WO2009147781A1 - 抗がん剤 - Google Patents

抗がん剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2009147781A1
WO2009147781A1 PCT/JP2009/001940 JP2009001940W WO2009147781A1 WO 2009147781 A1 WO2009147781 A1 WO 2009147781A1 JP 2009001940 W JP2009001940 W JP 2009001940W WO 2009147781 A1 WO2009147781 A1 WO 2009147781A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
mfg
anticancer agent
anticancer
agent
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/001940
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
秀晃 田原
将久 地主
Original Assignee
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2008/001393 external-priority patent/WO2009147695A1/ja
Application filed by 国立大学法人東京大学 filed Critical 国立大学法人東京大学
Priority to JP2010515738A priority Critical patent/JP4686733B2/ja
Priority to EP09758048.4A priority patent/EP2283862B1/en
Priority to US12/995,942 priority patent/US9226934B2/en
Publication of WO2009147781A1 publication Critical patent/WO2009147781A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to a new anticancer agent, particularly an anticancer agent by enhancing the therapeutic effect of other cancer treatment methods.
  • Non-patent Document 4 MFG-E8 induces immune tolerance by promoting the proliferation of Foxp3 positive regulatory T cells and negatively regulates the anti-tumor immunity of tumor vaccines.
  • Patent Document 5 a patent application has already been filed for the development of a therapeutic method using MFG-E8 decoy gene or inhibitory antibody on the premise of combined use with tumor antigens such as cancer vaccines.
  • MFG-E8 is not limited to antigen-presenting cells such as dendritic cells, but is widely expressed in tumor cells such as breast cancer, colon cancer, and melanoma (Non-patent Document 5), and promotes angiogenesis and tumor metastasis to tumors. It has been clarified that it has a promoting action and has a positive correlation with the clinical progression of melanoma (Non-patent Document 6).
  • the present inventor has examined the pharmacological action using an antibody against MFG-E8 and found that the anti-MFG-E8 antibody alone has an excellent anticancer effect. Further investigations have shown that anti-MFG-E8 antibody is used in combination with other cancer therapies including other anticancer agents, despite the fact that it does not administer tumor antigens, rather than the anticancer effect by itself. Thus, the present inventors have found that the effect of enhancing the effect of other cancer treatment methods is particularly excellent by exhibiting an extremely powerful anticancer effect. Furthermore, the anti-MFG-E8 antibody has an action of activating intratumor and systemic antitumor immune responses and inducing and promoting antitumor immune responses including induction of tumor-specific cytotoxic T cells and the like. Revealed.
  • the present invention provides an anticancer agent comprising an anti-MFG-E8 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides an anticancer agent comprising a combination of an anti-MFG-E8 antibody and another anticancer agent.
  • the present invention also provides an anticancer agent containing an anti-MFG-E8 antibody for use in combination with other cancer treatment methods.
  • the anticancer agent is characterized by exhibiting a tumor cell-specific anticancer effect even though it does not contain tumor antigens or tumor cells. This is because the anti-MFG-E8 antibody, which is an active ingredient, promotes the uptake of tumor cells that have fallen into apoptosis by antigen-presenting cells in vivo via Fc receptors and is specific to cytotoxic T cells.
  • the present invention also provides the use of an anti-MFG-E8 antibody for the production of an anticancer agent in combination with another anticancer agent.
  • the present invention also provides the use of an anti-MFG-E8 antibody for the production of an anticancer agent for use in combination with other cancer therapies.
  • the present invention also provides the use of an anti-MFG-E8 antibody for the production of a specific immunity inducer for use in combination with a drug or treatment that can damage target cells.
  • the present invention also provides a method for treating cancer characterized by administering an anti-MFG-E8 antibody.
  • the present invention also provides a method for treating cancer, comprising administering an anti-MFG-E8 antibody in combination with another anticancer agent.
  • the anticancer effect is drastically improved. It is done.
  • the dose of the anti-cancer drug or the strength of the cancer treatment (corresponding to the radiation dose in radiation therapy)
  • Side effects can be reduced because the interval between administration of the anticancer drug and the interval between cancer treatments can be set longer. If the frequency of occurrence of side effects decreases, treatment with other anticancer agents and radiation therapy can be continued for a longer time, and the cancer treatment effect is further improved.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the combined use effect of the other anticancer agent and anti-MFG-E8 antibody with respect to the subcutaneous tumor model using the mouse
  • the active ingredient of the anticancer agent of the present invention is an anti-MFG-E8 antibody.
  • the anti-MFG-E8 antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically binds to MFG-E8 and inhibits the function of MFG-E8.
  • Antibodies of the present invention include monoclonal and polyclonal antibodies, as well as antibody variants and derivatives such as antibodies and T-cell receptor fragments that retain the ability to specifically bind to antigenic determinants.
  • the type of the antibody of the present invention is not particularly limited, and is intended to reduce mouse antigens, human antibodies, rat antibodies, rabbit antibodies, sheep antibodies, camel antibodies, avian antibodies, etc. Artificially modified recombinant antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies can be used as appropriate.
  • the recombinant antibody can be produced using a known method.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable region and a human antibody heavy chain and light chain constant region, and a DNA encoding the murine antibody variable region. Can be obtained by ligating to the DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and is obtained by transplanting a complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal such as a mouse antibody into a complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to form a desired human antibody having binding activity to the antigen.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, WO94 / 25585).
  • WO96 / 34096, WO96 / 33735 ).
  • antibodies are low molecular weight antibodies such as antibody fragments (fragments), modified antibodies, etc., as long as they do not lose the property of recognizing the full length or part of the protein encoded by the MFG-E8 gene. Also good.
  • Specific examples of the antibody fragment include Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, Diabody, and the like.
  • genes encoding these antibody fragments are constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al.). al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods Enzymol.
  • an antibody having a modified sugar chain can also be used for the purpose of enhancing cytotoxic activity.
  • Antibody sugar chain modification techniques are already known (for example, WO00 / 61739, WO02 / 31140, etc.).
  • multispecific antibodies having specificity for two or more different antigens are also included.
  • a molecule binds two antigens (ie, a bispecific antibody), but the “multispecific antibody” in the present invention is directed against more (eg, three types) antigens.
  • Multispecific antibodies can be full-length antibodies, or fragments of such antibodies (eg, F (ab ′) 2 bispecific antibodies).
  • the constant domain sequence preferably comprises at least part of the hinge, CH2 and CH3 regions of the constant region of the immunoglobulin heavy chain.
  • the CH1 region of the heavy chain necessary for binding to the light chain is further included.
  • the DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the DNA encoding the immunoglobulin light chain are each inserted into separate expression vectors and transformed into a suitable host organism. By inserting each gene into a separate expression vector, if the ratio of each chain is not the same, if the yield of the resulting antibody is increased, it is possible to adjust the expression ratio of each chain, Of course, it is also possible to insert a gene encoding a plurality of chains into one vector.
  • one of the surface of the antibody molecule comprising CH3 of the constant domain of an antibody and binding to the other molecule Change multiple small side chain amino acids to larger side chain amino acids (eg tyrosine or tryptophan), and change the size of the corresponding antibody side chain amino acids to smaller ones (eg alanine or threonine)
  • a method of providing a cavity corresponding to the large side chain of the first antibody molecule is also known (WO96 / 27011).
  • a method for producing a bispecific antibody from an antibody fragment has also been reported. For example, it can be produced using a chemical bond. For example, first an F (ab ′) 2 fragment is prepared and the fragment is reduced in the presence of the dithiol complexing agent arsanyl sodium to prevent disulfide formation within the same molecule. The F (ab ′) 2 fragment is then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative.
  • TAB thionitrobenzoate
  • a bispecific antibody obtained by re-reducing one F (ab ′) 2 -TNB derivative to Fab′-thiol using mercaptoethylamine and then mixing equal amounts of F (ab ′) 2 -TNB derivative and Fab′-thiol Manufacturing.
  • the antibodies and antibody fragments of the present invention can be produced by any appropriate method, for example, in vivo, cultured cells, in vitro translation reactions, and recombinant DNA expression systems.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by excising spleen cells from an immunized animal and fusing them with myeloma cells to produce hybridoma cells that produce monoclonal antibodies. Using methods well known in the art such as ELISA assay, Western blot analysis, or radioimmunoassay, hybridoma cells producing an antibody that recognizes the protein of interest or a fragment thereof are selected. A hybridoma that secretes the desired antibody is cloned, cultured under appropriate conditions, and the secreted antibody is recovered and purified using methods well known in the art, such as ion exchange columns, affinity chromatography, and the like. be able to.
  • a human monoclonal antibody may be produced using a xenomous strain (Green, J. Immunol. Methods 231: 11-23, 1999; Wells, Eek, Chem Biol 2000 Aug; 7 (8): R185-6. See).
  • monoclonal antibodies based on phage display without immunization are currently being produced, and the antibodies of the present invention may be produced by any of these methods.
  • the other anticancer agent that can be used in combination with the anti-MFG-E8 antibody is not particularly limited as long as it is an anticancer agent having an anticancer effect, but is an anticancer agent having tumor cytotoxicity. Is particularly preferable in terms of obtaining a synergistic effect.
  • Examples of the other anticancer agents include alkylating agents, antimetabolites, microtubule inhibitors, antibiotic anticancer agents, topoisomerase inhibitors, platinum preparations, molecular target drugs, hormone agents, biologics, and the like.
  • Examples of the alkylating agent include cyclophosphamide, ifosfamide, nitrosourea, dacarbazine, temozolomide, nimustine, busulfan, melphalan, procarbazine, ranimustine and the like.
  • Antimetabolites include, for example, enositabine, carmofur, capecitabine, tegafur, tegafur uracil, tegafur gimeracil oteracil potassium, gemcitabine, cytarabine, cytarabine ocphosphate, nelarabine, fluorouracil, fludarabetine, pemetrexed, pentotrexet
  • Examples include cladribine, doxyfluridine, hydroxycarbamide, mercaptopurine, and the like.
  • the microtubule inhibitor include alkaloid anticancer agents such as vincristine and taxane anticancer agents such as docetaxel and paclitaxel.
  • Antibiotic anticancer agents include, for example, mitomycin C, doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, bleomycin, actinomycin D, aclarubicin, idarubicin, pirarubicin, pepromycin, mitoxantrone, amrubicin, dinostatin stimaramer and the like.
  • topoisomerase inhibitors include CPT-11, irinotecan, nogitecan, which has a topoisomerase I inhibitory action, etoposide which has a topoisomerase II inhibitory action, and sobuzoxane.
  • platinum preparation examples include cisplatin, nedaplatin, oxaliplatin, carboplatin and the like.
  • hormonal agents for example, dexamethasone, finasteride, tamoxifen, astrozole, exemestane, ethinylestradiol, chlormadinone, goserelin, bicalutamide, flutamide, brednisolone, leuprorelin, letrozole, estramustine, toremifene, phosfestol, mitotane
  • Examples include methyltestosterone, medroxyprogesterone, and mepithiostane.
  • biologics include interferon ⁇ , ⁇ and ⁇ , interleukin 2, ubenimex, and dry BCG.
  • molecular targeting drugs include rituximab, alemtuzumab, trastuzumab, cetuximab, panitumumab, imatinib, dasatinib, nilotinib, gefitinib, erlotinib, temsirolimus, bevacizumab, VEGF trap, sonitizumab , Ibritumomab tiuxetan, tamibarotene, tretinoin and the like.
  • the following drugs may also be used in combination: thalidomide, everolimus, elplat, ABI-007, ixabepilone, miriplatin, lapatinib, pemetrexed, cladribine, liposomal doxorubicin, Z-100, hicamtin, vandedanib, ZD4054, Anastrozole, GSK1572932A, Pazopanib, Denosumab, S-1, Motesanib, Trastuzumab, Enzastaurin, Imcyst, NIK-333, Axitinib, Bostinib, E7080, Sobridotine, Degarelix, Zolvestib 68, TAC-101, TAS-108, NK911, NK105, eroticinib, LBH589, MK-0457, Tamibarotene, Nalidimide, BNP1350, AZD0530, AZ
  • gemcitabine 5-FU, CPT-11, etoposide, cisplatin, oxaliplatin, paclitaxel, docetaxel, dacarbazine, doxorubicin, bevacizumab, cetuximab, anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 inhibitory antibody, epidermal growth factor tyrosine
  • kinase inhibitors particularly preferred are kinase inhibitors and the like.
  • the anti-MFG-E8 antibody and the other anticancer agent may be used as one preparation, or may be used in the form of separate preparations. When different preparations are used, they may be a combination of preparations having different administration routes such as injections and oral preparations. Further, the anti-MFG-E8 antibody and the other anticancer agent may be administered simultaneously, or one of them may be administered first and the other may be administered later. That is, the anti-MFG-E8 antibody may be administered before other anticancer agents, may be administered at the same time, or may be after administration of other anticancer agents.
  • the anti-MFG-E8 antibody When administration is not performed at the same time, for example, it is preferable to administer another anticancer agent for a certain period and administer the anti-MFG-E8 antibody during or after the administration of the other anticancer agent.
