WO2009132810A1 - Verfahren zum kalibrieren einer ablenkeinheit in einem tirf-mikroskop, tirf-mikroskop und verfahren zu dessen betrieb - Google Patents

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WO2009132810A1
WO2009132810A1 PCT/EP2009/003035 EP2009003035W WO2009132810A1 WO 2009132810 A1 WO2009132810 A1 WO 2009132810A1 EP 2009003035 W EP2009003035 W EP 2009003035W WO 2009132810 A1 WO2009132810 A1 WO 2009132810A1
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sample
angle
deflection unit
incidence
total reflection
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PCT/EP2009/003035
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Mattias Gonschor
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Carl Zeiss Microimaging Gmbh
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the invention in a first aspect relates to a method for calibrating a deflection unit in a TIRF microscope.
  • the invention in a second aspect, relates to a TIRF microscope.
  • the invention in another aspect, relates to a method of operating a TIRF microscope.
  • the angle of incidence is usually adjusted via a motor-driven deflection unit and influenced by the mechanical-optical manufacturing tolerances of the microscope components used, such as filter set or lens. Therefore, a calibration of the deflection unit is necessary for every combination of components with different mechanical dimensions.
  • the object of the invention is to specify a method and to provide a TIRF microscope with which a deflection unit in a TIRF microscope can be calibrated more accurately in comparison to the prior art and further essential parameters of the evanescent field in a sample can be determined ,
  • the invention also provides a method for operating a TIRF microscope according to claim 18.
  • a setting of the deflection is chosen so that the associated angle of incidence is certainly greater or safe smaller than an expected critical angle for the Total reflection of the excitation light on a surface of a sample used. Then, the angle of incidence is scanned by changing the setting of the deflecting unit toward an expected critical angle, and for each setting of the deflecting unit, an intensity of an optical response of the sample used caused by the exciting light is measured.
  • the intensity of the optical response of the sample used is measured at least for as many settings of the deflection unit as the intensity of the optical response of the sample used is a flank passes through and the flank belonging to the setting of the deflection unit is stored as a setting for the critical angle of total reflection on the sample used.
  • the excitation light used is usually a laser source. However, other types of excitation light, such as e.g. Conventional mercury arc lamps are used.
  • adjustment of the deflection unit can be used to specify an angle setting or else another setting option, such as, for example, the adjustment of the deflection unit.
  • a lateral deflection adjustment can be understood.
  • the intensity measurement can be carried out integrally via the objective pupil or a plane conjugate thereto.
  • the objective pupil here is understood to be the focal plane of the objective which is devoid of the sample.
  • the adjustment of the deflection unit is automatically changed such that the focus of the excitation light once moves across the entire objective pupil.
  • the excitation light is focused on a point in the objective pupil. Since this is the focal plane of the objective facing away from the specimen, the bundle of rays which converges at this point is imaged on the specimen side in parallel light which strikes the specimen under a certain angle of incidence, which is identical for all the rays.
  • the location of the focus of the excitation light or the excitation beam in the objective pupil thus determines the angle at which the sample is illuminated. If the point in the objective pupil is scanned centrally across the objective pupil, the angle of incidence of the excitation light changes from a large positive angle of incidence through vertical incidence up to a large negative angle of incidence.
  • each beam In the case of a circular pupil illumination, in which each beam is at an identical distance from the central optical axis, each beam likewise impinges on the sample at the same angle relative to the sample.
  • the one that fits the sample Single rays are not parallel to each other. However, the beam has a cylindrical symmetry.
  • a significant advantage of the method according to the invention is that the original TIRF objective and the original excitation filter set can be used.
  • the biological sample used itself can be used for calibration. No special test preparation is necessary.
  • the refractive index of the sample need not be known.
  • the evaluation is very robust. Both the entire camera image and parts of the pupil image can be evaluated.
  • Another advantage of the method according to the invention is that the system can calibrate itself. In contrast to the method in document DE 10 2006 021 996 A1, no calibrated detector element is required.
  • the TIRF microscope according to the invention for carrying out the method according to the invention comprises the following components: a light source for emitting the excitation light, a microscope optics for letting the excitation light on the sample used, the deflection unit for adjusting the angle of incidence of the excitation light on the surface of the sample used and a detector for detecting the optical response of the sample used.
  • a detector e.g. a CCD, a photomultiplier, a PSD, photodiodes or similar detection devices are used for light.
  • the solution according to the invention requires only a very small additional hardware expenditure.
  • only one auxiliary lens is needed to realize the invention.
  • the invention use is made of the fact that, when the limit angle of total reflection is reached and exceeded, the penetration depth of the excitation light into the sample decreases rapidly and then only a few 10 to 100 nm. This has the consequence that the background fluorescence from sample parts, which are farther away from the cover glass, drops rapidly.
  • Optical response is understood to mean a reaction of the sample used to an external excitation by light.
  • the excitation light should in this case not be limited to visible light, it may also be meant in particular infrared and ultraviolet light.
  • the reaction of the sample used to such excitation can also be varied.
  • the excitation light can either be scattered or absorbed and then emitted again.
  • any type of luminescence radiation in particular fluorescence radiation, should be understood. Generally so !! optical response means any radiation reaction of the sample to light excitation.
  • the deflection unit To calibrate the deflection unit, adjust it so that the associated angle of incidence is certainly greater or smaller than an expected limit angle for the total reflection. Thereafter, the angle of incidence is scanned toward an expected critical angle and, at the same time, the intensity emitted by the sample is measured. The then traversed edge is measured and evaluated. The same procedure is used for punctual pupil illumination of the TIRF objective for the second critical angle of total reflection, which differs from the first critical angle of total reflection only by its sign. From the edges of the angle-dependent intensity curve and the associated settings of the deflection unit, the zero point setting of the deflection unit, also called the angular offset, can then be determined.
  • n p n d sin a ⁇ .
  • the penetration depth d of the evanescent field can be determined from the angle of incidence ⁇ according to the following relationship:
  • the penetration depth d is understood to be the length in the direction of the optical axis at which the intensity of the evanescent field in the sample is at the e-th part corresponding to a value of approximately 0.37 of the intensity of the light field decayed at the interface.
  • the optical response of the sample used is measured in a plane conjugate to the plane of an objective pupil. Since the objective pupil is a common passage surface for all light cones of the optical image, the objective pupil is particularly well suited for measuring the optical response of the sample. Equivalent to this is a measurement of the optical response in a plane conjugate to the objective pupil.
  • the optical response is measured with a detector, in particular with a camera.
  • the camera can be used particularly advantageously, which is used in the TIRF measuring operation. When changing from measuring to calibration mode and vice versa no replacement of the camera is necessary.
  • the objective pupil can be imaged by imaging optics on the camera detector, and by means of a special software-controlled read-out technique, only partial regions of the camera detector can be used for the evaluation. It is particularly preferred in this case to evaluate a circular section which is only slightly larger than the image of the likewise circular objective pupil. However, it is also possible to use circular sections of the objective pupil image or rectangular sections which comprise a semicircle of the objective pupil image.
  • the angle of incidence is scanned only in an environment of the expected critical angle or an expected critical angle. Since the zero point adjustment ⁇ o of the deflection unit, which corresponds to an angle of incidence of 0 °, in practice does not exceed a maximum value of ax specified by the component tolerances, the positions of the expected critical angles of total reflection are already known to a certain extent. In this respect, the scan can be started immediately in an environment of an expected limit angle. This advantageously leads to a considerable acceleration of the calibration process.
  • Further acceleration can be achieved by operating the camera at a reduced resolution. This is usually achieved by an interconnection of intensities of adjacent picture elements, the so-called binning.
  • the image resolution is reduced according to the number of combined pixels. This results in faster scanning to the next measurement point.
  • Another advantage is that with reduced resolution, the camera sensitivity increases and thus less illumination light can be used for the sample illumination. This spares the sample.
  • This method is suitable both for system calibration and for determining the calculation index for a number of different samples.
