WO2010050328A1 - 腫瘍の転移抑制剤 - Google Patents

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WO2010050328A1
WO2010050328A1 PCT/JP2009/066992 JP2009066992W WO2010050328A1 WO 2010050328 A1 WO2010050328 A1 WO 2010050328A1 JP 2009066992 W JP2009066992 W JP 2009066992W WO 2010050328 A1 WO2010050328 A1 WO 2010050328A1
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mir143
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seq
mir145
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孝広 落谷
充彦 尾崎
松木　泰
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国立がんセンター総長が代表する日本国
大日本住友製薬株式会社
国立大学法人鳥取大学
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Definitions

  • the present invention relates to a drug that suppresses tumor metastasis, a medicine using the drug, a method for determining tumor metastasis risk, an agent for determining tumor metastasis risk, and a substance having an action of inhibiting tumor metastasis It is related with the screening method of this.
  • the present invention relates to a nucleic acid that suppresses metastasis of solid cancer, more specifically osteosarcoma.
  • miRNA is an endogenous non-coding RNA of about 20 to 25 bases encoded on the genome. miRNA is first transcribed from the miRNA gene on the genomic DNA as a primary transcript (Primary miRNA, hereinafter referred to as “Pri-miRNA”) with a length of several hundred to several thousand bases, and then processed. Pre-miRNA (precusor miRNA) having a hairpin structure of about 60 to 110 bases. After that, it moves from the nucleus into the cytoplasm and is further processed into a double-stranded mature miRNA of about 20-25 bases.
  • Primary miRNA Primary miRNA
  • Pre-miRNA precusor miRNA having a hairpin structure of about 60 to 110 bases. After that, it moves from the nucleus into the cytoplasm and is further processed into a double-stranded mature miRNA of about 20-25 bases.
  • RISC protein-binding protein
  • More than 1000 types of miRNA are known in humans and mice, and each of them has been suggested to regulate the expression of a plurality of target genes and participate in various life phenomena such as cell proliferation and differentiation.
  • miRNA involved in hematopoietic cell and neuronal cell differentiation for example, see Non-Patent Document 2.
  • miRNAs involved in cancer cell growth have been reported, and miRNA expression patterns can be used for clinical diagnosis of cancer, and miRNA expression can be suppressed to suppress cancer cell growth.
  • Patent Document 3 discloses the expression control pattern of microRNA 143 (hereinafter referred to as miR143) and pathway analysis of genes controlled by miR143, and Non-Patent Document 3 discloses that miR143 is expressed in colon cancer cells. In addition, as a result of experiments in which miR143 was introduced into colon cancer cells, miR143 has been shown to suppress cell growth of colon cancer.
  • Non-Patent Document 4 reports the results of examining the expression patterns of miR21, 31, 143 and 145 in tumor tissues of various stages of colon cancer (Colorectal) patients. It has been disclosed that miRNAs whose expression is increased in tumor tissues of colon cancer (Colorectal) patients are miR21 and 31, and miR143 and 145 have decreased expression.
  • tumor cells released from the primary lesion invade the vascular system, and when they reach a distant organ, they take a process of engrafting and starting to proliferate. Even with complete removal, cancerous cells can often metastasize patients to death.
  • metastasis to the lung causes direct or indirect death of the patient, that is, suppressing lung metastasis has been a major challenge in the treatment of osteosarcoma.
  • miRNAs involved in metastasis of tumors, particularly osteosarcoma have been no reports on miRNAs involved in metastasis of tumors, particularly osteosarcoma.
  • an object of the present invention is to provide a drug for controlling (suppressing) tumor, particularly osteosarcoma metastasis, a method for determining the risk of tumor metastasis, and a method for searching for a substance that can inhibit tumor metastasis. is there.
  • the present inventors obtained new knowledge about miRNA involved in osteosarcoma metastasis, and studied the tumor metastasis inhibitory effect of miR143 and miR145 using the knowledge. As a result, these miRNAs, particularly miR143 were excellent.
  • the present invention was completed by finding that it has an effect of suppressing tumor metastasis.
  • a tumor metastasis inhibitor comprising a nucleic acid comprising miR143 or a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to miR143.
  • a tumor metastasis inhibitor according to [1] wherein the nucleic acid is single-stranded or double-stranded.
  • miR143 is a nucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • nucleic acid is RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, or a modified product thereof.
  • nucleic acid is RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a modified product thereof.
  • nucleic acid containing miR143 is at least one nucleic acid selected from the group consisting of miR143 and a precursor thereof.
  • precursor is pri-miRNA or pre-miRNA of miR143.
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR143 or SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143, and represented by miR145 or SEQ ID NO: 3
  • a tumor metastasis inhibitor comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with a nucleotide sequence and a nucleic acid comprising a nucleotide having a function equivalent to miR145.
  • nucleic acid comprising miR143 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 having a nucleotide sequence having 70% or more identity and having a function equivalent to miR143, or (b) a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR143 or SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143, and represented by miR145 or SEQ ID NO: 3
  • An agent for preventing a disease caused by tumor metastasis comprising a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% identity or more and having a function equivalent to miR145.
  • (A) (a) a nucleic acid comprising miR143 or a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% or more identity with SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to miR143, or (b) a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR143 or SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143, and represented by miR145 or SEQ ID NO: 3
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% or more identity to the nucleotide sequence and having a function equivalent to miR145;
  • B A therapeutic agent for tumors that is used in combination with an antitumor agent.
  • An agent for determining the risk of tumor metastasis comprising a nucleic acid probe capable of specifically detecting miR143 or miR143 and miR145.
  • a method for searching for a substance that can inhibit tumor metastasis or tumor cell invasion ability comprising the following steps: (I) contacting a test substance with a cell capable of measuring the expression of miR143 or miR143 and miR145; (II) measuring the expression level of miR143 or miR143 and miR145 in a cell contacted with a test substance, and comparing the expression level with the expression level of miR143 or miR143 and miR145 in a control cell not contacted with the test substance; And (III) a test substance that increases the expression level of miR143 or miR143 and miR145 is selected as a substance that can inhibit tumor metastasis or tumor cell invasion ability based on the comparison result of (II) above. .
  • nucleic acid comprising a nucleotide sequence comprising miR143 or a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to miR143 is administered to a mammal A method for suppressing tumor metastasis in the mammal.
  • a nucleic acid comprising an effective amount of miR143 or a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143 for mammals, and Metastasis of a tumor in the mammal comprising administering a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR145 or SEQ ID NO: 3 and having a function equivalent to miR145 How to suppress.
  • Effective amount for mammals (a) a nucleic acid comprising miR143 or a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising a nucleotide having a function equivalent to miR143, or (b) a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR143 or SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143, and represented by miR145 or SEQ ID NO: 3
  • a method for preventing a disease caused by tumor metastasis in a mammal comprising administering a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% or more identity with a nucleotide sequence and having a function equivalent to miR145.
  • [20] It consists of a nucleotide sequence having 70% or more identity with the effective amount of (A) (a) miR143 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has a function equivalent to that of miR143.
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% or more identity with a nucleotide sequence and having a function equivalent to miR145 and (B) a method for treating a tumor in said mammal, comprising administering an antitumor agent .
  • a nucleic acid comprising miR143 or a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% or more identity with SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to miR143 for use in suppressing tumor metastasis.
  • nucleic acid comprising a nucleotide sequence comprising miR143 or a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to miR143, for use in suppressing tumor metastasis; And a combination comprising a nucleic acid comprising miR145 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 having a nucleotide sequence having 70% or more identity and having a function equivalent to miR145.
  • nucleic acid for use in the prevention of diseases caused by tumor metastasis, (a) a nucleic acid comprising miR143 or a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising a nucleotide having a function equivalent to miR143, or (b) a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR143 or SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143, and represented by miR145 or SEQ ID NO: 3
  • a combination comprising a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% or more identity to the nucleotide sequence and having a function equivalent to miR145.
  • [24] for use in treating a tumor (A) (a) a nucleic acid comprising miR143 or a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising a nucleotide having a function equivalent to miR143, or (b) a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR143 or SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143, and represented by miR145 or SEQ ID NO: 3
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% or more identity to the nucleotide sequence and having a function equivalent to miR145 and (B) a combination comprising an antitumor agent.
  • a tumor metastasis inhibitor a method for determining tumor metastasis risk, an agent for determining tumor metastasis risk, and tumor metastasis inhibition, which show an inhibitory effect on tumor, particularly osteosarcoma metastasis
  • action which can be provided can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of miRNA microarray analysis in Reference Example 1.
  • FIG. 1 is originally a color photograph.
  • FIG. 2 is a scheme of a method for assaying the function of invasive capacity and proliferation of cells by introducing miRNA into 143B cells.
  • FIG. 3 shows the results of a 143B cell infiltration test in which miRNA was introduced.
  • FIG. 4 shows the results of a 143B cell proliferation test in which miRNA was introduced.
  • FIG. 5 shows the results of creating a mouse osteosarcoma metastasis model.
  • FIG. 5 is originally a color photograph.
  • FIG. 6 shows the administration protocol of miR143 to the mouse osteosarcoma metastasis model.
  • FIG. 7 shows lung metastases 4 weeks after administration of miR143 to a mouse osteosarcoma metastasis model.
  • FIG. 7 is originally a color photograph.
  • miR143 has a function of suppressing tumor invasion and metastasis (see Examples, described later), tumor (preferably solid cancer, more preferably osteosarcoma) It was found that it can be used as an active ingredient of a metastasis inhibitor.
  • the present invention An agent comprising a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR143 or SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143, and A nucleic acid comprising a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by miR143 or SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to that of miR143, and a nucleotide sequence represented by miR145 or SEQ ID NO: 3 And a nucleic acid comprising a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having 70% or more identity and having a function equivalent to that of miR145.
  • the agent of the present invention is useful as a tumor metastasis inhibitor or an agent for treating or preventing a disease caused by tumor metastasis.
  • the nucleic acid of the present invention is RNA, RNA-DNA chimeric nucleic acid (hereinafter referred to as chimeric nucleic acid) or hybrid nucleic acid.
  • the chimera nucleic acid means a single-stranded or double-stranded nucleic acid containing RNA and DNA in a single nucleic acid
  • a hybrid nucleic acid is a double-stranded nucleic acid in which one strand is RNA or It refers to a nucleic acid in which the other strand is DNA or a chimeric nucleic acid.
  • the nucleic acid of the present invention is single-stranded or double-stranded.
