WO2010046588A1 - Derives peptidiques et leur utilisation comme vecteurs de molecules sous forme de conjugues - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to peptide derivatives (peptides and pseudo-peptides) and their use as vectors of molecules of interest.
  • the invention also relates to conjugates containing a peptide derivative of the invention bound to a molecule of interest.
  • the peptides and prodrug conjugates of the invention can be used to vector molecules of pharmaceutical or diagnostic interest, such as, for example, therapeutic molecules, imaging or diagnostic agents, or molecular probes, through cell membranes, and in particular to promote their transport across the blood-brain barrier (BBB).
  • BBB blood-brain barrier
  • the brain is protected against potentially toxic substances by the presence of two main systems of physiological barriers: the BBB, and the cerebrospinal fluid-blood barrier (BS-LCR).
  • BBB is considered to be the main route for the uptake of plasma ligands. Its area is about 5000 times larger than that of BS-LCR.
  • the total length of the blood vessels constituents of the BBB is approximately 600 km.
  • Each cm 3 of cerebral cortex contains the equivalent of 1 km of blood vessels.
  • the total area of the BBB is estimated at 20 m 2 ⁇ De Boer et al, 2007, Clin. Pharmacokinet., 46 (7), 553-576).
  • cerebral endothelium which constitutes the BBB, represents a major obstacle to the use of potential drugs against many CNS disorders, but also a significant area of potential exchange between blood and nerve tissue.
  • BCECs brain capillary endothelial cells
  • BCECs are closely linked by tight junctions, compared to other endothelial cells of other organs, which are fenestrated. These tight junctions thus prevent any para-cellular transport through the BBB.
  • the BBB is considered as the major obstacle to be overcome in the development of new therapies intended to treat cerebral pathologies, and in particular for the use of molecules capable of treating CNS disorders (Neuwelt et al., 2008, Lancet Neurol, 7, 84-96).
  • One of the reasons why no effective treatment is currently available for the major brain pathologies is that the developers of candidates -medicines intended to treat pathologies of the brain, carry out internally research programs (brain drug-discovery programs) by investing little effort in the problem of the passage of the BBB and in the preferential targeting of the CNS, and in particular of the brain ⁇ brain drug-targeting programs), (Pardridge, 2003, Mol Interv., 3, 90-105).
  • a drug candidate must meet certain structural, physicochemical, pharmacochemical and pharmacological rules in order to have the best chance of becoming a drug to treat a CNS pathology or disorder (Pajouhesh et al., 2005, NeuroRx, 2 (4), 541-553).
  • the selectivity and specificity (pharmacological enhancement) of a molecule for its target are essential to its therapeutic activity (efficacy).
  • the bioavailability and potential toxicity (pharmaceutical enhancement) of a molecule are crucial for its future as a drug.
  • any molecule that could become a drug intended to treat a pathology or disorder of the CNS must firstly pass through the BBB, secondly, retain its biological activity, and have good pharmacokinetic properties (PK), adsorption, metabolism, distribution and excretion (ADME) and pharmacodynamics (PD), with low toxicity (Tox).
  • PK pharmacokinetic properties
  • ADME adsorption, metabolism, distribution and excretion
  • PD pharmacodynamics
  • Tox low toxicity
  • the major problem in the treatment of disorders and pathologies of the CNS lies therefore in the fact that the administered molecules do not pass the BBB and therefore can not reach their target (s) in the CNS.
  • the endothelial cells of CNS vessels and capillaries that make up the BBB hinder molecules that can not pass from blood to nervous tissue.
  • these endothelial cells and the astrocyte feet surrounding them constitute a physical barrier related in particular to the existence of tight junctions between the endothelial cells which limit / prevent any passage / transport by the para-cellular pathway, and also a fence physiological, since these cells have effective efflux systems that restrict any passage / transport by the trans-cellular pathway.
  • MDR multidrug resistant transport proteins
  • P-gp which is mainly localized on the luminal surface of the endothelial cells of the cerebral capillaries, is an essential element in the physiological barrier function of the BBB preventing the entry into the brain of most xenobiotics but also candidates. drugs and other molecules of therapeutic interest that may be active in the CNS.
  • Neurosurgical approaches may be implemented by direct cerebral intraventricular injection of the active substance, intracerebral injection or intrathecal infusion, or by disruption of the BBB (temporary break in the integrity of the BBB).
  • intraventricular infusion involves placing a catheter in the ventricles (Aird, 1984, Exp Neurol, 86, 342-358).
  • This highly invasive technique is not effective for the transport of active substances in the cerebral parenchyma.
  • the volume of flow from the cerebrospinal fluid to the cerebral parenchyma during the delivery of a drug by intraventricular infusion is governed by an abnormally slow diffusion of its convection (of its transport), because the brain has no intra-parenchymal volume flow.
  • the diffusion of an active substance in the brain decreases very rapidly from the injection site to the site of injury. Indeed, the brain concentration of an active substance decreases by 90% at a distance of 500 microns from its injection site.
  • Intrathecal infusion involves placing a catheter in the brain connected to a pump that delivers the active substance at a predefined rate. Because the brain is the only organ that does not have a lymphatic system, normally used to bring extracellular fluids back to the general circulation, the distribution of an active substance by intrathecal infusion at the cerebral level is very slow. This decreases the concentration of the active substance at the site of injury.
  • the temporary interruption of the impermeability of the BBB is associated with a transient opening of the tight junctions of the endothelial cells of the cerebral capillaries. This is the case of vasoactive substances such as leukotrienes or bradykinins ⁇ Baba et al, 1991, J. Cereb. Blood Flow Metab., 11, 638-643).
  • This strategy is also invasive and requires arterial access to the carotid artery in subjects / patients sedated.
  • the major problem with the temporary break in the integrity of the BBB, besides the expenses related to the radiologist's act for access to the carotid artery, is that the BBB only remains open for a short period of time, limiting indeed the possibility of delivering a drug in chronic.
  • the pharmacological strategies for the transport of molecules include the trans-cellular diffusion of molecules made more lipophilic by the addition of lipid groups on the active substance (Transcellular Lipophilic Diffusion or TLD) or the use of liposomes (Zhou et al. al., 1992, J. Control Release, 19, 459-486), and ion adsorption transport via positively charged or cationized carrier molecules of the active molecule (Adsorptive-Mediated Transport or AMT).
  • lipid group allows the chemical conversion of hydrophilic molecules into more lipophilic molecules, in particular through prodrug approaches.
  • the synthesis of such compounds leads to molecules that exceed the optimal transport threshold for crossing the BBB, especially as regards the molecular weight which becomes greater than the optimum limit of 450 Daltons (Pajouhesh et al, 2005, NeuroRx, 2 (4), 541-553).
  • liposomes or even small vesicles or nanoparticles are generally too big, not specific enough for the BBB, and therefore relatively ineffective for the transport of molecules of therapeutic interest (or imaging or diagnostic agents, or any other molecule such as a molecular probe) through the BBB (Levin, 1980, J. Med Chem, 23, 682-684, Schackert et al. al, 1989, Selective Cancer Ther., 5, 73-79).
  • TLDs lipidization technologies
  • AMT advanced cellular cancer
  • the main problem encountered is the low specificity to specifically target and cross the BBB compared to other cell membranes.
  • the AMT is based on cationic molecules adsorbed on cells whose membrane is negatively charged, which is the case of most cells.
  • the decrease in plasma AUC values of the drug, their generally limited use in vectorization of small molecules, and their cytotoxicity are all factors that penalize the vectorization approach via AMT.
  • Physiological approaches to vectorization involve exploiting the different mechanisms of natural transport at the level of the BBB. These mechanisms of active transport of molecules through the BBB are either via coupling to a receptor-specific substrate or by molecular mimicry with the carrier specific substrate (Carrier-Mediated Transport or CMT), or via coupling or ligand fusion specifically targeting a receptor (Receptor-Mediated Transport or RMT).
  • CMT Carrier-Mediated Transport
  • RMT Receptor-Mediated Transport
  • L-DOPA Parkinson's disease
  • melphalan brain cancer
  • ⁇ -methyl-DOPA artificial hypertension
  • gabapentin epilepsy
  • CMT broad neutral amino acid transporter
  • RMT uses a receiver-dependent transport system.
  • the vectorization is carried out via endocytosis mechanisms by targeting endogenous receptors / transporters present in the cerebral capillaries.
  • endogenous receptors / transporters present in the cerebral capillaries include the transferrin receptor (TfR), the insulin receptor (IR), the low-density lipoprotein receptors (LDL) for the transport of cholesterol including the LDL receptor (LDLR) and members of the low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP) family, or the insulin-like growthfactor (IGFR) receptor, the diphtheria toxin receptor (DTR) ) or heparin binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF), as well as scavenger receptors (SCAV-Rs) including the scavenger receptor class B type I (SR-BI).
  • TfR transferrin receptor
  • IR insulin receptor
  • LDL low-density lipoprotein receptors
  • IGFR insulin-like growthfactor
  • DTR diphtheria toxin receptor
  • receptors on the membrane of an endothelial cell of the BBB bind their ligand, resulting in endocytosis of the receptor / transporter complex and its ligand in a vesicle that forms on the surface of the cell. and then enters the endothelial cell of the BBB.
  • the ligand / receptor complex can pass through the endothelial cell (transcytosis), and thus cross the BBB to act in the nerve tissue.
  • This process of RMT does not depend on the size of what is being endocyted.
  • the RMT is a mechanism that allows the transport from the blood into the brain of molecules such as insulin, iron-carrying proteins, cholesterol, various peptide derivatives and proteins, etc.
  • transferrin is used as a ligand vector of TfR on the BBB (Jefferies et al., 1984, Nature, 312, 162-163, Friden et al, 1983, Science, 259, 373-377, Friden, 1994, Neurosurgery , 35, 294-298), and the molecule to be transported (active substance) is coupled to transferrin (ligand vector).
  • this vectorization strategy using a macromolecule allows an increase in the passage of conjugated molecules of interest through the BBB, it has some disadvantages.
  • the coupling of the molecule to the vector is generally done by methods of gene expression (fusion) thus limiting the number of molecules to be transported to only polypeptides or proteins.
  • the coupling system of the molecule to the vector is rather complex, a traditional chemical or biochemical coupling does not make it possible to obtain macro-molecular systems well defined from a structural and molecular point of view.
  • the present invention makes it possible to overcome these disadvantages.
  • the invention shows that it is possible to design peptides or pseudo-peptides of reduced size capable of carrying through the cell membranes, and more specifically the BBB, substances of mass and / or volume.
  • the invention thus proposes novel peptides, conjugates and compositions, making it possible to improve the bioavailability of molecules of interest, and in particular to improve their access (targeting) to the CNS.
  • the inventors have developed peptide derivatives capable of binding human LDLR.
  • the inventors have shown that these derivatives were able to cross the BBB.
  • the inventors have also shown that these derivatives make it possible to convey, in the cells of the BBB, molecules of therapeutic or diagnostic interest.
  • the inventors have developed peptides capable of binding LDLR without competition with the natural ligand, and thus without interference with LDL transport. These peptide derivatives therefore represent new products (vectors) particularly advantageous for the design and vectorization of drugs or diagnostic agents, in particular to reach the CNS.
  • An object of the invention thus resides in a peptide or pseudo-peptide comprising a sequence of natural and / or non-natural amino acids, characterized in that it contains at most 30 amino acid residues and in that binds human LDLR to the surface of cell membranes.
  • the peptides comprise at least 5 amino acid residues, preferably at least 6, 7, or 8.
  • the peptides of the invention also bind murine LDLR.
  • the peptides of the invention have the ability to pass the BBB and potentially the membranes of cancerous or infectious cells.
  • Another subject of the invention relates to a conjugate comprising a peptide or pseudopeptide as defined above coupled to a substance of interest.
  • the coupling is advantageously covalent and can be made to dissociate after the passage of cell membranes, in order to release the substance interest in a site of interest.
  • the release of the substance can take place for example passively or under the action of enzymes or specific physiological conditions.
  • Another subject of the invention relates to a process for the preparation of a conjugate as defined above.
  • Another subject of the invention relates to a pharmaceutical or diagnostic composition comprising a conjugate of the invention.
  • Another subject of the invention relates to the use of a peptide or pseudo-peptide, or a conjugate, as defined above, for the preparation of a medicament, a diagnostic or imaging agent.
  • Another object of the invention relates to a method for improving or allowing the passage of a molecule through the BBB, comprising the coupling of this molecule to a peptide or pseudo-peptide as defined above.
  • Another object of the invention resides in an improved method of treating a subject in a subject with a medicament, the improvement consisting in coupling this drug to a peptide or pseudo-peptide as defined above.
  • the invention is usable in any mammal, especially any human being.
  • FIG. 4 Western blot performed on CHO cell lines constitutively expressing the hLDLR-GFP or GFP fusion proteins (used as a control). A 190 kDa band corresponding to the size of the hLDLR-GFP fusion protein is detected with the anti-hLDLR antibody.
  • a - CHO-hLDLR-GFP cells expressing hLDLR-GFP (green) incubated with DiI-LDL (red), the red and green markings overlap is visible in yellow / orange, note the strong labeling of the cells.
  • B Cells of a CHO-TfR-GFP line expressing hTfR-GFP (green) incubated with DiI-LDL (red): absence of binding and endocytosis of DiI-LDL.
  • C CHO-hLDLR-GFP cells expressing hLDLR-GFP (green) incubated with Texas Red-coupled transferrin (red): absence of Tf ligand binding and endocytosis.
  • CHO lines stably expressing A - Ia GFP alone (green), and B - hLDLR-GFP (green), and immunoblotting with anti-viral coat protein of a clone of bacterial viruses with a peptide (SEQ ID NO: 1) displayed for the hLDLR (red dots).
  • the cell nuclei are marked with Hoechst (blue, Al and Bl).
  • the fluorescence of GFP is visible in green (A2 and B2), that of the labeling of the viral envelope of the bacterial virus by the anti-viral protein antibody is visible in the red (A3 and B3) and the superposition of the red markings. and green is visible in yellow / orange (A4 and B4). Note that cells that do not express hLDLR at A do not fix bacterial viruses.
  • the signal in Q2 shows a combination of 2 signals on the cells that are positive on the one hand if the hLDLR-GFP is expressed (GFP fluorescence, horizontal axis) and on the other hand if bacterial viruses affine for this receptor are linked to cells via the peptides they present (labeling by immunocytochemistry, vertical axis).
  • a - CHO-hLD LR-GFP cells incubated with the anti-viral envelope protein antibody and its secondary APC antibody.
  • B CHO-hLDLR-GFP cells incubated with control (negative) bacterial viruses, the anti-viral envelope protein antibody and its secondary APC antibody.
  • C CHO-hLDLR-GFP Cells Incubated with a Clone of Bacterial Viruses Containing an Affinity Peptide for hLDLR (SEQ ID NO: 11), the Anti-Viral Envelope Protein Antibody and Its APC Secondary Antibody There is a significant displacement of the signal at Q2.
  • the signal in Q2 shows a combination of 2 signals on the cells which are positive on the one hand if the hLDLR is expressed (labeling by immunocytochemistry, horizontal axis) and on the other hand if bacterial viruses affine for this receptor are linked to the cells via the peptides they present (immunocytochemical labeling, vertical axis).
  • a - Human fibroblasts incubated with the anti-viral envelope protein antibody and its secondary APC antibody.
  • B - Human fibroblasts incubated with the anti-LDLR antibody and its Alexa 488 secondary antibody.
  • C - Human fibroblasts incubated with control (negative) bacterial viruses, anti-viral envelope protein antibody, anti-LDLR antibody and secondary antibodies APC and Alexa 488.
  • D - Human Fibroblasts incubated with a clone of bacterial viruses having the peptide SEQ ID NO: 12 affine for hLDLR, the anti-viral envelope protein antibody, the anti-LDLR antibody and APC secondary antibodies and Alexa 488. A significant displacement of the signal is observed.
  • a - HUVEC endothelial cells incubated with the viral envelope anti-protein antibody and its secondary APC antibody.
  • B - HUVEC endothelial cells incubated with the anti-LDLR antibody and its Alexa 488 secondary antibody.
  • C - HUVEC endothelial cells incubated with control (negative) bacterial viruses, anti-viral envelope protein antibody, anti-LDLR antibody and secondary antibodies APC and Alexa 488.
  • D - HUVEC endothelial cells incubated with a clone of bacterial viruses having the cyclic peptide (SEQ ID NO: 11) affine for the hLDLR, the viral envelope antiprotein antibody, the anti-LDLR antibody and the APC and Alexa 488 secondary antibodies. signal in Q2.
  • E-HUVEC endothelial cells incubated with a clone of bacterial viruses presenting the linear peptide (SEQ ID NO: 21) labeled for the hLDLR, the viral envelope antiprotein antibody, the anti-LDLR antibody and the secondary antibodies APC and Alexa 488. There is a significant displacement of the signal in Q2.
  • Figure 12 FACS evaluation on HUVEC cells of a competition between the peptides presented by the affinity bacterial viruses for LDLR and its natural ligand LDL.
  • a - HUVEC endothelial cells incubated with the viral envelope anti-protein antibody and its secondary APC antibody.
  • D - HUVEC endothelial cells incubated with control (negative) bacterial viruses, anti-viral envelope protein, anti-LDLR antibody,
  • LDL, and APC and Alexa 488 secondary antibodies No effects are observed due to the presence of LDL.
  • E-HUVEC endothelial cells incubated with a clone of bacterial viruses presenting the linear peptide (SEQ ID NO: 21) affine for hLDLR, the antiprotein antibody of the viral envelope, the anti-LDLR antibody and the secondary antibodies APC and Alexa 488.
  • F - HUVEC endothelial cells incubated with a clone of bacterial viruses presenting the linear peptide (SEQ ID NO: 21) affine for hLDLR, the antiprotein antibody of the viral envelope, the anti-LDLR antibody, the LDL and the APC and Alexa 488 secondary antibodies.
  • LDL strongly decreases the binding of the peptides SEQ ID NO: 21 presented by the bacterial viruses.
  • G - HUVEC endothelial cells incubated with a clone of bacterial viruses having the cyclic peptide (SEQ ID NO: 11) affinity for hLDLR, viral envelope antiprotein antibody, anti-LDLR antibody and secondary antibodies APC and Alexa 488.
  • the cerebral vessels are labeled with anti-mouse IgG, in green (A-C), the bacterial viruses are labeled with an anti-viral envelope protein, in red (B-D).
  • Figure 14 General scheme of synthesized peptides conjugated to rhodamine or S-Tag, with C-terminal spacer arm (C-term).
  • the signal in Q2 shows a combination of 2 signals on the cells which are positive on the one hand if the hLDLR-GFP is expressed (fluorescence GFP, horizontal axis) and on the other hand if the peptide controls, and the peptide SEQ ID NO 11 affin for this receptor is bound to cells (immunocytochemical labeling, vertical axis).
  • the invention relates to peptide derivatives capable of binding human LDLR and their use in the pharmaceutical field, in particular for conveying, in the cells of the BBB, molecules of therapeutic or diagnostic interest.
  • Human LDLR is a transmembrane protein of 839 amino acids comprising three regions: the extracellular region (1-768), the transmembrane region (768-790) and the cytoplasmic region (790-839).
  • the extracellular region is divided into two subregions: that of LDL binding (1-322) and that outside the LDL binding zone (322-768) (see WO2007 / 014992).
  • LDLR natural ligands are LDL and more particularly apo lipoprotein B (ApoB) and apo lipoprotein E (ApoE) constitutive of LDL particles thus allowing the transport of cholesterol, contained in these particles, through cell membranes. and more particularly the BBB.
  • LDLR allows the transcytosis of LDL particles through the BBB (Dehouck et al., 1997, J. CeIl Biol, 138 (4), 877-889), via a process of RMT, in particular endosomal vesicles that prevent lysosome fusion.
  • BBB BBB
  • RMT endosomal vesicles that prevent lysosome fusion.
  • the invention shows that such peptides or pseudo-peptides are selective for certain cell membranes and can be used to deliver both small chemical molecules (whether or not they are lipophilic), as well as macro molecules such as proteins. therapeutic interest.
  • the vector peptides or pseudo-peptides can be easily synthesized chemically, and most of the molecules of therapeutic interest, or imaging or diagnostic agents can be coupled to the peptide or pseudo-peptide vector in a simple and effective way. through a prodrug strategy via a spacer arm (synthesis via linker) or by direct coupling (tandem synthesis) between the two entities ( Figure 2).
  • the peptides and pseudo-peptides of the invention can be designed to adopt a cyclic configuration, and therefore more resistant to proteolysis.
  • the peptides and pseudopeptides of the invention can be designed to bind LDLR without competition with the natural ligand.
  • the invention has indeed allowed the discovery of a new binding site on LDLR, different from the LDL binding site. Therefore, the use of peptides and pseudo-peptides of the invention targeting this site allows efficient transport without substantial disturbance of the binding of the natural ligand.
  • linear or cyclic peptides or pseudo-peptides which it has developed can be used as vectors of molecules of therapeutic interest, or of imaging or diagnostic agents, or any other molecule such as a molecular probe, in the treatment, imaging and / or diagnosis of neurological pathologies, as well as cerebral or non-cerebral infectious or cancerous pathologies.
  • linear or cyclic peptides or pseudo-peptides described in the present invention possess the ability to target cellular receptors / transporters, particular cell types and / or to pass cell membranes including those physiological barriers of the brain and more particularly the BBB or blood-retinal barrier (BSR).
  • BBB blood-retinal barrier
  • linear or cyclic peptides or pseudo-peptides described in the present invention possess the capacity to target cellular receptors / transporters, particular cell types, in particular cancerous cells, nervous or non-nervous tissue, and / or to pass cell membranes, particularly those physiological barriers of the CNS and more particularly the blood-brain barrier (BHT) at the level of tumors of the nervous tissue.
  • BHT blood-brain barrier
  • linear or cyclic peptides or pseudo-peptides described in the present invention possess the capacity to target cellular receptors / transporters, particular cell types and / or to pass cell membranes, in particular those of physiological barriers of the CNS, to treat more particularly infectious diseases cerebral or other, bacterial, viral, parasitic or fungal.
  • linear or cyclic peptides or pseudo-peptides described in the present invention possess the ability to bind to a murine or human LDLR of the cell membrane and to cross said membrane through this receptor by transcytosis.
  • linear or cyclic peptides or pseudo-peptides described in the present invention possess the ability to bind to the LDLR at the cell membrane surface of the murine and human brain physiological barriers and to cross the physiological barrier through LDLR by MRT. .
  • the invention therefore relates more particularly to peptides and pseudo-peptides which have an affinity for LDLR, and their use as vectors of molecules of therapeutic interest or of imaging or diagnostic agents, or of any other molecule such as a molecular probe.
  • peptides can be used in many indications, in particular in the treatment, imaging and / or diagnosis of neurological pathologies, as well as infectious or cancerous pathologies, cerebral or otherwise.
  • An object of the invention therefore resides in a peptide or pseudo-peptide comprising a sequence of natural and / or non-natural amino acids, characterized in that it contains at most 30 amino acid residues, preferably at most 25 amino acids. and in that it binds human LDLR to the surface of cell membranes.
  • the term "peptide” or "pseudo-peptide” denotes a molecule comprising a chain of amino acid residues, which may or may not be natural, optionally modified or functionalized, and linked together by peptide bonds, which are not peptidic. or modified peptides.
  • the peptides may or may not be cyclic, and may have, where appropriate, one or more protected ends.
  • a preferred object of the invention resides in a peptide or pseudo-peptide as defined above, characterized in that it has the ability to pass the BBB.
  • the peptides or pseudo-peptides of the invention correspond to the following general formula (I):
  • X is a group comprising 1 to 11 consecutive natural and / or non-natural amino acids
  • Y is a group comprising 1 to 11 consecutive natural and / or non-natural amino acids
  • X and / or Y contains at least one amino acid residue allowing the formation of a ring within the peptide
  • M denotes methionine or one of its isosteres or one of its analogues
  • P denotes proline or one of its isosteres or one of its analogues
  • X is a group of formula (Xaa) 1 Z (Xaa) J and Y is a group of formula (Xaa) kW (Xaa) i, in which Xaa represents a natural or non-natural amino acid, including a D-configuration amino acid, an uncoded amino acid, or an amino acid containing a peptidomimetic bond, Z and W represent two identical or different amino acids for cyclizing the peptide, and i, j, k and 1 are integers, identical or different, between 0 and 5.
  • the invention results in particular from the identification, by comparison strategies of the peptide ligand sequence, of motifs which provide binding and transport by LDLR but without competition with the natural ligand.
  • the absence of competition with the natural ligand shows that the binding motifs discovered by the inventors imply a new binding site on the LDLR, which constitutes an unexpected and particularly advantageous discovery in the context of the vectorization of compounds in vivo.
  • amino acids, natural or non-natural, constituting the X and Y groups of the peptides or pseudo-peptides of the invention may be identical or different and chosen from: glycine (GIy, G) or 2-aminoethanoic acid, sarcosine ( Sar) or N-methylglycine (MeGIy), N-ethylglycine (EtGIy), allylglycine (allylGly) or 2-aminopent-4-enoic acid, 2-cyclopentylglycine (Cpg), 2-cyclohexylglycine (Chg), 2,2-dipropylglycine (Dpg), 2- (3-indolyl) glycine (IndGly), 2-indanylglycine (IgI), 2-neopentylglycine (NptGly), 2-octylglycine (OctGly), 2- propargylglycine (Pra) or 2-amino pent-4
  • glycinol or 2-aminoethanol alanine (Ala, A) or 2-aminopropanoic acid, beta-alanine ( ⁇ -Ala) or 3-aminopropanoic acid, dehydroalanine, N-methylalanine, 3 cyclopropylalanine (Cpa), 3-cyclohexylalanine (Cha), 3-cyclopentylalanine, 3- (1-naphthyl) alanine (INaI), 3- (2-naphthyl) alanine (2NaI), 3- (3-cyclopentylalanine); pyridyl) alanine, 3- (2-thienyl) alanine (Thi), palaninol or 2-aminopropanol, valine (Val, V) or 2-amino-3-methylbutanoic acid, N-methylvaline (MeVaI), norvaline (Nva) and its methylated and / or
  • wing N-methyliso leucine (Melle), isoleucinol or 2-amino-3-methylpentanol,
  • aspartic acid Aspartic acid (Asp, D) or 2-aminobutanedioic acid and its derivatives esterified or laterally amidated, 3-methylaspartic acid, aspartinol, asparagine (Asn, N) or 2-amino-3-acid carbamoylpropanoic or 2-aminosuccinamic acid and its N-substituted derivatives, N-ethylasparagine (EtAsn), asparaginol,
  • glutamic acid Glu, E or 2-aminopentanedioic acid and its derivatives esterified or laterally amidated, pyroglutamic acid (Pyr) or pidolic acid or 5-oxoproline, gamma-carboxyglutamic acid or 4-carboxyglutamic acid (GIa), glutarinol, glutamine (GIn, Q) or 2-amino-4-carbamoylbutanoic acid and its N-substituted derivatives, glutaminol, diaminoethanoic acid, 2,3-diaminopropanoic acid (Dpr or Dap) ), 3-mercaptopropanoic acid (Mpa), 2-amino-3-guanidinopropanoic acid
  • threonine Thr, T
  • 2-amino-3-hydroxybutanoic acid and its O-substituted derivatives (ethers, etc.)
  • allo-threonine allo-Thr
  • allo-Thr allo-Thr
  • O-substituted derivatives ethers, etc.
