inmunizado con una dosis de AFCoI (50 μg / 25 μL por animal) por vía Intranasal (IN), el tercero inmunizado con una dosis de AFPLl (12.5 μg / 50 μL) IM y simultáneamente AFCoI (100 μg / 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal) IN STVS y el cuarto con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl (12.5 μg / 50 μL por animal) por vía Intramuscular (IM). Para la evaluación de los niveles de IgA anti PL se emplearon las muestras de saliva extraídas a los 7 y 14 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (UA/mL) de la saliva extraída a los 7 días para los grupos AFCoI, AFPLl y a los 14 días para el grupo STVS en 3 experimentos independientes en que las respuestas fueron las máximas. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 11. Respuesta de IgA anti PL en heces, inducida por la inmunización simultánea de AFPLl Intramuscular y AFCoI Intranasal en un solo tiempo (STVS). Ratones Balb/c fueron distribuidos en tres grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con una dosis de AFPLl (12.5 μg / 50 μL) intramuscular (IM) y AFCoI (100 μg / 25 μL) intranasal (IN) en un solo tiempo y un segundo grupo inmunizado con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI (50 μg / 25 μL por animal) por vía IN. Para la evaluación de los niveles de IgA anti PL se emplearon las muestras de heces extraídas a los 14 días después de la última dosis inmunizada. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA contra el PL. En el gráfico se muestran las medias y desviaciones estándarares de la relación matemática de los valores (UA/mL) de las heces extraídas a los 14 días en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 12. Respuesta de IgA anti PL en lavado vaginal, inducida por la inmunización simultánea de AFPLl Intramuscular y AFCoI Intranasal en un solo tiempo (STVS).
Ratones Balb/c fueron distribuidos en tres grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo inmunizado con una dosis de AFPLl (12.5 μg / 50 μL) intramuscular (IM) y AFCoI (100 μg / 25 μL) intranasal (IN) en un solo tiempo y un segundo grupo inmunizado con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI (50 μg / 25 μL por animal) por vía IN. Para la evaluación de los niveles de IgA contra PL se emplearon las muestras de lavado vaginal extraídas a los 21 días después de la última dosis inmunizada. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti PL. En el gráfico se muestran las medias y desviaciones estándares de la relación matemática de los valores (UAImL) del lavado vaginal extraído a los 21 días en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 13. Respuesta de IgG anti Ova en suero inducida por la inmunización unitemporal (STVS) de AFCol-Ova Intranasal y AFPLl-Ova Intramuscular. Ratones Balb/c fueron distribuidos en cuatro grupos inmunizados y uno como control. Un primer grupo inmunizados con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCol-Ova (50 μg / 25 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía Intranasal (IN). Un segundo grupo inmunizados con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl-Ova (12.5 μg / 10 μg / 50 μL por animal) por vía Intramuscular (IM). Un tercer grupo inmunizados con una dosis de AFPLl-Ova (12.5 μg / 10 μg / 50 μL) IM y simultáneamente una de AFCol-Ova (100 μg / 50 μg / 25 μL) IN (STVS). Un cuarto grupo inmunizados con 2 dosis de Ova (10 μg / 50 μL por animal) por vía intramuscular. Para la evaluación de los niveles de IgG anti Ova se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti Ova. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 14. Respuesta de IgA anti Ova en saliva inducida por la inmunización unitemporal (STVS) de AFCoI Intranasal y AFPLl Intramuscular. Ratones Balb/c fueron distribuidos en cuatro grupos inmunizados y uno como control. Un primer grupo inmunizados con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCol-Ova (50 μg / 25 μg / 25 μL por animal,
12.5 μL por cada fosa nasal) por vía Intranasal (IN). Un segundo grupo inmunizados con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl-Ova (12.5 μg / 10 μg / 50 μL por animal) por vía Intramuscular (IM). Un tercer grupo inmunizados con una dosis de AFPLl-Ova (12.5 μg / 10 μg / 50 μL) IM y simultáneamente una de AFCol-Ova (100 μg / 50 μg / 25 μL) IN (STVS). Un cuarto grupo inmunizados con 3 dosis de Ova (25 μg / 25 μL por animal) por vía intranasal. Para la evaluación de los niveles de IgA anti Ova se emplearon las muestras de saliva extraídas a los 7 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti Ova. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de la saliva extraída a los 7 días en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 15. Respuesta de IgG anti PL inducida por la inmunización simultánea de AFCoI intramuscular y AFCoI intranasal en un solo tiempo o de AFPLl intramuscular y AFPLl intranasal en un solo tiempo (STVS homologo). Ratones Balb/c se distribuyeron en cuatro grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con una dosis de AFCoI (lOOμg en 25μL) por vía intranasal (IN) y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo, el segundo con una dosis de AFCoI (100 μg en 25 μL) por vía IN y una dosis de AFCoI (12.5 μg en 50 μL) por vía IM en un solo tiempo y el tercero con una dosis de AFPLl (100 μg en 25 μL) por vía IN y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular en un solo tiempo. Como control positivo un grupo con tres dosis (0, 7, 14 días) de AFCoI por vía IN a una concentración de 50 μg / 25 μL por animal, 12.5 μL por cada fosa nasal. Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti PL. En la figura se muestran las medias y desviaciones estándares de la relación matemática de los valores (U/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 16. Respuesta de IgG anti Ova inducida por la inmunización simultánea de AFCol-Ova Intramuscular y AFCol-Ova Intranasal en un solo tiempo o de AFPLl-Ova Intramuscular y AFPLl-Ova Intranasal en un solo tiempo (STVS homologo). Ratones Balb/c se distribuyeron en seis grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo inmunizado con una dosis de AFCol-Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal (IN) y una dosis de AFPLl-Ova (12.5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. El segundo y tercer grupo inmunizado con AFCol-Ova por vía IN e IM y AFPLl- Ova por vía IN e IM, respectivamente en las mismas concentraciones que el primer grupo. El cuarto grupo inmunizado con tres dosis de AFCoI- Ova por vía IN (50 μg / 25 μg en 25 μL) y los dos restantes inmunizados con tres y dos dosis de Ova por vía IN e IM respectivamente. Para la evaluación de los niveles de IgG anti Ova se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti Ova. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 17. Respuesta de IgA en heces inducida por la administración unitemporal de una dosis de AFCoI por vía oral o sublingual y AFPLl por vía intramuscular respectivamente al mismo tiempo (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en seis grupos inmunizados y uno control. Los tres primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCoI por vía intranasal (IN) (100 μg en 25 μL), oral (IG) (100 μg en 200 μL) o sublingual (Sl) (100 μg en 25 μL) respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. Los tres restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI IN (50 μg en 25 μL por animal), IG (100 μg en 200 μL ) o Sl (50 μg en 25 μL por animal), respectivamente. Para la evaluación de los niveles de IgA anti PL se emplearon las muestras de heces extraídas 14 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti PL. En la figura se muestran las medias y desviaciones estándares de la relación matemática de los valores (UA/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 18. Respuesta de IgA en lavado vaginal inducida por la administración unitemporal de una dosis de AFCoI por vía oral o sublingual y AFPLl por vía intramuscular respectivamente al mismo tiempo (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en seis grupos inmunizados y uno control. Los tres primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCoI por vía intranasal (IN) (100 μg en 25 μL), oral (IG) (100 μg en 200 μL) o sublingual (Sl) (100 μg en 25 μL) respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. Los tres restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI IN (50 μg en 25 μL por animal), IG (100 μg en 200 μL ) o Sl (50 μg en 25 μL por animal), respectivamente. Para la evaluación de los niveles de IgA anti PL se emplearon las muestras de lavado vaginal extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti PL. En la figura se muestran las medias y desviaciones estándares de la relación matemática de los valores (UA/mL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 19. Respuesta de IgG en suero inducida por la administración unitemporal de una dosis de AFCoI por vía oral o sublingual y AFPLl por vía intramuscular al mismo tiempo (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en seis grupos inmunizados y uno control. Los tres primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCoI por vía intranasal (IN) (100 μg en 25 μL), oral (IG) (100 μg en 200 μL) o sublingual (Sl) (100 μg en 25 μL), respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. Los tres restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI IN (50 μg en 25 μL por animal), IG (100 μg en 200 μL) o Sl (50 μg en 25 μL por animal), respectivamente. Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti PL. En la figura se muestran las medias y desviaciones estándares de la relación matemática de los valores (LVmL) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 20. Respuesta de IgA anti PL en heces, inducida por la inmunización simultánea de AFPLl intramuscular y AFCoI intranasal-oral combinadas en un solo tiempo
(STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en cinco grupos inmunizados y uno control. Los dos primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCoI por vía intranasal (IN) (100 μg en 25 μL) u oral (IG) (100 μg en 200 μL), respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. Otro grupo inmunizado con una dosis de AFCoI por vía IN (100 μg en 25 μL) y IG (100 μg en 200 μL) de forma combinada y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía IM en un solo tiempo Los dos restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI IN (50 μg en 25 μL por animal) o IG (100 μg en 200 μL), respectivamente. Para la evaluación de los niveles de IgA contra PL se emplearon las muestras de heces extraídas a los 14 días después de la última dosis inmunizada. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA contra el PL. En el gráfico se muestran las medias y desviaciones estándares de la relación matemática de los valores (UAJmL) de IgA en heces extraído a los 21 días en 3 experimentos independientes.
Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 21. Respuesta de IgA anti PL en heces, inducida por Ia inmunización simultánea de AFPLl Intramuscular y AFCoI intranasal-sublingual combinadas en un solo tiempo (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en cinco grupos inmunizados y uno control. Los dos primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCoI por vía intranasal (ESi) (100 μg en 25 μL) o sublingual (Sl) (100 μg en 200 μL), respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. Otro grupo inmunizados con una dosis de AFCoI por vía IN (100 μg en 25 μL) y Sl (100 μg en 25 μL) de forma combinada y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía IM en un solo tiempo Los dos restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI IN (50 μg en 25 μL por animal) o sublingual (50 μg en 25 μL), respectivamente. Para la evaluación de los niveles de IgA contra PL se emplearon las muestras de heces extraídas a los 14 días después de la última dosis inmunizada. La determinación se realizo mediante un ELISA de IgA contra el PL. En el gráfico se muestran las medias y desviaciones estándares de la relación matemática de los valores (UAJmL) de IgA en heces extraído a los 21 días en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 22. Respuesta de IgA anti PL en heces, inducida por la inmunización simultánea de AFPLl intramuscular y AFCoI oral-sublingual combinadas en un solo tiempo (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en cinco grupos inmunizados y uno control. Los dos primeros grupos fueron inmunizados con una dosis de AFCoI por vía oral (IG) (100 μg en 200 μL) o sublingual (Sl) (100 μg en 25 μL), respectivamente y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) en un solo tiempo. Otro grupo inmunizado con una dosis de AFCoI por vía oral (IG) (100 μg en 200 μL) y sublingual (Sl) (100 μg en 25 μL) de forma combinada y una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía IM en un solo tiempo. Los dos restantes grupos fueron inmunizados con tres dosis (0, 7, 14) de AFCoI Sl (50 μg en 25 μL por animal) o IG (100 μg en 200 μL). Para la evaluación de los niveles de IgA anti PL se emplearon las muestras de heces extraídas a los 14 días después de la última dosis inmunizada. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA contra el PL. En el gráfico se muestran las medias y desviaciones estándares de la relación matemática de los valores (UA/mL) de IgA en heces extraído a los 21 días en 3 experimentos independientes.
Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 23. Respuesta de memoria anti PL inducida por la inmunización simultánea de unidosis de AFCoI intranasal y AFPLl intramuscular (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en dos grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo inmunizado con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl por vía intramuscular (IM) a una concentración de 12.5 μg en 50 μL por animal. El segundo grupo fue inmunizado con una dosis de AFCoI (50 μg en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía intranasal (IN) y simultáneamente una dosis de AFPLl (12.5 μg en 50 μL) por vía intramuscular (IM) (STVS). A los 120 días (4 meses) se le realizó un desafío por vía intranasal con 50 μg de cada antígeno en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal. Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21, 70, 90 y 120 días después de la última dosis de inmunización, así como a los 14 y 21 días después del desafío. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti PL. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 24. Respuesta de memoria anti Ova inducida por Ia inmunización simultánea de de AFCol-Ova intranasal y AFPLl-Ova intramuscular (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en tres grupos inmunizados y uno como control. Un primer grupo inmunizados con dos dosis (0, 14 días) de AFPLl-Ova por vía intramuscular (IM) a una concentración de 12.5 μg / lOμg en 50 μL por animal. El segundo grupo fue inmunizado con una dosis de AFCol-Ova (50 μg / 25 μg en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal) por vía intranasal (IN) y simultáneamente (STVS) una dosis de AFPLl (12.5 μg / lOμg en 50 μL) por vía IM. Un tercer grupo inmunizado con dos dosis Ova (10 μg en 50 μL) IM. A los 120 días (4 meses) se le realizó un desafío por vía intranasal con AFCol-Ova (50 μg / 25 μg) en 25 μL, 12.5 μL por cada fosa nasal. Para la evaluación de los niveles de IgG anti PL se emplearon las muestras de suero extraídas 21, 70, 90 y 120 días después de la última dosis de inmunización, así como a los 14 y 21 días después del desafío. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti Ova. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05). Figura 25. Respuesta de IgG anti Ova en suero inducida por la administración unitemporal de una dosis de CT-Ova por vía intranasal y CT-Ova por vía intramuscular respectivamente al mismo tiempo (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en dos grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con una dosis de APCoI -Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y simultáneamente una dosis de AFPLl -Ova (25 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular. Un segundo grupo fue inmunizado con una dosis de CT-Ova (5 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y simultáneamente una dosis de CT-Ova (5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular. Para la evaluación de los niveles de IgG anti Ova se emplearon las muestras de suero extraídas 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgG anti Ova. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 26. Respuesta de IgA anti Ova en lavado vaginal inducida por la administración unitemporal de una dosis de CT-Ova por vía intranasal y CT-Ova por vía intramuscular respectivamente al mismo tiempo (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en dos grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con una dosis de AFCoI -Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y simultáneamente una dosis de AFPLl -Ova (25 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular. Un segundo grupo fue inmunizado con una dosis de CT-Ova (5 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y simultáneamente una dosis de CT- Ova (5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular. Para la evaluación de los niveles de IgA anti Ova se emplearon las muestras de lavado vaginal extraídas a los 21 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti Ova. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) del lavado vaginal extraído a los 21 días en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).
Figura 27. Respuesta de IgA anti Ova en heces inducida por la administración unitemporal de una dosis de CT-Ova por vía intranasal y CT-Ova por vía intramuscular respectivamente al mismo tiempo (STVS). Ratones Balb/c se distribuyeron en dos grupos inmunizados y uno control. Un primer grupo fue inmunizado con una dosis de AFCoI -Ova (100 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y simultáneamente una dosis de AFPLl-Ova (25 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular. Un segundo grupo fue inmunizado con una dosis de CT-Ova (5 μg / 50 μg en 25 μL) por vía intranasal y simultáneamente una dosis de CT- Ova (5 μg / 10 μg en 50 μL) por vía intramuscular. Para la evaluación de los niveles de IgA anti Ova se emplearon las muestras de heces extraídas a los 14 días después de la última dosis. La determinación se realizó mediante un ELISA de IgA anti Ova. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de las heces extraídas a los 14 días en 3 experimentos independientes. Las p diferentes denotan diferencias significativas según prueba Tukey (p<0.05).

Claims

VACUNAS UNITEMPORALESREIVINDICACIONES
1. Formulaciones vacunales caracterizadas porque contienen proteoliposomas o sus derivados que se aplican simultáneamente por una o más vías de administración.
2. Formulaciones vacunales según reivindicación 1, caracterizadas porque los proteoliposomas y sus derivados son administrados simultáneamente por vía mucosal y parenteral.
3. Formulaciones vacunales según reivindicación 2, caracterizadas porque la administración mucosal puede realizarse por varias vías.
4. Formulaciones vacunales según reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas porque pueden ser administradas simultáneamente en una de las siguientes combinaciones: A+B; B+C; A+D o C+D:
A: proteoliposoma por vía mucosal B : proteoliposoma por vía parenteral
C: derivados del proteoliposoma por vía mucosal D: derivados del proteoliposoma por vía parenteral
5. Formulaciones vacunales según reivindicaciones 2 a 4, caracterizadas porque la administración mucosal puede ser la vía nasal, oral, sublingual, vaginal y/o rectal.
