BRPI0919777B1 - Derivados de peptídeo e uso dos mesmos como vetores para moléculas na forma de conjugados - Google Patents

Abstract

derivados de peptídeo e uso dos mesmos como vetores para moléculas na forma de conjugados. a invenção se refere a derivados de peptídeo (peptídeos e pseudo-peptídeos) e uso dos mesmos como vetores para moléculas de interesse. a invenção também se refere a conjugados que contêm um derivado de peptídeo da invenção ligado a uma molécula de interesse. os peptídeos e conjugados de pró-fármacos da invenção podem ser utilizados para vetorizar moléculas de interesse diagnóstico ou farmacêutico, tais como, por exemplo, moléculas terapêuticas, agentes da obtenção de imagem ou de diagnóstico, ou sondas moleculares, através da membranas celulares, e de maneira notável para promover seu transporte através da barreira hematoencefálica (bhe).

Description

DESCRIÇÃO

A invenção se refere a derivados de peptídeo (peptídeos e pseudo-peptídeos) e uso dos mesmos como vetores para moléculas de interesse. A invenção também se refere a conjugados que contêm um derivado de peptídeo da invenção ligado a uma molécula de interesse. Os peptídeos e conjugados de pró-fármaco da invenção podem ser usados para vetorizar moléculas de interesse diagnóstico ou farmacêutico, tal como, por exemplo, moléculas terapêuticas, agentes de obtenção de imagem ou de diagnóstico, ou sondas moleculares, através de membranas celulares, e de maneira notável para promover o seu transporte através da barreira hematoencefálica (BHE).

CONTEXTO DA INVENÇÃO

De acordo com IMS Health, o mercado global para fármacos para tratar patologias do sistema nervoso central (SNC, cérebro e medula espinhal) foi aproximadamente de 70 bilhões de dólares em 2007, com quase 9 bilhões dólares desta quantidade representando produtos que surgem de tecnologias de distribuição de fármacos (Jain, 2008, Jain PharmaBiotech Report, Drug Delivery in CNS disorders). Assim, o SNC é hoje uma das três maiores áreas terapêuticas, juntamente com medicina cardiovascular e oncologia. Embora o número de pessoas que sofrem de transtornos e patologias do SNC por todo o mundo seja maior que esse de pessoas com doenças cardiovasculares ou cânceres, a neurologia continua sendo um mercado subdesenvolvido. Isto é explicado pelo fato de que 98% dos fármacos potenciais para tratar patologias do SNC não cruzam a barreira hematoencefálica ou BHE (Pardridge, 2003, Mol. Interv., 3, 90-105).

De fato, o cérebro é protegido de substâncias potencialmente tóxicas pela presença de dois sistemas principais de barreira fisiológica: a BHE, e a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (BS-LCR). A BHE é considerada como a principal via para a absorção de ligandos de plasma. Sua área superficial é aproximadamente 5000 vezes maior que essa da BS-LCR. O comprimento total dos vasos sangüíneos constitutivos da BHE é de aproximadamente 600 km. Cada cm3 do córtex cerebral contém o equivalente de 1 km de vasos sangüíneos. A área superficial total da BHE é estimada em 20 m2 (De Boer et al., 2007, Clin. Pharmacokinet., 46(7), 553-576). Assim, o endotélio cerebral, que constitui a BHE, representa um obstáculo principal ao uso de fármacos potenciais contra muitos transtornos do SNC, mas também uma grande superfície de troca potencial entre o sangue e o tecido nervoso.

Como uma regra geral, somente algumas moléculas lipofílicas pequenas de aproximadamente 450 a 600 Daltons podem cruzar a BHE (somente 2% de candidatos de fármaco), isto quer dizer, passam do sangue ao cérebro. O peso molecular e o tamanho de muitos candidatos de fármaco, que mostram resultados prometedores em estudos animais para tratar transtornos do SNC, são consideravelmente maiores. Assim, a maioria das moléculas tais como peptídeos ou proteínas terapêuticas é geralmente excluída da passagem/transporte do sangue ao cérebro, por causa da baixa permeabilidade de células endoteliais dos capilares cerebrais (CECCs) para estes candidatos de fármaco. As CECCs organizadas em vasos são circundadas por uma lâmina basal, pés-vasculares astrocitários, pericitos e células microgliais e neuronais. A associação apertada de células endoteliais com pés-vasculares astrocitários é responsável pelo desenvolvimento e manutenção das propriedades de impermeabilidade da BHE a maioria das moléculas, assim assegurando controle restrito e efetivo de trocas moleculares entre o sangue e o cérebro a fim de manter a homeostase do cérebro. As CECCs são intimamente ligadas pelas junções apertadas, em comparação com outras células endoteliais de outros órgãos, que são fenestradas. Estas junções apertadas assim previnem qualquer transporte paracelular através da BHE.

A BHE é considerada como o maior obstáculo a superar no desenvolvimento de novas terapias para tratar patologias cerebrais, e de maneira notável para o uso de moléculas que são provavelmente para tratar transtornos do SNC (Neuwelt et al., 2008, Lancet Neurol., 7, 84-96).

Uma das razões que pode explicar porque nenhum tratamento efetivo está atualmente disponível para as principais patologias cerebrais (câncer cerebral, doenças de Parkinson e de Alzheimer, derrame/acidentes vasculares cerebrais (AVC), etc.) é que os desenvolvedores de candidatos de fármaco para tratar patologias cerebrais são levados a cabo em programas de pesquisa internos (programas de descoberta de fármacos para o cérebro) enquanto pouco esforço é investido nos problemas de cruzamento da BHE e no alvejamento preferencial do SNC, e de maneira notável do cérebro (programas de alvejamento de fármacos para o cérebro), (Pardrídge, 2003, Mol. Interv., 3, 90-105). De fato, um candidato de fármaco precisa seguir certas regras estruturais, físico-químicas, farmacoquímicas e farmacológicas a fim de ter as melhores chances de se tornar um fármaco para tratar uma patologia ou transtorno do SNC (Pajouhesh et al., 2005, NeuroRx, 2(4), 541-553). No desenvolvimento de um candidato de fármaco, a seletividade e a especificidade (perfil farmacológico) de uma molécula para o seu alvo são essenciais para a sua atividade terapêutica (eficácia). A biodisponibilidade e a toxicidade potencial (perfil farmacêutico) de uma molécula são cruciais para o seu futuro como um fármaco. Em outras palavras, qualquer molécula com probabilidade de se tornar um fármaco para tratar uma patologia ou transtorno do SNC precisa se mover através da BHE, manter sua atividade biológica, e exibir propriedades adequadas de farmacocinética (FC), absorção, distribuição, metabolismo e excreção/eliminação (ADME) e farmacodinâmica (FD), com baixa toxicidade (Tox). Assim, o equilíbrio hidrofílico/lipofílico da molécula sob desenvolvimento é particularmente difícil de encontrar pelos químicos médicos na área terapêutica do SNC.

O maior problema no tratamento de transtornos e patologias do SNC assim reside no fato de que as moléculas administradas não cruzam a BHE e não podem assim alcançar seu(s) alvo(s) no SNC. As células endoteliais dos vasos e capilares do SNC, que são 5 constitutivas da BHE, são um obstáculo a moléculas que não podem passar do sangue ao tecido nervoso. De fato, estas células endoteliais e ós pés-vasculares astrocitários, que circundam as mesmas, constituem uma barreira física relacionada de maneira notável à existência de junções apertadas entre células endoteliais que limitam/previnem qualquer passagem/transporte pela via paracelular, e também uma barreira fisiológica, uma vez que 10 estas células têm sistemas de efluxo efetivos, que restringem qualquer passagem/transporte pela via transcelular. Estas propriedades assim limitam fortemente a passagem de substâncias do plasma sangüíneo em direção ao espaço extracelular do cérebro.

De fato, algumas moléculas capazes de cruzar a BHE são ativamente expelidas/efluídas do cérebro em direção à corrente sangüínea por proteínas de transporte 15 resistentes a múltiplos fármacos (RMF). Estes sistemas de transporte de efluxo ativo (TEA) geralmente controlam o efluxo ativo de moléculas pequenas do cérebro em direção à corrente sangüínea. O modelo de sistema de TEA na BHE é o transportador de cassete de ligação a ATP (CLA), denominado de glicoproteína-P (gp-P); no entanto, outros sistemas de TEA estão presentes na BHE tal como a proteína associada a RMF 1 (MRP1). gp-P, que 20 está principalmente localizada sobre a superfície luminal de células endoteliais dos capilares cerebrais, é um elemento essencial na função da barreira fisiológica da BHE prevenir a entrada no cérebro da maioria dos xenobióticos, mas também candidatos de fármaco e outras moléculas de interesse terapêutico capazes de serem ativas no SNC.

Uma das prioridades de pesquisa na descoberta de moléculas para tratar, 25 diagnosticar ou obter imagem de transtornos ou patologias cerebrais é assim encontrar meios para aumentar a efetividade da passagem de substâncias ativas através da BHE.

Em relação a isso, estratégias para a vetorização de moléculas através da BHE, atualmente estudadas e usadas por desenvolvedores de candidatos de fármaco a fim de permitir que uma molécula de interesse terapêutico para alcançar o SNC, podem ser 30 divididas em três estratégias principais (Figura 1), (Pardridge, 2007, Pharm. Res., 24(9), 1733-1744; DeBoer et al., 2007, Clin. Pharmacokinet., 46(7), 553-576; De Boeretal., 2007, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 47, 327-355; Jones et al., 2007, Pharm. Res., 24(9), 1759- 1771). Abordagens neurocirúrgicas

As abordagens neurocirúrgicas podem ser implementadas por injeção intraventricular direta no cérebro, injeção intracerebral ou infusão intratecal da substância ativa, ou por rotura da BHE (ruptura temporária da integridade da BHE).

O problema principal das abordagens neurocirúrgicas por injeção intraventricular, à parte dos custos relacionados ao procedimento neurocirúrgico, é que o fármaco não é distribuído diretamente no parênquima do cérebro, mas no líquido cefalorraquidiano. De fato, a infusão intraventricular envolve a colocação de um cateter nos ventrículos (Aird, 5 1984, Exp. Neurol., 86, 342-358). Esta técnica altamente invasiva não é efetiva para o transporte de substâncias ativas no parênquima do cérebro. De fato, o fluxo de volume do líquido cefalorraquidiano ao parênquima do cérebro durante a distribuição de um fármaco por infusão intraventricular é governado por uma difusão anormalmente lenta de sua convecção (transporte), devido ao cérebro não ter taxa de fluxo volumétrico 10 intraparenquimal.

De maneira similar para injeção intracerebral, a difusão de uma substância ativa no cérebro diminui muito rapidamente desde o local da injeção até o local da lesão. De fato, a concentração no cérebro de uma substância ativa diminui em 90% a uma distância de 500 μm desde o seu local de injeção.

A infusão intratecal envolve a colocação de um cateter no cérebro conectado a uma bomba que distribui a substância ativa com uma taxa de fluxo pré-definida. Devido ao fato de que o cérebro é o único órgão que não têm um sistema linfático, normalmente servindo para transportar fluidos extracelulares de volta a circulação geral, a distribuição de uma substância ativa por infusão intratecal no cérebro é muito lenta. Isto diminui a concentração 20 da substância ativa no local da lesão.

Além disso, os riscos de infecção são significantes durante tais procedimentos neurocirúrgicos, de maneira notável pela presença de um cateter. Sob estas condições, o conforto do paciente não é ótimo.

A interrupção temporária da impermeabilidade da BHE é associada à abertura 25 transitória das junções apertadas de células endoteliais dos capilares cerebrais. Este é o caso para substâncias vasoativas tais como leucotrienos ou bradiquininas (Baba et a!., 1991, J. Cereb. Blood Flow Metab., 11, 638-643). Esta estratégia é igualmente invasiva e requer acesso arterial à carótida em sujeitos/pacientes sedados. O maior problema encontrado pela ruptura temporária da integridade da BHE, além das despesas relacionadas 30 ao procedimento radiológico para acesso à carótida, é que a BHE somente permanece aberta por um curto período de tempo, assim limitando a possibilidade de distribuir um fármaco ao longo de um período estendido. Além disso, a ruptura temporária da BHE permite que as proteínas plasmáticas entrem no cérebro (considerando que estas proteínas podem ser tóxicas para o cérebro) e pode também facilitar a entrada de agentes infecciosos. 35 Este tipo de ruptura da BHE pode assim levar a roturas neuropatológicas crônicas e é associada a altos riscos de infecção (Salahuddin et al., 1988, Acta Neuropathol., 76, 1-10). Abordagens farmacológicas para a vetorização

As estratégias farmacológicas para transportar moléculas incluem a difusão transcelular de moléculas tornadas mais lipofílicas pela adição dos grupos lipídicos na substância ativa (difusão lipofílica transcelular ou DLT) ou o uso de lipossomas (Zhçu et al., 1992, J. Control. Release, 19, 459-486), e transporte por adsorção iônica via moléculas de vetor positivamente carregadas ou por cationização da molécula ativa (transporte mediado adsortivo ou TMA).

Adicionar um grupo lipídico permite a conversão química de moléculas hidrofílicas em moléculas mais lipofílicas de maneira notável através de abordagens com pró-fármacos. No entanto, a síntese de tais compostos leva a moléculas que excedem o limiar de transporte ótimo para cruzar a BHE, de maneira notável com relação ao peso molecular que se torna superior ao limite ótimo de 450 Daltons (Pajouhesh et al., 2005, NeuroRx, 2(4), 541- 553). Pela mesma razão, os lipossomas ou mesmo pequenas vesículas ou nanopartículas (micelas, nanoesferas, nanocápsulas) são geralmente grandes demais, não específicas o suficiente para a BHE, e conseqüentemente relativamente não efetivas para transportar moléculas de interesse terapêutico (ou agentes de obtenção de imagem ou de diagnóstico, ou qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular) através da BHE (Levin, 1980, J. Med. Chem., 23, 682-684' Schackert et al., 1989, Selective Cancer Then, 5, 73-79). Assim, os principais problemas encontrados pelas tecnologias de lipidização (DLT) são sua baixa especificidade para o alvejamento e cruzamento de maneira específica a BHE em comparação com outras membranas celulares, a diminuição em valores em plasma da área sob a curva (ASC) do fármaco, e seu uso geralmente limitado para a vetorização de moléculas pequenas.

Em abordagens de TMA, o principal problema encontrado é a baixa especificidade para alvejamento e cruzamento especificamente a BHE em comparação com outras membranas celulares. De fato, o TMA é baseado em moléculas catiônicas que adsorvem em células cuja membrana é negativamente carregada, o que é o caso para a maioria das células. A diminuição em valores em plasma da ASC do fármaco, seu uso geralmente limitado para a vetorização de moléculas pequenas, e sua citotoxicidade são fatores adicionais que penalizam a abordagem de vetorização por TMA. Abordagens fisiológicas para a vetorização

As estratégias baseadas em abordagens fisiológicas para a vetorização consistem em explorar os vários mecanismos de transporte naturais da BHE. Estes mecanismos de transporte ativo de moléculas através da BHE trabalham via acoplamento com um receptor específico substrato ou por mimetismo molecular com um substrato de receptor específico (transporte mediado por portador ou TMP), ou via acoplamento ou fusão com um ligando especificamente alvejando um receptor (transporte mediado por receptor ou TMR).

Como um exemplo, as moléculas tais como L-DOPA (doença de Parkinson), melfalan (câncer cerebral), α-metil-DOPA (hipertensão arterial) e gabapentina (epilepsia) ganham acesso ao cérebro por TMP via o grande transportador de aminoácidos neutros (LAT1), (Pardridge, 2003, Mol. Interv., 3, 90-105). Estas moléculas têm estruturas químicas próximas a fenilalanina, um dos substratos naturais de LAT1. No entanto, os principais 5 problemas encontrados por abordagens de TMP são sua ampla seletividade/especificidade para conjugados que intimamente imitam/mimetizam o substrato do receptor/transportador endógeno, e conseqüentemente seu uso que permanece limitado para a vetorização de moléculas pequenas.

A TMR recorre a um sistema de transporte dependente de receptor. A vetorização é 10 levada a cabo via mecanismos de endocitose pelo alvejamento dos receptores/transportadores endógenos presentes em capilares do cérebro. Exemplos notáveis dos vários receptores de BHE humana envolvidos em TMR incluem: receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina (IR), receptores da lipoproteína de baixa densidade (LDL), que permitem transporte de colesterol, incluindo o receptor de LDL (LDLR) e 15 membros da família da proteína relacionada a receptor da lipoproteína de baixa densidade (LRP), ou receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), receptor de toxina da difteria (DTR) ou fator de crescimento semelhante a fator de crescimento epidérmico de ligação a heparina (HB-EGF), bem como receptores de seqüestrantes (SCAV-Rs) incluindo receptor de seqüestrantes classe B tipo I (SR-BI). Em TMR, os receptores na membrana de 20 uma célula endotelial da BHE se ligam ao seu ligando, o que leva a endocitose do complexo composto do receptor/transportador e o seu ligando em uma vesícula, que se forma na superfície celular e então penetra a célula endotelial da BHE. O complexo ligando/receptor pode passar através da célula endotelial (transcitose), e assim pode conseqüentemente cruzar a BHE para agir no tecido nervoso. Este processo de TMR não depende do tamanho 25 da molécula engolfada pela endocitose. Assim, a TMR é um mecanismo que permite o transporte do sangue ao cérebro de moléculas tais como insulina, proteínas de transporte de ferro, colesterol, vários derivados de peptídeo e proteínas, etc. Por exemplo, a transferrina é usada como um vetor de ligando de TfR presente na BHE (Jefferies et al., 1984, Nature, 312, 162-163; Friden et al., 1983, Science, 259, 373-377; Friden, 1994, Neurosurgery, 35, 30 294-298), e a molécula a ser transportada (substância ativa) é acoplada com a transferrina (vetor de ligando). Embora esta estratégia de vetorização usando uma macromolécula permita um aumento na passagem das moléculas de conjugado de interesse através da BHE, tem diversas desvantagens. Em primeiro lugar, a molécula é geralmente acoplada ao vetor por métodos de expressão de genes (fusão) assim limitando o número de moléculas a 35 ser transportadas a somente polipeptídeos ou proteínas. Em segundo lugar, o sistema para o acoplamento da molécula com o vetor é bem complexo; acoplamento químico ou bioquímico tradicional não rende os sistemas macromoleculares bem definidos desde um ponto de vista estrutural e molecular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção supera estas desvantagens. A invenção mostra que é possível desenhar peptídeos ou pseudo-peptídeos de tamanho reduzido capazes de transportar através de membranas celulares, e mais especificamente através da BHE, substâncias de alto peso molecular e/ou grande volume. A invenção assim propõe novos peptídeos, conjugados e composições que melhoram a biodisponibilidade de moléculas de interesse, e de maneira notável melhoram o seu acesso (alvejamento) ao SNC.