  • the specific administration timing of the anti-MFG-E8 antibody is within 2 weeks, preferably within 1 week, more preferably within 3 days after the start of administration of the other anticancer agent.
  • anti-MFG-E8 antibodies In consideration of the action and effect of these anti-MFG-E8 antibodies, it is extremely effective to perform chemotherapy such as other anticancer agents at the same time as or prior to administration of the anti-MFG-E8 antibody.
  • the “combination of anti-MFG-E8 antibody and other anticancer agent” in the present specification is not limited to the case where the drug is integrated as a pharmaceutical preparation, and the preparation includes anti-MFG-E8 antibody alone.
  • the anti-MFG-E8 antibody is used in the present specification as long as it is used in combination with another anti-cancer agent at the timing described above for the purpose of enhancing the effect of the other anti-cancer agent, In combination with other anticancer agents.
  • the “other anticancer agent” may be a combination of two or more agents.
  • a concomitant agent (or an antitumor agent) in which an anti-MFG-E8 antibody is used in combination with other anticancer agent administration at a desired timing and the anti-MFG-E8 antibody can enhance the effect of the other anticancer agent. Even when used as an effect enhancer, it falls under “combination of anti-MFG-E8 antibody with other anticancer agent”.
  • anti-MFG-E8 antibody is the main cancer therapeutic agent
  • other anticancer agents become combination agents (or initiators) that can effectively elicit antitumor immunity by anti-MFG-E8 antibody.
  • anti-MFG-E8 antibody and other anticancer drugs are administered.
  • anti-MFG-E8 antibody and other anticancer drugs are administered.
  • cancer therapies besides anti-cancer drugs include surgery, radiation therapy (including gamma knife therapy, cyber knife therapy, boron neutron capture therapy, proton beam therapy / heavy particle therapy), MR Guided focused ultrasound surgery, cryotherapy, radiofrequency coagulation therapy, ethanol infusion therapy, arterial embolization therapy and the like.
  • radiation therapy including gamma knife therapy, cyber knife therapy, boron neutron capture therapy, proton beam therapy / heavy particle therapy
  • MR Guided focused ultrasound surgery including cryotherapy, radiofrequency coagulation therapy, ethanol infusion therapy, arterial embolization therapy and the like.
  • Either one of these cancer treatment methods and administration of the anti-MFG-E8 antibody may be performed first, and the other may be performed later, or may be performed simultaneously.
  • a means for administering an anti-MFG-E8 antibody after performing predetermined radiotherapy is preferable.
  • combinations of administration of anti-MFG-E8 antibody and other cancer treatment methods as long as administration of anti-MFG-E8 antibody and other cancer treatment methods are administered at the timing as described above, the present specification In the concept of “Combination of anti-MFG-E8 antibody with other cancer treatment methods”.
  • the “other cancer treatment method” may be a combination of a plurality of treatment methods.
  • the “other cancer treatment method” is used in combination with the above-mentioned “other anticancer agent” administration.
  • An anti-MFG-E8 antibody may be used in combination with cell therapy performed for cancer treatment.
  • an anti-MFG-E8 antibody may be added in the step of preparing cells to be used for cell therapy, and when returning the prepared cells to the patient, anti-MFG- An E8 antibody may be administered to the patient.
  • the anticancer agent of the present invention is effective against a wide variety of cancers in mammals including humans.
  • Ovarian cancer liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, malignant melanoma, thyroid cancer and other epithelial cancers; osteosarcoma, chondrosarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, liposarcoma, blood vessel
  • Non-epithelial cancers such as sarcoma, fibrosarcoma, leukemia, malignant lymphoma, and myeloma.
  • the anti-MFG-E8 antibody exerts an effective anti-tumor immunity induction and tumor recurrence suppression effect by enhancing the immunogenicity of apoptotic tumor cells induced by chemotherapy by MFG-E8 inhibition. is doing. Therefore, the anti-tumor effect of anti-MFG-E8 antibody can be sufficiently expected if tumor cell death is induced by chemotherapy or radiotherapy. It is possible to enhance the tumor reduction effect and improve the disease-free and recurrence rate by using the combination therapy that is expected and standard treatment such as radiochemotherapy.
  • Such candidates are: FOLFOX (5-FU + oxalplatin) in colorectal cancer, fluorouracil drugs (including tegafur, gimeracil, oteracil potassium) in gastric cancer + cisplatin, esophageal cancer, head and neck Chemoradiation combination therapy for cervical cancer and uterine cancer (esophageal cancer: fluorouracil + cisplatin, head and neck cancer: fluorouracil + cisplatin + taxane, uterine cancer: carboplatin, etc.), gemcitabine and radiation therapy for pancreatobiliary cancer, lung CDDP + taxane / vinorelbine / gemcitabine for non-small cell carcinoma, CDDP + etoposide for lung small cell carcinoma, anthracycline antibiotic + cytarabine for acute myeloid leukemia, R-CHOP therapy for malignant lymphoma (rituximab, cyclophosphine) Famide, an
  • the anticancer agent of the present invention can be formulated by mixing, dissolving, granulating, tableting, emulsifying, encapsulating, lyophilizing, etc. with a pharmaceutically acceptable carrier well known in the art. it can.
  • anti-MFG-E8 antibody for oral administration, anti-MFG-E8 antibody, together with pharmaceutically acceptable solvents, excipients, binders, stabilizers, dispersants, etc., tablets, pills, dragees, soft capsules, hard capsules, It can be formulated into dosage forms such as solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups and slurries.
  • the dose of anti-MFG-E8 antibody varies depending on the patient's symptoms, administration route, body weight, age, etc., but is preferably 1 ⁇ g to 500 mg per day for adults, for example.
  • the dosage of other anticancer agents is preferably an effective amount of each anticancer agent or 0.01 to 1 times the effective amount thereof.
  • the radiation dose in other cancer treatment methods such as radiotherapy can be reduced by 0.1 to 0.8 times.
  • the anticancer agent of the present invention is usually administered by parenteral administration route, for example, injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, transpulmonary, etc.
  • parenteral administration route for example, injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, transpulmonary, etc.
  • parenteral administration route for example, injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, transpulmonary, etc.
  • parenteral administration route for example, injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, transpulmonary, etc.
  • injection subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.
  • transdermal
  • the mechanism of action of the anti-cancer effect of the anti-MFG-E8 antibody of the present invention has not been completely elucidated, it activates the anti-tumor immune response in the tumor and systemic and produces tumor-specific cytotoxic T cells. It is thought that the main thing is to induce and promote an anti-tumor immune response including induction of the tumor.
  • the anti-MFG-E8 antibody activates an immune response against a target cell as described above, induces cytotoxic T cells and the like to induce and promote an immune response against the target cell. Therefore, when an anti-MFG-E8 antibody is combined with a drug or therapeutic method capable of damaging a target cell, an immune response against the target cell can be strongly induced. It can be used as an immunity inducer.
  • the specific immunity induction by the anti-MFG-E8 antibody is by suppressing the immune tolerance pathway via ⁇ v ⁇ 3 integrin on the antigen-presenting cell and switching to the immune activation pathway via Fc receptor.
  • antigen-presenting cells include dendritic cells, monocytes, and macrophages.
  • Example 1 (Synergistic tumor reduction effect by other anticancer agents and anti-MFG-E8 antibody) (Method) Mouse colon cancer cells MC-38 or B16 melanoma cells (1 ⁇ 10 5 per mouse) were injected subcutaneously on the dorsal side of 6-week-old C57BI / 6 mice, and the tumor diameter was 5 mm (25-30 mm 2 ). At the time of growth (day 10), an anticancer drug and anti-MFG-E8 antibody were intraperitoneally administered to day 10, day 13, and day 16 according to the following protocol. The same examination was performed twice according to the following protocol. As the anti-MFG-E8 antibody, an inhibitory antibody commercialized by MBL was used. Protocols 1-4 used MC-38 and protocol 5 used B16 melanoma.
  • Protocol 1 ⁇ Gemcitabine (GEM): 4 mg / kg -Gemcitabine (GEM): 1 mg / kg Anti-MFG-E8 antibody: 1 mg / kg Gemcitabine (GEM): 4 mg / kg + anti-MFG-E8 antibody: 1 mg / kg Gemcitabine (GEM): 1 mg / kg + anti-MFG-E8 antibody: 1 mg / kg
  • Protocol 2 ⁇ CPT-11: 1mg / kg ⁇ 5-FU: 0.1M Anti-MFG-E8 antibody: 1 mg / kg CPT-11: 1 mg / kg + anti-MFG-E8 antibody: 1 mg / kg 5-FU: 0.1M + anti-MFG-E8 antibody: 1 mg / kg
  • Protocol 3 Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase 1 (EGFR-TK1): 40 mg / g
  • Anti-MFG-E8 antibody 1 mg / kg
  • Protocol 4 -Irradiation (XRT): 3 Gy / day 5 times-Anti-MFG-E8 antibody: 1 mg / kg
  • Protocol 5 ⁇ Doxorubicin (Dox): 5mg / kg ⁇ Etoposide (Etop): 2 mg / kg Anti-MFG-E8 antibody: 1 mg / kg
  • Example 2 (Examination of surface traits related to immunological function of intratumoral lymphocytes) (Method)
  • Method In a tumor model using subcutaneous administration of colon cancer cells MC38 as described above, various treatment protocols were performed, and tumor tissues were collected from mice at 1 week later (day 23). After treatment with collagenase I, lymphocytes present in the tumor tissue were separated and collected by a specific gravity gradient method using Lymphoprep. The following examination was carried out on the surface antigen related to the activity of intratumoral lymphocytes using flow cytometry.
  • CD11b-Gr-1 positive cells a marker of dendritic cells that contribute to enhancing antitumor T cell activity-Dendritic cells
  • CD11b proportion of CD11b and CD86 positive fractions
  • Example 3 Evaluation of splenic lymphocyte immunoreactivity
  • spleen cells which are representative peripheral lymphoid tissues.
  • the spleen is removed from a mouse that has been examined for the immune activity of intratumoral lymphocytes, and the spleen cells are isolated from the spleen, and mainly CD4 positive helper T cells and CD8 positive cytotoxic T cells.
  • the activity was examined by flow cytometry as follows.
  • the ratio of T cells, immature myeloid cells, and dendritic cells in the group administered with the anticancer agent alone does not change significantly (FIGS. 8 and 9).
  • the anti-MFG-E8 antibody alone administration group is equivalent to the anticancer agent.
  • CD44 expression and IFN ⁇ production were clearly enhanced.
  • There was no significant difference in IL-10 response compared to the untreated group and the anticancer agent alone group (FIGS. 8 and 9). From the above, it has been clarified that the combined use of an anticancer agent and an anti-MFG-E8 antibody activates a systemic antitumor immune response as well as a tumor locality.
  • Cytotoxic activity against MC38 was confirmed by lymph node cells derived from the anti-MFG-E8 antibody treatment group.
  • lymph node cells derived from the anti-cancer agent and anti-MFG-E8 antibody combination treatment group were found to enhance MC38-specific cytotoxicity.
  • almost no toxic activity against B16 malignant melanoma cells was induced (FIG. 10). From the above, it was revealed that the combined use of an anticancer drug and an anti-MFG-E8 antibody enhanced the ability to induce tumor-specific cytotoxic lymphocytes.
  • Example 5 In vitro study of antigen-specific T cell activity enhancement through dendritic cell activity modification by MFG-E8, (Method) The mechanism of dendritic cell and T cell activity in combination with an anti-MFG-E8 antibody observed in vivo and an anticancer agent was examined in detail in a mixed culture system in vitro. Specifically, in order to use Ovalbumin (OVA) as a model antigen, bone marrow cells were collected from DO11.10 (MHC class II-restricted OVA antigen transgenic mouse), and granulocyte monocyte colony-stimulating factor (GM-CSF) To induce differentiation of dendritic cells.
  • Ovalbumin Ovalbumin
  • MFG-E8 recombinant protein 100 ⁇ g / mL or anti-MFG-E8 antibody (20 ⁇ g / mL)
  • MHC class IIOVA-restricted OVA peptide 5 mg / mL or negative control peptide was used on day 8.
  • HSA HSA was pulsed for 6 hours. They are mixed with a native CD4 + positive T cell derived from Syngeneic (Balb / c) mouse so that the ratio of dendritic cell to CD4 + T cell is 1:10, and anti-CD3 antibody (0.1 ⁇ g / mL) Mixed culture was carried out in the presence. After 72 hours, T cell activity was examined by measuring intracellular expression of IFN- ⁇ and IL-10 by flow cytometry.
  • Untreated dendritic cells T cell activity by OVA-specific dendritic cells was observed (because it is increased with IFN- ⁇ and IL-10, it is considered that both immune and suppressive functions are active) ).
  • Dendritic cells pre-stimulated with MFG-E8 OVA-specific reduced IFN- ⁇ production and enhanced IL-10 production were observed compared to the control group (suppression of antigen-specific immune response was observed).
  • MFG-E8 of dendritic cells was inhibited with anti-MFG-E8 antibody, enhanced OVA-specific IFN- ⁇ production ability and decreased IL-10 production were observed compared to the control group (antigen-specificity). Activation of the immune response was observed).
  • MFG-E8 acts directly on dendritic cells, negatively controls its immune activity function, and strongly activates immune responses by dendritic cells antigen-specifically by neutralization with anti-MFG-E8 antibody It became clear. Since the function of this anti-MFG-E8 antibody was also observed in dendritic cells pulsed with peptide, it is thought to be through the control of costimulatory molecules that are functions other than antigen presentation of dendritic cells. (FIG. 11 (IFNg is IFN- ⁇ )).
  • Example 6 Investigation of MFG-E8 expression (secretion) induction from tumor cells by anticancer agents) (Method)
  • MC38 colon cancer cells normal fibroblasts (NIH3T3, primary fibroblasts) and various anticancer agents (Doxorubicine, GEM, 5-FU, CPT-11).
  • MC38 colon cancer cells normal fibroblasts (NIH3T3, primary fibroblasts)
  • various anticancer agents Doxorubicine, GEM, 5-FU, CPT-11.
  • Example 7 (Study on the effect of anti-MFG-E8 antibody on tumor cell death induction by anticancer agents) (Method) When administering various anticancer agents (GEM: 1M, CPT-11: 0.5M, 5FU: 1M) to MC38 colon cancer cell line, anti-MFG-E8 inhibitory antibody (20 ⁇ g / mL) or IgG antibody as a negative control The cell death ratio after adding at the same time and culturing under serum-free for 48 hours was quantitatively examined by flow cytometry.
  • GEM 1M
  • CPT-11 0.5M
  • 5FU 1M