  • threoninol phenylalanine (Phe, F) or 2-amino-3-phenylpropanoic acid
  • tryptophan or 2-amino-3- (1H-indol-3-yl) propanoic acid and its N-substituted derivatives, 2-methyltryptophan, 5-hydroxytryptophan (5-HTP), tryptophanol , cysteine (Cys, C) or 2-amino-3-mercaptopropanoic acid and its S-substituted derivatives, S-acetylcysteine or 2-amino-3- (acetylthio) propanoic acid, selenocysteine (Sec, U) or acid 2-amino-3- (seleno) propanoic acid, cysteinol, methionine (Met or M) or 2-amino-4- (methylthio) butanoic acid, homomethionine or 3-amino-5- (methylthio) pentanoic acid, methioninol,
  • proline Pro, P
  • pyrolidine-2-carboxylic acid homoproline or 2- (2-pyrrolidinyl) ethanoic acid, 3-hydroxyproline (3Hyp), 4-hydroxyproline
  • peptides comprising at least 1, preferably 2, amino acid residues which may allow cyclization of the peptide are preferred.
  • amino acids are typically selected from Cys, Mpa, Pen, dehydroalanine, or allylGly.
  • Cyclization is typically achieved by forming a disulfide bridge between two cysteine residues (or Pen), one present in group X, the other in group Y.
  • a cysteine in N-terminal position (N-term) can also be replaced by an Mpa for cyclization via a disulfide bridge.
  • a cysteine residue can also be replaced by dehydroalanine, for cyclization via a lanthionine bridge, or by allylGly for metathesis cyclization via a dicarba bridge.
  • a lactam bridge can be created between the lateral acid function of a Glu (or Asp) residue and a side amino function on a N-term Lys or amine.
  • a cyclization between the amino function N-term and the C-terminal or C-term acid function (head / tail) can be carried out via an amide bond, just like a cyclization between the amine side function of a Lys and the C-term acid function of the peptide.
  • At least one of the groups X and Y contains a cysteine residue.
  • the residues Z and W each represent a cysteine.
  • M represents a methionine residue, or one of its isosteres or one of its analogues.
  • the isosteres or analogs of methionine are preferably chosen from Nie, homomethionine, Pen, Mpa.
  • P represents a proline residue, or one of its isosteres or one of its analogues.
  • the isosteres or proline analogues are preferably selected from cyclopentene isosteres, 3,4-dehydroproline, 3,4-methanoproline, homoproline, 3Hyp, 4Hyp, 3-methylproline, 4-aminoproline, 4 -oxoproline, Thz, 2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid, Idc, Pip, Mp, 4-oxopipecolic acid, 4-hydroxypipecolic acid, amino-1-cyclohexane carboxylic acid.
  • R represents an arginine residue, or one of its isosteres or one of its analogues.
  • the isosteres or analogs of arginine are preferably chosen from homoarginine, N-hydroxyarginine, Agp, Agb, Cit, 2-amino-5- (4-carbamimidoylphenyl) pentanoic acid, 2-amino acid (5H-imidazol-2-ylamino) pentanoic acid, Orn, Lys and its isosteres / analogs, S-aminoethylcysteine, 3-methyl-5-aminoethylcysteine, hLys, ⁇ yl, a ⁇ yl, MeLys, ⁇ is and its isosteres / analogues, Nie, diaminoethanoic acid, Dpr, Dbu.
  • i is an integer selected from 0, 1, 3 or 4;
  • j is an integer selected from 0, 3 or 4;
  • k is an integer selected from 0, 1 or 3; and / or - 1 is an integer selected from 0, 1 or 3.
  • Preferred peptides or pseudo-peptides within the meaning of the invention correspond to the general formula (Xaa) i-Cys- (Xaa) 1-Met-Pro-Arg- (Xaa) k-Cys- (Xaa) 1, in which Xaa denotes any natural or non-natural amino acid residue and i, j, k and 1 are integers, identical or different, between 0 and 5.
  • Xaa denotes any natural or non-natural amino acid residue and i, j, k and 1 are integers, identical or different, between 0 and 5.
  • i 0, 1, 3 or 4
  • j 0, 3 or 4
  • k 0, 1 or 3
  • / or 1 0, 1 or 3.
  • Particular examples of peptides according to the invention having the formula (I) are described in the following sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 30 to SEQ ID NO: 65:
  • SEQ ID NO: 33 DSALCMPRLRGCDPR
  • SEQ ID NO: 34 DSGACMPRLRGCDPR
  • SEQ ID NO: 40 DSGLCMPRLRGCDPA
  • these peptides bind LDLR without competition with LDL, exhibit high affinity, are able to cross the BBB and carry molecules of interest.
  • the peptides of formula (I) having a cyclic configuration are preferred. Particularly preferred is the peptide comprising the sequence SEQ ID NO: 11, or a sequence derived therefrom, for example SEQ ID NO: 30 and 48.
  • the peptides or pseudo-peptides of the invention are chosen from the peptides of sequence SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 29: SEQ ID NO: 12, MT VMPTGL WNPLIP S; SEQ ID NO: 13, SASWFAVPIPPLRLE; SEQ ID NO 14, MTPMSTPRMLPVYVA; SEQ ID NO: 15, MTATHLSTLFQPLTY; SEQ ID NO: 16, MSPIPPAASTWANTL; SEQ ID NO: 17, MTANPLQNAPGPLSL; SEQ ID NO 18, MQTAPPPPLTRVQWS; SEQ ID NO 19, GTPRMHIPLNVDHLP; SEQ ID NO.
  • LTLPPISGLSSYPLP LTLPPISGLSSYPLP; SEQ ID NO: 21, TPSAHAMALQSLSVG; SEQ ID NO 22, LTLPPISGLSSYPLP; SEQ ID NO. 23, MGTLNAPTAYPQDSL; SEQ ID NO 24, LTNPPAYLPQNTDPH; SEQ ID NO: 25, MGLPLPYIQTILHTP; SEQ ID NO. 26, SAALIAMSSFKSITA; SEQ ID NO: 27, SGFAFARSVPTESRR; SEQ ID NO: 28, MTSPYMSLPPSTDDM; SEQ ID NO 29, LTNPPAYLPQNTDPH.
  • the linear or cyclic peptides or pseudo-peptides of the invention may comprise modified peptide, non-peptide and / or peptide bonds.
  • the peptides or pseudo-peptides comprise at least one peptidomimetic bond, preferably chosen from the intercalation of a methylene group (-CH 2 -) or phosphate (-PO 2 -), secondary amine.
  • alpha-azapeptides alpha-alkylpeptides, N-alkylpeptides, phosphonamidates, depsipeptides, hydroxymethylenes, hydroxyethylenes, dihydroxyethylenes, hydroxyethylamines, retro-inverso, methyleneoxy, cetomethylene, esters, phosphinates , phosphinic, phosphonamides, carba analogues.
  • the peptides or pseudo-peptides of the invention comprise a function N-term and / or C-term respectively protected, for example, by acylation, or by amidation or esterification.
  • the peptides or pseudo-peptides of the invention can be synthesized by any technique known per se to those skilled in the art (chemical, biological, genetic synthesis, etc.). They can be stored as is, or formulated in the presence of a substance of interest or any acceptable excipient.
  • amino acids referred to as exotic, that is to say, non-coded
  • a peptide sequence containing one or more peptidomimetic linkages may in particular include the intercalation of a methylene (-CH 2 -) or phosphate (-PO 2 - ), secondary amine (-NH-) or oxygen (-O-).
  • lipid derivative or phospholipidic derivative
  • a constituent of a nanoparticle so as to incorporate the peptide or pseudo-peptide of the invention in a lipid membrane such as that of a liposome consisting of one or more lipid layers or bilayers, or a nanoparticle.
  • the peptides of the invention, or part of them of protein nature can also be obtained from a nucleic acid sequence coding for it.
  • the subject of the present invention is also a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleic sequence coding for a peptide as defined above. More particularly, the invention relates to a nucleic acid molecule comprising at least one sequence coding for a compound of general formula (I) or corresponding to one of the sequences SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 29 or a part of this one of protein nature.
  • These nucleic acid sequences may be DNA or RNA and may be associated with control sequences and / or inserted into biological expression vectors. The biological expression vector used is chosen according to the host in which it will be transferred.
  • nucleic acids and biological expression vectors are particular objects of the invention, and are useful for producing the peptides of the invention, or part thereof of a protein nature, in a cellular host.
  • the preparation of these biological expression vectors as well as the production or expression in a host of the peptides can be carried out by the techniques of molecular biology and genetic engineering well known to those skilled in the art.
  • the peptides of the invention are particularly useful for formulating substances of therapeutic or diagnostic interest, and especially for promoting their biodistribution and / or their passage through the BBB.
  • an object of the invention lies in the use of a linear or cyclic peptide or pseudo-peptide as defined above, as a vector for the transfer / transport of molecules of therapeutic interest, or as agents for imaging or diagnostic, or any other molecule.
  • Another subject of the invention is the use of a linear or cyclic peptide or pseudo-peptide as defined above for the preparation of a drug capable of crossing the BBB.
  • Another object of the invention relates to a method for enabling or improving the passage of a molecule through the BBB, comprising coupling the molecule to a peptide or pseudo-peptide of the invention.
  • linear or cyclic peptides or pseudo-peptides of the invention make it possible to cross the BBB to an active substance that does not pass this barrier. They can therefore be used in the treatment, prevention or diagnosis of any disease affecting the CNS, but also as carriers of biological material (biotransporters) in studies conducted on various families of molecules with cell membrane models and more particularly of BBB.
  • biological material biological material
  • the present application describes various prodrug conjugate compounds comprising a peptide or pseudo-peptide as defined above.
  • conjugate refers to a molecule resulting from the combination of one or more peptides or pseudo-peptides of the invention and one or more molecules of interest.
  • the conjugation can be of a chemical nature, such as by means of a linker or spacer arm, or of a genetic nature, for example genetic recombination technology.
  • a fusion protein with for example a marker or tracer molecule (for example, GFP, ⁇ -galactosidase, etc.) or a therapeutic molecule (for example a growth factor, neurotrophic factor, etc.).
  • a marker or tracer molecule for example, GFP, ⁇ -galactosidase, etc.
  • a therapeutic molecule for example a growth factor, neurotrophic factor, etc.
  • VxDy (II) wherein V represents a linear or cyclic peptide or pseudo-peptide of the invention, D represents an active substance or of interest, and x and y are integers between 1 and 5. In a particular embodiment , x and y are equal to 1, where x is greater than y.
  • the active substance is an analgesic therapeutic peptide, dalargine.
  • the direct coupling (tandem synthesis) of this therapeutic peptide into N-term of the vector peptide SEQ ID NO: 48 gives the conjugate SEQ ID NO: 66, Y- (D) -AGFLR- (D) -CMPRLRGC.
  • Another particular object of the invention relates to a conjugate compound of formula (III) below:
  • VxLzDy (III) wherein V represents a linear or cyclic peptide or pseudo-peptide of the invention, L represents a spacer arm, D represents an active substance or of interest, x and y are integers between 1 and 5 and z is an integer between 1 and 10.
  • the active substance or of interest may be any molecule of pharmaceutical interest, in particular therapeutic, a diagnostic or medical imaging agent, or a molecular probe. It may be in particular any chemical entity having a biological interest such as a small chemical molecule (antibiotic, antiviral, immunomodulator, anticancer, anti-inflammatory, etc.), a peptide or polypeptide, a protein (enzyme , hormone, cytokine, apolipoprotein, growth factor, antigen, antibody or part of antibody), a nucleic acid (ribonucleic acid or deoxyribonucleic acid of human, viral, animal, eukaryotic or prokaryotic origin, vegetable, synthetic, etc.
  • a small chemical molecule antibiotic, antiviral, immunomodulator, anticancer, anti-inflammatory, etc.
  • a peptide or polypeptide a protein (enzyme , hormone, cytokine, apolipoprotein, growth factor, antigen, antibody or part of antibody)
  • a nucleic acid
  • the "substance of interest” can be any active ingredient of a drug, be it a chemical, biochemical, natural or synthetic.
  • the term "small chemical molecule” denotes a molecule of pharmaceutical interest having a molecular weight of up to 1000 Daltons, typically between 300 and 700 Daltons. Another particular object of the invention relates to a compound of formula (IV) below:
  • the coupling between V and D, or between V and L on the one hand and between L and D on the other hand can be achieved by any means of binding acceptable given the chemical nature , the size and the number of active substance (s) and associated peptide (s) or pseudo-peptide (s).
  • the coupling can thus be carried out by one or more covalent, hydrophobic or ionic bonds, cleavable or otherwise in a physiological medium or inside cells.
  • D can be coupled to V, where appropriate via L, at different reactive groups, and in particular at one or more N-term and / or C-term ends of V and / or at a or more reactive groups carried by the side chains of the natural amino acids or not, constituting V.
  • the coupling can be carried out at any site of the peptide or pseudo-peptide, in which functional groups such as -OH, -SH, -CO 2 H, -NH 2 , -SO 3 H, -
  • a molecule of therapeutic interest, or a diagnostic agent (or medical imaging agent) or any other molecule such as a molecular probe may be linked (coupled) to the linear or cyclic peptide or pseudo-peptide vector of the invention by a covalent bond either at the N-term or C-term termini, or at the level of the reactive groups borne by the side chains of the natural amino acids or not, of this peptide sequence.
  • the coupling can be carried out at any site of the active substance or of interest (molecule of therapeutic interest, diagnostic or medical imaging agent, any other molecule such as a molecular probe), where for example groupings such as -OH, -SH, -CO 2 H, -NH 2 , -SO 3 H, -PO 2 H are naturally present or have been introduced.
  • groupings such as -OH, -SH, -CO 2 H, -NH 2 , -SO 3 H, -PO 2 H are naturally present or have been introduced.
  • the interaction is sufficiently solid so that the peptide does not dissociate from the active substance until it has reached its site of action.
  • the preferred coupling according to the invention is a covalent coupling, but it could however be a non-covalent coupling.
  • the substance of interest can be coupled directly to the peptide (tandem synthesis) either at one of these terminal ends (N-term or C-term), or at the level of a side chain of one of the constituent amino acids of the sequence ( Figure 2).
  • the substance of interest can also be coupled indirectly via a linker or spacer arm (synthesis via linker), either at one of the terminal ends of the peptides, or at a side chain of a amino acids constituting the sequence ( Figure 2).
  • an object of the invention also resides in a process for preparing a conjugated compound as defined above, characterized in that it comprises a step of coupling between a peptide or pseudo-peptide V and a Substance D, where appropriate via L, preferably chemically, biochemically, enzymatically, or by genetic engineering.
  • Another subject of the invention relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises at least one conjugated compound as defined above and one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • Another subject of the invention relates to a diagnostic composition characterized in that it comprises a diagnostic or medical imaging agent consisting of a conjugated compound as defined above.
  • the conjugate can be used in the form of any pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salts is meant, for example and without limitation, pharmaceutically acceptable basic or acid addition salts, hydrates, esters, solvates, precursors, metabolites or stereoisomers, said vectors or conjugates charged with at least one substance of interest. .
  • salts refers to non-toxic salts, which can be generally prepared by reacting a free base with a suitable organic or inorganic acid. These salts retain the biological efficacy and properties of free bases.
  • Representative examples of such salts are water-soluble and water-insoluble salts, such as acetates, N-methylglucamine ammonium, ansonates (4,4-diaminostilbene-2,2'-disulfonates), benzenesulfonates, benzonates, bicarbonates, bisulfates, bitartrates, borates, hydrobromides, bromides, buryates, camsylates, carbonates, hydrochlorides, chlorides, citrates, clavulariates, dihydrochlorides, diphosphates, edetates, calcium edetates, edisylates, estolates, esylates, fumarates, gluceptates, gluconates, glutamates, glycolylars
  • compositions of the invention advantageously comprise a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle may be chosen from the vehicles conventionally used according to each of the modes of administration. Depending on the intended mode of administration, the compounds may be in solid, semi-solid or liquid form.
  • the active substance may be combined with: a) diluents, for example lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine; b) lubricants, for example silica, talc, stearic acid, its magnesium or calcium salt and / or polyethylene glycol; c) binders, for example magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, gum tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidone; d) disintegrants, for example starch, agar, alginic acid or its sodium salt, or effervescent mixtures; and / or e) absorbents, dyes, flavoring agents and sweeteners.
  • diluents for example lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine
  • lubricants for
  • the excipients may be, for example, mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate and pharmaceutical grade analogs.
  • the excipient may, for example, be a fat emulsion or suspension, or based on polyalkylene glycol, such as polypropylene glycol.
  • Liquid compositions, in particular injectable or to be included in a soft capsule can be prepared for example by dissolution, dispersion, etc. of the active substance in a pharmaceutically pure solvent such as, for example, water, physiological saline, aqueous dextrose, glycerol, ethanol, an oil and its analogues.
  • compositions or conjugates of the invention may be administered by any suitable route and, in a non-limiting manner by the parenteral route, such as, for example, in the form of injectable preparations subcutaneously, intravenously or intramuscularly; orally (or per os), such as, for example, in the form of coated tablets or not, capsules, powders, granules, suspensions or oral solutions (such a form for oral administration can be either immediate release, either prolonged or delayed release); - rectal route, such as, for example, in the form of suppositories; - Topical route, particularly transdermal, such as, for example, in the form of patches, ointments or gels; - intra- nasal, such as aerosols and sprays; - perlingual route; - intraocular route.
  • the parenteral route such as, for example, in the form of injectable preparations subcutaneously, intravenously or intramuscularly; orally (or per os), such as, for example, in the form
  • compositions typically comprise an effective dose of a peptide or pseudo-peptide or conjugate of the invention.
  • a "therapeutically effective dose” as herein described is understood to be the dose that provides a therapeutic effect for a given condition and administration regimen. This is typically the average dose of an active substance to be administered to substantially improve some of the symptoms associated with a disease or condition. For example, in the treatment of cerebral or non-brain cancer, a pathology, a lesion or a disorder of the CNS, the dose of an active substance which decreases, prevents, delays, suppresses or stops the any of the causes or symptoms of the disease or disorder would be therapeutically effective.
  • a "therapeutically effective dose" of an active substance is not required to cure a disease or disorder but will provide treatment for that disease or disorder so that its onset is delayed, hindered or prevented, or that its symptoms are alleviated, or the term is modified or, for example, less severe or the patient's recovery is accelerated.
  • the "therapeutically effective dose” for a particular individual will depend on various factors, including the activity / efficacy of the active substance, its time of administration, route of administration, rate of excretion and metabolism, associations / drug interactions and the severity of the disease (or disorder) treated as a preventative or curative, as well as age, body weight, overall health status, sex and / or diet of the patient.
  • the conjugates and compositions of the invention may be used for the treatment, prevention, diagnosis or imaging of numerous pathologies, in particular pathologies affecting the CNS, infectious pathologies or cancers.
  • the invention relates to the use of conjugates or pharmaceutical compositions as described above for the treatment or the prevention of CNS pathologies or disorders, of cerebral cancer tumors or of other cancerous cells, and of infectious pathologies. cerebral or otherwise, bacterial, viral, parasitic or fungal.
  • the invention also relates to the use of conjugates or pharmaceutical compositions as described above for the diagnosis or imaging of CNS pathologies or disorders, of cerebral cancer tumors or of other cancerous cells, and of cerebral infectious pathologies or others, bacterial, viral, parasitic or fungal.
  • the invention also relates to the use of a conjugate or a composition as defined above for the treatment, imaging and / or diagnosis of a cerebral cancer tumor or of another type of cancer cells.
  • hypocholesterolemia This hypocholesterolemia is the consequence of overuse of cholesterol by cancer cells.
  • the latter induce an increase in the level of expression of LDLR in the tumoral organs in order to survive (Henricksson et al., 1989, Lancet, 2 (8673), 1178-1180).
  • LDLR low-denothelial ase.
  • LDLR low-density lipoprotein
  • tumor cells overexpress LDLR, such as those of prostate cancer (Chen et al, 2001, J. Cancer, 91, 41-45), colon cancer (Niendorf et al, 1995, Int. J. Cancer, 61, 461- 464), leukemias (Tatidis et al., 2002, Biochem Pharmacol, 63, 2169-2180), colorectal cancer (Caruso et al., 2001, Anticancer Res., 21, 429-433), breast cancer (Graziani et al, 2002, Gynecol, Oncol, 85, 493-497), as well as cancers of the liver, pancreas, ovary, lung, stomach, etc.
  • the invention also relates to the use of a conjugate or a composition as defined above for the treatment, imaging and / or diagnosis of infectious diseases of the brain or the like, of the bacterial, viral, parasitic or fungal, such as, and not limited to, AIDS, even meningitis, etc.
  • LDLR is also present on liver cells. It is now known that endocytosis of hepatitis C virus (HCV) can be mediated through LDLR. LDLR could serve as a viral receptor at an early stage of human hepatocyte infection with HCV (Molina et al., 2007, J. Hepatol, 46 (3), 411-419).
  • the conjugates of the invention can therefore be used to specifically target pathological cells, infected with viruses such as hepatitis B and C, which express LDLR and / or to modulate the process of infection of healthy cells by viruses. via the LDLR.
  • the invention also relates to the use of a conjugate or a composition as defined above for the treatment, imaging and / or diagnosis of neurodegenerative pathologies such as but not limited to Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jacob disease, stroke, bovine spongiform encephalitis, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, etc.
  • neurodegenerative pathologies such as but not limited to Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jacob disease, stroke, bovine spongiform encephalitis, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, etc.
  • the invention also relates to the use of a conjugate or a composition as defined above for the treatment, imaging and / or diagnosis of neurological pathologies such as, but not limited to, epilepsy, migraine , encephalitis, CNS pain, etc.
  • the invention also relates to the use of a conjugate or a composition as defined above for the treatment, imaging and / or diagnosis of pathologies neuropsychiatrics such as, but not limited to, depression, autism, anxiety, schizophrenia, etc.
  • treatment means obtaining a pharmacological and / or physiological effect, for example, inhibition of cancer cell growth, cancer cell death, or amelioration. of a disease or neurological disorder.
  • the effect may be prophylactic or preventative in order to totally or partially prevent the aggravation of a disease or symptom thereof, in a sick person, or its spread, in healthy subjects, and / or may be therapeutic in order to treat totally or partially a disease and / or its related harmful effects.
  • treatment includes any treatment of a disease in a mammal, and more particularly a human, and includes: (a) the prevention of a disease (for example, the prevention of cancer) or a condition that may occur in a person who is prone to this condition or disorder, but has not yet been diagnosed as having it, (b) slowing down a disease (for example, stopping its development) , or (c) the relief of a disease (for example, by reducing the symptoms associated with a disease).
  • a disease for example, the prevention of cancer
  • condition that may occur in a person who is prone to this condition or disorder, but has not yet been diagnosed as having it
  • slowing down a disease for example, stopping its development
  • the relief of a disease for example, by reducing the symptoms associated with a disease.
  • treatment also includes any administration of an active substance to treat, cure, relieve, ameliorate, diminish or inhibit a condition in an individual or patient, including but not limited to , administering to a person in need of a drug composed of a vector or conjugate as described herein.
  • the present invention also relates to the use of a linear or cyclic peptide or pseudo-peptide, of the invention for increasing the biological activity of an active substance or of interest (molecule of therapeutic interest, diagnostic agent or medical imaging, any other molecule such as a molecular probe) to which it is coupled.
  • an active substance or of interest molecule of therapeutic interest, diagnostic agent or medical imaging, any other molecule such as a molecular probe
  • the present invention also relates to the use of a linear or cyclic peptide or pseudo-peptide of the invention for reducing the toxicity of the active substance or of interest (molecule of therapeutic interest, diagnostic or medical imaging agent, any other molecule such as a molecular probe) to which it is coupled.
  • the active substance or of interest molecule of therapeutic interest, diagnostic or medical imaging agent, any other molecule such as a molecular probe
  • the peptides were identified on the basis of their interaction and affinity for the human and murine receptors with low-density lipoproteins (hLDLR and mLDLR), involved in particular in endocytosis and transcytosis (trans-cellular transport, in particular through the BBB ) cholesterol.
  • hLDLR and mLDLR low-density lipoproteins
  • trans-cellular transport in particular through the BBB ) cholesterol.
  • CHO Chinese Hamster Ovary Cells
  • the messenger RNA sequences coding for hLDLR and mLDLR are available in the databases (access numbers: NM_000527 and NM O 10700 respectively).
  • the primers necessary for amplification of the cDNAs by PCR were selected, having at their end (in bold type) the necessary restriction sites (HindIII and SalI for human LDLR and HindIII and KpnI for murine LDLR) for cloning in the pEGFP-N1 expression vector (Clontech):
  • RNAs prepared from human and murine brains were transformed into reverse transcription cDNA for PCR amplification of DNA fragments encoding hLDLR and mLDLR.
  • the PCR products were digested with the HindIII-SalI and HindIII-KpnI restriction enzymes respectively and ligated into the pEGFP-N1 expression vector (Clontech), digested with the same restriction enzymes.
  • this vector allows the expression, under the control of the CMV promoter, of LDLR fused to GFP at their C-term end, ie at the end of their intracellular domains (FIG. 3).
  • E. coli DH5 ⁇ competent bacteria After transformation of E. coli DH5 ⁇ competent bacteria, obtaining isolated colonies, preparation of the plasmid DNA, the constructs were integrally sequenced on the 2 strands for verification.
  • Transient transfections in different cell lines were performed to determine the expression levels and membrane localization of hLDLR and mLDLR on living cells.
  • the receptor is visible directly on living cells, under fluorescence microscopy, without the need for immunostaining, thanks to the green fluorescence emitted by the GFP fused at C-term of these receptors.
  • Stable transfectants were selected by limiting dilution and using the geneticin resistance gene (G418) carried by the expression vector. These lines were amplified while keeping a selection pressure.
  • the expression of the hLD LR-GFP of the expected size was verified by Western Blot on cell lysates with antibodies directed against the Human LDLR and against GFP.
  • a protein corresponding to the combined sizes of GFP and hLDLR (190 kDa) is recognized by anti-hLDLR ( Figure 4) and anti-GFP antibodies in cell extracts prepared from stable lines.
  • a CHO line expressing GFP constitutively was used as a negative control.
  • the anti-hLDLR antibody does not detect any protein in the GFP line.
  • DiI-LDL fluorescent natural ligand
  • Figure 6- A This fluorescent natural ligand (DiI-LDL) is rapidly internalized (endocytosis) as visualized under fixed-cell fluorescence microscopy ( Figure 6- A).
  • DiI-LDL is not endocytinated by the CHO-GFP control line, or by another CHO cell control line, which overexpresses, for example, the human transferrin receptor (hTfR, Figure 6-B), a other receptor involved in transcytosis.
  • hTfR human transferrin receptor
  • the endocytosis activity of the CHO-LDLR-GFP line is specific to the LDLR ligand, since in this line no non-specific ligand endocytosis is observed, for example transferrin (Tf) labeled with a red fluorochrome (Texas Red, Figure 6-C).
  • Tf transferrin labeled with a red fluorochrome (Texas Red, Figure 6-C).
  • Receptor functionality endocytotic capacity is confirmed by real-time experiments under fluorescent video microscopy, showing that LDL, the natural ligand of hLDLR, labeled with DiI, is effectively transported rapidly and very efficiently in expressing cells.
  • hLDLR-GFP compared to cells expressing GFP alone or cells expressing another receptor involved in endocytosis such as hTfR (negative controls).
  • video microscopy experiments performed with Texas Red Tf which is very effective endocytated by cells expressing hTfR-GFP, confirm that transferrin is not endocytinated by the cells of a GFP control line nor those of a line hLDLR.
  • the clones of bacterial viruses identified by the binding of the peptides they present and which bind to the hLDLR-GFP expressed by the CHO-hLDLR-GFP stable line were placed in the presence of the cells of the LDLR lines and after intensive washing, were were detected with an antibody directed against the viral envelope protein of the bacterial virus followed by a second antibody coupled to Alexa 594. ( Figure 7). These bacterial viruses do not bind to cells of the CHO-GFP control line expressing GFP alone.