Mais particularmente, os inventores desenvolveram derivados de peptídeo capazes de se ligar a LDLR humano. Os inventores mostraram que estes derivados são capazes de cruzar a BHE. Os inventores mostraram também que estes derivados podem transportar, em células da BHE, as moléculas de interesse terapêutico ou diagnóstico. Além disso, os inventores desenvolveram peptídeos capazes de se ligar a LDLR sem competição com o ligando natural, e assim sem interferência com o transporte de LDL. Estes derivados de peptídeo assim representam novos produtos (vetores) que são particularmente vantajosos para o desenho e vetorização de fármacos ou agentes de diagnóstico, de maneira notável para alcançar o SNC.

A invenção assim se refere a um peptídeo ou pseudo-peptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos naturais e/ou não naturais, caracterizada por conter como máximo 30 resíduos de aminoácidos e por se ligar ao LDLR humano na superfície de membranas celulares. Os peptídeos compreendem pelo menos 5 resíduos de aminoácidos, preferivelmente pelo menos 6, 7, ou 8. Em uma modalidade preferida, os peptídeos da invenção também se ligam ao LDLR murino. De uma maneira particularmente vantajosa e preferida, os peptídeos da invenção têm a capacidade de cruzar a BHE e potencialmente as membranas de células cancerosas ou infecciosas.

A invenção também se refere a um conjugado que compreende um peptídeo ou pseudo-peptídeo tal como definido acima acoplado a uma substância de interesse. Como será descrito a seguir, o acoplamento é vantajosamente covalente e pode ser levado a cabo de modo a desassociar depois do cruzamento das membranas celulares, a fim de liberar a substância de interesse em um local de interesse. De acordo com a natureza do acoplamento, a substância pode, por exemplo, ser liberada passivamente ou sob a ação de enzimas ou de dadas condições fisiológicas.

A invenção também se refere a um método/processo para preparar um conjugado tal como definido acima. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende um conjugado da invenção.

A invenção também se refere ao uso de um peptídeo ou pseudo-peptídeo, ou um conjugado, tal como definido acima, para preparar um fármaco ou um agente de diagnóstico ou de obtenção de imagem.

A invenção também se refere a um método para melhorar ou que permite a passagem de uma molécula através da BHE, que compreende o acoplamento desta molécula a um peptídeo ou pseudo-peptídeo tal como definido acima.

A invenção também se refere a um método melhorado para tratar a patologia em um sujeito por um fármaco, a melhora consistindo no acoplamento deste fármaco com um peptídeo ou pseudo-peptídeo tal como definido acima. A invenção pode ser usada em qualquer mamífero, de maneira notável qualquer ser humano.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 Diagrama que ilustra os vários modos de passagem de moléculas naturais ou farmacológicas através da BHE, adaptado de Abbott e Romero, 1996, Mol. Med. Today, 2(3), 106-113. Figura 2 Diagrama comparativo da síntese em tandem e síntese via um ligante de um vetor/molécula de conjugado de interesse terapêutico. Figura 3 A - Diagrama do plasm ideo usado para clonar hLDLR e mLDLR. B - Diagrama representando a proteína de fusão expressada por células transfectadas. Figura 4 Western blot realizado em linhagens de células de CHO que expressam constitutivamente proteínas de fusão de hLDLR-GFP ou GFP (controle). Uma banda de 190 kDa correspondente ao tamanho da proteína de fusão de hLDLR-GFP é detectada com anticorpo anti-hLDLR. Figura 5 Imunocitoquímica em células de CHO não permeabilizadas, que expressam estavelmente A -GFP somente (controle), ou B - a construção hLDLR-GFP. Os núcleos de células são corados com Hoechst (azul, A1 e B1). A fluorescência de GFP é visível em verde (A2 e B2), essa da coloração do domínio extracelular de hLDLR pelo anticorpo anti- hLDLR é visível em vermelho (A3 e B3) e a sobreposição de manchas vermelha e verde é visível em amarelo/laranja (A4 e B4). Notar que somente as células estavelmente transfectadas com a construção hLDLR-GFP expressam o receptor de membrana (B3). Figura 6

A - Células da linhagem de células de CHO-hLDLR-GFP que expressam hLDLR- GFP (verde) incubadas com Dil-LDL (vermelho), a sobreposição de manchas vermelha e verde são visíveis em amarelo/laranja: notar a forte coloração das células. B - Células de uma linhagem de células de CHO-TfR-GFP que expressam hTfR- GFP (verde) incubadas com Dil-LDL (vermelho): ausência de ligação de Dil-LDL e endocitose. C - Células da linhagem de células de CHO-hLDLR-GFP que expressam hLDLR- GFP (verde) incubadas com transferrina acoplada a Texas Red (vermelho): ausência de ligação de ligando Tf e endocitose. Notar a diferença de intensidade de coloração entre A por um lado, e B e C por outro lado, onde somente a coloração de receptores hTfr e hLDLR fusionados com GFP é detectada. Figura 7 Linhagens de células de CHO que expressam estavelmente A - GFP somente (verde), e B - hLDLR-GFP (verde), e imunocoloração com um anticorpo de anti-proteína de envelope viral de um clone de vírus bacterianos que expressam um peptídeo (SEQ ID NO: 1) com afinidade para hLDLR (pontos vermelhos). Os núcleos de células são corados com Hoechst (azul, A1 e B1). A fluorescência de GFP é visível em verde (A2 e B2), essa da coloração do envelope viral do vírus bacteriano pelo anticorpo anti-proteína virai é visível em vermelho (A3 e B3) e a sobreposição de manchas vermelha e verde é visível em amarelo/laranja (A4 e B4). Notar que as células que não expressam hLDLR em A não se ligam a vírus bacterianos. Figura 8 Comparação por imunocitoquímica da ligação de vírus bacterianos de controle (A- C) e de vírus bacterianos que expressam peptídeos com afinidade para hLDLR (SEQ ID NO: 1) (B, D), em fibroblastos humanos (A-B) e em células endoteliais microvasculares cerebrais porcinas (C-D). Os vírus bacterianos são visualizados com um anticorpo de anti-proteína de envelope virai. Figura 9 Avaliação por FACS da interação entre células de CHO-hLDLR-GFP e um clone de vírus bacterianos que expressam a SEQ ID NO: 11 de peptídeo com afinidade para hLDLR em comparação com vírus bacterianos de controle que não expressam peptídeos com afinidade para este receptor. O sinal em Q2 mostra nas células uma combinação de dois sinais, que são positivos por um lado se hLDLR-GFP é expresso (fluorescência de GFP, eixo horizontal) e por outro lado se vírus bacterianos com afinidade para este receptor são ligados a células via os peptídeos que os mesmos expressam (coloração de imunocitoquímica, eixo vertical). A - células de CHO-hLDLR-GFP incubadas com anticorpo de anti-proteína de envelope viral e seu anticorpo secundário APC. B - células de CHO-hLDLR-GFP incubadas com vírus bacterianos de controle negativo, anticorpo de anti-proteína de envelope virai e seu anticorpo secundário APC. C - células de CHO-hLDLR-GFP incubadas com um clone de vírus bacterianos que expressam um peptídeo com afinidade para hLDLR (SEQ ID NO: 11), anticorpo de anti- proteína de envelope virai e seu anticorpo secundário APC. Um significante desvio do sinal é observado em Q2. Figura 10

Avaliação por FACS da interação entre fibroblastos humanos e um clone de vírus bacterianos que expressam a SEQ ID NO: 12 de peptídeo com afinidade para hLDLR, em comparação com vírus bacterianos de controle que não expressam peptídeos com afinidade para este receptor. O sinal em Q2 mostra nas células uma combinação de dois sinais, que são positivos por um lado se hLDLR é expresso (coloração de imunocitoquímica, eixo horizontal) e por outro lado se vírus bacterianos com afinidade para este receptor são ligados a células via os peptídeos que os mesmos expressam (coloração de imunocitoquímica, eixo vertical). A - Fibroblastos humanos incubados com anticorpo de anti-proteína de envelope virai e seu anticorpo secundário APC. B - Fibroblastos humanos incubados com anticorpo anti-LDLR e seu anticorpo secundário Alexa 488. C - Fibroblastos humanos incubados com vírus bacterianos de controle negativo, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR e anticorpos secundários APC e Alexa 488. D - Fibroblastos humanos incubados com um clone de vírus bacterianos que expressam a SEQ ID NO: 12 de peptídeo com afinidade para hLDLR, anticorpo de anti- proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR e anticorpos secundários APC e Alexa 488. Um significante desvio do sinal é observado em Q2. Figura 11

Avaliação por FACS da interação entre HUVEC e dois clones de vírus bacterianos que expressam peptídeos, um cíclico (SEQ ID NO: 11), o outro linear (SEQ ID NO: 21), com afinidade para hLDLR, em comparação com vírus bacterianos de controle que não expressam peptídeos com afinidade para este receptor. A - HUVEC incubadas com anticorpo de anti-proteína de envelope virai e seu anticorpo secundário APC. B - HUVEC incubadas com anticorpo anti-LDLR e seu anticorpo secundário Alexa 488. C - HUVEC incubadas com vírus bacterianos de controle negativo, anticorpo de anti-proteína de envelope viral, anticorpo anti-LDLR e anticorpos secundários APC e Alexa 488. D - HUVEC incubadas com um clone de vírus bacterianos que expressam peptídeo cíclico (SEQ ID NO: 11) com afinidade para hLDLR, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR e anticorpos secundários APC e Alexa 488. Um significante desvio do sinal é observado em Q2. E - HUVEC incubadas com um clone de vírus bacterianos que expressam o

A peptídeó linear (SEQ ID NO: 21) com afinidade para hLDLR, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR e anticorpos secundários APC e Alexa 488. Um significante desvio do sinal é observado em Q2. Figura 12

Avaliação por FACS em HUVEC de competição entre os peptídeos expressados pelos vírus bacterianos com afinidade para LDLR e seu ligando natural LDL. A - HUVEC incubadas com anticorpo de anti-proteína de envelope virai e seu anticorpo secundário APC. B - HUVEC incubadas com anticorpo anti-LDLR e seu anticorpo secundário Alexa 488. C - HUVEC incubadas com vírus bacterianos de controle negativo, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR e anticorpos secundários APC e Alexa 488. D - HUVEC incubadas com vírus bacterianos de controle negativo, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR, LDL, e anticorpos secundários APC e Alexa 488. Nenhum efeito é observado devido à presença de LDL. E - HUVEC incubadas com um clone de vírus bacterianos que expressam peptídeo linear (SEQ ID NO: 21) com afinidade para hLDLR, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR e anticorpos secundários APC e Alexa 488. F - HUVEC incubadas com um clone de vírus bacterianos que expressam peptídeo linear (SEQ ID NO: 21) com afinidade para hLDLR, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR, LDL, e anticorpos secundários APC e Alexa 488. LDL fortemente diminui a ligação de SEQ ID NO: 21 peptídeos expressados pelos vírus bacterianos. G - HUVEC incubadas com um clone de vírus bacterianos que expressam peptídeo cíclico (SEQ ID NO: 11) com afinidade para hLDLR, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR e anticorpos secundários APC e Alexa 488. H - HUVEC incubadas com um clpne de vírus bacterianos que expressam peptídeo cíclico (SEQ ID NO: 11) com afinidade para hLDLR, anticorpo de anti-proteína de envelope virai, anticorpo anti-LDLR, LDL, e anticorpos secundários APC e Alexa 488. Nenhum efeito é observado devido à presença de LDL. I - Gráfico representando a porcentagem de desvio do sinal de fluorescência na zona Q2 dos gráficos A-H obtidos por FACS. Nenhum desvio é medido em Q2 para os vírus bacterianos de controle que não expressam peptídeos com afinidade para hLDLR. Para os vírus bacterianos que expressam a SEQ ID NO: 21 de peptídeo, mais de 55,8% dos desvios de sinal em Q2 indicando afinidade dos peptídeos expressados por estes vírus bacterianos para HUVEC hLDLR. Adicionar LDL leva a uma perda de 85% do sinal em Q2 nos vírus bacterianos de controle, indicando competição entre o vírus bacteriano correspondente à seqüência peptídica SEQ ID NO: 21 e LDL no local onde LDL se liga a hLDLR. O sinal igualmente forte em Q2 dos vírus bacterianos que expressam a SEQ ID NO: 11 de peptídeo (desvio superior a 70% em comparação com vírus bacterianos de controle) é somente ligeiramente desviado (17%) pela adição de LDL. Figura 13 Coloração imunofluorescente dupla de seções congeladas de cérebro de camundongo C57BL6, 2 h após injeção na veia da cauda do camundongo de vírus bacterianos de controle (A-B) e vírus bacterianos que expressam um peptídeo (SEQ ID NO: 1) com afinidade para hLDLR e mLDLR (C-D). Vasos cerebrais são corados com IgG anti- camundongo, em verde (A-C); vírus bacterianos são corados com anticorpo de anti-proteína de envelope virai, em vermelho (B-D). Figura 14 Esquema geral de peptídeos sintetizados conjugados com rodamina ou Etiqueta S, com um espaçador/ligante C-terminal (C-term). Figura 15 Avaliação por fluorescência e imunocitoquímica de ligação a e endocitose de peptídeos com afinidade para hLDLR (SEQ ID NO: 1/rodamina em A e, SEQ ID NO: 2/Etiqueta S em C) em células da linhagem de células de CHO-hLDLR-GFP em comparação com um peptídeo de controle (em B). A fluorescência de GFP é visível em verde (A1, B1 e C1); essa relacionada aos peptídeos, visualizada por rodamina ou pela ligação de um anticorpo anti-Etiqueta S acoplado a Alexa594 é visível em vermelho (A2, B2 e C2), e a sobreposição de manchas vermelha e verde é visível em amarelo/laranja (A3, B3 e C3). Notar os altos níveis de coloração intracelular em vermelho com peptídeos SEQ ID NO: 1/rodamina em A2 e, SEQ ID NO: 2/Etiqueta S em C2, e a sobreposição de coloração de hLDLR-GFP (verde, A1, C1) com peptídeos ligados ou internalizados por endocitose (A2, C2). Figura 16 Quantificação de taxas de ligação (A-C) e endocitose (B-D) de peptídeos SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 2 e de peptídeo de controle em Linhagem de células de CHO-hLDLR- RFP (A-B) e fibroblastos humanos (C-D), respectivamente. Figura 17

Avaliação imunocitoquímica da interação entre células de CHO-hLDLR-GFP e SEQ ID NO: 11 de peptídeo com afinidade para hLDLR, conjugados com Etiqueta S, em comparação com um peptídeo de controle também conjugado com Etiqueta S. O sinal em Q2 mostra nas células uma combinação de dois sinais, que são positivos por um lado se hLDLR-GFP é expresso (fluorescência de GFP, eixo horizontal) e por outro lado se o peptídeo de controle e SEQ ID NO: 11 de peptídeo com afinidade para este receptor são ligados às células (coloração de imunocitoquímica, eixo vertical). A - Células incubadas com anticorpo secundário APC. B - Células incubadas com peptídeo de controle conjugado com Etiqueta S, anticorpo anti-Etiqueta S e anticorpo secundário APC. C - Células incubadas com SEQ ID NO: 11 de peptídeo com afinidade para LDLR conjugado com Etiqueta S, anticorpo anti-Etiqueta S e anticorpo secundário APC. Um significante desvio do sinal é observado em Q2. Figura 18 Avaliação da toxicidade de peptídeos em uma barreira de células endoteliais no modelo de BHE in vitro pela co-incubação com Lucifer Yellow (LY, análise fluorimétrica) e análise da taxa de passagem de LY como uma função do tempo e na ausência ou presença de um peptídeo de controle e SEQ ID NO: 1 de peptídeo, ambos conjugados com rodamina. Figura 19 Avaliação de células após a lise e análise fluorimétrica de taxas de ligação às células endoteliais do modelo de BHE in vitro e/ou internalização nestas células de um peptídeo de controle e SEQ ID NO: 1 de peptídeo, ambos conjugados com rodamina. Figura 20

Avaliação fluorimétrica de taxas de passagem (permeabilidade, Pe) através das células endoteliais de um modelo de BHE in vitro de um peptídeo de controle e SEQ ID NO: 1 de peptídeo, ambos conjugados com rodamina. As medições LY Pe são usadas para verificar a integridade de modelos de BHE in vitro.

DESCRICÀQ DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção se refere a derivados de peptídeo capazes de se ligar a LDLR humano e uso da mesma no campo de produtos farmacêuticos, de maneira notável para transportar, em células da BHE, as moléculas de interesse terapêutico ou de diagnóstico.