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を有効成分とする抗がん剤、および抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤を含むがん治療法とを組み合せてなる抗がん剤に関する。

Description

抗がん剤
　本発明は、新たな抗がん剤、特に他のがん治療法の治療効果を増強させることによる抗がん剤に関する。
　がんは昭和５６年に死因の一位になって以来、現在でも死因の一位を続けており、常に新たな治療法が求められている。がんの治療法としては、外科療法、放射線療法、化学療法（抗がん剤）があるが、外科手術後でも抗がん剤による治療が用いられる。
　抗がん剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド系抗がん剤、抗生物質抗がん剤、白金製剤等が用いられているが、その治療効果は未だ十分とはいえず、また副作用の発生頻度が高いという問題もある。かかる観点から、より優れた抗がん剤の開発が望まれている。
　一方、ＭＦＧ－Ｅ８（脂肪球被膜糖蛋白質：ｍｉｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ　ｆａｃｔｏｒ８）は、乳腺より分泌され乳腺分化、授乳刺激を促進する因子として同定された（非特許文献１）。近年ＭＦＧ－Ｅ８がこれらの作用のみならず、種々の異なった機能を有する事が明らかになった。その一つが、オプソニンとしてアポトーシス細胞上のホスファチジルセリンを認識してマクロファージや樹状細胞による貪食処理能を促進し免疫寛容を維持するという重要な機能である（非特許文献２、３）。さらに、ＭＦＧ－Ｅ８はＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞の増殖を促進することで免疫寛容を誘導し、腫瘍ワクチンの抗腫瘍免疫を負に調節することも判明した（非特許文献４）。この知見を基盤として、がんワクチンをはじめとした腫瘍抗原との併用を前提として、ＭＦＧ－Ｅ８のデコイ遺伝子あるいは阻害抗体を用いる治療法開発について既に特許出願がなされている(特許文献１)。またＭＦＧ－Ｅ８は樹状細胞などの抗原提示細胞に限らず乳癌、大腸癌、メラノーマなど腫瘍細胞に広範に発現すること（非特許文献５）、血管新生や腫瘍転移能を促進することにより腫瘍促進作用を有することやメラノーマの臨床的進行度と正相関することが明らかになっている（非特許文献６）。
ＷＯ２００８／０４３０１８号パンフレット
Ｓｔｕｂｂｓ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．１９９０．ｃＤＮＡ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：８４１７－８４２１． Ｈａｎａｙａｍａ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ．２００２．Ｎａｔｕｒｅ　４１７：１８２－１８７． Ｈａｎａｙａｍａ　Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．２００４．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ＭＦＧ－Ｅ８－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３０４：１１４７－１１５０． Ｊｉｎｕｓｈｉ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．２００７．ＭＦＧ－Ｅ８　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｕｐｔａｋｅ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ＡＰＣｓ　ｌｉｎｋｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏ－ａｎｄ　ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＧＭ－ＣＳＦ．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１１７：１９０２－１９１３． Ｃａｒｍｏｎ　Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．２００２．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｖｅｌ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ＢＡ４６－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ＨＬＡ－２．１／Ｄ（ｂ）－ｂｅｔａ２ｍ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１１０：４５３－４６２． Ｎｅｕｔｚｎｅｒ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．２００７．ＭＦＧ－Ｅ８／ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ａｎ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｓｔａｇｅ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　６７：６７７７－６７８５．
　本発明は、新たな抗がん剤および新たながんの治療方法を提供することにある。
　本発明者は、ＭＦＧ－Ｅ８に対する抗体を用いて、その薬理作用について検討してきたところ、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が、単独で優れた抗がん効果を有することを見出した。さらに検討を進めたところ、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、単独による抗がん効果よりも、腫瘍抗原を投与しないにもかかわらず、他の抗がん剤を含む他のがん治療法との併用により、極めて強力な抗がん効果を発揮し、他のがん治療法の効果を増強させる効果が特に優れていることを見出した。さらに、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、腫瘍内および全身性の抗腫瘍免疫応答を活性化させ、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞等の誘導を含む抗腫瘍免疫反応を惹起促進させる作用を有することを明らかにした。特に抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法と組み合せた際に、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による抗腫瘍免疫反応を強力に誘導し得る特異的免疫誘導薬として極めて有用であることも見出した。さらに、この抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による特異的免疫誘導作用が、樹状細胞等の抗原提示細胞上のαｖβ３インテグリンを介するシステムからＦｃ受容体を介するシステムへとスイッチすることによるものであることも明らかにした。ここであげた特異的免疫とは、標的抗原に対して特異的なＢ細胞などによる液性免疫およびＴ細胞などによる細胞性免疫応答をさす。
　すなわち、本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を有効成分とする抗がん剤を提供するものである。
　また本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤とを組み合せてなる抗がん剤を提供するものである。
　また本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を含有し、他のがん治療法と組み合せて使用するための抗がん剤を提供するものである。前記抗がん剤は、腫瘍抗原または腫瘍細胞を含まないにもかかわらず腫瘍細胞特異的な抗がん作用を発揮することを特徴とする。これは、有効成分である抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が、生体内の抗原提示細胞によるアポトーシスに陥った腫瘍細胞の取り込みを、Ｆｃ受容体を介して促進し細胞障害性Ｔ細胞を中心とする特異的抗腫瘍免疫を誘導することに基づくと考えられる。
　また本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を有効成分とし、標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法と組み合せて使用するための、標的細胞に対する特異的免疫誘導薬を提供するものである。前記標的細胞は、腫瘍細胞であることが好ましい。また、前記抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、抗原提示細胞上のＦｃ受容体を介して標的細胞に対する特異的免疫を誘導することを特徴とする。さらに本発明の１つの実施形態において、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を含み、標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法によってＭＦＧ－Ｅ８が発現誘導された標的細胞に対する免疫寛容を、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が抑制するとともに生体内の抗原提示細胞によるアポトーシスに陥った標的細胞の取り込みを、Ｆｃ受容体を介して促進し細胞障害性Ｔ細胞を中心とする抗腫瘍免疫を賦活化する、免疫経路スイッチ剤を提供する。
　また本発明は、抗がん剤製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用を提供するものである。
　また本発明は、他の抗がん剤と組み合せてなる抗がん剤製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用を提供するものである。
　また本発明は、他のがん治療法と組み合せて使用するための抗がん剤製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用を提供するものである。
　また本発明は、標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法と組み合せて使用するための特異的免疫誘導薬製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用を提供するものである。
　また本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を投与することを特徴とするがんの治療法を提供するものである。
　また本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤とを組み合せて投与することを特徴とするがんの治療法を提供するものである。
　また、本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与と、他のがん治療法とを組み合せることを特徴とするがんの治療法を提供するものである。
　また本発明は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と、標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法とを組み合せることを特徴とする特異的免疫誘導方法を提供するものである。
　本発明の抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤等の他のがん治療法とを組み合せれば、抗がん効果が飛躍的に向上するため、より優れたがん治療効果が得られる。また、副作用のある他の抗がん剤や放射線療法等のがん治療法と併用した場合には、その抗がん剤の投与量やがん治療法の強度（放射線療法における放射線照射量にあたるもの）を減らすことができ、その抗がん剤の投与間隔やがん治療法実施の間隔を長く設定できるため、副作用の軽減も可能になる。副作用が発生する頻度が低下すれば、他の抗がん剤や放射線療法等による治療をより長く継続できるため、がん治療効果はさらに向上することになる。
　また、本発明における抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体によるがん治療効果はがん患者の体内に存在している状態の腫瘍細胞由来の抗原を利用して特異的免疫を誘導し得るものであるため、本発明によれば、従来の腫瘍ワクチンのような腫瘍細胞の抗原を患者から分離あるいは同定する必要はなく、また治療の際に患者に腫瘍抗原を投与することなく治療効果が得られる。
　また、本発明によれば、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による特異的免疫誘導作用は、樹状細胞やマクロファージに代表される抗原提示細胞上のαｖβ３インテグリンを介した免疫寛容経路を抑制し、Ｆｃ受容体を介した免疫賦活化経路にスイッチすることにより行われていることが明らかになった。
マウス大腸癌細胞株（ＭＣ３８）を用いた皮下腫瘍モデルにおける抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独投与、または他の抗がん剤（ゲムシタビン：ＧＥＭ）との併用による抗がん効果を示す図である。ＮＴは無治療群、Ａｎｔｉ－ＭＦＧ－Ｅ８Ａｂは抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を示す（以下同じ）。 図１と同じ腫瘍モデルにおける抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独投与、または他の抗がん剤（ＣＰＴ１１、５ＦＵ）との併用による抗がん効果を示す図である。 図１と同じ腫瘍モデルにおける抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独投与、またはＥＧＦＲ－ＴＫ１、α－ＶＥＧＦＲ－２Ａｂとの併用による抗がん効果を示す図である。 図１と同じ腫瘍モデルにおける抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独投与、または放射線療法（ＸＲＴ）との併用による抗がん効果を示す図である。 マウス悪性黒色腫細胞株（Ｂ１６）を用いた皮下腫瘍モデルにおける抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独投与、または他の抗がん剤（ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、エトポシド（Ｅｔｏｐ））との併用による抗がん効果を示す図である。 図１と同じ腫瘍モデルにおける５－ＦＵと抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用による腫瘍内リンパ球（ＣＤ４、ＣＤ８）の活性に関連する表面抗原のフローサイトメトリーを示す図である。 図１と同じ腫瘍モデルにおける５－ＦＵと抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用による腫瘍内リンパ球（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ）の活性に関連する表面抗原のフローサイトメトリーを示す図である。 図１と同じ腫瘍モデルにおける５－ＦＵと抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用による脾臓内リンパ球（ＣＤ４）の活性に関連する表面抗原のフローサイトメトリーを示す図である。 図１と同じ腫瘍モデルにおける５－ＦＵと抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用による脾臓内リンパ球（ＣＤ８）の活性に関連する表面抗原のフローサイトメトリーを示す図である。 図１と同じ腫瘍モデルにおける他の抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用によるリンパ節内リンパ球の腫瘍特異的細胞傷害活性を示す図である。Ｂ１６はＢ１６細胞を、ＭＣ３８はＭＣ３８細胞を示す。 ＯＶＡトランスジェニック・マウスの細胞を用いたＴ細胞活性状態をフローサイトメトリーによってＩＦＮ－α（ＩＦＮｇ）およびＩＬ－１０の細胞内発現を測定した結果を示す図である。 他の抗がん剤による腫瘍細胞および非腫瘍細胞からのＭＦＧ－Ｅ８発現を示す図である。 他の抗がん剤による腫瘍細胞からのＭＦＧ－Ｅ８発現を示す図である。 マウス大腸癌細胞株（ＭＣ３８）を用いた抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が他の抗がん剤による腫瘍細胞死誘導に与える作用を示す図である。 他の抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用による、アポトーシスのマーカーであるカスパーゼ３活性化作用を示す図である（ＭＣ３８に対する化学療法はゲムシタビン、Ｂ１６に対する化学療法はダカルバジン）。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおけるマウス大腸癌細胞株（ＭＣ３８）を用いた皮下腫瘍モデルに対する他の抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用効果を示す図である。 野生型マウスにおいて抗体でＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１を阻害した場合の、マウス大腸癌細胞株（ＭＣ３８）に対する他の抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用効果を示す図である。 他の抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用による、ＭＣ３８再移植に対する作用を示す図である。 図１と同じ腫瘍モデルにおける抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用によるＣＤ１１ｂ、ＣＤ８６の発現に対する作用を示す図である。 他の抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用による、ＭＣ３８およびＢ１６細胞に対する貧食作用を示す図である。 ＰＫＨ２６によりラベルしたＥＧ７－ＯＶＡ細胞の貪食実験において抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を使用することにより、αｖβ３インテグリンよりもＦｃレセプターの関与が増加することを示す図である。 樹状細胞による腫瘍抗原の交差提示において抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体存在下でのＦｃ受容体を介するシステムの重要性を示す図である（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）。 樹状細胞による腫瘍抗原の交差提示において抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体存在下でのＦｃ受容体を介するシステムの重要性を示す図である（ｉｎ　ｖｉｖｏ）。 抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による抗原提示細胞のサイトカイン（ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１０）産生に対する作用を示す図である。