  • Double-stranded embodiments include double-stranded RNA, double-stranded chimeric nucleic acid, RNA / DNA hybrid, RNA / chimeric nucleic acid hybrid, chimeric nucleic acid / chimeric nucleic acid hybrid, and chimeric nucleic acid / DNA hybrid.
  • the nucleic acid of the present invention is preferably single-stranded RNA, single-stranded chimeric nucleic acid, double-stranded RNA, double-stranded chimeric nucleic acid, RNA / DNA hybrid, RNA / chimeric nucleic acid hybrid, chimeric nucleic acid / chimeric nucleic acid hybrid, or chimeric nucleic acid / DNA hybrid, more preferably single-stranded RNA, single-stranded chimeric nucleic acid, double-stranded RNA, double-stranded chimeric nucleic acid, RNA / DNA hybrid, chimeric nucleic acid / chimeric nucleic acid hybrid or RNA / chimeric nucleic acid hybrid .
  • the length of the nucleic acid of the present invention is not limited as long as it has an activity to inhibit the invasive ability of mammalian (preferably human) tumor cells.
  • the length of the nucleic acid of the present invention is, for example, about 200 bases or less, preferably about 130 bases or less, more preferably about 50 bases or less, and most preferably 30 bases or less. As a minimum, it is 15 bases or more, for example, Preferably, it is 17 bases or more.
  • the length of a nucleic acid in the case where a nucleic acid forms a double-stranded structure by taking a hairpin loop type structure is considered as a single-stranded length.
  • MiR143 is a molecule already known and typically refers to what is called mature miRNA.
  • miR143 includes isomers of miR143. Specifically, for example, it means a nucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC) (MIMAT0000435).
  • the mature miR143 means single-stranded or double-stranded RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • nucleic acid of the present invention When incorporated into a tumor cell, the nucleic acid of the present invention has an activity of inhibiting the invasive ability of the cell.
  • “nucleotide having a function equivalent to miR143” means a substance that forms a hybrid with miR143 target mRNA under biological conditions (for example, 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) at 25 ° C.). . More specifically, when miR143 target mRNA is hybridized under biological conditions (for example, 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) at 25 ° C.) and taken into tumor cells, the cells infiltrate. It means a nucleotide having an activity of inhibiting the ability.
  • Tumor cells are usually mammalian (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, horse, pig, cow, monkey, human, preferably human) cells.
  • Tumor types include osteosarcoma, esophageal cancer, lung cancer, liver cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, ureteral tumor, brain tumor, gallbladder cancer, bile duct cancer, biliary tract cancer, renal cancer, breast cancer , Bladder cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, thyroid cancer, testicular tumor, Kaposi sarcoma, maxillary cancer, tongue cancer, lip cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, myoma, skin cancer, etc. And myeloma and leukemia.
  • the type of tumor is preferably solid cancer, more preferably osteosarcoma.
  • a nucleic acid has an activity of inhibiting the invasive ability of tumor cells can be confirmed by, for example, the following assay. That is, after culturing 143B cells, which are human osteosarcoma cell lines having metastatic potential, in 1 ⁇ 10 6 cells / 6 cm dish overnight, 30 nM of nucleic acid is introduced by DharmaFECT transfection (GE Healthcare Biosciences). The cells after 48 hours are subjected to cell invasion assay using CytoSelect TM 96-Well Cell Invasion Assay kit (Cell Biolab), and the number of infiltrated cells after 20 hours is counted.
  • 143B cells which are human osteosarcoma cell lines having metastatic potential
  • nucleotide sequence of “nucleotide having a function equivalent to miR143” used in the present invention is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and further preferably, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. It has 95% or more identity.
  • Identity refers to an optimal alignment when two nucleotide sequences are aligned using mathematical algorithms known in the art (preferably the algorithm uses one or the other of the sequences for optimal alignment). The percentage of identical nucleotide residues to all overlapping nucleotide residues) (which can be considered the introduction of gaps to both).
  • NCBI BLAST-2 National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted, inserted or added
  • a sequence for example, (1) a nucleotide sequence in which 1 to 6 (preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2) nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, (2) A nucleotide sequence obtained by adding 1 to 6 (preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2) nucleotides to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (3) a nucleotide represented by SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence in which 1 to 6 (preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2) nucleotides are inserted into the sequence (4) a nucleotide represented by SEQ ID NO: 1 A nucleotide sequence in which 1 to 6 (preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2) nucleotides in the tide sequence are replaced with other nucleotides, or (5) the above (1) to (4) A nucleotide sequence in which mutations are combined (in this case, the total number of nucleotides mutated is 1 to 6 (preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2)).
  • the nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferably 15 bases or more (preferably 17 bases or more, more preferably) contained in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid includes “miR143” or “nucleotide having a function equivalent to miR143”.
  • nucleic acids of the present invention may be modified to be resistant to various degrading enzymes.
  • the modified form of the present invention includes various modifications, including sequence modifications, within the range of nucleotides having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a function equivalent to miR143. Modified products are included.
  • modifications in the modified form include, for example, those in which the sugar chain part is modified (for example, 2′-O methylation), those in which the base part is modified, phosphate group or hydroxyl part is modified (For example, biotin, amino group, lower alkylamine group, acetyl group and the like), but not limited thereto.
  • the nucleic acid itself may be modified. Further, for example, it may be a synthetic nucleic acid comprising the same region as miR143 and a complementary region that is complementary to the sequence by 60% to less than 100%. It may be a synthetic RNA molecule as described in WO2006 / 627171.
  • the nucleic acid of the present invention may have an additional base at the 5 'or 3' end.
  • the length of the additional base is usually 5 bases or less.
  • the additional base may be DNA or RNA, but the use of DNA may improve the stability of the nucleic acid. Examples of such additional base sequences include ug-3 ', uu-3', tg-3 ', tt-3', ggg-3 ', guuu-3', gttt-3 ', ttttt-3 Examples include, but are not limited to, ', uuuuuu-3'.
  • nucleic acid of the present invention include nucleic acids such as mature miR143 and its precursor.
  • Another preferred embodiment of the nucleic acid of the present invention is to use a nucleic acid comprising a nucleotide having an activity similar to that of mature miRNA, such as miR143 mimic synthesized so as to mimic endogenous mature miR143. Can do.
  • Commercially available products can also be used.
  • Pre-miR TM miRNA precursor molecule manufactured by Ambion (by merger, Life Technologies, as of September 2009) can be exemplified.
  • the precursor of miR143 means a nucleic acid capable of producing mature miR143 in a cell as a result of intracellular processing or cleavage of a double-stranded nucleic acid.
  • Examples of the precursor include miR143 pri-miRNA and pre-miRNA.
  • the pri-miRNA is a primary transcript (single-stranded RNA) of the miRNA gene, and usually has a length of about several hundred to several thousand bases.
  • Pre-miRNA is a single-stranded RNA having a hairpin structure generated by pri-miRNA undergoing intracellular processing, and usually has a length of 90 to 110 bases.
  • pri-miRNA and pre-miRNA of miR143 are known molecules, and are disclosed in, for example, the miRBase database (http://microrna.sanger.ac.uk/) created by Sanger Laboratories. Has been.
  • a suitable pre-miRNA of miR143 a single-stranded RNA consisting of the nucleotide sequence represented by the following SEQ ID NO: 2 can be mentioned: GCGCAGCGCCCUGUCUCCCAGCCUGAGGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGUCAGUUGGGAGUCUGAGAUGAAGCACUGUAGCUCAGGAAGAGAGAAGUUGUUCUGCAGC (hsa-miR143 MI0000459)
  • a single-stranded nucleic acid in which a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (first sequence) and its complementary sequence (second sequence) are linked via a hairpin loop part A nucleic acid in which the first sequence has a shape of a double-stranded structure with the second sequence by taking a hairpin loop type structure is also a preferred embodiment of the nucleic acid of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention is obtained by isolating from a mammalian cell (human cell or the like) using a known method, or by chemically synthesizing, or by using a gene recombination technique. be able to. It is also possible to use commercially available nucleic acids as appropriate. miR143 mimic is available, for example, from Ambion (LifeologiesTechnologies as of September 2009).
  • the agent of the present invention can contain any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to an effective amount of the nucleic acid of the present invention, and is applied as a pharmaceutical in the form of a pharmaceutical composition.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, lubricants such as magnesium stearate and aerosil, citric acid, Fragrances such as menthol, preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspensions such as methylcellulose and polyvinylpyrrolidone, dispersants such as surfactants, water, physiological Although diluents, such as salt solution, base wax, etc. are mentioned, it is not limited to them.
  • excipients such as sucrose and starch
  • binders such as cellulose and methylcellulose
  • disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose
  • lubricants such as magnesium stearate and aerosil
  • citric acid Fragrances such as menthol
  • preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite
  • stabilizers
  • the agent of the present invention can further contain a reagent for nucleic acid introduction.
  • the nucleic acid introduction reagent include atelocollagen; liposome; nanoparticle; lipofectin, lipofectamine, DOGS (transfectum), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, polybrene, or poly (ethyleneimine) (PEI) Cationic lipids such as can be used.
  • the nucleic acid of the present invention can be efficiently delivered to the target tumor cells and efficiently incorporated into the cells.
  • the agent of the present invention can be administered to mammals orally or parenterally, but it is desirable that the agent of the present invention be administered parenterally, usually parenterally. Administered.
  • Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Further, a buffer solution, an antibacterial agent, an isotonic agent and the like may be contained. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • the preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials.
  • the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
  • the content of the nucleic acid of the present invention in the pharmaceutical composition is, for example, about 0.1 to 100% by weight of the whole pharmaceutical composition.
  • the dosage of the agent of the present invention varies depending on the purpose of administration, administration method, tumor type, size, and the situation of the subject of administration (sex, age, body weight, etc.).
  • the amount of the nucleic acid of the present invention is preferably 1 pmol / kg or more and 10 nmol / kg or less, and 2 nmol / kg or more and 50 nmol / kg or less for systemic administration. It is desirable to administer such dose 1 to 10 times, more preferably 5 to 10 times.
  • the agent of the present invention is a mammal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, horse, pig, cow, so that the nucleic acid of the present invention, which is an active ingredient thereof, is delivered to tumor tissue (tumor cells). It is safely administered to monkeys and humans.