O LDLR humano é uma proteína transmembranar de 839 aminoácidos que compreende três regiões: a região extracelular (1-768), a região transmembranar (768-790) e a região citoplasmática (790-839). A região extracelular é dividida em duas sub-regiões: essa de ligação a LDL (1-322) e essa fora da região de ligação a LDL (322-768) (ver documento W02007/014992).

O cérebro tem uma grande necessidade para que o LDL funcione apropriadamente: Os ligandos naturais de LDLR são LDL e mais particularmente a apolipoproteína B (ApoB) e apolipoproteína E (ApoE) componentes de partículas de LDL, que assim permitem o transporte de colesterol contido nestas partículas através de membranas celulares e mais particularmente através da BHE.

Tem assim sido mostrado que o LDLR permitiu a transcitose de partículas de LDL através da BHE (Dehouck et al., 1997, J. Cell Biol., 138(4), 877-889), via um processo de TMR, em vesículas endossômicas específicas que previnem a fusão com o lisossoma. Estas lipoproteínas, tendo cruzado a BHE por transcitose, são então absorvidas pelos neurônios e/ou astrócitos (Spencer et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 104(18), 7594-7599). Esta propriedade foi usada para vetorizar moléculas de interesse terapêutico por meio de nanopartículas às quais são conjugadas apolipoproteínas inteiras (componentes de LDL) (Kreuter et al., 2007, J. Control. Release, 118, 54-58). Neste estudo, no entanto, uma apolipoproteína inteira foi usada, e de uma forma acoplada a uma nanopartícula a fim de mimetizar a estrutura da partícula de LDL.

A presente invenção mostra, pela primeira vez, que é possível desenhar peptídeos pequenos capazes de se ligar a LDLR e de cruzar a BHE. A invenção proporciona muitas vantagens em comparação com estratégias da técnica anterior, que decorrem de maneira notável da escolha de receptor e da estratégia de desenho e natureza dos peptídeos. A invenção mostra que tais peptídeos ou pseudo-peptídeos são seletivos para algumas membranas celulares e podem ser usados para distribuir moléculas químicas pequenas (ou lipofílicas ou não) bem como macromoléculas tais como proteínas de interesse terapêutico. Os vetores de peptídeo ou pseudo-peptídeo podem ser facilmente sintetizados quimicamente, e a maioria das moléculas de interesse terapêutico ou agentes de obtenção de imagem ou de diagnóstico pode ser acoplada com o vetor de peptídeo ou pseudo- peptídeo simplesmente e efetivamente através de uma estratégia de pró-fármaco via um espaçador (síntese via um ligante) ou por acoplamento direto (síntese em tandem) entre as duas entidades (Figura 2). Os peptídeos e pseudo-peptídeos da invenção podem ser desenhados para adotar uma configuração cíclica, assim mais resistente a proteólise. Além disso, os peptídeos e pseudo-peptídeos da invenção podem ser desenhados para se ligarem a LDLR sem competição com o ligando natural. A invenção de fato levou à descoberta de um novo sítio de ligação no LDLR, diferente do sítio de ligação a LDL. Como um resultado, o uso dos peptídeos e pseudo-peptídeos da invenção alvejando este sítio permite o transporte efetivo sem rotura substancial da ligação do ligando natural.

A pesquisa levada a cabo dentro do escopo da presente invenção permitiu ao Requerente mostrar que os peptídeos lineares ou cíclicos ou pseudo-peptídeos que o Requerente desenvolveu podem ser usados como vetores para moléculas de interesse terapêutico, ou para agentes de obtenção de imagem ou de diagnóstico, ou para qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular, no tratamento, obtenção de imagem e/ou diagnóstico de patologias neurológicas, bem como patologias infecciosas ou cancerosas do cérebro ou outros tecidos/órgãos.

Os peptídeos lineares ou cíclicos ou pseudo-pθptideos descritos na presente invenção têm a capacidade de alvejar receptores/transportadores de células e tipos de células particulares e/ou de cruzar membranas celulares, de maneira notável aquelas das barreiras fisiológicas do cérebro e mais particularmente a BHE ou a barreira hemato- retiniana (BHR).

Os peptídeos lineares ou cíclicos ou pseudo-peptídeos descritos na presente invenção têm a capacidade de alvejar receptores/transportadores de células e tipos de células particulares, de maneira notável células de câncer, tecido nervoso ou não nervoso e/ou de cruzar membranas celulares, de maneira notável aquelas das barreiras fisiológicas do SNC e mais particularmente a barreira sangue-tumor (BST) de tumores de tecido nervoso.

Os peptídeos lineares ou cíclicos ou pseudo-peptídeos descritos na presente invenção têm a capacidade de alvejar receptores/transportadores de células e tipos de células particulares e/ou de cruzar membranas celulares, de maneira notável aquelas das barreiras fisiológicas do SNC, para tratar mais particularmente patologias cerebrais infecciosas ou outras patologias de uma natureza bacteriana, viral, parasitica ou fúngica.

Os peptídeos lineares ou cíclicos ou pseudo-peptídeos descritos na presente invenção têm a capacidade de se ligar a um LDLR murino ou humano da membrana celular e cruzar a membrana mencionada anteriormente via este receptor por transcitose.

Os peptídeos lineares ou cíclicos ou pseudo-peptídeos descritos na presente invenção têm a capacidade de se ligar a LDLR na superfície de membranas celulares de barreiras fisiológicas do cérebro murino e humano e cruzar a barreira fisiológica mencionada anteriormente via LDLR por TMR.

A invenção assim mais particularmente se refere a peptídeos e pseudo-peptídeos que têm uma afinidade para LDLR, e uso dos mesmos como vetores para moléculas de interesse terapêutico ou para agentes de obtenção de imagem ou de diagnóstico, ou para qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular. Tais peptídeos podem ser usados em muitas indicações, de maneira notável no tratamento, obtenção de imagem e/ou diagnóstico de patologias neurológicas e de patologias infecciosas ou cancerosas do cérebro ou outros tecidos/órgãos.

A invenção assim se refere a um peptídeo ou pseudo-peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos naturais e/ou não naturais, caracterizado por conter como máximo 30 resíduos de aminoácidos, preferivelmente como máximo 25, e por se ligar ao LDLR humano na superfície de membranas celulares. No contexto da invenção, o termo “peptídeo” ou “pseudo-peptídeo” designa uma molécula que compreende uma cadeia/seqüência de resíduos de aminoácidos, que podem ser naturais ou não naturais, opcionalmente modificados ou funcionalizados, e ligados juntos por ligações peptídicas, não peptídicas ou peptídicas modificadas. Os peptídeos podem ser cíclicos ou não cíclicos e podem ter, se for necessário, uma ou mais extremidades protegidas (N- e/ou C-terminal).

A invenção mais preferivelmente se refere a um peptídeo ou pseudo-peptídeo tal como definido acima, caracterizado por ter a capacidade de cruzar a BHE.

Em uma primeira modalidade, os peptídeos ou pseudo-peptídeos da invenção são de fórmula geral (I) como segue: X-M-P-R-Y (I) em que: - X é um grupo que compreende de 1 a 11 aminoácidos naturais e/ou não naturais consecutivos, - Y é um grupo que compreende de 1 a 11 aminoácidos naturais e/ou não naturais consecutivos, - X e/ou Y contém/contêm pelo menos um resíduo de aminoácido que permite a formação de um ciclo dentro do peptídeo, - M designa metionina ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma, - P designa prolina ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma, - R designa arginina ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma, e em que o número total de resíduos de aminoácidos é inferior a ou igual a 25. Vantajosamente, nos peptídeos ou pseudo-peptídeos de fórmula (I), X é um grupo de fórmula (Xaa),Z(Xaa)j e Y é um grupo de fórmula (Xaa)kW(Xaa)h em que Xaa representa um aminoácido natural ou não natural, incluindo um aminoácido de configuração D, um aminoácido não codificado, ou um aminoácido que contém uma ligação peptideomimética, Z e W representam dois aminoácidos idênticos ou diferentes que permitem a ciclização do peptídeo, e i, j, k e I são números inteiros, idênticos ou diferentes, entre 0 e 5.

A invenção resulta de maneira notável da identificação, por comparação de estratégias de seqüências de ligando de peptídeo, de motivos que asseguram ligação de LDLR e transporte, mas sem competição com o ligando natural. A ausência de competição com o ligando natural mostra que os motivos de ligação encontrados pelos inventores envolvem um novo sítio de ligação em LDLR, que constitui um achado inesperado e particularmente vantajoso no contexto de vetorização de compostos in vivo.

Os aminoácidos naturais ou não naturais constitutivos dos grupos X e Y dos peptídeos ou pseudo-peptídeos da invenção podem ser idênticos ou diferentes e podem ser selecionados de: glicina (Gly, G) ou ácido 2-aminoetanóico, sarcosina (Sar) ou N-metilglicina (MeGly), N-etilglicina (EtGly), alilglicina (alilGly) ou ácido 2-aminopent-4-enóico, 2- ciclopentilglicina (Cpg), 2-ciclohexilglicina (Chg), 2,2-dipropilglicina (Dpg), 2-(3-indolil)glicina (IndGly), 2-indanilglicina (Igl), 2-neopentilglicina (NptGly), 2-octilglicina (OctGly), 2- propargilglicina (Pra) ou ácido 2-aminopent-4-inóico, 2-fenilglicina (Phg), 2-(4- clorofenil)glicina, azaglicina (AzGIy), glicinol ou 2-aminoetanol, alanina (Ala, A) ou ácido 2-aminopropanóico, beta-alanina (β-Ala) ou ácido 3- aminopropanóico, deshidroalanina, N-metilalanina, 3-ciclopropilalanina (Cpa), 3- ciclohexilalanina (Cha), 3-ciclopentilalanina, 3-(1-naftil)alanina (1Nal), 3-(2-naftil)alanina (2Nal), 3-(3-piridil)alanina, 3-(2-tienil)alanina (Thi), alaninol ou 2-aminopropanol, valina (Vai, V) ou ácido 2-amino-3-metilbutanóico, N-metilvalina (MeVal), norvalina (Nva) e derivados metilados e/ou hidroxilados da mesma, 5-hidroxinorvalina (Hnv) e derivados da mesma, 3-mercaptovalina (penicilamina, Pen), valinol ou 2-amino-3- metilbutanol, leucina (Leu, L) ou ácido 2-amino-4-metilpentanóico, norleucina (Nle) ou ácido 2-aminohexanóico, 3-hidroxileucina, 6-hidroxinorleucina, terc-leucina (Tie) ou ácido 2-amino- 3,3-dimetilbutanóico, homoleucina ou ácido 3-amino-5-metilhexanóico, 2,3-dehidroleucina, leucinol ou 2-amino-4-metilpentanol, isoleucina (lie, I) ou ácido 2-amino-3-metilpentanóico, alo-isoleucina (ale ou Alo-lle), N-metilisoleucina (Melle), isoleucinol ou 2-amino-3-metilpentanol, ácido aspártico (Asp, D) ou ácido 2-aminobutanodióico e derivados de cadeia lateral esterificados ou amidados do mesmo, ácido 3-metilaspártico, aspartinol, asparagina (Asn, N) ou ácido 2-amino-3-carbamoilpropanóico ou ácido 2- aminosuccinâmico e derivados N-substituídos do mesmo, N-etilasparagina (EtAsn), asparaginol, ácido glutâmico (Glu, E) ou ácido 2-aminopentanedióico e derivados de cadeia lateral esterificados ou amidados do mesmo, ácido piroglutâmico (Pir) ou ácido pidólico ou 5-oxoprolina, ácido gama-carboxiglutâmico ou ácido 4-carboxiglutâmico (Gla), glutarinol, glutamina (Gin, Q) ou ácido 2-amino-4-carbamoilbutanóico e derivados N- substituídos do mesmo, glutaminol, ácido diaminoetanóico, ácido 2,3-diaminopropanóico (Dpr ou Dap), ácido 3- mercaptopropanóico (Mpa), ácido 2-amino-3-guanidinopropanóico (Agp), ácido 2- aminobutanóico (Abu), ácido 4-aminobutanóico (4Abu) ou GABA, ácido 2-aminoisobutanóico (Aib), ácido 3-aminoisobutanóico (bAib), ácido 2,4-diaminobutanóico (Dab), ácido 3,4- diaminobutanóico (Dbu), ácido 2-amino-4-cianobutanóico (Cba), ácido 2-amino-4- guanidinobutanóico (Agb), ácido 5-aminopentanóico (Ava), ácido 4-amino-3-hidroxi-5- fenilpentanóico (AHPPA), ácido 4-amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanóico (ACHPA), ácido 6- aminohexanóico (Acp ou Ahx), ácido para-aminobenzóico (PABA), ácido meta- aminometilbenzóico ou ácido 3-aminometilbenzóico, ácido para-aminometilbenzóico (PAMBA) ou ácido 4-aminometilbenzóico, ácido 2-aminoadípico (Aad) ou ácido 2- aminohexanodióico, ácido 3-aminoadípico (bAad) ou ácido 3-aminohexanodióico, ácido 2- aminopimélico (Apm) ou ácido 2-amino-heptanodióico (Ahe), ácido 4-amino-3-hidroxi-6- metilheptanóico ou estatina (Sta), ácido 2,2-diaminopimélico (Dpm) ou ácido 2,2-diamino- heptanodióico, desmosina (Des) ou ácido 2-amino-6-[4-(4-amino-4-carboxibutil)-3,5-bis-(3- amino-3-carboxipropil)-piridin-1-il]hexanóico, isodesmosina (Ide) ou ácido 2-amino-6-[2-(4- amino-4-carboxibutil)-3,5-bis-(3-amino-3-carboxipropil)-piridin-1-il]hexanóico, ornitina (Orn) ou ácido 2,5-diaminopentanóico e derivados épsilon-aminados ou amidados do mesmo, canalina ou ácido 2-amino-4-(aminooxi)butanóico, ornitinol, lisina (Lys, K) ou ácido 2,6-diaminohexanóico e derivados épsilon-aminados ou amidados do mesmo, homolisina ou ácido 2,7-diaminoheptanóico (hLys), 5-hidroxilisina (Hil) ou ácido 2,6-diamino-5-hidroxihexanóico, alo-hidroxilisina (aHil), 6-N-metillisina (MeLys), S-aminoetilcisteína ou ácido 2-amino-3-(2-aminoetiltio)propanóico, 3-metil-S- aminoetilcisteína ou ácido 2-amino-3-(2-aminoetiltio)butanóico, lisinol, arginina (Arg, R) ou ácido 2-amino-5-guanidinopentanóico ou ácido 2-amino- 5-(diaminometilideno amino)pentanóico, homoarginina ou ácido 2-amino-6- guanidinohexanóico, N-hidroxiarginina, citrulina (Cit) ou ácido 2-amino-5- (carbamoilamino)pentanóico, ácido 2-amino-5-(4-carbamimidoilfenil)pentanóico, ácido 2- amino-5-(1/-/-imidazol-2-ilamino)pentanóico, canavanina ou 2-amino-4- (guanidinooxi)butanóico ácido, argininol, histidina (His, H) ou ácido 2-amino-3-(1H-imidazol-4-il)propanóico e derivados N-substituídos do mesmo, histidinol, serina (Ser, S) ou ácido 2-amino-3-hidroxipropanóico e derivados O- substituídos do mesmo (éteres, etc.), ácido 2-amino-4-hidroxibutanóico ou homoserina (Hse) e derivados O-substituídos do mesmo (éteres, etc.), serinol ou 2-amino-propan-1,3-diol, treonina (Thr, T) ou ácido 2-amino-3-hidroxibutanóico e derivados O- substituídos do mesmo (éteres, etc.), alo-treonina (alo-Thr) e derivados O-substituídos da mesma (éteres, etc.), treoninol (Thol), fenilalanina (Phe, F) ou ácido 2-amino-3-fenilpropanóico, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 3,4-difluorofenilalanina, pentafluorofenilalanina, 2- clorofenilalanina, 3-clorofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 3,4-diclorofenilalanina, 4- bromofenilalanina, 3-iodofenilalanina, 4-iodofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 2- metoxifenilalanina, 3-metoxifenilalanina, 4-metilfenilalanina, 4-aminofenilalanina, 4- guanidinofenilalanina, 3,4-dihidroxifenilalanina ou DOPA, ácido 2-amino-4-fenilbutanóico ou homofenilalanina, 4-bifenililalanina (Bip), 4-benzoilfenilalanina (Bpa), fenilalaninol (Phol), tirosina (Tyr, Y) ou ácido 2-amino-3-(p-hidroxifenil)propanóico e derivados O- substituidos do mesmo (éteres, etc.), 3-iodotirosina, 3,5-diiodotirosina, 2-bromotirosina, 3,5- dibromotirosina, 2,6-dimetiltirosina, 3-nitrotirosina, 3-sulfotirosina, tirosinol ou 2-amino-4- hidroxibenzenopropanol, triptofano (Trp, W) ou ácido 2-amino-3-(1H-indol-3-il)propanóico e derivados N-substituidos do mesmo, 2-metiltriptofano, 5-hidroxitriptofano (5-HTP), triptofanol, cisteina (Cys, C) ou ácido 2-amino-3-mercaptopropanóico e derivados S- substituidos do mesmo, S-acetilcisteina ou ácido 2-amino-3-(acetiltio)propanóico, selenocisteina (Sec, U) ou ácido 2-amino-3-(seleno)propanóico, cisteinol, metionina (Met ou M) ou ácido 2-amino-4-(metiltio)butanóico, homometionina ou ácido 3-amino-5-(metiltio)pentanóico, metioninol, prolina (Pro, P) ou ácido pirolidina-2-carboxílico, homoprolina ou ácido 2-(2- pirrolidinil)etanóico, 3-hidroxiprolina (3Hyp), 4-hidroxiprolina (4Hyp), 3-metilprolina, 3,4- deshidroprolina, 3,4-metanoprolina, 4-aminoprolina, 4-oxoprolina, tioprolina ou ácido tiazolidina-4-carboxílico (Thz), ácido 2-oxotiazolidina-4-carboxílico, ácido indolin-2- carboxilico (Ide), ácido pipecólico (Pip) ou ácido piperidina-2-carboxílico, ácido nipecótico (Nip) ou ácido piperidina-3-carboxílico, ácido 4-oxopipecólico, ácido 4-hidroxipipecólico, ácido amino-1-ciclohexanocarboxílico, prolinol.