　本発明の抗がん剤の有効成分は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体である。本発明に用いられる抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、ＭＦＧ－Ｅ８に特異的に結合し、ＭＦＧ－Ｅ８の機能を阻害する抗体であれば特に制限されない。
　本発明の抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに抗原決定基に特異的に結合する能力を保持している抗体およびＴ－細胞レセプターフラグメント等の、抗体の変種および誘導体が含まれる。
　又、本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６．）。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
　また、これらの抗体は、ＭＦＧ－Ｅ８遺伝子によってコードされる蛋白質の全長または一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８－２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ　Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６－４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ　Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７－５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２－６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３－６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２－１３７参照）。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
　又、本発明においては、細胞傷害活性を増強する目的などで、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など）。
　又、本発明においては、２種以上の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体も含まれる。通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（すなわち、二重特異性抗体）、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類の）抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）であり得る。
　当分野において多特異性抗体の製造法は公知である。全長の二特異性抗体の産生は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖の共発現を含むものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３０５：５３７－５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖はランダムに取り合わされるので、共発現を行う得られた複数のハイブリドーマ（クワドローマ）は、各々異なる抗体分子を発現するハイブリドーマの混合物であり、このうち正しい二特異性抗体を産生するものを選択する必要がある。選択はアフィニティークロマトグラフィー等の方法により行うことができる。また、別な方法では所望の結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、および、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
　好ましい態様においては、第一の結合特性を有する重鎖がハイブリッド免疫グロブリンの一方の腕として存在し、別の結合特性の重鎖－軽鎖複合体がもう一方の腕として存在する二重特異性抗体が望ましい。このように一方の腕のみに軽鎖を存在させることにより、二重特異性抗体の他の免疫グロブリンからの分離を容易に行うことができる（ＷＯ９４／０４６９０参照）。二重特異性抗体の作成方法については、さらに、Ｓｕｒｅｓｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１２１：２１０（１９８６））の方法を参照することができる。組換細胞培養物から得られる最終産物中のホモダイマーを減らしヘテロダイマーの割合を増加させる方法として、抗体の定常ドメインのＣＨ３を含み、一方の抗体分子において、他方の分子と結合する表面の１若しくは複数の小さな側鎖のアミノ酸を大きな側鎖のアミノ酸（例えば、チロシンやトリプトファン）に変え、他方の抗体分子の対応する部分の大きさ側鎖のアミノ酸を小さなもの（例えば、アラニンやスレオニン）に変えて第一の抗体分子の大きな側鎖に対応する空洞を設ける方法も知られている（ＷＯ９６／２７０１１）。
　二重特異性抗体には、例えば、一方の抗体がアビジンに結合され、他方がビオチン等に結合されたようなヘテロ共役抗体が含まれる（米国特許第４，６７６，９８０号；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；ＥＰ０３０８９）。このようなヘテロ共役抗体の作製に利用される架橋剤は周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号にもそのような例が記載されている。
　また、抗体断片より二特異性抗体を製造する方法も報告されている。例えば、化学結合を利用して製造することができる。例えば、まずＦ（ａｂ’）２断片を作成し、同一分子内でのジスルフィド形成を防ぐため断片をジチオール錯化剤アルサニルナトリウムの存在化で還元する。次にＦ（ａｂ’）２断片をチオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。メルカプトエチルアミンを用いて一方のＦ（ａｂ’）２－ＴＮＢ誘導体をＦａｂ’－チオールに再還元した後、Ｆ（ａｂ’）２－ＴＮＢ誘導体およびＦａｂ’－チオールを等量混合し二特異性抗体を製造する。
　組換細胞培養物から直接、二重特異性抗体を製造し、単離する方法も種々、報告されている。例えば、ロイシンジッパーを利用した二重特異性抗体の製造方法が報告されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２））。まず、ＦｏｓおよびＪｕｎ蛋白質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させ、ホモダイマーの抗体をヒンジ領域においてモノマーを形成するように還元し、抗体へテロダイマーとなるように再酸化する。また、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、これら２つのドメイン間での対形成できない位に短いリンカーを介して連結し、相補的な別のＶＬおよびＶＨドメインと対を形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成させる方法もある（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：６４４４－６４４８（１９９３））。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）を用いたダイマーについても報告されている（Ｇｒｕｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４））。さらに、二重特異性ではなく三重特異性の抗体についても報告されている（Ｔｕｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
　本発明の抗体および抗体フラグメントは、任意の適当な方法、例えば、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、および組換えＤＮＡ発現系により製造することができる。
　モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５：１－２１，１９８０）。ＭＦＧ－Ｅ８遺伝子によりコードされる蛋白質またはフラグメントを免疫原として用いて、抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）に皮下または腹膜内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。
　ポリクローナル抗体は、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。
　モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とする蛋白質またはそのフラグメントを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよい（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２３１：１１－２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ　２０００　Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５－６を参照）。また、免疫を行わないファージディスプレイに基づいたモノクローナル抗体の作製も現在行われており、本発明の抗体はこれらの方法のいずれで製造されてもかまわない。
　モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５２－５５４（１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と併用することができる他の抗がん剤としては、抗がん効果を有する抗がん剤であれば特に限定されないが、腫瘍細胞傷害性を有する抗がん剤であることが、相乗効果を得る点で特に好ましい。
　当該他の抗がん剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬、ホルモン剤、生物製剤等が挙げられる。アルキル化剤としては、例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、プロカルバジン、ラニムスチン等が挙げられる。代謝拮抗剤としては、例えば、エノシタビン、カルモフール、カペシタビン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ネララビン、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メトトレキサート、クラドリビン、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メルカプトプリン等が挙げられる。微小管阻害剤としては、例えば、ビンクリスチン等のアルカロイド系抗がん剤、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗がん剤が挙げられる。抗生物質抗がん剤としては、例えば、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アムルビシン、ジノスタチンスチマラマー等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としてはトポイソメラーゼＩ阻害作用を有するＣＰＴ－１１、イリノテカン、ノギテカン、トポイソメラーゼＩＩ阻害作用をもつエトポシド、ソブゾキサンが挙げられる。白金製剤としては、例えば、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等が挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、アストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、リュープロレリン、レトロゾール、エストラムスチン、トレミフェン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン等が挙げられる。生物製剤としては、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン２、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ等が挙げられる。分子標的薬としては、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、テムシロリムス、ベバシズマブ、ＶＥＧＦ　ｔｒａｐ、スニチニブ、ソラフェニブ、トシツズマブ、ボルテゾミブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タミバロテン、トレチノイン等が挙げられる。ここに特定する分子標的薬以外にも、ヒト上皮性増殖因子受容体２阻害剤、上皮性増殖因子受容体阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、血管内皮増殖因子受容体２阻害剤（α－ＶＥＧＦＲ－２抗体）等の血管新生を標的にした阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤などの各種チロシンキナーゼ阻害剤、サイトカインを標的とした阻害剤、プロテアソーム阻害剤、抗体―抗がん剤配合体等の分子標的薬なども含めることができる。これら阻害剤には抗体も含む。上記の薬剤の他にも、以下の医薬も併用し得る；サリドマイド、エベロリムス、エルプラット、ＡＢＩ－００７、イキサベピロン、ミリプラチン、ラパチニブ、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ、クラドリビン、リポソーマルドキソルビシン、Ｚ－１００、ハイカムチン、バンデダニブ、ＺＤ４０５４、アナストロゾール、ＧＳＫ１５７２９３２Ａ、パゾパニブ、デノスマブ、Ｓ－１、モテサニブ、トラスツズマブ、Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ、イムシスト、ＮＩＫ－３３３、アキシチニブ、ボスチニブ、Ｅ７０８０、ソブリドチン、デガレリクス、フルベストラント、ゾラデックス、セディラニブ、エリブリン、ＴＳＵ－６８、ＴＡＣ－１０１、ＴＡＳ－１０８、ＮＫ９１１、ＮＫ１０５、エロチニブ、ＬＢＨ５８９、ＭＫ－０４５７、タミバロテン、レナリドミド、ＢＮＰ１３５０、ＡＺＤ０５３０、ＡＺＤ１１５２、ＡＺＤ２２８１、ＡＺＤ４８７７、ＡＢＴ－８６９、ＯＮＯ－４５３８、ＯＴＳ１０２、ＫＷ－０７６１、ＡＲＱ１９７、オファツムマブ、ＡＭＧ６５５、ＴＡＫ－７００、ＴＡＫ－６８３、ＴＡＫ－４４８、ＣＢＰ５０１、ＴＡＫ－２８５、ＴＡＫ－５９３、ＭＬＮ８０５４、ＭＬＮ４９２４、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｒ１５０７、ＮＫ０１２、ＢＩＢＦ１１２０、ＢＩＢＷ２９９２、Ｐａｔｕｐｉｌｏｎｅ、ＭＫ－２４６１、ＣＰ７５１，８７１、ＰＦ－００２９９８０４、サトラプラチン、ＣＭＣ－５４４、ＹＭ１５５、ＧＰＩ２１０１６、ＹＨＯ－１３３５１。
　これらの他の抗がん剤のうち、細胞傷害活性を特徴とするアルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬等が特に好ましい。具体的には、ゲムシタビン、５－ＦＵ、ＣＰＴ－１１、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ダカルバジン、ドキソルビシン、ベバシズマブ、セツキシマブ、抗血管内皮増殖因子受容体２阻害抗体、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤等が特に好ましい。
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤は、一の製剤として用いてもよいし、それぞれ別の製剤の形態で用いてもよい。別の製剤にする場合、例えば注射剤と経口剤のように、投与ルートの異なる製剤の組み合せであってもよい。また、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤とは、同時に投与してもよいし、いずれか一方を先に投与し、他方を後に投与してもよい。つまり、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は他の抗がん剤よりも前に投与してもよく、また同時であってもよく、あるいは他の抗がん剤投与開始後であってもよい。投与時期を同時にしない場合、例えば他の抗がん剤を一定期間投与し、他の抗がん剤の投与期間中又は投与期間終了後に抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を投与するのが好ましい。具体的な抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与タイミングは、他の抗がん剤投与開始後２週間以内、好ましくは１週間以内、より好ましくは３日以内である。
　他の抗がん剤等の化学療法により誘導されたアポトーシス腫瘍細胞の免疫原性を、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体によるＭＦＧ－Ｅ８阻害によって効果的に発揮させることで、生体に本来備わっている抗腫瘍免疫を適切に引き出すことができ、さらには腫瘍再発抑制効果をも誘導することができる。これらの抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の作用効果を考慮すると、他の抗がん剤等の化学療法は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与と同時、もしくは先に実施することが極めて効果的である。
　なお、本明細書における「抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤との組み合せ」とは製剤的に一体として薬剤とする場合に限定するものではなく、製剤としては抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独での提供であったとしても、他の抗がん剤の効果増強の目的で、上述のようなタイミングで他の抗がん剤と併用される限り、本明細書における「抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤との組み合せ」の概念に含まれる。後述にて詳しく説明するように、「他の抗がん剤」は、２剤以上の併用であってもよい。