  • the agent of the present invention is administered to a tumor patient, a patient after treatment of a tumor having a risk of tumor metastasis, or the like. Tumor metastasis can be suppressed, and diseases caused by tumor metastasis can be treated or prevented. Therefore, the agent of the present invention is useful as a tumor metastasis inhibitor or an agent for preventing a disease caused by tumor metastasis.
  • tumor suppression means that tumor cells reach a different site from the primary lesion and suppress the secondary generation of a tumor at the site.
  • tumors to which the agent of the present invention can be applied include osteosarcoma, esophageal cancer, lung cancer, liver cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, ureteral tumor, brain tumor, gallbladder cancer, bile duct cancer, Biliary tract cancer, renal cancer, breast cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, thyroid cancer, testicular tumor, Kaposi sarcoma, maxillary cancer, tongue cancer, lip cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, muscle tumor
  • solid cancers such as skin cancer and retinoblastoma, myeloma, leukemia, malignant lymphoma, myeloma, malignant melanoma, hemangioma, polycythemia vera, neuroblastoma and the like.
  • blood cell malignancies including breast cancer, lung cancer, renal cancer, multiple myeloma, thyroid cancer, prostate cancer, adenocarcinoma, leukemia and lymphoma; head and neck cancer; gastric cancer, colon cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, liver cancer
  • malignant tumors of the female reproductive tract including ovarian cancer, endometrial cancer, and cervical cancer
  • bladder cancer brain tumors including neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; and malignant melanoma or squamous epithelium
  • metastatic cancer such as skin cancer including cancer.
  • the agent of the present invention is preferably applicable to the above solid cancer, more preferably osteosarcoma.
  • diseases caused by tumor metastasis include metastatic cancer, respiratory failure due to tumor growth and cancerous pleurisy.
  • miR143 or a nucleotide sequence having 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has the same function as miR143.
  • a nucleic acid containing nucleotides hereinafter referred to as the first nucleic acid
  • An agent comprising a combination of a nucleic acid containing hereinafter referred to as a second nucleic acid is provided.
  • the first nucleic acid is as described in the above section (1. Agent of the present invention), and the second nucleic acid is described in the section of (1. Agent of the present invention) except that miR143 is replaced with miR145. It is the same as the contents.
  • MiR145 is a nucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU) (MIMAT0000437), and a suitable precursor (pre-miRNA) of miR145 is represented by SEQ ID NO: 4 below.
  • a single-stranded RNA consisting of the following nucleotide sequence: CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU (hsa-miR145 MI0000461)
  • the administration timing of the first nucleic acid and the second nucleic acid is not limited, and the first nucleic acid and the second nucleic acid are simultaneously administered to the administration subject. It may be administered or may be administered after a time difference.
  • the dosage of the first nucleic acid and the second nucleic acid is not particularly limited as long as the prevention / treatment of the applicable disease can be achieved, and administration is performed within the dosage range described in the above section (1. Agent of the present invention). Although it is possible to enhance the tumor metastasis inhibitory activity by the combined use, the first nucleic acid or the second nucleic acid can be used in an amount smaller than the dose described in the above section (1. Agent of the present invention). It is expected to exert the same effect as when administered alone.
  • the administration form of the first nucleic acid and the second nucleic acid is not particularly limited as long as the first nucleic acid and the second nucleic acid are combined at the time of administration.
  • Examples of such administration forms include (1) administration of a single preparation obtained by simultaneously formulating the first nucleic acid and the second nucleic acid, and (2) the first nucleic acid and the second nucleic acid.
  • An agent comprising a combination of the first nucleic acid and the second nucleic acid can be formulated by a conventional method according to the description in the above section (1. Agent of the present invention).
  • the preparation containing the first nucleic acid and the preparation containing the second nucleic acid may be administered at the same time.
  • the formulation containing the second nucleic acid may be administered first, followed by the formulation containing the first nucleic acid, or the formulation containing the first nucleic acid first, A formulation containing the second nucleic acid may be administered.
  • the time difference varies depending on the active ingredient to be administered, dosage form, and administration method.
  • the preparation containing the second nucleic acid examples include a method of administering a preparation containing the first nucleic acid within 1 minute to 3 days after administration, preferably within 10 minutes to 1 day, more preferably within 15 minutes to 1 hour.
  • a method of administering a preparation containing the first nucleic acid first after administration of the preparation containing the first nucleic acid, it is within 1 minute to 1 day, preferably within 10 minutes to 6 hours, more preferably from 15 minutes to 1
  • a method of administering a preparation containing the second nucleic acid within a time can be mentioned.
  • the present invention provides a tumor therapeutic agent comprising the nucleic acid of the present invention and an antitumor agent in combination.
  • the antitumor agent that can be used in the concomitant drug of the present invention is not particularly limited, but preferably has an activity of suppressing the growth of the tumor itself.
  • antitumor agents include not only microtubule agonists such as taxanes, but also antimetabolites, DNA alkylating agents, DNA binding agents (platinum preparations), anticancer antibiotics, and the like.
  • amrubicin hydrochloride irinotecan hydrochloride, ifosfamide, etopocydastet, gefitib, cyclophosphamide, cisplatin, trastuzumab, fluorouracil, mitomycin C, imatinib mesylate, methotrexate, rituxan, and adriamycin.
  • the administration timing of the nucleic acid of the present invention and the antitumor agent is not limited, and the nucleic acid of the present invention and the antitumor agent are administered simultaneously to the administration subject. Alternatively, administration may be performed with a time difference.
  • the dosage of the nucleic acid of the present invention is not particularly limited as long as it can achieve prevention / treatment of the applicable disease, and can be administered within the dosage range described in the above section (1. Agent of the present invention).
  • the dose of the antitumor agent can be determined according to the dose adopted when the antitumor agent is administered as a single agent in the clinic.
  • the administration mode of the nucleic acid of the present invention and the antitumor agent is not particularly limited as long as the nucleic acid of the present invention and the antitumor agent are combined at the time of administration.
  • Examples of such administration forms include (1) administration of a single preparation obtained by simultaneously formulating the nucleic acid of the present invention and an antitumor agent, and (2) separating the nucleic acid of the present invention and the antitumor agent separately.
  • An agent comprising a combination of the nucleic acid of the present invention and an antitumor agent can be formulated by a conventional method according to the description in the above section (1. Agent of the present invention).
  • the dosage form of the antitumor agent is selected according to the dosage form adopted when the antitumor agent is administered as a single agent in clinical practice. I can do it.
  • the nucleic acid-containing preparation of the present invention and the anti-tumor agent-containing preparation may be administered at the same time.
  • the preparation containing the antitumor agent may be administered first, followed by the preparation containing the nucleic acid of the present invention, or the preparation containing the nucleic acid of the present invention may be administered first, and then the antitumor agent May be administered.
  • the time difference varies depending on the active ingredient to be administered, dosage form, and administration method. For example, when a preparation containing an antitumor agent is administered first, a preparation containing an antitumor agent was administered.
  • Examples thereof include a method of administering a preparation containing the nucleic acid of the present invention within 1 minute to 3 days, preferably within 10 minutes to 1 day, more preferably within 15 minutes to 1 hour.
  • the preparation containing the nucleic acid of the present invention is administered first, after administration of the preparation containing the nucleic acid of the present invention, it is 1 minute to 1 day, preferably 10 minutes to 6 hours, more preferably 15 minutes to
  • the method of administering the formulation containing an antitumor agent within 1 hour is mentioned.
  • two or more kinds of antitumor agents may be used.
  • the present invention measures the expression level or concentration of miR143 or miR143 and miR145 in a tumor or peripheral blood, and a negative correlation between the expression level or the concentration and the incidence of metastasis
  • the present invention provides a method for determining the risk of metastasis of a tumor, including determining the risk of metastasis of a tumor.
  • the expression level or concentration of miR143 or miR143 and miR145 in a tumor or peripheral blood (preferably serum derived from peripheral blood) removed from a patient to be measured is measured.
  • tumor types to which the determination method of the present invention can be applied include tumors to which the agent of the present invention described in detail in the above section (1. Agent of the present invention) can be applied.
  • the determination method of the present invention is preferably applicable to the solid cancer, more preferably osteosarcoma.
  • the miR143 or miR145 whose expression level or concentration is measured in the determination method of the present invention includes mature type, pri-miRNA, and pre-miRNA.
  • the expression level and concentration of miR143 or miR145 can be measured by a method known per se using a nucleic acid probe that can specifically detect the miRNA.
  • the measuring method include RT-PCR, Northern blotting, in situ hybridization, nucleic acid array and the like.
  • it can be measured by a commercially available kit (for example, TaqMan (registered trademark) MicroRNA Cells-to-CT TM Kit).
  • the nucleic acid probe capable of specifically detecting miR143 or miR145 is 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably about 20 bases or more, most preferably included in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the nucleic acid probe may contain an additional sequence (a nucleotide sequence that is not complementary to the polynucleotide to be detected) as long as specific detection is not hindered.
  • the nucleic acid probe may be an appropriate labeling agent such as a radioisotope (eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, etc.), an enzyme (eg, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase).
  • fluorescent substances eg, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc.
  • luminescent substances eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.
  • a quencher quenching substance
  • the fluorescence is detected by separating the fluorescent substance and the quencher during the detection reaction.
  • the nucleic acid probe may be any of DNA, RNA, and chimeric nucleic acid, and may be single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic acid probe or primer can be synthesized according to a conventional method using an automatic DNA / RNA synthesizer based on the information of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, for example.
  • the risk of tumor metastasis is determined based on the measured expression level or concentration of miR143 or miR143 and miR145. As shown in Examples described later, the lower the expression level of miR143 in tumor tissue, the higher the incidence of distant metastasis. The determination is made based on such a negative correlation between the expression level or concentration of miR143 or miR143 and miR145 and the incidence of tumor metastasis.
  • a tumor is removed from a tumor patient without metastasis (negative control) and a patient with metastasis (positive control) (or peripheral blood is obtained (preferably serum thereof)), and the subject patient's miR143 or miR143 and miR145
  • the expression level (or concentration) of is compared to that of the positive and negative controls.
  • a correlation diagram between the expression level (or concentration) of miR143 or miR143 and miR145 in the tumor and the incidence of metastasis is prepared in advance, and miR143 or miR143 and miR145 in the tumor (or peripheral blood) removed from the subject patient.
  • the expression level may be compared with its correlation diagram.
  • the comparison of the expression level (or concentration) is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the risk of tumor metastasis is relatively high Can be determined. Conversely, when the expression level or concentration of miR143 or miR143 and miR145 to be measured is relatively high, it can be determined that the risk of tumor metastasis is relatively low.