Como indicado, os peptídeos que compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido, preferivelmente dois resíduos de aminoácidos capazes de permitir a ciclização do peptídeo são preferidos. Tais aminoácidos são tipicamente selecionados de Cys, Mpa, Pen, deshidroalanina, ou alilGIy.

A ciclização é tipicamente obtida pela formação de uma ponte dissulfeto entre dois resíduos de cisteína (ou Pen), um no grupo X, o outro no grupo Y. Uma cisteína na posição N-terminal (N-term) pode, além disso, ser substituída por Mpa para a ciclização via uma ponte dissulfeto.

Um resíduo de cisteína pode também ser substituído por deshidroalanina, para a ciclização via uma ponte de lantionina, ou pela alilGIy para a ciclização por metátese via uma ponte dicarba.

Uma ponte lactama pode ser criada entre a função de ácido lateral de um resíduo Glu (ou Asp) e uma função de amina lateral em um Lys ou uma amina N-term. De maneira similar, a ciclização entre a função de amina N-term e o C-terminal ou função de ácido C- term (cabeça/cauda) pode ser levado a cabo via uma ligação amida, justo como a ciclização entre a função de amina lateral de uma Lys e a função de ácido C-term do peptídeo.

Preferivelmente, nos peptídeos ou pseudo-peptídeos de fórmula (I), pelo menos um dos grupos X e Y contêm um resíduo cisteína. Em uma modalidade particularmente preferida, os resíduos Z e W cada um representa cisteína.

Como indicado, M representa um resíduo metionina, ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma. Os isósteros ou análogos de metionina são preferivelmente selecionados de Nle, homometionina, Pen e Mpa.

Como indicado, P representa um resíduo prolina, ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma. Os isósteros ou análogos de prolina são preferivelmente selecionados de isósteros ciclopenteno, 3,4-dehidroprolina, 3,4-metanoprolina, homoprolina, 3Hyp, 4Hyp, 3-metilprolina, 4-aminoprolina, 4-oxoprolina, Thz, ácido 2-oxotiazolidina-4-carboxílico, Ide, Pip, Nip, ácido 4-oxopipecólico, ácido 4-hidroxipipecólico e ácido amino-1- ciclohexanocarboxílico.

Como indicado, R representa um resíduo arginina, ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma. Os isósteros ou análogos arginina são preferivelmente selecionados de homoarginina, N-hidroxiarginina, Agp, Agb, Cit, ácido 2-amino-5-(4- carbamimidoilfenil)pentanóico, ácido 2-amino-5-(1/7-imidazol-2-ilamino)pentanóico, Orn, Lys e isósteros/análogos da mesma, S-aminoetilcisteína, 3-metil-S-aminoetilcisteína, hLys, Hila, aHila, MeLys, His e isósteros/análogos da mesma, Nle, ácido diaminoetanóico, Dpr e Dbu.

Particularmente preferidos entre os peptídeos ou pseudo-peptídeos de fórmula (I) são aqueles em que: - i é um número inteiro selecionado de 0, 1,3 ou 4; e/ou - j é um número inteiro selecionado de 0, 3 ou 4; e/ou - k é um número inteiro selecionado de 0,1 ou 3; e/ou -1 é um número inteiro selecionado de 0, 1 ou 3.

Os peptídeos ou pseudo-peptídeos preferidos no contexto da invenção são da fórmula geral (Xaa)rCys-(Xaa)j-Met-Pro-Arg-(Xaa)k-Cys-(Xaa)i, em que Xaa designa qualquer resíduo de aminoácidos natural ou não natural e i, j, k e I são números inteiros, idênticos ou diferentes, entre 0 e 5. Preferivelmente, i = 0, 1,3 ou 4; j = 0, 3 ou 4; k = 0,1 ou 3; e/ou I = 0,1 ou 3.

Os exemplos particulares dos peptídeos da invenção de fórmula (I) são descritos nas seqüências SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 65 como segue: SEQ ID NO: 1, HLDCMPRGCFRN; SEQ ID NO: 2, ACQVKSMPRC; SEQ ID NO: 3, ACTTPMPRLC; SEQ ID NO: 4, ACKAPQMPRC; SEQ ID NO: 5, ACLNPSMPRC; SEQ ID NO: 6, ACLVSSMPRC; SEQ ID NO: 7, ACLQPMPRLC; SEQ ID NO: 8, ACPVSSMPRC; SEQ ID NO: 9, ACQSPMPRLC; SEQ ID NO: 10, ACLTPMPRLC; SEQ ID NO: 11, DSGLCMPRLRGCDPR; SEQ ID NO: 30, ACMPRLRGCA; SEQ ID NO: 31, ASGLCMPRLRGCDPR; SEQ ID NO: 32, DAGLCMPRLRGCDPR; SEQ ID NO: 33, DSALCMPRLRGCDPR; SEQ ID NO: 34, DSGACMPRLRGCDPR; SEQ ID NO: 35, DSGLCMPRARGCDPR; SEQ ID NO: 36, DSGLCMPRLAGCDPR; SEQ ID NO: 37, DSGLCMPRLRACDPR; SEQ ID NO: 38, DSGLCMPRLRGCAPR; SEQ ID NO: 39, DSGLCMPRLRGCDAR; SEQ ID NO: 40, DSGLCMPRLRGCDPA; SEQ ID NO: 41, SGLCMPRLRGCDPR; SEQ ID NO: 42, GLCMPRLRGCDPR; SEQ ID NO: 43, CMPRLRGC; SEQ ID NO: 44, CMPRARGC; SEQ ID NO: 45, CMPRLAGC; SEQ ID NO: 46, CMPRLRAC; SEQ ID NO: 47, CMPRLKGC; SEQ ID NO: 48, (D)-CMPRLRGC; SEQ ID NO: 49, CMPR-(D)-LRGC; SEQ ID NO: 50, CMPRL-(D)-RGC; SEQ ID NO: 51, CMPRLRG-(D)-C; SEQ ID NO: 52, (D)-CMPRLRG-(D)-C; SEQ ID NO: 53, (D)-CMPRLRSarC; SEQ ID NO: 54, (D)-CMPRKRGC; SEQ ID NO: 55, (D)-CMPRLRCG; SEQ ID NO: 56, (D)-CMPRLCRG; SEQ ID NO: 57, (D)-CMPRCLRG; SEQ ID NO: 58, CMPRGC; SEQ ID NO: 59, PenMPRLRGC; SEQ ID NO: 60, (D)-PenMPRLRGC; 1 SEQ ID NO: 61, (D)-CMPRLRGPen; SEQ ID NO: 62, PenMPRLRGPen; SEQ ID NO: 63, (D)-PenMPRLRGPen; SEQ ID NO: 64, (D)-PenMPRLRG-(D)-Pen; SEQ ID NO: 65, MpaMPRLRGC.

Como ilustrado na seção experimental, estes peptídeos se ligam a LDLR sem competição com LDL, exibem alta afinidade e são capazes de cruzar a BHE e transportar moléculas de interesse.

Em uma modalidade particularmente preferida, os peptídeos de fórmula (I) tendo uma configuração cíclica são preferidos. O peptídeo que compreende a seqüência SEQ ID NO: 11, ou uma seqüência derivada da mesma, por exemplo, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 48, é preferido em particular.

De acordo com outra modalidade, os peptídeos ou pseudo-peptídeos da invenção são selecionados dos peptídeos da seqüência SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 29 como segue: SEQ ID NO: 12, MTVMPTGLWNPLIPS; SEQ ID NO: 13, SASWFAVPIPPLRLE; SEQ ID NO: 14, MTPMSTPRMLPVYVA; SEQ ID NO: 15, MTATHLSTLFQPLTY; SEQ ID NO: 16, MSPIPPAASTWANTL; SEQ ID NO: 17, MTANPLQNAPGPLSL; SEQ ID NO: 18, MQTAPPPPLTRVQWS; SEQ ID NO: 19, GTPRMHIPLNVDHLP; SEQ ID NO: 20, LTLPPISGLSSYPLP; SEQ ID NO: 21, TPSAHAMALQSLSVG; SEQ ID NO: 22, LTLPPISGLSSYPLP; SEQ ID NO: 23, MGTLNAPTAYPQDSL; SEQ ID NO: 24, LTNPPAILPQNTDPH; SEQ ID NO: 25, MGLPLPYIQTILHTP; SEQ ID NO: 26, SAALIAMSSFKSITA; SEQ ID NO: 27, SGFAFARSVPTESRR; SEQ ID NO: 28, MTSPYMSLPPSTDDM; SEQ ID NO: 29, LTNPPAILPQNTDPH.

Como indicado acima, os peptídeos lineares ou cíclicos ou pseudo-peptídeos da invenção podem compreender ligações peptídicas, não peptídicas e/ou peptídicas modificadas. Em uma modalidade preferida, os peptídeos ou pseudo-peptídeos compreendem pelo menos uma ligação peptideomimética, escolhida preferivelmente entre a intercalação de um grupo metileno (-CH2-) ou fosfato (-PO2-), amina secundária (-NH-) ou oxigênio (-O-), alfa-azapeptídeos, alfa-alquilpeptídeos, N-alquilpeptídeos, fosfonamidatos, depsipeptídeos, hidroximetilenos, hidroxietilenos, dihidroxietilenos, hidroxietilaminas, os peptídeos retro-inversos, metilenooxi, cetometileno, ésteres, fosfinatos, fosfínicos, fosfonamidas e análogos de carba.

Além disso, em uma modalidade particular, os peptídeos ou pseudo-peptídeos da invenção compreendem uma função N-term e/ou C-term protegida, por exemplo, pela acilação, e/ou amidação ou esterificação, respectivamente.

Os peptídeos ou pseudo-peptídeos da invenção podem ser sintetizados por qualquer técnica conhecida pelo técnico no assunto (síntese química, biológica ou genética, etc.). Podem ser conservados tais quais, ou ser formulados na presença de uma substância de interesse ou qualquer aceitável excipiente.

Para as sínteses químicas, equipamentos comerciais que podem incorporar aminoácidos naturais bem como não naturais, tais como D-enantiômeros e resíduos com cadeias laterais com hidrofobicidades e impedimentos estéricos diferentes daqueles dos seus homólogos naturais (denominados aminoácidos exóticos, isto é, não codificados), ou uma seqüência peptídica que contém uma ou mais ligações peptideomiméticas que podem incluir de maneira notável a intercalação de um grupo metileno (-CH2-) ou fosfato (-PO2-), uma amina secundária (-NH-) ou um oxigênio (-O-), são usados.

Durante a síntese, é possível introduzir várias modificações químicas, tais como, por exemplo, acoplamento na posição N-term ou C-term ou em uma cadeia lateral um derivado de lipídio (ou fosfolipídio) ou um constituinte de uma nanopartícula, a fim de ser capaz de incorporar o peptídeo ou pseudo-peptídeo da invenção dentro de uma membrana lipídica tal como essa de um composto de lipossoma de uma ou mais camadas ou bicamadas lipídicas, ou de uma nanopartícula.

Os peptídeos da invenção, ou uma parte protéica dos mesmos, podem também ser obtidos a partir de uma seqüência de ácidos nucleicos que codificam os mesmos. A presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico que compreende, ou é constituída por, uma seqüência nucléica que codifica um peptídeo tal como definido acima. Mais particularmente, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma seqüência que codifica um composto de fórmula geral (I) ou correspondente a um das seqüências SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 29 ou uma parte protéica do mesmo. Estas seqüências de ácidos nucleicos podem ser DNA ou RNA e ser combinadas com seqüências de controle e/ou ser inseridas em vetores de expressão biológicos.

O vetor de expressão biológico usado é selecionado de acordo com o hospedeiro no qual será transferido. Pode ser, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo, vírus, etc. A invenção se refere em particular a estes ácidos nucleicos e vetores de expressão biológicos, que podem ser usados para produzir os peptídeos da invenção, ou partes protéicas dos mesmos, em uma célula hospedeira. Estes vetores de expressão biológicos podem ser preparados e os peptídeos podem ser produzidos ou expressos em um hospedeiro por técnicas de biologia molecular e de engenharia genética bem conhecidas pelo técnico no assunto.

Como indicado, os peptídeos da invenção são particularmente úteis para formular substâncias de interesse terapêutico ou de diagnóstico, e de maneira notável para promover a biodistribuição e/ou passagem da mesma através da BHE.

Em relação a isso, a invenção se refere ao uso de um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico tal como definido acima, como um vetor para a transferência/transporte de moléculas de interesse terapêutico, ou agentes de obtenção de imagem ou de diagnóstico, ou qualquer outra molécula.

A invenção também se refere ao uso de um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico tal como definido acima para preparar um fármaco capaz de cruzar a BHE.

A invenção também se refere a um método para permitir ou melhorar a passagem de uma molécula através da BHE, que compreende o acoplamento da molécula a um peptídeo ou pseudo-peptídeo da invenção.

Os peptídeos lineares ou cíclicos ou pseudo-peptídeos da invenção tornam possível cruzar a BHE com uma substância ativa que normalmente pode cruzar esta barreira somente pouco ou de modo algum. Podem assim ser usados no tratamento, prevenção ou diagnóstico de qualquer doença que afete o SNC, mas também como transportadores de material biológico (biotransportadores) no contexto de estudos empreendidos em várias famílias de moléculas com modelos de membrana celular e mais particularmente modelos de BHE.

Em relação a isso, o presente pedido descreve vários compostos conjugados de pró-fármacos que compreendem um peptídeo ou pseudo-peptídeo tal como definido acima. O termo “conjugado” designa uma molécula que resulta da combinação entre um ou mais dos peptídeos ou pseudo-peptídeos da invenção e uma ou mais moléculas de interesse. Como será descrito em detalhes adicionais a seguir, a conjugação pode ser de natureza química, como por meio de um ligante ou espaçador, ou de natureza genética, tal como, por exemplo, tecnologia de recombinação genética, tal como em uma proteína de fusão com, por exemplo, um marcador ou molécula de traçador (por exemplo, GFP, β-galactosidase, etc.) ou uma molécula terapêutica (por exemplo, fator de crescimento, fator neurotrófico, etc.).

Assim, a invenção se refere em particular a um composto conjugado de fórmula (II) como segue: VxDy (II) em que V representa um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico da invenção, D representa uma substância ativa ou substância de interesse, e x e y são números inteiros entre 1 e 5. Em uma modalidade particular, x e y são iguais a 1, ou x é maior que y.

Como um exemplo, o conjugado em que V=cMPRLRGC, x=1, D=Y-(D)-AGFLR e y=1 foi sintetizado. Neste caso, a substância ativa é um peptídeo terapêutico analgésico, dalargin. O acoplamento direto (síntese em tandem) deste peptídeo terapêutico no N-term do vetor de peptídeo SEQ ID NO: 48 dá o conjugado SEQ ID NO: 66, Y-(D)-AGFLR-(D)- CMPRLRGC.

A invenção também se refere a um composto conjugado de fórmula (III) como segue: VxLzDy (III) em que V representa um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico da invenção, L representa um espaçador (ou ligante), D representa uma substância ativa ou substância de interesse, x e y são números inteiros entre 1 e 5 e z é um número inteiro entre 1 e 10. Em uma modalidade particular, x=z=y=1 ou x=z>y ou z>x>y.

Como um exemplo, os conjugados em que V=cMPRLRGC (com x=1) e D=Y-(D)- AGFLR (com y=1) foram sintetizados via ligantes com L=GGG ou GFLG ou ALAL ou β-Ala ou Ahx ou GFAL (com z=1). SEQ ID NO: 67, Y-(D)-AGFLRGGG-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO: 68, Y-(D)-AGFLRGFLG-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO: 69, Y-(D)-AGFLRALAL-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO: 70, Y-(D)-AGFLR-β-Ala-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO: 71, Y-(D)-AGFLR-Ahx-(D)-CMPRLRGC SEQ ID NO: 72, Y-(D)-AGFLRGFAL-(D)-CMPRLRGC

Os exemplos contidos no presente pedido mostram, em experimentos de perfusão em cérebro no camundongo, que estes conjugados são capazes de cruzar a BHE, ilustrando o mecanismo de ação dos vetores de peptídeo da invenção.

A substância ativa ou substância de interesse pode ser qualquer molécula de interesse farmacêutico, de maneira notável terapêutico, um agente de obtenção de imagem de diagnóstico ou médica, ou uma sonda molecular. Pode ser em particular qualquer entidade química de interesse biológico tal como uma molécula química pequena (antibiótico, antiviral, imunomodulator, antineoplásico, antiinflamatório, etc.), um peptídeo ou polipeptídeo, uma proteína (enzima, hormônio, citocina, apolipoproteína, fator de crescimento, antígeno, anticorpo ou parte de um anticorpo), um ácido nucleico (ácido ribonucléico ou ácido desoxirribonucléico humano, virai, animal, eucariótico ou procariótico, de planta ou de origem sintética, etc., cujo tamanho pode variar desde desse de um único oligonucleotídeo até aquele do genoma ou um fragmento do genoma), um genoma virai ou um plasmídeo, uma ribozima, um marcador ou um traçador. Geralmente, a “substância de interesse” pode ser qualquer ingrediente farmacêutico ativo (IFA), seja um composto químico, bioquímico, natural ou sintético. A expressão “molécula química pequena” designa uma molécula de interesse farmacêutico com um peso molecular máximo de 1000 Daltons, tipicamente entre 300 Daltons e 700 Daltons.

