WO2009110473A1

WO2009110473A1 - 急性呼吸器感染症起炎病原体の鑑別方法

Info

Publication number: WO2009110473A1
Application number: PCT/JP2009/053976
Authority: WO
Inventors: 崇平間; 弘一萩原
Original assignee: 学校法人埼玉医科大学
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2009-09-11
Also published as: US20110091886A1; CN102112625B; JP4665203B2; JPWO2009110473A1; EP2253712A4; CN102112625A; AU2009220657A1; EP2253712B1; CA2717244A1; EP2253712A1; US20130252241A1

Abstract

　鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体であり、ａ）対象の気道分泌物を含む検体から調製したＤＮＡ中の、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、ｂ）ＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、ｃ）対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数に対する病原体に由来する遺伝子のコピー数の相対数を算出する工程と、ｄ）鑑別基準値及び相対数に基づいて、病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する工程と、を備える、急性呼吸器感染症起炎病原体を鑑別する方法を提供する。

Description

急性呼吸器感染症起炎病原体の鑑別方法

　本発明は、急性呼吸器感染症起炎病原体の鑑別方法に関する。

　肺炎等の急性呼吸器感染症は起炎病原体の種類別から、細菌性（結核菌等の抗酸菌によるものも含む）、真菌性、ウイルス性等に分類される。また日常臨床において、肺炎は発症場所により市中肺炎、ナーシングホーム肺炎（主に誤嚥性肺炎をさす）、院内肺炎（人工呼吸器肺炎や日和見肺炎など特殊状態下での肺炎が含まれる）に分類される。発症場所の違いによって、起炎病原体の種類や頻度などの疫学的特徴の違いが認められている。また、急性呼吸器感染症においてその起炎病原体を同定することは、診断確定、治療方針決定のために非常に重要であるため、より信頼性の高い肺炎病原体の検査法が望まれている。

　急性呼吸器感染症の起炎病原体の検査法としては、塗抹グラム染色、培養検査、血清診断が知られている。また、レジオネラや肺炎球菌を対象とした尿中抗原検出法（非特許文献１）、及び、遺伝子診断法（特許文献１、及び、非特許文献２）が開発されている。

特開２００５－１１０５４５号公報Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉs．　４４：Ｓ２７－７２（２００７）Ｎｉｐｐｏｎ　Ｒｉｎｓｈｏ　６５　Ｓｕｐｐｌ２：１９９－２０７（２００７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．　３４８：１２５６－１２６６（２００３）Ｔｈｏｒａｘ　５８：９６０－９６５（２００４）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．　１６５：８６７－９０３（２００２）Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．　２２：３８７－３９４（１９９６）Ｌａｎｃｅｔ　３６２：１９９１－２００１（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．　３５２：３８０－３９１（２００５）

　急性呼吸器感染症は、気道に通常存在しない病原体（非定着病原体）による急性感染と、気道定着病原体又は慢性呼吸器感染起炎病原体による急性感染とに大別される。気道定着病原体や慢性呼吸器感染起炎病原体は、健常者にも気道内にその存在が確認されるが、定着や持続性感染の状態を維持する。しかし、保因者の体調不良等の要因を契機に急性感染に移行し、強い症状（発熱、肺炎、敗血症など）を引き起こす。したがって、たとえＰＣＲ等により急性気道感染症の原因となりうる病原体が検出されたとしても、この病原体が急性感染に寄与する起炎病原体か、急性感染に関与しない定着病原体や慢性呼吸器感染起炎病原体のいずれかであるかを鑑別することはできない（非特許文献３）。実際、ＰＣＲを用いて検査すると、健常者の喀痰や気道分泌物及び肺炎患者の喀痰や気道分泌物の両方から同一の病原体が検出される。

　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、急性呼吸器感染症起炎病原体の鑑別方法を提供することを目的とする。

　本発明は、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法であって、
　鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体を含み、
　対象の気道分泌物を含む検体中の対象の細胞量に対する、上記検体中の病原体量の相対値を測定する工程と、
　上記相対値に基づいて、上記病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する工程と、
を備える、方法を提供する。

　Ｔｈｏｒａｘ　５８：９６０－９６５（２００４）（非特許文献４）において実施された前向きコホート研究では、入院治療を要した市中肺炎に対して初期治療に不適切な抗生剤を使用した場合、適切な抗生剤を使用した場合と比較し、死亡率が１１倍となることが示されている。

　Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．　１６５：８６７－９０３（２００２）（非特許文献５）には、院内肺炎のうち人工呼吸器関連肺炎において初期治療に適切な抗生剤を使用した場合と、不適切な抗生剤を使用した場合に、統計学的に有意に死亡率に差がでることが報告されている。

　Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．　２２：３８７－３９４（１９９６）（非特許文献６）は、ＩＣＵでの治療を要する肺炎において、初期治療に使用した抗生剤が必ずしも適切ではなかったことを報告しており、誤認率の高い病原体として、シュードモナス属菌、スタフィロコッカス属菌、アシネトバクター属菌等の気道定着病原体が挙げられている。つまり、初期治療の段階で起炎菌の同定を誤ると、適切な治療を完遂できない危険性が高く、死亡率も高くなる。

　本発明の急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法によれば、これまでに起炎状態・定着状態の鑑別が困難であった気道定着病原体について、検体中の対象の細胞数との比較に基づいて鑑別することで、検出された病原体が起炎病原体か定着病原体であるかを、より高感度・高特異度に鑑別することができる。

　本発明は、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための鑑別基準値を決定する方法であって、
　鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体であり、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体から調製したＤＮＡ中の、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）上記ＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｃ）上記対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数に対する上記病原体に由来する遺伝子のコピー数の相対数を算出する工程と、
ｄ）複数の対象について上記工程ａ）～ｃ）を行い、各々の対象について相対数を得る工程と、
ｅ）各々の対象の相対数と、各々の対象の臨床診断結果との比較により、
　　ｉ）臨床診断において起炎病原体陽性となる相対数の下限値；及び／又は
　　ｉｉ）臨床診断において起炎病原体陰性となる相対数の上限値；
を鑑別基準値と決定する工程と、
を備える、方法を提供する。

　気道定着病原体は、ストレプトコッカス属菌、ヘモフィルス属菌、モラキセラ属菌、シュードモナス属菌、クレブシエラ属菌、ステノトロフォモナス属菌、アシネトバクター属菌、及び、スタフィロコッカス属菌からなる群より選ばれる１以上の病原体であることが好ましい。また、気道定着病原体に由来する遺伝子は、病原体特異的な遺伝子であることが好ましく、肺炎球菌のｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ遺伝子、肺炎球菌のｌｙｔＡ遺伝子、インフルエンザ菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、モラキセラ・カタラーリスのｃｏｐＢ遺伝子、シュードモナス属菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、肺炎桿菌のｇａｐＡ遺伝子、ステノトロフォモナス・マルトフィリアの２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＢ遺伝子等が好ましい。

　本発明の方法によれば、気道定着病原体において急性呼吸器感染症で検出された病原体が、起炎病原体か定着病原体であるかを鑑別するための鑑別基準値を決定することができる。

　本発明は、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法であって、
　鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体であり、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体から調製したＤＮＡ中の、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）上記ＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｃ）上記対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数に対する上記病原体に由来する遺伝子のコピー数の相対数を算出する工程と、
ｄ）上記鑑別基準値及び上記相対値に基づいて、上記病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する工程と、
を備える、方法を提供する。

　本発明の急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法によれば、これまでに起炎状態・定着状態の鑑別が困難であった気道定着病原体について、客観的な指標である鑑別基準値に基づいて鑑別することで、検出された病原体が起炎病原体か定着病原体であるかを、より高感度・高特異度に鑑別することができる。

　また、上記急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法において、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法により遺伝子のコピー数を測定することが好ましい。これにより迅速に起炎病原体を鑑別することができる。例えば、複数の遺伝子を検査しながら、検体提出から４時間以内に起炎病原体の鑑別結果が得られる。したがって、初期治療の初期段階で適切な起炎病原体の鑑別を行うことができ、適切な初期治療を行うことができる。

　さらに、気道分泌物の検体中に含まれている対象由来の細胞数を同時に測定するため、検体採取、ＤＮＡ調製、ＰＣＲ反応等が適正に行われたことを確認できる。したがって、ＤＮＡ精製不良（例えば精製キットの誤操作）や術者の測定ミス（例えば検体を測定機器に入れ忘れる）等で本来は陽性になるべき結果を陰性として判断してしまうこと（偽陰性）を低減することができる。鑑別結果が陰性の場合にはその病原体の感染関与を否定できる。

　さらに、本発明の急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法は、
　さらなる鑑別対象となる病原体が、気道に通常存在しない病原体であり、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体から調製したＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）ｉ）上記病原体に由来する遺伝子が検出されない場合に、上記病原体が感染症に関与しない；及び、
　　ｉｉ）上記病原体に由来する遺伝子が検出される場合に、上記病原体が起炎病原体である；
と鑑別する工程と、
をさらに備えることを特徴とする。