  • the present invention also provides an agent (referred to as agent (II) of the present invention) for determining the risk of tumor metastasis, comprising a nucleic acid probe capable of specifically detecting the above-described miR143 or miR143 and miR145.
  • agent (II) of the present invention can be a kit for determining the risk of distant metastasis of a tumor or the life prognosis of a tumor patient. By using the agent (II) of the present invention, the risk of tumor metastasis can be easily determined by the above-described determination method.
  • the nucleic acid probe is usually in the form of an aqueous solution dissolved at an appropriate concentration in water or an appropriate buffer (eg, TE buffer, PBS, etc.), or the nucleic acid probe is immobilized on a solid support. In the embodiment of the nucleic acid array, it is included in the agent (II) of the present invention.
  • the agent (II) of the present invention may further contain other components necessary for carrying out the method as a constituent, depending on the measurement method of miR143 or miR143 and miR145.
  • the agent (II) of the present invention can further contain a blotting buffer, a labeling reagent, a blotting membrane, and the like.
  • the agent (II) of the present invention can further contain a labeling reagent, a chromogenic substrate, and the like.
  • a method for searching for a substance capable of inhibiting tumor metastasis or tumor cell invasion ability The present invention also includes assessing whether a test substance enhances the expression of miR143 or miR143 and miR145. Alternatively, a method for searching for a substance that can inhibit the invasion ability of tumor cells and a substance that can be obtained by the method are provided. In the search method of the present invention, a substance that up-regulates the expression of miR143 or miR143 and miR145 is selected as a substance that can inhibit tumor (particularly osteosarcoma) metastasis or tumor cell (particularly osteosarcoma cell) invasion ability.
  • test substance used in the search method of the present invention may be any known compound or novel compound, for example, using nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, organic low molecular weight compound, combinatorial chemistry technique.
  • the prepared compound library, random peptide library, natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like can be mentioned.
  • the search method of the present invention includes the following steps: (I) contacting a test substance with a cell capable of measuring the expression of miR143 or miR143 and miR145; (II) measuring the expression level of miR143 or miR143 and miR145 in a cell contacted with a test substance, and comparing the expression level with the expression level of miR143 or miR143 and miR145 in a control cell not contacted with the test substance; And (III) a test substance that increases the expression level of miR143 or miR143 and miR145 is selected as a substance that can inhibit tumor metastasis or tumor cell invasion ability based on the comparison result of (II) above. .
  • miR143 or miR143 and miR145 whose expression levels are measured include mature forms, pri-miRNAs and pre-miRNAs, but preferably the sum or maturation of expression levels of all these types
  • the expression level of the type is measured, more preferably the expression level of the mature type.
  • a cell capable of measuring expression refers to a cell capable of evaluating the expression level of the miRNA to be measured. Examples of the cells include cells that can naturally express the miRNA to be measured.
  • the measurement target that is, a cell that can naturally express miR143 or miR143 and miR145 is not particularly limited as long as it can potentially express miR143 or miR143 and miR145, and the cell may be a mammal (eg, human, mouse, etc.).
  • the contact between the test substance and cells capable of measuring the expression of miR143 or miR143 and miR145 is performed in a culture medium.
  • the culture medium is appropriately selected depending on the cells capable of measuring the expression of miR143 or miR143 and miR145.
  • a minimal essential medium MEM containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM).
  • the culture conditions are appropriately determined in the same manner.
  • the pH of the medium is about 6 to about 8
  • the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C.
  • the culture time is about 12 to about 72 hours.
  • the measurement of the expression level of miR143 or miR143 and miR145 can be performed according to the method described in the section of (3. Method for determining tumor metastasis risk).
  • the comparison of expression levels can be preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the expression level of miR143 or miR143 and miR145 in the control cells not contacted with the test substance is the expression level measured in advance compared to the measurement of miR143 or miR143 and miR145 expression level in the cells contacted with the test substance. Even if it is, the expression level measured simultaneously may be sufficient, but it is preferable that it is the expression level measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • the substance that up-regulates the expression level of miR143 or miR143 and miR145 obtained as a result of the comparison is selected as a substance that can inhibit tumor metastasis or tumor cell invasion ability.
  • the compound obtained by the search method of the present invention is useful as a candidate substance for the development of a new tumor metastasis inhibitor.
  • nucleotide sequence is described using the RNA sequence for the sake of convenience, but this does not mean that the nucleic acid identified by the SEQ ID NO represents only RNA, and U It should be understood that (uracil) is replaced with T (thymine) to indicate the nucleotide sequence of DNA or chimeric nucleic acid.
  • 143B cells form tumors when inoculated into mouse knee joints, and then form metastases in the lung, whereas HOS cells do not cause lung metastases.
  • the 143B cell is a cell line prepared by transforming HOS cells with the v-Ki-ras gene. That is, although both have high genetic background similarity, they exhibit completely different kinetics of metastasis, suggesting that miRNAs with different expression are involved in metastasis.
  • HOS cells and 143B cells were grown in DMEM medium supplemented with 10% horse serum and 10% fetal bovine serum (FBS), and RNA from both cell lines was mirVana RNA Isolation kit (Ambion Inc. (As of September, 2008, Life Technologies, Inc.)) was used for extraction, and miRNA microarrays (Agilent microarrays Ver. 1.0) were used to compare expression patterns. As a result, 9 types of miRNAs whose expression levels were more than doubled and 9 types of miRNAs of less than half were identified in 143B cells (highly metastatic strains) compared to HOS sputum cells (non-metastatic strains) (FIG. 1).
  • Test Example 1 Functional analysis of osteosarcoma metastasis-related candidate miRNA and identification of tumor metastasis-related candidate
  • a cell line 143B Fluc stably introduced by introducing the firefly luciferase gene pGL3control (Promega) into 143B cells was established. Functional analysis was performed.
  • MiRNAs miRNA-28, 99b, 133b, 140, 143, 145, 149, 193b, 335) whose expression was decreased in 143B cells are pre-miR TM miRNA precursor molecules (hereinafter referred to as “miRNA mimic” for convenience).
  • miRNA mimic pre-miR TM miRNA precursor molecules
  • miRNA 143B Fluc cells were grown in DMEM medium supplemented with 10% horse serum and 10% fetal bovine serum (FBS), cultured overnight in 1x10 6 cells / 6cm dish, then DharmaFECT transfection ( GE Healthcare Biosciences Co., Ltd.) introduced miRNA mimic (Ambion (manufactured by Life Technologies, as of September 2009 by merger)) according to the attached protocol.
  • FBS fetal bovine serum
  • Reference Example 2 Creation of a mouse osteosarcoma metastasis model Tumors (primary foci) are formed daily by inoculating 1.5x10 6 of the 143B Fluc prepared in Test Example 1 into the knee joints of nude mice, and can be detected by biological imaging in the early mouse after 2 weeks A mouse model of osteosarcoma spontaneous lung metastasis with pulmonary metastasis was constructed. In the primary lesion in the model, tumor cells increased histologically with the destruction of existing tissues including bone tissue, while in the lung, tumor cell masses similar to the tumor cells in the primary lesion were occasionally found. The formation of metastases was confirmed (FIG. 5).
  • Example 1 Effect of miR143 hyperfunction on osteosarcoma metastasis
  • Pre-miR TM miRNA143 precursor molecule (hereinafter referred to as “miRNA143 mimic” for convenience, using the mouse model of spontaneous pulmonary metastasis created in Reference Example 2) At that time, the suppression of lung metastasis by Life Technologies))) was verified.
  • miRNA143 mimic for convenience, using the mouse model of spontaneous pulmonary metastasis created in Reference Example 2
  • 143B Fluc 1.5 ⁇ 10 6 mice from the next day, 0.25 ⁇ g / ⁇ l miR143 mimic / 0.05% atelocollagen solution was administered to 200 ⁇ l per tail vein 7 times every 3 days.
  • miR-NC1 manufactured by Ambion (as of September 2009, Life Technologies) as a result of merger
  • mice Four weeks after 143B Fluc knee joint inoculation, the mice were sacrificed and the lungs and primary lesions were removed. Macroscopic observation of the lung revealed many yellowish white nodules in the miR-NC1 (Ambion (Merged, Life Technologies, as of September 2009)) administration group, but miRNA143 mimic (Ambion ( As a result of the merger, no obvious nodules were observed in the group treated with Life Technologies) as of September 2009, except for mice whose lung metastases were detected by in vivo imaging. On the other hand, the weight of the primary lesion was 3.67 ⁇ 0.59 g in the miR-NC1 (Ambion (from merger, Life Technologies) as of September 2009)) administration group, miRNA143 mimic (Ambion (in September 2009)).
  • Example 2 Preparation of Atelocollagen Formulation 1 ml of an aqueous solution containing 500 ⁇ g / ml miRNA143 mimic (Pre-miR TM miRNA143 precursor molecule: manufactured by Ambion (as of September 2009, Life Technologies) as a result of merger) and 0.1% (w 1 ml of atelocollagen solution of / w) was mixed to obtain 2 ml of 0.25 ⁇ g / ⁇ l miR-143 mimic / 0.05% atelocollagen preparation.
  • Pre-miR TM miRNA143 precursor molecule manufactured by Ambion (as of September 2009, Life Technologies) as a result of merger)
  • 0.1% w 1 ml of atelocollagen solution of / w
  • the osteosarcoma metastasis inhibitor of the present invention is useful for treatment and prevention of diseases caused by osteosarcoma metastasis.
  • a tumor metastasis risk can be determined, and an agent for determining a tumor metastasis risk and a method for screening a substance having an action of inhibiting tumor metastasis can be provided.