  • Bacterial viruses with affinity peptides for hLDLR were incubated with adherent, non-engineered cells, and known to constitutively or inducibly express hLDLR, including human fibroblasts, human endothelial cells prepared from umbilical cord ( HUVEC) or microvascular endothelial cells of pig brain.
  • Immunocytochemistry approaches with antibodies to bacterial viral envelope protein show that affinity peptides for hLDLR, presented by bacterial viruses, also bind to LDLR present on primary cells, not genetically modified, for example human fibroblasts and microvascular endothelial cells of pig brain (Figure 8).
  • FACS quantitative flow cytometry
  • Figures 9, 10, 11 correspond to the results obtained for the peptides SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 21 on cells of the CHO-hLDLR-GFP line (FIG. 9), human fibroblasts ( Figure 10) and HUVEC cells ( Figure 11).
  • Bacterial viruses with affinity peptides for hLDLR (SEQ ID NO: 1 is described here for example) and control bacterial viruses (lacking affinity peptide for hLDLR) were injected into the anesthetized C57BL6 mouse tail vein with halothane. After 15 min and 2 h post injection, the mice were sacrificed and perfused with 0.9% NaCl. The brain, liver and kidneys were frozen in isopentane and freezing sections were made for double immunohistochemical staining to visualize the blood vessels with an anti-mouse IgG and an anti-mouse antibody. viral envelope protein for visualizing bacterial viruses linked to endothelial cells in vivo.
  • the experiments show that the bacterial viruses presenting the peptide SEQ ID NO: 1 for hLDLR and for mLDLR bind to the endothelial cells of the vessel wall, which is not the case for the control bacterial viruses (FIG. 13). .
  • Peptides were synthesized by Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) on an automatic synthesizer, Advanced ChemTech Apex396 model (AAPPTec), or a Liberty TM (CEM) microwave assisted automatic synthesizer, using a Fmoc / tBu strategy on Rink resins
  • SPPS Solid Phase Peptide Synthesis
  • AAPPTec Advanced ChemTech Apex396 model
  • CEM Liberty TM microwave assisted automatic synthesizer
  • Barlos and Sieber type "hypersensitive acid labile or HAL" resins allow the release of the terminal acid or amide function (in C-term) while preserving the orthogonal lateral protections of the different amino acids of the synthesized peptide as well as the amino terminal protection.
  • N-term of the amino function of its last amino acid (for example, N-acetylation for stability issues of the neo-synthesized peptide sequence).
  • This type of resins via an Fmoc synthesis strategy (in Proti) makes it possible to use orthogonal acid-labile side protections (PrOt 2 of the Boc, tBu, OtBu, Trt, Mmt, Acm, etc.
  • the standard orthogonal side protections (Prot 2 ) used for each amino acid during peptide synthesis are: Arg (N-Pbf), Arg (N-Pmc), Asn (N-Trt), Asp (O-tBu), Cys (S-Acm), Cys (S-Mmt), Cys (S-4MeBn), Cys (S-tBu), Cys (S-Tmob), Cys (S-Trt), Glu (O-tBu), Gln (N-Trt), His (N-Trt), Lys (N-Boc), Ser (O-tBu), Thr (O-tBu), Trp (N-Boc), Tyr (O-tBu) (Applied Biosystems) , 1998, Cleavage, Deprotection, and Isolation of Peptides after Fmoc Synthesis.
  • the amino acid couplings are made by activation of the acid function of the amino acid n + 1 using DIEA / HBTU / HOBt or DIPC / HOBt in DMF.
  • the deprotection of the Fmoc (Proti) group of a new amino acid thus coupled is carried out using 20% of piperidine in DMF.
  • the last amino acid coupled during the peptide sequence will either be protected by a Boc function (in order to release its free terminal amine function at the end of synthesis) or acetylated (in order to stabilize the synthesized neo-peptide at the end of synthesis). risks of side reactions during the coupling of the molecule of therapeutic interest in C-term for example).
  • the disulfide bridges are obtained by intramolecular cyclization from 2 thiol functions of 2 suitably protected Cys (mAb, Trt, tBu, etc.), either in solution or on the resin, using reagents typically used by those skilled in the art: I 2 / DMF, I 2 / HFIP / DCM, TFA / DMSO / anisole, I 2 / DCM / MeOH / H 2 O, etc.
  • a Cys N-term positon can be advantageously replaced by an Mpa acid for cyclization via a disulfide bridge.
  • Lanthionine bridges (by cyclization via dehydroalanine) or dicarba (by cyclization via allylGly) can also be obtained by synthetic routes known to those skilled in the art.
  • a lactam bridge can be created between the lateral acid function of a Glu (or Asp) residue and a side amino function on a N-term Lys or amine.
  • a cyclization between the amino function N-term and the C-term acid function (head / tail) can be carried out via an amide bond, as can a cyclization between the amine side function of a Lys and the acid function C- term of the peptide.
  • the cleavage of the peptides of the Barlos or Sieber resins is carried out by methods conventionally used by those skilled in the art, either with 0.5% of TFA (v / v) in DCM or with AcOH / TFE. / DCM (1/1/3), either with HFIP (30%) in DCM or with TFE (30%) in DCM, etc.
  • the deprotections of the side chains, and the cleavage of the peptides of Rink Amide or Wang resins are carried out by methods conventionally used by those skilled in the art: either with a TFA / H 2 O / TIS or TIPS mixture (95 / 2.5 / 2.5), either with TFA / H 2 O / EDT / TIS or TIPS (94 / 2.5 / 2.5 / 1), or with TFA / thioanisole / H 2 O (94/5 / 1), either with TFA / TIS / H 2 O / thioanisole (90/5/3/2), or with
  • the peptides are isolated and purified by HPLC on a Beckman System GoId 126 apparatus with a Chromolith C18 column (4.6 ⁇ 50 mm) or Nucleosil C18 (10 ⁇ 250 mm) with, for example, a gradient of 0 to 100% acetonitrile.
  • the preparative purifications are performed with a Waters prep LC4000 System with a Guard-PakTM cartridge (stationary phase) containing Delta-PakTM Cl 8 cartridges (25 x 10 mm) with detection by a Waters 2487 Dual 1 Absorbance Detector.
  • LC-MS analysis conditions are as follows:
  • Affine peptides for hLDLR-GFP, as well as control peptides were synthesized, and coupled / conjugated in C-term to different "tracer” molecules, namely rhodamine, either S-Tag, separated by a spacer arm consisting of 3 GIy residues ( Figure 14).
  • S-Tag (15 amino acid peptide derived from the 1-15 sequence of bovine pancreatic ribonuclease A) can be recognized by an anti-S-tag antibody for immunocytochemistry or FACS approaches, and on the other hand to reconstitute enzymatic activity by binding to the ribonuclease S-protein (C-term portion, amino acids 21-124) in in vitro activity assays using the FRETWorks S-Tag assay kit (Novagen 70724-3) .
  • the ribonuclease thus activated digests an MRA substrate releasing a masked fluorescent agent revealed by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) and quantified in a 96-well plate in a Beckmann spectrofluorometer.
  • the cells are washed twice with 2 ml of PBS and then incubated for 1 h at 37 ° C. with 250 ⁇ l of peptide solution. They are again washed twice with 2 ml of PBS and then twice with 1 ml of PBS, then scraped into 1 ml of PBS and centrifuged for 5 min at 1250 rpm. The supernatant is then aspirated and the cell pellet is lysed in 80 .mu.l of PBS + 0.1% of Triton X100. Twenty ⁇ l of each cell lysate are analyzed by measuring the fluorescence emission after FRET reaction. Incubation experiments of peptides on different cells expressing hLDLR were performed.
  • Endocytosis of affinity peptides for hLDLR was quantified.
  • peptides SEQ ID NO: 11 / S-Tag and control random peptide
  • the cells were washed to remove any trace of unbound peptide.
  • the washes were carried out firstly with PBS which makes it possible to quantify by FRET the peptides fixed to the cell membrane and those internalized by endocytosis (FIG. 16-A), on the other hand with an acidic solution (glycine 0.2M 0.15M NaCl, pH3) which makes it possible to dissociate the peptides attached to hLDLR to the cell membrane. Only the peptides endocytosed by the cells are then detected by FRET (FIG. 16-B). Likewise with the peptides SEQ ID NO: 2 / S-Tag on human fibroblasts (FIG. 16-C-D).
  • Toxicity, endocytosis and transcytosis of peptides synthesized, affinity for hLDLR, on endothelial cells in a BBB model in vitro The potential toxic effects of peptides on endothelial cells, the binding / accumulation of peptides in these cells, and the transcytosis passage of peptides were evaluated on BBB models in vitro.
  • the cells needed to put in place of the model are bovine cells (bovine brain microvascular endothelial cells, BBMEC) distributed by Cellial Technologies (Lens, France).
  • This model of in vitro BBB is used to evaluate the passive passage or active transport of many molecules, including pharmacological agents, across the BBB and thus their ability to reach the CNS nervous tissue.
  • the model exhibits ultrastructural properties characteristic of the cerebral endothelium, including tight junctions, absence of pores, absence of transendothelial canals, low permeability to hydrophilic molecules and high electrical resistance.
  • this model showed a good correlation between the results of the measurements made on different molecules evaluated in vitro and in vivo for their property of passage through the BBB. To date, all the data obtained reveal that this model of BBB closely mimics the in vivo situation by reproducing some of the complexities of the cellular environment that exist in vivo, while retaining the benefits associated with tissue culture experimentation. . Numerous studies have validated this cell co-culture as one of the most reproducible model of BBB in vitro.
  • the in vitro BBB model involves a co-culture of BBMECs and astrocytes.
  • plate inserts Prior to cell culture, plate inserts (Millicell-PC 3.0 ⁇ M, 30 mm diameter) are treated on the upper side with rat tail collagen to allow optimal adhesion of BBMECs and create the conditions for a basal blade.
  • Primary mixed astrocyte cultures are established from neonatal rat cerebral cortex (Dehouck et al., 1990, J. Neurochem., 54, 1798-1801). Briefly, after removing the meninges, the brain tissue was passed through a 82 ⁇ m nylon screen.
  • the astrocytes are distributed in the microplate wells at a concentration of 1.2x10 5 cells / ml and 2 ml of optimal culture medium (DMEM) supplemented with 10% inactivated fetal calf serum by heating. The middle is changed twice a week.
  • the BBMECs obtained from Cellial Technologies are cultured in the presence of DMEM medium supplemented with 10% (y IY) of horse serum and 10% of inactivated calf serum by heating, 2 mM of glutamine, 50 ⁇ g / ml of gentamycin, and 1 ng / ml of basic fibroblast growth factor, added every two days.
  • the BBMECs are then distributed on the upper side of the filters in 2 ml of the co-culture. This BBMECs medium is changed three times a week. Under these conditions, differentiated BBMECs form a monolayer of confluent cells 7 days later. The experiments reported below are carried out between 5 and 7 days after the confluence has been reached.
  • the culture medium of the lower chamber is collected at different times and the fluorescence quantified by fluorimetric analysis.
  • the results are expressed as endothelial surface permeability (or Pe) expressed in 10 -3 cm / min.
  • Lucifer Yellow (LY) a small fluorescent molecule that spends little of the BBB, is used on the one hand to control the integrity of the BBB in vitro, in all the wells analyzed, but on the other hand, in co-incubation.
  • the in vitro barrier is considered “permeable” or “open” if the LY pass value Pe is greater than 1.10 " cm / min.
  • TEER Tr ans Endothelial Electrical Resistance
  • the binding and / or internalization rate of a control peptide and the peptide SEQ ID NO: 1, both conjugated to rhodamine, was determined on the in vitro BBB model described above. This analysis was performed by lysis of the endothelial cells at different times (2h, 5h, 24h), and by fluorimetric measurement of the amount of fluorescence (rhodamine), associated with the cells (membrane and cytoplasmic compartments). obtained by centrifugation these cells after lysis). The measured values indicate that the peptide SEQ ID NO: 1 conjugated to rhodamine has more affinity for endothelial cells in a BBB model in vitro than the control peptide, at all times analyzed (Figure 19).
  • the passage of a control peptide and peptide SEQ ID NO: 1, both conjugated to rhodamine was determined on the model of in vitro BBB described above. This analysis is performed by measuring by fluorimetry the amount of fluorescence accumulated in the recipient well at different times (Ih, 4h, 24h). The integrity of the BBB in the different wells analyzed was evaluated by simultaneously measuring the rate of LY passing from one compartment to another as a function of time. The measured Pe values indicate that at short times (Ih and 4h), peptide levels of SEQ ID NO: 1 that pass through transcytosis can not be distinguished from non-specific or para-cellular passage as measured for the control peptide.
  • the rate of passage of peptide SEQ ID NO: 1 conjugated to rhodamine is very significantly greater than that of the control peptide.
  • the LY measurements also show that the integrity of the BBB is preserved at 1h, 4h and 24h ( Figure 20).
  • Other measurements show that the concentration of peptide SEQ ID NO: 1 conjugated to rhodamine is much higher in the recipient compartment at 24 hours, compared with that of the donor compartment, suggesting active transport of the peptide, certainly via the receptors, without which a balance of concentration would have been reached between the two compartments.
  • a solution containing 10 ⁇ M peptide SEQ ID NO: 11 / S-Tag is prepared in HamF12-1% BSA culture medium. To this solution is added 10 ⁇ M peptide derived from the Ala-scan to be evaluated (competition).
  • Several control solutions are also prepared: (i) HamF medium 12-1% BSA.
  • SEQ ID NO: 48 / S-Tag serves as a reference for the chemical optimization (study of the size of the cycle, introduction of non-natural amino acids) of the peptide vector SEQ ID NO: 48, and measuring the affinity of conjugates on LDLR.
  • the conjugates SEQ ID NO: 66 to SEQ ID NO: 72, described in the present application also exhibit in vitro affinity for LDLR.
  • a molecule of therapeutic interest or imaging or diagnostic agent or any other molecule such as a molecular probe may be released from the vector after transport and passage through the cell membranes and more particularly the
  • BHE for example through a prodrug strategy by hydrolysis or enzymatic cleavage of a chemical bond between the vector and the active substance.
  • Covalent coupling between the totally protected peptide vector on its lateral reactive functions (case of couplings in C-term and N-term) or partially protected (case of coupling on a reactive function of a side chain), and the molecule d therapeutic interest, is achieved via 2 general strategies (Figure T): tandem synthesis (ie direct coupling without intermediate between the two entities), synthesis through a linker (Temsamani et al., 2004, Drug Discov. 23, 1012-1019).
  • tandem synthesis of the peptide conjugate SEQ ID NO: 66 between an analgesic therapeutic peptide, dalargine, and the vector peptide SEQ ID NO: 48 was carried out as described for the synthesis of peptides in the EXAMPLE VI.
  • syntheses via peptide linkers (GGG, GFLG, ALAL, ⁇ -Ala, Ahx, GFAL) of the peptide conjugates SEQ ID NO: 67 to SEQ ID NO: 72 between an analgesic therapeutic peptide, dalargine, and the vector peptide SEQ ID NO: 48 was carried out as described for peptide synthesis in EXAMPLE VI.
  • one or the other of the various strategies is applied either on the C-term or on the N-term, or on a reactive function of a side chain.
  • the spacer arms selected should allow a good release of the active substance and the improvement of the solubility of the conjugate (Molema et al, 2001, Drug targeting, organ-specific strategies, In Methods and Principles in Medicinal Chemistry, Vol 12 ).
  • Various labile covalent chemical bonds can thus be generated between the two entities (vector and active substance) through or not a spacer arm: amides, carbamates, esters, thioester, disulfide, etc.
  • disulfide bonds relatively stable in plasma, can be cleaved within the intracerebral compartment to restore free thiol function (Saito et al., 2003, Adv Drug Deliv. Rev., 55, 199-215).
  • PEG polyethylene glycol
  • the conjugates vectors / active substances or of interest can be used in diagnosis, imaging or therapy of a pathology, a lesion or a disorder of the CNS for the preparation of a drug able to cross the BBB, a cerebral cancer tumor or other type of cancer cells for the preparation of a drug capable of traversing cancerous cell membranes, and / or infectious pathologies for the preparation of a drug capable of crossing cell membranes and targeting infected cells of cerebral or other infectious diseases, of bacterial, viral, parasitic or fungal type.
  • In situ brain perfusion for vectors and vector / molecule conjugates of therapeutic interest or imaging (or diagnostic) agent or any other molecule such as a molecular probe, and study of their transport kinetics through the BBB, and of their accumulation in the mouse brain.
  • the in situ brain perfusion technique (in the OFl male adult mouse) is used here to select the best vectors and to provide proof of their mechanism of action for their passage in the brain through the BBB.
  • the peptide vectors are radiolabeled with tritium ( 3 H), which offers the highest sensitivity for the detection of radioactive compounds, especially on tissue sections.
  • the preparation of radioactive peptides with a high specific radioactivity (RAS, up to 100 Ci / mmol) is carried out by a strategy of acylation of the N-term amino function by propionic anhydride (or propanoic) tritiated or tritiated propionyl-N-succinimide (NPS).
  • This tritiation method can be applied to all peptides, provided that the modification of the N-term does not affect the affinity of the peptides for the targeted receptor (ie LDLR) or their biological activity in the case of therapeutic peptides.
  • the tritiation reaction of the peptide vectors SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 48 in N-term by propionylation is carried out in DMF (1 mg of peptide in 100 to 450 ⁇ l according to solubility) by addition of 0.1 equivalent of NPS. tritiated for 5 minutes at room temperature, then 0.9 equivalents of cold (non tritiated) NPS for Ih, then a new equivalent of cold NPS for 5 hours. The reaction medium is then left at 4 ° C. overnight and purified the next day by HPLC.
  • the SAR for each tritiated peptide is between 5 and 10 Ci / mmol (theoretically of the order of 7.7 Ci / mmol).
  • the total amount of radioactivity prepared by synthesis is between 600 and 950 ⁇ Ci.
  • Another strategy consists of the synthesis of a conjugate between a therapeutic peptide and a peptide vector via a linker (which may be of peptide or organic nature) or not, as in the case of the conjugates SEQ ID NO: 66 to SEQ ID NO: 72 described in this application.
  • a linker which may be of peptide or organic nature
  • bicarbonate buffer plasma or blood
  • Oxygenated Krebs bicarbonate buffer is used first to evaluate the brain passage abilities of vectors and conjugates. After catheterization of the carotid artery, the endogenous blood flow is stopped by cutting the ventricles of the heart to avoid mixing of the buffer with blood and elevation of blood pressure. The duration of the fixed rate infusion is controlled. Buffer infusion can be extended for up to 20 min or up to 1 h in the presence of oxygen transporters (washed erythrocytes) for Receptor-Mediated Transport (RMT) studies.
  • RTT Receptor-Mediated Transport
  • the study of the vector peptide SEQ ID NO: 11 made it possible to determine its cerebral transport or transfer coefficient (Kin).
  • the cerebral perfusion time for these experiments is 5 min with a perfusate flow rate of 2 ml / min.
  • Kin volume of distribution on the cerebral perfusion time of the vector peptide SEQ ID NO: 11 gives a value of 3.5 ⁇ 0.2 ⁇ 10 -4 ml / s / g.
  • transferrin (Tf) has a Kin of 3.0 x 10 -4 ml / s / g (Demeule et al., 2008, J. Neurochem., 106 (4), 1534-1544).
  • RAP protein is 1.0 x 10 "5 ml / s / g ⁇ Pan et al, 2004, J. Ceil Sci 117, 5071-5078).
  • this type of in situ brain perfusion experiment also makes it possible to distinguish between compounds that remain in the vascular compartment of those who have passed the abluminal endothelial membrane to enter the cerebral parenchyma.
  • the technique of post-perfusion capillary depletion makes it possible to measure if the molecule actually crosses the endothelium in order to enter the cerebral parenchyma.
  • the use of this technique makes it possible to demonstrate that specific peptide vectors (or conjugates) tend to accumulate in the cerebral parenchyma.
  • This technique (Triguero et al., 1990, J. Neurochem., 54 (6), 1882-8) is used to distinguish between the fraction of vectors (or conjugates), which has passed through the endothelium and entered in the brain by extracellular space or brain cells, and the remaining fraction associated with endothelial cells.
  • LDLR LDLR.
  • iii Study of the rate of cerebral uptake as a function of the concentration of vectors or conjugates (Tmax, Km).
  • iv Study of transport mechanisms using inhibitor or modulator substrates of LDLR.
  • v Distribution in the Brain Compartments: Capillary Depletion (Triguero et al., 1990, J. Neurochem., 54 (6), 1882-8).

Abstract

L'invention concerne des dérivés peptidiques (peptides et pseudo-peptides) et leur utilisation comme vecteurs de molécules d'intérêt. L'invention concerne également des conjugués contenant un dérivé peptidique de l'invention lié à une molécule d'intérêt. Les peptides et conjugués prodrogues de l'invention sont utilisables pour vectoriser des molécules d'intérêt pharmaceutique ou diagnostique, comme par exemple des molécules thérapeutiques, des agents d'imagerie ou de diagnostic, ou des sondes moléculaires, à travers les membranes cellulaires, et notamment pour favoriser leur transport à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE).

Description

DERIVES PEPTIDIQUES ET LEUR UTILISATION COMME VECTEURS DE MOLECULES SOUS FORME DE CONJUGUES
L'invention concerne des dérivés peptidiques (peptides et pseudo-peptides) et leur utilisation comme vecteurs de molécules d'intérêt. L'invention concerne également des conjugués contenant un dérivé peptidique de l'invention lié à une molécule d'intérêt. Les peptides et conjugués prodrogues de l'invention sont utilisables pour vectoriser des molécules d'intérêt pharmaceutique ou diagnostique, comme par exemple des molécules thérapeutiques, des agents d'imagerie ou de diagnostic, ou des sondes moléculaires, à travers les membranes cellulaires, et notamment pour favoriser leur transport à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE).
CONTEXTE DE L'INVENTION
Selon IMS Health, le marché mondial des médicaments destinés à traiter les pathologies du système nerveux central (SNC, cerveau et moelle épinière) était d'environ 70 milliards de dollars en 2007, dont la part des produits issus des technologies de drug delivery est estimé à près de 9 milliards de dollars (Jain, 2008, Jain PharmaBiotech Report, Drug Delivery in CNS disorders). Ainsi, à ce jour le SNC fait partie des 3 aires thérapeutiques les plus importantes avec le cardiovasculaire et l'oncologie. Même si le nombre de personnes souffrant de troubles et de pathologies du SNC à travers le monde est plus important que celui des personnes atteintes par des maladies cardiovasculaires ou des cancers, la neurologie reste un marché sous-exploité. Ceci s'explique par le fait que 98% des médicaments potentiels destinés à traiter les pathologies du SNC ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique ou BHE (Pardridge, 2003, Mol. Interv., 3, 90-105).
En effet, le cerveau est protégé contre les substances potentiellement toxiques par la présence de deux systèmes principaux de barrières physiologiques : la BHE, et la barrière sang-liquide céphalo-rachidien (BS-LCR). La BHE est considérée comme la principale voie pour la captation de ligands plasmatiques. Sa superficie est environ 5000 fois supérieure à celle de la BS-LCR. La longueur totale des vaisseaux sanguins constitutifs de la BHE est d'environ 600 km. Chaque cm3 de cortex cérébral contient l'équivalent d' 1 km de vaisseaux sanguins. La surface totale de la BHE est estimée à 20 m2 {De Boer et al, 2007, Clin. Pharmacokinet., 46 (7), 553-576). Ainsi, l'endothélium cérébral, qui constitue la BHE, représente un obstacle majeur à l'utilisation de médicaments potentiels contre de nombreux troubles du SNC, mais également une surface importante d'échange potentiel entre le sang et le tissu nerveux.
En règle générale, seules quelques petites molécules lipophiles d'environ 450 à 600 Daltons peuvent passer à travers la BHE (soit seulement 2% des candidats- médicaments), c'est-à-dire, passer depuis le sang jusqu'au cerveau. Le poids moléculaire et la taille de nombreux candidats-médicaments, qui montrent des résultats prometteurs dans les études animales pour le traitement des troubles du SNC, sont considérablement plus importants. Ainsi, la plupart des molécules telles que les peptides ou protéines thérapeutiques sont généralement exclues du passage/transport depuis le sang jusqu'au cerveau, en raison de la faible perméabilité des cellules endothéliales des capillaires cérébraux {brain capillary endothelial cells ou BCECs) pour ces candidats- médicaments. Les BCECs organisées en vaisseaux sont entourées d'une lame basale, de pieds d'astrocytes, de péricytes et de cellules microgliales et neuronales. L'association étroite des cellules endothéliales avec les pieds astrocytaires est responsable du développement et du maintien des propriétés d'imperméabilité de la BHE à la plupart des molécules, assurant ainsi un contrôle strict et efficace des échanges moléculaires entre le sang et le cerveau afin de maintenir l'homéostasie cérébrale. Les BCECs sont étroitement liées par des jonctions serrées, comparativement aux autres cellules endothéliales d'autres organes, qui sont fenestrées. Ces jonctions serrées empêchent ainsi tout transport para-cellulaire à travers la BHE.
La BHE est considérée comme l'obstacle majeur à franchir dans le développement de nouvelles thérapies destinées à traiter les pathologies cérébrales, et notamment pour l'utilisation de molécules susceptibles de traiter les désordres du SNC (Neuwelt et al., 2008, Lancet Neurol, 7, 84-96). L'une des raisons pouvant expliquer pourquoi aucun traitement efficace n'est actuellement disponible pour les principales pathologies cérébrales (cancer du cerveau, maladies de Parkinson et d'Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux (AVC), etc.) est que les développeurs de candidats-médicaments destinés à traiter des pathologies du cerveau, réalisent en interne des programmes de recherche {brain drug-discovery programs) en investissant peu d'efforts dans la problématique du passage de la BHE et dans le ciblage préférentiel du SNC, et notamment du cerveau {brain drug-targeting programs), (Pardridge, 2003, Mol. Interv., 3, 90-105). En effet, un candidat- médicament doit répondre à certaines règles structurales, physico-chimiques, pharmacochimiques et pharmaco logiques afin d'avoir toutes les chances de devenir un médicament pour traiter une pathologie ou un trouble du SNC (Pajouhesh et al., 2005, NeuroRx, 2 (4), 541-553). Dans le développement d'un candidat-médicament, la sélectivité et la spécificité (profîlage pharmacologique) d'une molécule pour sa cible sont essentielles à son activité thérapeutique (efficacité). La biodisponibilité et la toxicité potentielle (profîlage pharmaceutique) d'une molécule sont quant à elles cruciales pour son devenir en tant que médicament. Autrement dit, toute molécule susceptible de devenir un médicament destiné à traiter une pathologie ou un trouble du SNC doit d'une part passer au travers de la BHE, d'autre part, conserver son activité biologique, et présenter de bonnes propriétés de pharmacocinétique (PK), d'adsorption, de métabolisme, de distribution et d'excrétion (ADME) et de pharmacodynamie (PD), avec une faible toxicité (Tox). Ainsi, la balance hydrophile/lipophile de la molécule en développement est particulièrement difficile à trouver pour les chimistes médicinaux dans cette aire thérapeutique du SNC.
Le problème majeur dans le traitement des troubles et pathologies du SNC réside donc dans le fait que les molécules administrées ne passent pas la BHE et ne peuvent donc atteindre leur(s) cible(s) dans le SNC. Les cellules endothéliales des vaisseaux et capillaires du SNC constitutives de la BHE font obstacle aux molécules qui ne peuvent passer du sang au tissu nerveux. En effet, ces cellules endothéliales et les pieds d'astrocytes qui les entourent constituent une barrière physique liée notamment à l'existence de jonctions serrées entre les cellules endothéliales qui limitent/empêchent tout passage/transport par la voie para-cellulaire, et également une barrière physiologique, puisque ces cellules disposent de systèmes d'efflux efficaces qui restreignent tout passage/transport par la voie trans-cellulaire. Ces propriétés limitent donc fortement le passage des substances du plasma sanguin vers l'espace extracellulaire cérébral.