　気道に通常存在しない病原体としては、マイコプラズマ属菌、レジオネラ属菌、クラミドフィラ属菌、マイコバクテリウム属菌、コクシエラ属菌、ノルカジア属菌、ニューモシスチス属菌、アスペルギルス属菌等が挙げられる。気道に通常存在しない病原体に由来する遺伝子としては、マイコプラズマ・ニューモニエの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、レジオネラ・ニューモフィラのｍｉｐ遺伝子、レジオネラ属菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、肺炎クラミジアの５３ｋＤ－ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子、オウム病クラミジアのｏｍｐＡ遺伝子、結核菌のＭＰＢ６４遺伝子、マイコバクテリウム・イントラセルラーレのＩＴＳ　１６－２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、マイコバクテリウム・アビウムの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、マイコバクテリウム・アビウムのＩＴＳ　１６－２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、マイコバクテリウム・カンサシのｄｎａＪ遺伝子、ノルカジア属菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、ニューモシスチス・イロヴェツィイの５Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子等が好ましい。

　従来の急性呼吸器感染症の起炎病原体診断にはさまざまな問題点がある。まず、最も頻用される迅速診断法であるグラム染色は、菌量が多い一部の細菌感染症において有用であるが、菌量が少ない場合や、細菌以外の感染症の場合には臨床的有用性はなくなる。また、細菌が検出された場合でも、定着病原体や慢性呼吸器感染起炎病原体である場合もあり、急性呼吸器感染症の起炎病原体とは断定できないことがしばしばある。尿中抗原診断は肺炎球菌及びレジオネラ菌で利用可能であるが、この２種類以外の菌は検出できない。また、いずれの尿中抗原検査でも感染後長期にわたって陽性となるため、検査時点の感染の判断が難しいことがある。ＰＣＲ診断が可能な病原体としては結核菌がある。このＰＣＲ診断は画像診断で結核が疑われた際の確認検査として有用であるが、他の細菌の検査は出来ないため、一般の急性気道感染症の起炎病原体診断には不適である。従来行なわれて来た培養検査では、診断までに時間がかかる、分離・同定された病原体が起炎病原体か定着病原体か鑑別ができない、また、抗生物質が先行投与されていると培養されないことが多いなどの問題がある。また、病原体に適した培地でないと培養できず、多数の培地を組み合わせて行なわないと起炎病原体が分からない等の問題点がある。

　本発明の急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法によれば、気道定着病原体に加えて、気道に通常存在しない病原体について同時に検査することができる。つまり、急性呼吸器感染症の病原体を包括的に検出することが可能となる。よって、異なる病原体間での解析結果の比較が容易にできる。市中肺炎、院内肺炎において高頻度に検出される病原体はすべて含まれているため、主要な起炎病原体を包括的に鑑別できる点で臨床的有用性が極めて高い。

　加えて、本発明の急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法は、病原体に由来する遺伝子が、病原体の薬剤耐性獲得に関係する遺伝子（薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことを特徴とする。薬剤耐性遺伝子としては、ｍｅｃＡ遺伝子又はメタロ－β－ラクタマーゼ遺伝子等が好ましい。

　これによって、薬剤耐性遺伝子も病原体と同時に包括的に検索することができ、迅速に、包括的な検査結果を得ることができる。よって、薬剤耐性病原体が定着病原体・起炎病原体であるかを鑑別することができる。したがって、抗生剤選択のために有用な情報を提供することができる。さらに、薬剤耐性遺伝子を有する薬剤耐性病原体の存在を検出することができ、例えば、入院患者の薬剤耐性菌の保菌の有無を調べることもできるため、院内感染対策等の予防的観点からも優れている。

　また、上記対象が哺乳類であることが好ましく、特に、ヒトであることが好ましい。上記対象がヒトの場合、対象の細胞に由来する遺伝子は、ヒト細胞に由来するヒト特異的な遺伝子であることが好ましく、例えば、ヒトのＳＦＴＰＣ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ，　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ）遺伝子やβ－ｇｌｏｂｉｎ遺伝子、β－ａｃｔｉｎ遺伝子が好ましい。

　本発明は、上記急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法により、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するためのキットを提供する。本発明のキットは、ストレプトコッカス属菌、ヘモフィルス属菌、モラキセラ属菌、シュードモナス属菌、クレブシエラ属菌、ステノトロフォモナス属菌、アシネトバクター属菌、及び、スタフィロコッカス属菌からなる群より選ばれる１以上の気道定着病原体に由来する遺伝子に対するプライマーセット、及び、使用説明書を含むことを特徴とする。

　また、本発明のキットは、マイコプラズマ属菌、レジオネラ属菌、クラミドフィラ属菌、マイコバクテリウム属菌、コクシエラ属菌、ノルカジア属菌、ニューモシスチス属菌、ノルカジア属菌、ニューモシスチス属菌、アスペルギルス属菌からなる群より選ばれる１以上の気道に通常存在しない病原体に由来する遺伝子に対するプライマーセット、及び、使用説明書をさらに含むことが好ましい。本発明のキットは、ｍｅｃＡ遺伝子、及び、メタロ－β－ラクタマーゼ遺伝子からなる群より選ばれる１以上の薬剤耐性遺伝子に対するプライマーセット、及び、使用説明書をさらに含むことが好ましい。

　本発明の急性呼吸器感染症起炎病原体を鑑別するためのキットによれば、既存の検査と比較して、より高感度・高特異的に急性呼吸器感染症の起炎病原体と定着病原体とを鑑別することができる。

　本発明は、上記急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法により、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための装置を提供する。本発明の装置は、鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体であり、以下の手段：
ａ）対象の気道分泌物を含む検体からＤＮＡを調製するためのＤＮＡ調製手段と、
ｂ）上記ＤＮＡ中の、対象の細胞に由来するＤＮＡ、及び、病原体に由来するＤＮＡを特異的に増幅するためのＤＮＡ増幅手段と、
ｃ）上記ＤＮＡ増幅手段によって増幅された対象の細胞に由来するＤＮＡ、及び、病原体に由来するＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出手段と、
ｄ）上記ＤＮＡ検出手段によって検出されたシグナルに基づき、上記対象の細胞に由来するＤＮＡのコピー数に対する上記病原体に由来するＤＮＡのコピー数の相対数を算出するための算出手段と、
ｅ）上記鑑別基準値及び上記相対数に基づいて、上記病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別するための鑑別手段と、
を備えることを特徴とする。

　また、本発明の装置は、さらなる鑑別対象となる病原体が気道に通常存在しない病原体であり、以下の手段：
ａ）対象の気道分泌物を含む検体からＤＮＡを調製するためのＤＮＡ調製手段と、
ｂ）上記ＤＮＡ中の、病原体に由来するＤＮＡを特異的に増幅するためのＤＮＡ増幅手段と、
ｃ）上記ＤＮＡ増幅手段によって増幅された病原体に由来するＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出手段と、
ｄ）上記ＤＮＡ検出手段によって検出されたシグナルに基づき、上記病原体に由来するＤＮＡのコピー数を算出するための算出手段と、
ｅ）ｉ）上記病原体に由来するＤＮＡが検出されない場合に、上記病原体が感染症に関与しない；及び、
　　ｉｉ）上記病原体に由来するＤＮＡが検出される場合に、上記病原体が起炎病原体である；
と鑑別するための鑑別手段と、
をさらに備えることを特徴とする。

　本発明の装置は、病原体に由来するＤＮＡが薬剤耐性遺伝子をさらに含むことが好ましい。

　本発明の装置によれば、多数の検体、および、検体当たり多数の病原体や薬剤耐性遺伝子を短時間に検査し、急性呼吸器感染症起炎病原体を鑑別することができる。

　さらに、本発明の急性呼吸器感染症起炎病原体を鑑別する方法、並びに、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するためのキット及び装置によれば、気道感染に関与するウイルスやいままで迅速診断が困難であった真菌についても検査対象として追加することができるため柔軟性に優れ、それによってさらに利便性を高めることができる。

　既存の検査では、これらの病原体を検索するだけでも高コスト（２６，０００円以上）を要する。本発明では１検体につき２１種類の標的遺伝子の包括的検索を実施しても低コスト（４，６００円）で実施可能である。検査コストを大幅に上回る医療費削減が可能となっており、市場的観点からみても大きな期待がもてる。

　既存の検査では、診断確定までに、主要な検出方法である培養検査でも最低３～１４日の時間を要し、ペア血清を用いれば最低１４日は要する。これに対し、本発明では、検体処理から複数の標的遺伝子の包括的検索、検査結果返却まで４時間で実施可能である。したがって、迅速性の観点からも優れている。

　既存の迅速診断で用いられるグラム染色はその読影に熟練した技術と能力を要するため、検査実施者によって結果が異なることがある。しかし、ＰＣＲは熟練した技術を必要とせず、マニュアル化も可能である。また検査実施者が異なっても精度の高い結果が得られる。したがって、高い客観性を有する点で優れている。

気道感染症の原理を模式化したシェーマ。本発明の一実施例に係る急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための装置の構成を示すブロック図。実際の肺炎２症例を用いた標的遺伝子の検出におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフ及び喀痰グラム染色写真。肺炎球菌を検出した４４例（Ａ）及び１００例（Ｂ）におけるΔＣｙｃｌｅと臨床診断結果とをプロットしたグラフ。インフルエンザ菌を検出した２６例（Ａ）及び２９例（Ｂ）におけるΔＣｙｃｌｅと臨床診断結果とをプロットしたグラフ。緑膿菌を検出した３７例（Ａ）及び４８例（Ｂ）におけるΔＣｙｃｌｅと臨床診断結果とをプロットしたグラフ。モラキセラ・カタラーリスを検出した１７例（Ａ）及び２０例（Ｂ）におけるΔＣｙｃｌｅと臨床診断結果とをプロットしたグラフ。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出した３４例におけるΔＣｙｃｌｅと臨床診断結果とをプロットしたグラフ。３００例のうち起炎病原体を同定した１５８例の内訳を示したグラフ。病原体の名称、症例数、症例の割合（％）を示す。２２３例の鑑別結果の内訳を示したグラフ。病原体の名称、症例の割合（％）を示す。多段階前向き試験において登録された１７４例の鑑別結果の内訳を示したグラフ。病原体の名称、症例の割合（％）を示す。