　さらに言えば、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が他の抗がん剤投与と所望のタイミングで併用され、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を当該他の抗がん剤の効果を増強させ得る併用剤（あるいは抗腫瘍効果増強剤）として使用するような場合も、「抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤との組み合せ」に該当する。あるいは、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が主となるがん治療薬とすると、他の抗がん剤が、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による抗腫瘍免疫作用を効果的に引き出し得る併用剤（あるいはイニシエーター）となり、当該併用される他の抗がん剤と主となるがん治療薬である抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体とが所望のタイミングで投与するような場合にも、「抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤との組み合せ」に該当する。
　抗がん剤以外の他のがん治療法としては、外科手術の他、放射線療法（ガンマーナイフ療法、サイバーナイフ療法、ホウ素中性子捕捉療法、陽子線治療・重粒子線治療法を含む）、ＭＲガイド下集束超音波手術、凍結療法、ラジオ波凝固療法、エタノール注入療法、動脈塞栓療法等が挙げられる。
　これらのがん治療法と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与とは、いずれか一方を先に行い、他方を後に行ってもよいが、同時に行ってもよい。このうち、所定の放射療法を行った後に抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を投与する手段が好ましい。抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与と他のがん治療法との組み合わせについても、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与と他のがん治療法とが上述のようなタイミングで投与される限り、本明細書における「抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他のがん治療法との組み合せ」の概念に含まれる。なお、「他のがん治療法」は、複数の治療法の併用実施であってもよく、さらに「他のがん治療法」と、上述した「他の抗がん剤」投与との併用であってもよい。
　がん治療で実施される細胞療法などと組み合わせて抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を用いてもよい。細胞療法との組み合わせの場合には、細胞療法に使用する細胞を調製している工程で抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を添加してもよく、また、調製後の細胞を患者に戻す際に抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を患者に投与してもよい。
　本発明の抗がん剤は、ヒトを含む哺乳類の、多岐にわたるがんに対して有効であり、例えば咽頭癌、喉頭癌、舌癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、悪性黒色腫、甲状腺癌などの上皮がん；骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、繊維肉腫、白血病や悪性リンパ腫、骨髄腫などの非上皮がんが挙げられる。
　前記のように、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、化学療法により誘導されたアポトーシス腫瘍細胞の免疫原性を、ＭＦＧ－Ｅ８阻害により増強させることで効率的な抗腫瘍免疫誘導、腫瘍再発抑制効果を発揮している。従って、化学療法、放射線療法による腫瘍細胞死の誘導が行われれば抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の抗腫瘍効果は十分期待できる。想定される多剤併用療法、および放射線化学療法など標準治療として確率されている治療法との併用にて、腫瘍縮小効果の増強、無病無再発率の向上が可能である。
　このような候補としては以下の通りである：大腸癌でのＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵ＋オキサルプラチン）、胃癌でのフルオロウラシル系薬剤（テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウムを含む）＋シスプラチン、食道癌、頭頸部癌や子宮癌での化学放射線併用療法（食道癌：フルオロウラシル＋シスプラチン、頭頸部癌：フルオロウラシル＋シスプラチン＋タキサン系、子宮癌：カルボプラチンなど）、膵胆道系癌でのゲムシタビンと放射線併用療法、肺非小細胞癌でのＣＤＤＰ＋タキサン／ビノレルビン／ゲムシタビン等、肺小細胞癌でのＣＤＤＰ＋エトポシド、急性骨髄性白血病でのアンスラサイクリン系抗生剤＋シタラビン、悪性リンパ腫でのＲ－ＣＨＯＰ療法（リツキシマブ、シクロフォスファミド、アンスラサイクリン系抗生剤、ビンクリスチン、プレドニン）、乳癌における多剤化学療法（ＣＡＦ療法：シクロフォスファミド、アンスラサイクリン系抗生剤、フルオロウラシルなど）およびタキサン系＋ハーセプチン、髄芽種におけるＴａｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ＋放射線全脳照射、などが挙げられる。
　本発明の抗がん剤は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
　経口投与用には、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
　非経口投与用には、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ～５００ｍｇであるのが好ましい。また、他の抗がん剤の投与量は、それぞれの抗がん剤の有効量またはその有効量の０．０１～１倍までが好ましい。また、他のがん治療法、例えば放射線療法における放射線照射量を０．１～０．８倍に低減することができる。
　本発明の抗がん剤は、通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、特に限定されず、経口投与でもよい。
　本発明の抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の抗がん効果の作用機序は完全には解明されていないが、腫瘍内および全身性の抗腫瘍免疫応答を活性化させ、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を含む抗腫瘍免疫反応を惹起・促進させることを主要なものとすると考えられる。
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、上記のように標的細胞に対する免疫応答を活性化させ、細胞傷害性Ｔ細胞等を誘導して、標的細胞に対する免疫反応を惹起・促進させる。従って、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を、標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法と組み合せれば、標的細胞に対する免疫反応を強力に誘導し得ることから、がん等の排除したい種々の病巣細胞に対する特異的免疫誘導薬として用いることができる。この抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による特異的免疫誘導は、抗原提示細胞上のαｖβ３インテグリンを介した免疫寛容経路を抑制し、Ｆｃ受容体を介した免疫賦活化経路にスイッチさせることによる。ここで抗原提示細胞には、樹状細胞、単球、マクロファージが含まれる。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
実施例１（他の抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による相乗的な腫瘍縮小効果）
（方法）
　マウス大腸癌細胞ＭＣ－３８またはＢ１６メラノーマ細胞（マウス一匹あたり１×１０５個）を、６週齢Ｃ５７ＢＩ／６マウス背側皮下に注入後、腫瘍径が長径５ｍｍ（２５～３０ｍｍ２）に増殖した時点（ｄａｙ１０）で抗がん剤、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を以下のプロトコールにてｄａｙ１０、ｄａｙ１３、ｄａｙ１６に腹腔内投与した。以下のプロトコールに沿って各々２回同様の検討を施行した。なお、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、ＭＢＬ社より商品化されている阻害抗体を用いた。また、プロトコール１～４はＭＣ－３８を用い、プロトコール５は、Ｂ１６メラノーマを用いた。
プロトコール１：
・Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ＧＥＭ）：４ｍｇ／ｋｇ
・Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ＧＥＭ）：１ｍｇ／ｋｇ
・抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
・Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ＧＥＭ）：４ｍｇ／ｋｇ＋抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
・Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ＧＥＭ）：１ｍｇ／ｋｇ＋抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
プロトコール２：
・ＣＰＴ－１１：１ｍｇ／ｋｇ
・５―ＦＵ：０．１Ｍ
・抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
・ＣＰＴ－１１：１ｍｇ／ｋｇ＋抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
・５―ＦＵ：０．１Ｍ＋抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
プロトコール３：
・上皮性増殖因子受容体チロシンキナーゼ１（ＥＧＦＲ－ＴＫ１）：４０ｍｇ／ｇ
・抗血管内皮増殖因子受容体－２モノクローナル抗体（α－ＶＥＧＦＲ－２Ａｂ）：４０ｍｇ／ｋｇ
・抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
プロトコール４：
・放射線照射（ＸＲＴ）：３Ｇｙ／ｄａｙ　５回
・抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
プロトコール５：
・ドキソルビシン（Ｄｏｘ）：５ｍｇ／ｋｇ
・エトポシド（Ｅｔｏｐ）：２ｍｇ／ｋｇ
・抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体：１ｍｇ／ｋｇ
（結果）
　抗がん剤を単独投与した場合、投与後５～１０日は無治療群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果を示しているが、それ以降で無治療群と同等な確率で腫瘍増殖を認めた。以上の傾向はＧＥＭ、５ＦＵ、ＣＰＴ－１１、ドキソルビシン、エトポシド、ＥＧＦ－ＴＫ１、α－ＶＥＧＦＲ－２Ａｂのいずれの抗がん剤投与および放射線療法にても同等であった。以上より、抗がん剤による制がん効果は一過性であり長期的な抗腫瘍効果は期待できないことが判明した（図１～５）。
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独投与では、無治療群に比較して軽微な腫瘍増殖抑制効果を認めるが、抗がん剤投与または放射線療法時に比較してその効果は弱い（図１～５）。
　抗がん剤または放射線療法と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体との併用投与群では有意な強い腫瘍増殖抑制効果を認めた。この効果は抗がん剤単独投与群または放射線療法単独群と異なり、治療終了後長期間を経過しても強力な腫瘍抑制効果を維持した。例えばゲムシタビン４ｍｇ／ｋｇと抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用群や５－ＦＵと抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用群では３５日後まで腫瘍はほとんど増殖しなかった。上記の結果は抗がん剤の種類に関わらず（抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体等）、同様であった（図１～５）。
　以上の結果より、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体によるＭＦＧ－Ｅ８活性阻害が、各種抗がん剤または放射線療法による抗腫瘍効果を劇的に改善する事が明らかとなった。また、腫瘍抗原を使用することなく、抗がん剤または放射線療法と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体との併用による優れた抗腫瘍効果が得られることは、全く予想外である。
実施例２（腫瘍内リンパ球の免疫学的機能に関連する表面形質の検討）
（方法）
　上記と同様の大腸癌細胞ＭＣ３８皮下投与を用いた腫瘍モデルにおいて、各種治療プロトコールを施行し、その１週間後（ｄａｙ２３）の時点でマウスより腫瘍組織を採取した。これをコラゲナーゼＩにて処理後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いた比重勾配法にて、腫瘍組織内に存在するリンパ球を分離・採取した。この腫瘍内リンパ球の活性に関連する表面抗原についてフローサイトメトリーを用いて、下記の検討を行った。
・ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞のメモリー活性状態（ＣＤ４４発現）
・Ｔ細胞活性抑制に重要なＣＤ１１ｂ・Ｇｒ－１陽性細胞（未熟ミエロイド細胞）の割合
・抗腫瘍Ｔ細胞活性増強に寄与する樹状細胞のマーカーであるＣＤ１１ｃ陽性細胞分画の割合
・樹状細胞の活性度の評価：ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８６陽性分画の割合
（結果）
　代表例として５―ＦＵ投与群のみ提示する。他の治療群でも同様の結果である。
　無治療群と比較して、抗がん剤単独投与群でのＴ細胞、未熟ミエロイド細胞、樹状細胞の比率に大きな変化を生じない（図６および７）。抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独投与群でも抗がん剤と同等である。
　抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体とを併用した群では以下の変化が生じた。
　Ｔ細胞のメモリー活性（ＣＤ４４発現）が増加した（図６）。これは、腫瘍内に浸潤したＴ細胞の活性能が誘導されたことを示す。
　樹状細胞数の大幅な増加、活性の増強が生じた（図６および７）。これは、腫瘍内の樹状細胞の浸潤、活性が誘導されていることを示唆しており、特異的Ｔ細胞免疫応答を増強するのに好適な環境となっている。
　以上より、抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体との併用により、腫瘍内の抗腫瘍免疫応答（標的とする腫瘍に対する特異的免疫応答）が増強されているものと考えられた。この腫瘍局所での環境が、併用群における腫瘍増殖抑制効果の大幅な増強に関与している可能性が示唆された。
実施例３（脾臓内リンパ球免疫活性能の評価）
　腫瘍局所だけではなく、全身の免疫応答の変化を検討するため、代表的な末梢リンパ系組織である脾臓細胞を用いて検討した。具体的には、腫瘍内リンパ球の免疫活性能の検討を行ったマウスより脾臓を摘出し、そこから脾細胞を分離して、主にＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞の活性について、フローサイトメトリー法にて以下のように検討した。
・メモリー活性状態（ＣＤ４４発現）
・サイトカイン産生プロフィール：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ（ＩＦＮ－α；免疫活性化のマーカー）
　　　　　　　　　　　　　　　：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０（ＩＬ－１０；免疫抑制のマーカー）
（結果）
　無治療群と比較して、抗がん剤単独投与群でのＴ細胞、未熟ミエロイド細胞、樹状細胞の比率については、大きな変化を生じない（図８および９）。
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独投与群でも抗がん剤と同等である。
　抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を併用した群では、ＣＤ４４発現およびＩＦＮγ産生の明らかな増強を認めた。ＩＬ－１０反応については無治療群、抗がん剤単独群と比較して有意差を認めなかった（図８および９）。
　以上より、抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用により、腫瘍局所だけではなく全身性の抗腫瘍免疫応答が活性化していることが明らかとなった。
実施例４（抗ＭＦＧ－８抗体、抗がん剤併用による腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞誘導能についての検討）
（方法）
　無治療群、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体群、抗がん剤群、および抗がん剤と抗体併用群で治療した担癌マウスよりリンパ節細胞を分離して、放射線処理（２００Ｇｙ）したＭＣ３８大腸癌細胞と１０：１の割合で共培養を施行した。５日後にリンパ節細胞と５１Ｃｒで標識した標的腫瘍細胞を４時間混合培養したあと、γシンチレーターにて５１Ｃｒの上清への放出量を計測することにより、腫瘍細胞傷害活性を計測した。
（結果）
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体治療群由来のリンパ節細胞によりＭＣ３８に対する細胞傷害活性を認めた。さらに抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用治療群由来のリンパ節細胞では、ＭＣ３８特異的細胞傷害の増強作用を認めた。それに対し、Ｂ１６悪性黒色腫細胞への傷害活性は殆ど誘導されなかった（図１０）。
　以上より、抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用により、腫瘍特異的細胞障害性リンパ球の誘導能増強を認めることが明らかとなった。
実施例５（ＭＦＧ－Ｅ８による樹状細胞活性修飾を介した抗原特異的Ｔ細胞活性増強のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの検討）
（方法）