En effet, certaines molécules, qui sont capables de franchir la BHE, sont expulsées activement du cerveau vers le système sanguin par des protéines de transport multidrug résistant (MDR). Ces systèmes d'efflux par transport actif (active efflux transport, AET) contrôlent généralement l' efflux actif des petites molécules depuis le cerveau vers le système sanguin. Le système d'AET modèle au niveau de la BHE est le transporteur ATP Binding Cassette (ABC) à savoir la glycoprotéine P (P-glycoprotein, P-gp) ; toutefois d'autres systèmes d'AET sont présents au niveau de la BHE tel que la MDR- associated protein 1 (MRPl). La P-gp, qui est principalement localisée à la surface luminale des cellules endothéliales des capillaires cérébraux, est un élément essentiel dans la fonction de barrière physiologique de la BHE prévenant l'entrée dans le cerveau de la plupart des xénobiotiques mais également des candidats-médicaments et autres molécules d'intérêt thérapeutique pouvant être actives dans le SNC.
Une des priorités de la recherche, dans la découverte de molécules destinées à traiter, diagnostiquer ou imager les troubles ou les pathologies cérébrales, est donc de trouver des moyens permettant d'augmenter l'efficacité de passage des substances actives à travers la BHE.
A cet égard, les stratégies de vectorisation de molécules au travers de la BHE, actuellement étudiées et utilisées par les développeurs de candidats-médicaments afin de permettre à une molécule d'intérêt thérapeutique d'atteindre le SNC, peuvent être divisées selon trois principales stratégies (Figure 1), (Pardridge, 2007, Pharm. Res., 24
(9), 1733-1744 ; De Boer et al, 2007, Clin. Pharmacokinet, 46 (7), 553-576 ; De Boer et al., 2007, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 47, 327-355 ; Jones et al., 2007, Pharm. Res., 24 (9), 1759-1771). Approches neurochirurgicales
Les approches neurochirurgicales peuvent être mise en œuvre par injection intra- ventriculaire cérébrale directe de la substance active, injection intracérébrale ou infusion intrathécale, ou par perturbation de la BHE (rupture temporaire de l'intégrité de la BHE).
Le problème principal des approches neurochirurgicales par injection intra- ventriculaire, en dehors des coûts relatifs à l'acte neurochirurgical, est que le médicament n'est pas délivré directement au niveau du parenchyme cérébral mais dans le liquide céphalo-rachidien. En effet, l'infusion intra-ventriculaire implique le placement d'un cathéter dans les ventricules (Aird, 1984, Exp. Neurol, 86, 342-358). Cette technique très invasive n'est pas efficace pour le transport de substances actives dans le parenchyme cérébral. En effet, le volume d'écoulement depuis le liquide céphalo-rachidien jusqu'au parenchyme cérébral lors de la délivrance d'un médicament par infusion intra-ventriculaire est régi par une diffusion anormalement lente de sa convection (de son transport), car le cerveau ne possède pas de débit volumique intra- parenchymateux.
De même pour l'injection intracérébrale, la diffusion d'une substance active dans le cerveau décroît très rapidement depuis le site d'injection jusqu'au site de lésion. En effet, la concentration cérébrale d'une substance active diminue de 90% à une distance de 500 μm de son site d'injection.
L'infusion intrathécale implique le placement d'un cathéter dans le cerveau connecté à une pompe qui délivre la substance active à un débit prédéfini. Du fait que le cerveau soit le seul organe qui n'ait pas de système lymphatique, servant normalement à ramener les fluides extracellulaires jusqu'à la circulation générale, la distribution d'une substance active par infusion intrathécale au niveau cérébral est très lente. Ceci diminue la concentration de la substance active au site de lésion.
De plus, les risques infectieux sont importants au cours de tels actes neurochirurgicaux, notamment de par la présence d'un cathéter. Dans ces conditions, le confort des patients n'est pas optimal.
L'interruption temporaire de l'imperméabilité de la BHE est associée à une ouverture transitoire des jonctions serrées des cellules endothéliales des capillaires cérébraux. C'est le cas des substances vasoactives comme les leukotriènes ou bradykinines {Baba et al, 1991, J. Cereb. Blood Flow Metab., 11, 638-643). Cette stratégie est également invasive et nécessite un accès artériel au niveau de la carotide chez les sujets/patients mis sous sédatifs. Le problème majeur rencontré par la rupture temporaire de l'intégrité de la BHE, outre les dépenses relatives à l'acte du radiologue pour l'accès à la carotide, est que la BHE ne reste ouverte que pendant une courte période de temps, limitant de fait la possibilité de délivrer en chronique un médicament. En outre, la rupture temporaire de la BHE permet aux protéines plasmatiques d'entrer dans le cerveau (alors que ces protéines peuvent être toxiques pour le cerveau) et peut également faciliter l'entrée d'agents infectieux. Ce type de rupture de la BHE peut donc conduire à des perturbations neuropathologiques chroniques et est associé à des risques importants d'infection (Salahuddin ét al, 1988, Acta Neuropathol, 76, 1-10).
Approches pharmacologiques de vectorisation Les stratégies pharmacologiques pour le transport de molécules comprennent la diffusion trans-cellulaire de molécules rendues plus lipophiles par l'addition de groupements lipidiques sur la substance active {Transcellular Lipophilic Diffusion ou TLD) voire l'utilisation des liposomes (Zhou et al, 1992, J. Control Release, 19, 459- 486), et le transport par adsorption ionique via des molécules vecteurs chargées positivement ou par cationisation de la molécule active (Adsorptive-Mediated Transport ou AMT).
L'addition d'un groupement lipidique permet la conversion chimique des molécules hydrophiles en molécules plus lipophiles notamment au travers d'approches prodrogues. Cependant, la synthèse de tels composés conduit à des molécules qui dépassent le seuil de transport optimal pour traverser la BHE, notamment en ce qui concerne le poids moléculaire qui devient supérieur à la limite optimale de 450 Daltons (Pajouhesh et al, 2005, NeuroRx, 2 (4), 541-553). Pour cette même raison, les liposomes ou même les petites vésicules ou nanoparticules (micelles, nanosphères, nanocapsules) sont généralement trop grosses, pas assez spécifiques pour la BHE, et par conséquent relativement inefficaces pour le transport de molécules d'intérêt thérapeutique (ou d'agents d'imagerie ou de diagnostic, ou de toute autre molécule comme une sonde moléculaire) à travers la BHE (Levin, 1980, J. Med. Chem., 23, 682-684 ; Schackert et al, 1989, Sélective Cancer Ther., 5, 73-79). Ainsi, les principaux problèmes rencontrés par les technologies de lipidisation (TLD) sont leur faible spécificité pour cibler et traverser spécifiquement la BHE par rapport à d'autres membranes cellulaires, la diminution des valeurs plasmatiques de l'aire sous la courbe de la drogue (ASC), et leur utilisation généralement limitée à la vectorisation de petites molécules.
Dans les approches d'AMT, le principal problème rencontré est la faible spécificité pour cibler et traverser spécifiquement la BHE par rapport à d'autres membranes cellulaires. En effet, l'AMT est basée sur des molécules cationiques s'adsorbant sur des cellules dont la membrane est chargée négativement, ce qui est le cas de la plupart des cellules. La diminution des valeurs plasmatiques de l'ASC de la drogue, leur utilisation généralement limitée à la vectorisation de petites molécules, et leur cytotoxicité sont autant de facteurs qui pénalisent l'approche de vectorisation via AMT.
Approches physiologiques de vectorisation Les stratégies fondées sur des approches physiologiques de vectorisation consistent à exploiter les différents mécanismes de transport naturel au niveau de la BHE. Ces mécanismes de transport actif de molécules au travers de la BHE se font soit via couplage à un substrat spécifique d'un récepteur ou par mimétisme moléculaire avec le substrat spécifique d'un récepteur (Carrier-Mediated Transport ou CMT), soit via couplage ou fusion à un ligand ciblant spécifiquement un récepteur (Receptor-Mediated Transport ou RMT).
A titre d'exemple des molécules comme la L-DOPA (maladie de Parkinson), le melphalan (cancer du cerveau), l'α-méthyl-DOPA (hypertension artérielle) et la gabapentine (épilepsie) passent dans le cerveau par CMT via le large neutral amino- acid transporter (LATl), (Pardridge, 2003, Mol. Interv., 3, 90-105). Ces molécules ont des structures chimiques proches de la phénylalanine, l'un des substrats naturels de LATl. Toutefois, les principaux problèmes rencontrés par les approches CMT sont leur grande sélectivité/spécificité pour des conjugués qui imitent/miment étroitement le substrat du récepteur/transporteur endogène, et par conséquent leur utilisation qui reste limitée à la vectorisation de petites molécules. Le RMT fait appel à un système de transport récepteur-dépendant. La vectorisation est réalisée via des mécanismes d'endocytose par le ciblage des récepteurs/transporteurs endogènes présents au niveau des capillaires cérébraux. Parmi les différents récepteurs humains de la BHE impliqués dans le RMT, on recense notamment: le récepteur à la transferrine (TfR), le récepteur à l'insuline (IR), les récepteurs aux low-density lipoproteins (LDL) permettant le transport du cholestérol dont le récepteur au LDL (LDLR) et les membres de la famille des low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP), ou encore le récepteur à Y insulin-like growthfactor (IGFR), le récepteur à la toxine diphtérique (DTR) ou heparin binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF), ainsi que les scavenger receptors (SCAV-Rs) dont le scavenger receptor class B type I (SR-BI). Dans le RMT, les récepteurs sur la membrane d'une cellule endothéliale de la BHE lient leur ligand, ce qui entraîne l'endocytose du complexe constitué du récepteur/transporteur et de son ligand dans une vésicule qui se forme à la surface de la cellule et pénètre ensuite dans la cellule endothéliale de la BHE. Le complexe ligand/récepteur peut passer au travers de la cellule endothéliale (transcytose), et par conséquent traverser ainsi la BHE pour agir dans le tissu nerveux. Ce processus de RMT ne dépend pas de la taille de ce qui est endocyté. Ainsi, le RMT est un mécanisme qui permet le transport depuis le sang jusque dans le cerveau de molécules telles que l'insuline, des protéines transporteuses de fer, le cholestérol, divers dérivés peptidiques et protéines, etc. Par exemple, la transferrine est utilisée comme vecteur ligand du TfR présent sur la BHE (Jefferies et al, 1984, Nature, 312, 162-163 ; Friden et al, 1983, Science, 259, 373-377 ; Friden, 1994, Neurosurgery, 35, 294-298), et la molécule à transporter (substance active) est couplée à la transferrine (vecteur ligand). Bien que cette stratégie de vectorisation à l'aide d'une macromolécule permette une augmentation du passage des molécules d'intérêt conjuguées à travers la BHE, elle présente quelques inconvénients. D'abord, le couplage de la molécule au vecteur se fait généralement par des méthodes d'expression génétique (fusion) limitant ainsi le nombre de molécules à transporter à seulement des polypeptides ou des protéines. Ensuite, le système de couplage de la molécule au vecteur est assez complexe, un couplage chimique ou biochimique traditionnel ne permet pas d'obtenir des systèmes macro moléculaires bien définis d'un point de vue structurel et moléculaire. RESUME DE L'INVENTION
La présente invention permet de palier ces inconvénients. L'invention montre qu'il est possible de concevoir des peptides ou pseudo-peptides de taille réduite capables de véhiculer à travers les membranes cellulaires, et plus spécifiquement la BHE, des substances de masse et/ou volume importants. L'invention propose ainsi de nouveaux peptides, conjugués et compositions, permettant d'améliorer la biodisponibilité de molécules d'intérêt, et notamment d'améliorer leur accès (ciblage) au SNC.
Plus particulièrement, les inventeurs ont mis au point des dérivés peptidiques capables de lier le LDLR humain. Les inventeurs ont montré que ces dérivés étaient capables de traverser la BHE. Les inventeurs ont également montré que ces dérivés permettaient de véhiculer, dans les cellules de la BHE, des molécules d'intérêt thérapeutique ou diagnostique. En outre, les inventeurs ont mis au point des peptides capables de lier le LDLR sans compétition avec le ligand naturel, et donc sans interférence avec le transport du LDL. Ces dérivés peptidiques représentent donc de nouveaux produits (vecteurs) particulièrement avantageux pour la conception et la vectorisation de médicaments ou d'agents de diagnostic, notamment pour atteindre le SNC.
Un objet de l'invention réside ainsi dans un peptide ou pseudo-peptide comprenant une séquence d'acides aminés naturels et/ou non naturels, caractérisé en ce qu'il contient au plus 30 résidus d'acides aminés et en ce qu'il lie le LDLR humain à la surface de membranes cellulaires. Les peptides comprennent au moins 5 résidus d'acides aminés, de préférence au moins 6, 7, ou 8. Dans un mode de mise en œuvre préféré, les peptides de l'invention lient également le LDLR murin. De manière tout particulièrement avantageuse et préférée, les peptides de l'invention présentent la capacité de passer la BHE et potentiellement les membranes de cellules cancéreuses ou infectieuses.
Un autre objet de l'invention concerne un conjugué comprenant un peptide ou pseudo- peptide tel que défini ci-dessus couplé à une substance d'intérêt. Comme il sera indiqué dans la suite, le couplage est avantageusement covalent et peut être réalisé de manière à se dissocier après le passage de membranes cellulaires, afin de libérer la substance d'intérêt en un site d'intérêt. Selon la nature du couplage, la libération de la substance peut s'opérer par exemple de manière passive ou sous l'action d'enzymes ou de conditions physiologiques déterminées.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique ou diagnostique comprenant un conjugué de l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un peptide ou pseudo-peptide, ou d'un conjugué, tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament, agent de diagnostic ou d'imagerie.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour améliorer ou permettre le passage d'une molécule à travers la BHE, comprenant le couplage de cette molécule à un peptide ou pseudo-peptide tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention réside dans une méthode améliorée de traitement d'une pathologie chez un sujet par un médicament, l'amélioration consistant à coupler ce médicament à un peptide ou pseudo-peptide tel que défini ci-dessus.
L'invention est utilisable chez tout mammifère, notamment tout être humain.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1
Schéma illustrant les différents modes de passage de molécules naturelles ou pharmaco logiques à travers la BHE, adapté d'après Abbott et Romero, 1996, Mol. Med. Today, 2 (3), 106-113. Figure 2
Schéma comparatif de la synthèse en tandem et de la synthèse via un linker d'un conjugué vecteur/molécule d'intérêt thérapeutique.
Figure 3
A - Schéma du plasmide utilisé pour cloner les hLDLR et mLDLR.
B - Schéma représentant la protéine de fusion exprimée par les cellules transfectées.
Figure 4 Western blot réalisé sur des lignées cellulaires CHO exprimant de manière constitutive les protéines de fusion hLDLR-GFP ou GFP (utilisée comme contrôle). Une bande de 190 kDa correspondant à la taille de la protéine de fusion hLDLR-GFP est détectée avec l'anticorps anti- hLDLR.
Figure 5
Immunocytochimie sur cellules CHO non perméabilisées, exprimant de manière stable soit A - Ia GFP seule (contrôle), soit B - Ia construction hLDLR-GFP. Les noyaux cellulaires sont marqués au Hoechst (bleu, Al et Bl). La fluorescence de la GFP est visible en vert (A2 et B2), celle du marquage du domaine extracellulaire du hLDLR par l'anticorps anti-hLDLR est visible dans le rouge (A3 et B3) et la superposition des marquages rouges et verts est visible en jaune/orange (A4 et B4). Noter que seules les cellules transfectées de manière stable avec la construction hLDLR-GFP expriment le récepteur à la membrane (B3).
Figure 6
A - Cellules de la lignée CHO-hLDLR-GFP exprimant le hLDLR-GFP (vert) incubées avec du DiI-LDL (rouge), la superposition des marquages rouges et vert est visible en jaune/orange, noter le fort marquage des cellules.
B - Cellules d'une lignée CHO-TfR-GFP exprimant le hTfR-GFP (vert) incubées avec du DiI-LDL (rouge) : absence de liaison et d'endocytose du DiI-LDL. C - Cellules de la lignée CHO-hLDLR-GFP exprimant le hLDLR-GFP (vert) incubées avec de la transferrine couplée à du Texas Red (rouge) : absence de liaison et d'endocytose du ligand Tf.
Noter la différence d'intensité de marquage entre A d'une part, B et C d'autre part, où seul le marquage des récepteurs hTfr et hLDLR fusionnés à la GFP est détecté.
Figure 7
Lignées CHO exprimant de manière stable A - Ia GFP seule (vert), et B - le hLDLR- GFP (vert), et immuno marquage avec un anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale d'un clone de virus bactériens présentant un peptide (SEQ ID NO : 1) affîn pour le hLDLR (points rouges). Les noyaux cellulaires sont marqués au Hoechst (bleu, Al et Bl). La fluorescence de la GFP est visible en vert (A2 et B2), celle du marquage de l'enveloppe virale du virus bactérien par l'anticorps anti-protéine virale est visible dans le rouge (A3 et B3) et la superposition des marquages rouges et verts est visible en jaune/orange (A4 et B4). Noter que les cellules qui n'expriment pas le hLDLR en A ne fixent pas de virus bactériens.
Figure 8
Comparaison par immunocytochimie de la liaison de virus bactériens contrôles (A-C) et de virus bactériens présentant des peptides affïns pour le hLDLR (SEQ ID NO : 1), (B, D) sur des fîbroblastes humains (A-B) et sur des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau porcin (C-D). Les virus bactériens sont révélés avec un anticorps antiprotéine de l'enveloppe virale.
Figure 9
Evaluation par FACS de l'interaction entre cellules CHO-hLDLR-GFP et un clone de virus bactériens présentant le peptide SEQ ID NO : 11 affîn pour le hLDLR comparé à des virus bactériens contrôles ne présentant pas de peptides affïns pour ce récepteur. Le signal en Q2 montre une combinaison de 2 signaux sur les cellules qui sont positifs d'une part si le hLDLR-GFP est exprimé (fluorescence GFP, axe horizontal) et d'autre part si des virus bactériens affïns pour ce récepteur sont liés aux cellules via les peptides qu'ils présentent (marquage par immunocytochimie, axe vertical). A - Cellules CHO-hLD LR-GFP incubées avec l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale et son anticorps secondaire APC.
B - Cellules CHO-hLDLR-GFP incubées avec des virus bactériens contrôles (négatifs), l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale et son anticorps secondaire APC. C - Cellules CHO-hLDLR-GFP incubées avec un clone de virus bactériens présentant un peptide affïn pour le hLDLR (SEQ ID NO : 11), l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale et son anticorps secondaire APC. On observe un déplacement important du signal en Q2.
Figure 10
Evaluation par FACS de l'interaction entre fîbroblastes humains et un clone de virus bactériens présentant le peptide SEQ ID NO : 12 affîn pour le hLDLR, comparé à des virus bactériens contrôles ne présentant pas de peptides affïns pour ce récepteur. Le signal en Q2 montre une combinaison de 2 signaux sur les cellules qui sont positifs d'une part si le hLDLR est exprimé (marquage par immunocytochimie, axe horizontal) et d'autre part si des virus bactériens affïns pour ce récepteur sont liés aux cellules via les peptides qu'ils présentent (marquage par immunocytochimie, axe vertical). A - Fibroblastes humains incubés avec l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale et son anticorps secondaire APC. B - Fibroblastes humains incubés avec l'anticorps anti-LDLR et son anticorps secondaire Alexa 488.
C - Fibroblastes humains incubés avec des virus bactériens contrôles (négatifs), l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. D - Fibroblastes humains incubés avec un clone de virus bactériens présentant le peptide SEQ ID NO : 12 affïn pour le hLDLR, l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. On observe un déplacement important du signal en Q2.
Figure 11
Evaluation par FACS de l'interaction entre cellules endothéliales HUVEC et 2 clones de virus bactériens présentant les peptides, l'un cyclique (SEQ ID NO : 11), l'autre linéaire (SEQ ID NO : 21), affïns pour le hLDLR, comparé à des virus bactériens contrôles ne présentant pas de peptides affïns pour ce récepteur.
A - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale et son anticorps secondaire APC. B - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec l'anticorps anti-LDLR et son anticorps secondaire Alexa 488.
C - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec des virus bactériens contrôles (négatifs), l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. D - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec un clone de virus bactériens présentant le peptide cyclique (SEQ ID NO : 11) affïn pour le hLDLR, l'anticorps antiprotéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. On observe un déplacement important du signal en Q2. E - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec un clone de virus bactériens présentant le peptide linéaire (SEQ ID NO : 21) affîn pour le hLDLR, l'anticorps antiprotéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. On observe un déplacement important du signal en Q2.
Figure 12 Evaluation par FACS sur cellules HUVEC d'une compétition entre les peptides présentés par les virus bactériens affïns pour le LDLR et son ligand naturel le LDL.
A - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale et son anticorps secondaire APC.
B - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec l'anticorps anti-LDLR et son anticorps secondaire Alexa 488.
C - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec des virus bactériens contrôles
(négatifs), l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR et les anticorps secondaires APC et Alexa 488.
D - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec des virus bactériens contrôles (négatifs), l'anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR, le
LDL, et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. Aucun effet n'est observé dû à la présence du LDL. E - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec un clone de virus bactériens présentant le peptide linéaire (SEQ ID NO : 21) affïn pour le hLDLR, l'anticorps antiprotéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. F - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec un clone de virus bactériens présentant le peptide linéaire (SEQ ID NO : 21) affïn pour le hLDLR, l'anticorps antiprotéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR, le LDL et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. Le LDL diminue fortement la liaison des peptides SEQ ID NO : 21 présentés par les virus bactériens. G - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec un clone de virus bactériens présentant le peptide cyclique (SEQ ID NO : 11) affïn pour le hLDLR, l'anticorps antiprotéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. H - Cellules endothéliales HUVEC incubées avec un clone de virus bactériens présentant le peptide cyclique (SEQ ID NO : 11) affïn pour le hLDLR, l'anticorps antiprotéine de l'enveloppe virale, l'anticorps anti-LDLR, le LDL et les anticorps secondaires APC et Alexa 488. Aucun effet n'est observé dû à la présence du LDL. I - Graphe représentant le pourcentage de déplacement du signal de fluorescence dans la zone Q2 des graphiques A-H obtenus par FACS. On ne mesure aucun déplacement en Q2 pour les virus bactériens contrôles qui ne présentent pas de peptides affïns pour le hLDLR. Pour les virus bactériens présentant le peptide SEQ ID NO : 21, plus de 55,8% du signal se déplace en Q2 indiquant une affinité des peptides présentés par ces virus bactériens pour le hLDLR des cellules HUVEC. L'addition de LDL entraîne une perte du signal en Q2 de 85% au niveau des virus bactériens contrôles, indiquant une compétition entre le virus bactérien correspondant à la séquence peptidique SEQ ID NO : 21 et le LDL au niveau du site de liaison du LDL au hLDLR. Le signal en Q2 des virus bactériens qui présentent le peptide SEQ ID NO : 11 également important (déplacement supérieur à 70% par rapport aux virus bactériens contrôles) n'est pratiquement pas déplacé (17%) par l'ajout de LDL. Figure 13
Double marquage en immuno fluorescence de coupes à congélation de cerveau de souris C57BL6, 2h après injection dans la veine de queue de souris de virus bactériens contrôles (A-B) et de virus bactériens présentant un peptide affïn (peptide SEQ ID NO : 1) pour le hLDLR et pour le mLDLR (C-D). Les vaisseaux cérébraux sont marqués avec un IgG anti-souris, en vert (A-C), les virus bactériens sont marqués avec un anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale, en rouge (B-D).
Figure 14 Schéma général des peptides synthétisés conjugués à la rhodamine ou au S-Tag, avec bras espaceur en C-terminal (C-term).
Figure 15
Evaluation par fluorescence et immunocytochimie de la liaison et de l'endocytose des peptides affïns pour le hLDLR (SEQ ID NO : 1/rhodamine en A et, SEQ ID NO : 2/S- Tag en C) sur les cellules de la lignée CHO-hLDLR-GFP comparé à un peptide contrôle (en B). La fluorescence de la GFP est visible en vert (Al, Bl et Cl), celle liée aux peptides, révélée grâce à la rhodamine ou par liaison d'un anticorps anti-S-Tag couplé à un Alexa594 est visible dans le rouge (A2, B2 et C2), et la superposition des marquages rouges et vert est visible en jaune/orange (A3, B3 et C3). Noter les forts taux de marquage intracellulaire dans le rouge avec les peptides SEQ ID NO : 1 /rhodamine en A2 et, SEQ ID NO : 2/S-Tag en C2, et la superposition du marquage hLDLR-GFP (vert, Al, Cl) avec les peptides liés ou internalisés par endocytose (A2, C2).
Figure 16
Quantification des taux de liaison (A-C) et d' endocytose (B-D) des peptides SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 2 et d'un peptide contrôle sur lignée CHO-hLDLR-RFP (A-B) et sur fïbroblastes humains (C-D) respectivement.
Figure 17
Evaluation par immunocytochimie de l'interaction entre cellules CHO-hLDLR-GFP et le peptide SEQ ID NO : 11 affîn pour le hLDLR, conjugué au S-Tag, comparé à un peptide contrôle également conjugué au S-Tag. Le signal en Q2 montre une combinaison de 2 signaux sur les cellules qui sont positifs d'une part si le hLDLR-GFP est exprimé (fluorescence GFP, axe horizontal) et d'autre part si le peptide contrôle, et le peptide SEQ ID NO : 11 affïn pour ce récepteur, est lié aux cellules (marquage par immunocytochimie, axe vertical).
A - Cellules incubées avec l'anticorps secondaire APC.
B - Cellules incubées avec le peptide contrôle conjugué au S-Tag, l'anticorps anti S- Tag et l'anticorps secondaire APC.
C - Cellules incubées avec le peptide SEQ ID NO : 11 affîn pour le LDLR, conjugué au S-Tag, l'anticorps anti S-Tag et l'anticorps secondaire APC. On observe un déplacement important du signal en Q2.
Figure 18
Evaluation de la toxicité des peptides sur une barrière de cellules endothéliales dans le modèle de BHE in vitro par co-incubation avec le Lucifer Yellow (LY, analyse fluorimétrique) et analyse du taux de passage du LY en fonction du temps et en absence ou en présence d'un peptide contrôle et du peptide SEQ ID NO : 1, tous deux conjugués à la rhodamine.
Figure 19
Evaluation après lyse des cellules et analyse par fluorimétrie des taux de liaison aux cellules endothéliales du modèle BHE in vitro et/ou internalisation dans ces cellules, des peptides contrôle et SEQ ID NO : 1, tous deux conjugués à la rhodamine.
Figure 20
Evaluation par fluorimétrie des taux de passage (Perméabilité, Pe) à travers les cellules endothéliales d'un modèle BHE in vitro des peptides contrôle et SEQ ID NO : 1, tous deux conjugués à la rhodamine. La mesure de Pe du LY permet de vérifier l'intégrité des modèles de BHE in vitro. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention concerne des dérivés peptidiques capables de lier le LDLR humain et leur utilisation dans le domaine pharmaceutique, notamment pour véhiculer, dans les cellules de la BHE, des molécules d'intérêt thérapeutique ou diagnostique.