  • a first setting ⁇ i of the deflection unit for a positive critical angle for the total reflection and a second setting ⁇ 2 of the deflection unit for a negative critical angle for the total reflection are determined for a punctiform pupil illumination and as setting ⁇ 0 of the deflection unit for vertical incidence of the excitation light on the surface of the If the sample is used, the middle between the first setting ⁇ 2 and the second setting P 1 is determined.
  • This method describes the actual calibration of the deflection unit in the case of a point pupil illumination. This fail is important as it occurs most frequently in practice.
  • the light hits the sample at a certain angle, which is the same for all the rays. From the settings of the deflection unit for the two critical angles of total reflection one determines their center, which corresponds to an angle of incidence of 0 ° or a zero point setting ßo. An absolute angular calibration is then possible using the design-related transfer function.
  • the optical response of the sample used can be measured in a plane conjugate to the plane of the surface of the sample used.
  • the scale With a punctiform objective pupil illumination, the scale can accordingly be calibrated absolutely. That is, a fixed relationship has been established between the deflection unit setting and the absolute magnitude of the angle of incidence. From the course of the measured intensity, the absolute value of the critical angle for the total reflection CCT, the refractive index of the sample n p and the zero point setting ⁇ 0 for vertical incidence can furthermore be determined. For this it must be known how much the adjustment of the deflection unit must be adjusted in order to change the angle of incidence ⁇ by a certain amount. This is known by the design-related transfer function. Under this assumption, the absolute value of the limit angle for the total reflection can be determined, with which one can determine the calculation index of the sample n p .
  • punctiform pupil illumination it is particularly preferred for punctiform pupil illumination to use the calculation indices of the sample used and a cover glass and, after determining the settings, the limit angle for total reflections.
  • the deflection unit can be unambiguously assigned absolute values for the angles of incidence.
  • absolute values for the angles of incidence are unambiguously assigned to the settings of the deflection unit for annular pupil illumination using the calculation indices of the sample used and the cover glass and after determining the adjustment of the critical angle for total reflection.
  • a preferred embodiment of the TIRF microscope according to the invention has an additional optical system which can be swiveled into an imaging beam path for switching between an image of the sample used and an image of an objective pupil on the detector.
  • the additional optics In this simple way, it is possible to switch between the TIRF measuring mode, in which the sample is imaged onto a detector, and the TIRF calibration mode, in which the objective pupil is imaged onto the detector by means of the additional optics. This can be done e.g. reach through an additional optics circuit in a camera adapter.
  • the camera which is also used in the TIRF measuring operation, used as a detector.
  • the detector when switching between TIRF measurement mode and TIRF calibration mode, the detector does not need to be changed and one and the same camera can be used.
  • a separate detector for measuring the optical response may also be present. It may be advantageous in TIRF calibration mode not to use the same camera used in TIRF measurement mode, but a separate detector, such as a photomultiplier or semiconductor detectors.
  • the method according to the invention for operating a TIRF microscope is carried out using a TIRF microscope according to the invention.
  • the deflection unit is calibrated according to a method according to the invention, the angle of incidence of the excitation light is set to a value which is greater in magnitude than a critical angle for the total reflection and then TIRF measurements are performed.
  • the deflection unit is accordingly first calibrated by the method according to the invention.
  • the zero point setting ßo the deflection can according to a Incident angle of 0 ° and the absolute value of the critical angle for the total reflection ⁇ be determined.
  • the angle of incidence of the excitation light is set to a value which is greater in magnitude than the critical angle for total reflection.
  • an evanescent field then forms in the sample behind the boundary layer between cover glass and sample, which excites sample particles in this boundary layer. In this configuration, TIRF measurements are then performed.
  • ⁇ denotes the wavelength used
  • n d is the calculation index of the cover glass
  • n p is the calculation index of the sample
  • a is the angle of incidence of excitation light on the sample, for a desired penetration depth d of the evanescent field the associated angle of incidence a is set.
  • the penetration depth d is in a range of several 10 nm to several 100 nm.
  • the limit angle for the total reflection is determined for a sample used and determined using the limit angle for the total reflection. xio ⁇ and the calculation index of the cover glass, the calculation index of the sample used determined.
  • This method can be used to quickly determine the calculation index for a number of different samples. Since the calculation index of the coverslip used is generally known, the calculated critical angle of the total reflection can easily be used to deduce the calculation index of the modified sample.
  • Fig. 1 is a schematic view of an embodiment of a TIRF microscope according to the invention.
  • Fig. 3 is a schematic partial view of an embodiment, wherein in particular the sample with cover glass, immersion oil and lens is illustrated;
  • the TIRF microscope 100 according to the invention shown schematically in FIG. 1 has as essential components a light source 40, a deflection unit 30, a microscope optics 20, a reflector module 50 and an additional optics 70 and a detector 80.
  • the excitation light 42 emitted by the light source 40 first passes through the deflection unit 30, from which it deflects differently depending on the setting ⁇ becomes.
  • the deflected excitation light 42 is deflected by the reflector module 50 in the direction of a sample 10 and first enters the microscope optics 20 through the objective pupil 22, which directs the excitation light 42 onto the sample 10.
  • An optical path in the microscope optics 20 is schematically indicated in FIG.
  • the imaging optics 60 sharply images the sample 10 onto the detector 80.
  • TIRF measurements can be made.
  • the additional optics 70 is pivoted into the imaging beam path, the objective pupil 22 is sharply imaged on the detector 80.
  • the TIRF microscope 100 of the present invention can be calibrated.
  • the retractable additional optics 70 may not, as in FIG. 1, be arranged behind the imaging optics 60, but also in front of or inside the imaging optics 60. It is also possible that the additional optics 70 can be pivoted into an additional imaging beam path, which is not shown in FIG. 1.
  • FIG. 2 schematically illustrates how the angle of incidence ⁇ at the surface 11 between the sample 10 and cover glass 12 is measured.
  • a surface normal 18 is drawn in the direction of the cover glass 12.
  • the angle between the incident excitation light 42 and the surface normal 18 is designated ⁇ .
  • angles which are plotted in the mathematically positive direction are designated by convention as positive angles
  • angles which are plotted in the mathematically negative direction are referred to as negative angles.
  • the two critical angles of total reflection ⁇ j and - ⁇ are also shown, which left and right of the surface Norma ⁇
  • the angle of incidence ⁇ is not equal to 0 °, so there is a shift between the zero points of the ⁇ scale and the ⁇ scale. This shift must be determined to calibrate the TIRF microscope.
  • Fig. 3 illustrates in further details the beam path within the microscope optics 20 and at the interface 11 between the sample 10 and cover glass 12.
  • the coming of the reflector module 50 excitation light 42 is deflected by the microscope optics 20 so that it at an angle of incidence ⁇ on the surface 11 between sample
  • the excitation light 42 After the excitation light 42 has left the microscope optics 20, it enters an imersion oil 14.
  • the refractive index of the immersion oil 14 coincides with the refractive index of the cover glass 12, so that no refraction occurs at the interface between immersion oil 14 and cover glass 12.
  • FIG. 4 schematically illustrates how the focus of the excitation light 42 in the objective pupil 22 is displaced.
  • FIG. 5 shows the intensity profile of the integrated intensity measured in the detector 80 as a function of the setting ⁇ of the deflection unit 30.
  • the additional optics 70 are swiveled into the imaging beam path in order to be able to calibrate the TIRF microscope according to the invention, see FIG.
  • Fig. 5 images of the objective pupil are shown, which correspond to the positions with the settings ß of the deflection unit 30. In this case, the light intensity in the objective pupil 22 or a plane conjugate thereto was measured.
  • the hatching symbolizes the intensity of the light 16 emitted by the sample 10.
  • the integrated intensity decreases sharply and reaches a minimum value when the limit angle of total reflection is exceeded. This can be seen in the outer areas of the graph.