6. Formulaciones vacunales según reivindicaciones 2 y 4, caracterizadas porque la administración parenteral puede ser por la vía intramuscular, intradérminca, subcutánea o transdérmica.
7. Formulaciones vacunales según reivindicación 1, caracterizadas porque los proteoliposomas y sus derivados actúan como adyuvantes de antígenos propios o heterólogos.
8. Formulaciones vacunales según reivindicación 1, caracterizada porque los derivados de los proteoliposomas pueden ser los cocleatos.
9. Formulaciones vacunales de aplicación unitemporal en que se empleen otros adyuvantes mucosales.
10. Formulaciones vacunales de aplicación unitemporal en que la aplicación parenteral pueda ser amplificada por la adición de otros sistemas de reparto (delivery).
11. Uso de formulaciones vacunales de forma unitemporal por dos o más vías de administración.
12. Uso de formulaciones vacunales según reivindicación 11, que comprende la aplicación simultánea de proteoliposomas y sus derivados por dos o más vías de administración de forma unitemporal.
13. Uso de formulaciones vacunales según reivindicaciones 11 y 12, que comprende la administración simultánea de proteoliposomas y sus derivados por vía Mucosal y Parenteral.
14. Uso de formulaciones vacunales según reivindicación 13, caracterizado porque la administración mucosal puede realizarse por varias vías.
15. Uso de formulaciones vacunales según reivindicación 12, caracterizado porque pueden ser administradas simultáneamente en una de las siguientes combinaciones: A+B;
B+C; A+D o C+D:
A: proteoliposoma por vía mucosal
B: proteoliposoma por vía parenteral C: derivados del proteoliposoma por vía mucosal
D: derivados del proteoliposoma por vía parenteral
16. Uso de formulaciones vacunales según reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque la administración mucosal puede ser por vía nasal, oral, sublingual, vaginal y/o rectal.
17. Uso de formulaciones vacunales según reivindicaciones 13 y 15, caracterizado porque la administración parenteral puede ser por vía intramuscular, intradérminca, subcutánea o transdérmica.
18. Uso de formulaciones vacunales según reivindicaciones 11 a la 16, para la prevención y tratamiento de infecciones o enfermedades tumorales.
19. Uso de formulaciones vacunales según reivindicación 11, en donde se apliquen diferentes tipos de antígenos por una o varias vías mucosales simultáneamente con la correspondiente vacuna combinada por vía parenteral.
20. Método de tratamiento caracterizado porque comprende la aplicación de formulaciones vacunales de forma unitemporal por dos o más vías de administración.
21. Método de tratamiento según reivindicación 20, que comprende la aplicación simultánea de proteoliposomas y sus derivados por dos o más vías de administración de forma unitemporal.
22. Método de tratamiento según reivindicaciones 20 y 21, que comprende la aplicación simultánea de proteoliposomas y sus derivados por vía mucosal y parenteral.
23. Método de tratamiento según reivindicación 22, caracterizado porque la administración mucosal puede realizarse por varias vías.
24. Método de tratamiento según reivindicación 21 y 22, caracterizada porque pueden ser administradas simultáneamente en una de las siguientes combinaciones A+B; B+C;
A+D o C+D:
A: proteoliposoma por vía mucosal
B: proteoliposoma por vía parenteral C: derivados del proteoliposoma por vía mucosal
D: derivados del proteoliposoma por vía parenteral
25. Método de tratamiento según reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque la administración mucosal puede ser por vía nasal, oral, sublingual, vaginal y/o rectal.
26. Método de tratamiento según reivindicaciones 22 y 24, caracterizada porque la administración parenteral puede ser por vía intramuscular, intradérminca, subcutánea o transdérmica.
27. Método de tratamiento según reivindicaciones 20 a 26, para la prevención y tratamiento de infecciones y enfermedades tumorales.
28. Método de tratamiento según reivindicación 20, en donde se apliquen diferentes tipos de antígenos por una o varias vías mucosales simultáneamente con la correspondiente vacuna combinada por vía parenteral.
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