　以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

　本実施形態の急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法は、鑑別対象となる病原体が気道定着病原体を含み、対象の気道分泌物を含む検体中の対象の細胞量に対する、検体中の病原体量の相対値を測定する工程と、相対値に基づいて、病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する工程と、を備える。

　まず、図１を用いて本発明の急性呼吸器感染症起炎病原体の鑑別方法の原理について説明する。図１左のグラフ及び写真は、正常な対象（健常人）の喀痰や気道分泌物中に存在する病原体（例として、病原体１及び病原体２）や、対象由来の細胞（ヒト細胞）の存在を示す。病原体１や病原体２は気道定着病原体であり、これら病原体は炎症を引き起こしておらず、保菌者である対象も呼吸器症状を呈していない。ここで、病原体２によって急性呼吸器感染症が引き起こされたと仮定する。急性呼吸器感染症を発症した対象における喀痰や気道分泌物中の細菌及び対象由来の細胞の割合は、図１右のように変化する。気道に強い炎症が生じているため、対象は呼吸器症状（呼吸困難、咳嗽、膿性痰）を呈する。起炎病原体である病原体２も増加する。肺炎を引き起こしていない病原体１は著明な変化がみられない。このことから、病原体１は定着病原体であるとわかる。

　ここで、病原体１及び病原体２をＰＣＲ法等の公知の方法で検出すると、双方が検出される。病原体のＤＮＡ精製効率、標的遺伝子の増幅・検出効率等の違いにより、目的とする病原体の存在量（存在比）を見積もることは難しい。さらに、公知のＰＣＲ法を用いた対象由来の喀痰、気道分泌物検査で計測できるのは、病原体の存在・非存在及び単位体積当たりの病原体量である。喀痰や気道分泌物には唾液や上気道の定着病原体が多量に混入することが多く、急性呼吸器感染症の起炎病原体を、病原体の存在・非存在、及び単位体積当たりの病原体量情報から確定することは難しい。別の言い方をすると、喀痰・気道分泌物は、同一種類の検体として一括して扱うことはできないほど多様性が大きい。よって、検出に用いる検体量やＤＮＡ量を一定にして既知の手法で検査を行なったとしても、検出結果を標準化することは困難であり、その結果の解釈は多くの場合容易ではない。

　本発明では、気道分泌物内に共通に存在する対象由来の細胞（気道上皮細胞や白血球等の炎症細胞）に着目した。図１右に示すように、急性呼吸器感染症の発症時には、病原体の活動を鎮静しようと対象由来の細胞が増加する。一方、炎症に無関係な定着病原体の量はあまり変化しないことが推測される。したがって、対象由来の細胞を内部コントロールとして、病原体の存在量の相対数を見積もることにより、起炎病原体・定着病原体の鑑別が可能となるとの仮説を立てた。以下に述べる実施例においてこの仮説を立証し、本願発明を完成した。

　以下に、発症場所により分類した急性呼吸器感染症の主要な起炎病原体について説明する。市中肺炎（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ－ａｑｕｉｒｅｄ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、ＣＡＰ）は、一般人等が社会において罹患する肺炎を指す。表１に、市中肺炎の主要な起炎病原体を列挙する（非特許文献３及び７参照）。市中肺炎は、気道定着病原体、及び、気道に通常存在しない病原体を含む多数の起炎病原体が原因となりうる。そのため、多数の病原体について包括的に検査し、急性気道感染症の主責任病原体を決定する必要がある。このためには２段階の過程が必要となる。１段階目は、可能性のある病原体を高感度の手法により包括的に検出する過程である。２段階目は、検出した病原体のうち、どれが起炎病原体でどれが定着病原体かを鑑別する過程である。本発明の鑑別方法により、包括的な病原体の検出と鑑別が可能となる。

　　ＣＯ：気道定着病原体
　　ＮＣＯ：気道に通常存在しない病原体

　人工呼吸器関連肺炎（Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ＶＡＰ）は、院内肺炎の一分類であり、人工呼吸器使用中の患者の肺炎を指す。表２に、人工呼吸器関連肺炎の主要な起炎病原体を列挙する（非特許文献５参照）。表２から明らかな通り、主要な起炎病原体のほとんどが、気道定着病原体や慢性呼吸器感染起炎病原体体である。したがって、検出された病原体が起炎病原体及び定着病原体のいずれであるか鑑別する必要性が高い。本発明により、これまでに鑑別できなかった気道定着病原体について、鑑別することが可能となった。

　　ＣＯ：気道定着病原体

　次に、本発明の実施形態である、急性呼吸器感染症起炎病原体を鑑別するための鑑別基準値を決定する方法、及び、鑑別基準値に基づいて急性呼吸器感染症起炎病原体を鑑別する方法について説明する。

（急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための鑑別基準値を決定する方法）
　急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための鑑別基準値を決定する方法は、気道定着病原体を鑑別するための鑑別基準値を決定する方法であり、以下の工程を備える。
　対象の気道分泌物を含む検体からＤＮＡを調製する工程と、
ａ）ＤＮＡ中の、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）ＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｃ）対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数に対する病原体に由来する遺伝子のコピー数の相対数を算出する工程と、
ｄ）複数の対象について工程ａ）～ｃ）を行い、各々の対象について相対数を得る工程と、
ｅ）各々の対象の相対数と、各々の対象の臨床診断結果との比較により、
　　ｉ）臨床診断において起炎病原体陽性となる相対数の下限値；及び／又は
　　ｉｉ）臨床診断において起炎病原体陰性となる相対数の上限値；
を鑑別基準値と決定する工程。

　引き続いて、各工程について説明する。

　本実施形態における病原体は、気道定着病原体である。「気道定着病原体」とは、気道に定着し得る病原体（定着病原体、常在病原体、片利共生病原体、Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ　ｏｒｇａｎｉｓｍともいう）であり、感染を起こしていない健常者にも存在する。正常時には、これらの定着病原体は炎症を引き起こしておらず、保菌者（対象）も呼吸器症状を呈さない。しかし、対象の体調不良等の要因を契機に感染に移行し、慢性／急性呼吸器感染の原因病原体（起炎病原体）になり得る。本発明においては、「気道定着病原体」とは、気道に定着し得る病原体の種類を指す。また、単に「定着病原体」と言う場合は、気道定着病原体で気道感染に関与していない状態のものを指す。

　気道定着病原体としては、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のストレプトコッカス属菌；インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）等のヘモフィルス属菌；モラキセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）等のモラキセラ属菌；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス属菌；肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のクレブシエラ属菌；ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）等のステノトロフォモナス属菌；アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｕｍａｎｎｉｉ）等のアシネトバクター属菌；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）等のスタフィロコッカス属菌等が挙げられる。

　対象は、哺乳類、特にヒトが好ましい。また、対象は、急性肺炎等の急性呼吸器感染症を有する対象又はその疑いのある対象である。検体は、気道分泌物を含むものであれば利用可能であり、具体的には、喀出痰、吸引痰、誘発喀痰、気管内採痰等の喀痰が好ましい。また、喀出されてすぐの喀痰又は－２０℃冷凍保存した喀痰であることが好ましい。

　ＤＮＡは、対象由来のＤＮＡ及び／又は病原体由来のＤＮＡ、つまり、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又は、ゲノムＲＮＡより逆転写酵素にてＤＮＡに変換した相補ＤＮＡを指す。検出に用いるＤＮＡは、ＤＮＡ中に存在する遺伝子ＤＮＡを検出できるように調整すればよい。ＤＮＡ抽出・精製方法は当分野で知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載されている当業者にとって公知の方法や市販のＤＮＡ精製キットを用いて調製することができる。

　「遺伝子のコピー数を測定する」とは、対象由来のＤＮＡ及び／又は病原体由来のＤＮＡ中の、標的とする遺伝子配列のコピー数を測定することを指す。また、検体中で比較可能な標的ＤＮＡの相対コピー数を測定することを指す。ＤＮＡの相対コピー数の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、ＰＣＲ法（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法）等の遺伝子増幅検出法が挙げられる。ＰＣＲ定量方法としては、アガロースゲル電気泳動法、インターカレーター法（ＳＹＢＲグリーン法）、蛍光プローブ法等が挙げられる。中でも、蛍光プローブ法を利用したＲｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法が好ましい。ＤＮＡの相対コピー数は、インターカレーター法又は蛍光プローブ法を利用したＲｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法において、Ｃｙｃｌｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ値）により表すことができる。

　ＰＣＲ法に用いるプライマーセットは、対象の遺伝子又は病原体の遺伝子を特異的に認識するよう、遺伝子の特異的な領域を認識するものであり、プライマーの具体的なヌクレオチド配列は、適宜決定することができる。