　Ｉｎ　ｖｉｖｏで認められた抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と、抗がん剤との併用による樹状細胞、Ｔ細胞活性のメカニズムについてｉｎ　ｖｉｔｒｏでの混合培養の系にて詳細に検討した。
　具体的にはモデル抗原としてＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）を利用するため、ＤＯ１１．１０（ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ拘束性ＯＶＡ抗原トランスジェニックマウス）より骨髄細胞を採取し、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）により樹状細胞を分化誘導する。誘導開始後Ｄａｙ７でＭＦＧ－Ｅ８組換え蛋白（１００μｇ／ｍＬ）ないし抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体（２０μｇ／ｍＬ）で処理、さらにｄａｙ８にてＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩＯＶＡ拘束性ＯＶＡ　ｐｅｐｔｉｄｅ（５ｍｇ／ｍＬ）あるいは陰性コントロールｐｅｐｔｉｄｅ（ＨＳＡ）を６時間パルスした。それらを、Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ（Ｂａｌｂ／ｃ）マウス由来のｎａiｖｅ　ＣＤ４＋陽性Ｔ細胞と、樹状細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の比が１：１０の割合となるように混和し、抗ＣＤ３抗体（０．１μｇ／ｍＬ）存在下にて混合培養した。７２時間後にＴ細胞活性状態をフローサイトメトリー法によってＩＦＮ－αおよびＩＬ－１０の細胞内発現を測定することにより検討した。
（結果）
　無処理樹状細胞：ＯＶＡ特異的な樹状細胞によるＴ細胞活性を認めた（ＩＦＮ－α，ＩＬ－１０供に増加しているため免疫活性、抑制機能双方を活性している状態と考えられる）。
　ＭＦＧ－Ｅ８を前刺激した樹状細胞：コントロール群に比して、ＯＶＡ特異的なＩＦＮ－α産生低下、ＩＬ－１０産生増強を認めた（抗原特異的免疫応答の抑制が認められた）。
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体にて樹状細胞のＭＦＧ－Ｅ８を阻害した場合、コントロール群に比して、ＯＶＡ特異的なＩＦＮ－α産生能の増強、ＩＬ－１０産生の低下を認めた（抗原特異的免疫応答の活性化が認められた）。
　以上よりＭＦＧ－Ｅ８は樹状細胞に直接作用し、その免疫活性機能を負に制御すること、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による中和により抗原特異的に樹状細胞による免疫応答を強力に活性化することが明らかになった。この抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の機能は、ｐｅｐｔｉｄｅをパルスした樹状細胞においても同様に見られたので、樹状細胞の抗原提示以外の機能である共刺激分子の制御を介したものであると考えられた（図１１（ＩＦＮｇはＩＦＮ－α））。
実施例６（抗がん剤による腫瘍細胞からのＭＦＧ－Ｅ８発現（分泌）誘導の検討）
（方法）
　抗がん剤によるＭＦＧ－Ｅ８阻害の感受性増強を検討するため、ＭＣ３８大腸癌細胞、正常繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３，Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に各種抗がん剤（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ、ＧＥＭ，５－ＦＵ，ＣＰＴ－１１等）投与後２４時間後におけるＭＦＧ－Ｅ８発現を細胞内フローサイトメトリー、細胞培養上清を用いＥＬＩＳＡ法にて検討した。
（結果）
　各種抗がん剤投与により、ＭＣ３８におけるＭＦＧ－Ｅ８産生能は有意に増強した。これに対してＮＩＨ３Ｔ３、Ｐｒｉｍａｒｙ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ非がん細胞でのＭＦＧ－Ｅ８発現は抗がん剤による増強効果を認めなかった（図１２）。またＢ１６メラノーマ細胞においても抗がん剤によるＭＦＧ－Ｅ８産生誘導を認めた（図１３）。
　以上の結果より、抗がん剤により腫瘍細胞のＭＦＧ－Ｅ８産生が誘導されることが判明した。これまでに明らかとなったＭＦＧ－Ｅ８の機能を考慮すると、抗がん剤に対する治療抵抗性獲得の機序の一つとなっている可能性が示唆された。
実施例７（抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が抗がん剤による腫瘍細胞死誘導に与える影響についての検討）
（方法）
　ＭＣ３８大腸癌細胞株に各種抗がん剤（ＧＥＭ：１Ｍ，ＣＰＴ－１１：０．５Ｍ，５ＦＵ：１Ｍ）投与する際に抗ＭＦＧ－Ｅ８阻害抗体（２０μｇ／ｍＬ）あるいは陰性コントロールとしてＩｇＧ抗体を同時に添加し、無血清下で４８時間培養した後の細胞死比率をフローサイトメトリー法にて定量的に検討した。
（結果）
　抗がん剤非添加群においても抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体添加にて有意の腫瘍細胞死の誘導を認めたが、抗がん剤と比してその効果は軽微である。
　抗がん剤投与群については、コントロール群と比較して抗体併用群で、有意の腫瘍細胞死増強を認めた。この効果は抗がん剤の種類に関わりなく一定であった。
　以上よりＭＦＧ－Ｅ８阻害による抗腫瘍効果には、免疫能増強による間接的な腫瘍退縮に加え、直接的な抗がん剤による腫瘍細胞アポトーシス誘導増強作用が関与している可能性が示された（図１４）。
実施例８（インビボにおけるアポトーシス誘導）
（方法）
　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるアポトーシスを測定するために、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体存在下もしくは非存在下で、ＭＣ３８もしくはＢ１６腫瘍（２５ｍｍ２）をゲムシタビンもしくはダカルバジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理し、処理の４日後に腫瘍を採取、腫瘍ホモジェネート中のカスパーゼ３活性化をｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（インビトロジェン）で測定した。
（結果）
　ゲムシタビンと抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を投与されたマウスから摘出されたＭＣ３８腫瘍は、それぞれの薬剤で治療されたマウスから摘出された腫瘍と比較すると、カスパーゼ３活性を促進させた（図１５）。同様に、Ｂ１６メラノーマはダカルバジンと抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を組み合わせると、カスパーゼ３活性が増加した（図１５）。
実施例９（抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と免疫）
（方法）
　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による抗がん剤の抗腫瘍効果増強作用と免疫との関係を明らかにするため、免疫不全マウスおよび野生型マウスを用いて、実施例１と同様に腫瘍細胞ＭＣ３８、Ｂ１６またはＭＣＡ－２０５を移植して試験を行った。
　すなわち、樹立した腫瘍細胞ＭＣ３８（２５ｍｍ２）を移植したＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに全身的に（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）ＧＥＭおよび抗ＭＦＧ－Ｅ８モノクローナル抗体を投与した。また、樹立した腫瘍細胞ＭＣ３８を移植し、抗体でＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＮＫ１．１＋細胞を枯渇させた野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、全身的に（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）ＧＥＭおよび抗ＭＦＧ－Ｅ８モノクローナル抗体を投与した。また、ＭＣ３８を移植した野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスにＧＥＭ及び抗ＭＦＧ－Ｅ８モノクローナル抗体を投与してＭＣ３８の増殖を抑制させたマウスに、５０日経過後、ＭＣ３８、Ｂ１６又はＭＣＡ－２０５を移植し、抗腫瘍効果を検討した。
（結果）
　免疫不全マウスであるＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおいては、実施例１で観察された抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による、抗がん剤の抗腫瘍効果に対する増強効果は全く認められなかった（図１６）。また、野生型マウスに対してＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した場合、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と抗がん剤併用による抗腫瘍増強効果は低減した（図１７）。ＧＥＭ及び抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体投与により、ＭＣ３８に対する増殖抑制効果が得られたマウスに、５０日経過後に再度ＭＣ３８を移植したところ、ＭＣ－３８に対する増殖抑制効果が持続していた（図１８）。一方、５０日経過後に移植したＢ１６及びＭＣＡ－２０５に対しては、増殖抑制効果は得られなかった（図１８）。
　この結果、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と抗がん剤併用療法による抗腫瘍活性を増強する効果が、持続的であり、特異性が高い宿主免疫応答を介するものであることが、より明確になった。
実施例１０
（方法）
　投与マウスから腫瘍浸潤細胞を採取し、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ８６の発現をフローサイトメトリー法により分析した。また、骨髄由来樹状細胞と、ＰＫＨ２６で標識したＥＧ．７－ＯＶＡとを（抗ＭＦＧ－Ｅ８モノクローナル抗体でオプソニン化して、またはオプソニン化せずに）混合培養し、貪食性を評価した。
（結果）
　抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の併用治療により、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋の樹状細胞の数は、有意に増加し、そして、これらの細胞は、共促進する分子ＣＤ８６を高発現した（図１９）。骨髄由来の樹状細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で、化学療法に晒されたＭＣ３８及びＢ１６細胞を効果的に貪食した（図２０）ので、腫瘍浸潤の解析により、ｉｎ　ｓｉｔｕにおける腫瘍細胞の樹状細胞捕捉がＴ細胞プライミングに重要であるという可能性が考えられる。
実施例１１
（方法）
　樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）は、ＧＭ－ＣＳＦ条件培地を用いて骨髄前駆細胞から７日間培養し、その後、組換えＭＦＧ－Ｅ８（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗ＭＦＧ－Ｅ８モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍＬ、ＭＢＬ）もしくはポリクローナルＭＦＧ－Ｅ８抗血清（２０μｇ／ｍＬ）で一晩処理した。培養上清中のＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１０濃度はＥＬＩＳＡ法により測定した。７日目のＢＭＤＣｓは、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識したＥＧ．７－ＯＶＡ細胞とともに１２穴丸底プレートで共培養し（比１：１０）、貪食作用をフローサイトメトリー法で測定した。共培養の前に抗ＭＦＧ－Ｅ８モノクローナル抗体（３０ｍｇ／ｍＬ）で３０分間前処理した腫瘍細胞での実験も行った。αｖβ３インテグリン阻止抗体（ＲＭＶ－７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）もしくはＦｃレセプター阻止抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の腫瘍細胞取り込みに対する影響も同様に評価した。交差提示をテストするため、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＡＣＴＢ－ＯＶＡ）９１６Ｊｅｎ／Ｊマウスの脾臓からｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて単離し、２４時間腫瘍細胞を負荷した樹状細胞に加えた。細胞内のＩＦＮ－γ発現は、フローサイトメトリー法で測定した。
　ｉｎ　ｖｉｖｏにおける交差提示アッセイとして、Ｘ線処理したＥＧ．７－ＯＶＡ細胞（１×１０６／マウス）をＭＦＧ－Ｅ８モノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍＬ）、抗ＦｃＲブロック抗体（１ｍｇ／ｍＬ）もしくはアイソタイプコントロールとともにＯＴ－Ｉマウスの足蹠に投与した。投与５日後にマウスを屠殺し、流入領域リンパ節細胞を単離して、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＯＶＡペプチド（１０ｍｇ／ｍＬ）とともに一晩培養した。その後、培養上清を用い、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生をフローサイトメトリーもしくはＥＬＩＳＡ法で測定した。
（結果）
　骨髄由来の樹状細胞は、照射されたＥＧ．７－ＯＶＡ細胞を効果的に取り込んだが、αｖβ３インテグリンに対する抗体により部分的に阻害された。このことは、ＭＦＧ－Ｅ８がこの系において腫瘍細胞の取り込みに寄与したことを示している（図２１）。抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は、放射線処理されたＥＧ．７－ＯＶＡ細胞の全貪食には影響しなかったが、αｖβ３インテグリンに対してではなく、Ｆｃ受容体に対する拮抗抗体は、ＥＧ．７－ＯＶＡ細胞の取り込みを減衰させた。これらの結果は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が、ＭＦＧ－Ｅ８介在腫瘍細胞の取り込みに対する受容体を、αｖβ３インテグリンからＦｃ受容体にスイッチすることを明らかにしている。このスイッチ作用に関しては、Ｆｃ受容体を介する取り込みを促進できる抗体ならではの機能と考えられるため、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による抗腫瘍効果はＭＦＧ－Ｅ８の機能を特異的に阻害する抗体以外の薬剤を使用した場合のそれよりも格段に大きいものと想定される。
　免疫刺激を引き起こすＦｃ受容体を活性化する力と一致して、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体によるＥＧ．７－ＯＶＡ細胞のオプソニン化が、Ｃ５７Ｂ１／６同系マウスからのＯＶＡ　ＴＣＲ　トランスジェニックＴ細胞の樹状細胞刺激を増加させ、結果として、ＩＦＮ－γ産生が増加する一方、抗Ｆｃ受容体抗体は、クロスプライミングを阻害した（図２２、２３）。対照的に、抗αｖβ３インテグリンが、放射線処理されたＥＧ．７－ＯＶＡ細胞のみあるいは抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体がオプソニン化したかどうかのＴ細胞応答を増大させ、放射線処理されたＥＧ．７－ＯＶＡ細胞が樹状細胞に送られた。事実、樹状細胞上のαｖβ３インテグリンのＭＦＧ－Ｅ８取り込みはＩＬ－１０分泌を増加する一方、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体によるＭＦＧ－Ｅ８取り込みの阻害はＩＬ－１０を減少し、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３及びＴＮＦ－α産生を増加させた（図２４）。このサイトカインプロファイルの調節は、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による免疫活性化作用に寄与していると考えられる。
実施例１２
　抗がん剤および抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与時期による抗腫瘍効果の影響を検討した。すなわち、実施例１においては、抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体は同時に投与したが、投与時期を変更して、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体による抗がん剤の抗腫瘍効果に対する作用を検討した。
　その結果、抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と同時投与又は、先に抗がん剤を投与し、次いで抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を投与することにより、顕著に優れた抗腫瘍効果が得られた。このことは、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の作用が、抗がん剤によるがん細胞傷害作用に引き続く、がん免疫を含む免疫原性の活性化によることを明らかにしたものといえる。
実施例１３（他の抗がん剤２種以上の併用）
（方法）
　マウス大腸癌ＭＣ－３８（１×１０５／ｍｏｕｓｅ）を皮下接種後１０日目（腫瘍径２５ｍｍ２）に以下の薬剤を第１０、１２、１４、１６、１８日に腹腔内投与した。
・化学療法単独群：５ＦＵ（２０ｍｇ／ｋｇ）＋ＣＰＴ－１１（２ｍｇ／ｍＬ）
・抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体単独
・併用群：５―ＦＵ（２０ｍｇ／ｋｇ）＋ＣＰＴ－１１（２ｍｇ／ｍＬ）＋抗ＭＦＧ－Ｅ８阻害抗体（１ｍｇ／ｋｇ）
（結果）
　化学療法単独群、併用群で腫瘍縮小効果を認め、第３０日には腫瘍消失を認めた。ただし、投与後長期間経過後（第１２０日＜）に両群で明らかな抗腫瘍効果の相違を認めた。つまり、化学療法単独群の多くで急速な腫瘍再燃をきたしたのに対し、抗がん剤＋抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体併用群では再発例は認められなかった。以上より、抗がん剤と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を併用することにより、長期的な腫瘍増殖抑制効果を発揮することが判明した。