A invenção também se refere a um composto da seguinte fórmula (IV): VxLz (IV) em que V representa um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico da invenção, L representa um espaçador (ou ligante), x é um número inteiro entre 1 e 5 e z é um número inteiro entre 1 e 10. Em uma modalidade particular, x=z=1 ou z>x.

Nos compostos conjugados da invenção, o acoplamento entre V e D, ou entre V e L por um lado e L e D por outro lado, pode ser levado a cabo por quaisquer meios aceitáveis de ligação levando em conta a natureza química, impedimento e número de substâncias ativas associadas e peptídeos oú pseudo-peptídeos. O acoplamento pode assim ser levado a cabo por uma ou mais ligações covalentes, hidrofóbicas ou iônicas, cliváveis ou não cliváveis em meio fisiológico ou dentro de células. Além disso, D pode ser acoplado com V, se for necessário via L, em vários grupos reativos, e de maneira notável em um ou mais extremidades N-term e/ou C-term de V e/ou em um ou mais grupos reativos portados pelas cadeias laterais de aminoácidos naturais ou não naturais constitutivos de V.

O acoplamento pode ser levado a cabo em qualquer sítio do peptídeo ou pseudo- peptídeo onde grupos funcionais tais como -OH, -SH, -CO2H, -NH2, -SO3H ou -PO2H estão naturalmente presentes ou foram introduzidos. Assim, uma molécula de interesse terapêutico, ou um agente de diagnóstico (ou de obtenção de imagem médica) ou qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular pode ser ligada (acoplada) ao vetor de peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico da invenção por uma ligação covalente nas extremidades N-term ou C-term, ou nos grupos reativos portados pelas cadeias laterais de aminoácidos naturais ou não naturais desta seqüência peptídica.

De maneira similar, o acoplamento pode ser levado a cabo em qualquer sítio da substância ativa ou substância de interesse (molécula de interesse terapêutico, agente de obtenção de imagem de diagnóstico ou médica, qualquer outra molécula, tal como uma sonda molecular) onde, por exemplo, os grupos funcionais tais como -OH, -SH, -CO2H, - NH2, -SO3H, -PO2H estão naturalmente presentes ou foram introduzidos.

É preferível que a interação seja suficientemente forte de modo que o peptídeo não seja dissociado da substância ativa antes de ter alcançado o seu sítio de ação. Por esta razão, o acoplamento preferido da invenção é acoplamento covalente, mas acoplamento não covalente poderia ser usado, no entanto. A substância de interesse pode ser acoplada diretamente com o peptídeo (síntese em tandem) em uma destas extremidades de terminal (N-term ou C-term), ou em uma cadeia lateral de um dos aminoácidos constitutivos da seqüência (Figura 2). A substância de interesse pode também ser acoplada indiretamente por meio de um ligante ou espaçador, em uma das extremidades de terminal dos peptídeos, ou em uma cadeia lateral de um dos aminoácidos constitutivos da seqüência (Figura 2). Os meios de acoplamento químico covalente, que pedem um espaçador ou não, incluem aqueles selecionados de agentes bi- ou multifuncionais que contêm grupos alquila, arila ou peptídicos por grupos de ésteres, aldeídos ou ácidos de alquila ou arila, anidrido, sulfidrila ou carboxila, grupos derivados de brometo ou cloreto de cianogênio, carbonildiimidazol, ésteres de succinimida ou haletos sulfônicos.

Em relação a isso, a invenção também se refere a um método para preparar um composto conjugado tal como definido acima, caracterizado por compreender uma etapa de acoplamento entre um peptídeo ou pseudo-peptídeo V e uma substância D, se for necessário via L, preferivelmente por uma via química, bioquímica ou enzimática, ou por engenharia genética.

A invenção também se refere a uma composição farmacêutica caracterizada por compreender pelo menos um composto conjugado tal como definido acima e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

A invenção também se refere a uma composição de diagnóstico caracterizada por compreender um agente de obtenção de imagem de diagnóstico ou médica composto de um composto conjugado tal como definido acima.

O conjugado pode ser usado na forma de qualquer sal farmaceuticamente aceitável. A expressão “sais farmaceuticamente aceitáveis” se refere a, por exemplo, e de uma maneira não restritiva, sais de adição de base ou ácido farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, ésteres, solvatos, precursores, metabólitos ou estereoisômeros, ditos vetores ou conjugados carregados com pelo menos uma substância de interesse.

A expressão “sais farmaceuticamente aceitáveis” se refere a sais não tóxicos, que podem ser geralmente preparados por meio da reação de uma base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado. Estes sais conservam a eficácia biológica e as propriedades de bases livres. Os exemplos representativos de tais sais incluem sais solúveis em água e insolúveis em água tais como acetatos, N-metilglucamina amónio, ansonatos (4,4-diaminostilbeno-2,2’-dissulfonatos), benzenossulfonatos, benzonatos, bicarbonatos, bissulfatos, bitartratos, boratos, bromidratos, brometos, butiratos, cassilatos, carbonatos, cloridratos, cloretos, citratos, clavulanatos, dicloridratos, difosfatos, edetatos, edetatos de cálcio, edisilatos, estolatos, esilatos, fumaratos, gluceptatos, gluconatos, glutamatos, glicolilarsanilatos, hexafluorofosfatos, hexilresorcinatos, hidrabaminas, hidroxinaftoatos, iodetos, isotionatos, lactatos, lactobionatos, lauratos, malatos, maleatos, mandelatos, mesilatos, metilbrometos, metilnitratos, metilsulfatos, mucatos, napsilatos, nitratos, 3-hidroxi-2-naftoatos, oleatos, oxalatos, palmitatos, pamoatos (1,1-metileno-bis-2- hidroxi-3-naftoatos, ou emboatos), pantotenatos, fosfatos, picratos, poligalacturonatos, propionates, p-toluenosulfonatos, salicilatos, estearatos, subacetatos, succinates, sulfatos, 5 sulfosalicilatos, suramatos, tanatos, tartrates, teoclatos, tosilatos, trietiodetos, trifluoroacetatos e valerianates.

As composições da invenção vantajosamente compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado dos veículos classicamente utilizados de acordo com cada modo de 10 administração. De acordo com o modo de administração considerado, os compostos podem estar em forma sólida, semi-sólida ou líquida. Para composições sólidas tais como comprimidos, pílulas, pós, ou grânulos que são livres ou são incluídos em cápsulas de gelatina, a substância ativa pode ser combinada com: a) diluentes, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina; b) lubrificantes, por exemplo, 15 sílica, talco, ácido esteárico, seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietilenoglicol; c) ligantes, por exemplo, silicate de magnésio e alumínio, pasta de amido, gelatina, goma tragacanto, metilcelulose, carboximetil celulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona; d) desintegrantes, por exemplo, amido, agar, ácido algínico ou seu sal de sódio, ou misturas efervescentes; e/ou d) absorventes, corantes, agentes aromatizantes e adoçantes. Os excipientes podem ser, por 20 exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e análogos de qualidade farmacêutica. Para composições semi-sólidas tais como supositórios, o excipiente pode, por exemplo, ser uma emulsão ou suspensão oleosa, ou a base de polialquileno glicol, tal como polipropilenoglicol. As composições líquidas, em particular as injetáveis ou aquelas incluídas em uma cápsula 25 mole, podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, dispersão, etc., da substância ativa em um solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, água, solução fisiológica salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, óleo e análogos dos mesmos.

As composições ou conjugados da invenção podem ser administrados por qualquer via adequada e, de uma maneira não restritiva, por via parenteral, tal como, por exemplo, na 30 forma de preparações que podem ser injetadas por via subcutânea, intravenosa ou intramuscular; por via oral (ou per os), tal como, por exemplo, na forma de comprimidos revestidos ou não revestidos, cápsulas de gelatina, pós, pellets, suspensões ou soluções orais (uma de tais formas para administração oral pode ser com liberação imediata ou com liberação prolongada ou retardada); por via retal tal como, por exemplo, na forma de 35 supositórios; por via tópica, em particular por via transdérmica, tal como, por exemplo, na forma de emplastros, pomadas ou géis; por via intranasal tal como, por exemplo, na forma de aerossol e spray; por via perlingual; ou por via intraocular.

As composições farmacêuticas tipicamente compreendem uma dose efetiva de um peptídeo ou pseudo-peptídeo ou conjugado da invenção. Uma “dose terapeuticamente efetiva” como descrita no presente documento se refere à dose que dá um efeito terapêutico para uma dada condição e programação de administração. É tipicamente a dose média de uma substância ativa a administrar para melhorar apreciadamente alguns dos sintomas associados a uma doença ou um estado patológico. Por exemplo, no tratamento de um câncer do cérebro ou de outro tecido/órgão, uma patologia, uma lesão ou um transtorno do SNC, a dose de uma substância ativa que diminui, previne, retarda, elimina ou cessa uma das causas ou sintomas da doença ou transtorno seria terapeuticamente efetiva.

Uma “dose terapeuticamente efetiva” de uma substância ativa não necessariamente cura uma doença ou transtorno, mas proporcionará um tratamento para esta doença ou transtorno de modo que o seu aparecimento é retardado, impedido ou prevenido, ou seus sintomas são atenuados, ou seu termo é modificado ou, por exemplo, é menos grave, ou a recuperação do paciente é acelerada.

É entendido que a “dose terapeuticamente efetiva” para uma pessoa em particular dependerá de vários fatores, incluindo a atividade/eficácia da substância ativa, seu tempo de administração, sua via de administração, sua taxa de eliminação e metabolismo, combinações/interações de fármacos e a gravidade da doença (ou transtorno) tratada em uma base preventiva ou curativa, bem como a idade, peso, saúde global, sexo e/ou dieta do paciente.

Dependendo da substância acoplada, os conjugados e composições da invenção podem ser usados para tratar, prevenir, diagnosticar ou obter imagem de numerosas patologias, de maneira notável patologias que afetam o SNC, patologias infecciosas ou cânceres.

Em relação a isso, a invenção se refere ao uso de conjugados farmacêuticos ou composições como descritas acima para tratar ou prevenir patologias do SNC ou transtornos, tumores cerebrais ou outras células de câncer, e patologias infecciosas bacteriana, viral, parasitica ou fúngica do cérebro ou outros tecidos/órgãos.

A invenção também se refere ao uso de conjugados ou composições farmacêuticas como descritas acima para diagnosticar ou obter imagem de patologias do SNC ou transtornos, tumores cerebrais ou outras células de câncer, e patologias infecciosas bacteriana, viral, parasitica ou fúngica do cérebro ou outros tecidos/órgãos.

A invenção também se refere ao uso de um conjugado ou composição tal como definido acima para tratar, obter imagem e/ou diagnosticar um tumor no cérebro ou outros tipos de células de câncer. Estudos têm de fato mostrado que pacientes com alguns cânceres têm hipocolesterolemia. Esta hipocolesterolemia é a consequência de um uso excessivo de colesterol pelas células de câncer. As últimas para sobreviver induzem um aumento no nível de expressão de LDLR dentro de órgãos com tumores (Henricksson et a!., 1989, Lancet, 2(8673), 1178-1180). Existe assim uma correlação entre o aumento no nível de expressão de LDLR pelas células e alguns cânceres. Tem também sido recentemente mostrado que o número de LDLR é muito alto na superfície de algumas células patológicas tais como células de câncer. É geralmente aceitado que 1.000 a 3.000 LDLR estejam presentes na superfície de uma célula não patológica. De maneira similar, neurônios não patológicos têm somente alguns LDLR (Pitas et a!., 1987, J. Biol. Chem., 262, 14352- 14360). No caso do glioblastoma, a super-expressão de LDLR foi mostrada. Assim, na superfície de células tumorais no cérebro, 125.000 (para células U-251) a 900.000 (para células SF-767) LDLR foram contados (Malentiska et al., 2000, Cancer Res., 60, 2300-2303; Nikanjam et al., 2007, Int. J. Pharm., 328, 86-94). Deve ser também notado que muitas células tumorais super-expressam LDLR, tais como aquelas de câncer de próstata (Chen et al., 2001, Int. J. Cancer, 91, 41-45), câncer de cólon (Niendorf et al., 1995, Int. J. Cancer, 61, 461-464), leucemia (Tatidis et al., 2002, Biochem. Pharmacol., 63, 2169-2180), câncer colorretal (Caruso et al., 2001, Anticancer Res., 21, 429-433), câncer de mama (Graziani et al., 2002, Gynecol. Oncol., 85, 493-497), bem como cânceres do fígado, pâncreas, ovários, pulmão e estômago, etc.

A invenção também se refere ao uso de um conjugado ou composição tal como definida acima para tratar, obter imagem e/ou diagnosticar patologias infecciosas bacteriana, viral, parasitica ou fúngica do cérebro ou outros tecidos/órgãos, tais como, e de uma maneira não restritiva, AIDS ou meningite, etc. O LDLR está também presente em células hepáticas. É agora conhecido que a endocitose do vírus da hepatite C (VHC) pode ocorrer via LDLR. O LDLR poderia servir como um receptor viral em um estágio precoce de infecção de hepatócitos humanos por VHC (Molina et al., 2007, J. Hepatol., 46(3), 411-419). Os conjugados da invenção podem assim ser usados para especificamente alvejar células patológicas, infectadas por vírus tais como aquelas da hepatite B e hepatite C que expressam LDLR e/ou para modular a via de LDLR do processo de infecção viral de células saudáveis.

A invenção também se refere ao uso de um conjugado ou composição tal como definido acima para tratar, obter imagem e/ou diagnosticar patologias neurodegenerativas tais como, de uma maneira não restritiva, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jakob, derrame/acidentes vasculares cerebrais (AVC), encefalopatia espongiforme bovina, esclerose múltipla, esclerose amiotrófica lateral, etc.

A invenção também se refere ao uso de um conjugado ou composição tal como definida acima para tratar, obter imagem e/ou diagnosticar patologias neurológicas tais como, de uma maneira não restritiva, epilepsia, enxaqueca, encefalite, dor no SNC, etc.

A invenção também se refere ao uso de um conjugado ou composição tal como definida acima para tratar, obter imagem e/ou diagnosticar patologias neuropsiquiátricas tais como, de uma maneira não restritiva, depressão, autismo, ansiedade, esquizofrenia, etc.

Os termos “tratamento,” “tratando,” “tratar” e outras expressões similares se referem à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico, por exemplo, a inibição do crescimento de células de câncer, morte de células de câncer ou melhora de uma doença ou transtorno neurológico. O efeito pode ser profilático ou preventivo a fim de completamente ou parcialmente prevenir o agravamento de uma doença ou um sintoma de tal doença, em uma pessoa doente, ou sua propagação, em sujeitos saudáveis, e/ou pode ser terapêutico a fim de completamente ou parcialmente tratar uma doença e/ou seus efeitos prejudiciais relacionados. O termo “tratamento” como utilizado no presente documento cobre qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, e mais particularmente em seres humanos, e compreende: (a) prevenção de uma doença (por exemplo, prevenção de câncer) ou uma condição que pode surgir em uma pessoa pré-disposta a esta patologia ou transtorno, mas que não foi ainda diagnosticada positivamente, (b) a desaceleração de uma doença (por exemplo, interrompendo o seu desenvolvimento), ou (c) alívio de uma doença (por exemplo, pela redução de sintomas associados a uma doença). Este termo “tratamento” também cobre qualquer administração de uma substância ativa a fim de tender, curar, aliviar, melhorar, diminuir ou inibir uma condição em um individual ou paciente, incluindo, mas não limitado a, a administração a uma pessoa em necessidade de um fármaco composto de um vetor ou conjugado como descrito no presente documento.

A presente invenção também se refere ao uso de um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico da invenção para aumentar a atividade biológica de uma substância ativa ou uma substância de interesse (molécula de interesse terapêutico, agente de obtenção de imagem de diagnóstico ou médica, ou qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular) à qual é acoplado.

A presente invenção também se refere ao uso de um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico da invenção para diminuir a toxicidade da substância ativa ou substância de interesse (molécula de interesse terapêutico, agente de obtenção de imagem de diagnóstico ou médica, ou qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular) à qual é acoplado.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes mediante a consideração dos exemplos a seguir, que são somente ilustrativos em natureza e que não limitam o escopo do presente pedido. EXEMPLOS EXEMPLO I Clonagem de LDLR humano e murino em um vetor de expressão.

Os peptídeos foram identificados com base em sua interação com e afinidade para receptores de lipoproteínas de baixa densidade (hLDLR e mLDLR) humanos e murinos, que estão de maneira notável envolvidos na endocitose e transcitose (transporte transcelular, de maneira notável através da BHE) de colesterol. A pré-condição para a caracterização destes peptídeos foi o estabelecimento em células eucarióticas (células de ovário de hamster chinês, CHO) de linhagens celulares estáveis que expressam hLDLR e mLDLR constitutivamente e a altas taxas. Estas linhagens celulares são utilizadas: i) para a caracterização de ligação de peptídeos a hLDLR expressos na superfície celular, em sua configuração nativa; ii) para verificar que hLDLR e mLDLR podem internalizar os peptídeos selecionados por endocitose.