Le LDLR humain est une protéine transmembranaire de 839 acides aminés comprenant trois régions : la région extracellulaire (1-768), la région transmembranaire (768-790) et la région cytoplasmique (790-839). La région extracellulaire est divisée en deux sous- régions : celle de liaison des LDL (1-322) et celle en dehors de la zone de liaison des LDL (322-768) (voir WO2007/014992).
Le cerveau a un besoin important de LDL pour son bon fonctionnement. Les ligands naturels au LDLR sont le LDL et plus particulièrement l'apo lipoprotéine B (ApoB) et l'apo lipoprotéine E (ApoE) constitutives des particules de LDL permettant ainsi le transport de cholestérol, contenu dans ces particules, au travers des membranes cellulaires et plus particulièrement de la BHE.
II a ainsi été démontré que le LDLR permettait la transcytose de particules de LDL au travers de la BHE (Dehouck et al., 1997, J. CeIl Biol, 138 (4), 877-889), via un processus de RMT, dans des vésicules endosomiques particulières qui empêchent la fusion au lysosome. Ces lipoprotéines, ayant passé la BHE par transcytose, sont alors captées par les neurones et/ou les astrocytes (Spencer et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104 (18), 7594-7599). Cette propriété a été utilisée pour vectoriser des molécules d'intérêt thérapeutique par des nanoparticules sur lesquelles sont conjuguées des apolipoprotéines entières (constitutives du LDL) (Kreuter et al, 2007, J. Control. Release, 118, 54-58). Dans cette étude, toutefois, une apo lipoprotéine entière a été utilisée, et sous forme couplée à une nanoparticule afin de mimer la structure de la particule LDL. La présente invention montre, pour la première fois, qu'il est possible de concevoir de petits peptides capables de lier le LDLR et de passer à travers la BHE. L'invention offre de nombreux avantages par rapport aux stratégies de l'art antérieur, qui découlent notamment du choix du récepteur, de la stratégie de conception des peptides, et de leur nature. L'invention montre que de tels peptides ou pseudo-peptides sont sélectifs pour certaines membranes cellulaires et peuvent être utilisés pour délivrer aussi bien des petites molécules chimiques (qu'elles soient ou non lipophiles), que des macro molécules telles que des protéines d'intérêt thérapeutique. Les peptides ou pseudo-peptides vecteurs peuvent être aisément synthétisés par voie chimique, et la plupart des molécules d'intérêt thérapeutique, ou des agents d'imagerie ou de diagnostic peuvent être couplées au peptide ou pseudo-peptide vecteur de façon simple et efficace au travers d'une stratégie prodrogue via un bras espaceur (synthèse via linker) ou par couplage direct (synthèse en tandem) entre les deux entités (Figure 2). Les peptides et pseudo-peptides de l'invention peuvent être conçus pour adopter une configuration cyclique, et donc plus résistante à la protéolyse. Par ailleurs, les peptides et pseudo- peptides de l'invention peuvent être conçus pour lier le LDLR sans compétition avec le ligand naturel. L'invention a en effet permis la découverte d'un nouveau site de liaison sur le LDLR, différent du site de liaison des LDL. De ce fait, l'utilisation de peptides et pseudo-peptides de l'invention ciblant ce site permet un transport efficace sans perturbation substantielle de la liaison du ligand naturel.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis à la Demanderesse de montrer que les peptides ou pseudo-peptides linéaires ou cycliques qu'elle a mis au point peuvent être utilisés comme vecteurs de molécules d'intérêt thérapeutique, ou d'agents d'imagerie ou de diagnostic, ou de toute autre molécule comme une sonde moléculaire, dans le traitement, l'imagerie et/ou le diagnostic de pathologies neurologiques, ainsi que de pathologies infectieuses ou cancéreuses cérébrales ou non.
Les peptides ou pseudo-peptides linéaires ou cycliques décrits dans la présente invention possèdent la capacité de cibler des récepteurs/transporteurs cellulaires, des types cellulaires particuliers et/ou de passer les membranes cellulaires notamment celles des barrières physiologiques du cerveau et plus particulièrement la BHE ou la barrière sang-rétine (BSR).
Les peptides ou pseudo-peptides linéaires ou cycliques décrits dans la présente invention possèdent la capacité de cibler des récepteurs/transporteurs cellulaires, des types cellulaires particuliers, notamment des cellules cancéreuses, du tissu nerveux ou non et/ou de passer les membranes cellulaires notamment celles des barrières physiologiques du SNC et plus particulièrement la barrière hémato -tumorale (BHT) au niveau des tumeurs du tissu nerveux.
Les peptides ou pseudo-peptides linéaires ou cycliques décrits dans la présente invention possèdent la capacité de cibler des récepteurs/transporteurs cellulaires, des types cellulaires particuliers et/ou de passer les membranes cellulaires, notamment celles des barrières physiologiques du SNC, pour traiter plus particulièrement des pathologies infectieuses cérébrales ou autres, de type bactériennes, virales, parasitaires ou fongiques.
Les peptides ou pseudo-peptides linéaires ou cycliques décrits dans la présente invention possèdent la capacité de se fixer sur un LDLR murin ou humain de la membrane cellulaire et de traverser ladite membrane grâce à ce récepteur par transcytose.
Les peptides ou pseudo-peptides linéaires ou cycliques décrits dans la présente invention possèdent la capacité de se fixer sur le LDLR à la surface des membranes cellulaires des barrières physiologiques du cerveau de type murin et humain et de traverser ladite barrière physiologique grâce au LDLR par RMT.
L'invention concerne donc plus particulièrement des peptides et pseudo-peptides qui présentent une affinité pour le LDLR, et leur utilisation comme vecteurs de molécules d'intérêt thérapeutique ou d'agents d'imagerie ou de diagnostic, ou de toute autre molécule comme une sonde moléculaire. De tels peptides sont utilisables dans de nombreuses indications, notamment dans le traitement, l'imagerie et/ou le diagnostic de pathologies neurologiques, ainsi que de pathologies infectieuses ou cancéreuses, cérébrales ou non.
Un objet de l'invention réside donc dans un peptide ou pseudo-peptide comprenant une séquence d'acides aminés naturels et/ou non naturels, caractérisé en ce qu'il contient au plus 30 résidus d'acides aminés, de préférence au plus 25, et en ce qu'il lie le LDLR humain à la surface de membranes cellulaires. Au sens de l'invention, le terme peptide ou pseudo-peptide désigne une molécule comprenant un enchaînement de résidus d'acides aminés, qui peuvent être naturels ou non, éventuellement modifiés ou fonctionnalisés, et liés entre eux par des liaisons peptidiques, non peptidiques ou peptidiques modifiées. Les peptides peuvent être cycliques ou non, et présenter, le cas échéant, une ou des extrémités protégées.
Un objet préféré de l'invention réside dans un peptide ou pseudo-peptide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il présente la capacité de passer la BHE.
Dans un premier mode de mise en œuvre, les peptides ou pseudo-peptides de l'invention répondent à la formule générale (I) suivante :
X-M-P-R-Y (I)
dans laquelle :
- X est un groupe comprenant 1 à 11 acides aminés naturels et/ou non naturels consécutifs, - Y est un groupe comprenant 1 à 11 acides aminés naturels et/ou non naturels consécutifs,
- X et/ou Y contient au moins un résidu d'acide aminé permettant la formation d'un cycle au sein du peptide,
- M désigne la méthionine ou un de ses isostères ou un de ses analogues, - P désigne la proline ou un de ses isostères ou un de ses analogues,
- R désigne l'arginine ou un de ses isostères ou un de ses analogues, et dans laquelle le nombre total de résidus d'acides aminés est inférieur ou égal à 25. Avantageusement, dans les peptides ou pseudo-peptides de formule (I), X est un groupe de formule (Xaa)1Z(Xaa)J et Y est un groupe de formule (Xaa)kW(Xaa)i, dans lesquelles Xaa représente un acide aminé naturel ou non, y compris un acide aminé de configuration D, un acide aminé non codé, ou un acide aminé contenant une liaison peptidomimétique, Z et W représentent deux acides aminés identiques ou différents permettant la cyclisation du peptide, et i, j, k et 1 sont des nombres entiers, identiques ou différents, compris entre 0 et 5.
L'invention résulte notamment de l'identification, par des stratégies de comparaison de la séquence de peptides ligands, de motifs assurant la liaison et le transport par le LDLR mais sans compétition avec le ligand naturel. L'absence de compétition avec le ligand naturel montre que les motifs de liaison découverts par les inventeurs impliquent un nouveau site de liaison sur le LDLR, ce qui constitue une découverte inattendue et particulièrement avantageuse dans le cadre de la vectorisation de composés in vivo.
Les acides aminés, naturels ou non, constitutifs des groupes X et Y des peptides ou pseudo-peptides de l'invention peuvent être identiques ou différents et choisis parmi : - la glycine (GIy, G) ou acide 2-aminoéthanoïque, la sarcosine (Sar) ou N- méthylglycine (MeGIy), la N-éthylglycine (EtGIy), l'allylglycine (allylGly) ou acide 2-aminopent-4-énoïque, la 2-cyclopentylglycine (Cpg), la 2- cyclohexylglycine (Chg), la 2,2-dipropylglycine (Dpg), la 2-(3-indolyl)glycine (IndGly), la 2-indanylglycine (IgI), la 2-néopentylglycine (NptGly), la 2- octylglycine (OctGly), la 2-propargylglycine (Pra) ou acide 2-amino pent-4- ynoïque, la 2-phénylglycine (Phg), la 2-(4-chlorophényl)glycine, l'azaglycine
(AzGIy), le glycinol ou 2-aminoéthanol, l'alanine (AIa, A) ou acide 2-aminopropanoïque, la bêta-alanine (β-Ala) ou acide 3-aminopropanoïque, la déshydroalanine, la N-méthylalanine, la 3- cyclopropylalanine (Cpa), la 3-cyclohexylalanine (Cha), la 3-cyclopentylalanine, la 3-(l-naphtyl)alanine (INaI), la 3-(2-naphtyl)alanine (2NaI), la 3-(3- pyridyl)alanine, la 3-(2-thiényl)alanine (Thi), Palaninol ou 2-aminopropanol, la valine (Val, V) ou acide 2-amino-3-méthylbutanoïque, la N-méthylvaline (MeVaI), la norvaline (Nva) et ses dérivés méthylés et/ou hydroxylés, la 5- hydroxynorvaline (Hnv) et ses dérivés, la 3 -mercapto valine (pénicillamine, Pen), le valinol ou 2-amino-3-méthylbutanol, - la leucine (Leu, L) ou acide 2-amino-4-méthylpentanoïque, la norleucine (Nie) ou acide 2-aminohexanoïque, la 3-hydroxyleucine, la 6-hydroxynorleucine, la tert-leucine (TIe) ou acide 2-amino-3,3-diméthylbutanoïque, l'homoleucine ou acide 3-amino-5-méthylhexanoïque, la 2,3-déshydroleucine, le leucinol ou 2- amino-4-méthylpentanol, - l'iso leucine (Ile, I) ou acide 2-amino-3-méthylpentanoïque, l'allo-iso leucine
(aile), la N-méthyliso leucine (Melle), l'isoleucinol ou 2-amino-3- méthylpentanol,
- l'acide aspartique (Asp, D) ou acide 2-aminobutanedioïque et ses dérivés estérifïés ou amidés latéralement, l'acide 3-méthylaspartique, l'aspartinol, - l'asparagine (Asn, N) ou acide 2-amino-3-carbamoylpropanoïque ou acide 2- aminosuccinamique et ses dérivés N-substitués, la N-éthylasparagine (EtAsn), l'asparaginol,
- l'acide glutamique (Glu, E) ou acide 2-aminopentanedioïque et ses dérivés estérifïés ou amidés latéralement, l'acide pyroglutamique (Pyr) ou acide pidolique ou 5-oxoproline, l'acide gamma-carboxyglutamique ou acide 4- carboxy glutamique (GIa), le glutarinol, la glutamine (GIn, Q) ou acide 2-amino-4-carbamoylbutanoïque et ses dérivés N-substitués, le glutaminol, l'acide diaminoéthanoïque, l'acide 2,3-diaminopropanoïque (Dpr ou Dap), l'acide 3-mercaptopropanoïque (Mpa), l'acide 2-amino-3-guanidinopropanoïque
(Agp), l'acide 2-aminobutanoïque (Abu), l'acide 4-aminobutanoïque (4Abu) ou GABA, l'acide 2-aminoisobutanoïque (Aib), l'acide 3-aminoisobutanoïque (bAib), l'acide 2,4-diaminobutanoïque (Dab), l'acide 3,4-diaminobutanoïque (Dbu), l'acide 2-amino-4-cyanobutanoïque (Cba), l'acide 2-amino-4- guanidinobutanoïque (Agb), l'acide 5-aminopentanoïque (Ava), l'acide 4- amino-3-hydroxy-5-phénylpentanoïque (AHPPA), l'acide 4-amino-5- cyclohexyl-3-hydroxypentanoïque (ACHPA), l'acide 6-aminohexanoïque (Acp ou Ahx), l'acide para-aminobenzoïque (PABA), l'acide méta- aminométhylbenzoïque ou acide 3-aminométhylbenzoïque, l'acide para- aminométhylbenzoïque (PAMBA) ou acide 4-aminométhylbenzoïque, l'acide 2- aminoadipique (Aad) ou acide 2-aminohexanedioïque, l'acide 3-aminoadipique (bAad) ou acide 3-aminohexanedioïque, l'acide 2-aminopimélique (Apm) ou acide 2-amino-heptanedioïque (Ahe), l'acide 4-amino-3-hydroxy-6- méthylheptanoïque ou statine (Sta), l'acide 2,2-diaminopimélique (Dpm) ou acide 2,2-diamino-heptanedioïque, la desmosine (Des) ou acide 2-amino-6-[4- (4-amino-4-carboxybutyl)-3,5-bis-(3-amino-3-carboxypropyl)-pyridin-l- yl]hexanoïque, l'isodesmosine (Ide) ou acide 2-amino-6-[2-(4-amino-4- carboxybutyl)-3,5-bis-(3-amino-3-carboxypropyl)-pyridin-l-yl]hexanoïque, l'ornithine (Orn) ou acide 2,5-diaminopentanoïque et ses dérivés epsilon-aminés ou amidés, la canaline ou acide 2-amino-4-(aminooxy)butanoïque, l'ornithinol, la lysine (Lys, K) ou acide 2,6-diaminohexanoïque et ses dérivés epsilon-aminés ou amidés, l'homo lysine ou acide 2,7-diaminoheptanoïque (hLys), la 5- hydroxylysine (HyI) ou acide 2,6-diamino-5-hydroxyhexanoïque, l'allo- hydroxylysine (aHyl), la 6-N-méthyllysine (MeLys), la S-aminoéthylcystéine ou acide 2-amino-3-(2-aminoéthylthio)propanoïque, la 3-méthyl-S- aminoéthylcystéine ou acide 2-amino-3-(2-aminoéthylthio)butanoïque, le lysinol, l'arginine (Arg, R) ou acide 2-amino-5-guanidinopentanoïque ou acide 2-amino- 5-(diaminométhylidène amino)pentanoïque, l'homoarginine ou acide 2-amino-6- guanidinohexanoïque, la N-hydroxyarginine, la citrulline (Cit) ou acide 2- amino-5-(carbamoylamino)pentanoïque, l'acide 2-amino-5-(4- carbamimidoylphényl)pentanoïque, l'acide 2-amino-5-(lH-imidazol-2- ylamino)pentanoïque, la canavanine ou acide 2-amino-4- (guanidinooxy)butanoïque, 1 ' arginino 1, l'histidine (Ηis, Η) ou acide 2-amino-3-(lΗ-imidazol-4-yl)propanoïque et ses dérivés N-substitués, Phistidinol, la serine (Ser, S) ou acide 2-amino-3-hydroxypropanoïque et ses dérivés O- substitués (éthers, etc.), l'acide 2-amino-4-hydroxybutanoïque ou homosérine (Hse) et ses dérivés O-substitués (éthers, etc.), le sérinol ou 2-amino-propan-l,3- diol,
- la thréonine (Thr, T) ou acide 2-amino-3-hydroxybutanoïque et ses dérivés O- substitués (éthers, etc.), l' allô -thréonine (allo-Thr) et ses dérivés O-substitués (éthers, etc.), le thréoninol (Thol), la phénylalanine (Phe, F) ou acide 2-amino-3-phénylpropanoïque, la 2- fluorophénylalanine, la 3-fluorophénylalanine, la 4-fluorophénylalanine, la 3,4- difluorophénylalanine, la pentafluorophénylalanine, la 2-chlorophénylalanine, la 3-chlorophénylalanine, la 4-chlorophénylalanine, la 3,4-dichlorophénylalanine, la 4-bromophénylalanine, la 3-iodophénylalanine, la 4-iodophénylalanine, la 4- nitrophénylalanine, la 2-méthoxyphénylalanine, la 3-méthoxyphénylalanine, la 4-méthylphénylalanine, la 4-aminophénylalanine, la 4-guanidinophénylalanine, la 3,4-dihydroxyphénylalanine ou DOPA, l'acide 2-amino-4-phénylbutanoïque ou homophénylalanine, la 4-biphénylylalanine (Bip), la 4-benzoylphénylalanine (Bpa), le phénylalaninol (Phol), la tyrosine (Tyr, Y) ou acide 2-amino-3-(p-hydroxyphényl)propanoïque et ses dérivés O-substitués (éthers, etc.), la 3-iodotyrosine, la 3,5-diiodotyrosine, la 2- bromotyrosine, la 3,5-dibromotyrosine, la 2,6-diméthyltyrosine, la 3- nitrotyrosine, la 3-sulfotyrosine, le tyrosinol ou 2-amino-4- hydroxybenzènepropanol,
- le tryptophane (Trp, W) ou acide 2-amino-3-(lH-indol-3-yl)propanoïque et ses dérivés N-substitués, le 2-méthyltryptophane, le 5-hydroxytryptophane (5 -HTP), le tryptophanol, la cystéine (Cys, C) ou acide 2-amino-3-mercaptopropanoïque et ses dérivés S- substitués, la S-acétylcystéine ou acide 2-amino-3-(acétylthio)propanoïque, la sélénocystéine (Sec, U) ou acide 2-amino-3-(séléno)propanoïque, le cystéinol, la méthionine (Met ou M) ou acide 2-amino-4-(méthylthio)butanoïque, l'homométhionine ou acide 3-amino-5-(méthylthio)pentanoïque, le méthioninol,
- la proline (Pro, P) ou acide pyrolidine-2-carboxylique, l'homoproline ou acide 2-(2-pyrrolidinyl)éthanoïque, la 3-hydroxyproline (3Hyp), la 4-hydroxyproline
(4Hyp), la 3-méthylproline, la 3,4-déshydroproline, la 3,4-méthanoproline, la 4- aminoproline, la 4-oxoproline, la thioproline ou acide thiazolidine-4- carboxylique (Thz), l'acide 2-oxothiazolidine-4-carboxylique, l'acide indoline- 2-carboxylique (Idc), l'acide pipécolique (Pip) ou acide piperidine-2- carboxylique, l'acide nipécotique (Nip) ou acide piperidine-3 -carboxylique, l'acide 4-oxopipécolique, l'acide 4-hydroxypipécolique, l'acide amino-1- cyclohexane carboxylique, le prolinol.
Comme indiqué, on préfère des peptides comprenant au moins 1, de préférence 2 résidus d'acides aminés pouvant permettre la cyclisation du peptide. De tels acides aminés sont typiquement choisis parmi Cys, Mpa, Pen, la déshydroalanine, ou allylGly.
La cyclisation est typiquement obtenue par formation d'un pont disulfure entre deux résidus cystéine (ou Pen), l'une présente dans le groupe X, l'autre dans le groupe Y. Une cystéine en positon N-terminale (N-term) peut par ailleurs être remplacée par un Mpa pour la cyclisation via un pont disulfure.
Un résidu cystéine peut également être remplacé par la déshydroalanine, pour la cyclisation via un pont lanthionine, ou par l'allylGly pour une cyclisation par métathèse via un pont dicarba.
Un pont lactame peut-être créé entre la fonction acide latérale d'un résidu Glu (ou Asp) et une fonction aminé latérale sur une Lys ou une aminé N-term. De même une cyclisation entre la fonction aminé N-term et la fonction acide C-terminale ou C-term (tête/queue) peut être réalisée via une liaison amide, tout comme une cyclisation entre la fonction aminé latérale d'une Lys et la fonction acide C-term du peptide.
De préférence, dans les peptides ou pseudo-peptides de formule (I), l'un au moins des groupes X et Y contient un résidu cystéine.
Dans un mode de mise en œuvre particulièrement préféré, les résidus Z et W représentent chacun une cystéine. Comme indiqué, M représente un résidu méthionine, ou l'un de ses isostères ou l'un de ses analogues. Les isostères ou analogues de la méthionine sont choisis de préférence parmi Nie, l'homométhionine, Pen, Mpa.
Comme indiqué, P représente un résidu proline, ou l'un de ses isostères ou l'un de ses analogues. Les isostères ou analogues de la proline sont choisis de préférence parmi les isostères cyclopentèniques, la 3,4-déshydroproline, la 3,4-méthanoproline, l'homoproline, 3Hyp, 4Hyp, la 3-méthylproline, la 4-aminoproline, la 4-oxoproline, Thz, l'acide 2-oxothiazolidine-4-carboxylique, Idc, Pip, Mp, l'acide 4-oxopipécolique, l'acide 4-hydroxypipécolique, l'acide amino-1 -cyclo hexane carboxylique.
Comme indiqué, R représente un résidu arginine, ou l'un de ses isostères ou l'un de ses analogues. Les isostères ou analogues de l'arginine sont choisis de préférence parmi l'homoarginine, la N-hydroxyarginine, Agp, Agb, Cit, l'acide 2-amino-5-(4- carbamimidoylphényl)pentanoïque, l'acide 2-amino-5-(lH-imidazol-2- ylamino)pentanoïque, Orn, Lys et ses isostères/analogues, la S-aminoéthylcystéine, la 3- méthyl-S-aminoéthylcystéine, hLys, Ηyl, aΗyl, MeLys, Ηis et ses isostères/analogues, Nie, l'acide diaminoéthanoïque, Dpr, Dbu.
Parmi les peptides ou pseudo-peptides de formule (I), on préfère tout particulièrement ceux dans lesquels :
- i est un entier choisi parmi 0, 1, 3 ou 4 ; et/ou
- j est un entier choisi parmi 0, 3 ou 4 ; et/ou
- k est un entier choisi parmi 0, 1 ou 3 ; et/ou - 1 est un entier choisi parmi 0, 1 ou 3.
Des peptides ou pseudo-peptides préférés au sens de l'invention répondent à la formule générale (Xaa)i-Cys-(Xaa)j-Met-Pro-Arg-(Xaa)k-Cys-(Xaa)l, dans laquelle Xaa désigne tout résidu d'acide aminé naturel ou non naturel et i, j, k et 1 sont des nombres entiers, identiques ou différents, compris entre 0 et 5. De préférence, i = 0, 1, 3 ou 4 ; j = 0, 3 ou 4 ; k = 0, 1 ou 3 ; et/ou 1 = 0, 1 ou 3. Des exemples particuliers de peptides selon l'invention répondant à la formule (I) sont décrits dans les séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 30 à SEQ ID NO : 65 suivantes :
SEQ ID NO : 1, HLDCMPRGCFRN ;
SEQ ID NO : 2, ACQVKSMPRC ;
SEQ ID NO : 3, ACTTPMPRLC ;
SEQ ID NO : 4, ACKAPQMPRC ;
SEQ ID NO : 5, ACLNPSMPRC ; SEQ ID NO : 6, ACLVSSMPRC ;
SEQ ID NO : 7, ACLQPMPRLC ;
SEQ ID NO : 8, ACPVSSMPRC ;
SEQ ID NO : 9, ACQSPMPRLC ;
SEQ ID NO : 10, ACLTPMPRLC ; SEQ ID NO : 11 , DSGLCMPRLRGCDPR ;
SEQ ID NO : 30, ACMPRLRGCA ;
SEQ ID NO : 31, ASGLCMPRLRGCDPR ;
SEQ ID NO : 32, DAGLCMPRLRGCDPR ;
SEQ ID NO : 33, DSALCMPRLRGCDPR ; SEQ ID NO : 34, DSGACMPRLRGCDPR ;
SEQ ID NO : 35, DSGLCMPRARGCDPR ;
SEQ ID NO : 36, D S GLCMPRL AGCDPR ;
SEQ ID NO : 37, DSGLCMPRLRACDPR ;
SEQ ID NO : 38, DSGLCMPRLRGCAPR ; SEQ ID NO : 39, DSGLCMPRLRGCDAR ;
SEQ ID NO : 40, DSGLCMPRLRGCDPA ;
SEQ ID NO : 41, SGLCMPRLRGCDPR ;
SEQ ID NO : 42, GLCMPRLRGCDPR ;
SEQ ID NO : 43, CMPRLRGC ; SEQ ID NO : 44, CMPRARGC ;
SEQ ID NO : 45, CMPRLAGC ;
SEQ ID NO : 46, CMPRLRAC ; SEQ ID NO 47, CMPRLKGC ; SEQ ID NO 48, (D)-CMPRLRGC ; SEQ ID NO 49, CMPR-(D)-LRGC ; SEQ ID NO 50, CMPRL-(D)-RGC ; SEQ ID NO 51, CMPRLRG-(D)-C ; SEQ ID NO 52, (D)-CMPRLRG-(D)-C ; SEQ ID NO 53, (D)-CMPRLRSarC ; SEQ ID NO 54, (D)-CMPRKRGC ; SEQ ID NO 55, (D)-CMPRLRCG ; SEQ ID NO 56, (D)-CMPRLCRG ; SEQ ID NO 57, (D)-CMPRCLRG ; SEQ ID NO 58, CMPRGC ; SEQ ID NO 59, PenMPRLRGC ; SEQ ID NO 60, (D)-PenMPRLRGC ; SEQ ID NO 61, (D)-CMPRLRGPen ; SEQ ID NO 62, PenMPRLRGPen ; SEQ ID NO 63, (D)-PenMPRLRGPen ; SEQ ID NO 64, (D)-PenMPRLRG-(D)-Pen ; SEQ ID NO 65, MpaMPRLRGC.
Comme illustré dans la section expérimentale, ces peptides lient le LDLR sans compétition avec le LDL, présentent une affinité élevée, sont capables de traverser la BHE et de véhiculer des molécules d'intérêt.
Dans un mode particulièrement préféré de mise en œuvre, on préfère les peptides de formule (I) ayant une configuration cyclique. On préfère tout particulièrement le peptide comprenant la séquence SEQ ID NO : 11, ou une séquence dérivée de celle-ci, par exemple SEQ ID NO : 30 et 48.
Selon une autre variante, les peptides ou pseudo-peptides de l'invention sont choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO : 12 à SEQ ID NO : 29 suivantes : SEQ ID NO : 12, MT VMPTGL WNPLIP S ; SEQ ID NO 13, SASWFAVPIPPLRLE ; SEQ ID NO 14, MTPMSTPRMLPVYVA ; SEQ ID NO 15, MTATHLSTLFQPLTY ; SEQ ID NO 16, MSPIPPAASTWANTL ; SEQ ID NO 17, MTANPLQNAPGPLSL ; SEQ ID NO 18, MQTAPPPPLTRVQWS ; SEQ ID NO 19, GTPRMHIPLNVDHLP ; SEQ ID NO 20, LTLPPISGLSSYPLP ; SEQ ID NO 21, TPSAHAMALQSLSVG ; SEQ ID NO 22, LTLPPISGLSSYPLP ; SEQ ID NO 23, MGTLNAPTAYPQDSL ; SEQ ID NO 24, LTNPPAYLPQNTDPH ; SEQ ID NO 25, MGLPLPYIQTILHTP ; SEQ ID NO 26, SAALIAMSSFKSITA ; SEQ ID NO 27, SGFAFARSVPTESRR ; SEQ ID NO 28, MTSPYMSLPPSTDDM ; SEQ ID NO 29, LTNPPAYLPQNTDPH.