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Abstract

　本発明は、miR143又はmiR143及びmiR145等の核酸を含む腫瘍の転移抑制剤；腫瘍におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベルを測定することを含む、腫瘍の転移リスクを判定する方法；miR143又はmiR143及びmiR145の発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移を阻害し得る物質として選択することを含む、腫瘍の転移を阻害し得る物質を探索する方法等を提供する。

Description

腫瘍の転移抑制剤
　本発明は、腫瘍の転移を抑制する薬剤、前記薬剤を利用した医薬、腫瘍の転移リスクを判定する方法、腫瘍の転移リスクを判定するための剤、及び腫瘍の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法等に関する。具体的には、固形癌、より詳しくは骨肉腫の転移を抑制する核酸に関する。
　miRNA（マイクロRNA）は、ゲノム上にコードされた内在性の20～25塩基程度の非コード（non-coding）RNAである。miRNAは、ゲノムDNA上のmiRNA遺伝子から、まず数百～数千塩基程度の長さの一次転写物（Primary miRNA。以下、「Pri-miRNA」と称する。）として転写され、次にプロセッシングを受けて約60～110塩基程度のヘアピン構造を有するpre-miRNA（precusor miRNA）となる。その後、核から細胞質内へ移動し、さらにプロセッシングを受けて20～25塩基程度の二本鎖成熟miRNAとなる。二本鎖成熟miRNAは、そのうちの一本鎖がRISCと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のmRNAに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
　miRNAは、ヒトやマウスなどで1000種類以上が知られており、それぞれが複数の標的遺伝子の発現を調節し、細胞の増殖や分化など、様々な生命現象に関与することが示唆されている。例えば、造血細胞や神経細胞の分化などに関与するmiRNAについての報告がある（例えば、非特許文献２参照）。また、癌細胞の増殖に関与するmiRNAについても報告があり、miRNAの発現パターンを癌の臨床診断に利用することや、miRNAの発現を抑制することで癌細胞の増殖を抑制する癌の治療法について、提案がなされている（例えば、特許文献１、２参照）。
　特許文献３には、マイクロRNA143（以下、miR143と称する）の発現制御パターンおよびmiR143が制御している遺伝子のパスウェイ解析を開示し、また非特許文献３には、miR143は大腸癌細胞で発現が低下しており、また大腸癌細胞へmiR143を導入した実験の結果、miR143は大腸癌の細胞増殖を抑制することが示されている。
　非特許文献４は、様々なステージの結腸癌(Colorectal)患者の腫瘍組織でのmiR21、31、143および145についてその発現パターンを調べた結果を報告している。結腸癌(Colorectal)患者の腫瘍組織で発現が亢進しているmiRNAはmiR21、31であり、miR143、145は発現が低下していたことが開示されている。
特開２００８－８６２０１号　公報 特開２００６－５０６４６９号　公報 国際公開第２００８／０３５７１８号パンフレット
Nature Reviews Genetics vol.5 p522-p531 (2004) Science Vol.303 No.5654 p83-86 (2004) Oncol. Rep. Vol.16 p845-850 (2006) Oncology Vol.72 p392-402 (2007)
　腫瘍の治療に関しては、革新的進歩を遂げており、特に外科的手術や放射線療法による原発腫瘍（癌）の除去に対する成功率の向上は著しい。しかし、原発巣から遊離した腫瘍細胞は、脈管系に侵入し、遠隔臓器に到達すると生着し増殖を開始するという過程を経る、いわゆる転移が起こる可能性も大きく、原発腫瘍（癌）の除去が完全になされても、癌化した細胞の転移により患者を死に至らしめる場合が少なくない。例えば骨肉腫などでは、肺への転移が患者の直接的又は間接的な死亡原因となっており、すなわち肺転移を抑制することが骨肉腫の治療における大きな課題とされていた。
　腫瘍、特に骨肉腫の転移に関与するmiRNAについては、これまで報告がない。
　そこで、本発明の目的は、腫瘍、特に骨肉腫転移を制御（抑制）するための薬剤、腫瘍の転移リスクを判定する方法、腫瘍の転移を阻害し得る物質を探索する方法を提供することにある。
　本発明者らは、骨肉腫転移に関与するmiRNAについて新たな知見を得て、その知見を利用して、miR143及びmiR145の腫瘍転移抑制効果を検討した結果、これらのmiRNA、特にmiR143が優れた腫瘍転移抑制効果を示すことを見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は以下に関する。
［１］miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む、腫瘍の転移抑制剤。
［２］核酸が一本鎖または二本鎖である、［１］に記載の転移抑制剤。
［３］miR143が配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチドである、［１］に記載の転移抑制剤。
［４］核酸が配列番号１で表されるヌクレオチド配列又はその部分配列からなるＲＮＡ、或いはその修飾体である、［１］に記載の転移抑制剤。
［５］核酸が配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡまたはその修飾体である、［１］に記載の転移抑制剤。
［６］miR143を含む核酸が、miR143およびその前駆体からなる群から選ばれる少なくとも一種の核酸である、［１］に記載の転移抑制剤。
［７］前駆体が、miR143のpri-miRNA又はpre-miRNAである、［６］に記載の転移抑制剤。
［８］腫瘍が固形癌である、［１］に記載の転移抑制剤。
［９］固形癌が骨肉腫である、［８］に記載の転移抑制剤。
［１０］腫瘍が転移性癌である、［１］に記載の転移抑制剤。
［１１］miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、miR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸とを併用してなる腫瘍の転移抑制剤。
［１２］(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
(b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸
を含む、腫瘍の転移に起因する疾患を予防するための剤。
［１３］（A）(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
(b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
（B） 抗腫瘍剤
とを併用してなる腫瘍の治療剤。
［１４］腫瘍若しくは末梢血におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベル若しくは濃度を測定すること、及び該発現レベル若しくは該濃度と転移発生率との間の負の相関に基づき、腫瘍の転移リスクを判定することを含む、腫瘍の転移リスクを判定する方法。
［１５］miR143又はmiR143及びmiR145を特異的に検出し得る核酸プローブを含む、腫瘍の転移リスクを判定するための剤。
［１６］以下の工程を含む、腫瘍の転移又は腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法：
（Ｉ）被検物質とmiR143又はmiR143及びmiR145の発現を測定可能な細胞とを接触させること；
（ＩＩ）被検物質を接触させた細胞におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現量と比較すること；並びに
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、miR143又はmiR143及びmiR145の発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移又は腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
［１７］哺乳動物に対して、有効量のmiR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移を抑制する方法。
［１８］哺乳動物に対して、有効量のmiR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移を抑制する方法。
［１９］哺乳動物に対して、有効量の
(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
(b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸
を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移に起因する疾患を予防する方法。
［２０］哺乳動物に対して、有効量の
（A）(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
(b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、並びに
（B） 抗腫瘍剤
を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の治療方法。
［２１］腫瘍の転移抑制に使用するための、miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸。
［２２］腫瘍の転移抑制に使用するための、miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む組合せ。
［２３］腫瘍の転移に起因する疾患の予防に使用するための、
(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
(b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む組合せ。
［２４］腫瘍の治療に使用するための、
（A）(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
(b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及び
（B） 抗腫瘍剤
を含む組合せ。
　本発明により、腫瘍、特に骨肉腫の転移に対して抑制効果を示す、腫瘍転移抑制剤、腫瘍の転移リスクを判定する方法、腫瘍の転移リスクを判定するための剤、及び腫瘍の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
図１は、参考例１におけるmiRNAマイクロアレイ解析の結果を示す図である。尚、図１は本来カラー写真である。 図２は、143B細胞へmiRNAを導入する、細胞の浸潤能および増殖に対する機能のアッセイ法のスキームである。 図３は、miRNAを導入した143B細胞浸潤試験の結果を示している。 図４は、miRNAを導入した143B細胞増殖試験の結果を示している。 図５は、マウス骨肉腫転移モデルの作成の結果を示している。尚、図５は本来カラー写真である。 図６は、マウス骨肉腫転移モデルへのmiR143の投与プロトコールを示している。 図７は、マウス骨肉腫転移モデルへのmiR143の投与後４週間の肺転移巣を示している。尚、図７は本来カラー写真である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の剤
　本発明者らは、今回このmiR143が腫瘍の浸潤や転移を抑制する機能を有することを見出し（実施例参照、後述）、腫瘍（好ましくは固形癌、より好ましくは骨肉種）の転移抑制剤の有効成分として利用可能であることを見出した。即ち、本発明は、
・miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む剤、および、
・miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、miR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸とを併用してなる剤
を提供するものである。本発明の剤は、腫瘍の転移抑制剤や腫瘍の転移に起因する疾患を治療または予防するための剤として有用である。
　本発明の核酸は、RNA、RNAとDNAのキメラ核酸（以下、キメラ核酸と称する）又はハイブリッド核酸である。ここにおいて、キメラ核酸とは、１本鎖又は２本鎖の核酸において一本の核酸の中にＲＮＡとＤＮＡを含むことをいい、ハイブリッド核酸とは、二本鎖において、一方の鎖がＲＮＡまたはキメラ核酸でもう一方の鎖がＤＮＡまたはキメラ核酸である核酸をいう。
　本発明の核酸は、１本鎖又は２本鎖である。２本鎖の態様には、２本鎖RNA、２本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、RNA／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド及びキメラ核酸／DNAハイブリッドが含まれる。本発明の核酸は、好ましくは１本鎖RNA、１本鎖キメラ核酸、２本鎖RNA、２本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、RNA／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド又はキメラ核酸／DNAハイブリッドであり、より好ましくは１本鎖RNA、１本鎖キメラ核酸、２本鎖RNA、２本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド又はRNA／キメラ核酸ハイブリッドである。
　本発明の核酸の長さは、哺乳動物（好ましくはヒト）の腫瘍細胞の浸潤能を阻害する活性を有する限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本発明の核酸の長さは、例えば約２００塩基以下、好ましくは約１３０塩基以下、より好ましくは約５０塩基以下であり、最も好ましくは３０塩基以下である。下限としては、例えば１５塩基以上、好ましくは、１７塩基以上である。なお、核酸がヘアピンループ型の構造をとることにより２本鎖構造状を形成する場合の核酸の長さは、一本鎖の長さとして考えるものとする。
　miR143は、すでに公知の分子であり、代表的には、成熟型miRNAと呼ばれているものを意味する。ここで、miR143には、miR143のisomerも含まれる。具体的には、例えば、配列番号１（UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC）（MIMAT0000435)で表されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチドを意味する。成熟型miR143とは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなる１本鎖または２本鎖のＲＮＡを意味する。
　本発明の核酸は、腫瘍細胞内へ取り込まれると、該細胞の浸潤能を阻害する活性を有する。本発明において、「miR143と同等の機能を有するヌクレオチド」とは、miR143の標的mRNAと生体条件で（例えば0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0) 25℃で）ハイブリッドを形成するものを意味する。さらに、具体的には、miR143の標的mRNAと生体条件で（例えば0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0) 25℃で）ハイブリッドを形成し、且つ腫瘍細胞内に取り込まれると、該細胞の浸潤能を阻害する活性を有するヌクレオチドを意味する。miR143の標的mRNAとしては、ERK5等が知られており、これらは非特許文献３等の文献に開示されているがこれらに限定されない。