  • the setting ⁇ o of the deflection unit which corresponds to a sample illumination angle ⁇ of 0 °, can be calculated.
  • ßi and ß 2 the settings of the deflection unit 30, which correspond to the critical angles of total reflection ot ⁇ .
  • ß 0 the signs of the angles ßi and ß 2 are to be observed accordingly.
  • f is a function and f 1 is an associated inverse function. Since the function f is known in typical situations, only a constant, in the present case, for example, ⁇ o, has to be determined in order to achieve an absolute calibration of the deflection unit 30.
  • the setting ⁇ of the deflection unit 30 can also be calibrated absolutely. This means that each value ⁇ of the deflection unit 30 can be assigned an absolute value ⁇ . In this case, the refractive index of the sample n p can be calculated from one of the two critical angles .alpha.
  • the orientation of the annular excitation light 42 with respect to the optical axis must be centered as well as possible, otherwise the same angle of incidence would not exist at all points of the annulus.
  • the absolute value of the limit angle ⁇ ⁇ of the total reflection can be determined.
  • an absolute calibration of the deflection unit 30 can likewise be undertaken here.
  • the present invention provides a novel method for calibrating a deflection unit in a TIRF microscope, a corresponding TIRF microscope, and a method for operating such a TIRF microscope with which extremely minimal calibration of a TIRF microscope with minimal additional hardware expenditure an accurate determination of a critical angle for the total reflection can be performed. This can be done in comparison to the prior art with a reduced expenditure on equipment.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kalibrieren einer Ablenkeinheit in einem TIRF-Mikroskop, mit welcher ein Einfallswinkel von Anregungslicht auf eine Probe verstellt wird, bei dem eine Einstellung der Ablenkeinheit so gewählt wird, dass der zugehörige Einfallswinkel sicher größer ist oder sicher kleiner ist als ein erwarteter Grenzwinkel für die Totalreflexion des Anregungslichts an einer Oberfläche einer verwendeten Probe, bei dem der Einfallswinkel durch Ändern der Einstellung der Ablenkeinheit in Richtung eines erwarteten Grenzwinkels gescannt wird, wobei für jede Einstellung der Ablenkeinheit eine Intensität eines durch das Anregungslicht bewirkten optischen Response der verwendeten Probe gemessen wird, bei dem die Intensität des optischen Response der verwendeten Probe mindestens für so viele Einstellungen der Ablenkeinheit gemessen wird, bis die Intensität des optischen Response der verwendeten Probe eine Flanke durchläuft und bei dem die zu der Flanke gehörende Einstellung der Ablenkeinheit als Einstellung für den Grenzwinkel für Totalreflexion an der verwendeten Probe gespeichert wird.

Description

Verfahren zum Kalibrieren einer Ablenkeinheit in einem TIRF-Mikroskop. TIRF- Mikroskop und Verfahren zu dessen Betrieb
Die Erfindung bezieht sich in einem ersten Aspekt auf ein Verfahren zum Kalibrieren einer Ablenkeinheit in einem TIRF-Mikroskop.
In einem zweiten Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein TIRF-Mikroskop.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Betrieb eines TIRF-Mikroskops.
Bei der TIRF-Mikroskopie ist es wichtig, den Winkel, unter dem die Probe beleuchtet wird, genau bestimmen zu können. Mit Hilfe dieses Einfallswinkels können weitere Parameter des sich an der Grenzfläche zwischen Deckglas und Probe bildenden eva- neszenten Feldes sowie der Probe, wie zum Beispiel Eindringtiefe, Brechungsindex und Grenzwinkel der Totalreflexion, bestimmt werden.
Der Einfallswinkel wird in der Regel über eine motorisch angetriebene Ablenkeinheit eingestellt und durch die mechanisch-optischen Fertigungstoleranzen der verwendeten Mikroskopkomponenten wie zum Beispiel Filtersatz oder Objektiv beeinflusst. Deshalb ist für jede Kombination von Bauteilen mit unterschiedlichen mechanischen Abmessungen eine Kalibrierung der Ablenkeinheit notwendig.
DE 10 2006 021 906 A1 beschreibt ein Mikroskop zur totalinternen Reflexions- Mikroskopie, wobei sowohl Beleuchtungslicht als auch Detektionslicht über den Beleuchtungsstrahlengang durch das Objektiv geführt werden und wobei an der Grenzfläche zu einer Probe oder Probenabdeckung vorzugsweise total reflektiertes Beleuchtungslicht in den Beleuchtungsstrahlengang zurückkehrt. Dieses Reflexionslicht wird aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt und mit einem ortsauflösenden De- tektor aufgenommen. Aus dem detektierten Reflexionslicht werden Parameter des eva- neszenten Feldes berechnet.
Der Hardwareaufwand für das dort beschriebene Verfahren ist erheblich. Neben einer aufwändigen Optik zur Auskopplung des Reflexionsüchts aus dem Beleuchtungsstrahlengang verwendet das in DE 10 2006 021 906 A1 angegebene Verfahren lediglich total reflektiertes Licht, welches demgemäß keine probenspezifischen, sondern nur systemspezifische Informationen trägt. Dies ist problematisch, da insbesondere der Winkel für die Totalreflexion und weitere Parameter des evaneszenten Felds vom Brechungsindex der verwendeten Probe abhängen.
A u f g a b e der Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben und ein TIRF-Mikroskop zu schaffen, mit welchen eine Ablenkeinheit in einem TIRF-Mikroskop im Vergleich zum Stand der Technik genauer kalibriert werden kann und weitere wesentliche Parameter des evaneszenten Feldes in einer Probe bestimmt werden können.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das TIRF-Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 14 gelöst. Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zum Betreiben eines TIRF-Mikroskops nach Anspruch 18.
Vorteilhafte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens und bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen TIRF-Mikroskops sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Kalibrieren einer Ablenkeinheit in einen TIRF-Mikroskop, mit welcher ein Einfallswinkel von Anregungslicht auf eine Probe verstellt wird, wird eine Einstellung der Ablenkeinheit so gewählt, dass der zugehörige Einfallswinkel sicher größer oder sicher kleiner ist als ein erwarteter Grenzwinkel für die Totalreflexion des Anregungslichts an einer Oberfläche einer verwendeten Probe. Sodann wird der Einfallwinkel durch Ändern der Einstellung der Ablenkeinheit in Richtung eines erwarteten Grenzwinkels gescannt, wobei zu jeder Einstellung der Ablenkeinheit eine Intensität eines durch das Anregungslicht bewirkten optischen Response der verwendeten Probe gemessen. Die Intensität des optischen Response der verwendeten Probe wird mindestens für so viele Einstellungen der Ablenkeinheit gemessen, bis die Intensität des optischen Response der verwendeten Probe eine Flanke durchläuft und die zu der Flanke gehörende Einstellung der Ablenkeinheit wird als Einstellung für den Grenzwinkel der Totalreflexion an der verwendeten Probe gespeichert.
Als Anregungslicht wird in aller Regel eine Laserqueile verwendet. Es können aber auch andere Arten von Anregungslicht, wie z.B. konventionelle Quecksilberbogenlampen Verwendung finden.
Unter dem Begriff Einstellung der Ablenkeinheit kann eine Winkeleinstellung oder aber auch eine andere Einstellmöglichkeit wie z.B. eine laterale Ablenkeinstellung verstanden werden.
Die Intensitätsmessung kann in einer bevorzugten Variante der Erfindung integral ü- ber die Objektivpupille oder einer dazu konjugierten Ebene erfolgen. Unter der Objektivpupille wird hier die der Probe abgewaπdte Fokalebene des Objektivs verstanden.