Comme indiqué précédemment, les peptides ou pseudo-peptides linéaires ou cycliques de l'invention peuvent comprendre des liaisons peptidiques, non-peptidiques et/ou peptidiques modifiées. Dans un mode préféré, les peptides ou pseudo-peptides comprennent au moins une liaison peptidomimétique, choisie de préférence parmi l'intercalation d'un groupe méthylène (-CH2-) ou phosphate (-PO2-), aminé secondaire
(-NH-) ou oxygène (-O-), des alpha-azapeptides, alpha-alkylpeptides, N-alkylpeptides, phosphonamidates, depsipeptides, hydroxyméthylènes, hydroxyéthylènes, dihydroxyéthylènes, hydroxyéthy lamines, retro-inverso, méthylèneoxy, cétométhylène, esters, phosphinates, phosphiniques, phosphonamides, analogues carba.
Par ailleurs, dans un mode particulier de mise en œuvre, les peptides ou pseudo-peptides de l'invention comprennent une fonction N-term et/ou C-term respectivement protégée, par exemple, par une acylation, ou par une amidation ou une estérification. Les peptides ou pseudo-peptides de l'invention peuvent être synthétisés par toute technique connue en soi de l'homme du métier (synthèse chimique, biologique, génétique, etc.). Hs peuvent être conservés tels quels, ou formulés en présence d'une substance d'intérêt ou de tout excipient acceptable.
Pour les synthèses chimiques, sont utilisés des appareils commerciaux permettant d'incorporer aussi bien des acides aminés naturels que non naturels, tels que les énantiomères D et des résidus ayant des chaînes latérales avec des hydrophobicités et des encombrements stériques différents de ceux de leurs homologues naturels (acides aminés dits exotiques c'est-à-dire non codés), ou une séquence peptidique contenant une ou plusieurs liaisons peptidomimétiques pouvant inclure notamment l'intercalation d'un groupe méthylène (-CH2-) ou phosphate (-PO2-), d'une aminé secondaire (-NH-) ou d'un oxygène (-O-).
Au cours de la synthèse, il est possible d'introduire diverses modifications chimiques, comme par exemple, mettre en N-term, C-term ou sur une chaîne latérale un dérivé lipidique (ou phospho lipidique) ou un constituant d'une nanoparticule, de façon à pouvoir incorporer le peptide ou pseudo-peptide de l'invention au sein d'une membrane lipidique telle que celle d'un liposome constitué d'une ou plusieurs couches ou bicouches lipidiques, ou d'une nanoparticule.
On peut également obtenir les peptides de l'invention, ou partie de ceux-ci de nature protéique à partir d'une séquence d'acide nucléique codant pour celui-ci. La présente invention a aussi pour objet une molécule d'acide nucléique comprenant, ou constituée par, une séquence nucléique codant pour un peptide tel que défini ci-avant. Plus particulièrement l'invention concerne une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour un composé de formule générale (I) ou correspondant à l'une des séquences SEQ ID NO : 12 à SEQ ID NO : 29 ou une partie de celui-ci de nature protéique. Ces séquences d'acides nucléiques peuvent être des ADN ou ARN et être associées à des séquences de contrôle et/ou être insérées dans des vecteurs d'expression biologiques. Le vecteur d'expression biologique utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré. Il peut s'agir par exemple d'un plasmide, cosmide, virus, etc. Ces acides nucléiques et vecteurs d'expression biologiques constituent des objets particuliers de l'invention, et sont utiles pour produire les peptides de l'invention, ou partie de ceux-ci de nature protéique, dans un hôte cellulaire. La préparation de ces vecteurs d'expression biologiques ainsi que la production ou l'expression dans un hôte des peptides peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme de l'art.
Comme indiqué, les peptides de l'invention sont particulièrement utiles pour formuler des substances d'intérêt thérapeutique ou diagnostique, et notamment pour favoriser leur biodistribution et/ou leur passage à travers la BHE.
A cet égard, un objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un peptide ou pseudo- peptide linéaire ou cyclique tel que défini précédemment, comme vecteur pour le transfert/transport de molécules d'intérêt thérapeutique, ou d'agents d'imagerie ou de diagnostic, ou de toute autre molécule.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique tel que défini précédemment pour la préparation d'un médicament capable de traverser la BHE.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour permettre ou améliorer le passage d'une molécule à travers la BHE, comprenant le couplage de la molécule à un peptide ou pseudo-peptide de l'invention.
Les peptides ou pseudo-peptides linéaires ou cycliques de l'invention permettent de faire traverser la BHE à une substance active qui ne passe pas ou peu cette barrière. Ils peuvent donc être utilisés dans le traitement, la prévention ou le diagnostic de toute maladie affectant le SNC, mais aussi comme transporteurs de matériel biologique (biotransporteurs) dans le cadre d'études menées sur diverses familles de molécules avec des modèles de membranes cellulaires et plus particulièrement de BHE. A cet égard, la présente demande décrit différents composés conjugués prodrogues comprenant un peptide ou pseudo-peptide tel que défini précédemment. Le terme « conjugué » désigne une molécule résultant de la combinaison entre un ou plusieurs peptides ou pseudo-peptides de l'invention et une ou plusieurs molécules d'intérêt. Comme il sera décrit plus en détails dans la suite du texte, la conjugaison peut être de nature chimique, comme par le biais d'un bras espaceur {linker ou spacer), ou de nature génétique, comme par exemple la technologie de recombinaison génétique, telle que dans une protéine de fusion avec par exemple une molécule marqueur ou traceur (par exemple, la GFP, la β-galactosidase, etc.) ou une molécule thérapeutique (par exemple un facteur de croissance, facteur neurotrophique, etc.).
Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne un composé conjugué de formule (II) suivante :
VxDy (II) dans laquelle V représente un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique de l'invention, D représente une substance active ou d'intérêt, et x et y sont des nombres entiers compris entre 1 et 5. Dans un mode particulier, x et y sont égal à 1, ou x est supérieur à y.
A titre d'exemple, le conjugué pour lequel V = cMPRLRGC, x =1, D = Y-(D)-AGFLR et y = 1 a été synthétisé. Dans le cas présent, la substance active est un peptide thérapeutique analgésique, la dalargine. Le couplage direct (synthèse en tandem) de ce peptide thérapeutique en N-term du peptide vecteur SEQ ID NO : 48 donne le conjugué SEQ ID NO : 66, Y-(D)-AGFLR-(D)-CMPRLRGC.
Un autre objet particulier de l'invention concerne un composé conjugué de formule (III) suivante :
VxLzDy (III) dans laquelle V représente un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique de l'invention, L représente un bras espaceur, D représente une substance active ou d'intérêt, x et y sont des nombres entiers compris entre 1 et 5 et z est un entier compris entre 1 et 10. Dans un mode particulier, x=z=y=l ou x=z>y ou z>x>y. A titre d'exemple, les synthèses via linkers des conjugués pour lequel V = cMPRLRGC (avec x =1) et D = Y-(D)-AGFLR (avec y = 1) ont été réalisées avec L = GGG ou GFLG ou ALAL ou β-Ala ou Ahx ou GFAL (avec z =1).
SEQ ID NO 67, Y-(D)-AGFLRGGG-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO 68, Y-(D)-AGFLRGFLG-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO 69, Y-(D)-AGFLRALAL-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO 70, Y-(D)-AGFLR-β-Ala-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO 71, Y-(D)-AGFLR-AhX-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO 72, Y-(D)-AGFLRGFAL-(D)-CMPRLRGC
Les exemples contenus dans la présente demande montrent, dans des expériences de perfusion cérébrale chez la souris, que ces conjugués sont capables de passer la BHE, illustrant le mécanisme d'action des peptides vecteurs de l'invention.
La substance active ou d'intérêt peut être toute molécule d'intérêt pharmaceutique, notamment thérapeutique, un agent de diagnostic ou d'imagerie médicale, ou une sonde moléculaire. Il peut s'agir en particulier de toute entité chimique ayant un intérêt biologique telle qu'une petite molécule chimique (antibiotique, antiviral, immuno- modulateur, anticancéreux, anti-inflammatoire, etc.), un peptide ou polypeptide, une protéine (enzyme, hormone, cytokine, apolipoprotéine, facteur de croissance, antigène, anticorps ou une partie d'anticorps), un acide nucléique (acide ribonucléique ou acide désoxyribonucléique d'origine humaine, virale, animale, eucaryote ou procaryote, végétale, synthétique, etc., pouvant avoir une taille variable, allant du simple oligonucléotide au génome ou fragment de génome), un génome viral ou un plasmide, un ribozyme, un marqueur ou traceur. De manière générale, la « substance d'intérêt » peut être tout principe actif de médicament, qu'il s'agisse d'un produit chimique, biochimique, naturel ou synthétique. L'expression « petite molécule chimique » désigne une molécule d'intérêt pharmaceutique ayant un poids moléculaire de 1000 Daltons au maximum, typiquement compris entre 300 et 700 Daltons. Un autre objet particulier de l'invention concerne un composé de formule (IV) suivante :
VxLz (IV) dans laquelle V représente un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique de l'invention, L représente un bras espaceur, x est un nombre entier compris entre 1 et 5 et z est un entier compris entre 1 et 10. Dans un mode particulier, x=z=l ou z>x.
Dans les composés conjugués de l'invention, le couplage entre V et D, ou entre V et L d'une part et entre L et D d'autre part, peut être réalisé par tout moyen de liaison acceptable compte tenu de la nature chimique, de l'encombrement et du nombre de substance(s) active(s) et de peptide(s) ou pseudo-peptide(s) associés. Le couplage peut ainsi être réalisé par une ou plusieurs liaisons covalentes, hydrophobes ou ioniques, clivables ou non en milieu physiologique ou à l'intérieur de cellules. Par ailleurs, D peut être couplé à V, le cas échéant via L, au niveau de différents groupes réactifs, et notamment d'une ou des extrémités N-term et/ou C-term de V et/ou au niveau d'un ou plusieurs groupements réactifs portés par les chaînes latérales des acides aminés naturels ou non, constitutifs de V.
Le couplage peut être effectué en n'importe quel site du peptide ou pseudo-peptide, dans lequel des groupements fonctionnels tels que -OH, -SH, -CO2H, -NH2, -SO3H, -
PO2H sont naturellement présents ou ont été introduits. Ainsi, une molécule d'intérêt thérapeutique, ou un agent de diagnostic (ou d'imagerie médicale) ou toute autre molécule comme une sonde moléculaire peut être liée (couplée) au vecteur peptidique ou pseudo-peptidique linéaire ou cyclique de l'invention par une liaison covalente soit au niveau des extrémités N-term ou C-term, soit au niveau des groupements réactifs portés par les chaînes latérales des acides aminés naturels ou non, de cette séquence peptidique.
De même, le couplage peut être effectué en n'importe quel site de la substance active ou d'intérêt (molécule d'intérêt thérapeutique, agent de diagnostic ou d'imagerie médicale, toute autre molécule comme une sonde moléculaire), où par exemple des groupements fonctionnels tels que -OH, -SH, -CO2H, -NH2, -SO3H, -PO2H sont naturellement présents ou ont été introduits.
Il est préférable que l'interaction soit suffisamment solide pour que le peptide ne se dissocie pas de la substance active avant d'avoir atteint son site d'action. Pour cette raison, le couplage préféré selon l'invention est un couplage covalent, mais il pourrait cependant s'agir d'un couplage non covalent. La substance d'intérêt peut être couplée directement au peptide (synthèse en tandem) soit à l'une de ces extrémités terminales (N-term ou C-term), soit au niveau d'une chaîne latérale d'un des acides aminés constitutifs de la séquence (Figure 2). La substance d'intérêt peut aussi être couplée indirectement par le biais d'un bras de liaison ou bras espaceur (synthèse via linker), soit à l'une des extrémités terminales des peptides, soit au niveau d'une chaîne latérale d'un des acides aminés constitutifs de la séquence (Figure 2). On peut citer comme moyen de couplage chimique covalent, faisant appel ou pas à un bras espaceur, ceux choisis parmi des agents bi- ou multifonctionnels contenant des groupements alkyle, aryle ou peptidique par des esters, aldéhydes ou acides d'alkyle ou d'aryle, des groupements anhydrides, sulfhydriles ou carboxyles, des groupes dérivés du bromure ou chlorure de cyanogène, du carbonyldiimidazole, des esters de succinimide ou des halogénures sulfoniques.
A cet égard, un objet de l'invention réside également dans un procédé de préparation d'un composé conjugué tel que défini ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de couplage entre un peptide ou pseudo-peptide V et une substance D, le cas échéant via L, de préférence par voie chimique, biochimique, enzymatique, ou par génie génétique.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé conjugué tel que défini ci-avant et un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. Un autre objet de l'invention concerne une composition diagnostique caractérisée en ce qu'elle comprend un agent de diagnostic ou d'imagerie médicale constitué d'un composé conjugué tel que défini ci-avant.
Le conjugué peut être utilisé sous forme de tout sel pharmaceutiquement acceptable. Par sels pharmaceutiquement acceptables, on entend par exemple et de manière non limitative des sels d'addition basique ou acide pharmaceutiquement acceptables, hydrates, esters, solvates, précurseurs, métabolites ou stéréoisomères, desdits vecteurs ou conjugués chargés avec au moins une substance d'intérêt.
L'expression sels pharmaceutiquement acceptables se réfère aux sels non toxiques, qui peuvent être généralement préparés en faisant réagir une base libre avec un acide organique ou inorganique convenable. Ces sels conservent l'efficacité biologique et les propriétés des bases libres. Comme exemples représentatifs de tels sels, on peut citer les sels hydrosolubles et hydroinsolubles, tels que les acétates, N-méthylglucamine ammonium, ansonates (4,4-diaminostilbènes-2,2'-disulfonates), benzènesulfonates, benzonates, bicarbonates, bisulfates, bitartrates, borates, bromhydrates, bromures, buryrates, camsylates, carbonates, chlorhydrates, chlorures, citrates, clavulariates, dichlorhydrates, diphosphates, édétates, édétates de calcium, édisylates, estolates, ésylates, fumarates, gluceptates, gluconates, glutamates, glycolylarsanylates, hexafluorophosphates, hexylrésorcinates, hydrabamines, hydroxynaphtoates, iodures, isothionates, lactates, lactobionates, laurates, malates, maléates, mandélates, mésylates, méthylbromures, méthylnitrates, méthylsulfates, mucates, napsylates, nitrates, 3- hydroxy-2-naphtoates, oléates, oxalates, palmitates, pamoates (l,l-méthylène-bis-2- hydroxy-3-naphtoates, ou emboates), pantothénates, phosphates, picrates, polygalacturonates, propionates, p-toluènesulfonates, salicylates, stéarates, subacétates, succinates, sulfates, sulfosalicylates, suramates, tannâtes, tartrates, téoclates, tosylates, triéthiodides, trifluoroacétates, valérates.
Les compositions de l'invention comprennent avantageusement un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être choisi parmi les véhicules utilisés de manière classique selon chacun des modes d'administration. En fonction du mode d'administration prévu, les composés peuvent être sous forme solide, semi-solide ou liquide. Pour les compositions solides, telles que comprimés, pilules, poudres ou granulés à l'état libre ou inclus dans des gélules, la substance active peut être combinée avec : a) des diluants, par exemple le lactose, le dextrose, le sucrose, le mannitol, le sorbitol, la cellulose et/ou la glycine ; b) des lubrifiants, par exemple la silice, le talc, l'acide stéarique, son sel de magnésium ou de calcium et/ou le polyéthylène glycol ; c) des liants, par exemple le silicate de magnésium et d'aluminium, la pâte d'amidon, la gélatine, la gomme adragante, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique et/ou la polyvinylpyrrolidone ; d) des désintégrants, par exemple l'amidon, l'agar, l'acide alginique ou son sel de sodium, ou des mélanges effervescents ; et/ou e) des absorbants, colorants, aromatisants et édulcorants. Les excipients peuvent être par exemple du mannitol, lactose, amidon, stéarate de magnésium, saccharine sodique, talc, cellulose, glucose, sucrose, carbonate de magnésium et analogues de qualité pharmaceutique. Pour les compositions semi- solides, telles que suppositoires, l'excipient peut, par exemple, être une émulsion ou suspension grasse, ou à base de polyalkylène glycol, tel que le polypropylène glycol. Les compositions liquides, en particulier injectables ou à inclure dans une capsule molle, peuvent être préparées par exemple par dissolution, dispersion, etc. de la substance active dans un solvant pharmaceutiquement pur tel que, par exemple, l'eau, le sérum physiologique, le dextrose aqueux, le glycérol, l'éthanol, une huile et ses analogues.
Les compositions ou conjugués de l'invention peuvent être administrés par toute voie adaptée et, de manière non limitative par la voie parentérale, comme par exemple, sous forme de préparations injectables par voie sous-cutanée, intraveineuse ou intramusculaire ; par voie orale (ou per os), comme par exemple, sous forme de comprimés enrobés ou non, de gélules, de poudres, de granulés, de suspensions ou de solutions orales (une telle forme pour l'administration par voie orale peut être soit à libération immédiate, soit à libération prolongée ou retardée) ; - voie rectale, comme par exemple, sous forme de suppositoires ; - voie topique, notamment transdermique, comme par exemple, sous la forme de patchs, de pommades ou de gels ; - voie intra- nasale, comme par exemple sous forme d'aérosols et de sprays ; - voie perlinguale ; - voie intraoculaire.
Les compositions pharmaceutiques comprennent typiquement une dose efficace d'un peptide ou pseudo-peptide ou conjugué de l'invention. Une « dose thérapeutiquement efficace » telle qu'elle est décrite ici s'entend comme la dose qui donne un effet thérapeutique pour une condition et un régime d'administration donnés. C'est typiquement la dose moyenne d'une substance active à administrer pour améliorer sensiblement certains des symptômes associés à une maladie ou à un état pathologique. Par exemple, dans le traitement d'un cancer cérébral ou non, d'une pathologie, d'une lésion ou d'un trouble du SNC, la dose d'une substance active qui diminue, empêche, retarde, supprime ou arrête l'une des causes ou l'un des symptômes de la maladie ou du trouble serait thérapeutiquement efficace.
Une « dose thérapeutiquement efficace » d'une substance active n'est pas tenue de guérir une maladie ou un trouble mais fournira un traitement pour cette maladie ou ce trouble de façon à ce que son apparition soit retardée, entravée ou empêchée, ou que ses symptômes soient atténués, ou que son terme soit modifié ou, par exemple, soit moins sévère ou que la récupération du patient soit accélérée.
II est entendu que la « dose thérapeutiquement efficace » pour une personne en particulier dépendra de divers facteurs, incluant l' activité/efficacité de la substance active, son heure d'administration, sa voie d'administration, son taux d'excrétion et de métabolisation, les associations/interactions médicamenteuses et la sévérité de la maladie (ou du trouble) traitée à titre préventif ou curatif, ainsi que l'âge, le poids corporel, l'état de santé global, le sexe et/ou le régime alimentaire du patient.
Selon la substance couplée, les conjugués et compositions de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement, la prévention, le diagnostic ou l'imagerie de nombreuses pathologies, notamment de pathologies affectant le SNC, de pathologies infectieuses ou de cancers. A cet égard, l'invention concerne l'utilisation de conjugués ou compositions pharmaceutiques tels que décrits ci- avant pour le traitement ou la prévention de pathologies ou troubles du SNC, de tumeurs cancéreuses cérébrales ou d'autres cellules cancéreuses, et de pathologies infectieuses cérébrales ou autres, de type bactériennes, virales, parasitaires ou fongiques.
L'invention concerne également l'utilisation de conjugués ou compositions pharmaceutiques tels que décrits ci-avant pour le diagnostic ou l'imagerie de pathologies ou troubles du SNC, de tumeurs cancéreuses cérébrales ou d'autres cellules cancéreuses, et de pathologies infectieuses cérébrales ou autres, de type bactériennes, virales, parasitaires ou fongiques.
L'invention concerne également l'utilisation d'un conjugué ou d'une composition tels que définis ci-avant pour le traitement, l'imagerie et/ou le diagnostic d'une tumeur cancéreuse cérébrale ou d'un autre type de cellules cancéreuses. Des études ont en effet montré que des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Ces dernières induisent pour survivre une augmentation du niveau d'expression du LDLR au sein des organes tumoraux (Henricksson et al, 1989, Lancet, 2 (8673), 1178-1180). Il existe ainsi une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDLR par les cellules et certains cancers. Il a également été récemment démontré que le nombre de LDLR était très important à la surface de certaines cellules pathologiques comme les cellules cancéreuses. Il est généralement admis que 1 000 à 3 000 LDLR sont présents à la surface d'une cellule non pathologique. De même, des neurones non pathologiques ne présentent qu'un faible nombre de LDLR (Pitas et al, 1987, J. Biol. Chem., 262, 14352-14360). Dans le cas du glioblastome, il a été démontré une surexpression du LDLR. Ainsi, il a été dénombré à la surface des cellules cérébrales tumorales de 125 000 (pour les cellules U-251) à 900 000 (pour les cellules SF-767) LDLR (Malentiska et al, 2000, Cancer Res., 60, 2300-2303 ; Nikanjam et al, 2007, Int. J. Pharm., 328, 86-94). Notons également que beaucoup de cellules tumorales surexpriment le LDLR, telles que celles du cancer de la prostate (Chen et al, 2001, Int. J. Cancer, 91, 41-45), du cancer du colon (Niendorfet al, 1995, Int. J. Cancer, 61, 461- 464), des leucémies (Tatidis et al., 2002, Biochem. Pharmacol, 63, 2169-2180), du cancer colorectal (Caruso et al., 2001, Anticancer Res., 21, 429-433), du cancer du sein (Graziani et al, 2002, Gynecol. Oncol, 85, 493-497), ainsi que les cancers du foie, du pancréas, des ovaires, du poumon, de l'estomac, etc.
L'invention concerne également l'utilisation d'un conjugué ou d'une composition tels que définis ci-avant pour le traitement, l'imagerie et/ou le diagnostic de pathologies infectieuses cérébrales ou autres, de type bactériennes, virales, parasitaires ou fongiques, telles que, et de manière non limitative, le SIDA, voire les méningites, etc. Le LDLR est également présent sur les cellules hépatiques. Il est à présent connu que l'endocytose du virus de l'hépatite C (VHC) peut se faire par l'intermédiaire du LDLR. Le LDLR pourrait servir de récepteur viral à un stade précoce de l'infection des hépatocytes humains par le VHC (Molina et al., 2007, J. Hepatol, 46 (3), 411-419). Les conjugués de l'invention peuvent donc être utilisés pour cibler spécifiquement des cellules pathologiques, infectées par des virus tels que ceux des hépatites B et C, qui expriment le LDLR et/ou pour moduler le processus d'infection des cellules saines par les virus via le LDLR.
L'invention concerne également l'utilisation d'un conjugué ou d'une composition tels que définis ci-avant pour le traitement, l'imagerie et/ou le diagnostic de pathologies neurodégénératives telles que de manière non limitative la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Creutzfeldt-Jacob, les accidents vasculaires cérébraux (AVC), l'encéphalite bovine spongiforme, la sclérose en plaques, la sclérose latérale amyotrophique, etc.
L'invention concerne également l'utilisation d'un conjugué ou d'une composition tels que définis ci-avant pour le traitement, l'imagerie et/ou le diagnostic de pathologies neurologiques telles que de manière non limitative l'épilepsie, la migraine, les encéphalites, les douleurs du SNC, etc.
L'invention concerne également l'utilisation d'un conjugué ou d'une composition tels que définis ci-avant pour le traitement, l'imagerie et/ou le diagnostic de pathologies neuropsychiatriques telles que de manière non limitative la dépression, l'autisme, l'anxiété, la schizophrénie, etc.
Les termes « traitement », « traiter » et autres expressions semblables signifient l'obtention d'un effet pharmaco logique et/ou physiologique, par exemple, l'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses, la mort des cellules cancéreuses ou l'amélioration d'une maladie ou d'un trouble neurologique. L'effet peut être prophylactique ou préventif afin d'empêcher totalement ou partiellement l'aggravation d'une maladie ou d'un symptôme de celle-ci, chez une personne malade, ou sa propagation, chez des sujets sains, et/ou peut être thérapeutique afin de traiter totalement ou partiellement une maladie et/ou ses effets néfastes liés. Le terme « traitement » tel qu'il est utilisé dans le présent document couvre tout traitement d'une maladie chez un mammifère, et plus particulièrement un homme, et comprend : (a) la prévention d'une maladie (par exemple, la prévention du cancer) ou d'une condition pouvant survenir chez une personne prédisposée à cette pathologie ou trouble, mais qui n'a pas encore été diagnostiquée comme atteinte, (b) le ralentissement d'une maladie (par exemple, en arrêtant son développement), ou (c) le soulagement d'une maladie (par exemple, en réduisant les symptômes associés à une maladie). Ce terme « traitement » couvre également toute administration d'une substance active afin de soigner, de guérir, de soulager, d'améliorer, de diminuer ou d'inhiber une condition chez un individu ou patient, y compris, sans s'y limiter, l'administration à une personne en ayant besoin d'un médicament composé d'un vecteur ou d'un conjugué tels que décrits dans le présent document.
La présente invention concerne encore l'utilisation d'un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique, de l'invention pour augmenter l'activité biologique d'une substance active ou d'intérêt (molécule d'intérêt thérapeutique, agent de diagnostic ou d'imagerie médicale, toute autre molécule comme une sonde moléculaire) à laquelle il est couplé.
La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique, de l'invention, pour diminuer la toxicité de la substance active ou d'intérêt (molécule d'intérêt thérapeutique, agent de diagnostic ou d'imagerie médicale, toute autre molécule comme une sonde moléculaire) à laquelle il est couplé.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-dessous, qui sont de nature illustrative seulement mais ne limitent pas la portée de la présente demande.
EXEMPLES
EXEMPLE I
Clonage du LDLR humain et murin dans un vecteur d'expression.
Les peptides ont été identifiés sur la base de leur interaction et affinité pour les récepteurs humain et murin aux low-density lipoproteins (hLDLR et mLDLR), impliqués notamment dans l'endocytose et la transcytose (transport trans-cellulaire, notamment à travers la BHE) du cholestérol. Le préalable à la caractérisation de ces peptides était l'établissement dans des cellules eucaryotes (Chinese Hamster Ovary Cells, CHO) de lignées stables exprimant de manière constitutive et à taux élevés le hLDLR et le mLDLR. Ces lignées sont utilisées : i) pour la caractérisation de peptides se fixant sur le hLDLR exprimé à la surface des cellules, dans sa configuration native ; ii) pour vérifier que le hLDLR et le mLDLR peuvent internaliser les peptides sélectionnés par endocytose.