　腫瘍細胞は、通常、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト、好ましくはヒト）の細胞である。腫瘍の種類としては、骨肉腫、食道癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、脳腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、腎癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、甲状腺癌、睾丸腫瘍、カポジ肉腫、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、筋肉腫、皮膚癌などの固形癌、骨髄腫、白血病等が例示できる。腫瘍の種類は、好ましくは固形癌であり、より好ましくは骨肉腫である。核酸が腫瘍細胞の浸潤能を阻害する活性を有するか否かは、例えば以下のアッセイにより確認することが出来る。
　即ち、転移能を有するヒト骨肉腫細胞株である143B細胞を1x106細胞/6cm dishで終夜培養後、DharmaFECT transfection（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）によって核酸を30nM導入する。48時間後の細胞を用いてCytoSelectTM 96-Well Cell Invasion Assay kit（Cell Biolab社）により、細胞浸潤アッセイを行い、20時間後の浸潤細胞数を計測する。
　本発明において用いられる「miR143と同等の機能を有するヌクレオチド」のヌクレオチド配列は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する。
　「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。
　本明細書において、ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST-2（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝5ペナルティ；ギャップエクステンション＝2ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝50；期待値＝10；フィルタリング＝ON）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。
　配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列としては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において１若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されたヌクレオチド配列、例えば、(1)配列番号１で表されるヌクレオチド配列中の１～６個（好ましくは１～３個、より好ましくは１又は２個）のヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列、(2)配列番号１で表されるヌクレオチド配列に１～６個（好ましくは１～３個、より好ましくは１又は２個）のヌクレオチドが付加されたヌクレオチド配列、(3)配列番号１で表されるヌクレオチド配列に１～６個（好ましくは１～３個、より好ましくは１又は２個）のヌクレオチドが挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号１で表されるヌクレオチド配列中の１～６個（好ましくは１～３個、より好ましくは１又は２個）のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されたヌクレオチド配列、または(5)上記(1)～(4)の変異が組み合わせれたヌクレオチド配列（この場合、変異したヌクレオチドの総和が、１～６個（好ましくは１～３個、より好ましくは１又は２個））である。
　配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に含まれる連続する１５塩基以上（好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１９塩基以上、最も好ましくは２０塩基）の部分配列またはそれを含む配列である。
　本明細書において、核酸が「miR143」や「miR143と同等の機能を有するヌクレオチド」を含むとは、該核酸のヌクレオチド配列中に「miR143」や「miR143と同等の機能を有するヌクレオチド」のヌクレオチド配列が含まれることを意味する。
　天然型の核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によって容易に分解されるので、本発明の核酸は、各種分解酵素に対して抵抗性となるように修飾した、修飾体としてもよい。本発明の修飾体には、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有し、且つ、miR143と同等の機能を有するヌクレオチドの範囲で、配列の修飾も含めた各種修飾をされた修飾体が含まれる。修飾体における修飾の例としては、例えば、糖鎖部分が修飾されているもの（例えば、２’－Ｏメチル化）、塩基部分が修飾されているもの、リン酸部分やヒドロキシル部分が修飾されているもの（例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等）を挙げることができるが、これに限定されない。
　また、核酸自体を修飾してもよい。また、例えば、miR143と同一の領域と、その配列と60％～100％未満相補的である相補領域とを含む合成核酸であってもよい。WO2006/627171に記載のような合成ＲＮＡ分子としてもよい。
　本発明の核酸は、５’又は３’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常５塩基以下である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の核酸の好ましい態様としては、成熟型miR143、その前駆体等の核酸を挙げることができる。本発明の核酸の好ましい別の態様としては、成熟型miRNAと同様の活性を有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、内在性の成熟型miR143を模倣するように合成された、miR143 mimicなどを使用することができる。市販のものを利用することもできる。例えば、Pre-miRTM miRNA precursor molecule （Ambion社製（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社製））が例示できる。
　miR143の前駆体とは、細胞内のプロセシングや、２本鎖核酸の開裂の結果、細胞内において成熟型miR143を生じ得る核酸を意味する。該前駆体としては、miR143のpri-miRNAやpre-miRNA等を挙げることができる。pri-miRNAはmiRNA遺伝子の一次転写産物（１本鎖ＲＮＡ）であり、通常数百～数千塩基程度の長さを有する。pre-miRNAは、pri-miRNAが細胞内プロセシングを受けることにより生じるヘアピン構造を有する１本鎖ＲＮＡであり、通常９０～１１０塩基の長さを有する。
　miR143（や後述のmiR145）のpri-miRNAやpre-miRNAは公知の分子であり、例えばサンガー研究所が作成しているmiRBaseデータベース（http://microrna.sanger.ac.uk/）等に開示されている。miR143の好適なpre-miRNAとしては、下記の配列番号２で表されるヌクレオチド配列からなる１本鎖ＲＮＡを挙げることが出来る：
GCGCAGCGCCCUGUCUCCCAGCCUGAGGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGUCAGUUGGGAGUCUGAGAUGAAGCACUGUAGCUCAGGAAGAGAGAAGUUGUUCUGCAGC（hsa-miR143　MI0000459）
　また、ヘアピンループ部分を介して、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖核酸であって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造状の形状を有する核酸も本発明の核酸の好ましい態様の１つである。
　本発明の核酸は、従来公知の手法を用いて、哺乳動物細胞（ヒト細胞等）から単離することにより、または化学的に合成することにより、または遺伝子組み換え技術を用いて産生することにより得ることができる。また、適宜市販されている核酸を用いることも可能である。miR143 mimicは例えばAmbion社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）などから入手可能である。
　本発明の剤は、有効量の本発明の核酸に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができ、医薬組成物の形態で医薬として適用される。
　医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
　本発明の核酸の腫瘍細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine）、DOGS（トランスフェクタム）、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
　本発明の剤にアテロコラーゲンを含ませることにより、標的となる腫瘍細胞に、本発明の核酸を効率よく送達し、当該細胞に効率よく取り込ませることができる。
　本発明の剤は、経口的に又は非経口的に、哺乳動物に対して投与することが可能であるが、本発明の剤は、非経口的に投与されるのが望ましく、通常、非経口的に投与される。
　非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
　非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。
　医薬組成物中の本発明の核酸の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．１ないし１００重量％である。
　本発明の剤の投与量は、投与の目的、投与方法、腫瘍の種類、大きさ、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、成人に注射により局所投与する場合、通常、本発明の核酸の量として１ｐｍｏｌ／ｋｇ以上１０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下、全身投与では２ｎｍｏｌ／ｋｇ以上５０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下が望ましい。かかる投与量を１～１０回、より好ましくは５～１０回投与することが望ましい。
　本発明の剤は、その有効成分である本発明の核酸が腫瘍組織（腫瘍細胞）に送達されるように、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト）に対して安全に投与される。
　本発明の核酸は、腫瘍細胞の浸潤能を阻害する活性を有するので、本発明の剤を、腫瘍の患者や、腫瘍の転移リスクを有する腫瘍の治療後の患者等に対して投与することにより、腫瘍の転移を抑制し、腫瘍の転移に起因する疾患を治療又は予防することが出来る。従って、本発明の剤は、腫瘍の転移抑制剤として、或いは腫瘍の転移に起因する疾患を予防するための剤として有用である。
　ここで、「転移抑制」とは、腫瘍細胞が原発巣から異なる部位へ到達し、該部位において腫瘍を二次的に生じることを抑制することを意味する。
　本発明の剤が適用できる腫瘍としては、例えば、骨肉腫、食道癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、脳腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、腎癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、甲状腺癌、睾丸腫瘍、カポジ肉腫、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、筋肉腫、皮膚癌、網膜芽腫などの固形癌、骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、悪性黒色腫、血管腫、真性多血症、神経芽腫等が例示できる。
　例えば、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、白血病およびリンパ腫を含む血液細胞悪性腫瘍；頭頚部癌；胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌を含む消化管癌；卵巣癌、子宮内膜癌、および子宮頚癌を含む女性生殖管の悪性腫瘍；膀胱癌；神経芽細胞腫を含む脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；および悪性黒色腫またはへん平上皮癌を含む皮膚癌などの転移性癌も例示できる。
　本発明の剤は、好ましくは上記固形癌、より好ましくは骨肉腫に対して適用できる。
　腫瘍の転移に起因する疾患としては、例えば、転移性癌、腫瘍の増大や癌性胸膜炎による呼吸不全等を挙げることが出来る。
１－２．miR143とmiR145との併用
　上記本発明の剤の好適な一態様として、miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸（以下、第１の核酸と称する）と、miR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸（以下、第２の核酸と称する）とを併用してなる剤が提供される。
　第１の核酸と第２の核酸を組み合わせて投与することにより、それぞれ腫瘍細胞の浸潤能を阻害する活性が増強され、強力な腫瘍転移抑制活性を発揮することが期待される。
　第１の核酸は上記（１．本発明の剤）の項で記載した通りであり、第２の核酸は、miR143をmiR145と置き換える以外は上記（１．本発明の剤）の項で記載した内容と同様である。なお、miR145は、配列番号３で表されるヌクレオチド配列（GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU）（MIMAT0000437）からなるヌクレオチドであり、また、miR145の好適な前駆体（pre-miRNA）としては、下記の配列番号４で表されるヌクレオチド配列からなる１本鎖ＲＮＡを挙げることが出来る：
CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU（hsa-miR145　MI0000461）
　第１の核酸と第２の核酸との併用に際しては、第１の核酸と第２の核酸の投与時期は限定されず、第１の核酸と第２の核酸とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。
　第１の核酸及び第２の核酸の投与量は、適用疾患の予防・治療を達成し得る範囲で特に限定されず、上記（１．本発明の剤）の項で記載した投与量範囲で投与可能であるが、併用により腫瘍転移抑制活性の増強が期待されるので、上記（１．本発明の剤）の項で記載した投与量よりも少ない量で、第１の核酸又は第２の核酸を単独で投与したときと同等の効果を発揮することが期待される。
　第１の核酸と第２の核酸の投与形態は、特に限定されず、投与時に、第１の核酸と第２の核酸とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）第１の核酸と第２の核酸とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）第１の核酸と第２の核酸とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）第１の核酸と第２の核酸とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）第１の核酸と第２の核酸とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）第１の核酸と第２の核酸とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、第１の核酸→第２の核酸の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。