A construção destas linhagens celulares é brevemente descrita. As seqüências de RNA mensageiro que codificam hLDLR e mLDLR estão disponíveis em bases de dados (números de acesso: NM_000527 e NM_010700, respectivamente). Os iniciadores necessários para a amplificação de cDNA por POR foram selecionados, compreendendo em sua extremidade (em letra em negrito) os sítios de restrição necessários (Hindlll e Sail para LDLR humano e Hindlll e Kpnl para LDLR murino) para clonagem no vetor de expressão pEGFP-N1 (Clontech): hLDLR Iniciador direto: ATATATAAGCTTCGAGGACACAGCAGGTCGTGAT Iniciador reverso: TTAATTGTCGACCACGCCACGTCATCCTCCAGACT mLDLR Iniciador direto: ATATATAAGCTTGACGCAACGCAGAAGCTAAG Iniciador reverso: TTAATTGGTACCGTTGCCACATCGTCCTCCAG

Os RNA totais preparados a partir de cérebros humanos e murinos foram transformados em cDNA por transcrição reversa por amplificação por PCR de fragmentos de DNA que codificam hLDLR e mLDLR. Após a amplificação, os produtos PCR foram digeridos por Hindlll-Sall e Hindlll-Kpnl enzimas de restrição, respectivamente, e ligados no vetor de expressão pEGFP-N1 (Clontech), digeridos pelas mesmas enzimas de restrição. Após a transfecção em células eucarióticas, este vetor permite a expressão, sob o controle do promotor de CMV, de LDLR fusionado com GFP na sua extremidade C-term, isto é, na extremidade de seus domínios intracelulares (Figura 3). Após a transformação de bactérias DH5α E. coli competente, obtenção de colônias isoladas e preparação DNA de plasmídeo, ambas as fitas das construções foram seqüenciadas em sua totalidade para verificação. EXEMPLO II

Estabelecimento de linhagens de células de CHO de maneira estável que expressam LDLR humano e murino. Transfecções transitórias em várias linhagens celulares (CHO, COS, N2A e HEK293) foram levadas a cabo para determinar em células vivas ou fixas os níveis de expressão e localização em membrana de hLDLR e mLDLR. O receptor é diretamente visível em células vivas, sob microscopia de fluorescência, sem a necessidade de imunocoloração, em virtude da fluorescência verde emitida pela GFP fusionada na C-term destes receptores. Os transfectantes estáveis foram selecionados por diluição limite e pelo gene de resistência a geneticina (G418) portado pelo vetor de expressão. Estas linhagens celulares foram amplificadas enquanto se mantinha a pressão seletiva. No exemplo citado aqui, a expressão de hLDLR-GFP do tamanho esperado foi verificado por Western blot em lisados celulares com anticorpos dirigidos contra LDLR humano e contra GFP. Uma proteína que corresponde aos tamanhos combinados de GFP e hLDLR (190 kDa) é reconhecida pelos anticorpos anti-hLDLR (Figura 4) e anti-GFP em extratos celulares preparados a partir de linhagens celulares estáveis. Uma linhagem de células de CHO que expressa GFP constitutivamente foi utilizada como controle negativo. O anticorpo anti-hLDLR não detecta proteína na linhagem celular da GFP.

A imunocitoquímica com anticorpo anti-hLDLR em células fixadas (PFA) das linhagens de células CHO-GFP (controle) e CHO-hLDLR-GFP mostra que a fusão de hLDLR-GFP é bem expressa nas células transfectadas. Os experimentos de imunocitoquímica em células não permeabilizadas com Triton X100 mostram que o domínio extracelular de LDLR é bem detectado no nível extracelular (Figura 5).

A co-localização entre hLDLR e seu ligando natural LDL, tornado fluorescente por adsorção de Dil, um marcador fluorescente, é mostrada. Este ligando fluorescente natural (Dil-LDL) é rapidamente internalizado (endocitose) como visualizado sob microscopia de fluorescência em células fixadas (Figura 6-A). Em contraste, Dil-LDL não é incorporado por endocitose pela linhagem de células CHO-GFP de controle, ou por outra linhagem de células CHO de controle, que super-expressa, por exemplo, receptor de transferrina humana (hTfR, Figura 6-B), outro receptor envolvido em transcitose. Além disso, a atividade de transcitose da linhagem de células CHO-LDLR-GFP é específica para ligando de LDLR, uma vez que nesta linhagem celular a endocitose de ligando não específica para o mesmo, por exemplo, transferrina (Tf) corada com fluorocromo vermelho (Texas Red, Figura 6-C), não é observada.

A funcionalidade de receptor (capacidade de endocitose) é confirmada por experimentos em tempo real, sob vídeo microscopia de fluorescência que mostra que LDL, ligando natural de hLDLR, corada com Dil, é realmente transportada rapidamente e muito efetivamente em células que expressam hLDLR-GFP em comparação com células que expressam GFP somente ou células que expressam outro receptor envolvido em endocitose tal como hTfR (controle negativo). De modo inverso, os experimentos de vídeo microscopia levados a cabo com Tf corada com Texas Red, que é muito eficientemente incorporado por endocitose por células que expressam hTfR-GFP, confirmam que a transferrina não é incorporada por endocitose por células de uma linhagem celular da GFP de controle ou por células de uma linhagem celular de hLDLR.

Apesar de um alto nível de expressão de hLDLR em linhagens de células CHO- hLDLR-GFP, a sistema de endocitose não é somente efetivo, mas preservou sua seletividade. A presença de fusão de GFP não alterou as propriedades de inserção de membrana de hLDLR, nem a exposição do lado de fora da célula do domínio extracelular de hLDLR, nem a funcionalidade do receptor em processos de endocitose. EXEMPLO III

Triagem de bases de dados de vários bilhões de seqüências de peptídeo randômicas expressas por vírus bacterianos em linhagens de células CHO-hLDLR-GFP e identificação de vírus bacterianos e assim seqüências de peptídeo que exibem uma afinidade para hLDLR.

A triagem com bases de dados de seqüências de peptídeo randômicas expressas por vírus bacterianos foi utilizada na linhagem de células CHO-hLDLR-GFP, após a exaustão de bases de dados de vírus bacterianos em uma linhagem de células CHO-GFP de controle que expressam GFP somente. Após abundante lavagem e então eluição com ácido, os vírus bacterianos fixados nas linhagens celulares são amplificados por infecção de bactérias E. coli ER 2738 em meio líquido ou nas placas de Petri. A triagem reiterativa nas linhagens celulares de vírus bacterianos eluídas e então ream plif içadas permitiu a caracterização de vírus bacterianos exibindo forte afinidade para hLDLR expresso na superfície celular. Entre estes vírus bacterianos, somente aqueles que também se ligam à linhagem celular murina (CHO-mLDLR-GFP) foram selecionados.

Cinco triagens independentes foram levadas a cabo e em total aproximadamente 200 clones de vírus bacterianos (placas tardias) foram seqüenciadas após amplificação por PCR de regiões do genoma de vírus bacteriano que codificam os peptídeos expressos por estes vírus bacterianos. Numerosos vírus bacterianos tinham seqüências idênticas. Duas famílias de seqüência de peptídeo foram obtidas: peptídeos cíclicos com motivo conservado, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 65, e peptídeos lineares com motivo não conservado, SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 29 (ver as listas de seqüências do presente documento).

Os clones de vírus bacterianos identificados seguindo a ligação dos peptídeos, que expressam e que se ligam a hLDLR-GFP expresso pela linhagem de células CHO-hLDLR- GFP estável, foram juntados com células de LDLR e, após lavagem intensiva, foram detectados com um anticorpo dirigido contra a proteína de envelope viral do vírus bacteriano seguido por um segundo anticorpo acoplado com Alexa 594 (Figura 7). Estes vírus bacterianos não se ligam a células da linhagem de células CHO-GFP de controle que expressam GFP somente.

Lotes de vírus bacterianos purificados com titulações idênticas foram postos em competição em linhagens celulares e após a lavagem intensiva e eluição com ácido, clonagem e seqüenciamento de aproximadamente 50 vírus bacterianos, aqueles com as afinidades mais altas entre os peptídeos cíclicos e lineares foram identificados.

Aqueles não selecionados ou retidos para outros experimentos em nenhum caso são considerados inúteis; não podem ser considerados como não funcionais. Estes peptídeos preservam grande potencial como candidatos a vetor e, como uma conseqüência, também são reivindicados pela presente invenção. EXEMPLO IV

Interação de peptídeos expressos por vírus bacterianos com hLDLR de linhagens de células CHO-LDLR-GFP e com hLDLR de células não modificadas geneticamente.

Os vírus bacterianos que expressam peptídeos com afinidade para hLDLR foram incubados com células aderentes, não modificadas geneticamente, conhecidas por expressar hLDLR de uma maneira constitutiva ou induzível, de maneira notável fibroblastos humanos, células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) ou células endoteliais macrovasculares de cérebro porcino. A imunocitoquímica com anticorpos dirigidos contra a proteína de envelope viral do vírus bacteriano mostram que peptídeos com afinidade para hLDLR, expressos por vírus bacterianos, também se ligam a LDLR presentes em células primárias, não modificadas geneticamente, por exemplo, fibroblastos humanos e células endoteliais macrovasculares de cérebro porcino (Figura 8).

A imunocitoquímica qualitativa foi complementada com citometria de fluxo quantitativa (FACS) com células suspensas (linhagem celular da GFP, linhagem de células CHO-hLDLR-GFP, fibroblastos humanos, HUVEC). Estas células foram crescidas em meio de cultura, dissociadas ou desligadas mecanicamente (sem tripsina), centrifugadas, ressuspensas e incubadas na presença de vários clones de vírus bacterianos e anticorpo anti-LDLR, durante 20 min a 4°C a fim de evitar qualquer processo de endocitose. Após lavagens, os vírus bacterianos ligados a células foram visualizados com anticorpo anti- proteína de envelope viral. As análises de FACS foram levadas a cabo com um sistema FACSCanto (Becton Dickinson) usando o software BD FACSDiva. O número de células positivas foi padronizado com 5.000 eventos para cada teste. Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias de fluorescência.

Estas abordagens mostraram uma correlação entre a taxa de expressão de hLDLR determinada pelo anticorpo anti-hLDLR visualizado pelo anticorpo secundário Alexa 488 (eixo horizontal) em várias tipos de célula (Figuras 9-11), e um anticorpo dirigidos contra proteína de envelope de vírus bacteriano visualizado por anticorpo Alexa 647 ou anticorpo aloficocianina (APC) (eixo vertical). As figuras 9, 10, 11 correspondem aos resultados obtidos para os peptídeos de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 21 em células da linhagem de células CHO-hLDLR-GFP (Figura 9), fibroblastos humanos (Figura 10) e HUVEC (Figura 11).

A hipótese, de acordo com a qual os peptídeos expressados por vírus bacterianos com afinidade para hLDLR poderiam interagir com domínios de ligação de LDL, o ligando natural de hLDLR, foi avaliada em vários tipos de células, de maneira notável em HUVEC por experimentos de FACS, similares a aqueles apresentados acima, como mostrados aqui, por exemplo, (Figura 12). Em primeiro lugar, é mostrado que a taxa de ligação de vírus bacterianos que expressam peptídeos com afinidade para hLDLR (SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 11 são utilizados no presente documento como exemplos) é proporcional ao nível de expressão de LDLR por HUVEC. Os experimentos de FACS levados a cabo na presença de LDL tornaram possível mostrar e quantificar um forte desvio (85%) de LDL por peptídeos lineares (por exemplo, SEQ ID NO: 21), mas um pequeno desvio (17%) por peptídeos cíclicos (por exemplo, SEQ ID NO: 11). EXEMPLO V

Interação de peptídeos expressos por vírus bacterianos com afinidade para hLDLR com células endoteliais de vaso de cérebro de camundongo in vivo.

Os vírus bacterianos que expressam peptídeos com afinidade para hLDLR (SEQ ID NO: 1 é descrita no presente documento, por exemplo,) e vírus bacterianos de controle (não expressando peptídeo com afinidade para hLDLR) foram injetados na veia da cauda de camundongos C57BL6 anestesiados com halotano. Após 15 min e 2 h após a injeção, os camundongos foram sacrificados e perfusionados com 0,9% de NaCI. Cérebro, fígado e rins foram congelados em isopentano e seções congeladas foram preparadas para coloração imunohistoquímico dupla para visualizar os vasos sangüíneos com IgG anti-camundongo e anticorpo anti-proteína de envelope virai para visualizar vírus bacterianos ligados a células endoteliais in vivo. Os experimentos mostram que vírus bacterianos que expressam SEQ ID NO: 1 de peptídeo com afinidade para hLDLR e mLDLR se ligam a células endoteliais de paredes de vasos, o que não é o caso para vírus bacterianos de controle (Figura 13). EXEMPLO VI

Síntese de peptídeos que corresponde a vírus bacterianos com afinidade para hLDLR e acoplamento com um traçador molécula (biotina, fluoresceína, ou Etiqueta S com atividade enzimática).

Peptídeos foram sintetizados pelo método de síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) em um sintetizador Advanced ChemTech Apex396 (AAPPTec), ou um sintetizador de microondas Liberty™ (CEM), usando um estratégia de Fmoc/tBu em R resinas Rink Amide AM em poliestireno-1% de DVB, Wang em poliestireno-1% de DVB, Barlos (cloreto de 2-clorotritila) em poliestireno-1% de DVB, ou Sieber Amide em poliestireno-1% de DVB. A carga (ou substituição) é entre 0,25 mmol/g e 1,6 mmol/g de acordo com a resina utilizada.

Os aminoácidos N-protegidos por Fmoc (ou Boc para algumas extremidades N- term) e/ou protegida por funções ortogonais (de maneira notável funções de ácido lábil) em suas cadeias laterais, o acoplamento químico e reagentes de desproteção e os solventes são adquiridos de companhias especializadas e são utilizados como tal.

As resinas Rink Amide e Wang tornaram possível sintetizar seqüências de peptídeo completamente desprotegidas em suas cadeias laterais e suas extremidades C-term. Isto é assim SPPS ortogonal bidimensional (Fmoc/tBu).

As resinas Barlos e Sieber ácido lábil hipersensível (HAL) permitem a liberação da função de ácido ou amida terminal (C-term) enquanto preserva as proteções laterais ortogonais dos vários aminoácidos do peptídeo sintetizado bem como a proteção amina terminal (N-term) d função a amina do seu último aminoácido (por exemplo, N-acetilação para questões de estabilidade das seqüência de peptídeo neosintetizadas). Estes tipos de resinas, via uma estratégia de síntese Fmoc (Prot,), torna possível usar proteções laterais ortogonais ácido lábil (Prot2: Boc, tBu, OtBu, Trt, Mmt, Acm, etc.) cliváveis somente em meio fortemente ácido, enquanto que o peptídeo protegido é desacoplado em condições ácidas muito fracas. Este tipo de clivagem torna possível recuperar a seqüência de peptídeo completamente protegida em suas funções laterais (Prot2) com um vista para acoplar a molécula terapêutica de interesse com o peptídeo. Isto é assim SPPS ortogonal tridimensional (Barlos ou Sieber/Fmoc/tBu).

As proteções laterais ortogonais padrão (Prot2) utilizadas para cada aminoácido durante a síntese de peptídeo são: Arg(N-Pbf), Arg(N-Pmc), Asn(N-Trt), Asp(O-tBu), Cys(S- Acm), Cys(S-Mmt), Cys(S-4MeBn), Cys(S-tBu), Cys(S-Tmob), Cys(S-Trt), Glu(O-tBu), Gln(N-Trt), His(N-Trt), Lys(N-Boc), Ser(O-tBu), Thr(O-tBu), Trp(N-Boc), Tyr(O-tBu) (Applied Biosystems, 1998, Cleavage, Deprotection, and Isolation of Peptides after Fmoc Synthesis. Technical Bulletin). Gly, Ala, Vai, Leu, lie, Phe, Met e Pro não têm proteções laterais, uma vez que suas respectivas estruturas químicas não requerem as mesmas it.

Os aminoácidos são acoplado via ativação da função ácido do aminoácido n+1 usando DlEA/HBTU/HOBt ou DIPC/HOBt em DMF. A desproteção do grupo Fmoc (Prot-i) de um novo aminoácido assim acoplado é levada a cabo usando 20% de piperidina em DMF.

O último aminoácido acoplado durante o seqüenciamento de peptídeo será protegido por uma função Boc (com uma vista para liberar sua função amina terminal livre na extremidade de síntese), ou acetilado (a fim de estabilizar os neopeptídeos sintetizados, mas também para reduzir os riscos de reações secundárias durante o acoplamento covalente da molécula terapêutica de interesse na posição C-term, por exemplo,).

De acordo com o peptídeo sintetizado, pontes dissulfeto são obtidas por ciclização intramolecular de duas funções tiol de duas Cys protegidas adequadamente (Acm, Trt, tBu, etc.), em solução ou em resina, usando reagentes classicamente utilizados pelo técnico no assunto: I^DMF, I^HFIP/DCM, TFA/DMSO/anisol, l2/DCM/MeOH/H2O, etc. Um Cys na posição N-term pode vantajosamente ser substituído por um Mpa para ciclização via uma ponte dissulfeto. As pontes de lantionina (por ciclização via deshidroalanina) ou dicarba (por ciclização via alilGIy) podem também ser obtidas por vias de síntese conhecidas ao técnico no assunto. Uma ponte de lactama pode ser criada entre a função ácido lateral de um resíduo Glu (ou Asp) e uma função amina lateral em uma Lys ou lima amina N-term. De maneira similar, a ciclização entre a função amina N-term e a função ácido C-term (cabeça/cauda) pode ser levada a cabo via uma ligação amida, justo como a ciclização entre a função amina lateral de Lys e a função ácido C-term do peptídeo.

Os peptídeos de resinas Barlos ou Sieber são clivados por métodos classicamente utilizados pelo técnico no assunto, com 0,5% de TFA (v/v) em DCM, ou com AcOH/TFE/DCM (1/1/3), ou com HFIP (30%) em DCM, ou com TFE (30%) em DCM, etc.