La construction de ces lignées est brièvement décrite. Les séquences des ARN messagers codant pour le hLDLR et le mLDLR sont disponibles dans les banques de données (numéros d'accès: NM_000527 et NM O 10700 respectivement). Les amorces nécessaires à l'amplification des ADNc par PCR ont été sélectionnées, comportant à leur extrémité (en caractères gras) les sites de restriction nécessaires (HindIII et Sali pour le LDLR humain et HindIII et Kpnl pour le LDLR murin) au clonage dans le vecteur d'expression pEGFP-Nl (Clontech) :
hLDLR
Amorce Forward : AT ATAT AAGC TTCG AGGAC AC AGC AGGTCGTGAT Amorce Reverse : TTAATTGTCGACCACGCCACGTCATCCTCCAGACT
mLDLR
Amorce Forward : AT ATAT AAGC TTGACGC AACGC AGAAGCT AAG Amorce Reverse : TTAATTGGTACCGTTGCCACATCGTCCTCCAG
Les ARN totaux préparés à partir de cerveaux humains et murins ont été transformés en ADNc par reverse transcription pour l'amplification par PCR de fragments d'ADN codant pour le hLDLR et le mLDLR. Après amplification, les produits PCR ont été digérés par les enzymes de restriction HindIII-SalI et HindIII-Kpnl respectivement et ligués dans le vecteur d'expression pEGFP-Nl (Clontech), digéré par les mêmes enzymes de restriction. Après transfection dans des cellules eucaryotes, ce vecteur permet l'expression, sous contrôle du promoteur CMV, de LDLR fusionnés à la GFP à leur extrémité C-term, c'est à dire à l'extrémité de leurs domaines intracellulaires (Figure 3). Après transformation de bactéries compétentes E. CoIi DH5α, obtention de colonies isolées, préparation de l'ADN des plasmides, les constructions ont été intégralement séquencées sur les 2 brins pour vérification.
EXEMPLE II
Etablissement de lignées cellulaires CHO exprimant de manière stable les LDLR humain et murin.
Des transfections transitoires dans différentes lignées cellulaires (CHO, COS, N2A et HEK293) ont été réalisées pour déterminer sur cellules vivantes ou fixées les niveaux d'expression et la localisation membranaire du hLDLR et du mLDLR. Le récepteur est visible directement sur cellules vivantes, sous microscopie à fluorescence, sans nécessité d'immunomarquage, grâce à la fluorescence verte émise par la GFP fusionnée en C-term de ces récepteurs. Des transfectants stables ont été sélectionnés par dilution limite et grâce au gène de résistance à la généticine (G418) porté par le vecteur d'expression. Ces lignées ont été amplifiées tout en gardant une pression de sélection. Dans l'exemple évoqué ici, l'expression du hLD LR-GFP de la taille attendue a été vérifiée par Western Blot sur lysats cellulaires avec des anticorps dirigés contre le LDLR humain et contre la GFP. Une protéine correspondant aux tailles combinées de la GFP et du hLDLR (190 kDa) est reconnue par les anticorps anti-hLDLR (Figure 4) et anti-GFP dans des extraits cellulaires préparés à partir des lignées stables. Une lignée CHO exprimant la GFP de manière constitutive a été utilisée comme contrôle négatif. L'anticorps anti-hLDLR ne détecte aucune protéine dans la lignée GFP.
L'immunocytochimie avec l'anticorps anti-hLDLR sur cellules fixées (PFA) des lignées CHO-GFP (utilisée comme contrôle) et CHO-hLDLR-GFP montre que la fusion hLDLR-GFP est bien exprimée dans les cellules transfectées. Des expériences d'immunocytochimie sur cellules non perméabilisées avec du Triton XlOO montrent que le domaine extracellulaire du LDLR est bien détecté au niveau extracellulaire (Figure 5).
Une co-localisation entre le hLDLR et son ligand naturel le LDL, rendu fluorescent par adsorption du DiI, un marqueur fluorescent, est montrée. Ce ligand naturel fluorescent (DiI-LDL) est rapidement internalisé (endocytose) comme visualisé sous microscopie à fluorescence sur cellules fixées (Figure 6- A). Par contre, le DiI-LDL n'est pas endocyté par la lignée contrôle CHO-GFP, ou par une autre lignée contrôle de cellules CHO, qui surexprime par exemple le récepteur humain de la transferrine (hTfR, Figure 6-B), un autre récepteur impliqué dans la transcytose. De plus, l'activité d'endocytose de la lignée CHO-LDLR-GFP est spécifique au ligand du LDLR puisque dans cette lignée, on n'observe pas d'endocytose de ligand qui ne lui soit pas spécifique, à titre d'exemple la transferrine (Tf) marquée avec un fluorochrome rouge (le Texas Red, Figure 6-C).
La fonctionnalité des récepteurs (capacité d'endocytose) est confirmée par des expériences en temps réel, sous vidéo-microscopie à fluorescence montrant que le LDL, ligand naturel du hLDLR, marqué au DiI, est effectivement transporté rapidement et très efficacement dans les cellules exprimant le hLDLR-GFP comparé aux cellules exprimant la GFP seule ou aux cellules exprimant un autre récepteur impliqué dans l'endocytose tel le hTfR (contrôles négatifs). A l'inverse, des expériences de vidéo- microscopie réalisées avec la Tf marquée au Texas Red, qui est très efficacement endocytée par des cellules exprimant le hTfR-GFP, confirment que la transferrine n'est pas endocytée par les cellules d'une lignée contrôle GFP ni par celles d'une lignée hLDLR.
Malgré un haut taux d'expression du hLDLR dans les lignées CHO-hLDLR-GFP, le système d'endocytose est non seulement efficace, mais il a conservé sa sélectivité. La présence de la fusion GFP n'a altéré ni les propriétés d'insertion dans la membrane du hLDLR, ni l'exposition à l'extérieur de la cellule du domaine extracellulaire du hLDLR, ni la fonctionnalité du récepteur dans les processus d'endocytose.
EXEMPLE III
Crible de banques de plusieurs milliards de séquences peptidiques aléatoires présentées par des virus bactériens sur les lignées CHO-hLDLR-GFP et identification de virus bactériens et donc de séquences peptidiques présentant une affinité pour le hLDLR.
Les approches de crible avec des banques de séquences peptidiques aléatoires présentées par des virus bactériens ont été utilisées sur la lignée CHO-hLDLR-GFP, après épuisement des banques de virus bactériens sur une lignée contrôle CHO-GFP exprimant la GFP seule. Après lavage abondant puis élution à l'acide, les virus bactériens fixés sur les lignées sont amplifiés par infection de bactéries E. CoIi ER 2738 en milieu liquide ou sur boîtes de Pétri. Les cribles réitératifs sur lignées cellulaires des virus bactériens élues puis réamplifiés ont permis la caractérisation de virus bactériens présentant une forte affinité pour le hLDLR exprimé à la surface des cellules. Parmi ces virus bactériens, n'ont été retenus que ceux qui se lient également à la lignée murine (CHO-mLDLR-GFP).
Cinq cribles indépendants ont été réalisés et au total, environ 200 clones de virus bactériens (plages retard) ont été séquences après amplification par PCR des régions du génome du virus bactérien codant pour les peptides présentés par ces virus bactériens. De nombreux virus bactériens présentaient des séquences identiques. Deux familles de séquences de peptides ont été obtenues : des peptides cycliques avec motif conservé, SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 30 à SEQ ID NO : 65, et des peptides linéaires sans motif conservé SEQ ID NO : 12 à SEQ ID NO : 29. (cf. liste des séquences du présent document).
Les clones de virus bactériens identifiés suite à la liaison des peptides qu'ils présentent et qui se lient au hLDLR-GFP exprimé par la lignée stable CHO-hLDLR-GFP ont été mis en présence des cellules des lignées LDLR et après lavage intensif, ont été détectés avec un anticorps dirigé contre la protéine de l'enveloppe virale du virus bactérien suivi d'un second anticorps couplé à l'Alexa 594. (Figure 7). Ces virus bactériens ne se fixent pas sur les cellules de la lignée contrôle CHO-GFP exprimant la GFP seule.
Des lots de virus bactériens purifiés avec des titres identiques ont été mis en compétition sur les lignées et après lavage intensif et élution à l'acide, clonage et séquençage d'une cinquantaine de virus bactériens, les plus affïns parmi les peptides cycliques et linéaires ont été identifiés. Ceux qui n'ont pas été sélectionnés ou retenus pour d'autres expérimentations ne sont en aucun cas dénués d'intérêt, ils ne peuvent pas être considérés comme non fonctionnels. Ces peptides conservent un potentiel important en tant que candidats- vecteurs, ils sont par conséquent également revendiqués par la présente invention.
EXEMPLE IV
Interaction des peptides présentés par les virus bactériens avec le hLDLR des lignées
CHO-LDLR-GFP et avec le hLDLR de cellules non modifiées génétiquement.
Les virus bactériens présentant des peptides affïns pour le hLDLR ont été incubés avec des cellules adhérentes, non modifiées génétiquement, et connues pour exprimer de manière constitutive ou inductible le hLDLR, notamment des fîbroblastes humains, des cellules endothéliales humaines préparées à partir de cordon ombilical (HUVEC) ou des cellules endothéliales micro vasculaires de cerveau de porc. Les approches d'immunocytochimie avec les anticorps dirigés contre la protéine de l'enveloppe virale du virus bactérien montrent que les peptides affïns pour le hLDLR, présentés par les virus bactériens, se lient également au LDLR présents sur des cellules primaires, non génétiquement modifiées, par exemple des fibroblastes humains et des cellules endothéliales micro vasculaires de cerveau de porc (Figure 8).
Les approches d'immunocytochimie de nature qualitative ont été complétées avec des approches quantitatives de cytométrie en flux (FACS) avec des cellules en suspension (lignée GFP, lignée CHO-hLDLR-GFP, fibroblastes humains, cellules HUVEC). Ces cellules ont été cultivées dans du milieu de culture, elles ont été décollées et dissociées mécaniquement (sans trypsine), centrifugées, resuspendues et incubées en présence de différents clones de virus bactériens et de l'anticorps anti-LDLR, pendant 20 min à 4°C afin d'éviter tout processus d'endocytose. Après lavages, les virus bactériens liés aux cellules, ont été révélés avec un anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale. Les analyses par FACS ont été réalisées avec un FACSCanto (Beckton Dickinson) utilisant le logiciel BD FACSDiva. Le nombre de cellules positives a été standardisé à 5000 événements pour chaque essai. Les résultats ont été exprimés en unités arbitraires de fluorescence.
Ces approches ont démontré une corrélation entre le taux d'expression du hLDLR déterminé par l'anticorps anti-hLDLR révélé par anticorps secondaire Alexa 488 (axe horizontal) sur différents types cellulaires (Figures 9-11), et un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe du virus bactérien, révélé par un anticorps Alexa 647 ou un anticorps Allophycocyanine ou APC (axe vertical). Les Figures 9, 10, 11 correspondent aux résultats obtenus pour les peptides SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 21 sur des cellules de la lignée CHO-hLDLR-GFP (Figure 9), des fibroblastes humains (Figure 10) et des cellules HUVEC (Figure 11).
L'hypothèse, selon laquelle les peptides présentés par les virus bactériens affins pour le hLDLR pourraient interagir avec les domaines de liaison du LDL, le ligand naturel du hLDLR, a été évaluée sur différents types cellulaires, notamment sur cellules endothéliales HUVEC par des expériences de FACS, similaires à celles présentées ci- dessus, comme montré ici pour exemple (Figure 12). Dans un premier temps il est montré que le taux de liaison des virus bactériens présentant des peptides affins pour le hLDLR (SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 11 sont utilisés ici comme exemples) est proportionnel au taux d'expression du LDLR par les cellules HUVEC. Des expériences de FACS réalisées en présence de LDL, ont permis de démontrer et de quantifier un déplacement important (85%) du LDL par les peptides linéaires (par exemple SEQ ID NO : 21), mais minime (17%) par les peptides cycliques (par exemple SEQ ID NO : 11).
EXEMPLE V
Interaction des peptides présentés par les virus bactériens affins pour le hLDLR avec les cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux de souris in vivo.
Les virus bactériens présentant des peptides affins pour le hLDLR (SEQ ID NO : 1 est décrit ici pour exemple) et des virus bactériens contrôles (ne présentant pas de peptide affîn pour le hLDLR) ont été injectés dans la veine de queue de souris C57BL6 anesthésiée à l'halothane. Après 15 min et 2h post injection, les souris ont été sacrifiées et perfusées avec du NaCl 0,9%. Le cerveau, le foie et les reins ont été congelés dans l'isopentane et des coupes à congélation ont été réalisées pour un double marquage par immunohistochimie permettant de visualiser d'une part les vaisseaux sanguins avec une IgG anti- souris et un anticorps anti-protéine de l'enveloppe virale permettant de visualiser les virus bactériens liés aux cellules endothéliales in vivo. Les expériences montrent que les virus bactériens présentant le peptide SEQ ID NO : 1 affîn pour le hLDLR et pour le mLDLR se lient aux cellules endothéliales de la paroi des vaisseaux, ce qui n'est pas le cas des virus bactériens contrôles (Figure 13).
EXEMPLE VI
Synthèse des peptides correspondant aux virus bactériens affins pour le hLDLR, couplage à une molécule traceur (biotine, fluorescéine, ou S-Tag avec une activité enzymatique).
Les peptides ont été synthétisés par la méthode de synthèse en phase solide (solid phase peptide synthesis ou SPPS) sur un synthétiseur automatique, modèle Advanced ChemTech Apex396 (AAPPTec), ou un synthétiseur automatique assisté par les microondes, modèle Liberty™ (CEM), en utilisant une stratégie Fmoc/tBu sur résines Rink Amide AM sur polystyrène- 1%D VB, Wang sur polystyrène- 1%D VB, Barlos (2- chlorotrityl Monde) sur polystyrène- 1%D VB, ou Sieber Amide sur polystyrène- 1%DVB. La charge (ou substitution) est comprise entre 0,25 et 1,6 mmol/g suivant la résine utilisée. Les acides aminés N-protégés par un Fmoc (ou un Boc pour certaines extrémités N- term) et/ou protégés par des fonctions orthogonales (acido-labiles notamment) au niveau de leurs chaînes latérales, les réactifs chimiques de couplage et de déprotection, et les solvants sont achetés auprès de sociétés spécialisées et utilisés tels quels. Les résines Rink Amide et Wang permettent de synthétiser les séquences peptidiques totalement déprotégées sur leurs chaînes latérales et leurs extrémités C-term. On parle alors de synthèse peptidique SPPS orthogonale à 2 dimensions (Fmoc/tBu). Les résines « hypersensitive acid labile ou HAL » de type Barlos et Sieber permettent la libération de la fonction acide ou amide terminale (en C-term) tout en conservant les protections latérales orthogonales des différents acides aminés du peptide synthétisé ainsi que la protection aminé terminale (N-term) de la fonction aminé de son dernier acide aminé (par exemple, N-acétylation pour des questions de stabilité de la séquence peptidique néo-synthétisée). Ce type de résines via une stratégie de synthèse Fmoc (en Proti) permet d'utiliser des protections latérales orthogonales acido-labiles (PrOt2 de type Boc, tBu, OtBu, Trt, Mmt, Acm, etc.) clivables uniquement en milieu fortement acide, alors que le décrochage du peptide protégé se fait en conditions acides très douces. Ce type de clivage permet de récupérer la séquence peptidique totalement protégée sur ses fonctions latérales (PrOt2) en vue du couplage de la molécule d'intérêt thérapeutique sur le peptide. On parle alors de synthèse peptidique SPPS orthogonale à 3 dimensions (Barlos ou Sieber/Fmoc/tBu). Les protections latérales orthogonales (Prot2) standard utilisées pour chaque acide aminé au cours de la synthèse peptidique sont : Arg(N-Pbf), Arg(N-Pmc), Asn(N-Trt), Asp(O- tBu), Cys(S-Acm), Cys(S-Mmt), Cys(S-4MeBn), Cys(S-tBu), Cys(S-Tmob), Cys(S- Trt), Glu(O-tBu), Gln(N-Trt), His(N-Trt), Lys(N-Boc), Ser(O-tBu), Thr(O-tBu), Trp(N- Boc), Tyr(O-tBu) {Applied Biosystems, 1998, Cleavage, Deprotection, and Isolation of Peptides after Fmoc Synthesis. Technical Bulletin). GIy, AIa, Val, Leu, Ile, Phe, Met et Pro ne possèdent pas de protections latérales, puisque leurs structures chimiques respectives ne le nécessitent pas. Les couplages d'acides aminés se font via activation de la fonction acide de l'acide aminé n+1 à l'aide de DIEA/HBTU/HOBt ou DIPC/HOBt dans du DMF. La déprotection du groupement Fmoc (Proti) d'un nouvel acide aminé ainsi couplé est réalisée à l'aide de 20% de pipéridine dans le DMF. Le dernier acide aminé couplé au cours de la séquence peptidique sera soit protégé par une fonction Boc (en vue de libérer sa fonction aminé terminale libre en fin de synthèse), soit acétylé (afin de stabiliser le néo-peptide synthétisé mais également de réduire les risques de réactions secondaires lors du couplage co valent de la molécule d'intérêt thérapeutique en C-term par exemple). Suivant le peptide synthétisé, les ponts disulfures sont obtenus par cyclisation intramoléculaire à partir de 2 fonctions thiols de 2 Cys convenablement protégées (Acm, Trt, tBu, etc.), soit en solution, soit sur la résine, à l'aide de réactifs classiquement utilisés par l'homme de l'art : I2/DMF, I2/HFIP/DCM, TFA/DMSO/anisole, I2/DCM/MeOH/H2O, etc. Une Cys en positon N-term peut être avantageusement remplacée par un acide Mpa pour la cyclisation via un pont disulfure. Des ponts lanthionines (par cyclisation via déshydroalanine) ou dicarba (par cyclisation via allylGly) peuvent également être obtenus par des voies de synthèse connues de l'homme de l'art. Un pont lactame peut-être créé entre la fonction acide latérale d'un résidu Glu (ou Asp) et une fonction aminé latérale sur une Lys ou une aminé N-term. De même une cyclistion entre la fonction aminé N-term et la fonction acide C-term (tête/queue) peut être réalisée via une liaison amide, tout comme une cyclisation entre la fonction aminé latérale d'une Lys et la fonction acide C-term du peptide. Le clivage des peptides des résines Barlos ou Sieber se fait par des méthodes classiquement utilisées par l'homme de l'art, soit avec 0,5% de TFA (v/v) dans du DCM, soit avec de l'AcOH/TFE/DCM (1/1/3), soit avec du HFIP (30%) dans du DCM, soit avec du TFE (30%) dans du DCM, etc.
Les déprotections des chaînes latérales, et le clivage des peptides des résines Rink Amide ou Wang, sont réalisés par des méthodes classiquement utilisées par l'homme de l'art : soit avec un mélange TFA/H2O/TIS ou TIPS (95/2,5/2,5), soit avec TFA/H2O/EDT/TIS ou TIPS (94/2,5/2,5/1), soit avec TFA/thioanisole/H2O (94/5/1), soit avec TFA/TIS/H2O/thioanisole (90/5/3/2), soit avec
TFA/H2O/phénol/thioanisole/EDT (82,5/5/5/5/2,5), etc. Les biotines, fluorescéines, ou S-Tag (cf. EXEMPLE VII, ci-dessous) sont introduits en C-term selon des procédés de synthèse et de couplage classiques connus de l'homme de l'art.
Les peptides sont isolés et purifiés par HPLC sur un Appareil Beckman System GoId 126 avec une colonne Chromolith C18 (4,6 x 50 mm) ou Nucleosil C18 (10 x 250 mm) avec par exemple un gradient de 0 à 100% d'acétonitrile dans une phase aqueuse (H2O + 0,1% TFA) en 3,5 min puis 100 à 0% en 1,5 min (débit : 1 à 5 ml/min), ou sur une chaîne Waters 1525 avec une colonne (phase stationnaire) Chromolith Speed ROD RP- 18 (4,6 x 50 mm) avec détection par un équipement Waters 996 PDA (190 - 400 nm), ou sur une chaîne Waters Alliance 2690 avec une colonne (phase stationnaire) Chromolith Performance RP- 18 (3 x 100 mm) avec détection par un équipement Waters 996 PDA (190 - 400 nm). La détection UV est réalisée à 214 et 254 nm. Les purifications préparatives sont réalisées avec une chaîne Waters prep LC4000 System avec une colonne (phase stationnaire) Guard-PakTM cartridges Delta-PakTM Cl 8 (25 x 10 mm) avec détection par un équipement Waters 2487 Dual 1 Absorbance Detector.
Les masses moléculaires sont déterminées en utilisant un spectromètre de masse à électrospray d'ions (ESI) en mode positif. Les spectres sont obtenus en utilisant un appareil Waters MicromassQuattro Micro (analyseur quadripôle) équipé d'un système HPLC Waters Alliance 2690 permettant le couplage LC-MS. Les conditions d'analyses LC-MS utilisées sont les suivantes :
- colonne Cl 8 Chromolith Flash (4,6 x 25 mm),
- débit de 3 mL/min,
- gradient linéaire de 0 à 100 % de B en 2,5 min (A : H2O/HCO2H 0,1 % ; B : ACN/HCO2H 0,l %).
L'acquisition des spectres de masse en mode electrospray positif se fait à un débit de 100-200 μL/min. Les données sont obtenues en mode scan de 200 à 1700 m/z à intervalles de 0,1 s. EXEMPLE VII
Liaison et endocytose des peptides synthétisés, affïns pour le hLDLR dans les lignées CHO-LDLR-GFP.
Des peptides affïns pour hLDLR-GFP, ainsi que des peptides contrôles (random peptides, résidus identiques aux peptides affïns mais dans le désordre) ont été synthétisés, et couplés/conjugués en C-term à différentes molécules « traceurs », soit la rhodamine, soit le S-Tag, séparés par un bras espaceur constitué de 3 résidus GIy (Figure 14). Le S-Tag (peptide de 15 acides aminés dérivé de la séquence 1-15 de la ribonucléase A pancréatique bovine) peut d'une part être reconnu par un anticorps anti- S-Tag pour des approches d'immunocytochimie ou de FACS, et d'autre part reconstituer une activité enzymatique par liaison à la ribonucléase S-protein (portion C- term, acides aminés 21-124) dans des tests d'activité in vitro utilisant le FRETWorks S- Tag assay kit (Novagen 70724-3). La ribonucléase ainsi activée digère un substrat d' ARN libérant un agent fluorescent masqué révélé par FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfert) et quantifié en plaque de 96 puits dans un spectrofluorimètre Beckmann. Pour ces expériences de FRET, des cellules CHO contrôles et la GFP fusionnée en C-term au hLDLR et au mLDLR, qui génère un bruit de fond important aux longueurs d'ondes utilisées pour le FRET a été remplacée par la Red Fluorescent Protein (RFP). Les lignées stables générées pour les expériences de FRET sont donc CHO-RFP et CHO-hLDLR-RFP.
Pour les approches de FRET, les cellules sont lavées 2 fois avec 2 ml de PBS puis incubées Ih à 37°C avec 250 μl de solution de peptide. Elles sont à nouveau lavées 2 fois avec 2 ml de PBS puis 2 fois avec 1 ml de PBS, puis grattées dans 1 ml de PBS et centrifugées 5 min à 1250 rpm. Le surnageant est alors aspiré et le culot cellulaire est lysé dans 80 μl de PBS + 0.1% de Triton XlOO. Vingt μl de chaque lysat cellulaire sont analysés par mesure de l'émission de fluorescence après réaction de FRET. Des expériences d'incubation des peptides sur différentes cellules exprimant le hLDLR ont été réalisées. Les résultats obtenus avec le peptide SEQ ID NO : 1 conjugué à la rhodamine ou le peptide SEQ ID NO : 2 conjugué au S-Tag sont montrés pour exemple et indiquent que les peptides se lient bien aux cellules CHO-LDLR-GFP et qu'ils sont endocytés pour s'accumuler dans les cellules de la lignée qui expriment le hLDLR, ce qui n'est pas le cas des peptides contrôles (Figure 15). Dans ces expériences, des incubations préalables des peptides conjugués au S-Tag, avec un anticorps primaire (Ac primaire) dirigé contre le S-Tag, et d'un anticorps secondaire (Ac secondaire) dirigé contre l'anticorps primaire montrent que le complexe SEQ ID NO : 2/S-Tag/Ac primaire/ Ac secondaire se lie aux cellules exprimant le hLDLR et est internalisé par endocytose. Ces résultats indiquent que les peptides de la famille SEQ ID NO : 2 peuvent se lier à des cellules exprimant le hLDL et vectoriser des charges importantes (2 anticorps), i.e. internalisation par endocytose de ces charges.
L'endocytose des peptides affîns pour le hLDLR a été quantifiée. Dans ce but, les peptides SEQ ID NO : 11/S-Tag et contrôle (random peptide) ont été incubés avec les cellules CHO-hLDLR-RFP pendant Ih à 37°C. Les cellules ont été lavées afin d'éliminer toute trace de peptide non fixé. Les lavages ont été effectués d'une part avec du PBS ce qui permet de quantifier par FRET les peptides fixés à la membrane cellulaire et ceux internalisés par endocytose (Figure 16-A), d'autre part avec une solution acide (glycine 0.2M, NaCl 0.15M, pH3) qui permet de dissocier les peptides fixés au hLDLR à la membrane cellulaire. Seuls les peptides endocytés par les cellules sont alors détectés par FRET (Figure 16-B). De même avec les peptides SEQ ID NO : 2/S-Tag sur fîbroblastes humains (Figure 16-C-D).
Ces observations ont également été confirmées sur cellules non adhérentes par FACS. Un exemple est donné de la liaison sur les cellules de la lignée CHO-hLDLR-GFP du peptide SEQ ID NO : 11 à l'inverse du peptide contrôle, tous deux étant conjugués au S-Tag, (Figure 17).
EXEMPLE VIII
Toxicité, endocytose et transcytose des peptides synthétisés, affîns pour le hLDLR, sur des cellules endothéliales dans un modèle de BHE in vitro. Les potentiels effets toxiques des peptides sur cellules endothéliales, la liaison/accumulation des peptides dans ces cellules, et le passage par transcytose des peptides ont été évalués sur modèles de BHE in vitro. Les cellules nécessaires à la mise en place du modèle (co-culture de cellules endothéliales issues de micro -vaisseaux cérébraux et astrocytes) sont des cellules bovines (bovine brain microvascular endothelial cells, BBMEC) distribuées par la société Cellial Technologies (Lens, France). Ce modèle de BHE in vitro est utilisé pour évaluer le passage passif ou le transport actif de nombreuses molécules, notamment des agents pharmaco logiques, à travers la BHE et donc leur capacité à atteindre le tissu nerveux du SNC. Le modèle présente des propriétés ultra- structurales caractéristiques de l'endothélium cérébral notamment les jonctions serrées, l'absence de pores, l'absence de canaux trans- endothéliaux, la faible perméabilité aux molécules hydrophiles et une haute résistance électrique. En outre, ce modèle a montré une bonne corrélation entre les résultats des mesures effectuées sur différentes molécules évaluées in vitro et in vivo pour leur propriété de passage au travers de la BHE. A ce jour, toutes les données obtenues révèlent que ce modèle de BHE imite de près la situation in vivo en reproduisant certaines des complexités de l'environnement cellulaire qui existent in vivo, tout en conservant les avantages associés à l'expérimentation de culture de tissus. De nombreuses études ont validé cette co-culture cellulaire comme l'un des plus reproductible modèle de BHE in vitro.
Le modèle de BHE in vitro met en jeu une co-culture de BBMECs et d'astrocytes. Préalablement à la culture cellulaire, des inserts de plaque (Millicell-PC 3,0 μM ; 30 mm de diamètre) sont traités sur la partie supérieure avec du collagène de queue de rat afin de permettre une adhésion optimale des BBMECs et créer les conditions d'une lame basale. Des cultures primaires d'astrocytes mixtes sont établies à partir de cortex cérébral de rat nouveau-né (Dehouck et al., 1990, J. Neurochem., 54, 1798-1801). Brièvement, après avoir ôté les méninges, le tissu cérébral est passé sur un tamis de nylon à 82 μm. Les astrocytes sont distribués dans les puits de microplaques à une concentration de 1,2x105 cellules/ml et 2 ml de milieu de culture optimal (DMEM) complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal inactivé par chauffage. Le milieu est changé deux fois par semaine. Les BBMECs obtenus auprès de Cellial Technologies sont cultivées en présence de milieu DMEM complémenté avec 10% (y IY) de sérum de cheval et 10% de sérum de veau inactivé par chauffage, 2 mM de glutamine, 50 μg/ml de gentamycine, et de 1 ng/ml de facteur de croissance basique de fîbroblastes, ajouté tous les deux jours. Les BBMECs sont ensuite distribuées sur la face supérieure des filtres dans 2 ml de la co-culture. Ce milieu de BBMECs est changé trois fois par semaine. Dans ces conditions, des BBMECs différenciées forment une monocouche de cellules confluentes 7 jours plus tard. Les expériences rapportées ci-dessous sont réalisées entre 5 et 7 jours après que la confluence ait été atteinte.
