WO2009102081A1 - 環状1本鎖核酸複合体およびその製造方法 - Google Patents

環状1本鎖核酸複合体およびその製造方法 Download PDF

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Yoshihiro Ito
Naoko Abe
Mitsuru Harada
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Definitions

  • Circular single-stranded nucleic acid complex and method for producing the same
  • the present invention relates to a circular single-stranded nucleic acid complex, a method for producing the same, and a pharmaceutical composition using the circular single-stranded nucleic acid complex.
  • RNA interference methods are broadly divided into methods using chemically synthesized double-stranded RNA and methods using a plasmid vector. Drug development using this RNA interference method is currently underway. However, when the latter plasmid vector is used, safety to the human body becomes a problem, so the former chemically synthesized double-stranded chain is used. Development of pharmaceuticals using RNA is expected.
  • RNA when double-stranded RNA is administered to a living body, it is easily degraded by intracellular nucleases, resulting in a problem that it is unstable in the living body.
  • RNA strands with unnatural nucleosides were developed.
  • the problem was that the stability increased but the biological activity decreased.
  • the toxicity of unnatural nucleosides to the living body is unknown, making it difficult to apply to pharmaceuticals.
  • dumbbell-shaped RNA A circular single-stranded RNA (dumbbell-shaped RNA) was developed from another approach to improve the in vivo stability of double-stranded RNA.
  • Dumbbell-shaped RNA has double-stranded RNA closed at both ends in a loop, so the RNA ends are lost, and it is difficult to become a substrate for degrading enzyme exonuclease other than specific enzymes such as Dicer in the cell. It has the feature that it is difficult to be disassembled.
  • dumbbell-shaped RNA include dumbbell-shaped RNA described in Non-Patent Document 1. It is described in Non-Patent Document 1 that the dumbbell-type RNA is more stable in a buffer to which human serum is added than double-stranded RNA.
  • Patent Document 1 describes dumbbell-type RN as an anti-influenza virus agent.
  • A—DN A chimeric nucleic acids are described.
  • the dumbbell nucleic acid is used in an antisense method that directly attacks influenza virus genes.
  • the stem part of the dumbbell-shaped nucleic acid is a pair of DNA and complementary RNA, and the loop part consists of an oligonucleotide or an ethylenedaricol compound residue.
  • the dumbbell-shaped nucleic acid enters the cell, it is considered that it is degraded or cleaved by ribonuclease H, and the antisense DNA portion is released.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 1 1 1 1 3 7260
  • Non-Patent Document 1 Abe, N., Abe, H., & Ito, Y. Dumbbell- Shaped Nanocircular RNAs for RNA Interference. Journal of the American Chemical Society 129, 15108-15109 (2007) Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a circular single-stranded nucleic acid complex used for RNA interference, a method for producing the same, and a pharmaceutical composition using the circular single-stranded nucleic acid complex.
  • the present inventors made polyalkylene glycol, DNA, DNA and RNA chimera, derivatives thereof, or combinations thereof by making the two loop portions linking the stem portions of the circular single-stranded nucleic acid complex. The inventors have found that the in vivo stability is improved, the RNA interference action is exhibited in the cells, and that a circular single-stranded nucleic acid complex can be easily and efficiently produced, thereby completing the present invention.
  • Sense strand RNA sequence, an antisense strand RNA sequence complementary to the sense strand RNA sequence, and a circle containing two identical or different loop portions that bind both strands between the sense strand and the antisense strand A single-stranded nucleic acid complex in which the sense strand and the antisense strand pair to form a stem, and the loop portion is a polyalkylene glycol, DNA, DNA and RNA chimera, derivatives thereof, and combinations thereof
  • a circular single-stranded nucleic acid complex characterized by being selected from the group consisting of:
  • RNA sequence forming the stem is 80-100% identical to the target RNA sequence
  • a linear single-stranded nucleic acid complex containing a part of the sense strand, a loop part and a part of the antisense strand, and a linear one containing the remainder of the sense strand, the loop part and the remainder of the antisense strand Producing a strand nucleic acid complex;
  • the circular single-stranded nucleic acid complex according to any one of [1] to [5] is introduced into a non-human animal, a plant, or a cell thereof to disable the target RNA and translate it into a protein
  • a pharmaceutical composition comprising the circular single-stranded nucleic acid complex according to any one of [5] as an active ingredient.
  • circular single-stranded nucleic acid complex is also referred to as “dumbbell nucleic acid complex”.
  • a “dumbbell nucleic acid complex” is a complementary pair of sense and antisense strands. Thus, a stem is formed, and a loop connecting the sense strand and the antisense strand is formed at both ends of the stem, and the overall shape of the circular single-stranded nucleic acid complex is a dumbbell shape.
  • Nucleic acid complex refers to a complex of DNA and RNA, a complex of polyalkylene dallicol and RNA, or a complex of DNA, polyalkylene glycol and RNA.