　蛍光プローブ法に用いる蛍光プローブとしては、ＴａｑＭａｎプローブ、サイクリングプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎ等を選択することができる。蛍光プローブは、上記プライマーセットと共に対象の遺伝子又は病原体の遺伝子を特異的に認識するよう、遺伝子の特異的な領域を認識するものであり、プローブの具体的なヌクレオチド配列は、適宜決定することができる。蛍光プローブの５’及び３’末端側は、それぞれ蛍光物質とクエンチャー物質で修飾されており、ＰＣＲ反応の進行に伴い、クエンチャー物質による抑制が解除されることで発する蛍光を検出する。これにより、ＤＮＡ中の標的遺伝子配列の相対コピー数を測定することができる。蛍光物質及びクエンチャー物質の組み合わせは、互いに識別可能な組み合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組み合せはそれぞれ当業者に公知のものを用いることができるが、ＦＡＭ（登録商標）及びＴＡＭＲＡ（登録商標）、ＴＥＴ（登録商標）及びＢＨＱ－１（登録商標）等の組み合わせが好ましい。また、異なる波長の蛍光を同時に励起及び検出するシステム（例えば、Ｓｍａｒｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＩＩ　Ｓｙｓｔｅｍ、タカラバイオ株式会社）を用いることで、１つのマルチプレックスＰＣＲ反応で増幅した複数の標的配列を同時検出することができる。一対のＰＣＲプライマー対で１つの標的塩基配列を増幅するＰＣＲ反応を、Ｓｉｎｇｌｅ　ＰＣＲと言い、複数対のＰＣＲプライマー対で複数の標的塩基配列を同時に増幅するＰＣＲ反応を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲと言う。

　「相対数を算出する」とは、相対コピー数を算出することであり、具体的には、対象の細胞に由来する遺伝子配列の相対コピー数に対する、病原体に由来する遺伝子配列の相対コピー数の相対数を算出することである。これにより、対象由来の細胞数を内部コントロールとした病原体細胞の相対数を見積もることができ、異なる検体間での比較が可能となる。言い換えると、工程ａ）～ｃ）は病原体の検出工程であり、これにより、病原体を標準化して検出することができる。例えば、対象の細胞に由来する遺伝子で得られたＣｔ値から、病原体に由来する遺伝子で得られたＣｔ値を差し引いた値（ΔＣｙｃｌｅ）により病原体細胞の相対数を表すことができる。

　「臨床診断結果」とは、当該分野で利用可能な急性呼吸器感染症の臨床診断結果であり、喀痰塗抹グラム染色、喀痰培養法、尿中抗原検査、ペア血清法等の公知の検査方法により、起炎病原体が同定される、起炎病原体の疑いが認められる、ある病原体が起炎病原体ではないと判断される等の臨床診断において得られた所見を指す。

　また、「臨床診断において起炎病原体陽性」とは、上記診断において、起炎病原体が同定されたもの、又は、起炎病原体の疑いが認められたものを指す。「臨床診断において起炎病原体陰性」とは、上記診断において、ある病原体が起炎病原体ではないと判断されたものを指す。

　鑑別基準値を決定する工程においては、まず、各々の対象で得られた相対数（例えば、ΔＣｙｃｌｅ）と、各々の対象で得られた起炎病原体陽性／陰性を示す臨床診断結果を併せてプロットし、両者の相関を統計的に解析する。次に、目的とする病原体の起炎病原体／定着病原体（非起炎病原体）の境界となる相対数、つまり、臨床診断において有意に起炎病原体陽性となる相対数の下限値、及び／又は、臨床診断において有意に起炎病原体陰性となる相対数の上限値を決定し、これを鑑別基準値とする。そのような統計的解析方法は、当業者にとって公知である。このようにして、ある病原体の特定の標的遺伝子について、それぞれ固有の鑑別基準値を決定することができる。また、さらに検体数を追加し、それらの検体の相対数と臨床診断結果とを上記のプロットに追加することにより、鑑別基準値の信頼性を評価し、より信頼性の高い鑑別基準値を決定することができる。

（急性呼吸器感染症の起炎病原体の鑑別方法）
　本実施形態の急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法は、以下の３つの方法に大きく分けられる。
（１）気道定着病原体を鑑別対象とする鑑別方法
（２）気道に通常存在しない病原体をさらなる鑑別対象とする鑑別方法
（３）薬剤耐性遺伝子のコピー数を測定し、病原体の薬剤耐性を評価する鑑別方法
以下、それぞれの方法について説明する。

（１）気道定着病原体を鑑別対象とする鑑別方法
　気道定着病原体を鑑別対象とする急性呼吸器感染症の起炎病原体の鑑別方法は、以下の工程を備える。
　対象の気道分泌物を含む検体からＤＮＡを調製する工程と、
ａ）ＤＮＡ中の、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）ＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｃ）対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数に対する病原体に由来する遺伝子のコピー数の相対数を算出する工程と、
ｄ）上記鑑別基準値及び上記相対値に基づいて、病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する工程。

　ＤＮＡを調整する工程から工程ｃ）までは、上述の鑑別基準値を決定する方法と同様に行えば良く、重複する説明は省略する。

　気道定着病原体は、気道への付着、増殖、定着、感染という過程を経て、保因者の体調不良等の要因を契機に急性感染、つまり、起炎状態に移行する。したがって、気道定着病原体の場合、陰性、定着病原体及び起炎病原体の３種類の状態（鑑別結果）が存在する。日和見病原体についても同様の過程を経て感染に関与するため、陰性、定着病原体（不顕性感染の状態）及び起炎病原体の３種類の状態（鑑別結果）が存在する。

　鑑別する工程：（１）の工程ｄ）においては、得られた相対数と鑑別基準値との比較により、上述の３種類の状態のうち、いずれに属するか鑑別することができる。具体的には、ｉ）気道定着病原体に由来する遺伝子が検出されない場合に、病原体が気道に定着していない（陰性）；ｉｉ）気道定着病原体に由来する遺伝子が検出されるが、相対数が鑑別基準値未満の場合に、病原体が定着病原体であるが起炎病原体ではない；及び、ｉｉｉ）相対数が鑑別基準値以上の場合に、病原体が起炎病原体である；と鑑別する。ここで、「検出されない」、又は、検出限界以下とは、例えば、遺伝子の相対コピー数をＣｔ値で表す場合、遺伝子の増幅産物に由来するシグナル強度（蛍光強度等）が、Ｃｔ値を規定するシグナル強度に達しない場合を指す。なお、内部コントロールである対象の細胞に由来する遺伝子が検出されない場合には、相対数は得られず、よって、そのケースは鑑別の対象とはならない。この場合、検体採取、ＤＮＡ調製、ＰＣＲ反応等が適正に行われていないことが疑われる。したがって、従来の検査では陰性と判断されていた偽陰性を低減することができる。

（２）気道に通常存在しない病原体をさらなる鑑別対象とする鑑別方法
　次に、気道定着病原体に加えて、気道に通常存在しない病原体をさらなる鑑別対象とする、急性呼吸器感染症の起炎病原体の鑑別方法について説明する。本実施形態の鑑別方法は、（１）の鑑別方法の工程に加えて、さらに以下の工程を備える。
　対象の気道分泌物を含む検体からＤＮＡを調製する工程と、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体から調製したＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）ｉ）病原体に由来する遺伝子が検出されない場合に、病原体が感染症に関与しない；及び、
　　ｉｉ）病原体に由来する遺伝子が検出される場合に、病原体が起炎病原体である；
と鑑別する工程。

　気道に通常存在しない病原体（Ｎｏｎｃｏｍｍｅｎｓａｌ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）としては、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のマイコプラズマ属菌；レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）等のレジオネラ属菌；肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ　ｐｓｉｔｔａｃｉ）等のクラミドフィラ属菌；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋａｎｓａｓｉｉ）等のマイコバクテリウム属菌；コクシエラ・バーネティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ　ｂｕｒｎｅｔｉｉ）等のコクシエラ属菌等に加え、日和見感染病原体、すなわち、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）等のノルカジア属菌；ニューモシスチス・イロヴェツィイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｊｉｒｏｂｅｃｉ）等のニューモシスチス属菌；アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等のアスペルギルス属菌（真菌）等が挙げられる。

　日和見感染とは、健康な対象では感染症を起こさないような病原体（弱毒微生物、非病原微生物、平素無害菌等と呼ばれる）が原因で発症する感染症である。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）やステロイドや免疫抑制剤等で免疫力低下の状態にある対象において、通常であればその免疫力によって増殖が抑えられている病原性の低い病原体が増殖し、その結果として病気を引き起こすことがある。一般的に日和見感染に関与する病原体としては、環境に存在して時に対象に侵入する外因性の病原体と、ヒトに潜在的に存在する内因性の病原体に大別できるが、本発明においては、前者を日和見病原体として扱い、後者を気道定着病原体として扱う。

　気道に通常存在しない病原体は、通常、気道に存在しないため、陰性、起炎病原体の２種類の鑑別結果が存在する。鑑別する工程：（２）の工程ｂ）においては、気道に通常存在しない病原体の検出の有無により、２種類の状態のうち、いずれに属するか鑑別することができる。具体的には、ｉ）病原体に由来する遺伝子が検出されない場合に、病原体が感染症に関与しない（陰性）；及び、ｉｉ）病原体に由来する遺伝子が検出される場合に、病原体が起炎病原体である；と鑑別する。