Claims (31)

  1. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を有効成分とする抗がん剤。
  2. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤とを組み合せてなる抗がん剤。
  3. 　他の抗がん剤が、腫瘍細胞傷害性抗がん剤である請求項２記載の抗がん剤。
  4. 　他の抗がん剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤又は分子標的薬である請求項２又は３記載の抗がん剤。
  5. 　他の抗がん剤が、ゲムシタビン、５－ＦＵ、ＣＰＴ－１１、エトポシド、シスプラチン、オリサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ダカルバジン、ドキソルビシン、べバシズマブ、セツキシマブ、抗血管内皮増殖因子受容体２阻害抗体、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤である請求項２～４のいずれか１項記載の抗がん剤。
  6. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を含有し、他のがん治療法と組み合せて使用するための抗がん剤。
  7. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を有効成分とし、標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法と組み合せて使用するための、標的細胞に対する特異的免疫誘導薬。
  8. 　標的細胞が腫瘍細胞である、請求項７記載の特異的免疫誘導薬。
  9. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が、抗原提示細胞上のＦｃ受容体を介して標的細胞に対する特異的免疫を誘導する、請求項７又は８記載の特異的免疫誘導薬。
  10. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体を含み、
    　標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法によってＭＦＧ－Ｅ８が発現誘導された標的細胞に対する免疫寛容を、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が抑制するとともに免疫を賦活化する、免疫経路スイッチ剤。
  11. 　抗がん剤製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用。
  12. 　他の抗がん剤と組み合せてなる抗がん剤製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用。
  13. 　他の抗がん剤が、腫瘍細胞傷害性抗がん剤である請求項１２記載の使用。
  14. 　他の抗がん剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤又は分子標的薬である請求項１２または１３記載の使用。
  15. 　他の抗がん剤が、ゲムシタビン、５－ＦＵ、ＣＰＴ－１１、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ダカルバジン、ドキソルビシン、べバシズマブ、セツキシマブ、抗血管内皮増殖因子受容体２阻害抗体、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤である請求項１２～１４のいずれか１項記載の使用。
  16. 　他のがん治療法と組み合せて使用するための抗がん剤製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用。
  17. 　標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法と組み合せて使用するための、標的細胞に対する特異的免疫誘導薬製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用。
  18. 　標的細胞が腫瘍細胞である、請求項１７記載の使用。
  19. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が、抗原提示細胞上のＦｃ受容体を介して標的細胞に対する特異的免疫を誘導する、請求項１７または１８記載の使用。
  20. 　標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法によってＭＦＧ－Ｅ８が発現誘導された標的細胞に対する免疫寛容を、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が抑制するとともに免疫を賦活化する、免疫経路スイッチ剤製造のための抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の使用。
  21. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の有効量を投与することを特徴とするがんの治療法。
  22. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と他の抗がん剤とを組み合せて投与することを特徴とするがんの治療法。
  23. 　他の抗がん剤が、腫瘍細胞傷害性抗がん剤である請求項２２記載の治療法。
  24. 　他の抗がん剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤又は分子標的薬である請求項２２または２３記載の治療法。
  25. 　他の抗がん剤が、ゲムシタビン、５－ＦＵ、ＣＰＴ－１１、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ダカルバジン、ドキソルビシン、べバシズマブ、セツキシマブ、抗血管内皮増殖因子受容体２阻害抗体、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤である請求項２２または２３記載の治療法。
  26. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与と、他のがん治療法とを組み合せることを特徴とするがんの治療法。
  27. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と、標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法とを組み合せることを特徴とする、標的細胞に対する特異的免疫誘導方法。
  28. 　標的細胞が腫瘍細胞である、請求項２７記載の特異的免疫誘導方法。
  29. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が、抗原提示細胞上のＦｃ受容体を介して標的細胞に対する特異的免疫を誘導する、請求項１７または１８記載の特異的免疫誘導方法。
  30. 　標的細胞を傷害し得る薬剤の投与または治療法と抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体の投与を組み合せることを特徴とする、
    　標的細胞を傷害し得る薬剤又は治療法によってＭＦＧ－Ｅ８が発現誘導された標的細胞に対する免疫寛容を、抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体が抑制するとともに免疫を賦活化する、免疫経路スイッチ方法。
  31. 　抗ＭＦＧ－Ｅ８抗体と細胞療法を組み合わせることを特徴とするがんの治療法。
PCT/JP2009/001940 2008-06-02 2009-04-28 抗がん剤 WO2009147781A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010515738A JP4686733B2 (ja) 2008-06-02 2009-04-28 抗がん剤
EP09758048.4A EP2283862B1 (en) 2008-06-02 2009-04-28 Combination treatment of cancer comprising anti-mfg-e8 antibody
US12/995,942 US9226934B2 (en) 2008-06-02 2009-04-28 Anti-cancer drug