A desproteção de cadeias laterais, e a clivagem de peptídeos de resinas Rink Amide ou Wang, são levadas a cabo por métodos classicamente utilizados pelo técnico no assunto: com TFA/H2O/TIS ou TIPS (95/2,5/2,5), ou com TFA/H2O/EDT/TIS ou TIPS (94/2,5/2,5/1), ou com TFA/tioanisol/H2O (94/5/1), ou com TFA/TIS/H2O/tioanisol (90/5/3/2), ou com TFA/H2O/fenol/tioanisol /EDT (82,5/5/5/5/2,5), etc.

Biotinas, fluoresceínas, ou Etiqueta S (ver EXEMPLO VII, a seguir) são introduzidas na posição C-term de acordo com métodos de síntese e acoplamento clássicos conhecidos ao técnico no assunto.

As peptídeos são isolados e purificados por HPLC em um equipamento Beckman System Gold 126 com uma coluna Chromolith C18 (4,6 mm x 50 mm) ou Nucleosil C18 (10 mm x 250 mm) com, por exemplo, um gradiente de acetonitrilo de 0% a 100% em um fase aquosa (H2O + 0,1% de TFA) em 3,5 min então de 100% a 0% em 1,5 min (taxa de fluxo: de 1 ml/min a 5 ml/min), ou em um sistema Waters 1525 com uma coluna Chromolith Speed ROD RP-18 (4,6 mm x 50 mm) (fase estacionária) com detecção por um detector Waters 996 PDA (190 nm - 400 nm), ou em um sistema Waters Alliance 2690 com uma coluna Chromolith Performance RP-18 (3 mm x 100 mm) (fase estacionária) com detecção por um detector Waters 996 PDA (190 nm - 400 nm). A detecção de UV é levada a cabo a 214 nm e 254 nm.

As purificações preparativas são levadas a cabo com um sistema Waters Prep LC 4000 com uma coluna Guard-Pak™ (fase estacionária) com cartuchos Delta-Pak™ C18 (25 mm x 10 mm) com detecção por um detector de absorbância de comprimento de onda Waters 2487 Dual.

Os pesos moleculares são determinados usando um espectrômetro de massas de ionização por eletrospray (ESI) em modo positivo. Os espectros são obtidos usando um Waters Micromass Quattro Micro (analisador de quadrupolo) equipado com um sistema de HPLC Waters Alliance 2690 que permite acoplamento CL-EM.

As condições de análise de CL-EM utilizadas são como segue: - coluna Chromolith Flash C18 (4,6 mm x 25 mm), - taxa de fluxo de 3 ml/min, - gradiente linear desde 0% até 100% de B em 2,5 min (A: 0,1% de H2O/HCO2H; B: 0,1% de ACN/HCO2H).

Os espectros de massa em mos eletrospray positivo são adquiridos a uma taxa de fluxo de 100-200 μl/min. Os dados são obtidos em modo de varredura desde 200-1700 m/z com intervalos de 0,1 s. EXEMPLO VII Ligação e endocitose de peptídeos sintetizados com afinidade para hLDLR em linhagens de células CHO-LDLR-GFP.

Os peptídeos com afinidade para hLDLR-GFP e os peptídeos de controle (peptídeos randômicos, resíduos idênticos aos peptídeos com afinidade para hLDLR-GFP, mas não em ordem particular) foram sintetizados, e acoplados/conjugados na posição C- term com várias moléculas traçador, rodamina ou Etiqueta S, separados por um espaçador composto de três resíduos Gly (Figura 14). A etiqueta S (um peptídeo de 15 aminoácidos derivado da seqüência 1-15 de ribonuclease pancreática bovina A) por um lado pode ser reconhecida por um anticorpo anti-Etiqueta S para abordagens imunocitoquímica ou FACS, e por outro lado pode reconstituir a atividade enzimática por ligação com proteína S de ribonuclease (porção C-term, aminoácidos 21-124) em testes de atividade in vitro usando o kit de ensaio de Etiqueta S FRETWorks (Novagen 70724-3). A ribonuclease assim ativada digere um substrato de RNA liberando um agente fluorescente mascarado visualizado por FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) e quantificado em uma placa de 96 poços em um espectrofluorímetro Beckmann. Para estes experimentos de FRET, células CHO de controle e GFP fusionada na posição C-term com hLDLR e mLDLR, que gera forte ruído de fundo nos comprimentos de onda utilizados para FRET, foi substituída por proteína fluorescente vermelha (RFP). As linhagens celulares estáveis geradas para os experimentos de FRET são assim CHO-RFP e CHO-hLDLR-RFP.

Para as abordagens de FRET, as células são lavadas duas vezes com 2 ml de PBS e então incubadas durante 1 h a 37°C com 250 μl de solução de peptídeo. São de novo lavadas duas vezes com 2 ml de PBS e então duas vezes com 1 ml de PBS, e então raspadas em 1 ml de PBS e centrifugadas durante 5 min a 1,250 rpm. O sobrenadante é então aspirado e o precipitado de células é lisado em 80 μl de PBS + 0,1% de Triton X100. Vinte μl de cada lisado de células são analisados medindo a emissão de fluorescência após a reação de FRET.

Experimentos envolvendo a incubação de peptídeos em várias células que expressam hLDLR foram realizados. Os resultados obtidos com SEQ ID NO: 1 de conjugado de peptídeo com rodamina ou SEQ ID NO: 2 de conjugado de peptídeo com Etiqueta S são mostrados como um exemplo e indicam que os peptídeos se ligam bem a células CHO- LDLR-GFP e que os mesmos são incorporados por endocitose para acumular nas células da linhagem celular que expressa hLDLR, o que não é o caso para os peptídeos de controle (Figura 15). Nestes experimentos, a incubação preliminar de peptídeos conjugados com Etiqueta S, com um anticorpo primário (Ac primário) dirigidos contra Etiqueta S, e um anticorpo secundário (Ac secundário) dirigidos contra o anticorpo primário mostram que o complexo SEQ ID NO: 2/Etiqueta S/Ac primário/Ac secundário se liga a células que expressam hLDLR e é internalizado por endocitose. Estes resultados indicam que os peptídeos da família da SEQ ID NO: 2 podem se ligar a células que expressam hLDL e vetorizar grandes cargas (dois anticorpos), isto é, estas cargas são internalizadas por endocitose.

A endocitose de peptídeos com afinidade para hLDLR foi quantificada. Para este fim, os peptídeos de SEQ ID NO: 11/Etiqueta S e controle (randômico) foram incubados com células CHO-hLDLR-RFP durante 1 h a 37°C. As células foram lavadas a fim de eliminar qualquer traço de peptídeo não fixado. As lavagens foram levadas a cabo com PBS, o que torna possível quantificar por FRET os peptídeos ligados à membrana celular e aqueles internalizado por endocitose (Figura 16-A), bem como com. uma solução ácida (0,2 M de glicina, 0,15 M de NaCI, pH 3), que torna possível dissociar os peptídeos ligados a hLDLR na membrana celular. Somente os peptídeos incorporados por endocitose pelas células são então detectados por FRET (Figura 16-B). O mesmo é verdade com SEQ ID NO: 2 de peptídeo /Etiqueta S em fibroblastos humanos (Figura 16-C-D).

Estas observações foram também confirmadas em células não aderentes por FACS. Um exemplo é dado de ligação em células da linhagem de células CHO-hLDLR-GFP de SEQ ID NO: 11 de peptídeo de modo inverso ao peptídeo de controle, ambos sendo conjugados com Etiqueta S (Figura 17). EXEMPLO VIII

Toxicidade, endocitose e transcitose de peptídeos sintetizados com afinidade para hLDLR em células endoteliais em um modelo de BHE in vitro.

Os efeitos tóxicos potenciais de peptídeos em células endoteliais, a ligação/acumulação de peptídeos nestas células, e a passagem por transcitose de peptídeos foram avaliadas em modelos de BHE in vitro. As células necessárias para estabelecer o modelo (co-cultura de células endoteliais de microvasos cerebrais e astrócitos) são células bovinas (células endoteliais microvasculares de cérebro bovino, BBMEC) vendido por Cellial Technologies (Lens, France). Este modelo de BHE in vitro é usado para avaliar a passagem passiva/difusão ou transporte ativo de numerosas moléculas, de maneira notável agentes farmacológicos, através da BHE e assim sua capacidade para alcançar o tecido do SNC. O modelo tem propriedades ultra-estruturais características do endotélio cerebral, de maneira notável junções apertadas, ausência de poros, ausência de canais transendoteliais, baixa permeabilidade a moléculas hidrofílicas e lata resistência elétrica. Além disso, este modelo mostrou uma correlação sólida entre os resultados de medições tomadas em várias moléculas avaliadas in vitro e in vivo para sua propriedade de passar através da BHE. Até agora, todos os dados obtidos mostram que este modelo de BHE imita proximamente a situação in vivo reproduzindo algumas das complexidades do ambiente celular que existe in vivo, enquanto preserva as vantagens associadas a experimentação em cultura de tecido. Numerosos estudos validaram esta co- cultura de células como um dos modelos de BHE in vitro mais reproduzíveis.

O modelo de BHE in vitro põe em jogo uma co-cultura de BBMEC e astrócitos. Antes da cultura celular, os insertos de membrana (Millicell-PC 3,0 μm; 30 mm de diâmetro) são tratados na parte superior com colágeno da cauda do rato a fim de permitir a adesão ótima de BBMECs e para criar as condições de uma lâmina basal. As culturas primárias de astrócitos misturados são estabelecidas de córtex cerebral de rato neonatal (Dehouck et al., 1990, J. Neurochem., 54, 1798-1801). Brevemente, após as meninges serem removidas, o tecido cerebral é passado através de uma peneira de náilon de 82 μm. Os astrócitos são distribuídos em poços de microplacas a uma concentração de 1,2x105 células/ml com 2 ml de meio de cultura ótimo (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bezerro inativado pelo calor. O meio é trocado duas vezes por semana. As BBMECs obtidas de Cellial Technologies são crescidas na presença de meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro de cavalo e 10% de soro de bezerro inativado pelo calor, 2 mM de glutamina, 50 μg/ml de gentamicina e 1 ng/ml fator de crescimento de fibroblastos básicos, adicionados a cada dois dias. As BBMECs são então distribuídas sobre a superfície superior dos filtros em 2 ml de co-cultura. Este meio BBMEC é trocado três vezes por semana. Sob estas condições, BBMECs diferenciadas formam uma monocamada de células confluentes sete dias depois. Os experimentos reportados a seguir são levados a cabo entre cinco e sete dias após a confluência ter sido alcançada.

A SEQ ID NO: 1 de peptídeo e um peptídeo de controle, ambos conjugados com rodamina, foram incubados na câmara superior do sistema de cultura, em contato com células endoteliais por 1 h, 5 h e 24 h. O meio de cultura da câmara inferior é coletado em vários tempos e a fluorescência quantificada por análise fluorimétrica. Os resultados são expressos como permeabilidade de superfície endotelial (Pe) em unidades de 10'3cm/min. Lucifer Yellow (LY), uma molécula fluorescente pequena que cruza a BHE muito pouco, é usada em primeiro lugar para avaliar a integridade da BHE in vitro, em todos os poços analisados, e em segundo lugar para a co-incubação de peptídeos a fim de avaliar a ausência de toxicidade dos peptídeos para as células endoteliais que formam esta BHE. A barreira in vitro é considerada “permeável” ou “aberta” se o valor de Pe de LY é superior a 1x10'3 cm/min. A resistência elétrica transendotelial (RETE), medida com um ohmetro e expressada em ohm.cm2, também torna possível medir a integridade da BHE in vitro durante os testes de passagem através da BHE. O valor de limiar de qualidade é estabelecido a >500 ohm.cm2.

As análises levadas a cabo com os peptídeos mostram uma ausência de toxicidade para SEQ ID NO: 1 de peptídeo, bem como para o peptídeo de controle usado, e uma ausência de efeitos deletérios nas propriedades de permeabilidade da BHE, uma vez que os valores de Pe medidos com LY não aumentam na presença ou ausência dos peptídeos, mesmo após 24 h de incubação (Figura 18).

A taxa de ligação e/ou internalização de um peptídeo de controle e SEQ ID NO: 1 de peptídeo, ambos conjugados com rodamina, foi determinada no modelo de BHE in vitro descrito acima. Esta análise foi levada a cabo pela lise de células endoteliais em vários tempos (2 h, 5 h, 24 h), e por medições fluorimétricas da quantidade de fluorescência (rodamina) associada às células (membrana e compartimentos citoplasmáticos obtidos por centrifugação destas células após lise). Os valores medidos indicam que SEQ ID NO: 1 de peptídeo conjugada com rodamina tem mais afinidade para células endoteliais em um modelo de BHE in vitro que o peptídeo de controle, em todos os tempos analisados (Figura 19).

A passagem de um peptídeo de controle e SEQ ID NO: 1 de peptídeo, ambos conjugados com rodamina, foi estabelecida no modelo de BHE in vitro descrito acima. Esta análise é levada a cabo pela medição por fluorimetria da quantidade de fluorescência acumulada nos poços receptores em vários tempos (1 h, 4 h, 24 h). A integridade da BHE nos vários poços analisados foi avaliada pela medição simultânea do nível de LY que passa de um compartimento ao outro como uma função do tempo. Os valores de Pe medidos indicam que em períodos curtos (1 h e 4 h), o nível de SEQ ID NO: 1 de peptídeo que passa por transcitose não pode ser distinguido da passagem não específica ou paracelular como medido para o peptídeo de controle. Por outro lado, a 24 h, a taxa de passagem de SEQ ID NO: 1 de conjugado de peptídeo com rodamina é significantemente bem mais alta que essa do peptídeo de controle. As medições de LY também mostram que a integridade da BHE é conservada a 1 h, 4 h e 24 h (Figura 20). Outras medições mostram que a concentração de SEQ ID NO: 1 de conjugado de peptídeo com rodamina é muito mais alta no compartimento receptor a 24 h, em comparação com essa do compartimento doador, sugerindo o transporte ativo do peptídeo, certamente via receptores, sem um equilíbrio de concentração ter sido alcançado entre os dois compartimentos. EXEMPLO IX

Otimização química de SEQ ID NO: 11 de vetor de peptídeo. Um estudo das relações de estrutura/atividade (afinidade) foi levado a cabo na SEQ ID NO: 11 de vetor de peptídeo via a técnica de varredura de alanina (Ala-scan) e por truncagem de N- e C-term a fim de determinar a importância de cada um dos 15 aminoácidos constitutivos deste peptídeo. A afinidade para hLDLR de cada peptídeo neosintetizado que resulta da otimização química foi determinada por fluorimetria pela medição da taxa de deslocamento de SEQ ID NO: 11 de conjugado de peptídeo ao C-term via um espaçador três-Gly ao peptídeo da Etiqueta S (SEQ ID NO: 11/Etiqueta S) (ver EXEMPLO VII).

Brevemente, as células de CHO-hLDLR-RFP usadas são aderentes e na confluência. São crescidas em placas de seis poços. Três poços de células são usados por condição.

Uma solução que contém 10μM de SEQ ID NO: 11 de peptídeo/Etiqueta S é preparada em HamF12-1% de meio de cultura BSA. A esta solução são adicionados 10 μM de peptídeo resultante da Ala-scan a ser avaliada (competição).

Diversas soluções de controle são também preparadas: (i) HamF12-1% de meio BSA. (ii) HamF12-1% de meio BSA + 10 μm de peptídeo de controle CTRL-Etiqueta S (avaliação de ligação não específica de qualquer peptídeo que compreende a Etiqueta S). (iii) HamF12-1% de meio BSA + 10 μm de SEQ ID NO: 11 de peptídeo/Etiqueta S + 10 μm de peptídeo de controle CTRL (avaliação de competição “não específica” entre o peptídeo de interesse e o peptídeo de controle CTRL). As abordagens FRET usadas são aquelas descritas no EXEMPLO VII.

Aproximadamente 60 peptídeos foram testados por estas abordagens. Trinta e seis destes peptídeos (SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 65) exibem afinidade in vitro para LDLR.

Este estudo confirmou ainda a importância de cisteínas e assim da ciclização e do motivo de tripeptídeo de MPR. Este estudo também tornou possível reduzir o tamanho do vetor de peptídeo uma vez que o peptídeo cíclico de oito aminoácidos (SEQ ID NO: 48), que compreende pelo menos um aminoácido de configuração D, exibe excelente afinidade para LDLR.

De acordo com o mesmo protocolo, SEQ ID NO: 48/Etiqueta S serve como uma referência para a otimização química (estudo de tamanho de ciclo, introdução de aminoácidos não naturais) de SEQ ID NO: 48 de vetor de peptídeo e medições da afinidade de conjugados para LDLR. Assim, as SEQ ID NO: 66 a SEQ ID NO: 72 de conjugados, descritos no presente pedido, também exibem afinidade in vitro para LDLR. EXEMPLO X

A estratégia para a síntese química de conjugados compreendidos de um vetor e uma molécula terapêutica de interesse ou agente de obtenção de imagem (ou de diagnóstico) ou qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular.

Uma molécula terapêutica de interesse ou agente de obtenção de imagem ou de diagnóstico ou qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular pode ser liberada/clivada do vetor após o transporte e passagem através de membranas celulares, mais particularmente a BHE, por exemplo, através de uma estratégia de pró-fármaco por hidrólise ou clivagem enzimática de uma ligação química entre o vetor e a substância ativa.

O acoplamento covalente entre o vetor de peptídeo completamente protegido nas suas funções laterais reativas (acoplamento no C-term e N-term) ou parcialmente protegido (acoplamento em uma função reativa de uma cadeia lateral) e a molécula terapêutica de interesse é levado a cabo via duas estratégias geral (Figura 2): síntese em tandem (isto é, acoplamento direto com nenhum intermediário entre as duas entidades), síntese via um ligante (Temsamani et al., 2004, Drug Discov. Today, 23, 1012-1019).