　上記に挙げた病原体の他、気道感染に関与するウイルス、細菌、真菌、及び／又は寄生虫等をさらに追加して検出しても良い。ウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ＲＳウイルス、メタニューモ・ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。細菌としては、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｕｍａｎｎｉｉ）等のアシネトバクター属菌、コクシエラ・バーネティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ　ｂｕｒｎｅｔｉｉ）等のコクシエラ属菌等が挙げられる。真菌としては、例えば、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等のアスペルギルス属菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）等のクリプトコッカス属菌が挙げられる。寄生虫としては、例えば、ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ　ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）等の肺吸虫が挙げられる。

（３）薬剤耐性遺伝子のコピー数を測定し、病原体の薬剤耐性を評価する鑑別方法
　第三の鑑別方法は、上記の（１）又は（２）の鑑別方法に加えて、薬剤耐性遺伝子のコピー数を測定し、病原体の薬剤耐性を評価する鑑別方法である。この鑑別方法では、病原体に由来する遺伝子として病原体の薬剤耐性獲得に関係する遺伝子（薬剤耐性遺伝子）をさらに追加して検出・鑑別することができる。

　抗生物質等の薬剤に耐性を持つ遺伝子（薬剤耐性遺伝子）としては、メチシリン耐性遺伝子であるｍｅｃＡ遺伝子；ペニシリン、セフェム、カルバペネム等のβ-ラクタム環をもつほとんどの抗生物質を加水分解する酵素をコードするメタロ－β－ラクタマーゼ遺伝子（ＩＭＰ遺伝子、ＶＩＭ遺伝子、ＧＩＭ－１遺伝子、ＳＰＭ－１遺伝子等、非特許文献８：“Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　β－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ”参照）；イソニアジド（ＩＮＨ）耐性遺伝子であるｋａｔＧ遺伝子、ｉｎｈＡ遺伝子、ａｈｐＯ遺伝子等；リファンピシン（ＲＦＰ）耐性遺伝子であるｒｐｏＢ遺伝子等；エサンブトール（ＥＢ）耐性遺伝子であるｅｍｂＣ遺伝子、ｅｍｂＢ遺伝子、ｅｍｂＡ遺伝子等；ストレプトマイシン（ＳＭ）耐性遺伝子であるｒｐｓＬ遺伝子ｒｒｓ遺伝子等；ピラジナミド（ＰＺＡ）耐性遺伝子であるＰｎｃＡ遺伝子等；フルオロキノロン等のキノロン系薬剤耐性遺伝子であるｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子等が挙げられる。中でも、臨床上重要な薬剤耐性遺伝子であるｍｅｃＡ遺伝子、メタロ－β－ラクタマーゼ遺伝子等が好ましい。

　薬剤耐性病原体としては、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）や多剤耐性緑膿菌が知られている。また、ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＥＢ、ＳＭ、ＰＺＡ、キノロン系等の薬剤に耐性を持つ結核菌が報告されている。病原体の薬剤耐性を評価する方法としては、病原体特異的な遺伝子から得られた相対数と、病原体に由来する薬剤耐性遺伝子から得られた相対数とを比較し、病原体特異的な遺伝子の相対コピー数に対する薬剤耐性遺伝子の相対コピー数の比率から薬剤耐性病原体の存在を推定する方法が挙げられる。具体的には、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＢ遺伝子とメチシリン耐性遺伝子ｍｅｃＡとが同等量検出された場合には、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在が示唆される。また、メタロ－β－ラクタマーゼ遺伝子と、シュードモナス属菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子とが同等量検出された場合には、多剤耐性緑膿菌の存在が示唆される。

　また、薬剤耐性遺伝子の相対コピー数がわずかであっても、将来的にその薬剤耐性遺伝子を有する病原体が主要な起炎病原体となる危険性が提示される。また、他の病原体がその薬剤耐性遺伝子を獲得し、将来的に、例えば、メチシリン耐性ブドウ球菌や多剤耐性緑膿菌が出現する危険性が提示される。そのため、上述の病原体の薬剤耐性評価は、治療における抗生剤の選択の側面、また院内感染対策の側面からみても有用な情報となる。

　（急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するためのキット）
　本実施形態のキットは、上記急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法により、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するためのキットであり、１以上の上記気道定着病原体に由来する遺伝子に対するプライマーセット、及び、使用説明書を含む。また本実施形態のキットは、１以上の上記気道に通常存在しない病原体に由来する遺伝子に対するプライマーセット及び使用説明書、及び／又は、１以上の上記薬剤耐性遺伝子に対するプライマーセット及び使用説明書をさらに含むことが好ましい。

　各プライマーセットは、標的とする病原体において特異的な遺伝子領域に対して設計したものであることが好ましく、又は、薬剤耐性遺伝子に特異的な遺伝子領域に対して設計したものであることが好ましい。各プライマーセットには増幅する遺伝子領域に特異的なプローブを含んでいてもよく、蛍光プローブ法によって病原体に由来する遺伝子を増幅し検出することが好ましい。具体的には、表３に挙げたプライマーセットを用いることができる。使用説明書は、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法に加え、個々の病原体及び／又は薬剤耐性遺伝子についての鑑別基準値又は鑑別基準値の決定方法についての使用説明を含む。

　（急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための装置）
　本実施形態の急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための装置（以下、鑑別装置と言う）について説明する。本実施形態の鑑別装置は、以下の３つの方法に大きく分けられる。
（１）気道定着病原体を鑑別対象とする鑑別装置
（２）気道に通常存在しない病原体をさらなる鑑別対象とする鑑別装置
（３）薬剤耐性遺伝子のコピー数を測定し、病原体の薬剤耐性を評価する鑑別装置

　図２は、本実施形態の装置のブロック図である。以下、図２を参照しながら、本実施形態の装置を詳細に説明する。同図において、本実施形態の鑑別装置１０は、ＤＮＡ調製部１１、ＤＮＡ増幅部１２、ＤＮＡ検出部１３、算出部１４、及び、鑑別部１５を含んで構成されている。鑑別装置１０は、ＤＮＡ調製・増幅・検出・算出・鑑別工程を全て自動的に行うことができ、各工程は、それぞれ鑑別装置１０の内部に配置されたＤＮＡ調製部１１、ＤＮＡ増幅部１２、ＤＮＡ検出部１３、算出部１４、及び、鑑別部１５において、この順序で実施される。したがって、鑑別装置１０によれば、検査者は、対象の気道分泌物を含む検体を添加したサンプル管をＤＮＡ調製部１１のサンプル立てにセットした後、鑑別装置１０を始動させるだけで起炎病原体の鑑別を行うことができる。

　次に、このような構成を有する本実施例の鑑別装置の動作について説明する。鑑別装置１０を始動させると、対象の気道分泌物を含む検体はＤＮＡ調製部１１に導入され、ＤＮＡ調製部１１により検体からＤＮＡが調製される。ＤＮＡ調製部１０は、細胞を含む検体に界面活性剤とプロテアーゼＫを添加して処理し、次いでシリカゲルメンブレン等の多孔質メンブレンをベースにしたＤＮＡ精製法（例えば、ＱＩＡ　ａｍｐ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｋｉｔ（商標登録）、ＱＩＡＧＥＮ社）を含む任意のＤＮＡ抽出手段によりＤＮＡ調製を行う。ＤＮＡ増幅部１２は、ＤＮＡ調製部１０により調整されたＤＮＡをテンプレートとして、鑑別対象となる病原体由来のＤＮＡ（病原体の遺伝子に特異的な領域に相当するＤＮＡ）を増幅する。ここで、内部標準として対象の細胞に由来するＤＮＡを増幅する。鑑別対象となる病原体由来のＤＮＡは、（１）気道定着病原体由来のＤＮＡである、又は、（２）気道に通常存在しない病原体由来のＤＮＡをさらに含む。別の形態においては（３）鑑別対象となる病原体由来のＤＮＡが、薬剤耐性遺伝子に特異的な領域に相当するＤＮＡをさらに含む。ＤＮＡ増幅手段としては、ＰＣＲ、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ等が好ましい。ＤＮＡ検出部１３は、ＤＮＡ増幅手段によって増幅された対象の細胞に由来するＤＮＡ、及び、病原体に由来するＤＮＡを検出する。ＤＮＡの検出は、ＤＮＡの増幅と同時又は増幅終了後に行うことができる。ＤＮＡ検出方法としては、インターカレーター法（ＳＹＢＲグリーン法）、蛍光プローブ法等が挙げられる。ＤＮＡ増幅及び検出の組み合わせとしては、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法及び蛍光プローブ法を利用したものが好ましい。

　算出部１４は、（１）気道定着病原体を鑑別対象とする場合、ＤＮＡ検出手段によって検出されたシグナルに基づき、対象の細胞に由来するＤＮＡのコピー数に対する病原体に由来するＤＮＡのコピー数の相対数を算出する。また、（２）気道に通常存在しない病原体を鑑別対象とする場合、病原体に由来するＤＮＡのコピー数を算出する。そして、鑑別部１５は、（１）上記鑑別基準値及び上記相対数に基づいて、気道定着病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する。具体的には、ｉ）気道定着病原体に由来するＤＮＡが検出されない場合に、病原体が気道に定着していない（陰性）；ｉｉ）気道定着病原体に由来するＤＮＡが検出されるが、相対数が鑑別基準値未満の場合に、病原体が定着病原体であるが起炎病原体ではない；及び、ｉｉｉ）相対数が鑑別基準値以上の場合に、病原体が起炎病原体である；と鑑別する。また、（２）気道に通常存在しない病原体を鑑別対象とする場合、鑑別部１５は、ｉ）気道に通常存在しない病原体に由来するＤＮＡが検出されない場合に、病原体が感染症に関与しない；及び、ｉｉ）気道に通常存在しない病原体に由来するＤＮＡが検出される場合に、病原体が起炎病原体である；と鑑別する。