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2008/001393 WO2009147695A1 (ja) 2008-06-02 2008-06-02 抗がん剤
JPPCT/JP2008/001393 2008-06-02
US15311309P 2009-02-17 2009-02-17
US61/153,113 2009-02-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009147781A1 true WO2009147781A1 (ja) 2009-12-10

Family

ID=41397869

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/001940 WO2009147781A1 (ja) 2008-06-02 2009-04-28 抗がん剤

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9226934B2 (ja)
EP (1) EP2283862B1 (ja)
WO (1) WO2009147781A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021151264A (ja) * 2014-07-03 2021-09-30 トランシミューン アーゲー 全体的に活性化された単球を得るための方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130331294A1 (en) 2007-11-09 2013-12-12 Fox Chase Cancer Center Egfr/nedd9/tgf-beta interactome and methods of use thereof for the identification of agents having efficacy in the treatment of hyperproliferative disorders
WO2009062199A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Fox Chase Cancer Center EGFR/NEDD9/TGF-β LNTERACTOME AND METHODS OF USE THEREOF FOR THE IDENTIFICATION OF AGENTS HAVING EFFICACY IN THE TREATMENT OF HYPERPROLIFERATIVE DISORDERS
WO2013131105A1 (en) * 2012-03-02 2013-09-06 Sri International Synergistic anti-proliferation activity of tas-108 with mtor inhibitors against cancer cells
WO2013139956A1 (en) * 2012-03-22 2013-09-26 Thrombogenics Nv Antibodies abrogating cell binding to lactadherin
DK3218005T5 (da) 2014-11-12 2024-10-14 Seagen Inc Glycan-interagerende forbindelser og anvendelsesfremgangsmåder
IL302822A (en) 2015-11-12 2023-07-01 Seagen Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
KR20240044544A (ko) 2017-03-03 2024-04-04 씨젠 인크. 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법

Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0003089A1 (fr) 1978-01-06 1979-07-25 Bernard David Séchoir pour feuilles imprimées par sérigraphie
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
EP0239400A2 (en) 1986-03-27 1987-09-30 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
JPH0159878B2 (ja) 1982-05-21 1989-12-20 Yunibaashitei Obu Karifuorunia
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
WO1992001047A1 (en) 1990-07-10 1992-01-23 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1995001438A1 (en) 1993-06-30 1995-01-12 Medical Research Council Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
WO1996002576A1 (fr) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine
WO1996027011A1 (en) 1995-03-01 1996-09-06 Genentech, Inc. A method for making heteromultimeric polypeptides
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO2000061739A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
WO2002031140A1 (fr) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules produisant des compositions d'anticorps
JP2008503480A (ja) * 2004-06-18 2008-02-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の治療
WO2008043018A1 (en) 2006-10-04 2008-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor immunity

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5972337A (en) * 1990-11-01 1999-10-26 Cancer Research Fund Of Contra Costa 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein
GB9120467D0 (en) * 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production

Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0003089A1 (fr) 1978-01-06 1979-07-25 Bernard David Séchoir pour feuilles imprimées par sérigraphie
JPH0159878B2 (ja) 1982-05-21 1989-12-20 Yunibaashitei Obu Karifuorunia
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
EP0239400A2 (en) 1986-03-27 1987-09-30 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
WO1992001047A1 (en) 1990-07-10 1992-01-23 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1995001438A1 (en) 1993-06-30 1995-01-12 Medical Research Council Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
WO1996002576A1 (fr) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine
WO1996027011A1 (en) 1995-03-01 1996-09-06 Genentech, Inc. A method for making heteromultimeric polypeptides
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO2000061739A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
WO2002031140A1 (fr) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules produisant des compositions d'anticorps
JP2008503480A (ja) * 2004-06-18 2008-02-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の治療
WO2008043018A1 (en) 2006-10-04 2008-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor immunity

Non-Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BETTER, M.; HORWITZ, A. H., METHODS ENZYMOL., vol. 178, 1989, pages 476 - 496
BIRD, R. E.; WALKER, B. W., TRENDS BIOTECHNOL., vol. 9, 1991, pages 132 - 137
CAMPBELL: "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", 1984, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS
CARMON L. ET AL.: "Characterization of novel breast carcinoma-associated BA46- derived peptides in HLA-2.1/D(b)-beta2m transgenic mice", J. CLIN. INVEST., vol. 110, 2002, pages 453 - 462, XP002295881, DOI: doi:10.1172/JCI200214071
CO, M. S. ET AL., J. IMMUNOL., vol. 152, 1994, pages 2968 - 2976
GREEN, J. IMMUNOL. METHODS, vol. 231, 1999, pages 11 - 23
GRUGER ET AL., J. IMMUNOL., vol. 152, 1994, pages 5368
HANAYAMA R. ET AL., NATURE, vol. 417, 2002, pages 182 - 187
HANAYAMA R. ET AL.: "Autoimmune MFG-E8-deficient mice", SCIENCE, vol. 304, 2004, pages 1147 - 1150
HOLLINGE ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 6444 - 6448
JINUSHI M. ET AL.: "MFG-E8 mediated uptake of apoptotic cells by APCs links the pro-and anti-inflammatory activities of GM-CSF", J. CLIN. INVEST., vol. 117, 2007, pages 1902 - 1913
KOSTELNY ET AL., J. IMMUNOL., vol. 148, no. 5, 1992, pages 1547 - 1553
LAMOYI, E., METHODS ENZYMOL., vol. 121, 1986, pages 652 - 663
MCCAFFERTY ET AL., NATURE, vol. 348, 1990, pages 552 - 554
MILLSTEIN ET AL., NATURE, vol. 305, 1983, pages 537 - 539
NEUTZNER M. ET AL.: "MFG-E8./lactadherin promotes tumor growth in an angiogenesis- dependent transgenic mouse model of multistage carcinogenesis", CANCER RES., vol. 67, 2007, pages 6777 - 6785, XP009161940, DOI: doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-0165
PLUCKTHUN, A.; SKERRA, A., METHODS ENZYMOL., vol. 178, 1989, pages 497 - 515
ROUSSEAUX, J. ET AL., METHODS ENZYMOL., vol. 121, 1986, pages 663 - 669
SATO, K. ET AL., CANCER RES., vol. 53, 1993, pages 851 - 856
See also references of EP2283862A4
ST. GROTH ET AL., J. IMMUNOL. METHODS, vol. 35, 1980, pages 1 - 21
STUBBS T ET AL.: "cDNA reveals the existence sequences", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 8417 - 8421, XP002964878, DOI: doi:10.1073/pnas.87.21.8417
SURESH ET AL., METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 121, 1986, pages 210
TUTT ET AL., J. IMMUNOL., vol. 147, 1991, pages 60
WELLS, EEK, CHEM. BIOL., vol. 7, no. 8, August 2000 (2000-08-01), pages R185 - 6

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021151264A (ja) * 2014-07-03 2021-09-30 トランシミューン アーゲー 全体的に活性化された単球を得るための方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2283862A1 (en) 2011-02-16
US9226934B2 (en) 2016-01-05
EP2283862A4 (en) 2012-09-26
EP2283862B1 (en) 2018-08-08
US20110081356A1 (en) 2011-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2009147781A1 (ja) 抗がん剤
KR20220044481A (ko) 암 면역요법을 위한 조성물 및 방법
JP6805428B2 (ja) Ｃｅａｃａｍ１に対するヒト化抗体
US20220160829A1 (en) Use of annexin v as a method to block tumor induced immunosuppression of the innate immune response
CN107530419A (zh) 治疗疾病的组合疗法
JP2009518446A (ja) Ｃｔｌａ−４抗体投与量漸増レジメン
AU2016304597A1 (en) Methods and compositions for tumor therapy
JP2023524530A (ja) 免疫原性が低い癌の癌細胞死滅を増強するための３剤併用療法
CN114502196A (zh) Ido抑制剂的给药方案
CN110831629B (zh) 用于治疗癌症的包括abx196的组合
CN113474048A (zh) 用于癌症治疗的组合物和方法
US20200055947A1 (en) Bi-specific activators for tumor therapy
CN114364399A (zh) 脑信号蛋白-4d阻断剂(sema4d)与dc1疗法的联合疗法
WO2023240082A2 (en) Combination therapy of anti-pd-1 active agent, anti-tim-3 active agent, and anti-lag-3 active agent for treating cancer
TW201712035A (zh) 基於過敏反應素－１拮抗劑之癌免疫增強劑
JP4686733B2 (ja) 抗がん剤
KR102239752B1 (ko) 종양 특이적 약물복합체와 항pd-l1 항체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물
WO2009147695A1 (ja) 抗がん剤
JP2011074093A (ja) 抗がん剤
CN114450028A (zh) Lag-3拮抗剂治疗的定量空间剖析
TWI832069B (zh) 用於預防或治療癌症且含有萘醌系化合物及免疫檢查點抑制劑作為活性成分的藥學組成物
RU2801828C2 (ru) Комбинированная терапия блокированием семафорина 4d (sema4d) и терапией дк1
US20230255978A1 (en) Methods for treating glioblastoma
US20240000883A1 (en) Method of sensitizing cancers to immunotherapy using immunomodulatory agents
TW202315631A (zh) 增強低免疫原性癌症中癌細胞毒殺的三聯療法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09758048

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010515738

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009758048

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12995942

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE