WO2010052357A1 - Método de detección de la telangiectasia hemorrágica hereditaria - Google Patents

Método de detección de la telangiectasia hemorrágica hereditaria Download PDF

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Luisa María BOTELLA CUBELLS
Laura Barrios
Carmelo Bernabeu Quierante
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Raras CIBERER
Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Neurodegenerativas CIBERNED
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT) comprising the in vitro analysis of the products of the expression of the ENG or FLT1 and ENG genes or
  • the present invention relates to a kit for the molecular detection of HHT capable of carrying out the detection mentioned above.
  • HHT Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia
  • Osler-Weber-Rendu syndrome is an autosomal dominant vascular disease (Online Mendelian Inheritance in Man; OMIM 187300), associated with frequent epistaxis, gastrointestinal and cerebral hemorrhages, telangiectasias, and arteriovenous malformations in lung, liver and brain (Guttmacher et al., 1995; Shovlin and Letarte, 1999).
  • the penetrance of the disease varies with age, increasing the symptoms of dysplasia as the patient's age increases, being approximately 90% at 45 years.
  • telangiectasias of HHT patients show a widening of the postcapillary venules, eventually disappearing the capillary network, and thus establishing a direct connection between arterioles and venules.
  • the most recent studies indicate that the average prevalence of HHT is around 1 / 5,000-1 / 8,000, being higher in certain regions such as the island of Fu ⁇ en in Denmark, the region of Jura in France, or the island of Bonaire in the Netherlands Antilles (Kjeldsen et al., 1999; Plauchu et al., 1989; Shovlin and Letarte, 1999). This disease is caused by mutations in heterozygosis in at least 4 loci.
  • the first loci to be identified were endoglin (ENG), located on chromosome 9 (McAllister et al., 1994) and ALK1, located on chromosome 12 (Johnson et al., 1996), giving rise to HHT type 1 and 2 respectively.
  • Endoglin ENG
  • ALK1 located on chromosome 12
  • HHT2 is more frequent than HHT1 in Mediterranean countries (Spain, France and Italy).
  • chromosomes 5 CoIe et al., 2005
  • 7 Boyrak-Toydemir et al., 2006
  • Both endoglin and ALK1 are proteins that are expressed primarily in endothelial cells (Bourdeau et al., 1999; Oh et al., 2000) and their expression has been increased in these cells in areas where active angiogenesis is occurring (Duff and col., 2003, Fonsatti et al., 2003, Goumans et al., 2003). Due to their involvement in cardiovascular development, knock out mice, both from Eng and AIkI, die in the gestation process (Li et al., 1999, Oh et al., 2000).
  • Endoglina and ALK1 are part of the TGF-beta receptor complex, which belongs to a superfamily of related cytokines capable of regulating a multitude of cellular processes such as proliferation, differentiation, motility, adhesion and cell death (Massagué, 1990; Shi and Massagué, 2003 ).
  • the TGF-beta family controls and regulates homeostasis, development and repair of the different tissues of the organism.
  • One of the fundamental processes regulated by TGF-beta is Ia angiogenesis (Pepper, 1997).
  • Angiogenesis involves the formation of new blood vessels from other preexisting ones. This process is essential in embryogenesis, wound healing, tumor growth and pathologies inflammatory (Risau, 1997).
  • Endoglina plays an important role in angiogenesis (Duff et al., 2003; Jerkic et al., 2006a) and it is precisely in these pathophysiological processes that high levels of endoglin expression have been detected (Fonsatti et al., 2003; Duff and col., 2003). Endoglina also regulates vascular homeostasis (Jerkic et al., 2004; Toporsian et al., 2005; Jerkic et al., 2006b) and in this context, recently, a functional role for a soluble form of endoglin (sEng) has been described.
  • VEGF-R1 / sFlt1 epidermal growth factor 1 receptor
  • sEng epidermal growth factor 1 receptor
  • Angiopoitein-2 (Ang-2) is another soluble factor in plasma involved in angiogenesis and preeclampsia (Hirokoshi et al, 2007; Shim et al, 2007).
  • Ang-2 expression levels in patients with HHT are approximately halved with respect to levels in healthy donors indicates a potential functional relevance of this factor in HHT (Fernandez-L, 2007).
  • HHT HHT Thrombin et al, 2000
  • This criterion includes four features: epistaxis (spontaneous bleeding from the nostrils); telangiectasias (in characteristic sites, such as the lips, the oral cavity, the fingers, and the nose); arteriovenous malformations in internal organs (AVMs in lung, brain, liver or spinal cord); and family history.
  • epistaxis spontaneous bleeding from the nostrils
  • telangiectasias in characteristic sites, such as the lips, the oral cavity, the fingers, and the nose
  • arteriovenous malformations in internal organs AVMs in lung, brain, liver or spinal cord
  • family history AMMs in lung, brain, liver or spinal cord
  • the present invention based on the detection of levels of some soluble components in blood samples, is a useful tool to diagnose in a simple, fast and efficient manner the HHT and discriminate between its HHT1 and HHT2 forms.
  • Said method comprises obtaining a blood sample from subjects susceptible to HHT, the detection of the soluble components of the plasma sEng and sFIti or sEng and Ang-2 in said sample, and the comparison of the detected amount of said soluble components with a reference amount observed in a control group of healthy individuals.
  • the researchers were able to determine that the levels of sEng, sFIti and Ang-2 are significantly decreased in patients with HHT compared to the control group.
  • the levels of sEng and Ang-2 present significant differences between patients with the forms of the HHT1 and HHT2 disease.
  • HHT in subjects where the mutation in ENG or ALK1 had been identified, being able to analyze the behavior of sEng and Ang-2 in the plasma of both subtypes of HHT First, reduced levels of sEng and sFIti allowed to establish the condition "sick of HHT "with a probability of 95%. To distinguish between the HHT1 and HHT2 variants, the researchers considered in the discriminant analysis the expression levels of sEng and
  • a first aspect of the present invention refers to a method for the detection of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT) comprising:
  • step (b) obtaining a biological sample
  • b detection of the quantity of product of the expression of the genes ENG and FLT1 or ENG and ANGPT2 in the sample obtained in (a)
  • c comparison of the amount detected in step (b) with a reference amount.
  • the method of the present invention allows the detection and sub-classification of the HHT.
  • it is an "in vitro" method.
  • it may include other additional steps, for example related to the pre-treatment of the sample or the evaluation of the results obtained by this method.
  • steps (b) and / or (c) of the method can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the amount in step (b) or the computerized comparison in the step (b).
  • detection refers to the ability to discriminate between HHT and non-HHT (healthy) samples and / or between HHT1 and HHT2 samples, when a sample classification method based on the analysis is applied of the quantity of the product of the expression of the genes ENG and FLT1 or ENG and ANGPT2 and in the comparison of the amount detected with respect to a reference amount.
  • This discrimination as understood by an expert in the field, is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly.
  • the amount that is significantly statistical can be established by a person skilled in the art through the use of different statistical tools, for example, the determination of intervals of confidence, p-value determination, Student test, Fisher discriminant functions, etc.
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention allows the disease to be correctly detected in at least 60%, in at least 70%, in at least 80%, or in at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • biological sample refers to, but is not limited to, tissues and / or biological fluids of a subject, obtained by any method known to a person skilled in the art that serves this purpose.