（実施例１：ＤＮＡ精製）
　検体として、外来受診または入院中の呼吸器感染症患者の喀出痰、吸引痰、誘発痰、気管内採痰のいずれかを用いた。また、喀出されてすぐの喀痰又は－２０℃冷凍保存した喀痰を用いた。検体に等量のｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を加え、ボルテックスすることにより粘性の低下した均一な試料を得た。２００μＬの試料にｓａｍｐｌｅ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ　ＡＬ、株式会社キアゲン）２００μＬとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（タカラバイオ株式会社）２０μＬを加え、５７℃で２時間インキュベートした。そして、ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて検体のＤＮＡを精製した。

（実施例２：ＰＣＲ反応）
　精製した各検体由来のＤＮＡをテンプレートとして、２１種類の標的遺伝子についてＰＣＲ反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）を行った。なお、ＰＣＲ反応にはＳｍａｒｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＩＩ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）を使用し、１つの反応において１種類又は２種類の標的遺伝子を検出した。ＰＣＲ反応液及びＰＣＲ反応は、以下の条件を用いた。２２種類の標的遺伝子を検出するために使用したプライマーセット及びプローブの組み合わせを表３に示す。なお、１つの反応で２種類の標的塩基配列を同時に増幅する場合、プローブの蛍光標識の組み合わせが異なるものを用いた。

［ＰＣＲ反応液（Ｓｉｎｇｌｅ　ＰＣＲ）］
　　ＴＡＫＡＲＡ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　　　　　　　１２．５　μＬ
　　標的遺伝子Ａ　フォワードプライマー（１０μＭ）　　　　　０．７５μＬ
　　標的遺伝子Ａ　リバースプライマー（１０μＭ）　　　　　　０．７５μＬ
　　標的遺伝子Ａ　プローブ（１０μＭ）　　　　　　　　　　　０．７５μＬ
　　テンプレートＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　μＬ
　　滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｕｐ　ｔｏ　２５．０　μＬ

［ＰＣＲ反応液（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ）］
　　ＴＡＫＡＲＡ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　　　　　　　１２．５　μＬ
　　標的遺伝子Ａ　フォワードプライマー（１０μＭ）　　　　　０．７５μＬ
　　標的遺伝子Ａ　リバースプライマー（１０μＭ）　　　　　　０．７５μＬ
　　標的遺伝子Ａ　プローブ（１０μＭ）　　　０．２５μＬ又は０．７５μＬ
　　標的遺伝子Ｂ　フォワードプライマー（１０μＭ）　　　　　０．７５μＬ
　　標的遺伝子Ｂ　リバースプライマー（１０μＭ）　　　　　　０．７５μＬ
　　標的遺伝子Ｂ　プローブ（１０μＭ）　　　０．２５μＬ又は０．７５μＬ
　　テンプレートＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　μＬ
　　滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｕｐ　ｔｏ　２５．０　μＬ

［ＰＣＲ反応条件（アンプリコンサイズ：５００ｂｐ未満）］
　　第１変性ステップ　　　　　　　　９５℃　３０秒
　　３ステップＰＣＲ（４０サイクル）
　　　　変性ステップ　　　　　　　　９５℃　　８秒
　　　　アニーリングステップ　　　　６１℃　２５秒
　　　　伸長ステップ（蛍光を検出）　７２℃　２０秒

［ＰＣＲ反応条件（アンプリコンサイズ：５００ｂｐ以上）］
　　第１変性ステップ　　　　　　　　９５℃　３０秒
　　３ステップＰＣＲ（４０サイクル）
　　　　変性ステップ　　　　　　　　９５℃　１０秒
　　　　アニーリングステップ　　　　６１℃　３５秒
　　　　伸長ステップ（蛍光を検出）　７２℃　２５秒

（実施例３：実際の肺炎症例における病原菌の検出）
　実際の肺炎症例（ケース１及びケース２）におけるＰＣＲ解析の結果を図３に示す。図３は、標的遺伝子の検出におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフ、及び、喀痰グラム染色写真である。まず、喀痰グラム染色について説明する。ケース１の喀痰グラム染色写真は、ケース１の実際のものである。ヒト細胞（白血球）が多数認められるが、それ以上に紺色に染色されたレンサ球菌（肺炎球菌）が認められる。グラム染色での塗抹所見は肺炎球菌感染症の喀痰と考えられる。そのため、ケース１は肺炎球菌に起因する肺炎と考えられる。ケース２の喀痰グラム染色写真は、ケース２の実際のものである。ヒト細胞（白血球）が認められるが、それ以上に赤色に染色された小桿菌（インフルエンザ菌）が認められる。グラム染色での塗抹所見はインフルエンザ菌感染症の喀痰と考えられる。なお、ケース２の写真内にも紺色に染色されたレンサ球菌（肺炎球菌）がわずかに認められるが、インフルエンザ菌と比べると極めて小数であり、この病原体による感染症を疑う所見はみあたらない。そのため、ケース２では肺炎球菌は定着病原体と考えられる。

　これらの検体について病原体特異的遺伝子を検出した結果をそれぞれ図３中のグラフに示した。グラフにおいて、ＰＣＲサイクル数がより少ない時点で蛍光強度が増加する遺伝子は、喀痰中のＤＮＡ配列コピー数がより多いことを意味する。すなわち、一定の蛍光強度に達した時点のサイクル数（Ｃｙｃｌｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；Ｃｔ値）が、検体中の標的遺伝子（病原体）の相対コピー数を表す。また、コントロールであるヒト細胞のＣｔ値から、ある病原体のＣｔ値を差し引いた値（ΔＣｙｃｌｅ）は、ヒト細胞を内部コントロールとした病原体細胞の相対量を表す。

　ケース１（肺炎球菌に起因する肺炎）のグラフ中、点線は肺炎球菌特異的配列の増幅曲線を表し、Ｃｔ値は１７．８９サイクルであった。実線は、ヒト細胞特異的配列の増幅曲線を表し、Ｃｔ値は２２．６７サイクルであった。したがって、肺炎球菌のΔＣｙｃｌｅは、＋４．７８サイクルであることがわかった。

　ケース２では、肺炎球菌特異的配列の増幅曲線（点線）のＣｔ値は２９．３１サイクルであり、ヒト細胞特異的配列の増幅曲線（実線）のＣｔ値は２２．６７サイクルであった。したがって、肺炎球菌のΔＣｙｃｌｅは、－６．６４サイクルであった。一方、インフルエンザ菌特異的配列の増幅曲線のＣｔ値及びΔＣｙｃｌｅは、それぞれ１４．０７サイクル及び＋６．６０サイクルであった。このことから、ケース２においては、インフルエンザ菌特異的配列の相対コピー数が肺炎球菌よりも有意に高いと判断することができる。この結果は、喀痰塗抹グラム染色による所見と相関する。また、肺炎球菌について見ると、肺炎球菌のΔＣｙｃｌｅはケース２と比較してケース１で有意に高いことが分かる。この結果は、肺炎球菌に起因する／起因しないという診断結果と相関する。

　以上より、ヒト細胞数を内部コントロールとした病原体細胞の相対数（ΔＣｙｃｌｅ）を数値化できることがわかった。

（実施例４～９：実際の肺炎症例における鑑別基準値（カットオフ値）の設定）
　実際の肺炎症例の臨床検体を用いて、実施例１及び２に示した手順でＰＣＲ解析を行い、起炎病原体鑑別方法の有用性を評価した。なお、重複する臨床検体（１回目：２０７例又は３００例、２回目：２２３例）を用いて２回の解析を行った。１回目の解析では、臨床検体は外来又は入院の患者から得られた、受診から３日以内の喀痰のみを利用した。２回目の解析では、解析対象となる臨床検体の基準をより厳密に設定して解析を行った。具体的には、臨床検体は外来又は入院の患者から得られた、受診から２日以内の喀痰、気管内採痰、誘発喀痰を利用した。なお、マイコバクテリウム・アビウム特異的な遺伝子として、マイコバクテリウム・アビウム１６－２３　ＩＴＳ　ｒＲＮＡ遺伝子を検出した。

（実施例４：肺炎球菌の鑑別基準値の設定）
（４－１）
　２０７例のうち、ＰＣＲで肺炎球菌を検出した４４例を図４Ａに示す。この４４例をもとに鑑別基準値を設定した。図４Ａは、肺炎球菌性肺炎と臨床診断に至った症例１５例（菱形）と、肺炎球菌性肺炎と臨床診断できなかった肺炎症例、又は、別の起炎病原体の肺炎症例２９例（三角）とを、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、肺炎球菌における起炎／定着の鑑別基準値を「－４」と設定した。

（４－２）
　２２３例のうち、ＰＣＲで肺炎球菌を検出した１００例を図４Ｂに示す。このうち既存の方法で肺炎球菌が起炎病原体であった２７例をもとに鑑別基準値を設定した。図４Ｂは、肺炎球菌性肺炎と臨床診断に至った症例２７例（灰色三角）と、ＰＣＲで肺炎球菌は検出されるが肺炎球菌性肺炎と臨床診断できなかった肺炎症例、又は、別の起炎病原体の肺炎症例７３例（白色三角）とを、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、肺炎球菌における起炎／定着の鑑別基準値を「－４」と設定した。