In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird zum Scannen des Einfallswinkels des Anregungslichts die Einstellung der Ablenkeinheit automatisch so verändert, dass sich der Fokus des Anregungslichts einmal quer über die gesamte Objektivpupille bewegt. In dieser Variante wird das Anregungslicht auf einen Punkt in der Objektivpupille fokussiert. Da dies die der Probe abgewandte Fokalebene des Objektivs ist, wird das Strahlenbündel, welches in diesem Punkt zusammenläuft, probenseitig in paralleles Licht abgebildet, welches die Probe unter einem bestimmten, für alle Strahlen identischen Einfallswinkel trifft. Der Ort des Fokus des Anregungslichts beziehungsweise des Anregungsstrahlenbündels in der Objektivpupille bestimmt also den Winkel, unter dem die Probe beleuchtet wird. Wird der Punkt in der Objektivpupille mittig quer über die Objektivpupille gescannt, so ändert sich der Einfallswinkel des Anregungslichts von einem großen positiven Einfallswinkel über senkrechten Einfall bis hin zu einem großen negativen Einfallswinkel.
Im Fall von punktförmiger Pupillenbeleuchtung treffen alle Strahlen des parallelen Strahlenbündels unter demselben räumlichen Winkel auf die Probe.
Im Fall einer kreisringförmigen Pupillenbeleuchtung, bei der jeder Strahl einen identischen Abstand von der zentralen optischen Achse besitzt, trifft jeder Strahl zwar ebenfalls unter demselben Winkel relativ zur Probe auf die Probe. Die auf die Probe einfal- lenden Einzelstrahlen sind aber nicht parallel zueinander. Das Strahlenbündel weist allerdings eine Zylindersymmetrie auf.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass das Original- TIRF-Objektiv und der Original-Anregungsfiltersatz verwendet werden können.
Weiterhin kann zum Kalibrieren die verwendete biologische Probe selbst verwendet werden. Es ist kein spezielles Testpräparat notwendig. Darüber hinaus muss der Brechungsindex der Probe nicht bekannt sein.
Weiterhin ist vorteilhaft, dass die Auswertung sehr robust ist. Es können sowohl das gesamte Kamerabild als auch Teile des Pupillenbilds ausgewertet werden.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass sich das System selbst kalibrieren kann. Im Gegensatz zum Verfahren in Druckschrift DE 10 2006 021 996 A1 wird kein kalibriertes Detektorelement benötigt.
Das erfindungsgemäße TIRF-Mikroskop zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist folgende Komponenten auf: eine Lichtquelle zum Aussenden des Anregungslichts, eine Mikroskop-Optik zum Letten des Anregungslichts auf die verwendete Probe, die Ablenkeinheit zum Einstellen des Einfallswinkels des Anregungslichts auf die Oberfläche der verwendeten Probe und einen Detektor zum Nachweisen des optischen Response der verwendeten Probe. Als Detektor können ein Kamerachip, z.B. ein CCD, ein Photomultiplier, ein PSD, Photodioden oder ähnliche Nachweisgeräte für Licht eingesetzt werden.
Bei den Vorarbeiten, die zur Erfindung führten, wurde erkannt, dass eine Kalibrierung eines TIRF-Mikroskops, welche direkt das von einer Probe emittierte Licht und nicht das von der Optik reflektierte Licht benutzt, deutliche Vorteile besitzt.
Als ein Kerngedanke der Erfindung kann deshalb angesehen werden, zur Kalibrierung eines TIRF-Mikroskops die von der Probe selbst emittierte Intensität zu benutzen. Hierdurch können die Parameter des evaneszenten Feldes wesentlich genauer als bisher ermittelt werden.
Darüber hinaus erfordert die erfindungsgemäße Lösung nur einen sehr geringen zusätzlichen Hardwareaufwand. Bei besonders vorteilhaften Varianten wird nur eine Hilfslinse benötigt, um die Erfindung zu realisieren. Erfindungsgemäß wird ausgenutzt, dass bei Erreichen und Überschreiten des Grenzwinkels der Totalreflexion die Eindringtiefe des Anregungslichts in die Probe rapide abnimmt und dann nur wenige 10 bis 100 nm beträgt. Dies hat zur Folge, dass die Hintergrundfluoreszenz aus Probenteilen, die vom Deckglas weiter entfernt sind, schnell abfällt.
Unter optischen Response soll eine Reaktion der verwendeten Probe auf eine externe Anregung durch Licht verstanden werden. Das Anregungslicht soll hierbei nicht auf sichtbares Licht beschränkt sein, es kann insbesondere auch infrarotes und ultraviolettes Licht gemeint sein. Die Reaktion der verwendeten Probe auf eine solche Anregung kann ebenfalls vielfältig sein. Das Anregungslicht kann entweder gestreut oder aber absorbiert und daraufhin wieder emittiert werden. Hierbei soll unter optischen Response jegliche Art von Lumineszenzstrahlung, insbesondere Fluoreszenzstrahlung, verstanden werden. Generell so!! unter optischen Response jegiiche Strahiungsreaktion der Probe auf eine Lichtanregung verstanden werden.
Zur Kalibrierung der Ablenkeinheit stellt man diese so ein, dass der zugehörige Einfallswinkel sicher größer oder kleiner ist als ein erwarteter Grenzwinkel für die Totalreflexion. Danach wird der Einfallswinkel in Richtung eines erwarteten Grenzwinkels gescannt und gleichzeitig die von der Probe abgestrahlte Intensität gemessen. Die sodann durchlaufene Flanke wird gemessen und ausgewertet. Dasselbe Verfahren wird bei punktueller Pupillenbeleuchtung des TIRF-Objektives für den zweiten Grenzwinkel der Totalreflexion, der sich vom ersten Grenzwinkel der Totalreflexion nur durch sein Vorzeichen unterscheidet, durchgeführt. Aus den Flanken des winkelabhängigen Intensitätsverlaufes und den dazugehörigen Einstellungen der Ablenkeinheit lässt sich dann die Nullpunktseinstellung der Ablenkeinheit, auch Winkeloffset genannt, ermitteln.
Damit ist es möglich, die Ablenkeinheit absolut zu kalibrieren. Denn die konstruktionsbedingte Übertragungsfunktion, die den Einfallswinkel in Abhängigkeit von der Einstellung der Ablenkeinheit angibt, ist bekannt. Eine Kenntnis über den Brechungsindex der Probe ist hier nicht nötig.
Bei Systemen, die eine kreisringförmige Objektivpupillenbeleuchtung verwenden, steht nur eine Intensitätsflanke zur Verfügung. Hierbei ist es für eine absolute Skalenkalibrierung notwendig, den Brechungsindex der Probe zu kennen. Dies kann zum Beispiel mit Hilfe eines Kalibrierpräparats mit bekanntem Brechungsindex geschehen. Bei dieser Anordnung kann demgemäß zum Kalibrieren nicht die zu untersuchende Probe verwendet werden kann, da der Brechungsindex der Probe im Allgemeinen unbekannt ist.
Für den Grenzwinkel der Totalreflexion ergibt sich folgende Beziehung:
np = nd sin aτ .
Nach der Kalibrierung der Ablenkeinheit kann mit Kenntnis der Brechungsindizes der Probe und des Deckglases im Falle von Totalreflexion die Eindringtiefe d des evanes- zenten Felds anhand des Einfallswinkels α gemäß folgender Beziehung:
d =
Aπ ■ nd yjssiin2 a - sin2 α7
eingestellt werden. Unter der Eindringtiefe d wird ausgehend von der Grenzfläche zwischen Probe und Deckglas die Länge in Richtung der optischen Achse verstanden, bei der die Intensität des evaneszenten Felds in der Probe auf den e-ten Teil entsprechend einem Wert von ungefähr 0,37 der Intensität des Lichtfelds an der Grenzfläche abgeklungen ist.
Bei einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der optische Response der verwendeten Probe in einer zur Ebene einer Objektivpupille konjugierten Ebene gemessen. Da die Objektivpupille eine gemeinsame Durchtrittsfläche für alle Lichtkegel der optischen Abbildung ist, eignet sich die Objektivpupille besonders gut dafür, den optischen Response der Probe zu messen. Äquivalent hierzu ist eine Messung des optischen Response in einer zur Objektivpupille konjugierten Ebene.