  • the biological sample is a biological fluid, such as, but not limited to, blood, plasma, urine, saliva, etc.
  • the biological fluid used is plasma.
  • subject refers to animals, preferably mammals, and more preferably humans. Specifically, the subject is suspected of suffering from HHT. More specifically, this suspicion is based on the fulfillment of two or more Curagao criteria.
  • the term "product of expression”, as used in the description, refers to its transcription or expression products (RNA or protein). Or to any form resulting from the processing of said transcription or expression products.
  • the gene expression product is the protein (endogline, FItI or Ang-2). More preferably, the protein is in its soluble form (sEng, sFIti or Ang-2).
  • the detection of the quantity of product of the expression of the genes in the sample obtained refers to the measurement of the quantity or the concentration, preferably in a semi-quantitative or quantitative manner.
  • the measurement can be carried out in a manner Direct or indirect.
  • Direct measurement refers to the measurement of the quantity or concentration of the product of the gene expression based on a signal that is obtained directly from the product of the gene expression and that is directly correlated with the number of molecules of the product of the gene. expression of the gene present in the sample.
  • Said signal - to which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of the expression product.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component (for example, a component other than the product of the gene expression) or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "labels" or enzymatic reaction products ).
  • the detection of the quantity of product of the expression of the genes ENG and FLT1 or ENG and ANGPT2 can be carried out by any method of determining the quantity of the product of the expression of the genes.
  • the detection of the product of the expression of the genes is performed by determining the level of mRNA derived from its transcription where the analysis of the level of mRNA can be performed, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), retrotranscription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), retrotranscription in combination with the ligase chain reaction (RT-LCR), or any other method of nucleic acid amplification; DNA chips made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA chips made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any method of marking; by electrophoresis gels; by membrane transfer and
  • the detection of the quantity of product of the expression of the genes ENG and FLT1 or ENG and ANGPT2 in the sample obtained is performed by determining the level of the proteins encoded by the genes (endoglin, FItI, Ang-2 ), soluble forms of proteins (sEng, sFIti, Ang-2) or fragments thereof, by incubation with a specific antibody, for example, by Western blotting, electrophoresis gels, protein chips, ELISA or any other enzymatic method; by NMR or any other imaging technique.
  • antibody as used in the present invention includes monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibody fragments, combibodies, Fab fragments and scFv antibodies, as well as ligand binding domains.
  • quantity refers to but is not limited to the absolute or relative quantity of the product of the expression of the gene, as well as to any other value or parameter related to it or that can be derived from it.
  • Said values or parameters comprise intensity values of the signal obtained from any of the physical or chemical properties of the expression products of the specified genes obtained by direct measurement, for example, intensity values of mass spectroscopy or nuclear magnetic resonance . Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
  • comparison refers to, but is not limited to, the comparison of the quantity of the product of the gene expression of the biological sample to be analyzed with an amount of a desirable reference source. described elsewhere in this description.
  • the comparison described in section (b) of the method of the present invention can be done manually or assisted by computer.
  • reference quantity refers to the quantity of the expression product that allows to assign the conditions of a healthy individual or an individual suffering from HHT, HHT1 or HHT2.
  • said reference quantity defines a threshold quantity.
  • Suitable reference amounts or thresholds can be determined by the method of the present invention from a reference sample that can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the biological problem sample. More preferably, the threshold amount can be derived from the normal distribution limits of a physiological amount found in a population of control subjects. Said physiological threshold amount can be determined by several well-known techniques, such as, for example, the calculation of the average of the product of the expression of the gene found in a population of control subjects determined by the method of the present invention.
  • the present invention refers, but is not limited, to the detection of the amount of the product of the expression of the ENG and FLT1 genes in biological samples of patients suspected of suffering from HHT and in the comparison of the amount detected in said samples with a reference amount.
  • a detected amount of sEng and sFIti less than the reference amount is indicative of the condition of HHT patient.
  • the reference quantities of sEng and sFIti are determined by the linear combinations obtained in a discriminant Fisher analysis.
  • the reference amount of sEng is equal to or greater than 3.8 ng / ml and the reference amount of sFIti is greater than 60 pg / ml, allowing the detection of the disease with a probability of 95%. In any case, reference amounts somewhat higher than those mentioned would also allow detection with a lower probability of success.
  • Another preferred embodiment of the present invention refers, but is not limited, to the detection of the quantity of the product of the expression of the ENG genes and ANGPT2 in biological samples of patients suspected of suffering from HHT and in the comparison of the amount detected in said sample with a reference amount.
  • a variation of the expression of sEng and Ang-2 with respect to a reference amount makes it possible to discriminate between HHT1 and HHT2.
  • the detected amount of sEng in HHT1 individuals is less than in HHT2 individuals and the detected amount of Ang-2 in HHT2 individuals is less than in HHT1 individuals.
  • the reference amounts of sEng and Ang-2 are determined by the linear combinations obtained in a discriminant Fisher analysis.
  • kits or devices adapted to carry out the HHT detection method comprising the elements necessary for:
  • step (b) compare the quantities detected in step (b) with a reference quantity.
  • Said kit may comprise primers, probes and all those reagents necessary to analyze the variation in the level of expression of the ENG and FLT1 and / or ENG and ANGPT2 genes by means of any of the methods described hereinbefore.
  • the kit can also include, without any limitation, the use of buffers, polymerases, cofactors to obtain optimum activity of these, agents to prevent contamination, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the Kit further comprises instructions for carrying out the HHT detection method.
  • a preferred embodiment of the present invention consists of a diagnostic device of the invention for the detection of mRNA expression levels by means of a technique, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, belonging to the following group: Northern blot analysis, polymerase chain reaction (PCR), real time polymerase chain reaction (RT-PCR), real time ligase chain reaction (RT-LCR) , hybridization or microarray.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR real time polymerase chain reaction
  • R-LCR real time ligase chain reaction
  • Another preferred embodiment of the invention constitutes a diagnostic device of the invention for the detection of mRNA expression levels consisting, by way of illustration and without limiting the invention, in a DNA microarray, a DNA gene chip or a microelectronic DNA chip, which comprises gene probes.
  • Another preferred embodiment of the invention constitutes a diagnostic device of the invention for the detection of protein expression levels by means of a technique, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, belonging to the following group: ELISA, Western blot and a biochip or microarray type protein device that includes specific antibodies.
  • Figure 1 Shows the Ang-2 levels in plasma of reference individuals, patients diagnosed as HHT 1 and patients diagnosed as HHT2.
  • Figure 2. It shows the plasma sEng levels of reference individuals, patients diagnosed as HHT 1 and patients diagnosed as HHT 2. Circles indicate out-of-range individuals.
  • Figure 3 It shows the plasma sFIti levels of reference individuals, patients diagnosed as HHT 1 and patients diagnosed as HHT 2. The asterisk indicates an extreme individual.
  • Figure 4 Shows the scatter plot of the discriminant analysis using the combination of Ang-2 and sEng plasma levels.
  • Figure 5 Shows the plot plot of distribution of sFIti levels in plasma of the reference population and the HHT population.
  • the horizontal line represents the threshold that differentiates both groups.