Como um exemplo, a síntese em tandem de SEQ ID NO: 66 de conjugado de peptídeo entre um peptídeo terapêutico analgésico, dalargin, e SEQ ID NO: 48 de vetor de peptídeo foi levada a cabo como descrita para a síntese de peptídeos no EXEMPLO VI.

Como um exemplo, as sínteses via ligantes de peptídeo (GGG, GFLG, ALAL, β-Ala, Ahx, GFAL) de SEQ ID NO: 67 a SEQ ID NO: 72 de conjugados de peptídeo entre um peptídeo terapêutico analgésico, dalargin, e SEQ ID NO: 48 de vetor de peptídeo foram levadas a cabo como descritas para a síntese de peptídeos no EXEMPLO VI.

De acordo com o vetor de peptídeo e molécula de interesse terapêutico selecionada, uma ou a outra das várias estratégias é aplicada no C-term, ou no N-term, ou em uma função reativa de cadeia lateral. De maneira ideal, os espaçadores selecionados deveriam permitir a liberação adequada da substância ativa e melhora da solubilidade do conjugado (Molema et al., 2001, Vetorisation, organ-specific strategies. Em: Methods and principles in medicinal chemistry, vol. 12). Várias ligações químicas covalentes lábeis podem assim ser geradas entre as duas entidades (vetor e substância ativa) via ou não via um espaçador: amidas, carbamatos, ésteres, tioéster, dissulfeto, etc. Por exemplo, foi mostrado na literatura que ligações dissulfeto, relativamente estáveis em plasma, podem ser clivadas dentro do compartimento intracerebral para restaurar uma função tiol livre (Saito et al., 2003, Adv. Drug Deliv. Rev., 55, 199-215).

Outros compostos de interesse são aqueles em que o espaçador é um polímero tal como polietilenoglicol (PEG). De fato, foi mostrado na literatura que a conjugação de uma molécula orgânica de interesse biológico com PEG tornou possível aumentar a meia-vida no plasma desta molécula (Greenwald et al., 2003, Adv. Drug Deliv. Rev., 55, 217-250) e diminuir a sua depuração.

Os conjugados entre vetores e uma substância ativa ou uma substância de interesse podem ser usados no diagnóstico, obtenção de imagem ou terapia de uma patologia, lesão ou transtorno do SNC para preparar um fármaco capaz de cruzar a BHE, um tumor cerebral ou outro tipo de célula de câncer, para preparar um fármaco capaz de cruzar membranas celulares do câncer, e/ou patologias infecciosas para preparar um fármaco capaz de cruzar membranas celulares e para alvejar as células infectadas de patologias infecciosas bacteriana, viral, parasitica ou fúngica do cérebro ou outros tecidos/órgãos. EXEMPLO XI

A perfusão cerebral in situ para vetores separados e conjugados entre vetores e uma molécula terapêutica de interesse ou um agente de obtenção de imagem (ou de diagnóstico) ou qualquer outra molécula tal como uma sonda molecular, e estudo da sua cinética de transporte através da BHE e sua acumulação no cérebro de camundongo.

A técnica de perfusão cerebral in situ (em camundongo adulto macho OF1) é usada aqui para selecionar os melhores vetores e para proporcionar a prova do seu mecanismo de ação para a sua passagem no cérebro através da BHE.

Antecipadamente, os vetores de peptídeo são radiomarcados com trítio (3H), que oferece a sensibilidade mais forte para a detecção de compostos radioativos, de maneira notável em seções de tecido. Os peptídeos radioativos com alta radioatividade específica (SRA, até 100 Ci/mmol) são preparados por uma estratégia de acilação da função amina N- term por anidrido propiônico tritiado (ou propanóico) ou N-propionil-succinimida tritiado (NPS). Este método de tritiação pode ser aplicado a todos os peptídeos, com a provisão de que a modificação do N-term não afete a afinidade dos peptídeos para o receptor alvo (isto é, LDLR) ou sua atividade biológica no caso de peptídeos terapêuticos.

A reação de tritiação de vetores de peptídeo SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 48 na posição N-term por propionilação é levada a cabo em DMF (1 mg de peptídeo em 100 μl a 450 μl de acordo com a solubilidade) adicionando 0,1 equivalente de NPS tritiado por 5 min a temperatura ambiente, então 0,9 equivalente de NPS frio (não tritiado) por 1 h, e então um novo equivalente de NPS frio por 5 h. O meio de reação é então deixado a 4 °C durante a noite e purificado no dia seguinte por HPLC. A SRA para cada peptídeo tritiado é entre 5 Ci/mmol e 10 Ci/mmol (teoricamente na ordem de 7,7 Ci/mmol). A quantidade total de radioatividade preparada pela síntese é entre 600 μCi e 950 μCi.

No caso de conjugados entre vetores e uma substância ativa, é importante, para evitar sínteses químicas radiomarcadas que requerem o desenvolvimento de novas vias de síntese longas e custosas, escolher uma substância ativa modelo já comercialmente disponível com a marcação com carbono-14 (14C). Os peptídeos radiomarcados (radiomarcados com 3H, por exemplo) são acoplado covalentemente com uma substância ativa radiomarcada (radiomarcada com 14C, por exemplo) como descrito no EXEMPLO X. Como mencionado anteriormente, este acoplamento covalente é levado a cabo de acordo com a estrutura e propriedades físico-químicas da substância ativa, em particular a presença de grupos químicos funcionais que podem ser modificados sem diminuir a atividade biológica desta substância. Os conjugados radiomarcados são sintetizados por extrapolação de vias de síntese desenvolvidas para conjugados não radiomarcados.

Outra estratégia consiste na síntese de um conjugado entre um peptídeo terapêutico e um vetor de peptídeo via um ligante (de natureza peptídica ou orgânica) ou não via um ligante, como no caso de SEQ ID NO: 66 a SEQ ID NO: 72 de conjugados descritos no presente pedido. Assim, SEQ ID NO: 72 de conjugado N-term tritiado foi preparado como descrito acima.

As técnicas brevemente sumarizadas a seguir foram desenvolvidas para estudar a distribuição no cérebro de substância ativas e, em particular, o papel da BHE e, mais particularmente, de LDLR na penetração destas moléculas no cérebro. As técnicas de perfusão cerebral in situ estão entre as mais tecnicamente demandadas e as mais difíceis de praticar no camundongo. No entanto, a perfusão cerebral in situ (como modelos in vitro) permite o controle total da composição do perfusato artificial a fim de manter as células e vascularização do cérebro sob condições fisiológicas e anatômicas normais dentro do animal, sem o fator de rotura da distribuição sistêmica.

Esta estratégia de perfusão cerebral in situ normalmente levada a cabo no rato foi adaptada para camundongo (Dagenais et al., 2000, J Cereb Blood Flow Metab., 20(2), 381- 6) a fim de ampliar sua aplicação para avaliar os parâmetros da cinética de transporte na BHE e na barreira hemato-retiniana, em camundongos transgênicos e mutantes KO para os receptores, enzimas ou transportadores de substâncias ativas. Isto envolve a cateterização de uma artéria carótida em camundongos anestesiados OF1 e a ligadura de algumas ramificações desta artéria carótida (externa, tiroidal, occipital) a fim de especificamente perfundir as artérias carótida interna e pterigopalatina, que são usadas para avaliar a absorção no cérebro dos vetores e conjugados. O cateter torna possível substituir a circulação geral por infusão com um perfusato bem controlado (tampão bicarbonato, plasma ou sangue) passando pela carótida. O tampão bicarbonato de Krebs oxigenado é em primeiro lugar usado para avaliar as capacidades dos vetores e conjugados de ganhar o acesso ao cérebro. Após a cateterização da carótida, o fluxo de sangue endógeno é interrompido secionando os ventrículos do coração a fim de evitar a mistura de tampão com o sangue e a elevação na pressão sangüínea. A duração da perfusão de taxa de fluxo fixo é monitorada. A perfusão tampão pode ser estendida até 20 min, ou até 1 h na presença de transportadores de oxigênio (eritrócitos lavados) para estudos de transporte mediado por receptor (TMR).

O estudo de SEQ ID NO: 11 de vetor de peptídeo tornou possível determinar seu transporte no cérebro ou coeficiente de transferência (Kin). A duração da perfusão cerebral para estes experimentos é 5 min com uma taxa de fluxo de perfusato de 2 ml/min. Assim, o cálculo do Kin (volume de distribuição ao longo do tempo de perfusão cerebral) de SEQ ID NO: 11 de vetor de peptídeo dá um valor de 3,5 ± 0,2 x 10'4 ml/s/g.

Deve ser notado que a transferrina (Tf) tem um Kin de 3,0 x 10'4 ml/s/g (Demeule et al., 2008, J. Neurochem., 106(4), 1534-1544). O Kin da proteína RAP é 1,0 x 10'5 ml/s/g [Pan etal., 2004, J. Cell Sei., 117, 5071-5078).

A otimização química de SEQ ID NO: 11 de vetor de peptídeo em uma SEQ ID NO: 48 de vetor de peptídeo otimizado permitiu uma melhora da passagem no cérebro do vetor de peptídeo em um fator de 1,37. SEQ ID NO: 73 de peptídeo, a CMPRC foi usada como um controle para este estudo de perfusão cerebral. Kin de SEQ ID NO: 48=4,8 ± 0,4 x 10'4 ml/s/g Kin de SEQ ID NO: 73=1,5 ± 0,2 x 10'4 ml/s/g

Como descrito anteriormente, a conjugação química de dalargin (SEQ ID NO: 74, Y-(D)-AGFLR) via um ligante N-term de SEQ ID NO: 48 de vetor de peptídeo tornou possível obter a SEQ ID NO: 72 de conjugado. A dalargin livre não vetorizada (SEQ ID NO: 74) foi usada como um controle para este estudo de perfusão cerebral.

Assim, a passagem no cérebro de dalargin vetorizada (SEQ ID NO: 72) em comparação com a sua forma livre não vetorizada (SEQ ID NO: 74) é multiplicada por um fator de 21,78. Km de SEQ ID NO: 72=19,6 ± 3,9 x 10’4 ml/s/g Kin de SEQ ID NO: 74=0,9 ± 0,1 x 10'4 ml/s/g

Além disso, este tipo de experimento de perfusão cerebral in situ também torna possível estabelecer uma distinção entre compostos que permanecem no compartimento vascular cerebral e aqueles que tinham cruzado a membrana endotelial abluminal para entrar no parênquima cerebral. De fato, a técnica de depleção capilar pós-perfusão torna possível medir se a molécula realmente cruza o endotélio a fim de entrar no parênquima cerebral. O uso desta técnica torna possível mostrar que vetores de peptídeo específicos (ou conjugados) tendem a acumular no parênquima cerebral. Esta técnica (Triguero et al., 1990, J Neurochem., 54(6), 1882-8) é usada a fim de fazer uma distinção entre a fração de vetores (ou conjugados) que transitou pelo endotélio e entrou no cérebro via o espaço extracelular ou células cerebrais, e a fração restante associada a células endoteliais.

Assim, as etapas chave dos estudos de perfusão cerebral in situ em camundongo podem ser sumarizadas como segue para os vetores e conjugados estudados: i) Avaliação de tolerância (não toxicidade) dos vetores e conjugados na BHE e preservação da integridade desta barreira fisiológica. ii) Estudo da cinética e linearidade da absorção cerebral via TMR por LDLR. iii) Estudo da taxa de absorção cerebral como uma função da concentração de vetor ou conjugado (Tmax, Km). iv) Estudo dos mecanismos de transporte usando substratos que inibem ou modulam o LDLR v) Distribuição nos compartimentos do cérebro: depleção capilar (Triguero et al., 1'990, J Neurochem., 54(6), 1882-8). vi) Avaliação da taxa de ligação de vetores e conjugados com proteínas plasmáticas (albuminas, etc.) e estudo da sua influência na absorção cerebral destas moléculas. vii) Administração intravenosa e avaliação da distribuição nos tecidos (cérebro e outros órgãos) como uma função do tempo.

Além disso, o Kin destes vários peptídeos, através da barreira hemato-retiniana (BHR), foi também determinado. Kin de SEQ ID NO: 11=1,2 ± 0,2 x 10’4 ml/s/g. Kin de SEQ ID NO: 48=2,4 ± 0,3 x 104 ml/s/g Kin de SEQ ID NO: 73=0,0 ± 0,0 x 10‘4 ml/s/g Kin de SEQ ID NO: 72=11,5 ± 3,3 x 10’4 ml/s/g Kin de SEQ ID NO: 74=1,8 ± 0,2 x W4 ml/s/g

Assim, o cruzamento da BHR pela dalargin vetorizada (SEQ ID NO: 72) é multiplicada por um fator de 6,39 em comparação com a sua forma livre não vetorizada (SEQ ID NO: 74).

Claims (18)

1. O peptídeo ou pseudo-peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos naturais e/ou não naturais, caracterizado por se ligar ao receptor de lipoproteína de baixa densidade humana (hLDLR) na superfície de membranas celulares e por ser de fórmula geral (I) como segue: (Xaa)iZ(Xaa)j-M-P-R-(Xaa)kW(Xaa)l (I) em que Xaa representa um aminoácido natural ou não natural, como um aminoácido de configuração D, um aminoácido não codificado, ou um aminoácido que contém uma ligação peptideomimética, Z e W representam dois aminoácidos idênticos ou diferentes que permitem a ciclização do peptídeo, e i, j, k e l são números inteiros, idênticos ou diferentes, entre 0 e 5, M designa metionina ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma, P designa prolina ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma e R designa arginina ou um isóstero da mesma ou um análogo da mesma.

2. O peptídeo ou pseudo-peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por i ser um número inteiro selecionado de 0, 1, 3 ou 4; j ser um número inteiro selecionado de 0, 3 ou 4; k ser um número inteiro selecionado de 0, 1 ou 3; e/ou l ser um número inteiro selecionado de 0, 1 ou 3.

3. O peptídeo ou pseudo-peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por os aminoácidos que permitem a ciclização do peptídeo serem selecionados de cisteína (Cys), ácido 3-mercaptopropanóico (Mpa), penicilamina (Pen), deshidroalanina, alilglicina (alilGly), ácido glutâmico, ácido aspártico, ou lisina, preferivelmente Z e W representando cisteína.

4. O peptídeo ou pseudo-peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se ligar ao receptor de lipoproteína de baixa densidade humana (hLDLR) na superfície de membranas celulares e por ser selecionado de peptídeos da sequência SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 65.

5. O peptídeo ou pseudo-peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser de configuração cíclica.

6. O peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender pelo menos uma ligação peptideomimética escolhida preferivelmente entre intercalação de um grupo metileno (-CH2-) ou fosfato (-PO2-), amina secundária (-NH-) ou oxigênio (-O-), alfa-azapeptídeos, alfa- alquilpeptídeos, N-alquilpeptídeos, fosfonamidatos, depsipeptídeos, hidroximetilenos, hidroxietilenos, dihidroxietilenos, hidroxietilaminas, peptídeos retro-inversos, metilenooxi, cetometileno, ésteres, fosfinatos, fosfínicos, fosfonamidas e análogos de carba.

7. O peptídeo ou pseudo-peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a função N-terminal (N-term) e/ou C-terminal (C-term) ser protegida por acilaçãoou amidação ou esterificação.

8. Uso de um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser para preparar uma composição farmacêutica ou de diagnóstico para vetorizar uma substância ativa ou substância de interesse em diagnóstico, obtenção de imagem ou terapia ou para aumentar a atividade biológica ou diminuir a toxicidade de uma substância ativa ou substância de interesse com a qual é acoplado.

9. Um composto conjugado de fórmula (II) caracterizado por ser como segue: VxDy (II) em que V representa um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, D representa uma substância ativa ou substância de interesse, e x e y são números inteiros entre 1 e 5.

10. Um composto conjugado de fórmula (III) caracterizado por ser como segue: VxLzDy (III) em que V representa um peptídeo ou pseudo-peptídeo linear ou cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, L representa um espaçador, D representa uma substância ativa ou substância de interesse, x e y são números inteiros entre 1 e 5 e z é um número inteiro entre 1 e 10.

11. O composto conjugado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por x=z=y=1 ou x=z>y ou z>x>y.

12. O composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por ser representado pelos peptídeos da seqüência SEQ ID NO: 66 a SEQ ID NO: 72.

13. O composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado por a substância ativa ou substância de interesse ser uma molécula de interesse terapêutico, um agente de obtenção de imagem de diagnóstico ou médica, ou uma sonda molecular, preferivelmente selecionada de uma molécula química pequena, um peptídeo ou polipeptídeo, uma proteína, um antígeno, um anticorpo ou parte de um anticorpo, um ácido nucleico ou um oligonucleotídeo, uma ribozima, um marcador ou um traçador.

14. O composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado por o acoplamento entre V e D, ou entre V e L por um lado e L e D por outro lado, ser levado a cabo por uma ou mais ligações covalentes, hidrofóbicas ou iônicas, cliváveis ou não cliváveis em meio fisiológico ou dentro de células.

15. O composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado por D ser acoplado com V, se for necessário via L, em uma ou mais extremidades N-term e/ou C-term de V e/ou em um ou mais grupos reativos portados pelas cadeias laterais de aminoácido natural ou não natural constitutivo de V.

16. Um método para preparar um composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado por compreender uma etapa de acoplamento entre um peptídeo ou pseudo-peptídeo V e uma substância D, se for necessário via L, preferivelmente por uma via química, bioquímica ou enzimática, ou por engenharia genética.

17. Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender pelo menos um composto conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

18. Uma composição de diagnóstico caracterizada por compreender um agente de obtenção de imagens de diagnóstico ou médicas composto de um composto conjugado de 10 acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15.

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