  • DNA and RNA chimera refers to a hybrid consisting of an arbitrary combination of 01 ⁇ 8 sequence and 1] ⁇ sequence, and the combination may be in any form. Blocks that are continuous with RNA may be linked, multiple blocks on both sides may be randomly mixed and linked, or DNA and RNA may be linked alternately one by one .
  • target RNA refers to mRNA of a gene whose expression is to be suppressed by RNA interference or its precursor RNA.
  • FIG. 1 schematically shows a dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention.
  • FIG. 2 shows an outline of a method for producing the dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention.
  • FIG. 3 shows an outline of a method for producing the dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention.
  • FIG. 4 shows an electrophoresis image of the dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention.
  • FIG. 5 shows the structures of the dumbbell-shaped nucleic acid complex and double-stranded RNA of the present invention.
  • FIG. 6 shows electrophoresis images of the dumbbell-type nucleic acid complex of the present invention, dumbbell-type RNA and double-stranded RNA in a biological stability test using serum.
  • Figure 7 shows the changes over time in the quantitative results of the electrophoretic image bands of the dumbbell-type nucleic acid complex of the present invention, dumbbell-type RNA and double-stranded RNA in the biological stability test using serum (residual Rate).
  • FIG. 8 shows electrophoresis images of the dumbbell-type nucleic acid complex of the present invention, dumbbell-type RNA and double-stranded RNA in a biological stability test using a cell extract.
  • Fig. 9 shows the dumbbell type of the present invention in a biological stability test using a cell extract. Shows the time-dependent change (residual rate) of the quantification results by the bands of electrophoresis images of nucleic acid complex, dumbbell RNA and double-stranded RNA.
  • FIG. 10 shows the RNA interference effect of the dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention in mammalian cell culture.
  • RNA interference is the action of small RNA molecules having a sequence complementary to the target RNA in the cell or in vivo, binding to the target RNA and degrading it or suppressing translation. .
  • the dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention comprises a sense strand RNA sequence, an antisense strand RNA sequence substantially complementary to the sense strand RNA sequence, and both strands between the sense strand and the antisense strand. It is a cyclic single-stranded nucleate complex that contains two loop parts that are the same or different from each other.
  • the antisense strand RNA sequence is a sequence that is substantially complementary to the sense strand RNA sequence and specifically binds to the target RNA in RNA interference.
  • the sense strand and the antisense strand pair to form a stem.
  • the sense strand RNA sequence and the antisense strand RNA sequence include a target RNA sequence and a sequence complementary thereto, or an RNA sequence having 80 to 100% identity with the target RNA sequence and a sequence thereof. It has a complementary sequence.
  • identity represents the ratio (%) of the number of identical bases to the total number of bases when two base sequences are aligned without introducing gaps or introducing gaps.
  • the length of the stem is not particularly limited as long as RNA interference is imparted.
  • the sense strand and / or antisense strand RNA may be a derivative containing a modified nucleoside.
  • Modified nucleosides are modified bases and sugar moieties, such as alkylates, alkoxylates, inosine, ribose 2, 1-O-alkyl or 2'-halogenates, 2 ', 4, 1-BNA. Etc. Nucleotides
  • the phosphate group may be modified, and phosphoric acid modified nucleotides, methylphosphonates, etc. may be mentioned as modifications of the phosphate group.
  • the base sequence of the sense strand and / or the antisense strand may be not only RNA but also a chimera of RNA and DNA as long as it has an RNA interference effect.
  • the sense strand may contain 1 to 6 base mismatches, preferably 1 to 3 base mismatches, more preferably 1 to 2 base mismatches. If base mismatches are included, double-stranded RNA is likely to be easily dissociated into single-stranded RNA by helicase (Schwarz, DS, et al. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell 115, 199- 208 (2003)).
  • the loops are located at both ends of the stem, linking the sense strand 5, the terminal RNA and the antisense strand 3, and the RNA at the 3 'end of the sense strand and the RNA at the antisense strand Concatenate the 5 'ends.
  • the loop portion is composed of polyalkylene glycol, DNA, DNA-RNA chimera, derivatives thereof, or combinations thereof. This makes it more intracellular, for example, compared to double-stranded RNA (siRNA), circular single-stranded RNA whose loop part consists of RNA alone, or double-stranded RNA with a hairpin structure (shRNA). Alternatively, in vivo stability is improved, and a more sustained and sustained effect can be exhibited in RNA interference.
  • the length of the loop is not particularly limited as long as it can connect both ends of the stem. Even if the loop is long, RNA cleavage by Dicer is not inhibited.
  • the polyalkylene dallicol in the loop portion is not particularly limited, but preferably has high biological safety. These include derivatives wherein the alkylene moiety may be substituted with non-limiting substituents such as halogen, alkyl, hydroxy, alkoxy, acyl, alkylthio and the like.
  • the monomer unit preferably has 1 to 4 carbon atoms, but may have 5 or more carbon atoms, for example, 5 to 8 carbon atoms.
