WO2009136548A1 - 新規な酵素電極及び該酵素電極を用いた燃料電池 - Google Patents

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貴晶 中川
英之 汲田
義夫 後藤
秀樹 酒井
正也 角田
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ソニー株式会社
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme electrode. More specifically, the present invention relates to an electrode in which an oxidation-reduction reaction proceeds using an enzyme as a catalyst, an enzyme electrode improved to achieve high output, and a fuel cell that can achieve high output using the enzyme electrode. .
  • glucose Glucose
  • glucose dehydrogenase Glucose Dehydrogenase
  • NAD + nicotinamide adenine dinucleotide
  • Diaphorase diaphorase
  • electron transfer mediator electrode (carbon)
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2006-234788 Japanese Patent Laid-Open No. 2006-93090.
  • the efficiency of the reaction on the electrode is increased by artificially increasing the compatibility between the enzyme immobilized on the electrode of the biofuel cell and the reaction substrate, thereby increasing the output of the biofuel cell.
  • the main purpose is to realize.
  • the present inventors have intensively studied a method for increasing the reaction efficiency between the enzyme on the electrode and the reaction substrate.
  • the electrostatic interaction between the enzyme and the reaction substrate and the parent By paying attention to the hydrophobic interaction, etc., the compatibility between the enzyme and the reaction substrate was artificially increased, and the present invention was completed.
  • an electrode in which an oxidation-reduction reaction proceeds using an enzyme as a catalyst Modified to increase affinity with reaction substrate or electron transfer mediator and / or reaction rate by adding or inserting at least one codon encoding a predetermined amino acid residue into the base sequence encoding the enzyme.
  • An enzyme electrode having the immobilized enzyme immobilized thereon is provided.
  • the enzyme modification method comprises adding or inserting at least one codon encoding a predetermined amino acid residue into a base sequence encoding the enzyme, thereby allowing affinity and / or reaction with a reaction substrate or electron transfer mediator.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method for increasing the speed.
  • the affinity with the reaction substrate or the electron transfer mediator and / or the reaction rate may be increased by utilizing electrostatic interaction. it can.
  • the amino acid residue is not particularly limited.
  • an amino acid residue having a charge opposite to that of the reaction substrate or the electron transfer mediator can be used.
  • the specific types of the electron transfer mediator and amino acid residue in this case are not particularly limited.
  • the mediator in which the oxidized form or the reduced form is an anion is used as the electron transfer mediator, the amino acid residue is It is also possible to select from lysine residues, histidine residues and arginine residues.
  • the enzyme modification method may be a method of increasing affinity and / or reaction rate with the reaction substrate or electron transfer mediator by utilizing hydrophilic or hydrophobic interaction.
  • enzyme modification used in the present invention refers to the reaction substrate or electron transfer mediator without changing the function of the enzyme protein by adding or inserting one or several codons encoding amino acid residues. It means changing properties such as affinity and / or reaction rate, or stability.
  • FIG. 3 is a drawing-substituting graph showing the results of the DNA sequence of Lys6 gene in Example 1.
  • FIG. 3 is a drawing-substituting graph showing the results of the DNA sequence of Lys8 gene in Example 1.
  • FIG. 3 is a drawing-substituting graph showing the results of the DNA sequence of Lys10 gene in Example 1.
  • the enzyme electrode according to the present invention is an electrode in which an oxidation-reduction reaction proceeds using an enzyme as a catalyst, and an enzyme modified so as to increase the affinity and / or reaction rate with a reaction substrate or an electron transfer mediator is immobilized. Electrode.
  • the enzyme is modified by adding or inserting at least one codon encoding a predetermined amino acid residue into the base sequence encoding the enzyme.
  • modification refers to affinity and / or reaction rate with a reaction substrate or electron transfer mediator by adding or inserting at least one predetermined amino acid residue without changing the properties as an enzyme. Means to raise.
  • a codon encoding an amino acid residue having a charge opposite to that of a reaction substrate or an electron transfer mediator to be used is added to the enzyme.
  • a codon encoding an amino acid residue having a charge opposite to that of a reaction substrate or an electron transfer mediator to be used is added to the enzyme.