Besonders bevorzugt wird der optische Response mit einem Detektor, insbesondere mit einer Kamera gemessen. Besonders vorteilhaft kann dabei die Kamera benutzt werden, welche beim TIRF-Messbetrieb verwendet wird. Beim Wechsel von Mess- zu Kalibrier- Betrieb und umgekehrt ist dann kein Austausch der Kamera notwendig.
Bei einer weiteren bevorzugten Variante werden zur Auswertung der Intensität nur Teilbereiche eines Kameradetektors benutzt. Hierbei kann zum Beispiel die Objektivpupille durch eine Abbildungsoptik auf dem Kameradetektor abgebildet werden und durch eine spezielle softwaregesteuerte Auslesetechnik können nur Teilbereiche des Kameradetektors zur Auswertung herangezogen werden. Besonders bevorzugt ist es hierbei, einen Kreisausschnitt auszuwerten, welcher nur leicht größer ist als das Bild der ebenfalls kreisförmigen Objektivpupille. Es können aber auch kreisförmige Ausschnitte des Objektivpupillenbilds oder rechteckige Ausschnitte, die einen Halbkreis des Objektivpupillenbilds umfassen, verwendet werden.
Besonders vorteilhaft an diesem Verfahren ist es, dass das Signal zu Rauschverhältnis und die Messgeschwindigkeit durch eine selektive Auswertung des Kameradetektors stark verbessert werden kann. Die in einem solchen Kamerabild verwendeten Ausschnitte zur Auswertung werden auch „Regions Of Interest" genannt.
Ferner ist es bevorzugt, dass zur Beschleunigung der Kalibrierung der Einfallswinkel nur in einer Umgebung der erwarteten Grenzwinkel oder eines erwarteten Grenzwinkels gescannt wird. Da die Nullpunkteinstellung ßo der Ablenkeinheit, welche einem Einfallswinkel von 0° entspricht, in der Praxis einen durch die Einzelteiltoleranzen vorgegebenen Höchstwert ßomax nicht überschreitet, sind die Positionen der erwarteten Grenzwinkel der Totalreflexion in einem gewissen Rahmen bereits bekannt. Insofern kann der Scan gleich in einer Umgebung eines erwarteten Grenzwinkels gestartet werden. Dies führt vorteilhafterweise zu einer erheblichen Beschleunigung des Kalibrierverfahrens.
Eine weitere Beschleunigung kann dadurch, erreicht werden, dass die Kamera mit einer reduzierten Auflösung betrieben wird. Dies wird in der Regel durch eine Zusammenschaltung von Intensitäten benachbarter Bildelemente, dem sogenannten Binning, erreicht. Die Bildauflösung wird hierbei entsprechend der Anzahl der zusammengefassten Pixel reduziert. Dies führt dazu, dass beim Scannen schneller zum nächsten Messpunkt verfahren werden kann. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass bei reduzierter Auflösung die Kameraempfindlichkeit steigt und somit weniger Beleuchtungslicht für die Probenbeleuchtung verwendet werden kann. Dies schont die Probe.
Dieses Verfahren ist sowohl zur Systemkalibrierung als auch zur Bestimmung des Berechnungsindexes für eine Reihe unterschiedlicher Proben geeignet.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante werden für eine punktförmige Pupillenbeleuchtung eine erste Einstellung ßi der Ablenkeinheit für einen positiven Grenzwinkel für die Totalreflexion und eine zweite Einstellung ß2 der Ablenkeinheit für einen negativen Grenzwinkel für die Totalreflexion bestimmt und als Einstellung ß0 der Ablenkeinheit für senkrechten Einfall des Anregungslichts auf die Oberfläche der ver- wendeten Probe wird die Mitte zwischen der ersten Einstellung ß2 und der zweiten Einstellung P1 bestimmt.
Dieses Verfahren beschreibt die eigentliche Kalibrierung der Ablenkeinheit für den Fall einer punktförmigen Pupillenbeleuchtung. Dieser Fail ist wichtig, da er in der Praxis am häufigsten auftritt. Dabei trifft das Licht auf die Probe unter einem bestimmten Winkel, der für alle Strahlen gleich groß ist. Aus den Einstellungen der Ablenkeinheit für die beiden Grenzwinkel der Totalreflexion bestimmt man deren Mitte, welche einem Einfallswinkel von 0° oder einer Nullpunktseinstellung ßo entspricht. Mithilfe der konstruktionsbedingten Übertragungsfunktion ist dann eine absolute Winkelkalibrierung möglich.
Alternativ kann der optische Response der verwendeten Probe in einer zur Ebene der Oberfläche der verwendeten Probe konjugierten Ebene gemessen werden.
Erfindungsgemäß gibt es mehrere Verfahren zur Kalibrierung der Einstellung der Ablenkeinheit. Daraus können die Grenzwinkel der Totalreflexionen und der Berechnungsindex der Probe bestimmt werden.
Bei einer punktförmigen Objektivpupillenbeleuchtung kann demgemäß die Skala absolut kalibriert werden kann. Das bedeutet, dass eine feste Beziehung zwischen der Einstellung der Ablenkeinheit und der Absolutgröße des Einfallswinkels ermittelt wurde. Aus dem Verlauf der gemessenen Intensität ist weiterhin der Absolutwert des Grenzwinkels für die Totalreflexion CCT, des Brechungsindexes der Probe np und die Nullpunkteinstellung ß0 für senkrechten Einfall bestimmbar. Dafür muss bekannt sein, um wie viel die Einstellung der Ablenkeinheit verstellt werden muss, um den Einfallswinkel α um einen bestimmten Betrag zu ändern. Dies ist durch die konstruktionsbedingte Übertragungsfunktion bekannt. Unter dieser Voraussetzung kann der Absolutbetrag des Grenzwinkels für die Totalreflexion bestimmt werden, mit dem man den Berechnungsindex der Probe np bestimmen kann.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es besonders bevorzugt, dass für eine punktförmige Pupillenbeleuchtung unter Verwendung der Berechnungsindizes der verwendeten Probe und eines Deckglases und nach Bestimmung der Einstellungen der Grenzwinkel für Totalreflexionen den Einstel- lungen der Ablenkeinheit eindeutig Absolutwerte für die Einfallswinkel zugeordnet werden.
Bei einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden für kreisringförmige Pupillenbeleuchtung unter Verwendung der Berechnungsindizes der verwendeten Probe und des Deckglases und nach Bestimmung der Einstellung des Grenzwinkels für Totalreflexion den Einstellungen der Ablenkeinheit eindeutig Absolutwerte für die Einfallswinkel zugeordnet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen TIRF-Mikroskops weist eine in einen Abbildungsstrahlengang einschwenkbare Zusatzoptik auf zum Umschalten zwischen einer Abbildung der verwendeten Probe und einer Abbildung einer Objektivpupille auf den Detektor. Auf diese einfache Weise erreicht man, dass zwischen dem TIRF-Messbetrieb, in dem die Probe auf einen Detektor abgebildet wird, und dem TIRF-Kalibrierbetrieb, bei dem mittels der Zusatzoptik die Objektivpupille auf den Detektor abgebildet wird, umgeschaltet werden kann. Dies kann man z.B. durch eine Zusatzoptikumschaltung in einem Kameraadapter erreichen.
Besonders bevorzugt wird in dieser Ausführungsform die Kamera, welche auch im TIRF-Messbetrieb verwendet wird, als Detektor verwendet. So braucht beim Umschalten zwischen TIRF-Messbetrieb und TIRF-Kalibrierbetrieb der Detektor nicht gewechselt zu werden und es kann ein und dieselbe Kamera verwendet werden.