（実施例５：インフルエンザ菌の鑑別基準値の設定）
（５－１）
　２０７例のうち、ＰＣＲでインフルエンザ菌を検出した２６例を図５Ａに示す。この２６例をもとに鑑別基準値を設定した。図５Ａは、急性呼吸器感染症でインフルエンザ菌を起炎病原体と臨床診断した９例（菱形）と、急性呼吸器感染症でインフルエンザ菌を定着病原体と考えた６例（三角）と、慢性呼吸器感染症でインフルエンザ菌を起炎病原体と臨床診断した１１例（四角）とを、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、インフルエンザ菌における起炎／定着の鑑別基準値を「－１」と設定した。

（５－２）
　２２３例のうち、ＰＣＲでインフルエンザ菌を検出した２９例を図５Ｂに示す。このうち既存の方法でインフルエンザ菌が起炎病原体であった１２例をもとに鑑別基準値を設定した。図５Ｂは、２２３例の肺炎のうちインフルエンザ菌を起炎病原体と臨床診断した１２例（灰色三角）と、ＰＣＲでインフルエンザ菌は検出されるがインフルエンザ菌肺炎と診断できなかった（インフルエンザ菌を定着病原体と考えた）１７例（白色三角）とを、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、インフルエンザ菌における起炎／定着の鑑別基準値を「１」と設定した。このように既存の診断結果と本発明により得られたΔＣｙｃｌｅとが比較可能な症例を増やして解析することにより、より信頼度の高い鑑別基準値を設定することができる。

（実施例６：緑膿菌の鑑別基準値の設定）
（６－１）
　２０７例のうち、ＰＣＲで緑膿菌を検出した３７例を図６Ａに示す。この３７例をもとに鑑別基準値を設定した。図６Ａは、急性呼吸器感染症で緑膿菌を起炎病原体と臨床診断した８例（菱形）と、急性呼吸器感染症で緑膿菌を定着病原体と考えた７例（三角）と、慢性呼吸器感染症で緑膿菌を起炎病原体と臨床診断した１５例（四角）と、慢性呼吸器感染症で緑膿菌を定着病原体と考えた７例（丸）を、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体／定着病原体の境界となるΔＣｙｃｌｅを求め、シュードモナス属菌における起炎／定着の鑑別基準値を「－２」と設定した。

（６－２）
　２２３例のうち、ＰＣＲで緑膿菌を検出した４８例を図６Ｂに示す。このうち既存の方法で緑膿菌が起炎病原体であった２７例をもとに鑑別基準値を設定した。図６Ｂは、２２３例の肺炎のうち緑膿菌を起炎病原体と臨床診断した２７例（灰色三角）と、ＰＣＲで緑膿菌は検出されるが緑膿菌肺炎と診断できなかった（緑膿菌を定着病原体と考えた）２１例（白色三角）とを、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、緑膿菌における起炎／定着の鑑別基準値を「－２」と設定した。

（実施例７：モラキセラ・カタラーリスの鑑別基準値の設定）
（７－１）
　３００例のうち、ＰＣＲでモラキセラ・カタラーリスを検出した１７例を図７Ａに示す。この１７例をもとに鑑別基準値を設定した。図７Ａは、急性呼吸器感染症でモラキセラ・カタラーリスを起炎病原体と臨床診断した９例（菱形）と、急性呼吸器感染症でモラキセラ・カタラーリスを定着病原体と考えた８例（三角）とを、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体／定着病原体の境界となるΔＣｙｃｌｅを求め、モラキセラ・カタラーリスにおける起炎／定着の鑑別基準値を「－４」と設定した。

（７－２）
　２２３例のうち、ＰＣＲでモラキセラ・カタラーリスを検出した２０例を図７Ｂに示す。このうち既存の方法でモラキセラ・カタラーリスが起炎病原体であった９例をもとに鑑別基準値を設定した。図７Ｂは、２２３例の肺炎のうちモラキセラ・カタラーリスを起炎病原体と臨床診断した９例（灰色三角）と、ＰＣＲでモラキセラ・カタラーリスは検出されるがモラキセラ・カタラーリス肺炎と診断できなかった（モラキセラ・カタラーリスを定着病原体と考えた）１１例（白色三角）とを、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、緑膿菌における起炎／定着の鑑別基準値を「０」と設定した。

（実施例８：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の鑑別基準値の設定）
（８－１）
　３００例のうち、ＰＣＲでメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡ）を検出した３４例を図８に示す。この３４例をもとに鑑別基準値を設定した。図８は、急性呼吸器感染症でＭＲＳＡを起炎病原体と臨床診断した８例（菱形）と、急性呼吸器感染症でＭＲＳＡを定着病原体と考えた２６例（三角）とを、個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいてプロットしたものである。この結果から、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、ＭＲＳＡにおける起炎／定着の鑑別基準値を「－４」と設定した。

（８－２）
　２２３例のうち、既存の方法でＭＲＳＡが起炎病原体であった症例をもとに実施例４～８と同様の方法で鑑別基準値を設定した。個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいて、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、ＭＲＳＡにおける起炎／定着の鑑別基準値を「－４」と設定した。

（実施例９：肺炎桿菌の鑑別基準値の設定）
　２回目の評価において、２２３例のうち既存の方法で肺炎桿菌が起炎病原体であった症例をもとに実施例４～８と同様の方法で鑑別基準値を設定した。個々の症例について得られたΔＣｙｃｌｅに基づいて、起炎病原体陽性となるΔＣｙｃｌｅの下限を求め、肺炎桿菌における起炎／定着の鑑別基準値を「－４」と設定した（図示せず）。

　あらゆる気道定着病原体についても実施例４～９と同様に鑑別基準値を設定することができる。また、症例数を追加することにより、設定した鑑別基準値の信頼度を高めることができると共に、さらに信頼度の高い鑑別基準値を設定することが可能である。

（実施例１０：実際の肺炎症例における実用化例）
　１回目の解析に用いた実際の肺炎症例（３００例、実施例４～８の肺炎症例と重複あり）の臨床検体について上述のＰＣＲ解析を行い、実施例４～８において設定した鑑別基準値に基づいて起炎病原体を同定した。その結果を図９に示す。病原体の検出率は、３００例中２３６例（７８．７％）であった。また、３００例中、１５８例において起炎病原体を同定した。コントロールであるヒト遺伝子を除く２０種類の病原体・薬剤耐性遺伝子の検出による、起炎病原体同定率は５２．７％であった。

　２回目の解析に用いた実際の肺炎症例（２２３例）の臨床検体について上述のＰＣＲ解析を行い、実施例４～９において設定した鑑別基準値に基づいて起炎病原体を同定した。その結果を図１０に示す。２２３例肺炎の起炎病原体の検出率は、２２３例中１１９例（５３．３６％）であった。したがって、１つの喀痰検体及び１シリーズの検査から得られる迅速検査結果としては、非常に高い同定率が得られることが確認できた。

　以上より、ヒト細胞を内部コントロールとしたＰＣＲ解析による、ΔＣｙｃｌｅを基に設定した鑑別基準値によって起炎病原体の鑑別が有効に機能することが示された。この検出方法は、特に、気道定着病原体の検出、つまり、起炎病原体及び定着病原体の鑑別に有効である。また、表３に示したヒト細胞、種々の病原体・薬剤耐性遺伝子（計２１種類、又は２２種類）を検出するＭｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲにより、１回の検査により気道定着病原体、気道に通常定着しない病原体等の包括的検索が可能となった。これにより、感染の主要因となる起炎病原体を同定することができ、個々の病原体に適した薬剤治療等の効率的な治療を行うことができる。

（実施例１１：前向き試験）
　実施例４～９において設定した鑑別基準値の妥当性を検討するために、臨床試験を実施した（ＵＭＩＮ試験ＩＤ：ＵＭＩＮ０００００１１１８）。肺炎症例を多施設で連続登録する前向き試験であり、既存の方法を用いての起炎病原体の同定方法と、上述の２回目の解析で設定した鑑別基準値を用いたＰＣＲ解析による起炎病原体の同定法とを比較検討した。主要アウトカムの評価項目は、肺炎球菌肺炎における鑑別基準値の妥当性の検討である。なお、マイコバクテリウム・アビウム特異的な遺伝子として、マイコバクテリウム・アビウム　１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を検出した。

　以下の症例選択基準を満たす症例を試験対象として採用した。
　　１８歳以上の対象であり、受診後又は肺炎発症後２日以内に喀痰が得られた症例。
　　喀痰はＭｉｌｌｅｒ－Ｊｏｎｅｓ分類Ｍ２，Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３であり、かつ、ヒト細胞特異的配列のＣｔ値が２７未満の症例。
　　喀痰検査（塗抹・培養）及び肺炎球菌尿中抗原検査を実施している症例。
　また、ここで扱う肺炎は急性呼吸器感染症（急性肺炎）であり、新たに出現した呼吸器症状（発熱、喀痰、咳嗽、胸膜痛、呼吸困難）に伴い、胸部画像診断検査で新たに出現した陰影を認めるものに限定した。

　気道定着病原体に関して、既存の臨床診断による起炎病原体の診断定義は、以下の通りである。
　ＰＣＲで検出された気道定着病原体のうち、起炎病原体として矛盾しない治療経過をたどり、かつ、以下の（１）～（４）のいずれかを満たすもの。
（１）無菌検体から当該病原体が検出される。（例：血液培養、胸水培養）
（２）Ｇｒａｍ染色で当該病原体と矛盾しない病原体が確認され、さらに喀痰培養で当該病原体が検出・同定される。
（３）Ｇｒａｍ染色で多数の白血球（＞２５ｃｅｌｌ／ｆｉｅｌｄ　ａｔ　ｘ１００）を認め、さらに当該病原体と形態的に矛盾しない病原体が貪食されている。
（４）肺炎球菌尿中抗原陽性である。（肺炎球菌のみ該当）

　多施設前向き試験の結果、肺炎症例は１７４例登録された。そのうち既存の方法で肺炎球菌を起炎病原体と同定した症例は４３例であった。一方、上述の鑑別基準値を用いたＰＣＲ解析により肺炎球菌を起炎病原体と同定した症例は４０例であった。肺炎球菌肺炎における起炎菌同定率（感度）は９３．０２％（４０／４３；９５％信頼区間：０．８３＜）（カットオフ値を用いた同定法／既存の方法での同定法）。また肺炎球菌がＰＣＲで検出されても起炎菌として否定できる能力（陰性的中立）は。９３．４８％であった。他の病原体においても、同等もしくはそれ以上の結果になる予備データが得られた。

　以上の結果より、特に肺炎球菌について、以下の（１）～（４）を確認することができた。
（１）本発明の鑑別方法は、既存の診断方法で診断できる症例を高感度に鑑別することができる（本発明の鑑別方法の陽性集合は既存検査の陽性集合を包含する）。
（２）本発明の鑑別方法の陽性集合は、既存の診断方法の陽性集合と同等の肺炎球菌／対象由来の細胞比（すなわち、ΔＣｙｃｌｅ値）を有する。
（３）したがって、本発明の鑑別方法の陽性集合を治療対象群（すなわち、肺炎球菌が起炎病原体であると想定すべき群）として考えて良いことが分かった。
（４）、前向き臨床試験の症例における治療経過もまた、本発明の鑑別結果に基づき肺炎球菌を治療対象とした場合に、鑑別結果が妥当であることを支持していた。

　臨床試験で登録した１７４例の肺炎症例の臨床検体について鑑別基準値を用いたＰＣＲ解析により起炎病原体を同定した。その結果を図１１に示す。１７４例の肺炎症例における起炎病原体の同定率は、１７４例中１２１例（７０％）であった（図１１）。既存の方法を用いた起炎病原体の同定率は、１７４例中９７例（５５％）であった。したがって、既存の方法より迅速に起炎病原体を同定でき、また検出率も高いことが証明された。

Claims

　急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法であって、
　鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体を含み、
　対象の気道分泌物を含む検体中の対象の細胞量に対する、前記検体中の病原体量の相対値を測定する工程と、
　前記相対値に基づいて、前記病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する工程と、
を備える、方法。
　急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための鑑別基準値を決定する方法であって、
　鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体であり、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体から調製したＤＮＡ中の、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）前記ＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｃ）前記対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数に対する前記病原体に由来する遺伝子のコピー数の相対数を算出する工程と、
ｄ）複数の対象について前記工程ａ）～ｃ）を行い、各々の対象について相対数を得る工程と、
ｅ）各々の対象の相対数と、各々の対象の臨床診断結果との比較により、
　　ｉ）臨床診断において起炎病原体陽性となる相対数の下限値；及び／又は
　　ｉｉ）臨床診断において起炎病原体陰性となる相対数の上限値；
を鑑別基準値と決定する工程と、
を備える、方法。
　急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別する方法であって、
　鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体であり、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体から調製したＤＮＡ中の、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）前記ＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｃ）前記対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数に対する前記病原体に由来する遺伝子のコピー数の相対数を算出する工程と、
ｄ）請求項２に記載の鑑別基準値及び前記相対値に基づいて、前記病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する工程と、
を備える、方法。
　前記気道定着病原体が、ストレプトコッカス属菌、ヘモフィルス属菌、モラキセラ属菌、シュードモナス属菌、クレブシエラ属菌、ステノトロフォモナス属菌、アシネトバクター属菌、及び、スタフィロコッカス属菌からなる群より選ばれる１以上の病原体である、請求項２又は３に記載の方法。
　さらなる鑑別対象となる病原体が、気道に通常存在しない病原体であり、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体から調製したＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する工程と、
ｂ）ｉ）前記病原体に由来する遺伝子が検出されない場合に、前記病原体が感染症に関与しない；及び、
　　ｉｉ）前記病原体に由来する遺伝子が検出される場合に、前記病原体が起炎病原体である；
と鑑別する工程と、
をさらに備える、請求項３又は４に記載の方法。
　前記気道に通常存在しない病原体が、マイコプラズマ属菌、レジオネラ属菌、クラミドフィラ属菌、マイコバクテリウム属菌、コクシエラ属菌、ノルカジア属菌、ニューモシスチス属菌、及び、アスペルギルス属菌からなる群より選ばれる１以上の病原体である、請求項５に記載の方法。
　前記病原体に由来する遺伝子が、肺炎球菌のｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ遺伝子、肺炎球菌のｌｙｔＡ遺伝子、インフルエンザ菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、モラキセラ・カタラーリスのｃｏｐＢ遺伝子、シュードモナス属菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、肺炎桿菌のｇａｐＡ遺伝子、ステノトロフォモナス・マルトフィリアの２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＢ遺伝子からなる群より選ばれる１以上の気道定着病原体に由来する遺伝子である、請求項２～６いずれか一項に記載の方法。
　前記病原体に由来する遺伝子が、マイコプラズマ・ニューモニエの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、レジオネラ・ニューモフィラのｍｉｐ遺伝子、レジオネラ属菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、肺炎クラミジアの５３ｋＤ－ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子、オウム病クラミジアのｏｍｐＡ遺伝子、結核菌のＭＰＢ６４遺伝子、マイコバクテリウム・イントラセルラーレのＩＴＳ　１６－２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、マイコバクテリウム・アビウムの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、マイコバクテリウム・アビウムのＩＴＳ　１６－２３Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、マイコバクテリウム・カンサシのｄｎａＪ遺伝子、ノルカジア属菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、及び、ニューモシスチス・イロヴェツィイの５Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子からなる群より選ばれる１以上の気道に通常存在しない病原体に由来する遺伝子である、請求項５～７いずれか一項に記載の方法。
　前記病原体に由来する遺伝子が、薬剤耐性遺伝子をさらに含む、請求項２～８いずれか一項に記載の方法。
　前記薬剤耐性遺伝子が、ｍｅｃＡ遺伝子、及び、メタロ－β－ラクタマーゼ遺伝子からなる群より選ばれる１以上の遺伝子である、請求項９に記載の方法。
　前記対象がヒトである、請求項１～１０いずれか一項に記載の方法。
　ストレプトコッカス属菌、ヘモフィルス属菌、モラキセラ属菌、シュードモナス属菌、クレブシエラ属菌、ステノトロフォモナス属菌、アシネトバクター属菌、及び、スタフィロコッカス属菌からなる群より選ばれる１以上の気道定着病原体に由来する遺伝子に対するプライマーセット、及び、使用説明書を含む、急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するためのキット。
　マイコプラズマ属菌、レジオネラ属菌、クラミドフィラ属菌、マイコバクテリウム属菌、コクシエラ属菌、ノルカジア属菌、ニューモシスチス属菌、及び、アスペルギルス属菌からなる群より選ばれる１以上の気道に通常存在しない病原体に由来する遺伝子に対するプライマーセット、及び、使用説明書をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
　ｍｅｃＡ遺伝子、及び、メタロ－β－ラクタマーゼ遺伝子からなる群より選ばれる１以上の薬剤耐性遺伝子に対するプライマーセット、及び、使用説明書をさらに含む、請求項１２又は１３いずれか一項に記載のキット。
　急性呼吸器感染症の起炎病原体を鑑別するための装置であって、
　鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体であり、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体からＤＮＡを調製するためのＤＮＡ調製手段と、
ｂ）前記ＤＮＡ中の、対象の細胞に由来するＤＮＡ、及び、病原体に由来するＤＮＡを特異的に増幅するためのＤＮＡ増幅手段と、
ｃ）前記ＤＮＡ増幅手段によって増幅された対象の細胞に由来するＤＮＡ、及び、病原体に由来するＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出手段と、
ｄ）前記ＤＮＡ検出手段によって検出されたシグナルに基づき、前記対象の細胞に由来するＤＮＡのコピー数に対する前記病原体に由来するＤＮＡのコピー数の相対数を算出するための算出手段と、
ｅ）請求項２に記載の鑑別基準値及び前記相対数に基づいて、前記病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別するための鑑別手段と、
を備える、装置。
　さらなる鑑別対象となる病原体が、気道に通常存在しない病原体であり、
ａ）対象の気道分泌物を含む検体からＤＮＡを調製するためのＤＮＡ調製手段と、
ｂ）前記ＤＮＡ中の、病原体に由来するＤＮＡを特異的に増幅するためのＤＮＡ増幅手段と、
ｃ）前記ＤＮＡ増幅手段によって増幅された病原体に由来するＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出手段と、
ｄ）ｉ）前記病原体に由来するＤＮＡが検出されない場合に、前記病原体が感染症に関与しない；及び、
　　ｉｉ）前記病原体に由来するＤＮＡが検出される場合に、前記病原体が起炎病原体である；
と鑑別するための鑑別手段と、
をさらに備える、請求項１５に記載の装置。
　病原体に由来するＤＮＡが、薬剤耐性遺伝子をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の装置。