　第１の核酸と、第２の核酸とを併用してなる剤は、上記（１．本発明の剤）の項の記載に準じ、常法により製剤化することが出来る。
　上述の第１の核酸と第２の核酸をそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、第１の核酸を含有する製剤と第２の核酸を含有する製剤とを同時期に投与してもよいが、第２の核酸を含有する製剤を先に投与した後、第１の核酸を含有する製剤を投与してもよいし、第１の核酸を含有する製剤を先に投与し、その後で第２の核酸を含有する製剤を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、第２の核酸を含有する製剤を先に投与する場合、第２の核酸を含有する製剤を投与した後１分～３日以内、好ましくは１０分～１日以内、より好ましくは１５分～１時間以内に第１の核酸を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。第１の核酸を含有する製剤を先に投与する場合、第１の核酸を含有する製剤を投与した後、１分～１日以内、好ましくは１０分～６時間以内、より好ましくは１５分から１時間以内に第２の核酸を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。
２．本発明の核酸と抗腫瘍剤との併用
　本発明の核酸と抗腫瘍剤とを併用することによって、腫瘍そのものの増殖を抑制するとともに、腫瘍の転移を抑制することによって、根治的に腫瘍を治療することができる。従って、本発明は、本発明の核酸と抗腫瘍剤とを併用してなる腫瘍治療剤を提供するものである。
　本発明の併用剤に使用することのできる抗腫瘍剤としては、特に制限はないが、腫瘍そのものの増殖を抑制する活性を有するものが好ましい。そのような抗腫瘍剤としては、タキサン類等の微小管作用薬だけでなく、代謝拮抗剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ結合剤（白金製剤）、抗ガン性抗生物質などが挙げられる。具体的には、塩酸アムルビシン、塩酸イリノテカン、イホスファミド、エトポシドラステット、ゲフィニチブ、シクロフォスファミド、シスプラチン、トラスツズマブ、フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メシル酸イマチニブ、メソトレキサート、リツキサン、アドリアマイシンなどが挙げられる。
　本発明の核酸と抗腫瘍剤との併用に際しては、本発明の核酸と抗腫瘍剤の投与時期は限定されず、本発明の核酸と抗腫瘍剤とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。
　本発明の核酸の投与量は、適用疾患の予防・治療を達成し得る範囲で特に限定されず、上記（１．本発明の剤）の項で記載した投与量範囲で投与可能である。
　抗腫瘍剤の投与量は、臨床において当該抗腫瘍剤を単剤で投与する際に採用される投与量に準じて決定することが出来る。
　本発明の核酸と抗腫瘍剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明の核酸と抗腫瘍剤とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明の核酸→抗腫瘍剤の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。
　本発明の核酸と、抗腫瘍剤とを併用してなる剤は、上記（１．本発明の剤）の項の記載に準じ、常法により製剤化することが出来る。本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化する場合には、抗腫瘍剤の剤型は、臨床において当該抗腫瘍剤を単剤で投与する際に採用される剤型に準じて選択することが出来る。
　上述の本発明の核酸と抗腫瘍剤をそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、本発明の核酸を含有する製剤と抗腫瘍剤を含有する製剤とを同時期に投与してもよいが、抗腫瘍剤を含有する製剤を先に投与した後、本発明の核酸を含有する製剤を投与してもよいし、本発明の核酸を含有する製剤を先に投与し、その後で抗腫瘍剤を含有する製剤を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、抗腫瘍剤を含有する製剤を先に投与する場合、抗腫瘍剤を含有する製剤を投与した後１分～３日以内、好ましくは１０分～１日以内、より好ましくは１５分～１時間以内に本発明の核酸を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。本発明の核酸を含有する製剤を先に投与する場合、本発明の核酸を含有する製剤を投与した後、１分～１日以内、好ましくは１０分～６時間以内、より好ましくは１５分～１時間以内に抗腫瘍剤を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。
　本発明の併用剤においては、２種以上の抗腫瘍剤を用いてもよい。
３．腫瘍の転移リスクを判定する方法
　本発明は、腫瘍若しくは末梢血におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベル若しくは濃度を測定すること、及び該発現レベル若しくは該濃度と転移発生率との間の負の相関に基づき、腫瘍の転移リスクを判定することを含む、腫瘍の転移リスクを判定する方法を提供するものである。
　本発明の判定方法においては、測定対象患者から摘出された腫瘍若しくは末梢血（好ましくは末梢血に由来する血清）におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベル若しくは濃度が測定される。本発明の判定方法を適用することの出来る腫瘍の種類としては、上記（１．本発明の剤）の項に詳述した、本発明の剤を適用可能な腫瘍を挙げることが出来る。本発明の判定方法は、好ましくは上記固形癌、より好ましくは骨肉腫に対して適用できる。
　本発明の判定方法において発現レベル若しくは濃度が測定されるmiR143又はmiR145には、成熟型、pri-miRNA及びpre-miRNAが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計又は成熟型の発現レベル、より好ましくは成熟型の発現レベルが測定される。
　例えば、miR143又はmiR145の発現レベル及び濃度は、該miRNAを特異的に検出し得る核酸プローブを用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、RT-PCR、ノザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、核酸アレイ等を挙げることができる。または、市販のキット（例えば、TaqMan（登録商標）　MicroRNA Cells-to-CTTMKit)によっても測定できる。
　miR143又はmiR145を特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列に含まれる、15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは約20塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
　核酸プローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
　また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
　核酸プローブは、DNA、RNA、キメラ核酸のいずれであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸プローブまたはプライマーは、例えば、配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
　次に、測定されたmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベル若しくは濃度に基づいて、腫瘍の転移リスクが判定される。後述の実施例に示すように、腫瘍組織におけるmiR143の発現レベルが低いほど遠隔転移の発生率が高い。上記判定は、miR143もしくはmiR143とmiR145の発現レベル若しくは濃度と腫瘍の転移発生率との間のこのような負の相関に基づき行われる。
　例えば、転移を伴わない腫瘍患者（ネガティブコントロール）及び、転移を併発した患者（ポジティブコントロール）から腫瘍を摘出し（または末梢血を得（好ましくはその血清））、対象患者のmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベル（または濃度）がポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較される。あるいは、腫瘍におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベル（または濃度）と転移発生率との相関図をあらかじめ作成しておき、対象患者から摘出された腫瘍（または末梢血）におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベルをその相関図と比較してもよい。発現レベル（または濃度）の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
　そして、miR143、又はmiR143及びmiR145の発現レベルまたは濃度の比較結果より、測定対象のmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベルまたは濃度が相対的に低い場合には、腫瘍の転移発生リスクが相対的に高いと判定することができる。逆に、測定対象のmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベルまたは濃度が相対的に高い場合には、腫瘍の転移発生リスクが相対的に低いと判定することができる。
　また、本発明は、上述のmiR143、又はmiR143及びmiR145 を特異的に検出し得る核酸プローブを含む、腫瘍の転移リスクを判定するための剤（本発明の剤（ＩＩ）と呼ぶ）を提供するものである。本発明の剤（ＩＩ）は、腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定するためのキットであり得る。本発明の剤（ＩＩ）を用いることにより、上述の判定方法により容易に腫瘍の転移リスクを判定することができる。
　核酸プローブは、通常、水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該核酸プローブが固相担体上に固定された核酸アレイの態様で、本発明の剤（ＩＩ）に含まれる。
　本発明の剤（ＩＩ）は、miR143又はmiR143及びmiR145の測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、ノザンブロッティングや核酸アレイを測定に用いる場合には、本発明の剤（ＩＩ）は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。in situ ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本発明の剤（ＩＩ）は、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。
４．腫瘍の転移又は腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法
　本発明はまた、被検物質がmiR143又はmiR143及びmiR145の発現を増強するか否かを評価することを含む、腫瘍の転移又は腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法、並びに当該方法により得られうる物質を提供する。本発明の探索方法においては、miR143又はmiR143及びmiR145の発現を上方制御する物質が、腫瘍（特に骨肉腫）の転移又は腫瘍細胞（特に骨肉腫細胞）の浸潤能を阻害し得る物質として選択される。
　本発明の探索方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
　本発明の探索方法は、以下の工程を含む：
（Ｉ）被検物質とmiR143又はmiR143及びmiR145の発現を測定可能な細胞とを接触させること；
（ＩＩ）被検物質を接触させた細胞におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現量と比較すること；並びに
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、miR143又はmiR143及びmiR145の発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移又は腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
　本発明の探索方法において、発現レベルが測定されるmiR143又はmiR143及びmiR145には、成熟型、pri-miRNA及びpre-miRNAが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計又は成熟型の発現レベル、より好ましくは成熟型の発現レベルが測定される。
　「発現を測定可能な細胞」とは、測定対象のmiRNAの発現レベルを評価可能な細胞をいう。該細胞としては、測定対象のmiRNAを天然で発現可能な細胞が挙げられる。
　測定対象、即ちmiR143又はmiR143及びmiR145を天然で発現可能な細胞は、miR143又はmiR143及びmiR145を潜在的に発現するものである限り特に限定されず、当該細胞として、哺乳動物（例えばヒト、マウス等）の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株などを用いることができる。miR143又はmiR143及びmiR145を天然で発現可能な細胞としては、例えば上記（１．本発明の剤）の項において、本発明の剤が適用可能な腫瘍の細胞（好ましくは骨肉腫細胞）を挙げることが出来る。
　被検物質とmiR143又はmiR143及びmiR145の発現を測定可能な細胞との接触は、培養培地中で行われる。培養培地は、miR143又はmiR143及びmiR145の発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約５～２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約６～約８であり、培養温度は通常約３０～約４０℃であり、培養時間は約１２～約７２時間である。
　miR143又はmiR143及びmiR145の発現量の測定は、（３．腫瘍の転移リスクを判定する方法）の項で述べた方法に従い行うことができる。
　発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現量は、被検物質を接触させた細胞におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
　そして、比較の結果得られた、miR143、又はmiR143及びmiR145の発現量を上方制御する物質が、腫瘍の転移又は腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択される。
　本発明の探索方法で得られる化合物は、新たな腫瘍の転移阻害剤の開発のための候補物質として有用である。
　尚、本願の配列表において、ヌクレオチド配列を便宜的にRNAの配列を用いて記載したが、これは、該配列番号により特定された核酸がRNAのみを示すことを意味するものではなく、適宜U（ウラシル）をT（チミン）と読み替えることにより、DNAやキメラ核酸のヌクレオチド配列をも示すものであることを理解するべきである。