Alternativ kann auch ein separater Detektor zum Messen des optischen Response vorhanden sein. Unter Umständen ist es vorteilhaft im TIRF-Kalibrierbetrieb nicht dieselbe Kamera zu verwenden, welche man im TIRF-Messbetrieb verwendet, sondern einen separaten Detektor, wie zum Beispiel einen Photomultiplier oder Halbleiterdetektoren.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Betreiben eines TIRF-Mikroskops wird mit einem erfindungsgemäßen TIRF-Mikroskop durchgeführt. Dabei wird die Ablenkeinheit gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren kalibriert, der Einfallswinkel des Anregungslichts wird auf einen Wert eingestellt, der betragsmäßig größer ist als ein Grenzwinkel für die Totalreflexion und anschließend werden TIRF-Messungen durchgeführt.
Die Ablenkeinheit wird demgemäß zuerst mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kalibriert. Dabei können die Nullpunktseinstellung ßo der Ablenkeinheit entsprechend einem Einfallswinkel von 0° und der Absolutbetrag des Grenzwinkels für die Totalreflexion αγ bestimmt werden. Danach wird der Einfallswinkel des Anregungslichts auf einen Wert eingestellt, der betragsmäßig größer ist als der Grenzwinkel für Totalreflexion. In diesem Bereich bildet sich dann in der Probe hinter der Grenzschicht zwischen Deckglas und Probe ein evaneszentes Feld, welches Probenteilchen in dieser Grenzschicht anregt. In dieser Konfiguration werden dann TIRF-Messungen durchgeführt.
Da es für den Anwender wünschenswert ist, bei Totalreflexion die Eindringtiefe des e- vaneszenten Feldes in einem gewissen Bereich stufenlos einstellen zu können, ist es erfindungsgemäß in einer weiteren Variante vorgesehen, dass auf Grundlage der Beziehung:
Figure imgf000012_0001
wobei λ die verwendete Wellenlänge, nd der Berechnungsindex des Deckglases, np den Berechnungsindex der Probe und a den Einfallswinkel von Anregungslicht auf die Probe bezeichnen, für eine gewünschte Eindringtiefe d des evaneszenten Feldes der zugehörige Einfallswinkel a eingestellt wird. Diese Formel für die Eindringtiefe d ist äquivalent der vorgenannten Beziehung für d. Dies kann durch einfaches Einsetzen der Gleichung np = nd sin aτ überprüft werden.
Falls a kleiner als der Grenzwinkel der Totalreflexion αr ist, existiert kein evaneszentes Feld mehr. Vielmehr wird der einfallende Strahl gebrochen und breitet sich in der Probe weiter aus. Für den Grenzfall, dass der Einfallswinkel gleich dem Grenzwinkel für die Totalreflexion ατ ist, ergibt sich theoretisch eine unendlich große Eindringtiefe, welche jedoch für größere Einfallswinkel a rasch abfällt. In der Praxis liegt die Eindringtiefe d in einem Bereich von einigen 10 nm bis einigen 100 nm. Durch die oben genannte Beziehung kann der Anwender die Eindringtiefe d mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sehr exakt einstellen, was bei TIRF-Messungen äußerst vorteilhaft ist.
In einer weiteren bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Betreiben eines TIRF-Mikroskops wird für eine verwendete Probe der Grenzwinkel für die Totalreflexion bestimmt und unter Verwendung des Grenzwinkels für die Totalrefle- xioπ sowie des Berechnungsindexes des Deckglases der Berechnungsindex der verwendeten Probe bestimmt.
Dieses Verfahren kann zum raschen Bestimmen des Berechnungsindexes für eine Reihe unterschiedlicher Proben verwendet werden. Da der Berechnungsindex des verwendeten Deckglases im Allgemeinen bekannt ist, kann durch den ermittelten Grenzwinkel der Totalreflexion ohne weiteres auf den Berechnungsindex der veränderten Probe geschlossen werden.
Weitere Vorteile und Merkmale der erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden nachstehend mit Bezug auf die schematischen Figuren erläutert. Hierin zeigen:
Fig. 1 eine schematische Ansicht eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen TIRF-Mikroskops;
Fig. 2 eine schematische Veranschaulichung des Einfallswinkels α und der Grenzwinkel der Totalreflexion αγ an einer Grenzfläche zwischen Deckglas und Probe;
Fig. 3 eine schematische Teilansicht eines Ausführungsbeispiels, worin insbesondere die Probe mit Deckglas, Immersionsöl und Objektiv veranschaulicht ist;
Fig. 4 eine schematische Veranschaulichung der Position des Fokus des Anregungslichts in der Objektivpupille; und
Fig. 5 eine Messkurve der integralen Intensität in Abhängigkeit der
Einstellung ß der Ablenkeinheit sowie eine Veranschaulichung der Lichtintensitäten in der Objektivpupille.
Das in Fig. 1 schematisch dargestellte erfindungsgemäße TIRF-Mikroskop 100 weist als wesentliche Komponenten eine Lichtquelle 40, eine Ablenkeinheit 30, eine Mikroskop- Optik 20, ein Reflektormodul 50 sowie eine Zusatzoptik 70 und einen Detektor 80 auf.
Das von der Lichtquelle 40 emittierte Anregungslicht 42 durchläuft zunächst die Ablenkeinheit 30, von der es in Abhängigkeit der Einstellung ß unterschiedlich stark abgelenkt wird. Das abgelenkte Anregungslicht 42 wird vom Reflektormodul 50 in Richtung einer Probe 10 umgelenkt und tritt zunächst durch die Objektivpupille 22 in die Mikroskop- Optik 20 ein, die das Anregungslicht 42 auf die Probe 10 lenkt. Ein Lichtweg in der Mikroskop-Optik 20 ist in Fig. 1 schematisch angedeutet.
Ein von der Probe 10 abgegebener optische Response, beispielsweise Fluoreszenz- und/oder Streulicht 16, verläuft symmetrisch zu einer Oberflächennormalen 18 der Probe 10 zurück durch die Mikroskop-Optik 20, verlässt diese durch die Objektivpupille 22 und trifft wiederum auf das Reflektormodul 50. Das Fluoreszenz- und/oder Streulicht 16 tritt durch das Reflektormodul 50 hindurch und wird mittels einer Abbildungsoptik 60 auf einen Detektor 80 abgebildet. In der in Fig. 1 dargestellten Konfiguration bildet die Abbildungsoptik 60 die Probe 10 scharf auf den Detektor 80 ab. In diesem Zustand können TIRF-Messungen durchgeführt werden. Wenn die Zusatzoptik 70 in den Abbildungsstrahlengang eingeschwenkt wird, wird die Objektivpupiüe 22 scharf auf dem Detektor 80 abgebildet. In dieser Konfiguration kann das erfindungsgemäße TIRF-Mikroskop 100 kalibriert werden. In anderen Ausführungsformen kann die einschwenkbare Zusatzoptik 70 nicht, wie in Fig.1 , hinter der Abbildungsoptik 60, sondern auch davor oder innerhalb der Abbildungsoptik 60 angeordnet sein. Es ist auch möglich, dass die Zusatzoptik 70 in einen zusätzlichen Abbildungsstrahlengang, welcher in Fig. 1 nicht dargestellt ist, eingeschwenkt werden kann.
Fig. 2 veranschaulicht schematisch, wie der Einfallswinkel α an der Oberfläche 11 zwischen Probe 10 und Deckglas 12 gemessen wird. Ausgehend von der Oberfläche 11 zwischen Probe 10 und Deckglas 12 zeichnet man eine Oberflächennormale 18 in Richtung des Deckglases 12. Der Winkel zwischen dem einfallenden Anregungslicht 42 und der Oberflächennormalen 18 wird mit α bezeichnet. Hierbei werden Winkel, die in die mathematisch positive Richtung abgetragen werden, per Konvention als positive Winkel bezeichnet, Winkel, welche in die mathematisch negative Richtung abgetragen werden, als negative Winkel bezeichnet. In der Zeichnung sind außerdem die zwei Grenzwinkel der Totalreflexion αj und -αγ eingezeichnet, welche links und rechts der Oberflächennorma¬
len 18 im Abstand des Grenzwinkels der Totalreflexion αγ = aresin \ — \ abgetragen
sind. Im Allgemeinen ist bei einem unkalibrierten TIRF-Mikroskop für die Nullpunkteinstellung ßo der Einfallswinkel α ungleich 0°, so dass zwischen den Nullpunkten der α-Skala und der ß-Skala eine Verschiebung besteht. Diese Verschiebung muss bestimmt werden, um das TIRF-Mikroskop zu kalibrieren.