Le peptide SEQ ID NO : 1 et un peptide contrôle, tous deux conjugués à la rhodamine, ont été incubés dans la chambre supérieure du système de culture, en contact avec les cellules endothéliales pendant Ih, 5h et 24h. Le milieu de culture de la chambre inférieure est collecté à différents temps et la fluorescence quantifiée par analyse fluorimétrique. Les résultats sont exprimés en perméabilité de surface endothéliale (ou Pe) exprimée en 10~3 cm/min. Le Lucifer Yellow (LY), une petite molécule fluorescente qui passe peu la BHE, est utilisé d'une part pour contrôler l'intégrité de la BHE in vitro, dans tous les puits analysés, mais d'autre part, en co-incubation avec les peptides, afin de contrôler l'absence de toxicité des peptides pour les cellules endothéliales qui forment cette BHE. La barrière in vitro est considérée « perméable » ou « ouverte » si la valeur de passage Pe du LY est supérieure à 1.10" cm/min. La mesure de la Tr ans Endothelial Electrical Resistence (TEER), évaluée avec un Ohm-mètre et exprimée en Ohm.cm2, permet également de mesurer l'intégrité de la BHE in vitro lors des tests de passage à travers cette BHE. La valeur du seuil de qualité est fixée à >500 Ohm.cm2.
Les analyses réalisées avec les peptides montrent une absence de toxicité du peptide SEQ ID NO : 1, de même pour le peptide contrôle utilisé, et une absence d'effets délétères sur les propriétés de perméabilité de la BHE, puisque les valeurs de Pe mesurées avec le LY n'augmentent pas en présence ou absence des peptides, même après 24h d'incubation (Figure 18).
Le taux de liaison et/ou d'internalisation d'un peptide contrôle et du peptide SEQ ID NO : 1 , tous deux conjugués à la rhodamine, a été déterminé sur le modèle de BHE in vitro décrit ci-dessus. Cette analyse a été réalisée par lyse des cellules endothéliales à différents temps (2h, 5h, 24h), et mesure par fluorimétrie de la quantité de fluorescence (rhodamine), associée aux cellules (compartiments membranaires et cytoplasmiques obtenus par centrifugation ces cellules après lyse). Les valeurs mesurées indiquent que le peptide SEQ ID NO : 1 conjugué à la rhodamine a plus d'affinité pour les cellules endothéliales dans un modèle de BHE in vitro que le peptide contrôle, à tous les temps analysés (Figure 19).
Le passage d'un peptide contrôle et du peptide SEQ ID NO : 1, tous deux conjugués à la rhodamine a été déterminé sur le modèle de BHE in vitro décrit ci-dessus. Cette analyse est réalisée en mesurant par fluorimétrie la quantité de fluorescence accumulée dans le puits receveur à différents temps (Ih, 4h, 24h). L'intégrité de la BHE dans les différents puits analysés a été évaluée par mesure simultanée du taux de LY qui passe d'un compartiment à l'autre en fonction du temps. Les valeurs de Pe mesurées indiquent qu'aux temps courts (Ih et 4h), les taux de peptide SEQ ID NO : 1 qui passent par transcytose ne peuvent être distingués du passage non spécifique ou para-cellulaire tel que mesuré pour le peptide contrôle. Par contre, à 24h, le taux de passage du peptide SEQ ID NO : 1 conjugué à la rhodamine est très significativement supérieur à celui du peptide contrôle. Les mesures de LY montrent également que l'intégrité de la BHE est préservée à Ih, 4h et 24h (Figure 20). D'autres mesures montrent que la concentration du peptide SEQ ID NO : 1 conjugué à la rhodamine est très supérieure dans le compartiment receveur à 24h, comparée à celle du compartiment donneur, suggérant un transport actif du peptide, certainement via les récepteurs, sans quoi un équilibre de concentration aurait été atteint entre les 2 compartiments.
EXEMPLE IX Optimisation chimique du peptide vecteur SEQ ID NO : 11.
Une étude des relations structure/activité (affinité) a été réalisée sur le peptide vecteur SEQ ID NO : 11 par l'intermédiaire de la technique de l'alanine scanning (Ala-scan) et par troncation en N- et C-term afin de déterminer l'importance de chacun des 15 acides aminés constitutifs de ce peptide. L'affinité pour le hLDLR de chacun des peptides néo- synthétisés issus de l'optimisation chimique a été déterminée par fluorimétrie en mesurant le taux de déplacement du peptide SEQ ID NO : 11 conjugué en C-term via un bras espaceur de 3 GIy au peptide S-Tag (SEQ ID NO : 11/S-Tag) (cf. EXEMPLE VII). Brièvement, les cellules utilisées CHO-hLDLR-RFP sont adhérentes et à confluence. Elles sont cultivées dans des plaques 6 puits. Trois puits de cellules sont utilisés par condition.
Une solution contenant lOμM de peptide SEQ ID NO : 11/S-Tag est préparée dans du milieu de culture HamF12-l% BSA. A cette solution est ajouté 10 μM de peptide issu de l'Ala-scan à évaluer (compétition). Plusieurs solutions contrôles sont aussi préparées : (i) Milieu HamF 12- 1 % BSA.
(ii) Milieu HamF 12-1% BSA + 10 μM de peptide contrôle CTRL-S-Tag (évaluation de la liaison non spécifique de tout peptide comportant un S-Tag).
(iii) Milieu HamF12-l% BSA + 10 μM de peptide SEQ ID NO : 11/S-Tag + 10 μM de peptide contrôle CTRL (évaluation de la compétition « non spécifique » entre le peptide d'intérêt et le peptide contrôle CTRL).
Les approches de FRET utilisées sont celles décrites dans l'EXEMPLE VII.
Une soixantaine de peptides ont été testés par ces approches. 36 de ces peptides (SEQ ID NO : 30 à SEQ ID NO : 65) présentent une affinité in vitro pour le LDLR.
Cette étude a par ailleurs confirmé l'importance des cystéines et donc du cycle et du motif tripeptidique MPR.
Cette étude a également permis de réduire la taille du peptide vecteur puisque le peptide cyclique de 8 acides aminés (SEQ ID NO : 48) comprenant au minimum un acide aminé de configuration D, présente une excellente affinité pour le LDLR.
Selon le même protocole, la SEQ ID NO : 48/S-Tag sert de référence pour l'optimisation chimique (étude de la taille du cycle, introduction d'acides aminés non naturels) du peptide- vecteur SEQ ID NO : 48, et mesure de l'affinité de conjugués sur le LDLR. Ainsi, les conjugués SEQ ID NO : 66 à SEQ ID NO : 72, décrits dans la présente demande, présentent également une affinité in vitro pour le LDLR.
EXEMPLE X
Stratégie pour la synthèse chimique de conjugués vecteur/molécule d'intérêt thérapeutique ou agent d'imagerie (ou de diagnostic) ou toute autre molécule comme une sonde moléculaire.
Une molécule d'intérêt thérapeutique ou agent d'imagerie ou de diagnostic ou toute autre molécule comme une sonde moléculaire peut être relargué(e) du vecteur après transport et passage au travers des membranes cellulaires et plus particulièrement de la
BHE, par exemple au travers d'une stratégie prodrogue par hydrolyse ou clivage enzymatique d'une liaison chimique entre le vecteur et la substance active.
Le couplage covalent, entre le vecteur peptidique totalement protégé sur ses fonctions réactives latérales (cas des couplages en C-term et N-term) ou partiellement protégé (cas du couplage sur une fonction réactive d'une chaîne latérale), et la molécule d'intérêt thérapeutique, est réalisé via 2 stratégies générales (Figure T) : synthèse en tandem (i.e. couplage direct sans intermédiaire entre les 2 entités), synthèse au travers d'un linker (Temsamani et al., 2004, Drug Discov. Today, 23, 1012-1019).
A titre d'exemple, la synthèse en tandem du conjugué peptidique SEQ ID NO : 66 entre un peptide thérapeutique analgésique, la dalargine, et le peptide vecteur SEQ ID NO : 48 a été réalisée comme décrit pour la synthèse de peptides dans l'EXEMPLE VI.
A titre d'exemple, les synthèses via linkers peptidiques (GGG, GFLG, ALAL, β-Ala, Ahx, GFAL) des conjugués peptidiques SEQ ID NO : 67 à SEQ ID NO : 72 entre un peptide thérapeutique analgésique, la dalargine, et le peptide vecteur SEQ ID NO : 48 ont été réalisées comme décrit pour la synthèse de peptides dans l'EXEMPLE VI. En fonction du vecteur peptidique sélectionné et de la molécule d'intérêt thérapeutique choisie, l'une ou l'autre des diverses stratégies est appliquée soit sur le C-term, soit sur le N-term, soit sur une fonction réactive d'une chaîne latérale. Idéalement, les bras espaceurs sélectionnés doivent permettre une bonne libération de la substance active et l'amélioration de la solubilité du conjugué (Molema et al, 2001, Drug targeting, organ- specific stratégies. In Methods and principles in médicinal chemistry, vol. 12). Diverses liaisons chimiques covalentes labiles peuvent ainsi être générées entre les 2 entités (vecteur et substance active) au travers ou non d'un bras espaceur : amides, carbamates, esters, thioester, disulfure, etc. Par exemple, il a été montré dans la littérature que les liaisons disulfures, relativement stables dans le plasma, peuvent être clivées à l'intérieur du compartiment intracérébral pour redonner une fonction thiol libre (Saito et al., 2003, Adv. Drug Deliv. Rev., 55, 199-215).
D'autres composés intéressants sont ceux dans lesquels le bras espaceur représente un polymère tel que le polyéthylène glycol (PEG). En effet, il a été montré dans la littérature que la conjugaison d'une molécule organique d'intérêt biologique avec un PEG permettait d'augmenter la demi-vie plasmatique de cette molécule (Greenwald et al., 2003, Adv. Drug Deliv. Rev., 55, 217-250) et de diminuer sa clairance. Les conjugués vecteurs/substances actives ou d'intérêt sont utilisables en diagnostic, imagerie ou thérapie d'une pathologie, d'une lésion ou d'un trouble du SNC pour la préparation d'un médicament capable de traverser la BHE, d'une tumeur cancéreuse cérébrale ou d'un autre type de cellules cancéreuses pour la préparation d'un médicament capable de traverser les membranes cellulaires cancéreuses, et/ou de pathologies infectieuses pour la préparation d'un médicament capable de traverser les membranes cellulaires et de cibler les cellules infectées des pathologies infectieuses cérébrales ou autres, de type bactériennes, virales, parasitaires ou fongiques.
EXEMPLE XI
Perfusion cérébrale in situ pour les vecteurs et les conjugués vecteur/molécule d'intérêt thérapeutique ou agent d'imagerie (ou de diagnostic) ou toute autre molécule comme une sonde moléculaire, et étude de leur cinétique de transport au travers de la BHE, et de leur accumulation dans le cerveau de souris. La technique de perfusion cérébrale in situ (chez la souris mâle adulte OFl) est utilisée ici pour sélectionner les meilleurs vecteurs et apporter la preuve de leur mécanisme d'action pour leur passage dans le cerveau au travers de la BHE.
Au préalable, les vecteurs peptidiques sont radiomarqués au tritium (3H), qui offre la plus forte sensibilité pour la détection de composés radioactifs notamment sur des coupes de tissus. La préparation de peptides radioactifs à haute radioactivité spécifique (RAS, pouvant aller jusqu'à 100 Ci/mmole) est réalisée par une stratégie d'acylation de la fonction aminé N-term par de l'anhydride propio nique (ou propanoïque) tritié ou du propionyl-N-succinimide (NPS) tritié. Cette méthode de tritiation peut être appliquée à tous les peptides, à condition que la modification du N-term n'affecte pas l'affinité des peptides pour le récepteur ciblé (i.e. LDLR) ou leur activité biologique dans le cas de peptides thérapeutiques. La réaction de tritiation des peptides vecteurs SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 48 en N-term par propionylation est réalisée dans le DMF (lmg de peptide dans 100 à 450 μl selon solubilité) par ajout de 0,1 équivalent de NPS tritié pendant 5 mn à T ambiante, puis de 0,9 équivalent de NPS froid (non tritié) pendant Ih, puis d'un nouvel équivalent de NPS froid pendant 5 h. Le milieu réactionnel est ensuite laissé à 4°C pendant la nuit et purifié le lendemain par HPLC. La RAS pour chaque peptide tritié est comprise entre 5 et 10 Ci/mmol (théoriquement de l'ordre de 7,7 Ci/mmol). La quantité totale de radioactivité préparée par synthèse est comprise entre 600 et 950 μCi.
Dans le cas des conjugués vecteurs/substances actives, il est important, pour éviter les synthèses chimiques radiomarquées nécessitant le développement de nouvelles voies de synthèse longues et coûteuses, de choisir une substance active modèle déjà commercialisée avec marquage au carbone 14 (14C). Le couplage covalent des peptides radiomarqués (au 3H par exemple) à une substance active radiomarquée (au 14C par exemple) est effectué, tel que décrit dans l' EXEMPLE X. Comme mentionné précédemment, ce couplage covalent est réalisé en fonction de la structure et des propriétés physico-chimiques de la substance active, en particulier la présence de groupes chimiques fonctionnels pouvant être modifiés sans diminuer l'activité biologique de cette substance. Les synthèses des conjugués radiomarqués sont réalisées par extrapolation à partir des voies de synthèse mise au point sur les conjugués non- radiomarqués.
Une autre stratégie consiste en la synthèse d'un conjugué entre un peptide thérapeutique et un peptide vecteur via un linker (pouvant être de nature peptidique ou organique) ou non, comme dans le cas des conjugués SEQ ID NO : 66 à SEQ ID NO : 72 décrits dans la présente demande. Ainsi, le conjugué SEQ ID NO : 72 tritié en N-term a été préparé comme décrit ci-dessus.
Les techniques brièvement résumées ci-dessous ont été développées pour étudier la distribution cérébrale de substances actives et en particulier le rôle de la BHE et plus particulièrement du LDLR dans la pénétration de ces molécules dans le cerveau. Les techniques de perfusion cérébrale in situ sont parmi les plus exigeantes techniquement et les plus difficiles à réaliser chez la souris. Toutefois, la perfusion cérébrale in situ
(comme les modèles in vitro) permet un contrôle total de la composition du perfusât artificiel, afin de maintenir les cellules et la vascularisation du cerveau dans des conditions physiologiques et anatomiques normales au sein de l'animal, sans le facteur perturbant de distribution systémique.
Cette stratégie de perfusion cérébrale in situ normalement effectuée chez le rat a été adaptée chez la souris (Dagenais et al., 2000, J Cereb Blood FlowMetab., 20(2), 381-6) afin d'élargir son application à évaluer les paramètres cinétiques de transport au niveau de la BHE et de la barrière sang-rétine, dans des souris transgéniques et KO mutantes pour les récepteurs, enzymes ou transporteurs de substances actives. Il s'agit d'une cathétérisation d'une carotide chez des souris OFl anesthésiées, et de la ligature de certaines branches de cette carotide (externe, thyroïdienne, occipitale) afin de perfuser spécifiquement la carotide interne et les artères ptérygopalatines, qui sont utilisées pour évaluer la captation cérébrale des vecteurs et conjugués. Le cathéter permet de remplacer la circulation générale par une infusion avec un perfusât bien contrôlé
(tampon bicarbonate, plasma ou sang) en passant par la carotide. Du tampon bicarbonate de Krebs oxygéné est utilisé en premier lieu afin d'évaluer les capacités de passage cérébral des vecteurs et conjugués. Après cathétérisation de la carotide, le débit sanguin endogène est stoppé en sectionnant les ventricules du cœur afin d'éviter le mélange du tampon avec le sang et l'élévation de pression sanguine. La durée de la perfusion à débit fixe est contrôlée. La perfusion avec tampon peut être prolongée jusqu'à 20 min, voire jusqu'à Ih en présence de transporteurs d'oxygène (érythrocytes lavés) pour les études de Receptor-Mediated Transport (RMT).
L'étude du peptide vecteur SEQ ID NO : 11 a permis de déterminer son transport cérébral ou coefficient de transfert (Kin). Le temps de perfusion cérébrale pour ces expériences est de 5 min avec un débit de perfusât à 2 ml/min. Ainsi, le calcul du Kin (volume de distribution sur le temps de perfusion cérébrale) du peptide vecteur SEQ ID NO : 11 donne une valeur de 3,5 ± 0,2 x 10"4 ml/s/g.
A noter que la transferrine (Tf) a un Kin de 3,0 x 10"4 ml/s/g {Demeule et al, 2008, J. Neurochem., 106 (4), 1534-1544). Le Kin de la protéine RAP est de 1,0 x 10"5 ml/s/g {Pan ét al, 2004, J. CeIl ScI, 117, 5071-5078).
L'optimisation chimique du peptide vecteur SEQ ID NO : 11 en un peptide vecteur optimisé SEQ ID NO : 48 a permis une amélioration du passage cérébral du peptide vecteur d'un facteur 1,37. Le peptide (SEQ ID NO : 73, CMPRC) a servi de contrôle pour cette étude de perfusion cérébrale. Kin de SEQ ID NO : 48 = 4,8 ± 0,4 x 10"4 ml/s/g Kin de SEQ ID NO : 73 = 1,5 ± 0,2 x 10"4 ml/s/g
Comme décrit précédemment, la conjugaison chimique de la dalargine (SEQ ID NO : 74, Y-(D)-AGFLR) via un linker en N-term du peptide vecteur (SEQ ID NO : 48) a permis d'obtenir le conjugué SEQ ID NO : 72. La dalargine (SEQ ID NO : 74) libre non vectorisée a servi de contrôle pour cette étude de perfusion cérébrale.
Ainsi, le passage cérébral de la dalargine vectorisée (SEQ ID NO : 72) par rapport à sa forme libre non vectorisée (SEQ ID NO : 74) est multiplié d'un facteur 21,78. Kin de SEQ ID NO : 72 = 19,6 ± 3,9 x 10"4 ml/s/g Kin de SEQ ID NO : 74 = 0,9 ± 0,1 x 10"4 ml/s/g
Par ailleurs, ce type d'expérience de perfusion cérébrale in situ permet également d'établir une distinction entre les composés qui restent dans le compartiment vasculaire cérébral de ceux ayant franchi la membrane endothéliale abluminale pour entrer dans le parenchyme cérébral. En effet, la technique de la déplétion capillaire post-perfusion permet de mesurer si la molécule traverse effectivement l'endothélium afin d'entrer dans le parenchyme cérébral. L'utilisation de cette technique permet de démontrer que les vecteurs peptidiques spécifiques (ou les conjugués) ont tendance à s'accumuler dans le parenchyme cérébral. Cette technique (Triguero et al., 1990, J Neurochem., 54(6), 1882-8) est utilisée afin de faire la distinction entre la fraction de vecteurs (ou conjugués), qui a transitée par l'endothélium et est entrée dans le cerveau par l'espace extracellulaire ou les cellules du cerveau, et la fraction restant associée aux cellules endothéliales.
Ainsi, les étapes clés des études de perfusion cérébrale m situ chez la souris peuvent se résumer comme suit pour les vecteurs et conjugués étudiés : i) Evaluation de la tolérance (non toxicité) des vecteurs et conjugués au niveau de la BHE, conservation de l'intégrité de cette barrière physiologique. ii) Etude de la cinétique et de la linéarité de la captation cérébrale via RMT par le
LDLR. iii) Etude du taux de captation cérébrale en fonction de la concentration en vecteurs ou en conjugués (Tmax, Km). iv) Etude des mécanismes de transport à l'aide de substrats inhibiteurs ou modulateurs du LDLR. v) Distribution dans les compartiments du cerveau : déplétion capillaire (Triguero et al., 1990, J Neurochem., 54(6), 1882-8). vi) Evaluation du taux de liaison des vecteurs et conjugués aux protéines plasmatiques (albumines, etc.), étude de leur influence sur la captation cérébrale de ces molécules vii) Administration intraveineuse et évaluation de la distribution tissulaire (cerveau et autres organes) en fonction du temps.
Par ailleurs, les Kin de ces différents peptides, au travers de la barrière sang-rétine (BSR), ont également été déterminés. Kin de SEQ ID NO : 11 = 1,2 ± 0,2 x 10"4 ml/s/g. Kin de SEQ ID NO : 48 = 2,4 ± 0,3 x 10"4 ml/s/g
Kin de SEQ ID NO : 73 = 0,0 ± 0,0 x 10"4 ml/s/g
Kin de SEQ ID NO : 72 = 11,5 ± 3,3 x 10"4 ml/s/g
Kin de SEQ ID NO : 74 = 1,8 ± 0,2 x 10"4 ml/s/g
Ainsi, le passage de la BSR par la dalargine vectorisée (SEQ ID NO : 72) est multiplié d'un facteur 6,39 par rapport à sa forme libre non vectorisée (SEQ ID NO : 74).

Claims

REVENDICATIONS
1) Peptide ou pseudo-peptide comprenant une séquence d'acides aminés naturels et/ou non naturels, caractérisé en ce qu'il contient au plus 30 résidus d'acides aminés et en ce qu'il lie le récepteur humain aux lipoprotéines de faible densité (hLDLR) à la surface de membranes cellulaires.
2) Peptide ou pseudo-peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente la capacité de passer la barrière hémato-encéphalique (BHE) et/ou les membranes de cellules cancéreuses ou infectieuses.
3) Peptide ou pseudo-peptide selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (I) suivante :
X-M-P-R-Y (I)
dans laquelle X est un groupe comprenant 1 à 11 acides aminés naturels et/ou non naturels consécutifs, Y est un groupe comprenant 1 à 11 acides aminés naturels et/ou non naturels consécutifs, X ou Y contient au moins un résidu d'acide aminé permettant la formation d'un cycle au sein du peptide, M désigne la méthionine ou un de ses isostères ou un de ses analogues, P désigne la proline ou un de ses isostères ou un de ses analogues, R désigne l'arginine ou un de ses isostères ou un de ses analogues, et dans laquelle le nombre total de résidus d'acides aminés est inférieur ou égal à 25.
4) Peptide ou pseudo-peptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que X est un groupe de formule (Xaa^Z^aa), et Y est un groupe de formule (Xaa)kW(Xaa)i, dans lesquelles Xaa représente un acide aminé naturel ou non, y compris un acide aminé de configuration D, un acide aminé non codé, ou un acide aminé contenant une liaison peptidomimétique, Z et W représentent deux acides aminés identiques ou différents permettant la cyclisation du peptide, et i, j, k et 1 sont des nombres entiers, identiques ou différents, compris entre 0 et 5. 5) Peptide ou pseudo-peptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que i est un entier choisi parmi 0, 1, 3 ou 4 ; j est un entier choisi parmi 0, 3 ou 4 ; k est un entier choisi parmi 0, 1 ou 3 ; et/ou 1 est un entier choisi parmi 0, 1 ou 3.
6) Peptide ou pseudo-peptide selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que les acides aminés permettant la cyclisation du peptide sont choisis parmi la cystéine (Cys), l'acide 3-mercaptopropanoïque (Mpa), la pénicillamine (Pen), la déshydroalanine, Pallylglycine (allylGly), l'acide glutamique, l'acide aspartique, ou la lysine, de préférence Z et W représentent une cystéine.
7) Peptide ou pseudo-peptide selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 30 à SEQ ID NO : 65.
8) Peptide ou pseudo-peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est de configuration cyclique.
9) Peptide ou pseudo-peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID NO : 12 à SEQ ID NO : 29.
10) Peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une liaison peptidomimétique, choisie de préférence parmi l'intercalation d'un groupe méthylène (- CH2-) ou phosphate (-PO2-), aminé secondaire (-NH-) ou oxygène (-O-), des alpha- azapeptides, alpha-alkylpeptides, N-alkylpeptides, phosphonamidates, depsipeptides, hydroxyméthylènes, hydroxyéthylènes, dihydroxyéthylènes, hydroxyéthylamines, retro- inverso, méthylèneoxy, cétométhylène, esters, phosphinates, phosphiniques, phosphonamides, analogues carba. 11) Peptide ou pseudo-peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fonction N-terminale (N-term) et/ou C-terminale (C-term) est protégée respectivement par une acylation, ou par une amidation ou une estérifïcation.
12) Utilisation d'un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou diagnostique pour vectoriser une substance active ou d'intérêt en diagnostic, imagerie ou thérapie.
13) Utilisation d'un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique selon l'une quelconque des revendications précédentes pour augmenter l'activité biologique ou diminuer la toxicité d'une substance active ou d'intérêt à laquelle il est couplé.
14) Composé conjugué de formule (II) suivante : VxDy (II) dans laquelle V représente un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, D représente une substance active ou d'intérêt, et x et y sont des nombres entiers compris entre 1 et 5.
15) Composé conjugué selon la revendication 14, caractérisé en ce que x et y sont égal à 1 , ou en ce que x est supérieur à y.
16) Composé conjugué selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il est représenté par le peptide de séquence SEQ ID NO : 66.
17) Composé conjugué de formule (III) suivante :
VxLzDy (III) dans laquelle V représente un peptide ou pseudo-peptide linéaire ou cyclique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , L représente un bras espaceur, D représente une substance active ou d'intérêt, x et y sont des nombres entiers compris entre 1 et 5 et z est un entier compris entre 1 et 10. 18) Composé conjugué selon la revendication 16, caractérisé en ce que x=z=y=l ou x=z>y ou z>x>y.
19) Composé conjugué selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il est représenté par les peptides de séquence SEQ ID NO : 67 à SEQ ID NO : 72.
20) Composé conjugué selon l'une des revendications 14-19, caractérisé en ce que la substance active ou d'intérêt est une molécule d'intérêt thérapeutique, un agent de diagnostic ou d'imagerie médicale, ou une sonde moléculaire, choisie de préférence parmi une petite molécule chimique, un peptide ou polypeptide, une protéine, un antigène, un anticorps ou une partie d'anticorps, un acide nucléique ou un oligonucléotide, un ribozyme, un marqueur ou un traceur.
21) Composé conjugué selon l'une des revendications 14 à 20, caractérisé en ce que le couplage entre V et D, ou entre V et L d'une part et entre L et D d'autre part, est réalisé par une ou plusieurs liaisons covalentes, hydrophobes ou ioniques, clivables ou non en milieu physiologique ou à l'intérieur de cellules.
22) Composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 14 à 21, caractérisé en ce que D est couplé à V, le cas échéant via L, au niveau d'une ou des extrémités N- term et/ou C-term de V et/ou au niveau d'un ou plusieurs groupements réactifs portés par les chaînes latérales des acides aminés naturels ou non, constitutifs de V.
23) Procédé de préparation d'un composé conjugué selon l'une des revendications 14 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de couplage entre un peptide ou pseudo- peptide V et une substance D, le cas échéant via L, de préférence par voie chimique, biochimique, enzymatique, ou par génie génétique.
24) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé conjugué selon l'une des revendications 14 à 22 et un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. 25) Composition diagnostique caractérisée en ce qu'elle comprend un agent de diagnostic ou d'imagerie médicale constitué d'un composé conjugué selon l'une des revendications 14 à 22.
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