  • a codon encoding an amino acid residue having a positive charge is used.
  • a reaction substrate or electron transfer mediator having a positive charge By adding or inserting a codon encoding an amino acid residue having a negative charge into the base sequence encoding the enzyme, the affinity of the expressed enzyme with the reaction substrate or electron transfer mediator and / or the reaction rate is increased. realizable.
  • the enzyme can be immobilized on the electrode using electrostatic action, The electrode can be stabilized.
  • positively charged amino acid residues examples include lysine residues, histidine residues, and arginine residues, and these can be used alone or in combination of two or more.
  • lysine residues are particularly preferred.
  • a method using poly-L-lysine is employed, but by adding or inserting a codon encoding a lysine residue into the base sequence encoding the enzyme.
  • an effect that the enzyme can be immobilized on the electrode without using poly-L-lysine is also produced, which leads to cost reduction of the poly-L-lysine material.
  • Examples of the negatively charged amino acid residues include aspartic acid residues and glutamic acid residues, and these can be used alone or in combination of two or more.
  • Electron transfer mediators that can be used when utilizing hydrophilic or hydrophobic interactions are not particularly limited.
  • hydrophilic electron transfer mediators include cyano metals such as hexacyanoferrate ions and octacyanotungstate ions.
  • LogP which is a new oil / hydrophilic parameter, such as Q0, 2,2'-azinobis (3-ethylbenzoline-6-sulfonate), which is a complex or quinone
  • Examples of hydrophobic electron transfer mediators that have a LogP value greater than 0, such as VK1, VK3, benzoquinone, and anthraquinone.
  • Hydrophobic amino acid residues are glycine residue, serine residue, threonine residue, cysteine residue, tyrosine residue, asparagine residue, glutamine residue, lysine residue, histidine residue, arginine residue, aspartic acid Residues and glutamic acid residues can be mentioned, and these can be used alone or in combination of two or more.
  • the kind of enzyme that can be immobilized on the enzyme electrode according to the present invention is not particularly limited, and any known enzyme can be freely selected.
  • an enzyme having oxidase activity using oxygen as a reaction substrate such as laccase, bilirubin oxidase (BOD), and ascorbate oxidase, can be immobilized.
  • the enzyme that can be immobilized when the enzyme electrode according to the present invention is used as a negative electrode is not particularly limited.
  • a substrate containing saccharide is used as a reaction substrate, an oxidase that oxidizes and decomposes saccharide is immobilized. Good.
  • oxidase examples include glucose dehydrogenase, gluconate 5 dehydrogenase, gluconate 2 dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde reductase, aldehyde dehydrogenase, lactate dehydrogenase, hydroxy parbate reductase, glycerate dehydrogenase, formate dehydrogenase, fructose dehydrogenase, galactose dehydrogenase, etc. Can be mentioned.
  • an electron transfer mediator may be immobilized on the enzyme electrode according to the present invention in order to smoothly transfer electrons generated by the oxidation-reduction reaction to the electrode.
  • the kind of electron transfer mediator that can be immobilized on the enzyme electrode according to the present invention is not particularly limited, and any known electron transfer mediator can be freely selected.
  • ABTS 2,2′-azinobis (3-ethylbenzoline-6-sulfonate)
  • K 3 [Fe (CN) 6 ] and the like are used as electron transfer mediators. It is possible to immobilize.
  • Naphthoquinone ANQ
  • 2-amino-3-methyl-1,4-naphthoquinone ANQ
  • 2,3-diamino-1,4-naphthoquinone osmium (Os), ruthenium (Ru), iron (Fe), Immobilizing metal complexes such as cobalt (Co), viologen compounds such as benzyl viologen, compounds having a quinone skeleton, compounds having a nicotinamide structure, compounds having a riboflavin structure, compounds having a nucleotide-phosphate structure, etc. Is possible.
  • the fuel cell according to the present invention is a fuel cell in which an oxidation-reduction reaction proceeds on an electrode using an enzyme as a catalyst, and has an affinity for a reaction substrate or an electron transfer mediator and / or on at least one of a positive electrode and a negative electrode.