Fig. 3 veranschaulicht in weiteren Details den Strahlengang innerhalb der Mikroskop- Optik 20 sowie an der Grenzfläche 11 zwischen Probe 10 und Deckglas 12. Das vom Reflektormodul 50 kommende Anregungslicht 42 wird durch die Mikroskop-Optik 20 derart abgelenkt, dass es unter einem Einfallswinkel α auf die Oberfläche 11 zwischen Probe
10 und Deckglas 12 trifft.
Im Allgemeinen befinden sich in der Mikroskop-Optik 20 mehrere Linsen, an denen das Anregungslicht 42 mehrfach gebrochen wird. Diese Brechungen sind in Fig. 3 durch einen Knick schematisch dargestellt.
Nachdem das Anregungslicht 42 die Mikroskop-Optik 20 verlassen hat, tritt es in ein Im- mersionsöl 14 ein. In dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel stimmt der Brechungsindex des Immersionsöls 14 mit dem Brechungsindex des Deckglases 12 überein, so dass an der Grenzfläche zwischen Immersionsöl 14 und Deckglas 12 keine Brechung erfolgt.
Wenn der Einfallswinkel α größer als der Totalreflexionswinkel ατ ist, findet an der Oberfläche 11 zwischen Deckglas 12 und Probe 10 Totalreflexion statt. Es bildet sich dann auf der Probenseite hinter der Grenzfläche 11 zwischen Deckglas 12 und Probe 10 ein evaneszentes Feld, welches typischerweise einige 10 bis einige 100 nm in die Probe 10 hineinreicht. Schematisch angedeutete Probenteilchen senden Fluoreszenzlicht 16 in alle Richtungen als optischen Response aus. Da das evaneszente Feld in der Probe 10 in Richtung der optischen Achse exponentiell abfällt, wird der größte Teil des Fluoreszenzlichts 16 von Probenteilchen abgestrahlt, welche sich in der Nähe der Grenzfläche
11 zwischen Probe 10 und Deckglas 12 befinden. Das von der Oberfläche 11 zwischen der Probe 10 und dem Deckglas 12 total reflektierte Licht verläuft symmetrisch zum einfallenden Anregungslicht 42 auf der anderen Seite der Oberflächennormalen 18 durch die Mikroskop-Optik 20 und verlässt diese durch die Objektivpupille 22 in Richtung Reflektormodul 50.
Fig. 4 verdeutlicht schematisch, wie der Fokus des Anregungslichts 42 in der Objektivpupille 22 verschoben wird. Wenn der Fokus des Anregungslichts 42 weiter entfernt vom Zentrum des Kreises der Objektivpupille 22 durch die Ebene der Objektivpupille 22 tritt, hat das einen größeren Einfallswinkel α an der Grenzfläche 11 zwischen Probe 10 und Deckglas 12 zur Folge.
Fig. 5 zeigt den Intensitätsverlauf der im Detektor 80 gemessenen integrierten Intensität in Abhängigkeit der Einstellung ß der Ablenkeinheit 30. Erfindungsgemäß ist in dieser Ausführungsform die Zusatzoptik 70 in den Abbildungsstrahlengang eingeschwenkt, um das erfindungsgemäße TIRF-Mikroskop kalibrieren zu können, siehe Fig.1.
In Fig. 5 unten sind Abbildungen der Objektivpupille dargestellt, welche den Positionen mit den Einstellungen ß der Ablenkeinheit 30 entsprechen. Hierbei wurde die Lichtintensität in der Objektivpupille 22 oder einer dazu konjugierten Ebene gemessen.
Die Schraffur symbolisiert die Intensität des von der Probe 10 emittierten Lichts 16.
Man erkennt zwei Flanken oder Intensitätssprünge, welche den beiden Grenzwinkeln der Totalreflexion CCT entsprechen. Der plateauartige Bereich zwischen den beiden Flanken entspricht den Fällen, in denen keine Totalreflexion auftritt, sondern sich das Anregungslicht 42 in der Probe 10 weiter ausbreitet. Deshalb erhält man viel Streulicht oder Fluoreszenzlicht 16 aus dem Volumen der Probe 10, was zu einer höheren Intensität in der Objektivpupille 20 oder einer dazu konjugierten Ebene führt.
Wenn man sich dem Grenzwinkel der Totalreflexion ocτ aus diesem Bereich kommend nähert, nimmt die integrierte Intensität stark ab und erreicht bei Überschreiten des Grenzwinkels der Totalreflexion einen Minimalwert. Dies ist in den äußeren Bereichen des Graphs erkennbar.
Bei Erreichen und Überschreiten des Grenzwinkels der Totalreflexion ατ bildet sich hinter der Oberfläche 11 in der Probe 10 ein evaneszentes Feld, dessen Eindringtiefe d in Abhängigkeit des Ablenkwinkels α sehr schnell abfällt. Dies spiegelt sich in den Abbildungen der Objektivpupille am unteren Rand der Fig. 5 wieder. Da nunmehr nur noch wenige Probenteilchen Licht emittieren können, ist hier die integrale Intensität im Vergleich zum Fall, bei dem noch keine Totalreflexion aufgetreten ist, sehr viel niedriger.
Aus der Position der beiden Flanken kann die Einstellung ßo der Ablenkeinheit, welche einem Probenbeleuchtungswinkel α von 0° entspricht, berechnet werden. Diese ergibt sich zu: Hierbei sind ßi und ß2 die Einstellungen der Ablenkeinheit 30, die den Grenzwinkeln der Totalreflexion otτ entsprechen. Zur korrekten Berechung von ß0 sind die Vorzeichen der Winkel ßi und ß2 entsprechend zu beachten.
Hiervon ausgehend können definierte Einfallswinkel eingestellt werden, da der Einfallswinkel α und die Einstellung ß der Ablenkeinheit 30 durch den optischen und mechanischen Aufbau in einer festen funktionalen Beziehung zueinander stehen:
α = f(ß-ß0), ß = ßo + f1(α),
wobei f eine Funktion und f 1 eine dazugehörige Umkehrfunktion beschreibt. Da in typischen Situationen die Funktion f bekannt ist, muss lediglich eine Konstante, im vorliegenden Fall z.B. ßo, bestimmt werden, um eine absolute Kalibrierung der Ablenkeinheit 30 zu erreichen.
Falls darüber hinaus in der jeweiligen Konstellation die Absolutgröße des Grenzwinkels ατ berechnet werden kann, so kann auch die Einstellung ß der Ablenkeinheit 30 absolut kalibriert werden. Das heißt, dass jedem Wert ß der Ablenkeinheit 30 ein Absolutwert α zugeordnet werden kann. In diesem Fall lässt sich weiterhin aus einem der beiden Grenzwinkel αγder Brechungsindex der Probe np berechnen.
Für den Fall, dass sich der Fluoreszenzfiltersatz im Beleuchtungsstrahlengang befindet, sollte eine Kalibrierung der Ablenkeinrichtung 30 für jede Kombination aus Objektiv 20 und Fluoreszenzfiltersatz durchgeführt werden, da jedes dieser Einzelteile unterschiedliche Maßabweichungen hat.