  • Angiopoietin 2 (Ang-2) and sEng levels were evaluated in a total of 20 HHT patients. Nine of them were HHT type 1 and the other 11, HHT2. To establish the normal ranges in non-HHT population, plasma levels of sEng and Ang-2 were also analyzed in 14 healthy volunteers. Plasma levels of sFIti were also analyzed in 8 HHT patients (without distinguishing between HHT1 and HHT2) and in 8 healthy volunteers. Consent was obtained informed in writing of all participants in the study. The analysis protocol was approved by the ethics committee of our institute. All the patients that were included in the study were clinically diagnosed according to the criteria of Curagao and the genetic mutation was identified by sequencing. Smokers were excluded from the study.
  • Venous blood samples were collected in the presence of EDTA as an anticoagulant and subjected to centrifugation at 15000 g for 15 minutes before the supernatants were stored at -8O 0 C until analysis. The samples were processed before 24 hours passed from the moment of extraction.
  • the levels of these three plasma soluble components were measured using the ELISA Standard quantitative technique, using Quantikine commercial kits (R&D System, Minneapolis, MN, USA), following the manufacturer's instructions.
  • the sensitivity of the assay for Ang-2 is between 1.20 and 21.3 pg / mL with an intra-assay coefficient of variation of 5.9% and intersession of 9.0%.
  • the sensitivity for the sEng ELISA is between 0.001 and 0.030 ng / mL with intra and inter-assay coefficients of 3.0% and 6.5% respectively.
  • the sensitivity for sFIti ELISA is between 1.5 and 13.3 pg / mL, with coefficients of intra and inter-test variation of 2.6% and 9.8% respectively.
  • Ang-2 and sEng levels followed a homogeneous distribution by Levene's test.
  • the distributed data is normally expressed as mean + standard deviation and compared by ANOVA test.
  • the Bonferroni test has been used as a posthoc analysis to establish paired differences.
  • the discriminant analysis was performed for Ang-2, sEng to determine which variables discriminate between two or more groups for the HHT.
  • the basic idea is to know if the groups differ from each other, with respect to the mean of a series of variables and then find a model that predicts belonging to those groups.
  • Figure 1 shows a box chart (Box-Whiskers).
  • the horizontal line in the center of the box represents the 50th percentile, the extremes the 25th and 75th percentiles.
  • Figure 2 shows a box chart (Box-Whiskers).
  • the horizontal line in the center of the box represents the 50th percentile, the 25th and 75th percentile extremes, respectively, and the closed circles indicate individuals out of range.
  • the highest value of these functions determines the group to which a particular individual belongs.
  • Hereditary haemorrhagic telangiectasia current views on genetics and mechanisms of disease. J Med Genet 43: 97-110. -Bayrak-Toydemir P, McDonald J, Akarsu N, Toydemir RM, Calderón F, Tuncali T, Tang W, Miller F, Mao R. (2006) A fourth locus for hereditary hemorrhagic telangiectasia maps to chromosome 7. Am. J. Med Genet A. 140: 2155-2162.
  • Hereditary haemorrhagic telangiectasia a questionnaire based study to commit the different phenotypes caused by endoglin and ALK1 mutations. Journal of Medical Genetics; 40: 585-590.
  • -Bourdeau A Dumont DJ, Letarte M. (1999) A murine model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. J. Clin. Invest. 104: 1343-51.
  • HHT3 hereditary haemorrhagic telangiectasia
  • Soluble endoglin is an accurate predictor and a pathogenic molecule in pre-eclampsia. Nephrol Dial Transplant 22: 712-4.
  • Soluble endoglin joins the soluble fms-like tyrosine kinase (sFlt) receptor as a pre-eclampsia molecule.
  • sEng Soluble endoglin joins the soluble fms-like tyrosine kinase (sFlt) receptor as a pre-eclampsia molecule.
  • sFlt soluble fms-like tyrosine kinase
  • Endoglin a TGFbeta binding protein of endothelial cells is the gene for hereditary haemorrhagic telangiectasia type I. Nature Genet. 8: 345-351. -Oh SP, Seki T, Goss KA, Imamura T, Yi Y, Donahoe PK, Li L, Miyazono K, ten
  • Activin receptor-like kinase 1 modulates transforming growth factor-beta 1 signaling in the regulation of angiogenesis.

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Abstract

Método para la detección de la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT) que comprende el análisis in vitro de los productos de la expresión de los genes ENG o FLT1 y ENG o ANGPT2 en muestras biológicas de pacientes y que, además, permite sub-clasificar las variantes HHT1 y HHT2 de la enfermedad. En particular, la presente invención se refiere a un kit para la detección molecular de HHT capaz de llevar a cabo la detección mencionada anteriormente.

Description

MÉTODO DE DETECCIÓN DE LA TELANGIECTASIA HEMORRAGICA HEREDITARIA.
La presente invención se refiere a un método para Ia detección de Ia Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT) que comprende el análisis in vitro de los productos de Ia expresión de los genes ENG o FLT1 y ENG o
ANGPT2 en muestras biológicas de pacientes y que, además, permite sub- clasificar las variantes HHT1 y HHT2 de Ia enfermedad. En particular, Ia presente invención se refiere a un kit para Ia detección molecular de HHT capaz de llevar a cabo Ia detección mencionada anteriormente.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT), también conocida como síndrome de Osler-Weber-Rendu es una enfermedad vascular autosómica dominante (Online Mendelian Inheritance in Man; OMIM 187300), asociada con frecuentes epistaxis, hemorragias gastrointestinales y cerebrales, telangiectasias, y malformaciones arteriovenosas en pulmón, hígado y cerebro (Guttmacher y col., 1995; Shovlin y Letarte, 1999). La penetrancia de Ia enfermedad varía con Ia edad, aumentando los síntomas de displasia conforme aumenta Ia edad del enfermo, siendo aproximadamente del 90% a los 45 años. Las telangiectasias de los pacientes de HHT muestran un ensanchamiento de las vénulas postcapilares, desapareciendo eventualmente Ia red capilar, y estableciéndose, por tanto, una conexión directa entre arteriolas y vénulas. Los estudios más recientes indican que Ia prevalencia media de Ia HHT se halla en torno a 1/5.000-1/8.000, siendo mayor en ciertas regiones como Ia isla de Fuñen en Dinamarca, Ia región de Jura en Francia, o Ia isla de Bonaire en las Antillas holandesas (Kjeldsen y col., 1999; Plauchu y col., 1989; Shovlin y Letarte, 1999). Esta enfermedad se produce por mutaciones en heterocigosis en al menos 4 loci. Los primeros loci en ser identificados fueron endoglina (ENG), situado en el cromosoma 9 (McAllister y col., 1994) y ALK1, situado en el cromosoma 12 (Johnson y col., 1996), dando lugar a las HHT tipo 1 y 2 respectivamente. En torno a un 90% de los enfermos de HHT presentan una mutación en uno de estos dos genes. Los síntomas clínicos de las variantes HHT1 y HHT2 son muy parecidos, pero su correcto diagnóstico es importante en Ia elección del screening y seguimiento. La prevalencia de Ia HHT1 sobre Ia HHT2 es mayor en Canadá, USA y Norte de Europa; además, en esta variante Ia edad de comienzo de Ia enfermedad es más temprana y las malformaciones arteriovenosas en pulmón aparecen con mayor frecuencia que en Ia HHT2. En cambio, el sangrado gastrointestinal y Ia afectación hepática son más frecuentes en Ia variante HHT2 que en Ia HHT1 (Berg y col., 2003, Abdalla y Letarte, 2006; Letteboer y col. 2006). Además Ia HHT2 es más frecuente que Ia HHT1 en los países mediterráneos (España, Francia e Italia). Recientemente se han descrito un tercer y cuarto locus situados en los cromosomas 5 (CoIe y col., 2005) y 7 (Bayrak-Toydemir y col., 2006) que serían responsables de Ia HHT3 y HHT4 respectivamente, aunque los genes afectados aún se desconocen.
Tanto endoglina como ALK1 son proteínas que se expresan fundamentalmente en células endoteliales (Bourdeau y col., 1999; Oh y col., 2000) y su expresión se ha visto aumentada en estas células en zonas donde se está produciendo una angiogénesis activa (Duff y col., 2003, Fonsatti y col., 2003, Goumans y col., 2003). Debido a su implicación en el desarrollo cardiovascular, los ratones knock out, tanto de Eng como de AIkI, mueren en el proceso de gestación (Li y col., 1999, Oh y col., 2000). Endoglina y ALK1 forman parte del complejo receptor de TGF-beta, que pertenece a una superfamilia de citoquinas relacionadas capaces de regular una multitud de procesos celulares como proliferación, diferenciación, motilidad, adhesión y muerte celular (Massagué, 1990; Shi y Massagué, 2003). La familia de TGF-beta controla y regula Ia homeostasis, desarrollo y reparación de los distintos tejidos del organismo. Uno de los procesos fundamentales regulados por TGF-beta es Ia angiogénesis (Pepper, 1997). La angiogénesis supone Ia formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes. Este proceso es fundamental en embriogénesis, cicatrización de heridas, crecimiento de tumores y patologías inflamatorias (Risau, 1997). Endoglina juega un importante papel en Ia angiogenesis (Duff y col., 2003; Jerkic y col., 2006a) y es precisamente en estos procesos fisiopatologicos donde se han detectado altos niveles de expresión de endoglina (Fonsatti y col., 2003; Duff y col., 2003). Endoglina también regula Ia homeostasis vascular (Jerkic y col., 2004; Toporsian y col., 2005; Jerkic y col., 2006b) y en este contexto, recientemente, se ha descrito un papel funcional para una forma soluble de endoglina (sEng) presente en pacientes embarazadas con preeclampsia (Levine y col., 2006, Luft, 2006, Venkatesha y col., 2006, Lopez-Novoa, 2007, Lim y col, 2008). Niveles elevados en suero del receptor del factor de crecimiento epidérmico 1 (VEGF- R1/sFlt1 ) y de sEng se han encontrado en mujeres con preclampsia (Levine y col., 2006, Lim y col., 2008).
Angiopoiteina-2 (Ang-2) es otro factor soluble en el plasma implicado en angiogenesis y preeclampsia (Hirokoshi y col, 2007; Shim y col, 2007). El hecho de que los niveles de expresión de Ang-2 en pacientes con HHT se encuentren disminuidos aproximadamente a Ia mitad con respecto a los niveles en donantes sanos indica una potencial relevancia funcional de este factor en HHT (Fernandez-L, 2007).
Actualmente, para Ia detección de HHT se suele emplear un perfil clínico consensuado que se conoce como el criterio de Curagao, desarrollado por el Comité consultivo científico de Ia Fundación de Ia HHT (Shovlin y col, 2000). Este criterio incluye cuatro rasgos: epistaxis (sangrados espontáneos de las fosas nasales); telangiectasias (en sitios característicos, tales como los labios, Ia cavidad bucal, los dedos, y Ia nariz); malformaciones arteriovenosas en órganos internos (AVMs en pulmón, en cerebro, en hígado o en Ia médula espinal); y antecedentes familiares. La diagnosis de HHT se establece, si tres de estos criterios están presentes. Si se cumplen uno o dos criterios, se recomienda Ia determinación de Ia mutación genética. Sin embargo, Ia disposición de un servicio de diagnóstico basado en Ia secuenciación es controvertida por el predominio de mutaciones nuevas en individuos afectados (al menos en ENG y ALK1) y de dificultades en Ia detección de mutaciones en heterocigosis, especialmente cuando un solo cambio en una base permite Ia detección de Ia enfermedad.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención, basada en Ia detección de niveles de algunos componentes solubles en muestras de sangre es una herramienta útil para diagnosticar de manera sencilla, rápida y eficaz Ia HHT y discriminar entre sus formas HHT1 y HHT2.
Dicho método comprende Ia obtención de una muestra de sangre de sujetos susceptibles de padecer HHT, Ia detección de los componentes solubles del plasma sEng y sFIti o sEng y Ang-2 en dicha muestra, y Ia comparación de Ia cantidad detectada de dichos componentes solubles con una cantidad de referencia observada en un grupo control de individuos sanos.
Como consecuencia de este análisis, los investigadores pudieron determinar que los niveles de sEng, sFIti y Ang-2 se encuentran disminuidos significativamente en pacientes con HHT con respecto al grupo control. Además, los niveles de sEng y Ang-2 presentan diferencias significativas entre los pacientes con las formas de Ia enfermedad HHT1 y HHT2.
Mediante un análisis discriminante usando como variables sEng, sFIti y Ang-2, los investigadores fueron capaces de realizar una detección diagnóstica de
HHT en sujetos donde Ia mutación en ENG o ALK1 había sido identificada, pudiendo analizar el comportamiento de sEng y Ang-2 en el plasma de ambos subtipos de HHT En primer lugar, niveles reducidos de sEng y de sFIti permitieron establecer Ia condición "enfermo de HHT" con una probabilidad del 95%. Para distinguir entre las variantes HHT1 y HHT2, los investigadores consideraron en el análisis discriminante los niveles de expresión de sEng y
Ang-2, pudiendo discriminar entre las condiciones "enfermo de HHT1" o "enfermo de HHT2" con una probabilidad del 80%.
Por Io tanto, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un método para Ia detección de Telangiectasia Hereditaria Hemorrágica (HHT) que comprende:
a. obtención de una muestra biológica, b. detección de Ia cantidad de producto de Ia expresión de los genes ENG y FLT1 o ENG y ANGPT2 en Ia muestra obtenida en (a) y c. comparación de Ia cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
El método de Ia presente invención permite Ia detección y Ia sub-clasificación de Ia HHT. Preferiblemente, es un método "in vitro". Además de los pasos especificados anteriormente puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo relacionados con el pre-tratamiento de Ia muestra o Ia evaluación de los resultados obtenidos mediante este método. Preferiblemente, los pasos (b) y/o (c) del método pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para Ia detección de Ia cantidad en el paso (b) o Ia comparación computerizada en el paso (b).
El término "detección" según se utiliza en Ia presente invención se refiere a Ia capacidad de discriminar entre muestras HHT y no HHT (sanas) y/o entre muestras HHT1 y HHT2, cuando se aplica un método de clasificación de muestras basado en el análisis de Ia cantidad del producto de Ia expresión de los genes ENG y FLT1 o ENG y ANGPT2 y en Ia comparación de Ia cantidad detectada con respecto a una cantidad de referencia. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en Ia materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en Ia materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, Ia determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student, funciones discriminantes de Fisher, etc. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , 0,05, 0,01 , 0,005 o 0,0001. Preferiblemente, Ia presente invención permite detectar correctamente Ia enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
El término "muestra biológica", tal y como se utiliza en Ia descripción se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en Ia materia que sirva para tal fin. Preferiblemente, Ia muestra biológica es un fluido biológico, como por ejemplo, pero sin limitarse, sangre, plasma, orina, saliva, etc. De preferencia, el fluido biológico utilizado es plasma.
El término "sujeto", tal y como se utiliza en Ia descripción se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente humanos. Específicamente, el sujeto es sospechoso de sufrir HHT. Más específicamente, esta sospecha está basada en el cumplimento de dos o más criterios de Curagao.
El término "producto de Ia expresión", tal y como se utiliza en Ia descripción, hace referencia a sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína). O a cualquier forma resultante del procesamiento de dichos productos de transcripción o expresión. Preferiblemente, el producto de expresión de los genes es Ia proteína (endoglina, FItI o Ang-2). Más preferiblemente, Ia proteína está en su forma soluble (sEng, sFIti o Ang-2).
La detección de Ia cantidad de producto de Ia expresión de los genes en Ia muestra obtenida, tal y como se utiliza en Ia descripción, hace referencia a Ia medida de Ia cantidad o Ia concentración, preferiblemente de manera semi- cuantitativa o cuantitativa. La medida puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a Ia medida de Ia cantidad o Ia concentración del producto de Ia expresión del gen basada en una señal que se obtiene directamente del producto de Ia expresión del gen y que está correlacionada directamente con el número de moléculas del producto de Ia expresión del gen presente en Ia muestra. Dicha señal - a Ia que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del producto de expresión. La medida indirecta incluye Ia medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto del producto de Ia expresión génica) o un sistema de medida biológica (por ejemplo Ia medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
De acuerdo con Ia presente invención, Ia detección de Ia cantidad de producto de Ia expresión de los genes ENG y FLT1 o ENG y ANGPT2 puede ser llevada a cabo por cualquier método de determinación de Ia cantidad del producto de Ia expresión de los genes. En una realización preferida, Ia detección del producto de Ia expresión de los genes se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción donde el análisis del nivel de ARNm se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, mediante amplificación por reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con Ia reacción encadena de Ia polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con Ia reacción en cadena de Ia ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; chips de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; chips de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.
En una realización más preferida, Ia detección de Ia cantidad de producto de Ia expresión de los genes ENG y FLT1 o ENG y ANGPT2 en Ia muestra obtenida se realiza determinando el nivel de las proteína codificada por los genes (endoglina, FItI , Ang-2), las formas solubles de las proteínas (sEng, sFIti , Ang- 2) o fragmentos de las mismas, mediante Ia incubación con un anticuerpo específico, por ejemplo, mediante Western blot, geles de electroforesis, chips de proteína, ELISA o cualquier otro método enzimático; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen.
El término "anticuerpo" tal y como se utiliza en Ia presente invención incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies, fragmentos Fab y scFv de anticuerpos, así como los dominios de unión a ligando.
El término "cantidad", tal y como se utiliza en Ia descripción, se refiere pero no se limita, a Ia cantidad absoluta o relativa del producto de Ia expresión del gen, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con Ia misma o que pueda derivarse de ésta. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de Ia señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de los productos de expresión de los genes especificados obtenidos mediante medida directa, por ejemplo, valores de intensidad de espectroscopia de masas o resonancia magnética nuclear. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
El término "comparación", tal y como se utiliza en Ia descripción, se refiere pero no se limita, a Ia comparación de Ia cantidad del producto de Ia expresión del gen de Ia muestra biológica a analizar con una cantidad de una fuente de referencia deseable descrita en otra parte de esta descripción. La comparación descrita en el apartado (b) del método de Ia presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en Ia descripción, se refiere a Ia cantidad del producto de expresión que permite asignar las condiciones de individuo sano o individuo enfermo de HHT, HHT1 o HHT2. Preferiblemente, dicha cantidad de referencia define una cantidad umbral. Las cantidades de referencia o umbrales adecuadas pueden ser determinadas por el método de Ia presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con Ia muestra biológica problema. Más preferiblemente, Ia cantidad umbral puede derivarse de los límites de distribución normal de una cantidad fisiológica encontrada en una población de sujetos control. Dicha cantidad umbral fisiológica puede ser determinada por varias técnicas bien conocidas, como por ejemplo, el cálculo de Ia media del producto de Ia expresión del gen encontrado en una población de sujetos control determinado mediante el método de Ia presente invención.
En una realización preferida Ia presente invención se refiere, pero no se limita, a Ia detección de Ia cantidad del producto de Ia expresión de los genes ENG y FLT1 en muestras biológicas de pacientes sospechosos de sufrir HHT y en Ia comparación de Ia cantidad detectada en dichas muestras con una cantidad de referencia. Preferiblemente, una cantidad detectada de sEng y sFIti menor que Ia cantidad de referencia es indicativa de Ia condición de enfermo de HHT. Más preferiblemente, las cantidades de referencia de sEng y sFIti vienen determinadas por las combinaciones lineales obtenidas en un análisis discriminante de Fisher. Más preferiblemente, Ia cantidad de referencia de sEng es igual o superior a 3.8 ng/ml y Ia cantidad de referencia de sFIti es superior a 60 pg/ml, permitiendo Ia detección de Ia enfermedad con una probabilidad del 95%. En cualquier caso, cantidades de referencia algo superiores a las citadas permitirían igualmente Ia detección con una probabilidad de acierto menor.
Otra realización preferida de Ia presente invención se refiere, pero no se limita, a Ia detección de Ia cantidad del producto de Ia expresión de los genes ENG y ANGPT2 en muestras biológicas de pacientes sospechosos de sufrir HHT y en Ia comparación de Ia cantidad detectada en dichas muestra con una cantidad de referencia. Preferiblemente, una variación de Ia expresión de sEng y Ang-2 con respecto a una cantidad de referencia permite discriminar entre HHT1 y HHT2. Más preferiblemente, Ia cantidad detectada de sEng en individuos HHT1 es menor que en individuos HHT2 y Ia cantidad detectada de de Ang-2 en individuos HHT2 es menor que en individuos HHT1. Aún más preferiblemente, las cantidades de referencia de sEng y Ang-2 vienen determinadas por las combinaciones lineales obtenidas en un análisis discriminante de Fisher.
Otro aspecto de Ia presente invención es un kit o dispositivo adaptado para llevar a cabo el método de detección de HHT que comprende los elementos necesarios para:
a. analizar el producto de Ia expresión de los genes ENG y FLT1 y/o
ENG y ANGPT2 en Ia muestra obtenida; y b. comparar las cantidades detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
Dicho kit puede comprender cebadores, sondas y todos aquellos reactivos necesarios para analizar Ia variación en el nivel de expresión de los genes ENG y FLT1 y/o ENG y ANGPT2 por medio de cualquiera de los métodos descritos en anteriormente en este documento. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir Ia contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el Kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de detección de HHT.
Una realización preferida de Ia presente invención consiste en un dispositivo diagnóstico de Ia invención para Ia detección de los niveles de expresión de ARNm mediante una técnica, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, perteneciente al siguiente grupo: análisis Northern blot, reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), reacción en cadena de Ia polimerasa en tiempo real (RT-PCR), reacción en cadena de Ia ligasa en tiempo real (RT- LCR), hibridación o microarrays.
Otra realización preferida de Ia invención Io constituye un dispositivo diagnóstico de Ia invención para Ia detección de los niveles de expresión de ARNm que consiste, a título ilustrativo y sin que limite Ia invención, en un microarray de ADN, un gene-chip de ADN o un chip microelectrónico de ADN, que comprenda sondas génicas.
Otra realización preferida de Ia invención Io constituye un dispositivo diagnóstico de Ia invención para Ia detección de los niveles de expresión de proteína mediante una técnica, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, perteneciente al siguiente grupo: ELISA, Western blot y un dispositivo tipo biochip o microarray de proteínas que incluyan anticuerpos específicos.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra los niveles de Ang-2 en plasma de individuos de referencia, pacientes diagnosticados como HHT 1 y pacientes diagnosticados como HHT2. Figura 2. Muestra los niveles de sEng en plasma de individuos de referencia, pacientes diagnosticados como HHT 1 y pacientes diagnosticados como HHT 2. Los círculos indican individuos fuera de rango.
Figura 3. Muestra los niveles de sFIti en plasma de individuos de referencia, pacientes diagnosticados como HHT 1 y pacientes diagnosticados como HHT 2. El asterisco indica un individuo extremo.
Figura 4. Muestra el gráfico de dispersión del análisis discriminante usando Ia combinación de niveles en plasma de Ang-2 y sEng.
Figura 5. Muestra el gráfico plot de distribución de los niveles de sFIti en plasma de Ia población de referencia y Ia población HHT. La línea horizontal representa el umbral que diferencia ambos grupos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPL0 1
Se evaluaron los niveles de Angiopoietina 2 (Ang-2) y sEng en un total de 20 pacientes de HHT. Nueve de ellos eran HHT tipo 1 y los otros 11 , HHT2. Para establecer los rangos normales en población no HHT, se analizaron también los niveles en plasma de sEng y Ang-2 en 14 voluntarios sanos. También se analizaron los niveles en plasma de sFIti en 8 pacientes de HHT (sin distinguir entre HHT1 y HHT2) y en 8 voluntarios sanos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes en el estudio. El protocolo de análisis se aprobó por el comité de ética de nuestro instituto. Todos los pacientes que se incluyeron en el estudio estaban clínicamente diagnosticados de acuerdo a los criterios de Curagao y Ia mutación genética se identificó por secuenciación. Los fumadores fueron excluidos del estudio.
EJEMPLO 2
La descripción genética de todos los pacientes HHT que han participado en el análisis de sus niveles en plasma de Ang-2 y sEng soluble, se muestra en Ia tabla 1.
Tabla 1. Descripción genética de los pacientes de HHT cuyo plasma fue analizado para sEng y Angiopoietina 2
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La descripción genética de los pacientes de HHT que participaron en el análisis de niveles plasmáticos de sFlt-1 se muestra en Ia tabla 2.
Tabla 2. Descripción genética de los pacientes que fueron analizados para Ia determinación en plasma de niveles de sFIti
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EJEMPLO 3
Las muestras de sangre venosa se recogieron en presencia de EDTA como anticoagulante y se sometieron a centrifugación a 15000 g durante 15 minutos antes de ser almacenados los sobrenadantes a -8O0C, hasta su análisis. Las muestras se procesaron antes de que pasara 24 horas desde el momento de Ia extracción.
Los niveles de estos tres componentes solubles en plasma se midieron usando Ia técnica cuantitativa Standard de ELISA, mediante kits comerciales Quantikine (R&D System, Minneapolis, MN, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La sensibilidad del ensayo para Ang-2 está comprendida entre 1.20 y 21.3 pg/mL con un coeficiente de variación intraensayo de 5.9% e interensayo de 9.0%. La sensibilidad para el ELISA de sEng está comprendida entre 0.001 y 0.030 ng/mL con coeficientes de variación intra e interensayo de 3.0% y 6.5% respectivamente. La sensibilidad para el ELISA de sFIti está comprendida entre 1.5 y 13.3 pg/mL, con coeficientes de variación intra e interensayo de 2.6% y 9.8% respectivamente. Se comprobó que los niveles de Ang-2 y de sEng seguían una distribución homogénea mediante test de Levene. Los datos distribuidos normalmente se expresan como media + desviación estándar y se comparan Mediante test ANOVA. El test de Bonferroni se ha usado como análisis posthoc para establecer las diferencias pareadas.
El análisis discriminante se realizó para Ang-2, sEng para determinar qué variables discriminan entre dos o más grupos para Ia HHT. La idea básica es saber si los grupos difieren entre sí, con respecto a Ia media de una serie de variables y luego encontrar un modelo que prediga Ia pertenencia a esos grupos.
EJEMPLO 4
Los niveles en plasma de Ang-2 en los pacientes con HHT están disminuidos con respecto a los plasmas control. Los controles sanos (n=14) tienen una media de 3488.43 pg/ml, los pacientes de HHT1 (n=9) tienen una media de 2782.28 ng/ml y los pacientes HHT2 (n=11 ) tienen una media de 1817.23 ng/ml. Los niveles de Ang-2 están disminuidos en ambos tipos de HHT, pero las diferencias son significativas cuando consideramos los individuos control y los pacientes HHT2 (Fig 1. tablas 3 y 4).
En Ia figura 1 se muestra un gráfico de caja (Box-Whiskers). La línea horizontal en el centro de Ia caja representa el percentil 50°, los extremos los percentiles 25° y el 75°.
Tabla 3. Test de ANOVA para los niveles de Ang-2 en plasma para los distintos grupos considerados. El efecto de grupo es significativo.
Figure imgf000016_0001
Tabla 4. Test de Bonferroni para Ang-2. El asterisco (*) marca una diferencia significativa a nivel de p<0.05.
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EJEMPLO 5
Los niveles en plasma de sEng en los pacientes con HHT están disminuidos con respecto a los plasmas control. Los controles sanos (n=14) tienen una media de 4.46 ng/ml, los pacientes de HHT1 (n=9) tienen una media de 1.81 ng/ml y los pacientes HHT2 (n=11 ) tienen una media de 2.94 ng/ml. Los niveles de sEng están disminuidos en ambos tipos de HHT, presentándose diferencias estadísticamente significativas entre todos los grupos; control, HHT1 y HHT2. (Fig. 2, tablas 5 y 6).
Tabla 5. ANOVA para los niveles de sEng, indicando una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos
Figure imgf000017_0002
Tabla 6. Test de Bonferroni para sEng. El asterisco (*) significa que hay diferencias significativas al nivel de 0.05
Figure imgf000018_0001
En Ia figura 2 se muestra un gráfico de caja (Box-Whiskers). La línea horizontal en el centro de Ia caja representa el percentil 50°, los extremos los percentiles 25° y el 75°, respectivamente y los círculos cerrados indican a los individuos fuera de rango.
EJEMPLO 6
Los niveles de sFIti en el plasma de los pacientes con HHT están disminuidos significativamente con respecto a los controles. Los plasmas controles (n=7) tienen una media de 88.31 pg/ml. Los pacientes de HHT (n=8) tienen una media de 51.02 pg/ml. (Figura 3, Tabla 7)
Tabla 7. Datos comparados por un test T de Student de los niveles de sFIti entre los controles sanos y los pacientes de HHT.
Figure imgf000018_0002
EJEMPLO 7
La función discriminante lineal de Fisher se ha usado para realizar un análisis usando Ia combinación de dos componentes, sEng y Ang-2. Este análisis estadístico proporciona una función que se puede utilizar para distinguir entre afectados y no afectados por HHT (tabla 8). El componente principal que decide entre sano o HHT es sEng. Las funciones que describen este proceso son:
Referencia — 8,4 x sEng ng/ml + 0,001 x Ang-2 pg/ml - 21,7 HHT = 4,5 x sEng ng/ml + 0,001 x Ang-2 pg/ml - 7,2
Tabla 8. Análisis discriminante utilizando Ia función lineal significante de Fisher.
Figure imgf000019_0001
El valor más alto de estas funciones determina el grupo al que pertenece un individuo en particular.
Como se ve en Ia Tabla 9, el 94.1 % de los grupos originales están correctamente clasificados según Ia función discriminante.
Cuando introducimos Ia concentración de Ang-2, podemos distinguir entre los dos tipos principales de HHT. Los niveles plasmáticos de Ang-2 en individuos HHT2 están más disminuidos que los de HHT1 con respecto a los niveles de Ia población de referencia (tabla 10).
Referencia — 14.3 x sEng (ng/ml -0.001 x Ang-2 pg/ml - 32.1 HHTl = 4.9 x sEng (ng/ml) + 0.001 Ang-2(pg/ml) - 6.5 HHT2 = 9.7 x sEng (ng/ml) - 0.001 x Ang-2(pg/ml) - 14.8 Tabla 9. Resultado de Ia clasificación del análisis discriminante de Fisher. Hay dos individuos mal clasificados en un total de 34 muestras. Por tanto un 94.1 % de los casos originales están bien clasificados
Figure imgf000020_0001
Tabla 10. Coeficientes de clasificación de Ia función discriminante lineal de
Fisher.
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Como vemos en Ia tabla 11 , el 82.4% de los casos agrupados molecularmente como sujeto de referencia, HHT1 o HHT2, están correctamente clasificados. La dispersión de los datos se muestra en un gráfico de dispersión bivariante, con marcas para los tres grupos (Fig. 4).
Tabla 11. Resultados de Ia clasificación del análisis discriminante de Fisher. Hay 3 individuos mal clasificados en una muestra total de 34 individuos. El
82.4% de los individuos se encuentra bien agrupado.
Figure imgf000020_0003
Cuando hacemos el análisis discrimínate para sFIti se obtiene un punto de corte, equivalente en valor experimental a 59.2 pg/ml, siendo el valor teórico obtenido a partir de los valores del discriminante de 60.05 pg/ml. Los individuos con niveles de sFIti en plasma por encima del punto de corte serán sanos y los individuos con niveles más bajos serían pacientes de HHT, con una probabilidad mayor del 95% (Fig.5).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
-Abdalla SA, Letarte M (2006). Hereditary haemorrhagic telangiectasia: current views on genetics and mechanisms of disease. J Med Genet 43:97-110. -Bayrak-Toydemir P, McDonald J, Akarsu N, Toydemir RM, Calderón F, Tuncali T, Tang W, Miller F, Mao R. (2006) A fourth locus for hereditary hemorrhagic telangiectasia maps to chromosome 7. Am. J. Med. Genet. A. 140: 2155-2162. -J Berg, M Porteous, D Reinhardt, C Gallione, S Holloway, T Umasunthar, A Lux, W McKinnon, D Marchuk, A Guttmacher (2003). Hereditary haemorrhagic telangiectasia: a questionnaire based study to delinéate the different phenotypes caused by endoglin and ALK1 mutations. Journal of Medical Genetics; 40:585-590. -Bourdeau A, Dumont DJ, Letarte M. (1999) A murine model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. J. Clin. Invest. 104: 1343-51. -CoIe, SG, Begbie, ME, Wallace, GM et al. (2005). A new locus for hereditary haemorrhagic telangiectasia (HHT3) maps to chromosome 5. J Med Genet, 42: 577-582. -Duff, S. E., Li, C, Garland, J. M., Kumar, S. (2003) CD105 is important for angiogenesis: evidence and potential applications. FASEB J. 17: 984-992. -Fernandez-L A, Garrido-Martin EM, Sanz-Rodriguez F, Pericacho M, Rodriguez-Barbero A, Eleno N, Lopez-Novoa JM, Düwell A, Vega MA, Bernabeu C, Botella LM. (2007) Gene expression fingerprinting for human hereditary hemorrhagic telangiectasia. Hum Mol Genet. 1 ; 16: 1515-33. -Fonsatti E, Altomonte M, Nicotra MR, Natali PG, Maio M. (2003). Endoglin (CD105): a powerful therapeutic target on tumor-associated angiogenetic blood vessels. Oncogene. 22: 6557-6563.
-Goumans MJ, Lebrin F, Valdimarsdottir G. (2003). Controlling the angiogenic switch: a balance between two distinct TGF-b receptor signaling pathways. Trends Cardiovasc. Med. 13: 301-307.
-Guttmacher, AE; Marchuk, DA and White Rl (1995) Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. New Eng. J. Med. 333: 918-924. -Jerkic M, Rivas-Elena JV, Prieto M, Carrón R, Sanz-Rodriguez F, Perez- Barriocanal F, Rodríguez-Barbero A, Bernabeu C, Lopez-Novoa JM. 2004. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. FASEB J. 18: 609- 611.
-Hirokoshi K, Maeshima Y, Kobayashi K, Matsuura E, Sugiyama H, Yamasaki Y, Masuyama H, Hiramatsu Y, Makino H. (2007) Nephron Clin Pract.; 106: c43- 50. Elevated serum sFlt-1/Ang-2 ratio in women with preeclampsia.
-Jerkic M, Rodriguez-Barbero A, Prieto M, Toporsian M, Pericacho M, Rivas- Elena JV, Obreo J, Wang A, Perez-Barriocanal F, Arevalo M, Bernabeu C, Letarte M, Lopez-Novoa JM. 2006a. Reduced angiogenic responses in adult Endoglin heterozygous mice. Cardiovasc. Res. 69:845-854. -Jerkic M, Rivas-Elena JV, Santibanez JF, Prieto M, Rodriguez-Barbero A, Perez-Barriocanal F, Pericacho M, Arevalo M, Vary CP, Letarte M, Bernabeu C, Lopez-Novoa JM. 2006b. Endoglin regulates cyclooxygenase-2 expression and activity. Circ Res. 99: 248-256. -Johnson, DW, Berg, JN; Baldwin, MA, et al. (1996) Mutations in the activin receptor-like kinase I gene in hereditary haemorrhagic telangiectasia type 2. Nat. Genet. 13: 189-195.