  • a fuel cell in which an enzyme modified so as to increase the reaction rate is immobilized.
  • the structure and functions other than the electrode of the fuel cell according to the present invention are not particularly limited, and can be freely designed as long as the enzyme electrode according to the present invention is used.
  • the fuel cell according to the present invention can obtain a large output current and voltage and has excellent durability, it can be suitably used for all known electronic devices.
  • the structure, function, and the like are not particularly limited, and include all devices that operate electrically.
  • mobile devices such as mobile phones, mobile devices, robots, personal computers, game devices, in-vehicle devices, household electrical appliances, industrial products, automobiles, motorcycles, aircraft, rockets, spacecrafts, etc.
  • Power generation systems medical devices such as power supplies for in-vivo devices including biosensors, power generation systems such as systems that disassemble garbage and generate electrical energy, and cogeneration systems.
  • Example 1 in order to modify an enzyme that can be immobilized on the enzyme electrode according to the present invention, a gene was prepared in which a codon encoding a predetermined amino acid residue was incorporated into a base sequence encoding the enzyme.
  • BOD bilirubin oxidase
  • a lysine residue is used as an amino acid residue
  • a lysine residue at the end of BOD was prepared.
  • Lys4-BOD gene In a competent cell of pMAD11, the Lys4-BOD gene, Lys6-BOD gene, Lys8-BOD gene, and Lys10-BOD gene excised with the restriction enzyme Asc1 were transformed into yeast Pichia Methanolica, respectively. This was developed in MD medium, and two colonies were obtained for each.
  • Example 2 it was confirmed that the modified protein expressed from the gene in which the lysine residue was incorporated at the end of the base sequence encoding BOD maintained the BOD activity.
  • the enzyme electrode according to the present invention since the oxidation-reduction reaction on the electrode proceeds with high efficiency, it is possible to realize high output of the obtained electric energy. Therefore, it can be suitably used for any fuel cell, biosensor, and electronic device.
  • the enzyme electrode according to the present invention has high stability of the electrode itself, if the enzyme electrode is used in a fuel cell, a biosensor, or an electronic device, a highly durable fuel cell, biosensor, or electronic device is provided. It becomes possible to do.

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Abstract

　酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、前記酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された酵素電極を提供する。該酵素電極は、電極上での酸化還元反応が高効率で進行するため、得られる電気エネルギーの高出力化が実現できる。そのため、そのため、あらゆる燃料電池やバイオセンサー、電子機器に好適に用いることができる。

Description

新規な酵素電極及び該酵素電極を用いた燃料電池
　本発明は、酵素電極に関する。より詳しくは、酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、高出力化を実現させるために改良された酵素電極、及び該酵素電極を用いて高出力化が実現し得る燃料電池に関する。
　近年、負極又は正極の少なくとも一方の電極上に触媒として酸化還元酵素を固定した燃料電池（以下、「バイオ燃料電池」という。）は、例えばグルコース及びエタノールのように通常の工業触媒では反応が困難な燃料から、効率よく電子を取り出すことができるため、高容量でかつ安全性が高い次世代の燃料電池として注目されている。
　図５を用いて、一般的なバイオ燃料電池の反応スキームを説明する。図５に示すグルコースを燃料とするバイオ燃料電池においては、負極でグルコース（Glucose）の酸化反応が進行し（図５（ａ））、正極で大気中の酸素（Ｏ２）の還元反応が進行する（図５（ｂ））。
　電子の流れを詳しく説明すると、負極では、グルコース（Glucose）、グルコース脱水素酵素（Glucose Dehydrogenase）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋；Nicotinamide Adenine Dinucleotide）、ジアホラーゼ（Diaphorase）、電子伝達メディエータ、電極（カーボン）の順に電子が受け渡される。
　一方、正極では、負極から放出された電子が、電極（カーボン）、電子伝達メディエータ、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）の順に受け渡され、該電子と外部から供給される酸素を用いて還元反応が進行することにより電気エネルギーを発生させる。
　このようなバイオ燃料電池は、安全性が高い燃料電池として注目されている一方で、他の燃料電池に比べて出力が小さいという問題点がある。そこで、最近では、高出力のバイオ燃料電池を得るための検討がなされている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
　例えば、特許文献１に記載のバイオ燃料電池では、電極を多孔質構造の導電性部材（金属、導電性高分子、金属酸化物、炭素材料等）で構成し、その孔内に酵素や電子伝達メディエータ等を固定することにより、実効面積あたりの酵素担持密度を高めて、電流密度の向上を図っている。
　特許文献２に記載のバイオ燃料電池では、カソード電極をカーボンなどの多孔質材料に酵素及び電子伝達メディエータを固定したものにより構成し、このカソード電極の少なくとも一部が気相の反応基質となる空気又は酸素と接触するようにすることで、優れた電極特性を充分に発揮できるように工夫している。
　このように電極の構造を工夫して高出力化を実現する技術の他に、電極に固定する酵素自体を工夫することにより、バイオ燃料電池の高出力化を達成させる技術がある。例えば、特許文献３では、デヒドロゲナーゼとジアフォラーゼ等を融合させたタンパク質を作製し、該融合タンパク質を負極に固定することにより、基質から電極までの電子伝達反応を効率的に進行させて、バイオ燃料電池の高出力化を実現させる技術が開示されている。
　また、特許文献４には、異なる２種以上の酵素タンパク質を会合させた会合タンパク質を電極に固定化することにより、該会合タンパク質を構成する２種の酵素タンパク質の相対的距離が接近しているため、基質から電極までの電子伝達反応を効率的に進行させて、バイオ燃料電池の高出力化を実現させる技術が開示されている。
　ところで、バイオ燃料電池の高出力化のためには、電極に固定化する酵素と反応基質（特に、電子伝達メディエータ）との反応効率を向上させることが必要である。酵素と反応基質との反応は、親和性（Ｋｍ）と反応速度（ｋcat）で表されるが、これら２つのパラメータは酵素と反応基質との組み合わせにより決定されるため、相性のよい酵素と反応基質（特に、電子伝達メディエータ）を探索する必要がある。
　しかし、バイオ燃料電池の高出力化のためには、電子伝達メディエータ等によって決定される電位を高く保ちつつ、高電流を得る必要性があるため、酵素と反応基質との組み合わせは限られており、その出力値にも限界があるのが現状である。
特開２００６－２３４７８８号公報。 特開２００６－９３０９０号公報。 特開２００７－１６３１８５号公報。 特開２００７－１６３２６８号公報。
　前記の通り、バイオ燃料電池の高出力化を実現する技術は様々な方向から開発されつつあるが、電気エネルギーを得るためのバイオ燃料電池の基本的原理は、電極上での酸化還元反応に基づくものであり、電極上の酵素と反応基質との反応効率を上昇させなければ、根本的解決にはならない。
　そこで、本発明では、バイオ燃料電池の電極に固定化する酵素と反応基質との相性を、人為的に上昇させることにより、電極上の反応効率を上昇させ、ひいては、バイオ燃料電池の高出力化を実現することを主目的とする。
　本願発明者らは、前記目的を解決するために、電極上の酵素と反応基質との反応効率を上昇させるための方法を鋭意研究した結果、酵素と反応基質間の静電的相互作用及び親疎水的相互作用等に着目することにより、酵素と反応基質との相性を人為的に上昇させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
　本発明では、まず、酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、
　前記酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された酵素電極を提供する。
　前記酵素の改変方法は、前記酵素をコードする塩基配列に所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高める方法であれば、その方法は特に限定されないが、例えば、静電的相互作用を利用することにより前記反応基質又は前記電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を上昇させることができる。
　前記アミノ酸残基は特に限定されないが、例えば、前記反応基質又は前記電子伝達メディエータと相反する電荷を有するアミノ酸残基を用いることができる。
　この場合の前記電子伝達メディエータ及びアミノ酸残基の具体的な種類も特に限定されないが、例えば、前記電子伝達メディエータとして、酸化体もしくは還元体がアニオンであるメディエータを用いた場合、前記アミノ酸残基はリジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基の中から選択することも可能である。
　また、前記酵素の改変方法は、親水性又は疎水性相互作用を利用することにより、前記反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を上昇させる方法を用いることも可能である。
　この場合、前記反応基質又は前記電子伝達メディエータが親水性物質の場合には、前記アミノ酸残基には親水性アミノ酸を用い、前記反応基質又は前記電子伝達メディエータが疎水性物質の場合には、前記アミノ酸には疎水性アミノ酸を用いることで親和性及び／又は反応速度の上昇が実現できる。
　本発明では、次に、電極上で酵素を触媒として酸化還元反応が進行する燃料電池であって、正極又は負極の少なくとも一方の電極上に、前記酵素をコードする塩基配列に所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された燃料電池を提供する。
　ここで本発明で用いる技術用語を説明する。
　本発明で用いる「酵素の改変」とは、アミノ酸残基をコードするコドンの１若しくは数個を付加若しくは挿入することによって、酵素タンパク質の機能を変化させることなく、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度、若しくは安定性などの性質を変化させることを意味する。
　本発明に係る酵素電極は、電極上での酸化還元反応が高効率で進行するため、得られる電気エネルギーの高出力化が実現できる。
実施例１におけるLys6遺伝子のＤＮＡシーケンスの結果を示す図面代用グラフである。 実施例１におけるLys8遺伝子のＤＮＡシーケンスの結果を示す図面代用グラフである。 実施例１におけるLys10遺伝子のＤＮＡシーケンスの結果を示す図面代用グラフである。 実施例２において、Lys6-BOD遺伝子、Lys8-BOD遺伝子、Lys10-BOD遺伝子から発現した酵素のＢＯＤ活性の有無を示す図面代用写真である。 一般的なバイオ燃料電池の反応スキームを示す概念図である。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　＜酵素電極＞
　本発明に係る酵素電極は、酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された電極である。
　前記酵素の改変は、該酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより行う。この場合の「改変」とは、酵素としての性質の変化を伴わず、所定のアミノ酸残基を少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を上昇させることをいう。
　前記酵素の改変方法は、該酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高める方法であれば、その具体的方法は特に限定されないが、例えば、静電的相互作用、親水性又は疎水性相互作用を利用することにより前記反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を上昇させることができる。
　静電的相互作用を利用した親和性及び／又は反応速度上昇の具体的方法としては、例えば、用いる反応基質又は電子伝達メディエータと相反する電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンを、前記酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することで、固定化する酵素と反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度の上昇を実現させることができる。
　より具体的に説明すると、負電荷を有する反応基質又は電子伝達メディエータを用いる場合には正電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンを、正電荷を有する反応基質又は電子伝達メディエータを用いる場合には負電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンを、前記酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することにより、発現する酵素の反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度の上昇が実現できる。
　また、電荷を有するアミノ酸残基をコードするコドンを、前記酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することにより、静電的作用を利用した酵素の電極への固定化を行うことができ、酵素電極の安定化を図ることができる。
　更に、酵素の電極への固定化のために必要な材料を減らすこともでき、その結果、酵素電極の製造過程におけるコストの削減にも繋がる。
　静電的相互作用を利用する場合に用いることができる電子伝達メディエータは特に限定されないが、例えば、負電荷を有する電子伝達メディエータ（酸化体もしくは還元体がアニオンであるメディエータ）としては、ＡＢＴＳ(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))などの色素系、ヘキサシアノ鉄酸イオン、オクタシアノタングステン酸イオンなどのシアノ金属錯体等、正電荷を有する電子伝達メディエータ（酸化体もしくは還元体がカチオンであるメディエータ）としては、 [Os(trpy3)]3+/2+，[Os(py)2(bpy)2]3+/2+，[Fe(dpy)]3+/2+などのピリジン、ビピリジン等が配意した金属錯体を挙げることができる。
　正電荷を有するアミノ酸残基は、リジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基を挙げることができ、これらは、単独で用いても複数種を組み合わせて用いることも可能である。
　この中でも特に、リジン残基がより好適である。一般に、電極に酵素を固定する場合にポリ－Ｌ－リジンを用いて固定する方法が行われているが、リジン残基をコードするコドンを、酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することにより、ポリ－Ｌ－リジンを用いることなく電極に酵素を固定化できるという効果も生じ、ポリ－Ｌ－リジン材料のコスト削減にも繋がる。
　負電荷を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基を挙げることができ、これらは、単独で用いても複数種を組み合わせて用いることも可能である。
　親水性又は疎水性相互作用を利用した親和性向上の具体的方法としては、親水性の反応基質又は電子伝達メディエータを用いる場合には親水性のアミノ酸残基をコードするコドンを、疎水性の反応基質又は電子伝達メディエータを用いる場合には疎水性のアミノ酸残基をコードするコドンを、前記酵素をコードする塩基配列に付加若しくは挿入することにより、発現する酵素の反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度の上昇が実現できる。
　親水性又は疎水性相互作用を利用する場合に用いることができる電子伝達メディエータは特に限定されないが、例えば、親水性の電子伝達メディエータとしては、ヘキサシアノ鉄酸イオン、オクタシアノタングステン酸イオンなどのシアノ金属錯体もしくはキノン系であるＱ０、2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate)などの色素系などの一般的に新油性/親水性のパラメータであるLogP値が０より小さいものが上げられる。まだ疎水性の電子伝達メディエータとしては、ＶＫ１、ＶＫ３、ベンゾキノン、アントラキノンなどLogP値が０より大きいものを挙げることができる。
　親水性のアミノ酸残基は、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基を挙げることができ、これらは、単独で用いても複数種を組み合わせて用いることも可能である。
　疎水性のアミノ酸残基は、グリシン残基、セリン残基、トレオニン残基、システイン残基、チロシン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基を挙げることができ、これらは、単独で用いても複数種を組み合わせて選択することも可能である。
　本発明に係る酵素電極に固定化し得る酵素の種類は特に限定されず、公知のあらゆる酵素を自由に選択することができる。例えば、本発明に係る酵素電極を正極として用いる場合、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸素を反応基質とするオキシダーゼ活性を有する酵素を固定化することができる。
　また、本発明に係る酵素電極を負極として用いる場合に固定化し得る酵素も特に限定されないが、例えば、反応基質として糖類を含む基質を用いる場合には、糖類を酸化分解する酸化酵素を固定化するとよい。酸化酵素の一例としては、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコネート５デヒドロゲナーゼ、グルコネート２デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシパルベートレダクターゼ、グリセレートデヒドロゲナーゼ、フォルメートデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
　また、本発明に係る酵素電極を負極として用いる場合には、上記の酸化酵素に加え、酸化型補酵素および補酵素酸化酵素を固定化してもよい。酸化型補酵素としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP＋）フラビンアデニンジヌクレオチド（flavin adenine dinucleotide；FAD＋）、ピロロキノリンキノン（pyrrollo-quinoline quinone；PQQ2＋）などが挙げられる。補酵素酸化酵素としては、例えば、ジアフォラーゼが挙げられる。
　更に、本発明に係る酵素電極には、酸化還元反応により発生した電子の電極への受け渡しをスムーズにするために、電子伝達メディエータを固定化してもよい。本発明に係る酵素電極に固定化し得る電子伝達メディエータ種類は特に限定されず、公知のあらゆる電子伝達メディエータを自由に選択することができる。例えば、本発明に係る酵素電極を正極として用いる場合は、電子伝達メディエータとして、ＡＢＴＳ(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))、K3[Fe(CN)6]などを固定化することが可能である。
　また、例えば、本発明に係る酵素電極を負極として用いる場合には、電子伝達メディエータとして、２－アミノ－３－カルボキシ－１，４－ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ビタミンＫ３、２－アミノ－１，４－ナフトキノン（ＡＮＱ）、２－アミノ－３－メチル－１，４－ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２、３－ジアミノ－１，４－ナフトキノン、オスミウム（Ｏｓ）、ルテニウム（Ｒｕ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）などの金属錯体、ベンジルビオローゲンなどのビオローゲン化合物、キノン骨格を有する化合物、ニコチンアミド構造を有する化合物、リボフラビン構造を有する化合物、ヌクレオチド－リン酸構造を有する化合物などを固定化することが可能である。
　なお、本発明に係る酵素電極に用いる材料は公知のあらゆる素材を用いることができ、外部と電気的に接続可能な素材であれば特に限定されず、例えば、Pt、Ag、Au、Ru、Rh、Os、Nb、Mo、In、Ir、Zn、Mn、Fe、Co、Ti、V、Cr、Pd、Re、Ta、W、Zr、Ge、Hfなどの金属、アルメル、真ちゅう、ジュラルミン、青銅、ニッケリン、白金ロジウム、ハイパーコ、パーマロイ、パーメンダー、洋銀、リン青銅などの合金類、ポリアセチレン類などの導電性高分子、グラファイト、カーボンブラックなどの炭素材、HfB2、NbB、CrB2、B4Cなどのホウ化物、TiN、ZrNなどの窒化物、VSi2、NbSi2、MoSi2、TaSi2などのケイ化物、及びこれらの合材等を用いることができる。
　＜燃料電池＞
　本発明に係る燃料電池は、電極上で酵素を触媒として酸化還元反応が進行する燃料電池であって、正極又は負極の少なくとも一方の電極上に、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定化された燃料電池である。
　前記酵素の改変は、該酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより行う。なお、本発明に係る燃料電池の電極の詳細は、前述した酵素電極の詳細と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　本発明に係る燃料電池の電極以外の構造、機能などは特に限定されず、本発明に係る酵素電極を少なくとも用いていれば、自由に設計することができる。
　本発明に係る燃料電池の電極上では、酸化還元反応が高効率で進行するため、得られる電気エネルギーの高出力化が実現できる。また、電極自体の安定性が高いため、耐久性の優れた燃料電池を提供できる。
　＜電子機器＞
　本発明に係る燃料電池は、大きな出力電流及び電圧を得ることができるとともに、耐久性が優れているため、公知のあらゆる電子機器に好適に用いることができる。
　該電子機器は、本発明に係る燃料電池を少なくとも使用できるものであれば、構造、機能等は特に限定されず、電気的に作動する機器を全て含有する。例えば、携帯電話、モバイル機器、ロボット、パーソナルコンピューター、ゲーム機器、車載機器、家庭電気製品、工業製品等の電子機器、自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船等の移動体、検査機器、ペースメーカー用の電源、バイオセンサーを含む生体内機器の電源等の医療機器、生ごみを分解し電気エネルギーを発電させるシステム等の発電システムおよびコジェネレーションシステム、等を挙げることができる。
　実施例１では、本発明に係る酵素電極に固定化し得る酵素の改変を行うために、酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを組み込んだ遺伝子を作成した。
　具体的には、本発明に係る酵素電極に固定化し得る酵素の一例としてビリルビンオキシダーゼ（以下「ＢＯＤ」と称する。）を用い、アミノ酸残基としてリジン残基を用い、ＢＯＤの末端にリジン残基を組み込んだ遺伝子を作製した。
　まず、ＢＯＤ遺伝子のベクターとして、表１に示すように、リジン残基をそれぞれ４、６、８、１０つ組み込んだpMETαBベクターLys4、Lys6、Lys8、Lys10、を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記で作製したpMETαBベクターLys４、Lys６、Lys８、Lys１０を用い、ＰＣＲ法にてＢＯＤ遺伝子を含む遺伝子（以下、「Lys4-BOD遺伝子」、「Lys6-BOD遺伝子」「Lys8-BOD遺伝子」「Lys10-BOD遺伝子」と称する。）を作製した。次にこれらの遺伝子（Lys4-BOD遺伝子、Lys6-BOD遺伝子、Lys8-BOD遺伝子、Lys10-BOD遺伝子）を、ライゲーションによりプラスミドへ取り込んだ。このプラスミドを大腸菌へトランスフォーメーションし、制限培地にて展開した。
　その結果、コントロール（プラスミドがないもの）、Lys4、Lys6、Lys8、Lys10についてそれぞれのコロニーを得た。それぞれについて、コロニーを拾い、SpeＩおよびEcoRIにて切断し、ゲル電気泳動を行うことで、目的ベクター（pMETαBベクターLys4、Lys6、Lys8、Lys10）がトランスフォーメーションされたかを確認した。
　続いて、Lys6、Lys8、Lys10の遺伝子それぞれについてＤＮＡシーケンスを行い、目的のLys配列を確認した。なお、ＤＮＡシーケンスの結果をそれぞれ図１～図３に示す（Lys6：図１、Lys8：図２、Lys10：図３）。
　実施例２では、実施例１で作製したプラスミドを、酵母Pichia Methanolicaへトランスフォーメーションすることにより、ＢＯＤ活性の有無の検討を行った。
　pMAD11のコンピテントセルに、制限酵素Asc1にて切り出したLys4-BOD遺伝子、Lys6-BOD遺伝子、Lys8-BOD遺伝子、Lys10-BOD遺伝子をそれぞれ酵母Pichia Methanolicaへトランスフォーメーションした。これを、ＭＤ培地に展開し、それぞれについてコロニーを２つずつ得た。
　これらのコロニーをＢＭＤＹで培養し、さらにＢＭＭＹに移すことでＢＯＤの発現誘導を行った。この溶液にＡＢＴＳ(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))を加え、緑色に呈色する様子を観察することで、ＢＯＤ活性があるかについて発現チェックを行った。それぞれの結果を図４に示す。なお、図４中符号ＤＭ１及びＤＭ２は、リジン残基を組み込んでいないＢＯＤを示す。
　図４に示す通り、全ての酵素についてＢＯＤ活性を有することが確認できた。従って、実施例２では、ＢＯＤをコードする塩基配列の末端にリジン残基を組み込んだ遺伝子から発現した改変タンパクが、ＢＯＤ活性を維持していることが確認できた。
　本発明に係る酵素電極は、電極上での酸化還元反応が高効率で進行するため、得られる電気エネルギーの高出力化が実現できる。そのため、あらゆる燃料電池やバイオセンサー、電子機器に好適に用いることができる。
　また、本発明に係る酵素電極は、電極自体の安定性が高いため、該酵素電極を燃料電池やバイオセンサー、電子機器に用いれば、耐久性の優れた燃料電池やバイオセンサー、電子機器を提供することが可能となる。
　更に、本発明に係る酵素電極は、電極への酵素固定化のために必要な材料を軽減することができるため、酵素電極自体、及び、該酵素電極を用いた燃料電池、バイオセンサー、電子機器等の製造コストの削減にも貢献できる。

Claims (8)

  1. 　酵素を触媒として酸化還元反応が進行する電極であって、
    　前記酵素をコードする塩基配列に、所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された酵素電極。
  2. 　前記酵素は、静電的相互作用により前記反応基質又は前記電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度が高められている請求項１記載の酵素電極。
  3. 　前記アミノ酸残基は、前記反応基質又は電子伝達メディエータと相反する電荷を有する請求項１又は２記載の酵素電極。
  4. 　前記電子伝達メディエータは、酸化体もしくは還元体がアニオンであるメディエータであり、前記アミノ酸残基はリジン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基の中から選択されるいずれか一のアミノ酸である請求項３記載の酵素電極。
  5. 　前記酵素は、親水性又は疎水性相互作用により前記反応基質又は前記電子伝達メディエータとの親和性が高められている請求項１記載の酵素電極。
  6. 　前記反応基質又は前記電子伝達メディエータは親水性物質であり、前記アミノ酸は親水性アミノ酸である請求項５記載の酵素電極。
  7. 　前記反応基質又は前記電子伝達メディエータは疎水性物質であり、前記アミノ酸は疎水性アミノ酸である請求項５記載の酵素電極。
  8. 　電極上で酵素を触媒として酸化還元反応が進行する燃料電池であって、
    　正極又は負極の少なくとも一方の電極上に、前記酵素をコードする塩基配列に所定のアミノ酸残基をコードするコドンを少なくとも一つ以上付加若しくは挿入することにより、反応基質又は電子伝達メディエータとの親和性及び／又は反応速度を高めるように改変された酵素が固定された燃料電池。
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