Bei kreisringförmiger Pupillenbeleuchtung muss beachtet werden, dass hierbei nur eine Intensitätskante zur Verfügung steht. In diesem Fall muss die Orientierung des kreisringförmigen Anregungslichts 42 bezüglich der optischen Achse möglichst gut zentriert sein, da andernfalls nicht an allen Stellen des Kreisringes derselbe Einfallswinkel α bestehen würde. Unter Voraussetzung einer guten Justage und wenn die Streckung der Skala kalibriert ist, kann der Absolutbetrag des Grenzwinkels ατ der Totalreflexion bestimmt werden. Falls zusätzlich der Brechungsindex der Probe 10 bekannt ist, kann hier ebenfalls eine Absolutkalibrierung der Ablenkeinheit 30 vorgenommen werden. Mit der vorliegenden Erfindung wird ein neuartiges Verfahren zum Kalibrieren einer Ablenkeinheit in einem TIRF-Mikroskop, ein entsprechendes TIRF-Mikroskop sowie ein Verfahren zum Betreiben eines solchen TIRF-Mikroskops bereitgestellt, mit welchen mit minimalen zusätzlichen Hardwareaufwand eine äußerst genaue Kalibrierung eines TIRF-Mikroskops sowie eine genaue Bestimmung eines Grenzwinkels für die Totalreflexion durchgeführt werden können. Dies kann im Vergleich zum Stand der Technik mit einem reduzierten apparativen Aufwand bewerkstelligt werden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Kalibrieren einer Ablenkeinheit (30) in einem TIRF-Mikroskop (100), mit welcher ein Einfallswinkel (α) von Anregungslicht (42) auf eine Probe (10) verstellt wird,
(a) bei dem eine Einstellung (ß) der Ablenkeinheit (30) so gewählt wird, dass der zugehörige Einfallswinkel (α) sicher größer ist oder sicher kleiner ist als ein erwarteter Grenzwinkel (α-r) für die Totalreflexion des Anregungslichts (42) an einer Oberfläche einer verwendeten Probe (10),
(b) bei dem der Einfallswinkel (α) durch Ändern der Einstellung (ß) der Ablenkeinheit (30) in Richtung eines erwarteten Grenzwinkels (ocτ) gescannt wird, wobei für jede Einstellung (ß) der Ablenkeinheit (30) eine Intensität eines durch das Anregungslicht (42) bewirkten optischen Response (16) der verwendeten Probe (10) gemessen wird,
(c) bei dem die Intensität des optischen Response (16) der verwendeten Probe (10) mindestens für so viele Einstellungen (ß) der Ablenkeinheit (30) gemessen wird, bis die Intensität des optischen Response (16) der verwendeten Probe (10) eine Flanke durchläuft und
(d) bei dem die zu der Flanke gehörende Einstellung (ßi,ß2) der Ablenkeinheit (30) als Einstellung für den Grenzwinkel (αγ) für Totalreflexion an der verwendeten Probe (10) gespeichert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass der optische Response (16) der verwendeten Probe (10) in einer zur Ebene einer Objektivpupille (22) konjugierten Ebene gemessen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch geke nnze ich n et, dass der optische Response (16) mit einem Detektor (80) gemessen wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich n et, dass der optische Response (16) mit einer Kamera gemessen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch geke n nze ichnet, dass der optische Response (16) mit einer im TIRF-Messbetrieb verwendeten Kamera gemessen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennze ichnet, dass zur Auswertung der Intensität nur Teilbereiche eines Kameradetektors benutzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Beschleunigung der Kalibrierung der Einfallswinkel (α) nur in einer Umgebung der erwarteten Grenzwinkel (α-r) oder eines erwarteten Grenzwinkels (ατ) gescannt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch geke n nzeichnet, dass die Kamera zur Beschleunigung der Kalibrierung mit einer reduzierten Auflösung betrieben wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch geke n nzeichnet, dass für eine punktförmige Pupillenbeleuchtung eine erste Einstellung (ßi) der Ablenkeinheit (30) für einen positiven Grenzwinkel (αγ) für die Totalreflexion und eine zweite Einstellung (ß2) der Ablenkeinheit (30) für einen negativen Grenzwinkel (α2) für die Totalreflexion bestimmt werden und dass als Einstellung (ß0) der Ablenkeinheit (30) für senkrechten Einfall des Anregungslichts (42) auf die Oberfläche (11) der verwendeten Probe (10) die Mitte zwischen der ersten Einstellung (ßi) und der zweiten Einstellung (ß2) bestimmt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch geken nze ich net, dass der optische Response (16) der verwendeten Probe (10) in einer zur E- bene der Oberfläche (11) der verwendeten Probe (10) konjugierten Ebene gemessen wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch geken nze ichnet, dass ais optischer Response (16) Fluoreszenzlicht der verwendeten Probe (10) und/oder Streulicht der verwendeten Probe (10) gemessen wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennze ichnet, dass für eine punktförmige Pupillenbeleuchtung unter Verwendung der Brechungsindizes der verwendeten Probe (10) und eines Deckglases (12) und nach Bestimmung der Einstellungen (ßi,ß2) der Grenzwinkel (ocτ) für Totalreflexion den Einstellungen (ß) der Ablenkeinheit (30) eindeutig Absolutwerte für die Einfallswinkel (α) zugeordnet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch geken nze ichnet, dass für eine kreisringförmige Pupillenbeleuchtung unter Verwendung der Brechungsindizes der verwendeten Probe (10) und des Deckglases (12) und nach Bestimmung der Einstellung des Grenzwinkels (ατ) für Totalreflexion den Einstellungen (ß) der Ablenkeinheit (30) eindeutig Absolutwerte für die Einfallswinkel (α) zugeordnet werden.
14. TIRF-Mikroskop zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13, mit a) einer Lichtquelle (40) zum Aussenden des Anregungslichts (42), b) einer Mikroskop-Optik (20) zum Leiten des Anregungslichts (42) auf die verwendete Probe (10), c) der Ablenkeinheit (30) zum Einstellen des Einfallswinkels (α) des Anregungslichts (42) auf die Oberfläche (11) der verwendeten Probe (10) und d) mit einem Detektor (80) zum Nachweisen des optischen Response (16) der verwendeten Probe (10).
15. TIRF-Mikroskop nach Anspruch 14, dadurch g eken nzeichnet, dass eine in einen Abbildungsstrahlengang eiπschwenkbare Zusatzoptik (70) vorhanden ist zum Umschalten zwischen einer Abbildung der verwendeten Probe (10) und einer Abbildung einer Objektivpupille (22) auf den Detektor (80).
16. TIRF-Mikroskop nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (80) eine im TIRF-Messbetrieb verwendete Kamera ist.
17. TIRF-Mikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch geken nzeichnet, dass ein separater Detektor zum Messen des optischen Response (16) vorhanden ist.
18. Verfahren zum Betreiben eines TIRF-Mikroskops nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch geken nzeichnet, dass die Ablenkeinheit (30) gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 kalibriert wird, dass der Einfallswinkel (α) des Anregungslichts (42) auf einen Wert eingestellt wird, der betragsmäßig größer ist als ein Grenzwinkel (α-r) für die Totalreflexion und dass anschließend TIRF-Messungen durchgeführt werden.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch g eke nnze ichnet, dass auf Grundlage der Beziehung:
d =
4π-nd^ss\in2 α-sin2 α7
wobei λ die verwendete Wellenlänge, nd den Brechungsindex des Deckglases (12), α den Einfallswinkel (α) von Anregungslicht (42) auf die Probe (10) und OtT den Grenzwinkel (α-p) für die Totalreflexion bezeichnen, für eine gewünschte Eindringtiefe d eines evaneszenten Felds in die verwendete Probe (10) der zugehörige Einfallswinkel (α) eingestellt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennze ichnet, dass unter Verwendung des Grenzwinkels (ατ) für die Totalreflexion und des Brechungsindexes des Deckglases (12) der Brechungsindex der verwendeten Probe (10) bestimmt wird.
PCT/EP2009/003035 2008-04-30 2009-04-25 Verfahren zum kalibrieren einer ablenkeinheit in einem tirf-mikroskop, tirf-mikroskop und verfahren zu dessen betrieb WO2009132810A1 (de)

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