WO2009134104A4 - 다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서 및 그의 제조방법 - Google Patents

다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서 및 그의 제조방법 Download PDF

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WO2009134104A4
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장승현
고영대
박재현
양진석
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Definitions

  • the present invention relates to a biosensor for detecting an immune protein using porous silicon and a method for producing the same, and more particularly, to a biosensor for detecting an immune protein by stabilizing a surface of an electrochemically etched porous silicon,
  • the present invention relates to a biosensor effective for detecting an immunological protein by using porous silicon having mesoporous pores and a method for producing the same.
  • porous silicon has been attracting attention as a sensor capable of detecting various analytes.
  • Such porous silicon can be obtained as a single layer and a multi-layer structure having nano-sized pores and nanoparticles on the surface of a silicon wafer through electrochemical corrosion by a silicon wafer as a semiconductor material.
  • Porous silicon (PSi) has been attracting attention as a sensor capable of detecting various analytes in recent years due to the possibility of developing a sensor using such an optical property.
  • fringe patterns can be generated and analyzed by the Bragg equation.
  • the porous silicon layer is stacked as a multilayer instead of a single layer, the optical characteristics of the multilayer porous silicon can be confirmed by the Bragg equation as a phenomenon of reflected light interference.
  • Bragg equation is as follows.
  • n 1 and n 2 are refractive indices
  • L 1 and L 2 are optical thicknesses of the layer
  • the porous silicon has a high surface area (several hundreds m < 2 > / cm < 3 >) and has two unique optical properties, photoluminescence or optical reflection, which allow the analyte to be in a large concentration at relatively narrow points And can change from recognition phenomena to quantitative signals.
  • porous silicon produced by an electrochemical process has a surface of Si-H, which is unstable in air or in aqueous solution and has been limited in subsequent application processes.
  • porous silicon is used as a biosensor for detecting an immune protein.
  • Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing a biosensor for detecting an immune protein using porous silicon, which is prepared to stabilize the surface of the electrochemically etched porous silicon and to be suitable for detecting immunological proteins.
  • the present invention provides a method of manufacturing a semiconductor device, comprising: thermally oxidizing a surface of porous silicon produced by an electrochemical etching method to induce an amine derivative on the surface thereof;
  • the present invention also provides a biosensor for detecting an immune protein using optical reflection of an incident light source.
  • the biosensor for detecting an immune protein of the present invention is characterized by using porous silicon prepared to stabilize the surface of electrochemically etched porous silicon and to be suitable for detecting immunological proteins.
  • the porous silicon used in the biosensor of the first aspect of the present invention is a single-layer porous silicon which is electrochemically asymmetrically etched by flowing a constant current.
  • the porous silicon used in the biosensor of the second aspect of the present invention uses multilayer porous silicon electrochemically etched using a sine wave current, and has a center current value of 150 to 250 mA / cm 2 And electrochemically etched using a sinusoidal current with a period of 1 to 200 seconds to have a rugate single peak at 400 to 2000 nm.
  • the porous silicon used in the biosensor of the third aspect of the present invention is electrochemically etched using a mixed current of 2 to 30 sinusoidal waveforms at a center current value of 120 to 200 mA / Porous silicon with 2 to 30 rugate multiple peaks is used.
  • the biosensor of the fourth aspect of the present invention is a biosensor comprising porous silicon particles obtained by ultrasonic pulverization so as to maintain the optical characteristics of the porous silicon used in the biosensor for detecting immunological proteins according to the first to third aspects, will be.
  • the porous silicon used in the biosensor of the first to fourth aspects of the present invention has a mesoporous pore size of 2 to 50 nm.
  • the method for manufacturing an immunochemical protein detecting biosensor comprises the steps of 1) preparing porous silicon by an electrochemical etching method, 2) separating the porous silicon at a temperature of 300 to 1,200 ° C, Forming a porous silicon film whose surface is oxidized for 60 minutes; 3) inducing an amine derivative on the surface of the oxidized porous silicon, and then forming a sensing recognition body capable of recognizing the biomolecule at the end of the amine derivative And 4) a step of entering a light source into the porous silicon, and detecting an immune protein using the optical reflection of the incident light source.
  • a method of manufacturing a biosensor for detecting an immune protein comprises the steps of 1) etching a silicon wafer by an electrochemical method to prepare a multilayer porous silicon having a single reflection peak or multiple reflection peaks at 400 to 2,000 nm, ) Separating the porous silicon from the silicon wafer into a porous silicon film, 3) heating the porous silicon film at a temperature of 300 to 1,200 ° C for 1 to 3 hours to form a porous silicon film whose surface is oxidized, 4) pulverizing the oxidized porous silicon film; 5) inducing an amine derivative on the surface of the pulverized porous silicon particles, and then forming a sensing recognition body capable of recognizing the biomolecule at the end of the amine derivative, A step of fixing an adult silanol compound, and 6) a step of introducing a light source into the porous silicon particles, And detecting the immune protein by optical reflection behavior.
  • the porous silicon produced in step 1) is made of mesoporous porous silicon having a size of 2 to 50 nm.
  • the porous silicon used in the present invention includes monolayer porous silicon produced by electrochemically asymmetric etching using a constant current and multilayer porous silicon produced using a sine wave current.
  • the preferred multilayer porous silicon used in the present invention is a multi-layer porous silicon which is electrochemically etched using a sinusoidal current with a center current value of 150 to 250 mA / cm 2 and a period of 1 to 200 seconds to produce a single reflection peak at 400 to 2000 nm Single Peak) or electrochemically etched using a mixed current of 2 to 30 sinusoidal waveforms at a center current value of 120 to 200 mA / cm < 2 > Porous multi-porous silicon with multiple reflection peaks.
  • the method of manufacturing a biosensor for detecting an immune protein of the present invention comprises thermally oxidizing a porous silicon surface having a surface of Si-H in an electrochemical etching process to cause instability in an air or an aqueous solution, inducing an amine derivative on the surface,
  • the porous silicon having a sensing recognition body capable of recognizing the biomaterial is fixed to the terminal of the amine derivative.
  • any one selected from biotin, a derivative thereof or protein A derivatized with biotin may be used as the detection recognition body, and any one selected from the group consisting of avidin, streptavidin, antibody IgG and protein-A Immune proteins can be detected.
  • the light source used in the method of manufacturing a biosensor of the present invention is selected from a tungsten-halogen lamp, an LED (Light Emitting Diode) or a laser.
  • the electrochemically etched porous silicon has a surface of Si-H, which is thermally oxidized in an air or an aqueous solution to induce an amine derivative on its surface, Sensor can be provided.
  • the present invention by pulverizing porous silicon particles to maintain the optical characteristics of the electrochemically etched porous silicon and not to damage the pores, and by functionalizing and derivatizing the oxidized surface of the porous silicon particles, It is possible to provide a biosensor using particles.
  • the biosensor capable of multi-sensing with one signal and improved selectivity of the sensor can be provided by the characteristics of simultaneously realizing the light reflectivity and the photo-luminescence of the porous silicon particles.
  • the biosensor of the present invention uses mesoporous porous silicon having a size of 2 to 50 nm to stabilize the surface of the biosensor and to be suitable for immuno-protein detection, thereby providing an antibody IgG which is a cause of immune diseases, chronic infections, , Protein-A, avidin, and streptavidin.
  • biotin-induced porous silicon it can be utilized in an antigen-antibody immune system due to binding between biotin-immunoprotein proteins.
  • Fig. 1 shows a monolayer porous silicon fabricated by asymmetric etching electrochemically as a biosensor according to a first aspect of the present invention.
  • FIG. 3 shows the change in effective optical thickness of the biosensor of the first embodiment of the present invention with respect to the biomaterial.
  • Fig. 4 shows the form of the biosensor of the first embodiment using the optically encoded monolayer porous silicon of the present invention.
  • FIG. 5 is a SEM measurement result of the surface of the porous silicon luge used in the biosensor of the second aspect of the present invention.
  • FIG. 6 is an optical reflection spectrum before and after the reaction for biomaterial detection of the biosensor of the second aspect of the present invention.
  • Fig. 7 is a light reflection spectrum of the luge porous silicon used in the biosensor of the third aspect of the present invention.
  • FIG. 9 is an optical reflection spectrum before and after the reaction for biomaterial detection of the biosensor of the third aspect of the present invention.
  • FIG. 10 shows a manufacturing process of the biosensor according to the fourth aspect of the present invention.
  • Fig. 11 shows a DBR porous silicon film which reflects various colors in a visible light region used in a biosensor for detecting an immune protein according to a fourth aspect of the present invention.
  • FIG. 12 is a DBR porous silicon particle obtained by subjecting the DBR porous silicon film of Fig. 11 to ultrasonic pulverization.
  • FIG. 13 shows a photoluminescence spectrum (solid line) and a reflection spectrum (dotted line) of the biosensor for detecting an immune protein according to the fourth aspect of the present invention, wherein the biosensor is photographed from a white light source It shows one photograph.
  • SEM scanning electron microscope
  • Fig. 15 is a light reflection spectrum of the porous silicon particles derivatized with biotin and silol of the present invention, measured according to the production steps.
  • 16 is a light reflection spectrum when streptavidin is flowed into a biosensor using porous silicon derivatized with biotin and silol of the present invention.
  • 17 is a light reflection spectrum when avidin is flowed into a biosensor using porous silicon derivatized with biotin and silol of the present invention.
  • the present invention provides a biosensor for detecting an immune protein by stabilizing an electrochemically etched porous silicon surface and using porous silicon having mesoporous pores.
  • the biosensor for detecting an immune protein of the present invention is a biosensor for detecting an immune protein, which comprises thermally oxidizing the surface of the electrochemically etched porous silicon, inducing an amine derivative on the surface thereof, And the porous silicon produced by fixing the sensing recognition body.
  • a light source having a wavelength of 400 to 2000 nm is incident on the porous silicon surface of the present invention, and the detection of the immune protein is performed through a short wavelength or a long wavelength shift of the reflection spectrum through optical reflection of the incident light. do.
  • the shift of the reflection spectrum is caused by the change of the refractive index in the porous silicon pores according to the Bragg equation, and the reflection wavelength is shifted.
  • the biosensor of the present invention increases the detection efficiency by improving the sensitivity and detection speed by increasing the selectivity with the immune protein by functionalizing and derivatizing the surface of the porous silicon having the mesoporous pores.
  • the pore shape, size, and orientation of the porous silicon used in the immunosuppressive biosensor of the present invention depend on the surface resistance, the degree of impurity of the crystalline silicon, the flow current, the temperature, and the concentration of the HF solution used in etching.
  • the porous silicon used in the present invention preferably has mesoporous pores having a size of 2 to 50 nm. At this time, if the pore size is less than 2 nm and the micropores have a pore size of more than 50 nm, it can not be used for the detection of avidin having a size of 56 ⁇ 50 ⁇ 40 ⁇ or streptavidin having a size of 54 ⁇ 58 ⁇ 48 ⁇ .
  • the biosensor for detecting an immune protein according to the first aspect of the present invention is manufactured by an electrochemical asymmetric etching method using a constant current and uses a monolayer porous silicon having a fringe peak pattern at 400 to 2000 nm, And detects the immune protein using the optical reflection of the incident light.
  • the optical characteristics of the monolayer porous silicon used in the present invention can be obtained as a reflection spectrum of a fringe peak pattern (wrinkle pattern) behaving according to the Bragg equation expressed by the following equation (2) when a light source is incident.
  • the reflected wave length depends on the refractive index n and the film thickness L. Further, since the thickness L is fixed when the porous silicon acts as a sensor, the reflected wave length is determined by the refractive index n.
  • the refractive index (n) and the film thickness (L) can be experimentally determined to determine the optical thickness of the multi-layer porous silicon and can be detected as the refractive index of the entire porous silicon changes due to the bonding of the biomaterial.
  • the effective optical thickness (EOT) could be measured.
  • the value obtained by dividing the wavelength of the m-th amplified reflection peak by half is the optical thickness, so that the optical effective thickness (EOT) Can be measured.
  • Fig. 4 shows the form of the biosensor of the first embodiment using the optically encoded monolayer porous silicon of the present invention. Therefore, the biosensor of the first aspect of the present invention can be used as an optional and simple biosensor by connecting an antigen capable of binding to various antibodies to the etched region.
  • the biosensor for detecting an immune protein uses multi-layer porous silicon electrochemically etched using a sine wave current,
  • the porous silicon used in the biosensor for detecting an immune protein of the second aspect is electrochemically etched using a sine wave current having a center current value of 150 to 250 mA / cm 2 and a cycle of 1 to 200 seconds , And luge porous silicon with a single reflection peak at 400 to 2000 nm ( Fig. 7 ). Further, a light source is incident on the above-mentioned luge porous silicon, and the detection is performed using the optical reflection of the incident light.
  • the lucent porous silicon used in the biosensor for detecting immunological proteins according to the second aspect of the present invention has a full-width at half-maximum (FWHM) of 15 nm, a very high light reflectance spectrum at 629 nm .
  • FWHM full-width at half-maximum
  • mesoporous pores having a size of 2 to 50 nm, more preferably 10 nm, can be confirmed ( Fig. 5 ).
  • immunological proteins were detected by confirming the long wavelength shift at the reflection wavelength of 18 nm in the reflection spectrum ( Fig. 6 ).
  • the biosensor for detecting an immune protein according to the third aspect of the present invention has a center current value of 120 to 200 mA / cm 2, electrochemically etched using a mixed current of 2 to 30 sinusoidal waves, Luge porous silicon with 2 to 30 multiple reflection peaks ( Fig. 7 ).
  • the multilayered porous silicon used in the biosensor for detecting an immune protein uses multilayer porous silicon electrochemically etched using a sine wave current at the time of etching, Can be synthesized.
  • A is the amplitude
  • f is the frequency (Hz)
  • t is the time
  • a center is the median of the waveform
  • a porous silicon with a luggate structure by controlling the sine waves and the etching conditions.
  • the advantage of the luggate porous silicon is that the sine wave is used to reflec- It is possible to predict in advance the reflection peak due to the canceling of the outgoing light and the constructive interference. Furthermore, several reflective peaks can be optically encoded to adjust the relative intensity at the desired wavelengths. Further, as a result of the SEM measurement on the surface of the luting multi-layer porous silicon used in the biosensor of the third aspect, mesoporous pores having a size of 2 to 50 nm, more preferably 15 nm, can be identified ( Fig. 8 ).
  • the biosensor for detecting an immune protein according to the third aspect of the present invention can detect various analyte materials in a short time by performing a multiplex assay of lucent multilayer porous silicon having multiple reflection peaks.
  • the biosensor for detecting an immune protein according to the fourth aspect of the present invention is characterized in that the optical characteristics of the porous silicon used in the biosensor for detecting immunological proteins according to the first to third aspects are maintained and the ultrasonic pulverized porous Silicon particles.
  • the porous silicon used in the biosensor for detecting an immune protein of the fourth aspect of the present invention has a single reflection peak by DBR (Distributed Bragg Reflector) or a porous reflection with a single reflection peak of Rugate at 400 to 2000 nm silicon; Or porous silicon having DBR multiple reflection peaks or lugar multiple reflection peaks that reflect only two or more, preferably 2 to 30, specific lights at 400-2000 nm.
  • DBR Distributed Bragg Reflector
  • DBR porous silicon particles using the porous silicon are specifically described in the embodiments of the present invention, it is to be understood that the porous silicon is not limited thereto.
  • FIG. 10 illustrates a manufacturing process of a biosensor for detecting an immune protein according to a fourth aspect of the present invention, which comprises etching a silicon wafer by an electrochemical method, separating the porous silicon from the silicon wafer to prepare a porous silicon film .
  • the separation method involves separating the porous silicon from the silicon wafer by pouring the porous silicon wafer on the glass plate with the tweezers.
  • Fig. 11 shows a porous silicon film reflecting various colors in a visible light region used in a biosensor for detecting an immune protein according to a fourth aspect of the present invention. Thereafter, the film is heated at 300 to 1200 DEG C for 1 to 3 hours to thermally oxidize the surface.
  • Layer porous silicon particle obtained by pulverizing the porous silicon film separated after the oxidation is advantageous in that the selectivity with respect to the fine molecules is increased by using the pulverized particle form.
  • the pulverization method using the ultrasonic wave may be used.
  • the multi-layer porous silicon particles obtained by the ultrasonic milling of the present invention are easily broken down due to the weak nano network structure and made into individual particles of various sizes.
  • FIG. 12 shows an example of porous silicon particles of various sizes obtained by ultrasonically pulverizing the porous silicon film of FIG. At this time, it is preferable that the pulverization size of the multi-layer porous silicon particles satisfies the size of several nano-sized particles at a few microns.
  • the present invention relates to a method for producing a porous silicon particle, which comprises the steps of inducing an oxidized surface of porous silicon particles to an amine derivative, fixing a sensing recognition body capable of recognizing a biomaterial at the terminal of the amine derivative and a photoluminescent silanol compound, To provide a biosensor in which a light source is incident on a particle and is realized by optical reflection behavior of the incident light source.
  • ⁇ max 607 nm
  • ⁇ max 607 nm
  • a biosensor using a porous silicon particle to which a sensing substance capable of recognizing a biomolecule and a photoluminescent silanol compound are simultaneously fixed can be used to confirm the immuno-protein detection behavior using light reflectivity,
  • the selectivity of the sensor can be improved. Therefore, the biosensor of the present invention simultaneously implements light reflectivity and photoluminescence, so that multiple sensing is possible with only one signal.
  • the porous silicon used in the biosensor according to the first to fourth embodiments of the present invention has a mesopore pore size of 2 to 50 nm.
  • the biosensor according to the first to fourth embodiments of the present invention is a sensing recognition body capable of recognizing a biomaterial, and any one selected from biotin, a derivative thereof or protein A derivatized with biotin is fixed.
  • biosensor using the biotin-induced porous silicon particles is useful for detecting any one of immune proteins selected from the group consisting of avidin, streptavidin, antibody IgG, and protein-A, which are immunologically bound to biotin.
  • the present invention provides a method of producing a biosensor for detecting an immune protein. More particularly, the method for producing an immunological protein-detecting biosensor according to the first to third aspects of the present invention comprises
  • the porous silicon produced in step 1) of the present invention includes monolayer porous silicon produced by electrochemically asymmetric etching using a constant current and multilayer porous silicon produced using a sine wave current.
  • the multi-layer porous silicon preferably has a luge porous silicon having a single peak at 400 to 2000 nm and a rugged porous silicon having a number of 2 to 30, more preferably 2 to 15 multiple reflection peaks at 400 to 2000 nm Peak). ≪ / RTI >
  • porous silicon used in the biosensor for detecting immune proteins of the first to third aspects of the present invention is used in the same manner, detailed description of the porous silicon will be omitted.
  • step 2) of the manufacturing method of the present invention since the porous silicon produced in the electrochemical etching process in step 1) has a surface of unstable Si-H in air or in an aqueous solution, the porous silicon is thermally oxidized, OH type.
  • the thermal oxidation process is performed at a temperature of 300 to 1200 ⁇ ⁇ for 1 to 60 minutes, more preferably in a furnace. If the heating temperature is less than 300 ° C, the oxidation reaction proceeds slowly, which is undesirable. If the heating temperature exceeds 1200 ° C, the oxidized porous silicon is unstable.
  • step 3) of the present invention the porous silicon surface is oxidized from Si-H to Si-OH in step 2), and then an amine derivative is induced on the surface thereof.
  • the amine derivative is a functional group linker for detecting a biological material, and it should be able to react with the Si-OH on the surface of the oxidized porous silicon, which is composed of a silane having an alkoxy group at one end, Is not particularly limited and can be used, and preferred examples thereof include any one selected from the group consisting of 3-aminopropyltrimethoxysilane, aminoalkyltrialkoxysilane, aminoalkyldialkoxysilane, and aminoalkylalkoxysilane .
  • an amine derivative is induced on the surface of the porous silicon, and then a sensing recognition body capable of recognizing the biomolecule is fixed to the end of the amine derivative.
  • the fixing method is to dissolve the biotin-containing compound in an organic solvent and then cool it. If necessary, a catalyst is added to the stirred solution, and then porous silicon to which an amine derivative is bound is added, followed by reaction at room temperature.
  • Biotin, a derivative thereof, or protein A derivatized with biotin may be used as the detection recognition body.
  • the object to be detected include antibodies IgG, protein-A, avidin and streptavidin, which cause immune diseases, chronic infections, And the like.
  • step 4) of the present invention the light source is incident on the porous silicon having pores of the mesoporous surface so as to be surface-stabilized in the step and suitable for immunoprotein detection, and the optical reflection of the incident light source is used to detect the immune protein .
  • the light source used in the present invention may be a tungsten-halogen lamp having a wavelength of 400 to 2000 nm or a white light source including a light emitting diode (LED) or laser having a wavelength corresponding to the reflection peak from each multi- use.
  • a tungsten-halogen lamp having a wavelength of 400 to 2000 nm
  • a white light source including a light emitting diode (LED) or laser having a wavelength corresponding to the reflection peak from each multi- use.
  • the present invention also provides a method for producing a biosensor for detecting an immunological protein according to the fourth aspect. More specifically, the present invention relates to a process for preparing a multi-layer porous silicon, comprising: 1) etching a silicon wafer by an electrochemical method to prepare a multilayer porous silicon having a single reflection peak or multiple reflection peaks at 400 to 2,000 nm,
  • a pure p + + - type silicon wafer (B doped, ⁇ 100>, 0.08-0.012 m cm) was electrochemically etched using a platinum electrode using a constant voltage (Galvanostat, Keithley 2420) To produce on-chip multi-encoded porous silicon.
  • a 48 wt% HF aqueous solution and ethanol were mixed at a ratio of 3: 1 v / v and used as an etching solvent for synthesizing porous silicon having a pore and depth of a uniform pattern.
  • the current was 60 mA ⁇ m -2 Lt; / RTI > for 20 seconds.
  • the solvent was purchased from Aldrich. All processes were performed in Teflon cells, and after etching, they were cleaned and dried using ethanol and argon gas.
  • the porous silicon obtained through the etching process in Step 1 has a surface of Si-H and is unstable in the air or in the aqueous solution
  • the porous silicon is heated at 300 ° C for one hour using an electric furnace (Thermolyne F6270-26 furnace equipped with controller) Lt; / RTI >
  • Step 3 Derivatization of the oxidized porous silicon surface
  • biotin tetrafluorophenyl ester 100 mg was dissolved in a solvent of N, N-dimethylformamide, and then triethylamine And the mixture was stirred at a high rate for 30 minutes. Porous silicon having an amine group prepared as described above was added to the above solution and reacted at room temperature for 12 hours. After completion of the reaction, the reaction product was washed with ethanol, dichloromethane, acetone, and then dried with nitrogen gas.
  • biotin tetrafluorophenyl ester was prepared by dissolving 2.5 g (10.22 mmol) of biotin in 200 ml of N, N-dimethylformamide at 70 ° C under argon, cooling, injecting 2.5 ml (20.5 mmol) , 4 g (15.25 mmol) of 2,3,5,6-tetrafluorophenyltrifluoroacetate were added. The reaction was allowed to proceed at room temperature for 30 minutes, and the solvent was removed under vacuum. At this time, the product was dissolved in 100 ml of ether and prepared by filtration.
  • Step 4 Detecting biomaterials
  • the porous silicon chip induced by the biotin was used to selectively detect biomolecules and used as a sensor for detecting an antibody IgG which is a cause of immune diseases, chronic infectious diseases and malabsorption syndrome in an immunochemical test.
  • Streptavidin, biotin-induced protein A and human IgG biomaterials were sequentially flowed at a flow rate of 0.8 ml / min while the porous silicon chip induced by biotin was immobilized on a flow cell. Respectively.
  • the FT-IR spectrum of the etched porous silicon confirmed the stretching vibration and bending vibration of Si-H at 2119 and 914 cm -1 .
  • the FT-IR spectrum of the thermally oxidized porous silicon heated in the furnace at 300 ° C for 1 hour reduces the peaks at 2085 to 2150 cm -1 in the stretching vibration region of Si-H, -H stretching vibration and bending vibration were observed at 2200 ⁇ 2250 and 877cm -1 , respectively.
  • the oscillation of Si-O-Si was confirmed to be strongly observed at 1000 to 1200 cm -1 , thereby confirming the oxidation of the porous silicon.
  • the biotin-derivatized porous silicon prepared in Example 1 was fixed in a flow cell, and phosphate buffer solution (PBS) was poured therein, and the original reflection wavelength was measured.
  • PBS phosphate buffer solution
  • a biased sensor chip to selectively detect unknown materials at one time by enlarging 9 etched regions of 2 mm in diameter to 2 ⁇ 2 cm 2 to create more etched regions in 4 inches .
  • FIG. 4 is a porous silicon optically encoded with asymmetric etching synthesized with different diameters, and each region has a different optical signal.
  • A has a diameter of 6 mm and has a size of 4 inches and 51 areas
  • B has a diameter of 2 mm and has 294 areas etched.
  • Such a biosensor can be used as an optional and simple biosensor if an antigen capable of binding to various antibodies is connected to each of the etched regions.
  • Molecular recognition with streptavidin a biomaterial, was performed using the porous silicon biosensor fabricated in Example 1.
  • the research method shifts the reflection peak to the long wavelength due to the change of the refractive index generated by bonding the biomaterial to the substrate.
  • the method of amplifying the sensing signal was used to analyze the long wavelength displacement by changing the optical thickness.
  • a pure p-type silicon single crystal wafer (B doped, ⁇ 100>, 0.08 to 0.012 m ⁇ ⁇ cm) was cut into a size of 1.5 cm 2, washed 2 to 3 times with ethanol before etching, and then surface-treated with argon gas. After the silicon wafer was fixed, a current adjuster (Keithley 2420) adjustable by a computer was used and a 3: 1 v solution of 48 wt% HF aqueous solution (manufactured by Aldrich) and anhydrous ethanol (manufactured by Aldrich) / v, electrochemical etching was performed by flowing a sine wave using a compounding solvent.
  • the current of the sine wave was 150 to 250 mA / cm 2, 0.44 Hz, and the etching area of the porous silicon was 1.0 cm 2. After the etching, washing and drying were performed using ethanol and argon gas, Respectively.
  • the rutile porous silicon obtained in Step 1 was heated in a furnace (Thermolyne F6270-26 furnace equipped with controller) at a temperature of 300 ° C for 1 hour for thermal oxidation.
  • Step 3 Derivatization of the oxidized porous silicon surface
  • the optical reflectance spectrum of the roughed porous silicon prepared in Example 2 was measured using an optical interferometer equipped with an optical probe (Ocean optics USB2000). At this time, the tungsten light source focused on the surface of the porous silicon at a spot of about 1 to 2 mm, and the spectra were recorded through the CCD detector in a wavelength range of 400 to 1200 nm.
  • the light reflection spectrum of the luge porous silicon produced in Example 2 showed a very high and very thin light reflection spectrum at 629 nm and the full-width at half-maximum (FWHM) of the film of the luge- Was observed at 15 nm. These results are thinner than the 20 nm of the quantum dot, and typical features of the reviewing porous silicon are thinner than the spectrum emitted from organic dyes or core-shell quantum dots. Thus, it is possible to produce a luge porous silicon with much thinner spectra.
  • the surface of the thermally oxidized porous silicon at 300 ° C had a peak at 2085 to 2150 cm -1 , which is the stretching vibration region of Si-H before thermal oxidation, and the stretching vibration and bending vibration of OSi-H were 2200 to 2250 And 877 cm -1 , and the oscillation of Si-O-Si was strongly observed at 1000 to 1200 cm -1 , confirming that the surface of the porous silicon was oxidized from Si-H to Si-OH.
  • the absorbance band of the oxidized lutetraporous silicon also supported that the oxidized lutetraporous silicon sample contained almost 0 and almost no H. These results indicate that the Si-H species of pure lu- gated porous silicon have disappeared as they are oxidized. Further, the light reflection spectrum was shifted from the initial 629 nm to 556 nm by a short wavelength of about 73 nm. From these results, it can be seen that the refractive index was decreased while changing from Si to SiO 2 .
  • the FT-IR spectra of the biotin-derivatized porous silicon confirmed that the CC stretching vibration corresponding to the head of biotin was observed at 1652 cm -1 , indicating that the reacted biotin was bound.
  • UV-2401 PC Shimazu
  • ⁇ max 343 nm
  • the size of the pores was 10 nm on average, and biotin binding was confirmed at an average distance of 0.03 ⁇ 2 in a region of 1.2 cm 2 .
  • the surface of the bearing porous silicon prepared in Example 2 was measured using a scanning electron microscope (SEM, FE-SEM, S-4700, Hitach).
  • FIG. 5 is a SEM measurement result of the surface of the roughed porous silicon.
  • the pore size of the roughed porous silicon was 10 nm, and avidin detection with a size of 56 ⁇ 50 ⁇ 40 ⁇ was possible using the pores.
  • FIG. 6 shows a change in the optical reflection spectrum when avidin was flown into the biosensor using the luge multi-layer porous silicon produced in Example 2, and the reflection wavelength was shifted to 18 nm for a long wavelength in the reflection spectrum. This result is due to the fact that the refractive index of biotin-induced porous silicon film is changed by binding with avidin, which means that the avidin on the solution is bound.
  • the mixed current of three sinusoidal waveforms was 126.1 to 183.85 mA Cm < -2 & gt ; for 0.5 second, 0.58, 0.54, and 0.50 Hz for 500 seconds in the same manner as in Example 1 to obtain a pore having a certain pattern of pores and a depth Optically encoded lutetal porous silicon.
  • the etched lugated porous silicon in step 1 was thermally oxidized by heating in a furnace (Thermolyne F6270-26 furnace equipped with controller) at 300 ° C for 3 hours.
  • Step 3 Derivatization of the oxidized porous silicon surface
  • biotin tetrafluorophenyl ester 100 mg was dissolved in a solvent of N, N-dimethylformamide, and then triethylamine And the mixture was stirred at a high rate for 30 minutes. Porous silicon having an amine group prepared as described above was added to the above solution and reacted at room temperature for 12 hours. After completion of the reaction, the reaction product was washed with ethanol, dichloromethane, acetone, and then dried with nitrogen gas.
  • Step 4 Detecting biomaterials
  • the porous silicon chip induced by biotin was immobilized on a flow cell, and the flow rate of the porous silicon chip was measured at a flow rate of 0.8 ml / min Streptavidin or avidin was set as a detection target.
  • the light reflection spectrum was measured in the same manner as in Experimental Examples 1 and 2, except that the optically encoded lutetal porous silicon prepared in Example 3 was used.
  • FIG. 7 is a light reflection spectrum of the optically encoded lucent porous silicon prepared in Example 3, which has a side band width value (FWHM) of 17, 16 and 17 nm, and a reflection spectrum at a specific wavelength of 631, 674 and 725 nm Respectively.
  • FWHM side band width value
  • FT-IR (Nicolet model 5700) spectra were obtained in the same manner as in Experimental Examples 1 and 2 except that optically encoded lutetal porous silicon prepared in Example 3 was used (not shown).
  • the surface of the thermally-oxidized porous silicon at 300 ° C has a peak at 2085 to 2150 cm -1 , which is a stretching vibration region of Si-H, and the stretching vibration and bending vibration of OSi-H are 2200 to 2250 and 877 cm -1 , And the oscillation of Si-O-Si was strongly observed at 1000 ⁇ 1200cm- 1 , confirming that the surface of the porous silicon was oxidized from Si-H to Si-OH.
  • the absorbance band of the oxidized lutetraporous silicon also supported that the oxidized lutetraporous silicon sample contained almost 0 and almost no H. These results indicate that the Si-H species of pure lu- gated porous silicon have disappeared as they are oxidized. Further, the light reflection spectrum was shifted from the initial 629 nm to 556 nm by a short wavelength of about 73 nm. From these results, it can be seen that the refractive index was decreased while changing from Si to SiO 2 . Also, as the refractive index (n) decreases, the oxidized porous silicon also changes its effective optical thickness, which is shifted by an average of 31 nm based on the first position.
  • FT-IR spectra of biotin-derivatized porous silicon confirmed that the stretching vibration of CC corresponding to the head of biotin was observed at 1652 cm -1 , indicating that the reacted biotin was bound.
  • the surface of the bearing porous silicon prepared in Example 3 was measured using a scanning electron microscope (SEM, FE-SEM, S-4700, Hitach).
  • the pore size of the roughed porous silicon was 15 nm.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in light reflection spectrum when avidin was flown into the biosensor using the luge multi-layer porous silicon produced in Example 3. As a result, the reflection peaks of avidin migrated to long wavelengths of 9, 10, and 11 nm, and streptavidin 12, 13 and 15 nm long wavelengths.
  • Streptavidin has a greater migration width than avidin, and avidin has a size of 56 ⁇ 50 ⁇ 40 ⁇ and streptavidin has a size of 54 ⁇ 58 ⁇ 48 ⁇ . Therefore, since streptavidin has a larger molecular size than avidin, it can be predicted that it has shifted to a longer wavelength with a large influence on the refractive index.
  • the specific surface area was also measured using a BET equation.
  • the specific surface area of the oxidized porous silicon is shown in Table 1 .
  • porous silicon derivatized with biotin was derivatized with biotin on its surface to increase the specific surface area, and that the specific surface area of biotin and streptavidin was increased due to binding of biotin.
  • the DBR porous silicon samples synthesized under the above conditions were etched, washed several times with ethanol, and dried with argon gas before use. As shown in FIG. 11, a reflector that reflects various colors in the visible light region can be obtained by changing the sizes of the low current and the high current.
  • the DBR porous silicon film separated in Step 2 was oxidized by heating in a furnace (Thermolyne F6270-26 furnace equipped with controller) at 300 ° C for 3 hours. Through the thermal oxidation, the porous silicon surface terminated with Si-H is terminated with Si-O-Si or Si-OH.
  • Step 4 Fabrication of Optically Encapsulated DBR Porous Silicon Particles
  • the DBR porous silicon film separated from the silicon substrate was subjected to ultrasonic pulverization in an organic solvent selected from ethanol, THF or acetone using a Schlenk flask for about 10 minutes to obtain optically encoded DBR porous silicon smart particles Smart Particle) was prepared.
  • the separated DBR porous silicon film is very thin ( ⁇ several microns), it is advantageous to obtain particles through ultrasonic pulverization easily, and since pulverized by ultrasonic wave, the pulverized particles maintain optical characteristics, Can be manufactured without damage.
  • the weak nano network structure thus obtained is easily broken down into individual particles of various sizes. 12 shows DBR porous silicon particles obtained by ultrasonically pulverizing the optically encoded porous silicon film of the present invention for 10 minutes.
  • Step 5 Derivatization of the oxidized porous silicon surface
  • the surface was designed to function as a sensing body to recognize biomolecules.
  • Step 6 Detection of biomaterials
  • DBR porous silicon particles derivatized with biotin and silol were immobilized on a flow cell.
  • phosphate buffer (PBS) pH 7 was firstly flowed to stabilize , And the immune proteins avidin and streptavidin dissolved in a PBS solution were flowed at a flow rate of 0.8 ml / min to confirm that the reflection wavelength of the DBR porous silicon particles was shifted.
  • optical reflectance spectra of the DBR porous silicon particles derivatized with optically encoded biotin and silole prepared in Example 1 were measured using an optical interferometer equipped with an optical probe (Ocean optics USB2000). At this time, the tungsten light source focused on the surface of the porous silicon at a spot of about 1 to 2 mm, and the spectra were recorded through the CCD detector in a wavelength range of 400 to 1200 nm.
  • DBR porous silicon particles surface-derivatized with biotin and silole exhibit two unique optical characteristics.
  • Figure 13 shows the photoluminescence spectra (solid line) and the reflection spectra (dotted lines) of DBR porous silicon particles derivatized with biotin and silol of the present invention, with very thin light reflectivity at lambda max 607 nm and a very low reflectance at lambda em 505 nm And has a very bright photoluminescence property.
  • DBR porous silicon particles derivatized with biotin and silole have a half width of the reflection spectrum of about 20 nm or less.
  • the biosensor using DBR porous silicon particles derivatized with biotin and silol is photographed from a white light source (above) and ultraviolet light (below). As can be seen from the above, it can be confirmed that each of the particles photographed with ultraviolet light emits green light.
  • the surface of the porous silicon derivatized with biotin and silole prepared in Example 4 was measured using a scanning electron microscope (SEM, FE-SEM, S-4700, Hitach).
  • FIG. 14 is a SEM measurement result of the surface of the porous silicon obtained by derivatizing biotin and silanol of the present invention. As can be seen from the SEM photograph, there were numerous pores on the surface of a particle of about several tens of microns in size.
  • the pore size of the porous silicon was formed in the form of a mesopore having a size of about 50 nm, more preferably 2 to 50 nm. From these results, it was confirmed that the size of 56 ⁇ 50 ⁇ 40 ⁇ , Or streptavidin with a size of 54 x 58 x 48 A was detectable.
  • FIG. 15 is a light reflection spectrum measured by the steps of producing porous silicon particles derivatized with biotin and silanol.
  • the first pure DBR porous silicon particles had a half width of 20 nm and a reflection peak at 624 nm.
  • the film was moved to a short wavelength of about 44 nm.
  • the surface was derivatized into an amine group and a silanol group, the film was shifted by about 20 nm to a long wavelength of 600 nm.
  • the porous silicon particles derivatized with biotin and silol showed a reflection peak at 610 nm. Therefore, the reflection peak shifted to a short wavelength through thermal oxidation is a result of the refractive index in the DBR porous silicon particle pores decreased, and the refractive index was shifted to the short wavelength by the Bragg equation. .
  • FIG. 16 shows a change in light reflection spectrum when streptavidin was flowed into a biosensor using porous silicon derivatized with biotin and silol, and the reflection wavelength was shifted by 14 nm in a long wavelength.
  • FIG. 17 shows the result of shifting the wavelength of 17 nm by changing the light reflection spectrum when streptavidin was flown into a biosensor using porous silicon derivatized with biotin and silanol.
  • a biosensor for detecting an immune protein using porosity silicon which is prepared to stabilize the surface of electrochemically etched porous silicon and is suitable for immunoprotein detection, is provided.
  • a biosensor has been provided in which a light source is incident on a specific porous silicon and the detection efficiency is enhanced by using the optical reflection characteristic of the incident light source.
  • various analytes can be detected in a short time by optically coating a specific single layer or multi-layered porous silicon.
  • porous silicon that is induced by biotin, it can be utilized in an antigen-antibody immune system that can be detected in immunologic proteins capable of binding to biotin, avidin, streptavidin, antibody IgG and protein-A.

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Abstract

본 발명은 다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘의 표면을 열적 산화하고 그 표면에 아민 유도체를 유도한 후, 상기 아민 유도체 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시켜 제조된 다공성 실리콘에, 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사를 이용하여 구현되는 것이다. 본 발명의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 다공성 실리콘을 표면 안정화하는 동시에 면역단백질 탐지에 적합하도록 2∼50㎚ 크기를 가지는 메조포러스의 다공성 실리콘을 이용함으로써, 면역성 질환, 만성 감염증, 흡수장애 증후군의 원인이 되는 항체 IgG, 프로테인-A, 아비딘 및 스트렙토아비딘 탐지에 유용하다.

Description

다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서 및 그의 제조방법
본 발명은 다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘의 표면을 안정화하는 동시에 면역단백질 탐지에 적합하도록 2∼50㎚ 크기의 메조포러스 기공을 가지는 다공성 실리콘을 이용함으로써, 면역단백질 탐지에 유효한 바이오센서 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 여러 가지 분석물을 탐지할 수 있는 센서로서 다공성 실리콘(Porous silicon, PSi)이 각광받고 있다. 이러한 다공성 실리콘은 반도체 재료인 실리콘웨이퍼를 전기화학적인 부식을 통하여 실리콘웨이퍼 표면에 나노 크기의 기공과 나노 입자를 갖는 단층 및 다층구조로 얻을 수 있다.
제조된 단층 다공성 실리콘은 백색광원인 텅스텐-할로겐 램프를 이용해 반사스펙트럼을 측정하면, 다공성 실리콘 층으로 인하여 반사된 파장들이 보강 또는 상쇄 간섭하여 프린지(fringe)패턴을 나타낸다. 즉, 이러한 프린지 패턴(주름)은 기공내부에 화학물질이 채워져 들어가거나 빠져나갈 때 다공성 실리콘 층의 굴절률의 변화에 의해 장파장 또는 단파장 방향으로 변위한다.
이러한 광학적 성질을 이용한 센서 개발의 가능성이 제기되면서, 최근에는 다양한 분석물을 탐지할 수 있는 센서로서 다공성 실리콘(Porous silicon, PSi)이 각광받고 있다.
특히, 프린지 패턴은 브래그(Bragg) 식에 의해 생성되며 분석될 수 있다. 또한, 다공성 실리콘 층을 단층이 아닌 다층으로 쌓을 경우에도 다층 다공성 실리콘의 광학적 특성은 브래그 식에 의해 반사광의 간섭현상을 규명할 수 있다.
이러한 굴절률이 서로 상이한 두 개의 층을 가진 다층 DBR(Distributed Bragg Reflectors) 다공성 실리콘의 경우 브래그 식은 하기와 같다.
Figure PCTKR2009002320-appb-I000001
다층 다공성 실리콘의 구조에서, n 1 및 n 2는 굴절률이고, L 1 및 L 2는 층의 광학두께(optical thickness)이고, 동일 위상 조건인 (2m+1)/4λ=n 1 L 1= n 2 L 2 (m은 정수)를 만족할 때, 다층 DBR 다공성 실리콘으로서 작용한다.
상기 다공성 실리콘은 높은 표면적(수백 ㎡/㎤)을 가지며, 광 발광성 또는 광학적 반사의 두 가지의 독특한 광학적 특성을 지니는데, 이러한 높은 표면적은 상대적으로 좁은 지점에 분석물질이 큰 농도가 될 수 있도록 해주며 인식현상에서 정량적 신호로 바꿀 수 있게 해준다.
그러나, 다공성 실리콘의 독특한 광학적 특성에도 불구하고, 전기화학적인 방법으로 제조된 다공성 실리콘은 Si-H의 표면을 가지고 있어 공기 중이나 수용액상에서 불안정하여, 후속 응용공정에 제한을 받아왔다.
따라서 다공성 실리콘 중, 광학적 반사 특성을 이용하여 센서에 적용한 일예는 거의 보고된 바 없으며, 특히 다공성 실리콘을 이용하여 면역단백질 탐지용 바이오센서로 적용된 일례는 아직까지 보고된 바 없다.
따라서, 다공성 실리콘의 광학적 특성을 유지하면서 다공성 실리콘 표면의 불안정성을 해소하고 다양한 분석물을 탐지할 수 있도록 표면을 기능 유도체화하여 다양한 분석물을 탐지할 수 있는 신규한 센서용도로서의 개발이 요구된다.
본 발명의 목적은 전기화학적으로 식각된 특정의 다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지에 유효한 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘의 표면을 안정화시키고 면역단백질 탐지에 적합하도록 제작된 다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전기화학적 식각방법으로 제조된 다공성 실리콘의 표면을 열적 산화하고 그 표면에 아민 유도체를 유도한 후, 상기 아민 유도체 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시켜 제조된 다공성 실리콘에, 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사를 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘의 표면을 안정화시키고 면역단백질 탐지에 적합하도록 제작된 다공성 실리콘을 이용한 것을 특징으로 한다.
이에, 본 발명의 제1태양의 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘은 정전류를 흘려 전기화학적으로 비대칭 식각된 단층 다공성 실리콘을 사용하는 것이다.
또한, 본 발명의 제2태양의 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘은 사인(sine)파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각된 다층 다공성 실리콘을 사용하는 것으로서, 중심전류 값을 150∼250 ㎃/㎠로 하고, 1∼200 초 주기로 하는 사인파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 루게이트 단일 반사 피크(Rugate Single Peak)를 가지는 것이다.
본 발명의 제3태양의 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘은 중심전류 값을 120∼200 ㎃/㎠로 하고, 2 내지 30개의 사인파형의 혼합된 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 2 내지 30개의 루게이트 다중 반사 피크(Rugate Multiple Peak)를 가지는 다공성 실리콘을 사용한다.
본 발명의 제4태양의 바이오센서는 제1태양 내지 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘의 광학적인 특성을 유지하고, 기공에 손상하지 않도록 초음파 분쇄한 다공성 실리콘 입자를 이용하는 것이다.
본 발명의 제1태양 내지 제4태양의 바이오센서에서 사용되는 다공성 실리콘은 2∼50㎚의 메조포러스 기공 크기를 가진다.
본 발명의 바이오센서에서 감지인식체로는 바이오틴, 그의 유도체 또는 바이오틴으로 유도화된 프로테인 A에서 선택되는 어느 하나를 사용하며, 본 발명의 바이오센서는 아비딘, 스트렙토아비딘, 항체 IgG 및 프로테인-A로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 면역단백질을 탐지하는데 유용하다.
본 발명은 제1태양 내지 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서의 제조방법은 1) 전기화학적 식각방법으로 다공성 실리콘을 준비하는 공정, 2) 상기 다공성 실리콘을 300∼1200℃ 온도조건에서 1∼60분 동안 수행하여 표면이 산화된 다공성 실리콘 필름을 형성하는 공정, 3) 상기 산화된 다공성 실리콘 표면에 아민 유도체를 유도 반응한 후, 상기 아민 유도체의 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시키는 공정 및 4) 상기 다공성 실리콘에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사를 이용하여 면역단백질을 탐지하는 공정을 포함한다.
본 발명의 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서의 제조방법은 1) 실리콘웨이퍼를 전기화학방법으로 식각하여 400∼2000nm에서 단일 반사 피크 또는 다중 반사 피크를 가지는 다층 다공성 실리콘을 준비하는 공정, 2) 상기 다공성 실리콘을 상기 실리콘웨이퍼에서 다공성 실리콘 필름으로 분리하는 공정, 3) 상기 다공성 실리콘 필름을 300∼1200℃ 온도조건에서 1∼3시간 동안 가열하여 표면이 산화된 다공성 실리콘 필름을 형성하는 공정, 4) 상기 산화된 다공성 실리콘 필름을 분쇄하는 공정, 5) 상기 분쇄된 다공성 실리콘 입자 표면에 아민 유도체를 유도 반응한 후, 상기 아민 유도체의 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체 및 광발광성인 실올 화합물을 고착시키는 공정 및 6) 상기 다공성 실리콘 입자에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사거동으로 면역단백질을 탐지하는 공정을 포함한다.
이때, 단계 1)에서 제조된 다공성 실리콘은 2∼50㎚ 크기를 갖는 메조포러스의 다공성 실리콘으로 제조된다.
본 발명에서 사용되는 다공성 실리콘은 정전류를 이용하여 전기화학적으로 비대칭 식각되어 제조되는 단층 다공성 실리콘 및 사인(sine)파 전류를 이용하여 제조되는 다층 다공성 실리콘을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바람직한 다층 다공성 실리콘으로는 중심전류 값을 150∼250 ㎃/㎠로 하고, 1∼200 초 주기로 하는 사인파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 단일 반사 피크(Rugate Single Peak)를 가지는 루게이트 다공성 실리콘 또는 중심전류 값을 120∼200 ㎃/㎠로 하고, 2 내지 30개의 사인파형의 혼합된 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 2 내지 30개의 다중 반사 피크(Rugate Multiple Peak)를 가지는 루게이트 다중 다공성 실리콘을 포함한다.
본 발명의 면역단백질 탐지용 바이오센서의 제조방법은 전기화학적 식각과정에서 Si-H의 표면을 가지는 다공성 실리콘 표면이 공기 중이나 수용액상에서 불안정한 문제점을 열적 산화하고, 그 표면에 아민 유도체를 유도한 후, 상기 아민 유도체 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시킨 다공성 실리콘을 제조하는 것을 특징으로 한다.
이때, 감지인식체로는 바이오틴, 그의 유도체 또는 바이오틴으로 유도화된 프로테인 A에서 선택되는 어느 하나를 사용하고, 이를 이용하여, 아비딘, 스트렙토아비딘, 항체 IgG 및 프로테인-A로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 면역단백질을 탐지할 수 있다.
본 발명의 바이오센서의 제조방법에서 사용되는 광원은 텅스텐-할로겐램프, LED(Light Emitting Diode) 또는 레이저에서 선택되는 것이다.
본 발명에 따라 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘은 Si-H의 표면을 가지고 있어 공기 중이나 수용액상에서 불안정한 문제점을 열적 산화하고 그 표면에 아민 유도체를 유도함으로써 해결하여, 다공성 실리콘의 표면 안정화를 구현한 바이오센서를 제공할 수 있다.
본 발명에 따라 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘을 광학적인 특성을 유지하고, 기공에 손상하지 않도록 분쇄된 다공성 실리콘 입자를 이용하고, 상기 다공성 실리콘 입자의 산화된 표면에 기능ㆍ유도체화함으로써, 다공성 실리콘 입자를 이용한 바이오센서를 제공할 수 있다. 상기 다공성 실리콘 입자의 광 반사성 및 광 발광성이 동시에 구현되는 특성에 의해, 하나의 신호로 다중감지가 가능하고 센서의 선택성이 향상된 바이오센서를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오센서는 표면이 안정화된 동시에 면역단백질 탐지에 적합하도록 2∼50㎚ 크기를 가지는 메조포러스의 다공성 실리콘을 이용함으로써, 면역성 질환, 만성 감염증, 흡수장애 증후군의 원인이 되는 항체 IgG, 프로테인-A, 아비딘 및 스트렙토아비딘 탐지에 유용하게 활용할 수 있다. 특히, 바이오틴으로 유도화된 다공성 실리콘을 이용하여, 바이오틴-면역단백질간의 결합으로 인한 항원항체 면역시스템에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제1태양의 바이오센서로서, 전기화학적으로 비대칭 식각되어 제작된 단층 다공성 실리콘을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 제1태양의 바이오센서에 사용된 단층 다공성 실리콘의 표면에 대한 SEM 측정결과이다.
도 3은 본 발명의 제1태양의 바이오센서의 바이오 물질에 대한 유효광학두께 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 광학 인코딩된 단층 다공성 실리콘을 이용한 제1태양의 바이오센서의 형태를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 제2태양의 바이오센서에 사용된 루게이트 다공성 실리콘 표면의 SEM 측정결과이다.
도 6은 본 발명의 제2태양의 바이오센서의 바이오물질 탐지에 대한 반응전후의 광학 반사 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 제3태양의 바이오센서에 사용된 루게이트 다공성 실리콘의 광 반사 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명의 제3태양의 바이오센서에 사용된 루게이트 다공성 실리콘 표면의 SEM 측정결과이다.
도 9는 본 발명의 제3태양의 바이오센서의 바이오물질 탐지에 대한 반응전후의 광학 반사 스펙트럼이다.
도 10은 본 발명의 제4태양의 바이오센서의 제조과정을 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 가시광선 영역에서 다양한 색을 반사하는 DBR 다공성 실리콘 필름을 나타낸 것이다.
도 12는 도 11의 DBR 다공성 실리콘 필름을 초음파 분쇄시킨 DBR 다공성 실리콘 입자이다.
도 13은 본 발명의 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서의 광 발광 스펙트럼(실선) 및 반사 스펙트럼(점선)을 나타낸 것이고, 상기 바이오센서를 백색광원(위) 및 자외선등(아래)에서 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 DBR 다공성 실리콘 입자의 표면에 대한 주사전자현미경 측정결과이다.
도 15는 본 발명의 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘 입자의 제조단계별로 측정한 광 반사 스펙트럼이다.
도 16은 본 발명의 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 스트렙토아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼이다.
도 17은 본 발명의 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘 표면을 안정화시키고, 메조포러스의 기공을 가지는 다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서를 제공한다.
더욱 상세하게는, 본 발명의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘의 표면을 열적 산화하고 그 표면에 아민 유도체를 유도한 후, 상기 아민 유도체 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시켜 제조된 다공성 실리콘을 이용한 것이다.
본 발명의 바이오센서에서 면역단백질의 탐지 방법으로는 본 발명의 다공성 실리콘 표면에 400∼2000nm 파장을 갖는 광원을 입사하고, 상기 입사한 빛의 광학적 반사를 통하여 반사스펙트럼의 단파장 또는 장파장 이동을 통하여 탐지한다. 반사스펙트럼의 이동은 브래그 식에 따라 다공성 실리콘 기공 내의 굴절률의 변화에 의해서 반사 파장의 이동이 이루어진다.
이에, 본 발명의 바이오센서는 메조포러스의 기공을 가지는 다공성 실리콘의 표면을 기능ㆍ유도체화하여 면역단백질과의 선택성을 증가시켜 감도 및 탐지속도를 향상시킴으로써, 탐지효율을 증가시킨다.
본 발명의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘의 기공 모양, 크기 및 방향은 표면의 저항과 결정 실리콘의 불순물 정도 및 흘려주는 전류, 온도, 식각 시 사용하는 HF 용액의 농도에 따라 달라진다. 이때, 본 발명에서 사용되는 다공성 실리콘은 2∼50㎚ 크기의 메조포러스 기공을 가지는 것이 바람직하다. 이때, 상기 기공크기가 2㎚ 미만의 마이크로포러스와, 50㎚를 초과하는 마크로포러스 기공을 가지면, 56×50×40Å의 크기를 갖는 아비딘 또는 54×58×48Å 크기의 스트렙토아비딘 탐지에 활용할 수 없다.
1. 제1태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서
본 발명의 제1태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 정전류를 이용하여 전기화학적 비대칭 식각방법으로 제조되며, 400∼2000nm에서 프린지(fringe) 피크 패턴을 가지는 단층 다공성 실리콘을 이용하고, 상기 단층 다공성 실리콘에 광원을 입사하고, 상기 입사한 빛의 광학적 반사를 이용하여 면역단백질을 탐지한다.
더욱 상세하게는 식각면적의 지름을 2 ㎜정도로 작게 한 식각 모형 틀을 이용하여 비대칭 식각하면, 각각 식각된 영역이 2차원으로 서로 다른 반사피크를 가지는 다공성 실리콘(on-chip multi-encoded porous silicon)을 제작할 수 있다[도 1]. 이때, 다공성 실리콘의 표면 관찰결과, 전극 위치와 가까운 첫 번째 자리(1)는 많은 전류의 영향을 받아 다공성도가 크고, 멀어질수록(∼9) 다공성도가 작아지는 광학 인코딩된 단층 다공성 실리콘을 얻을 수 있다[도 2].
본 발명에서 사용되는 단층 다공성 실리콘의 광학적 특성은 광원을 입사하면, 하기 수학식 2로 표시되는 브래그(Bragg) 식에 따라 거동하는 프린지 피크 패턴(주름 패턴)의 반사스펙트럼을 얻을 수 있다.
Figure PCTKR2009002320-appb-I000002
(상기에서, m는 광학계수이고, λ는 파장이고, n은 굴절률이고, L은 필름 두께이다.)
이때, θ가 90°이므로 sin 는 1이다. 따라서, 반사파장은 굴절률(n)과 필름 두께(L)에 의해서 달라진다. 또한, 다공성 실리콘이 센서로서 작용할 때 두께 L은 고정되므로, 반사파장은 굴절율(n)에 의해서 결정된다.
즉, 실험적으로 굴절률(n)과 필름 두께(L)를 구하면, 다층다공성 실리콘의 광학두께를 알 수 있으며, 바이오물질의 결합으로 인해 전체 다공성 실리콘의 굴절률이 변함에 따라 탐지할 수 있다. 또한, 광학유효두께(EOT: effective optical thickness)를 측정할 수 있었다.
광학두께에 대하여, nL=mλ/2로 표기하면, 보강간섭으로 인해 m번째 증폭하는 반사피크의 파장을 반으로 나눈 값이 광학두께이므로, 이를 프로그래밍하면, 광학유효두께(EOT: effective optical thickness)를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 제1태양의 바이오센서에 대하여, 바이오물질로서 스트렙토아비딘, 항체 IgG 및 프로테인-A을 탐지한 후, 유효광학두께 변화를 관찰한 결과, 바이오센서와 바이오물질간의 결합으로 굴절률(n)이 증가하므로, 유효광학두께가 증가함을 확인할 수 있다[도 3].
도 4는 본 발명의 광학 인코딩된 단층 다공성 실리콘을 이용한 제1태양의 바이오센서의 형태를 나타낸 것이다. 따라서, 본 발명의 제1태양의 바이오센서는 각각 식각된 영역에 다양한 항체와 결합할 수 있는 항원을 연결하면, 선택적이고 간편한 바이오센서로 활용될 수 있다.
2. 제2태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서
본 발명의 제2태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 사인(sine)파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각된 다층 다공성 실리콘을 이용하는 것으로서,
하기 수학식 3에 의해 합성할 수 있다.
Figure PCTKR2009002320-appb-I000003
(상기에서, A는 진폭, k는 진동수(Hz), t는 시간, B는 파형의 중앙값이 된다.)
더욱 상세하게는, 제2태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘은 중심전류 값을 150∼250 ㎃/㎠로 하고, 1∼200 초 주기로 하는 사인파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 단일 반사 피크(Rugate Single Peak)를 가지는 루게이트 다공성 실리콘[도 7]이다. 나아가, 상기 루게이트 다공성 실리콘에 광원을 입사하고, 상기 입사한 빛의 광학적 반사를 이용하여 탐지하는 것이다.
본 발명의 제2태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 루게이트 다공성 실리콘은 반측 띠폭값(full-width at half-maximum, FWHM)이 15㎚이고, 629 ㎚에서 매우 높고 매우 얇은 광 반사 스펙트럼을 보인다. 또한, 루게이트 다공성 실리콘의 표면에 대한 SEM 측정결과, 2∼50㎚, 더욱 바람직하게는 10nm 크기의 메조포러스 기공을 확인할 수 있다[도 5].
본 발명의 제2태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 바이오물질로서 아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화를 관찰한 결과, 반사 스펙트럼에서 반사파장이 18㎚으로 장파장 이동을 확인함으로써 면역단백질을 탐지한다[도 6].
3. 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서
본 발명의 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 중심전류 값을 120∼200 ㎃/㎠로 하고, 2 내지 30개의 사인파형의 혼합된 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 2 내지 30개의 다중 반사 피크(Rugate Multiple Peak)를 가지는 루게이트 다공성 실리콘을 이용한다[도 7].
본 발명의 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 다층 다공성 실리콘은 식각 시, 사인(sine)파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각된 다층 다공성 실리콘을 이용하는 것으로서, 하기 수학식 4에 의해 합성할 수 있다.
Figure PCTKR2009002320-appb-I000004
(상기에서, A는 진폭, f는 진동수(Hz), t는 시간, Acenter는 파형의 중앙값이다.)
사인(sine)파의 파형과 식각조건을 조절하여 루게이트 구조를 갖는 다공성 실리콘을 제작할 수 있는데 루게이트 다공성 실리콘의 장점은 사인(sine)파를 이용하여 파형에 대한 퓨리에 변환하면 다공성 실리콘에서 반사되어 나오는 빛의 상쇄와 보강간섭으로 인한 반사피크를 미리 예측할 수 있다. 더 나아가, 여러 개의 반사피크들이 원하는 파장들에서 상대적인 세기를 조절할 수 있도록 광학 인코딩(optical encoding)할 수 있다. 또한, 제3태양의 바이오센서에 사용되는 루게이트 다층 다공성 실리콘 표면에 대한 SEM 측정결과, 2∼50㎚, 더욱 바람직하게는 15nm 크기의 메조포러스 기공을 확인할 수 있다[도 8].
본 발명의 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 바이오물질로서 아비딘 및 스트렙토아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화를 관찰한 결과, 아비딘은 반사피크 각각이 9, 10, 11nm 장파장 이동하고, 스트렙토아비딘은 12, 13, 15nm 장파장 이동을 확인함으로써 면역단백질을 탐지한다[도 12].
본 발명의 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 다중 반사피크를 가지는 루게이트 다층 다공성 실리콘을 광학 인코딩(multiplex assay)함으로써, 여러 가지 분석물질들을 단시간에 감지할 수 있다.
4. 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서
본 발명의 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 제1태양 내지 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘의 광학적인 특성을 유지하고, 기공에 손상하지 않도록 초음파 분쇄한 다공성 실리콘 입자를 이용하는 것이다.
더욱 구체적으로는 본 발명의 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘은 400∼2000nm에서 DBR(Distributed Bragg Reflector)에 의한 단일 반사 피크 또는 루게이트(Rugate) 단일 반사 피크를 갖는 다공성 실리콘; 또는 400∼2000nm에서 두 개이상, 바람직하게는 2 내지 30개의 특정한 빛만을 반사하는 DBR 다중 반사 피크 또는 루게이트 다중반사 피크를 갖는 다공성 실리콘;에서 선택 사용하는 것이다.
이에, 본 발명의 실시예에서는 상기 다공성 실리콘을 이용한 DBR 다공성 실리콘 입자에 한정하여 구체적으로 설명하는 있으나, 다공성 실리콘이 이에 한정되는 것이 아님은 당연히 이해될 것이다.
도 10은 본 발명의 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서의 제조과정을 도시한 것으로서, 실리콘웨이퍼 상에서 전기화학적 방법으로 식각한 후, 상기 실리콘웨이퍼로부터 다공성 실리콘을 분리하여 다공성 실리콘 필름을 준비한다. 이때, 분리방법은 필름이 손상되지 않도록, 다공성 실리콘웨이퍼를 핀셋으로 잡아 유리판 위에서 에탄올을 흘려주어 실리콘웨이퍼로부터 다공성 실리콘을 분리시킨다. 도 11은 본 발명의 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에 사용되는 가시광선 영역에서 다양한 색을 반사하는 다공성 실리콘 필름을 나타낸 것이다. 이후, 상기 필름을 300∼1200℃ 온도조건에서 1∼3시간 동안 가열하여 표면을 열적 산화시킨다.
상기 산화이후 분리된 다공성 실리콘 필름을 분쇄하여 얻어진 다층 다공성 실리콘 입자를 사용하는 것으로, 분쇄된 입자형태를 사용함으로써 미세분자들과의 선택성이 증가한다는 측면에 유리하다.
이때, 분쇄된 입자들이 광학적인 특성을 유지하기 위해서는 생성된 기공에 손상이 가면 되지 않아야 하므로 물리적인 충격에 의한 방법도 가능하나, 더욱 바람직하게는 초음파를 이용한 분쇄방법으로 수행하는 것이다.
본 발명의 초음파분쇄하여 얻어진 다층 다공성 실리콘 입자는 약한 나노네트워크 구조로 인하여 쉽게 부스러지면서 다양한 크기의 개별적인 입자들로 제조된다. 도 12는 도 11의 다공성 실리콘 필름을 초음파 분쇄시킨 다양한 크기의 다공성 실리콘 입자의 일례를 제시한다. 이때, 다층 다공성 실리콘 입자의 분쇄크기는 수 마이크론에서 수나노크기 입자크기를 충족하는 것이 바람직하다.
이후, 본 발명은 다공성 실리콘 입자의 산화된 표면을 아민 유도체로 유도한 후, 상기 아민 유도체 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체 및 광발광성인 실올 화합물을 고착시켜 표면 유도체화한 다공성 실리콘 입자에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사거동으로 구현되는 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서는 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체 및 광발광성인 실올 화합물이 동시에 고착된 DBR 다공성 실리콘 입자를 이용함으로써, 광 반사성(λmax= 607nm) 및 광 발광성(λem= 505nm)이 동시에 구현되며, 입자의 반사 스펙트럼의 반측 띠폭값(full-width at half-maximum)은 약 20 ㎚이하의 값을 갖는다[도 13]. 또한, 상기 바이오센서를 백색광원 및 자외선등에서 촬영한 결과, 입자들이 녹색 빛으로 발광하는 것을 확인 할 수 있다.
상기 본 발명에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체 및 광발광성인 실올 화합물이 동시에 고착된 다공성 실리콘 입자를 이용한 바이오센서는 광 반사성을 이용하여, 면역단백질 탐지거동을 확인할 수 있으며, 광 발광성을 이용하여, 센서의 선택성을 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 바이오센서는 광 반사성과 광 발광성을 동시에 구현함으로써, 하나의 신호만으로도 다중 감지가 가능하다.
본 발명의 제1실시형태 내지 제4실시형태의 바이오센서에 사용되는 다공성 실리콘은 2∼50㎚의 메조포어 기공 크기를 갖는다.
본 발명의 제1실시형태 내지 제4실시형태의 바이오센서는 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체로서, 바이오틴, 그의 유도체 또는 바이오틴으로 유도화된 프로테인 A에서 선택되는 어느 하나가 고착된다.
따라서, 상기 바이오틴으로 유도된 다공성 실리콘 입자를 이용한 바이오센서는 바이오틴과의 면역결합되는 아비딘, 스트렙토아비딘, 항체 IgG 및 프로테인-A로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 면역단백질 탐지에 유용하다.
본 발명은 면역단백질 탐지용 바이오센서의 제조방법을 제공한다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 제1태양 내지 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서의 제조방법은
1) 전기화학적 식각방법으로 다공성 실리콘을 준비하는 공정,
2) 상기 다공성 실리콘을 300∼1200℃ 온도조건에서 1∼60분 동안 수행하여 상기 다공성 실리콘의 표면을 열적 산화하는 공정,
3) 상기 산화된 다공성 실리콘 표면에 아민 유도체를 유도 반응한 후, 상기 아민 유도체의 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시키는 공정 및
4) 상기 다공성 실리콘에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사를 이용하여 면역단백질을 탐지하는 공정을 포함한다.
본 발명의 단계 1)에서 제조된 다공성 실리콘은 정전류를 이용하여 전기화학적으로 비대칭 식각되어 제조되는 단층 다공성 실리콘 및 사인(sine)파 전류를 이용하여 제조되는 다층 다공성 실리콘을 포함한다. 또한, 상기 다층 다공성 실리콘이 400∼2000nm에서 단일 반사 피크(Rugate Single Peak)를 가지는 루게이트 다공성 실리콘 및 400∼2000nm에서 2 내지 30개, 더욱 바람직하게는 2개 내지 15개의 다중 반사 피크(Rugate Multiple Peak)를 가지는 루게이트 다중 다공성 실리콘을 포함한다.
본 발명의 제1태양 내지 제3태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서에서 사용된 다공성 실리콘과 동일하게 사용하므로, 다공성 실리콘에 대한 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 제조방법에서 단계 2)는 단계 1)에서 전기화학적 식각과정에서 제조된 다공성 실리콘이 공기 중이나 수용액상에서 불안정한 Si-H의 표면을 가지므로, 상기 다공성 실리콘을 열적 산화하여 그 표면을 Si-OH형으로 산화하는 공정이다.
이때, 열적 산화공정은 300∼1200℃ 온도조건에서 1∼60분 동안 수행하며, 더욱 바람직하게는 가열로(furnace)에서 수행하는 것이다. 가열온도가 300℃미만이면, 산화반응이 서서히 진행하여 바람직하지 않고, 1200℃를 초과하면 산화된 다공성 실리콘이 불안정하여 문제가 있다.
본 발명의 제조방법에서 단계 3)은 단계 2)에서 다공성 실리콘 표면이 Si-H에서 Si-OH로 산화된 후, 그 표면에 아민 유도체를 유도 반응한다.
이때, 아민 유도체는 생물물질을 감지하기 위한 관능기 링커(linker)로서 한쪽 끝이 알콕시 그룹을 가지고 있는 실란으로 이루어져 산화된 다공성 실리콘의 표면에 Si-OH와 반응할 수 있어야하며, 다른 끝에 아민그룹이 있는 화합물이라면, 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있으나, 바람직한 일례로는 3-아미노프로필트리메톡시실란, 아미노알킬트리알콕시실란, 아미노알킬디알콕시실란, 및 아미노알킬알콕시실란으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이다.
이후, 다공성 실리콘의 표면에 아민 유도체를 유도한 후, 상기 아민 유도체의 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시킨다.
고착방법은 바이오틴 함유 화합물을 유기용매 하에 용해시켜 냉각하고, 필요에 따라 촉매를 첨가하여 교반한 용액에, 아민 유도체가 결합된 다공성 실리콘을 첨가하고 실온에서 반응시키는 것이다.
감지인식체로는 바이오틴, 그의 유도체 또는 바이오틴으로 유도화된 프로테인 A를 사용할 수 있으며, 이에 대한 감지대상물로서, 면역성 질환, 만성 감염증, 흡수장애 증후군의 원인이 되는 항체 IgG, 프로테인-A, 아비딘 및 스트렙토아비딘 등의 면역단백질 탐지에 유용하다.
본 발명의 제조방법에서 단계 4)은 상기 단계에서 표면 안정화되고 면역단백질 탐지에 적합하도록 메조포러스의 기공을 가진 다공성 실리콘에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사를 이용하여 면역단백질을 탐지하는 공정이다.
본 발명에서 사용되는 광원은 400∼2000nm 파장을 갖는 텅스텐-할로겐램프 또는 각각의 다층 다공성 실리콘으로부터 나오는 반사피크와 일치하는 파장을 갖는 LED(Light Emitting Diode) 또는 레이저(Laser)를 포함하는 백색광원을 사용한다.
또한, 본 발명은 제4태양의 면역단백질 탐지용 바이오센서의 제조방법을 제공한다. 더욱 상세하게는, 1) 실리콘웨이퍼를 전기화학방법으로 식각하여 400∼2000nm에서 단일 반사 피크 또는 다중 반사 피크를 가지는 다층 다공성 실리콘을 준비하는 공정,
2) 상기 다공성 실리콘을 상기 실리콘웨이퍼에서 다공성 실리콘 필름으로 분리하는 공정,
3) 상기 다공성 실리콘 필름을 300∼1200℃ 온도조건에서 1∼3시간 동안 가열하여 표면이 산화된 다공성 실리콘 필름을 형성하는 공정,
4) 상기 산화된 다공성 실리콘 필름을 분쇄하는 공정,
5) 상기 분쇄된 다공성 실리콘 입자 표면에 아민 유도체를 유도 반응한 후, 상기 아민 유도체의 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체 및 광발광성인 실올 화합물를 고착시키는 공정 및
6) 상기 다공성 실리콘 입자에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사거동으로 면역단백질을 탐지하는 공정을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 단층 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서 제작 1
단계 1: 단층 다공성 실리콘의 제조
순수한 p++-type의 실리콘 웨이퍼(B dopped, <100>, 0.08∼0.012 m ㆍ㎝)를 침형 백금전극을 이용하여 정전압기(Galvanostat, Keithley 2420)를 이용하여 비대칭으로 전류를 흘려주면서 전기화학적으로 식각하여, 다공성 실리콘(on-chip multi-encoded porous silicon)을 제조하였다. 일정한 패턴의 기공(pore)과 깊이(depth)를 갖는 다공성 실리콘을 합성하기 위한 식각 용매로서, 48중량% HF 수용액 및 에탄올이 3:1 v/v로 혼합하여 사용하였으며 전류 60 mAㆍm-2를 20초 동안 흘려주었다. 이때, 상기 용매는 알드리치사 제품을 구입하여 사용하였다. 모든 공정은 테프론 셀에서 수행하고, 식각 후에는 에탄올과 아르곤 가스를 이용하여 세척 및 건조하였다.
이때, 식각면적의 지름을 2㎟ 정도로 작게 한 식각 모형 틀을 이용하여 비대칭 식각하면, 백금전극이 놓인 위치로부터 x 만큼의 거리에 위치한 부분은 거리에 반비례하여 상대적으로 낮은 전류의 영향을 받아 비대칭으로 식각된 다공성 실리콘을 제작하였다[도 1].
상기 제조된 다공성 실리콘의 표면에 대한 주사전자현미경(SEM) 측정 결과, 백금의 위치와 가까운 첫 번째 자리는 많은 전류의 영향을 받아 다공성도가 크고, 멀어질수록 다공성도가 작아지는 것을 확인하였다[도 2].
상기 제조된 단층 다공성 실리콘을 퓨리에 변환을 통하여 퓨리에 변환 스펙트럼을 얻은 결과, 프린지 패턴(주름패턴)이 관찰되었다.
단계 2: 열적 산화
단계 1에서 식각과정을 통해 얻은 다공성 실리콘은 Si-H의 표면을 가지고 있어 공기 중이나 수용액상에서 불안정하므로, 전기로(Thermolyne F6270-26 furnace equipped with controller)를 사용하여 상기 다공성 실리콘을 300℃에서 1시간 동안 가열하였다.
단계 3: 산화된 다공성 실리콘 표면의 유도체화
상기 단계 2에서 산화된 다공성 실리콘을 3-아미노프로필트리메톡시실란(10 mmol, 99%, 알드리치사 제품) 1㎖를 넣고 80℃로 12시간동안 가열하고, 가열 후 에탄올, 디클로로메탄, 아세톤 순서로 세척한 다음 질소가스로 건조하여, 아민 그룹을 갖는 다공성 실리콘 표면을 제작하였다.
이후, 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체로서, 바이오틴(biotin)을 표면에 고착화시키기 위하여, 바이오틴 테트라플로로페닐 에스테르 100mg를 N,N-디메틸포름아마이드 용매에 용해한 후, 촉매로서 트리에틸아민 0.9㎖를 넣고 30분간 높은 속도로 교반하였다. 상기 교반액에 상기에서 제조된 아민 그룹을 갖는 다공성 실리콘을 첨가하고 실내온도에서 12시간 동안 반응하였다. 반응종료 후, 에탄올, 디클로로메탄, 아세톤 순서로 세척한 다음 질소가스로 건조시켰다.
이때, 바이오틴 테트라플로로페닐 에스테르는 바이오틴 2.5g(10.22 mmol)을 70℃의 N,N-디메틸포름아마이드 200㎖에 아르곤 하에서 용해시킨 후 냉각하고, 테트라아민 2.5㎖(20.5 mmol)를 주입한 후, 2,3,5,6-테트라플로로페닐 트리플로로아세테이트 4g(15.25 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 30분간 반응시켜주며 용매는 진공상태에서 제거하였다. 이때, 생성물은 100㎖의 에테르에 녹여 여과시켜 준비하였다.
단계 4: 바이오 물질의 탐지
상기 바이오틴으로 유도화된 다공성 실리콘 칩을 이용하여 바이오 물질들을 선택적으로 탐지하고 면역 화학 검사 시 면역성 질환, 만성 감염증, 흡수장애 증후군(Malabsorption Syndrome)의 원인이 되는 항체 IgG를 탐지하는 센서로서 활용하였다.
상기 바이오틴으로 유도화된 다공성 실리콘 칩을 플로우 셀(flow cell)에 고정시킨 상태에서 0.8㎖/min의 유속으로 스트렙토아비딘(streptavidin), 바이오틴으로 유도화된 프로테인 A 및 휴먼 IgG의 바이오 물질을 순차적으로 흘려 사용하였다.
반응식 1
[규칙 제26조에 의한 보정 13.07.2009]　
Figure WO-DOC-1
<실험예 1>
실시예 1에서 제조된 단층 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 대하여, 성능분석을 하기와 같이 수행하였다.
1. FT-IR 스펙트럼 측정
상기 실시예 1에서 제조된 단층 다공성 실리콘 칩을 이용한 바이오센서에 대하여, 각 단계별로 산화 및 유도체화의 여부는 FT-IR을 통해 확인하였다[미도시].
그 결과로서, 식각된 다공성 실리콘의 FT-IR 스펙트럼은 2119와 914cm-1에서 Si-H의 신축 진동과 굽힘 진동을 확인하였다. 식각된 다공성 실리콘을 300℃의 전기로(furnace)에서 1시간 동안 가열한 열적 산화된 다공성 실리콘에 대한 FT-IR 스펙트럼은 Si-H의 신축 진동 영역인 2085∼2150cm-1의 피크가 줄어들게 되고 OSi-H의 신축 진동과 굽힘 진동이 각각 2200∼2250 과 877cm-1에서 나타나는 것을 확인하였다. 또한, Si-O-Si의 진동은 1000∼1200cm-1에서 강하게 나타나는 결과를 확인함으로써, 다공성 실리콘의 산화여부를 확인하였다.
또한, 아민그룹으로 유도화된 다공성 실리콘의 표면을 FT-IR 스펙트럼 통해 확인된 결과로서, 아민결합의 3386cm-1에서 신축진동 및 1575cm-1에서 굽힘진동 피크를 확인하였으며, 체인형태의 C-H 신축진동은 2850, 2923, 2952cm-1에서 확인하였다. 바이오틴이 유도화된 다공성 실리콘의 FT-IR 스펙트럼 결과로서, 바이오틴의 머리에 해당하는 C-C 신축진동은 1652cm-1에서 확인함으로써, 반응된 바이오틴이 결합되었음을 확인하였다.
2. 표면 고정화 반응 검증
상기 실시예 1의 단계 3에서 제조된 아민 그룹의 표면 고정화 반응을 확인하기 위하여, 2-피리딜-2-카르복실에틸 디설피드를 표면에 결합시키고 디싸이오쓰레이톨(dithiothreitol, DTT)에 의해 떨어지는 2-싸이오피리돈(thiopyridone)의 양을 분석하였다.
더욱 상세하게는, 2-피리딜-2-카르복실에틸 디설피드 0.2g(94.7 mmol)를 디클로로메탄 10㎖에 녹인 후, 1-(3-(디메틸아미노)프로필)-3-에틸카르보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 100mg(0.6mmol)를 첨가한 용매에 실시예 1의 단계 3에서 (3-아미노프로필)트리메톡시실란으로 유도화된 다공성 실리콘을 첨가하고 12시간동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 디싸이오쓰레이톨(dithiothreitol, DTT)에 의해 방출되는 2-싸이오피리돈(thiopyridone)의 정량을 자외선 분광기( λmax=343nm, ε= 8.08×103 M-1cm-1)를 통해 확인하였다[반응식 2]. 60 mA/mm2 전류에 의해 식각된 실리콘 칩의 경우 연결된 분자의 숫자는 대략 30∼80%가 표면에 결합한다고 했을 때, 그 정량은 137nmol/㎟이다. 이를 계산해 보면, 구멍의 크기는 평균 25∼90nm이고, 0.071㎠의 영역에 평균 0.03Å 간격으로 바이오틴 결합을 확인하였다.
반응식 2
[규칙 제26조에 의한 보정 13.07.2009]　
Figure WO-DOC-2
3. 바이오 센서로서의 바이오 물질의 탐지
상기 실시예 1에서 제조된 바이오틴으로 유도화된 다공성 실리콘을 플로우 셀(flow cell)에 고정시키고 인산완충용액(PBS)을 흘려주며 최초의 반사파장을 측정하였다.
이후, 셀에 PBS에 스트렙토아비딘 20 M를 녹여 0.8 mL/min의 속도로 흘려주면서 반사스펙트럼을 관찰하였다. 그 결과, 도 3에서 보이는 바와 같이, 굴절율 n의 증가로 인해 유효광학두께가 증가하였다. 백금전극의 많은 영향으로 유효광학두께가 높은 첫 번째 자리부터 아홉 번째 자리까지 전체적으로 스트렙토아비딘과 자리 결합하여 각각 유효광학두께가 증가한 것을 확인하였다. 다음으로 스트렙토아비딘의 남은 자리결합을 하고 항원 역할을 하는 바이오틴으로 유도화된 프로테인 A(biotinylted-protein A) 20μM를 녹인 PBS 용액을 동일속도로 셀에 흘려주었다.
도 3과 같이 스트렙토아비딘의 남은 자리와 바이오틴이 결합된 프로테인 A가 결합을 하여 굴절률 n의 증가로 인하여, 도 3에서 보이는 바와 같이, 유효광학두께의 변화를 확인하였다. 이때, 순수한 PBS를 흘려주어도 이미 결합을 한 결합은 변화를 보이지 않고 최종 유효광학두께를 유지한다. 이렇게 프로테인 A로 유도체화된 다공성 실리콘을 이용해 면역 화학 검사 시 면역성 질환, 만성 감염증, 흡수장애 증후군(Malabsorption Syndrome)의 원인이 되는 항체 IgG를 탐지하는 센서로서의 기능을 확인하였다.
역시 PBS 용매에 IgG 100μM을 녹여 0.8mL/min의 속도로 흘려준다. 항체인 IgG는 항원인 프로테인 A와 결합함으로써, 유효광학두께가 변화하였다(도 5).
따라서, 2×2㎠에 지름이 2mm인 9개의 식각된 영역을 확대하여, 4인치에 보다 많은 식각 영역을 만들어 주어 미지의 특정한 물질을 선택적으로 한 번에 탐지해 내기 위한 바이어 센서 칩을 개발하였다.
또한, 도 4는 지름을 다르게 하여 합성한 비대칭 식각으로 광학 인코딩된 다공성 실리콘으로서, 각각의 영역들은 서로 다른 광학 신호를 가지고 있다. A는 지름을 6mm로 하고 4인치 크기에 51개의 영역을 식각한 형태이고, B는 지름을 2mm하여 294개의 영역을 식각한 형태이다. 이러한 바이오센서는 각각 식각된 영역에 다양한 항체와 결합할 수 있는 항원을 연결하여 준다면 선택적이고 간편한 바이오센서로 활용될 수 있다.
실시예 1에서 제작된 다공성 실리콘 바이오센서를 이용하여 바이오물질인 스트렙토아비딘과의 분자인식에 대하여 연구를 수행하였다. 연구방법은 바이오물질이 기질과 결합함으로서 발생하는 굴절률의 변화로 인해 반사피크가 장파장으로 변위를 하게 된다. 이때, 감지 신호를 증폭하는 방법으로 장파장 변위를 광학두께의 변화로 변형하여 분석하였다.
<실시예 2> 루케이트 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서 제작
단계 1: 루게이트 다공성 실리콘의 제조
순수한 p-타입의 실리콘 단결정 웨이퍼(B dopped, <100>, 0.08∼0.012 mΩㆍ㎝)를 1.5㎠의 크기로 절단하고, 식각 전에 에탄올로 2∼3회 씻은 후 아르곤 가스로 표면처리하였다. 상기 실리콘 웨이퍼를 고정시킨 후, 컴퓨터에 의해 조절 가능한 전류공급기(Keithley 2420)를 이용하고 식각 용매로서, 48중량%의 HF 수용액(알드리치사 제품) 및 무수 에탄올(알드리치사 제품)의 3:1 v/v로 배합용매를 이용하여, 사인파를 흘려주며 전기화학적 식각을 수행하였다. 이때, 사인파의 전류는 150∼250 ㎃/㎠, 0.44 ㎐를 이용하였으며, 다공성 실리콘의 식각 면적은 1.0 ㎠으로 수행하였으며, 식각 후에는 에탄올과 아르곤 가스를 이용하여 세척 및 건조하여, 루게이트 다공성 실리콘을 제작하였다.
단계 2: 열적 산화
단계 1에서 얻은 루게이트 다공성 실리콘을 전기로(Thermolyne F6270-26 furnace equipped with controller)내 300℃ 온도에서 1시간 동안 가열하여 열적 산화 처리하였다.
단계 3: 산화된 다공성 실리콘 표면의 유도체화
상기 단계 2에서 산화된 다공성 실리콘을 3-아미노프로필트리메톡시실란(10 mmol, 99%, 알드리치사 제품) 1.8㎖를 넣고 80℃로 19시간동안 가열하고, 가열 후 톨루엔, 아세톤, 에탄올 순서로 세척한 다음 질소가스로 건조하여, 아민 그룹을 갖는 다공성 실리콘 표면을 제작하였다.
이후, 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체로서, 바이오틴(biotin)을 표면에 고착화시키기 위하여, 바이오틴 100㎎을 디클로로메탄 100㎖에 넣고 완전히 용해시킨 후, 1-(2-(디메틸아미노)프로필)-3-에틸카르보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 200㎎(1ｍmol)를 첨가하여 1시간동안 용해시켰다. 이후, 상기 열적 산화된 루케이트 다공성 실리콘을 첨가하여 밤새 반응하였다. 반응이 종결된 루케이트 다공성 실리콘 칩을 빼내어, 톨루엔, 디클로로메탄 및 인산완충용액(PBS, pH = 7.4)로 3회씩 세척하였다.
반응식 3
[규칙 제26조에 의한 보정 13.07.2009]　
Figure WO-DOC-3
<실험예 2>
실시예 2에서 제조된 루게이트 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 대하여, 성능분석을 하기와 같이 수행하였다.
1. 광 반사 스펙트럼 측정
상기 실시예 2에서 제조된 루게이트 다공성 실리콘에 대하여, 광학 프로브가 장착된 광학간섭기(Ocean optics USB2000)을 이용하여 광 반사 스펙트럼을 측정하였다. 이때, 텅스텐 광원은 다공성 실리콘의 표면에 거의 1∼2㎜ 점으로 초점을 맞추었고, 스펙트라는 CCD 검출기를 통하여, 400∼1200㎚ 파장영역을 기록하였다.
실시예 2에서 제조된 루게이트 다공성 실리콘의 광 반사 스펙트럼은 629 ㎚에서 매우 높고 매우 얇은 광 반사 스펙트럼을 보였으며, 루게이트 다공성 실리콘의 필름의 반측 띠폭값(full-width at half-maximum, FWHM)은 15㎚으로 관찰되었다. 이러한 결과는 양자점(quantum dot)이 갖는 20㎚보다 더 얇은 값이며, 루게이트 다공성 실리콘의 대표적인 특징은 유기 염료나 코어-쉘 양자점으로부터 발광하는 스펙트럼보다 더 얇다. 따라서, 더욱더 많은 얇은 스펙트라를 갖는 루게이트 다공성 실리콘을 제조할 수 있다.
2. FT-IR 스펙트럼 측정
상기 실시예 2에서 제조된 루게이트 다공성 실리콘의 각 단계별 반응을 FT-IR(Nicolet model 5700)을 통하여 확인하였다. FT-IR 스펙트라는 확산반사(Spectra-Tech diffuse reflectance attachment)방식을 이용하여 측정하였다[미도시].
그 결과, 300℃에서 열적 산화된 다공성 실리콘의 표면은 열적 산화이전의 Si-H의 신축 진동 영역인 2085∼2150cm-1의 피크가 줄어들고, OSi-H의 신축 진동과 굽힘 진동이 각각 2200∼2250 및 877cm-1에서 보이고, Si-O-Si의 진동은 1000∼1200cm-1에서 강하게 나타남으로써, 다공성 실리콘의 표면이 Si-H에서 Si-OH로 산화되었음을 확인하였다.
또한, 산화된 루게이트 다공성 실리콘의 흡광밴드는 산화된 루게이트 다공성 실리콘 샘플이 거의 O를 포함하고, H는 거의 없음을 뒷받침하였다. 이러한 결과는 산화가 되면서 순수한 루게이트 다공성 실리콘의 Si-H의 종류가 사라졌음을 의미한다. 또한, 광 반사 스펙트럼이 초기 629㎚에서 556㎚로 73㎚정도 단파장 이동하였는데, 이러한 결과로부터, Si에서 SiO2로 변하면서 굴절률의 감소가 일어났음을 알 수 있다.
열적 산화 처리이후, 다공성 실리콘의 Si-OH 표면이 아민그룹으로 유도체화되면, 아민결합으로 인한 신축진동 3386cm-1에서 굽힘진동 1575cm-1 피크를 확인하였다. 또한, 체인형태의 C-H 신축진동은 2850, 2923, 2952cm-1에서 확인하였다.
이후, 바이오틴이 유도화된 다공성 실리콘의 FT-IR 스펙트럼 결과는 바이오틴의 머리에 해당하는 C-C 신축진동은 1652cm-1에서 확인함으로써, 반응된 바이오틴이 결합되었음을 확인하였다.
3. 표면 고정화 반응 검증
상기 실시예 2의 단계 3에서 제조된 아민 그룹의 표면 고정화 반응을 확인하기 위하여, 2-피리딜-2-카르복실에틸 디설피드를 표면에 결합시키고 디싸이오쓰레이톨(dithiothreitol, DTT)에 의해 떨어지는 2-싸이오피리돈(thiopyridone)의 정량 분석하였다[미도시].
방출되는 2-싸이오피리돈의 정량을 자외선 분광기(UV-2401 PC, Shimazu, λmax=343nm, ε= 8.08×103 M-1cm-1)를 통해 확인하였다. 그 결과, 실시예 2에서 150∼250 mA/㎟ 전류에 의해 식각된 다공성 실리콘의 경우 연결된 분자의 숫자는 대략 30∼80%가 표면에 결합한다고 했을 때, 그 정량은 300nmol/㎟이다. 이를 계산해 보면, 구멍의 크기는 평균 10nm이고, 1.2㎠의 영역에 평균 0.03Å2 간격으로 바이오틴 결합을 확인하였다.
4. 루게이트 다공성 실리콘의 표면관찰
상기 실시예 2에서 제조된 루게이트 다공성 실리콘의 표면을 주사전자현미경(SEM, FE-SEM, S-4700, Hitach)를 이용하여 측정하였다.
도 5는 루게이트 다공성 실리콘의 표면에 대한 SEM 측정결과로서, 상기 루게이트 다공성 실리콘의 기공크기는 10nm이었으며, 이 기공을 이용하여 56×50×40Å의 크기를 갖는 아비딘 탐지가 가능하다.
5. 바이오 센서로서의 바이오 물질의 탐지
상기 실시예 2에서 제조된 바이오틴으로 유도화된 루게이트 다공성 실리콘에 아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화를 관찰하였다.
도 6은 실시예 2에서 제조된 루게이트 다층 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화로서, 반사 스펙트럼에서 반사파장이 18㎚으로 장파장 이동하였다. 이러한 결과는 바이오틴으로 유도화된 다공성 실리콘 필름에 아비딘과 결합하여 굴절률의 변화가 일어났기 때문이며, 이러한 증가는 수용액 상의 아비딘이 결합하였음을 의미한다.
<실시예 3> 광학 인코딩된 루케이트 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서 제작
단계 1: 광학 인코딩된 루게이트 다공성 실리콘의 제조
순수한 p++-타입의 실리콘 웨이퍼(B dopped, <100>, 0.0008∼0.0012Ω)를 이용하고, 컴퓨터 프로그램(Matlab)을 사용하여 3가지 사인파형의 혼합된 전류 즉, 전류의 세기를 126.1∼183.85 mAㆍcm-2에 0.58, 0.54, 0.50Hz의 혼성된 사인파형을 500초 동안 흘려주는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 일정한 패턴의 기공(pore)과 깊이(depth)를 갖는 광학 인코딩된 루게이트 다공성 실리콘을 제조하였다.
단계 2: 열적 산화
단계 1에서 식각된 루게이트 다공성 실리콘을 전기로(Thermolyne F6270-26 furnace equipped with controller)내 300℃ 온도에서 3시간 동안 가열하여 열적 산화 처리하였다.
단계 3: 산화된 다공성 실리콘 표면의 유도체화
상기 단계 2에서 산화된 다공성 실리콘을 3-아미노프로필트리메톡시실란(10 mmol, 99%, 알드리치사 제품) 1㎖를 넣고 80℃로 12시간동안 가열하고, 가열 후 에탄올, 디클로로메탄, 아세톤 순서로 세척한 다음 질소가스로 건조하여, 아민 그룹을 갖는 다공성 실리콘 표면을 제작하였다.
이후, 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체로서, 바이오틴(biotin)을 표면에 고착화시키기 위하여, 바이오틴 테트라플로로페닐 에스테르 100mg를 N,N-디메틸포름아마이드 용매에 용해한 후, 촉매로서 트리에틸아민 0.9㎖를 넣고 30분간 높은 속도로 교반하였다. 상기 교반액에 상기에서 제조된 아민 그룹을 갖는 다공성 실리콘을 첨가하고 실내온도에서 12시간동안 반응하였다. 반응종료 후, 에탄올, 디클로로메탄, 아세톤 순서로 세척한 다음 질소가스로 건조시켰다.
단계 4: 바이오 물질의 탐지
상기 바이오틴으로 유도화된 다공성 실리콘 칩을 이용하여 바이오 물질들을 선택적으로 탐지하는 연구를 수행하고자, 상기 바이오틴으로 유도화된 다공성 실리콘 칩을 플로우 셀(flow cell)에 고정시킨 상태에서 0.8㎖/min의 유속으로 스트렙토아비딘(streptavidin) 또는 아비딘을 탐지대상으로 설정하였다.
반응식 4
[규칙 제26조에 의한 보정 13.07.2009]　
Figure WO-DOC-4
<실험예 3>
실시예 3에서 제조된 광학 인코딩된 루게이트 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 대하여, 성능분석을 하기와 같이 수행하였다.
1. 광 반사 스펙트럼 측정
상기 실시예 3에서 제조된 광학 인코딩된 루게이트 다공성 실리콘을 이용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 1 및 2와 동일한 방법으로 광 반사 스펙트럼을 측정하였다.
도 7은 실시예 3에서 제조된 광학 인코딩된 루게이트 다공성 실리콘의 광 반사 스펙트럼으로서, 17, 16, 17nm의 반측 띠폭값(FWHM)을 가지고 있으며, 631, 674, 725nm의 특정 파장에서 반사 스펙트럼이 관찰되었다.
2. FT-IR 스펙트럼 측정
상기 실시예 3에서 제조된 광학 인코딩된 루게이트 다공성 실리콘을 이용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 1 및 2와 동일한 방법으로 FT-IR(Nicolet model 5700) 스펙트라를 얻었다[미도시].
그 결과, 300℃에서 열적 산화된 다공성 실리콘의 표면은 Si-H의 신축 진동 영역인 2085∼2150cm-1의 피크가 줄어들고, OSi-H의 신축 진동과 굽힘 진동이 각각 2200∼2250 및 877cm-1에서 보이고, Si-O-Si의 진동이 1000∼1200cm-1에서 강하게 나타남으로써, 다공성 실리콘의 표면이 Si-H에서 Si-OH로 산화되었음을 확인하였다.
또한, 산화된 루게이트 다공성 실리콘의 흡광밴드는 산화된 루게이트 다공성 실리콘 샘플이 거의 O를 포함하고, H는 거의 없음을 뒷받침하였다. 이러한 결과는 산화가 되면서 순수한 루게이트 다공성 실리콘의 Si-H의 종류가 사라졌음을 의미한다. 또한, 광 반사 스펙트럼이 초기 629㎚에서 556㎚로 73㎚정도 단파장 이동하였는데, 이러한 결과로부터, Si에서 SiO2로 변하면서 굴절률의 감소가 일어났음을 알 수 있다. 또한, 산화된 다공성 실리콘은 굴절율(n)이 감소함에 따라, 그 유효광학두께도 변화하게 되는데 첫 번째 포지션을 기준으로 평균 31 nm 이동하였다.
열적 산화 처리이후, 다공성 실리콘의 Si-OH 표면이 아민그룹으로 유도체화되면, 아민결합으로 인한 신축진동 3386cm-1에서 굽힘진동 1575cm-1 피크를 및 체인형태의 C-H 신축진동은 2850, 2923, 2952cm-1에서 확인함으로써, 아민그룹 유도체화 반응을 확인하였다.
또한, 바이오틴이 유도화된 다공성 실리콘의 FT-IR 스펙트럼 결과는 바이오틴의 머리에 해당하는 C-C 신축진동은 1652cm-1에서 확인함으로써, 반응된 바이오틴이 결합되었음을 확인하였다.
3. 표면 고정화 반응 검증
상기 실시예 3에서 제조된 아민 그룹의 표면 고정화 반응을 확인하기 위하여, 2-피리딜-2-카르복실에틸 디설피드를 표면에 결합시키고 디싸이오쓰레이톨(dithiothreitol, DTT)에 의해 떨어지는 2-싸이오피리돈(thiopyridone)의 정량 분석하였다[미도시].
방출되는 2-싸이오피리돈의 정량을 자외선 분광기(UV-2401 PC, Shimazu, λmax=343nm, ε= 8.08×103 M-1cm-1)를 통해 확인하였다. 그 결과, 126.1∼183.85 mA/㎠ 전류에 의해 식각된 실시예 3의 다공성 실리콘의 경우, 연결된 분자의 숫자는 대략 30∼80%가 표면에 결합한다고 했을 때, 그 정량은 300nmol/㎠이다. 이를 계산해 보면, 구멍의 크기는 평균 15nm이고, 다공성도는 81.7%, 식각된 층의 두께는 68.4 μm이며 1.2㎠의 영역에 평균 0.07Å2 간격으로 바이오틴 결합을 확인하였다.
4. 루게이트 다공성 실리콘의 표면관찰
상기 실시예 3에서 제조된 루게이트 다공성 실리콘의 표면을 주사전자현미경(SEM, FE-SEM, S-4700, Hitach)를 이용하여 측정하였다.
도 8은 루게이트 다공성 실리콘의 표면에 대한 SEM 측정결과로서, 상기 루게이트 다공성 실리콘의 기공크기는 15nm이었다.
5. 바이오 센서로서의 바이오 물질의 탐지
상기 실시예 3에서 제조된 바이오틴으로 유도화된 루게이트 다공성 실리콘에 스트렙토아비딘(streptavidin) 또는 아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화를 관찰하였다.
도 9는 실시예 3에서 제조된 루게이트 다층 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화로서, 아비딘은 반사피크 각각이 9, 10, 11nm 장파장으로 이동하였고, 스트렙토아비딘은 12, 13, 15nm 장파장으로 이동하였다.
아비딘보다 스트렙토아비딘이 더 많은 이동 폭을 보였으며, 아비딘은 56×50×40Å이고, 스트렙토아비딘은 54×58×48 Å의 크기를 가지고 있다. 따라서, 스트렙토아비딘이 아비딘보다 더 큰 분자크기를 가지고 있기 때문에, 굴절율에 미치는 영향이 커서 조금 더 장파장으로 이동한 것으로 예측할 수 있다.
또한 BET식을 이용하여 비표면적을 측정하였다. 산화된 다공성 실리콘의 비표면적은 표 1에 나타나 있다.
Figure PCTKR2009002320-appb-I000009
그 결과, 바이오틴으로 유도체화된 다공성 실리콘은 그 표면에 바이오틴으로 유도체화되어 비표면적의 길이가 증가하는 것을 확인할 수 있고, 바이오틴과 스트렙토아비딘이 결합하여 그 비표면적이 증가함을 확인하였다.
<실시예 4> DBR 다공성 실리콘 입자를 이용한 바이오센서 제작
단계 1: DBR 다층 다공성 실리콘의 제조
낮은 저항값을 갖는 p++-타입의 실리콘 단결정 웨이퍼(B dopped, <100>, 0.8∼1.2 mΩㆍ㎝)를 전류공급기(Keithley 2420)를 이용하여 직각파 전류를 흘려주어 전기 화학적 식각하여, DBR 다층 다공성 실리콘을 제조하였다. 식각용매로는 HF 용액 (48중량% 알드리치사 제품)과 순수한 에탄올 (알드리치사 제품)을 사용하였으며 HF:에탄올 = 3:1의 부피비로 식각하였다. 전기화학적 식각은 두개의 전극을 사용하여 테프론 셀 내에서 수행하였다. 이때, 흘려준 전류는 주기적으로 변하는 서로 다른 다공성(porosity)을 생성하기 위해 낮은 전류에 해당하는 30 ㎃/㎠를 11초, 높은 전류에 해당하는 300 ㎃/㎠를 1.5초 동안 교대로 흘려주어 30회 수행하였다. 상기 조건으로 합성된 DBR 다공성 실리콘 샘플은 식각 후 에탄올로 여러 번 씻어주고 사용하기 전에 아르곤 가스로 건조시켰다. 도 11에서 보이는 바와 같이, 낮은 전류와 높은 전류의 크기를 바꾸어줌에 따라 가시광선 영역에서 다양한 색을 반사하는 반사체를 얻을 수 있다.
단계 2: DBR 다공성 실리콘 필름 분리
상기 단계 1에서 합성된 DBR 다공성 실리콘을 전자연마작업을 통하여 실리콘 기판으로부터 필름형태로 분리시켰다. 전자연마작업 또한 DBR 다공성 실리콘의 제조는 테프론 셀에서 수행하였다. 이때, 정전압기(Potentiostat/Galvanostat 363모델, EG & E Instrument)를 이용하여 460 ㎃/㎠의 정전류를 100 초 동안 흘려주었다. 이때, HF:에탄올= 3:1의 부피비의 용매를 사용하였다. 이후, 다시 HF:에탄올= 1:15의 부피비로 제조된 용매를 사용하여 29㎃/㎠의 정전류를 200초 동안 흘려주었다. DBR 다공성 실리콘 기판을 핀셋으로 잡아 유리판 위에서 필름이 손상되지 않도록 에탄올을 흘려주어 실리콘 기판으로부터 DBR 다공성 실리콘을 분리시켰다.
단계 3: 열적 산화
단계 2에서 분리된 DBR 다공성 실리콘 필름을 전기로(Thermolyne F6270-26 furnace equipped with controller)내 300℃ 온도에서 3시간 동안 가열하여 산화 처리하였다. 상기 열적 산화를 통하여 Si-H로 종결된 다공성 실리콘 표면을 Si-O-Si 또는 Si-OH로 종결되도록 한다.
단계 4: 광학적으로 암호화된 DBR 다공성 실리콘 입자의 제작
상기 단계에서 실리콘 기판에서 분리된 DBR 다공성 실리콘 필름을 에탄올, THF 또는 아세톤에서 선택되는 유기용매 하에서 슈렝크 플라스크를 이용하여 약 10분 동안 초음파 분쇄하여, 광학적으로 암호화된 DBR 다공성 실리콘 스마트 입자(Optically Encoded Smart Particle)를 제조하였다.
상기 분리된 DBR 다공성 실리콘 필름은 매우 얇기(∼수 마이크론) 때문에 쉽게 초음파분쇄를 통하여 입자를 얻을 수 있는 장점이 있고, 초음파로 분쇄되기 때문에 분쇄된 입자들이 광학적인 특성을 유지하고, 생성된 기공에 손상없이 제조할 수 있다. 이렇게 얻어진 약한 나노네트워크 구조는 쉽게 부스러지면서 다양한 크기의 개별적 입자로 얻어진다. 도 12는 본 발명의 광학 인코딩된 다공성 실리콘 필름을 10분 동안 초음파 분쇄시킨 DBR 다공성 실리콘 입자를 나타낸 것이다.
단계 5: 산화된 다공성 실리콘 표면의 유도체화
상기 제작된 DBR 다공성 실리콘 입자를 바이오센서로 응용하기 위하여 표면을 감지인식체로 기능화하여 바이오 분자를 인식할 수 있도록 설계하였다.
250㎖ 슈렝크 플라스크에 디하이드록시실올 500mg(1.2 mmol)과 3-아미노프로필트리메톡시실란 1.8㎖(10 mmol, 99%, Aldrich Chemicals)을 50㎖ 톨루엔에 용해시킨 다음, 상기 제작된 DBR 다공성 실리콘 입자를 넣고 24 시간동안 환류 교반하여, DBR 다공성 실리콘 입자표면을 유도체화하였다. 반응이 끝난 후, 샘플은 에탄올, 메틸렌클로라이드, 아세톤 순서로 세척한 다음, 질소가스로 건조시켜 DBR 다공성 실리콘 입자표면이 아민(amine) 그룹과 실올(silole) 그룹으로 기능화된 입자들을 얻었다.
이후, 생물분자를 인식할 수 있는 감지인식체로서 바이오틴 테트라플로로페닐 에스테르 100mg를 N,N-디메틸포름아마이드 용매에 용해한 후, 촉매로서 트리에틸아민 0.9㎖를 넣고 30분간 높은 속도로 교반하였다. 상기 교반액에 아민그룹과 실올 그룹으로 표면 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자를 넣고 실온에서 약 12시간동안 반응하여, 바이오틴 및 실올로 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자를 제조하였다.
반응식 5
[규칙 제26조에 의한 보정 13.07.2009]　
Figure WO-DOC-5
단계 6: 바이오 물질의 탐지
바이오틴 및 실올로 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자를 플로우 셀(flow cell)에 고정시킨 상태에서 인체내의 pH와 비슷한 환경을 만들어 주기 위하여 인산완충용액(PBS) pH=7를 먼저 흘려주어 안정화를 시킨 후, 0.8㎖/min의 유속으로 PBS 용액에 용해시킨 면역 단백질인 아비딘, 스트렙토아비딘을 흘려주어 DBR 다공성 실리콘 입자들의 반사 파장이 이동하는 것을 확인하였다.
반응식 6
[규칙 제26조에 의한 보정 13.07.2009]　
Figure WO-DOC-6
<실험예 4>
실시예 1에서 광학 인코딩된 바이오틴 및 실올로 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자를 이용한 바이오센서에 대하여, 성능분석을 수행하였다.
1. 광 반사 스펙트럼 측정
상기 실시예 1에서 제조된 광학 인코딩된 바이오틴 및 실올로 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자에 대하여, 광학 프로브가 장착된 광학간섭기(Ocean optics USB2000)을 이용하여 광 반사 스펙트럼을 측정하였다. 이때, 텅스텐 광원은 다공성 실리콘의 표면에 거의 1∼2㎜ 점으로 초점을 맞추었고, 스펙트라는 CCD 검출기를 통하여, 400∼1200㎚ 파장영역을 기록하였다.
그 결과, 바이오틴 및 실올로 표면 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자는 두 가지 독특한 광학적 특징을 보인다.
도 13은 본 발명의 바이오틴 및 실올로 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자의 광 발광 스펙트럼(실선) 및 반사 스펙트럼(점선)을 나타낸 것으로서, λmax 607 nm에서의 매우 얇은 광 반사성과 λem 505 nm에서의 매우 밝은 광 발광성을 갖는다. 이때, 바이오틴 및 실올로 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자는 반사 스펙트럼의 반측 띠폭값이 약 20 ㎚이하의 값을 갖는다.
또한, 상기 바이오틴 및 실올로 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자를 이용한 바이오센서를 백색광원(위) 및 자외선등(아래)에서 촬영한 사진이다. 상기에서 보이는 바와 같이, 자외선등에서 촬영한 사진은 각 입자들이 녹색 빛으로 발광하는 것을 확인할 수 있다.
2. FT-IR 스펙트럼 측정
상기 실시예 1에서 광학 인코딩된 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서의 각 단계별 반응을 FT-IR(Nicolet model 5700)을 통하여 확인하였다. FT-IR 스펙트라는 확산반사(Spectra-Tech diffuse reflectance attachment)방식을 이용하여 측정하였다[미도시].
그 결과, 300℃에서 열적 산화된 다공성 실리콘의 표면은 Si-H의 신축 진동 영역인 2085∼2150cm-1의 피크가 줄어들고, OSi-H의 신축 진동과 굽힘 진동이 각각 2277 및 883cm-1에서 보이고, Si-O-Si의 진동이 1100cm-1에서 강하게 나타남으로써, 다공성 실리콘의 표면이 Si-H에서 Si-OH로 산화되었음을 확인하였다.
또한, 아민결합의 신축진동을 3300cm-1에서 굽힘 진동은 1579cm-1에서 피크를 확인하고, 체인형태의 C-H 신축진동은 2858, 2954cm-1에서 확인함으로써, 표면의 아민 유도체화를 확인하였다.
또한, 아비딘과 스트렙토아비딘의 탐지를 위하여 바이오틴을 반응시킨 후 바이오틴 및 실올로 유도체화된 DBR 다공성 실리콘 입자의 흡수 스펙트럼을 측정한 결과, 바이오틴의 머리 그룹인 카보닐기(carbonyl group)의 신축진동을 1682cm-1에서 확인함으로써, 반응된 바이오틴이 결합되었음을 확인하였다.
3. 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘의 표면관찰
상기 실시예 4에서 제조된 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘의 표면을 주사전자현미경(SEM, FE-SEM, S-4700, Hitach)를 이용하여 측정하였다.
도 14는 본 발명의 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘의 표면에 대한 SEM 측정결과로서, SEM 사진에서 확인할 수 있는 바와 같이, 약 수십 마이크론 크기의 입자 표면에 수많은 기공들이 존재하였다.
또한, 상기 다공성 실리콘의 기공크기가 약 ∼50nm정도, 더욱 바람직하게는 2∼50㎚ 크기를 갖는 메조포어(mesopore) 형태로 형성되어 있다는 것을 확인하였으며, 이러한 결과로부터, 56×50×40Å의 크기를 갖는 아비딘 또는 54×58×48Å의 크기를 갖는 스트렙토아비딘의 탐지가 가능함을 증명하였다.
4. 바이오 센서로서의 바이오 물질의 탐지
상기 실시예 1에서 제조된 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘에 스트렙토아비딘 또는 아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화를 관찰하였다.
도 15는 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘 입자의 제조단계별로 측정한 광 반사 스펙트럼으로서, 최초 순수한 DBR 다공성 실리콘 입자는 20nm의 반측 띠폭값을 갖고, 624nm에서 반사 피크를 나타내었다. 이후 열적 산화과정을 거치면, 단파장으로 약 44nm를 이동하고, 다시 아민그룹과 실올그룹으로 표면이 유도체화되면, 약 20nm 이동하여 600nm로 장파장 이동하였다. 최종적으로, 면역 단백질을 검출하기 위하여, 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘 입자는 610 nm에서 반사 피크를 나타내었다. 따라서, 열적 산화를 통하여 반사피크가 단파장으로 이동한 것은 DBR 다공성 실리콘 입자 기공내의 굴절률이 감소하여 브래그 식에 의하여 단파장으로 이동한 결과이고, 장파장으로 이동한 것은 굴절률이 증가하여 역시 브래그 식에 따라 장파장으로 이동하였음을 확인하였다.
도 16은 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 스트렙토아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화로서, 반사 파장이 14㎚ 장파장 이동하였다. 이러한 결과는 바이오틴 및 실올로 기능화된 DBR 다공성 실리콘 입자에 스트렙토아비딘이 결합함으로써, 굴절률의 변화가 일어났음을 확인하였다.
도 17은 바이오틴 및 실올로 유도체화된 다공성 실리콘을 이용한 바이오센서에 스트렙토아비딘을 흘려주었을 때 광 반사 스펙트럼의 변화로서, 반사 파장이 17㎚ 장파장 이동 결과를 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은
첫째, 전기화학적으로 식각된 다공성 실리콘의 표면을 안정화시키고 면역단백질 탐지에 적합하도록 제작된 다공성 실리콘을 이용한 면역단백질 탐지용 바이오센서를 제공하였다.
둘째, 특정의 다공성 실리콘에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사 특성을 이용하여 탐지효율을 높인 바이오센서를 제공하였다.
셋째, 특정의 단층 또는 다층 구조의 다공성 실리콘을 광학 인코팅함으로써, 여러 가지 분석물질들을 단시간에 감지할 수 있다.
넷째, 바이오틴으로 유도화된 다공성 실리콘을 이용함으로써, 바이오틴과 결합가능한 면역단백질, 아비딘, 스트렙토아비딘, 항체 IgG 및 단백질-A에 탐지가능한 항원항체 면역시스템에 활용할 수 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (20)

  1. 전기화학적 식각방법으로 제조된 다공성 실리콘의 표면을 열적 산화하고 그 표면에 아민 유도체를 유도한 후, 상기 아민 유도체 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시킨 다공성 실리콘에,
    광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사를 이용하여 면역단백질을 탐지하는 면역단백질 탐지용 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다공성 실리콘이 정전류를 이용하여 전기화학적으로 비대칭 식각되어 제조된 단층 다공성 실리콘인 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서.
  3. 제1항에 있어서, 상기 다공성 실리콘이 사인(sine)파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어 제조된 다층 다공성 실리콘인 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서.
  4. 제3항에 있어서, 상기 다공성 실리콘이 중심전류 값을 150∼250 ㎃/㎠로 하고, 1∼200 초 주기로 하는 사인파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 단일 반사 피크(Rugate Single Peak)를 가지는 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서.
  5. 제3항에 있어서, 상기 다공성 실리콘이 중심전류 값을 120∼200 ㎃/㎠로 하고, 2 내지 30개의 사인파형의 혼합된 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 2 내지 30개의 다중 반사 피크(Rugate Multiple Peak)를 가지는 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다공성 실리콘이 초음파 분쇄된 다공성 실리콘 입자인 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 실리콘이 2∼50㎚ 크기의 메조포러스 기공을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서.
  8. 제1항에 있어서, 상기 감지인식체가 바이오틴, 그의 유도체 또는 바이오틴으로 유도화된 프로테인 A에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서.
  9. 제1항에 있어서, 상기 면역단백질이 아비딘, 스트렙토아비딘, 항체 IgG 및 프로테인-A로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서.
  10. 1) 실리콘웨이퍼를 전기화학방법으로 식각하여 400∼2000nm에서 단일 반사 피크 또는 다중 반사 피크를 가지는 다층 다공성 실리콘을 준비하는 공정,
    2) 상기 다공성 실리콘을 300∼1200℃ 온도조건에서 1∼60분 동안 수행하여 표면이 산화된 다공성 실리콘 필름을 형성하는 공정,
    3) 상기 산화된 다공성 실리콘 표면에 아민 유도체를 유도 반응한 후, 상기 아민 유도체의 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체를 고착시키는 공정 및
    4) 상기 다공성 실리콘에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사를 이용하여 면역단백질을 탐지하는 공정을 포함한 바이오센서의 제조방법.
  11. 1) 실리콘웨이퍼를 전기화학방법으로 식각하여 400∼2000nm에서 단일 반사 피크 또는 다중 반사 피크를 가지는 다층 다공성 실리콘을 준비하는 공정,
    2) 상기 다공성 실리콘을 상기 실리콘웨이퍼에서 다공성 실리콘 필름으로 분리하는 공정,
    3) 상기 다공성 실리콘 필름을 300∼1200℃ 온도조건에서 1∼3시간 동안 가열하여 표면이 산화된 다공성 실리콘 필름을 형성하는 공정,
    4) 상기 산화된 다공성 실리콘 필름을 분쇄하는 공정,
    5) 상기 분쇄된 다공성 실리콘 입자 표면에 아민 유도체를 유도 반응한 후, 상기 아민 유도체의 말단에 바이오물질을 인식할 수 있는 감지인식체 및 광발광성인 실올 화합물을 고착시키는 공정 및
    6) 상기 다공성 실리콘 입자에 광원을 입사하고, 상기 입사한 광원의 광학적 반사거동으로 면역단백질을 탐지하는 공정을 포함한 바이오센서의 제조방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 단계 1)의 다공성 실리콘이 2∼50㎚ 크기를 갖는 메조포러스의 다공성 실리콘으로 제조된 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 단계 1)의 다공성 실리콘이 정전류를 이용하여 전기화학적으로 비대칭 식각되어 단층 다공성 실리콘으로 제조된 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법.
  14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 단계 1)의 다공성 실리콘이 사인(sine)파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어 다층 다공성 실리콘으로 제조된 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법.
  15. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 단계 1)의 다공성 실리콘이 중심전류 값을 150∼250 ㎃/㎠로 하고, 1∼200 초 주기로 하는 사인파 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 단일 반사 피크(Rugate Single Peak)를 가지는 다공성 실리콘으로 제조된 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법.
  16. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 단계 1)의 다공성 실리콘이 중심전류 값을 120∼200 ㎃/㎠로 하고, 2 내지 30개의 사인파형의 혼합된 전류를 이용하여 전기화학적으로 식각되어, 400∼2000nm에서 2 내지 30개의 다중 반사 피크(Rugate Multiple Peak)를 가지는 다공성 실리콘으로 제조된 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법.
  17. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 열적 산화된 다공성 실리콘의 표면이 Si-OH형으로 산화된 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법.
  18. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 감지인식체가 바이오틴, 그의 유도체 또는 바이오틴으로 유도화된 프로테인 A에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법.
  19. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 면역단백질이 아비딘, 스트렙토아비딘, 항체 IgG 및 프로테인-A로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법.
  20. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 광원이 텅스텐-할로겐램프, LED(Light Emitting Diode) 또는 레이저에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 바이오센서의 제조방법
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