-Kjeldsen, AD, Vase, P and Green, A (1999). Hereditary haemorrhagic telangiectasia: a population-based study of prevalence and mortality in Danish patients. J Intern Med, 245: 31-39. -Levine RJ, Lam C, Qian C et al. (2006). Soluble endoglin and other circulating antiangiogenic factors in preeclampsia. N Engl J Med. 355: 992-1005. Erratum in: N Engl J Med. 355:1840. -Letteboer TG, Mager JJ, Snijder RJ, Koeleman BP, Lindhout D, Pióos van
Amstel JK, Westermann CJ. (2006). Genotype-phenotype relationship in hereditary haemorrhagic telangiectasia. J Med Genet. 43: 371-7.
-Li DY, Sorensen LK, Brooke BS, Urness LD, Davis EC, Taylor DG, Boak BB, Wendel DP. (1999) Detective angiogenesis in mice lacking endoglin. Science.
284: 1534-1537.
-Lim JH, Kim SY, Park SY, Yang JH, Kim MY, Ryu HM (2008). Effective
Prediction of Preeclampsia by a Combined Ratio of Angiogenesis-Related
Factors.Obstetrics & Gynecology; 111 : 1403-1409 -Lopez-Novoa JM (2007). Soluble endoglin is an accurate predictor and a pathogenic molecule in pre-eclampsia. Nephrol Dial. Transplant. 22: 712-4.
-Luft FC (2006). Soluble endoglin (sEng) joins the soluble fms-like tyrosine kinase (sFlt) receptor as a pre-eclampsia molecule. Nephrol Dial Transplant. 21 :
3052-4. -Massagué J (1990). The transforming growth factor beta family. Annu. Rev.
CelI Biol. 6: 597-641.
-McAllister KA, Grogg KM, Johnson DW et al. (1994) Endoglin a TGFbeta binding protein of endothelial cells is the gene for hereditary haemorrhagic telangiectasia type I. Nature Genet. 8: 345-351 . -Oh SP, Seki T, Goss KA, Imamura T, Yi Y, Donahoe PK, Li L, Miyazono K, ten
Dijke P, Kim S, Li E. (2000) Activin receptor-like kinase 1 modulates transforming growth factor-beta 1 signaling in the regulation of angiogenesis.
Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 97: 2626-31.
-Pepper, MS (1997). Transforming growth factor beta: vasculogenesis, angiogenesis and vessel wall integrity. Cytokine & Growth Factor Rev. 8: 21-43
-Plauchu, H, de Chadarevian J-P, Bideau A and Robert JM (1989). Age related profile of hereditary hemorrhagic telangiectasia in an epidemiologically recruited population. Am J. Med. Genet.32: 291-297.
-Risau, W. (1997) Mechanism of angiogenesis. Nature. 386: 671-674. -Shi Y and Massagué J (2003). Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. CeII. 113: 685-700. -Shim WS, Ho IA, Wong PE. (2007) Angiopoietin: a TIE(d) balance in tumor angiogenesis.Mol Cáncer Res. JuI; 5:655-65.
-Shovlin, CL and Letarte, M (1999) Hereditary haemorrhagic telangiectasia and pulmonary arteriovenous malformations: issues in clinical management and review of pathogenic mechanisms. Thorax 54: 714-729.
-Toporsian M, Gros R, Kabir MG, Vera S, Govindaraju K, Eidelman DH, Husain
M, Letarte M. (2005) A role for endoglin in coupling eNOS activity and regulating vascular tone revealed in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Circ.
Res. 96:684-692. -Venkatesha S, Toporsian M, Lam C et al. (2006). Soluble endoglin contributes to the pathogenesis of preeclampsia. Nat Med. 12: 642-9. Erratum in: Nat Med.
2006 Jul;12(7): 862.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para Ia detección de Telangiectasia Hereditaria Hemorrágica (HHT) que comprende:
a. obtención de una muestra biológica, b. detección de Ia cantidad de producto de Ia expresión de los genes ENG y FLT1 o ENG y ANGPT2 en Ia muestra obtenida en (a) y c. comparación de Ia cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
2. Método según Ia reivindicación 1 donde el producto de expresión de los genes es Ia proteína endoglina, FItI o Ang-2.
3. Método según Ia reivindicación 2 donde las proteínas están en su forma soluble sEng, sFIti o Ang-2.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde Ia detección es de las proteínas sEng y sFth .
5. Método según Ia reivindicación 4 donde una cantidad detectada de sEng y sFth menor que Ia cantidad de referencia es indicativa de Ia condición de enfermo de HHT.
6. Método según Ia reivindicación 5 donde las cantidades de referencia de sEng y sFIti vienen determinadas por un análisis ANOVA y un test T de Student, respectivamente.
7. Método según cualquiera de Ia reivindicaciones 5 o 6 donde Ia cantidad de referencia de sEng es 3,8 ng/ml y Ia de sFIti es 60 pg/ml.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde Ia detección es de las proteínas sEng y Ang-2.
9. Método según Ia reivindicación 8 donde una variación de Ia expresión de sEng y Ang-2 con respecto a una cantidad de referencia permite discriminar entre HHT1 y HHT2.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 donde Ia cantidad detectada de sEng en individuos HHT1 es menor que en individuos HHT2 y Ia cantidad detectada de de Ang-2 en individuos HHT2 es menor que en individuos HHT1.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 donde las cantidades de referencia de sEng y Ang-2 vienen determinadas por las combinaciones lineales obtenidas en un análisis discriminante de Fisher.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 donde Ia detección de las proteínas se lleva a cabo mediante inmunoensayo.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde Ia muestra biológica es un fluido biológico.
14. Método según Ia reivindicación 13 donde el fluido biológico es sangre.
15. Kit adaptado para llevar a cabo el método de detección de HHT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que comprende los elementos necesarios para:
a. analizar el producto de Ia expresión de los genes ENG y FLT1 y/o ENG y ANGPT2 en Ia muestra obtenida; b. comparar las cantidades detectada en el paso (a) con una cantidad de referencia.
16. Kit según Ia reivindicación 15 que además comprende las instrucciones para llevar a cabo el método de detección de HHT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERNANDEZ-LOPEZ ET AL.: "Blood outgrowth indothelial cells from Hereditary Haemorrhagic Telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vacular lesions.", CARDIOVASCULAR RESEARCH, vol. 68, 2005, pages 235 - 248 *
FERNÁNDEZ-LÓPEZ ET AL.: "Gene expression fingerprinting for human hereditary hemorrhagic telangiectasia.", HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 16, no. 13, 2007, pages 1515 - 1533 *
HIRATSUKA S. ET AL.: "Involvement of Flt-1 Tyrosine Kinase (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1) in Pathological Angiogenesis.", CANCER RESEARCH, vol. 61, 2001, pages 1207 - 1213 *
LUFT F.C.: "Soluble indoglin (sEng)joins the soluble fms-like tyrosine kinase (sFIt) receptor as a pre-eclampsia molecule.", TRANSLATIONAL NEPHROLOGY, vol. 21, 2006, pages 3052 - 3054 *

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