　以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。
参考例１　ヒト骨肉腫転移に関与するmiRNAの探索 
　ヒト骨肉腫細胞転移に関連するマイクロRNA (miRNA)の探索には、ヒト骨肉腫細胞株（HOS細胞および143B細胞:ともにATCCより購入）を用いておこなった。143B細胞は、マウス膝関節に接種すると腫瘍を形成し、その後肺に転移巣を形成するが、一方HOS細胞は肺転移を引き起こさない。143B細胞は、HOS細胞をv-Ki-ras遺伝子により形質転換して作製された細胞株である。即ち、両者は遺伝的背景の類似性が高いにも関わらず、転移については全く異なる動態を示すことから、両者において発現の異なる miRNAが転移に関わることが示唆される。
　HOS 細胞および143B細胞をDMEM培地にウマ血清10%およびウシ胎児血清（FBS）を10%添加した培地を用いて増殖させ、両細胞株からRNAをmirVana RNA Isolation kit(Ambion社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）)を用いて抽出し、miRNA microarray （Agilent社 microarray Ver. 1.0）にて発現パターンを比較した。その結果、143B細胞（肺高転移株）においてHOS 細胞（非転移株）と比較しその発現量が２倍以上のmiRNA９種および２分の１未満のmiRNA9種を同定した（図１）。
　試験例１　骨肉腫転移関連候補miRNAの機能解析および腫瘍転移関連候補の同定
　143B細胞にホタルルシフェラーゼ遺伝子pGL3control（プロメガ社）を導入し、安定発現させた細胞株（143B Fluc）を樹立し、以下の機能解析をおこなった。143B細胞で発現が低下していたmiRNA （miRNA-28, 99b, 133b, 140, 143, 145, 149, 193b, 335）は、それぞれのPre-miRTM miRNA precursor molecule　（以下、便宜上「miRNA mimic」という） （Ambion社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製）を143B Fluc 細胞ヘ導入し、細胞の浸潤能および増殖に対する変化を検討した（図２）。
　（１）miRNAの導入
　143B Fluc 細胞をDMEM培地にウマ血清10%およびウシ胎児血清（FBS）を10%添加した培地を用いて増殖させ、1x106細胞/6cm dishで終夜培養後、DharmaFECT transfection（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）によってmiRNA mimic （Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製）を添付のプロトコールに従って10nMあるいは30nM導入した。 
　（２）細胞浸潤試験
　miRNA mimic（Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製）を143B Fluc細胞へ導入し、48時間後の細胞 1x105cell/wellを用いて、細胞浸潤アッセイを行った。細胞浸潤アッセイは、 CytoSelectTM 96-Well Cell Invasion Assay kit（Cell Biolab社）を用いて添付のプロトコールに従って実施した。20時間後の浸潤細胞数を計測し、Negative control miRNA として、Pre-miRTM miRNA precursor Negative Control: (Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製)（以下、便宜上「miR-NC1」という)を上記と同様に導入した143B Fluc 細胞におけるデータとの相対値を算出した。 
　その結果、143B細胞において発現が低下していたmiRNA ９種の内、miR143（30nM）導入株で最も浸潤が抑制された（コントロールの約30％）（図３）。
　（３）細胞増殖試験 
　miRNA mimic（Ambion社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製）を143B Fluc細胞へ導入し、48時間後の細胞 1x104cell/wellを用いて、72時間後の細胞数を計測し、miR-NC1(Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製)を導入した143B Fluc細胞におけるデータとの相対値を算出した。 
　miR143 を含め、143B細胞において発現が低下していたmiRNA 9種は、いずれも143B細胞の細胞増殖を著しくは抑制しなかった（図４）。
　細胞浸潤試験および細胞増殖試験より、143B細胞の細胞増殖には影響せず、浸潤能を最も抑制するmiRNAとしてmiR143を同定した。
　参考例２　マウス骨肉腫転移モデルの作成 
　試験例１で作成した143B Flucをヌードマウスの膝関節に1.5x106個接種することで経日的に腫瘍（原発巣）を形成し、接種後早いマウスで２週間後から生体イメージングで検出可能な肺転移を呈する骨肉腫自然肺転移マウスモデルを構築した。該モデルにおいて原発巣では、組織学的に腫瘍細胞が骨組織を含む既存組織の破壊を伴いながら増生しており、一方、肺においては、原発巣の腫瘍細胞と同様の腫瘍細胞塊が散見され、転移巣の形成が確認された（図５）。
　実施例１　miR143の機能亢進による骨肉腫転移への影響 
　参考例２で作成した骨肉腫自然肺転移マウスモデルを用い、miR143と同等の機能を有するPre-miRTM miRNA143 precursor molecule （以下、便宜上「miRNA143 mimic」という（Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製））投与による肺転移抑制効果の検証を行った。143B Fluc 1.5x106 個を10匹のマウス膝関節に接種後、翌日から0.25 μg/μl miR143 mimic/ 0.05% アテロコラーゲン溶液を1回あたり200 μl経尾静脈に3日毎に7回投与した。コントロール群として、同様にmiR-NC1(Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製) 0.25 μg/μl/ 0.05% アテロコラーゲン溶液を1回あたり200μl経尾静脈に3日毎に10回投与した（図６）。
　143B Fluc膝関節接種後3週間では、miR-NC1(Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製)投与群において10匹中8匹（内2匹はそれぞれ19日目と20日目に死亡したが、いずれも2週間の時点で肺転移を確認済）に肺転移を示すシグナルが検出されたが、一方miRNA143 mimic（Ambion社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製）投与群における肺転移陽性マウスは、10匹中2匹のみであった。
　143B Fluc膝関節接種後4週間後にマウスを犠牲死させ、肺および原発巣を摘出した。肺の肉眼的観察により、miR-NC1(Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製)投与群においては黄白色の結節が多数観察されたが、miRNA143 mimic（Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製）投与群においては、生体イメージングにて肺転移巣を検出されたマウスを除き明らかな結節は観察されなかった。一方、原発巣の重量は、miR-NC1 (Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製)投与群で3.67±0.59 g、miRNA143 mimic（Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製）投与群で3.32 ± 0.66 gであり、両群間に有意差はなかった。また、原発巣における腫瘍細胞の増殖活性をPCNA発現を指標として、抗PCNA抗体（DAKO社）を用いた免疫組織化学染色法（Vectastain kit（Vector 社））で検討したが、両群間に差はなかった（図７）。 
　以上の結果より、miR143は、骨肉腫細胞に対し細胞増殖能へは影響せず、浸潤能を抑制することにより、その全身投与によりヒト骨肉腫細胞の肺における転移巣形成を抑制する核酸医薬としての可能性が示唆された。 
　実施例２　アテロコラーゲン製剤の調製
　500μg/ml のmiRNA143 mimic（Pre-miRTM miRNA143 precursor molecule :Ambion 社（合併により、2009年9月時点ではLife Technologies社）製）を含有する水溶液1mlと0.1%(w/w)のアテロコラーゲン溶液1mlを混合することにより、0.25μg/μl miR-143 mimic /0.05% アテロコラーゲン製剤2mlを得た。
　本発明の骨肉種転移抑制剤は、骨肉種の転移に起因する疾患に対する治療および予防に有用である。本発明の方法により、腫瘍の転移リスクを判定でき、腫瘍の転移リスクを判定するための剤、及び腫瘍の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２００８－２７６１８１（出願日２００８年１０月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (24)

  1. 　miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む、腫瘍の転移抑制剤。
  2. 　核酸が一本鎖または二本鎖である、請求項１に記載の転移抑制剤。
  3. 　miR143が配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチドである、請求項１に記載の転移抑制剤。
  4. 　核酸が配列番号１で表されるヌクレオチド配列又はその部分配列からなるＲＮＡ、或いはその修飾体である、請求項１に記載の転移抑制剤。
  5. 　核酸が配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡまたはその修飾体である、請求項１に記載の転移抑制剤。
  6. 　miR143を含む核酸が、miR143およびその前駆体からなる群から選ばれる少なくとも一種の核酸である、請求項１に記載の転移抑制剤。
  7. 　前駆体が、miR143のpri-miRNA又はpre-miRNAである、請求項６に記載の転移抑制剤。
  8. 　腫瘍が固形癌である、請求項１に記載の転移抑制剤。
  9. 　固形癌が骨肉腫である、請求項８に記載の転移抑制剤。
  10. 　腫瘍が転移性癌である、請求項１に記載の転移抑制剤。
  11. 　miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、miR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸とを併用してなる腫瘍の転移抑制剤。
  12. (a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
    (b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸
    を含む、腫瘍の転移に起因する疾患を予防するための剤。
  13. （A）(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
    (b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
    （B） 抗腫瘍剤
    とを併用してなる腫瘍の治療剤。
  14. 　腫瘍若しくは末梢血におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現レベル若しくは濃度を測定すること、及び該発現レベル若しくは該濃度と転移発生率との間の負の相関に基づき、腫瘍の転移リスクを判定することを含む、腫瘍の転移リスクを判定する方法。
  15. 　miR143又はmiR143及びmiR145を特異的に検出し得る核酸プローブを含む、腫瘍の転移リスクを判定するための剤。
  16. 　以下の工程を含む、腫瘍の転移又は腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法：
    （Ｉ）被検物質とmiR143又はmiR143及びmiR145の発現を測定可能な細胞とを接触させること；
    （ＩＩ）被検物質を接触させた細胞におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR143又はmiR143及びmiR145の発現量と比較すること；並びに
    （ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、miR143又はmiR143及びmiR145の発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移又は腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
  17. 　哺乳動物に対して、有効量のmiR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移を抑制する方法。
  18. 　哺乳動物に対して、有効量のmiR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移を抑制する方法。
  19. 　哺乳動物に対して、有効量の
    (a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
    (b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸
    を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移に起因する疾患を予防する方法。
  20. 　哺乳動物に対して、有効量の
    （A）(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
    (b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、並びに
    （B） 抗腫瘍剤
    を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の治療方法。
  21. 　腫瘍の転移抑制に使用するための、miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸。
  22. 　腫瘍の転移抑制に使用するための、miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む組合せ。
  23. 　腫瘍の転移に起因する疾患の予防に使用するための、
    (a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
    (b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む組合せ。
  24. 　腫瘍の治療に使用するための、
    （A）(a) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、或いは
    (b) miR143または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR143と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及びmiR145または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR145と同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸、及び
    （B） 抗腫瘍剤
    を含む組合せ。
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