  • Polyalkylene glycols include, for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol mononole, polybutylene glycol ⁇ polyoxyethyleneoxypropylene glycol, polyoxyethyleneoxybutylene glycol, polyoxyethylenepolyoxypropylene dallicol, polyoxyethylene Polyoxybutyral recall and the like.
  • polyethylene dalycol is particularly preferred.
  • One or both hydroxyl groups of the polyalkylene dallicol may be phosphorylated.
  • the DNA of the loop part or the chimera of DNA and RNA may be one or more bases in length, preferably 2 to 20 bases, more preferably 6 to 12 bases, and even more preferably 7 to 1 is 1.
  • the nucleic acid sequence of the loop portion is not particularly limited as long as it includes a sequence that does not substantially form a complementary strand. Examples of DNA sequences that do not form complementary strands include GATTAGTCACT (SEQ ID NO: 14), AGAGAAC TT (SEQ ID NO: 15), TTCAAGAGA (SEQ ID NO: 16), TGTGCTGT C (SEQ ID NO: 17), and the like.
  • a part of the DNA sequence may be replaced with RNA corresponding to each DNA.
  • the DNA or RNA may be a derivative containing a modified nucleoside.
  • a modified nucleoside is a modification of the base and sugar moiety and is an alkylated, alkoxylated, inosine, or ribose 2, 1-O-anololyl or 2'-halogenated, 2 ', 4'-BNA-modified Examples include the body.
  • the phosphate group of the nucleotide may be modified, and examples of the modified phosphate group include phosphoroate-modified nucleotides and methylphosphonate.
  • a polyalkylene dallicol may be contained at any position in the nucleic acid sequence of the loop portion.
  • a peptide may be contained in the loop part.
  • the circular single-stranded nucleic acid complex of the present invention (a DNA nucleic acid complex) comprises the following steps:
  • a linear single-stranded nucleic acid complex containing a part of the sense strand, a loop part and a part of the antisense strand, and a linear single-stranded substance containing the remainder of the sense strand, the loop part and the remainder of the antisense strand Producing a nucleic acid complex;
  • the sense strand and antisense strand of the dumbbell-shaped nucleic acid complex are designed from the base sequence of the target gene so that the expression of the target gene can be suppressed.
  • the target gene is generally a gene derived from a eukaryote, and preferably a gene derived from an animal or a plant.
  • multiple sense strands and antisense strands may be prepared to check the suppression efficiency.
  • siRNA design algorithms may be used (Reference: JAJaeger et al. al., Methods in Enzymology (1989) 183: 281-306; DHMathews et al., J. Mol. Biol. (1999) 288: 911-940).
  • the dumbbell-shaped nucleic acid complex when the dumbbell-shaped nucleic acid complex is cleaved by a dicer in a cell or in vivo, the 3 ′ end of the resulting double-stranded RNA containing the sense strand and the antisense strand has 1 to 3 U (
  • the sequence may be designed to be the overhanging end of (uracil).
  • the length of the sense strand and the antisense strand is not particularly limited. For example, it is designed with a length of 19 to 31 bases, preferably 20 to 25 bases, more preferably 20 to 24 bases, and further preferably 20 to 23 bases. To do.
  • Specific target genes are not particularly limited. For example, over-expressed disease-related genes, viral genes, etc. Specifically, leukemia abl / bcr gene, age-related macular degeneration V EG F gene, hepatitis HCV genes, etc.
  • the loop part is polyalkylene glycol, DNA, DNA and RNA chimera, derivatives thereof, or combinations thereof, and the base sequence of the loop part is a sequence that does not substantially form a complementary strand as shown above. including.
  • the production can be performed using a commercially available nucleic acid synthesizer and reagents. Phosphorylates the 5 'end of the synthesized linear single-stranded nucleic acid complex.
  • each of the sense strand and the antisense strand is synthesized, and the sense strand and the antisense strand are mixed to form a double-stranded RNA, and a loop portion is connected to both ends of the double-stranded RNA, and dumbbell nucleic acid A composite may be produced.
  • the loop part contains polyalkylene glycol
  • the 5 'end of the nucleic acid is phosphorylated
  • the polyalkylene glycol is linked to the nucleic acid with a phosphorylated ester
  • both ends of the polyalkylene glycol are phosphorylated. It can be ligated with the 3 'and 5' ends of nucleic acids.
  • the loop is a DNA or DNA-RNA chimera
  • a method for producing a dumbbell-shaped nucleic acid complex (D b—23 P EG; a dumbbell-shaped nucleic acid complex composed of a stem consisting of 23 base pairs and a loop portion containing polyethylene dalycol) will be described. This will be specifically described.
  • the upper RNA strand in the stem is the sense strand
  • the lower RNA strand is the antisense strand.
  • Sense strand RNA strand is synthesized from an arbitrary break site of RNA sequence to 5, end, for example, with a nucleic acid synthesizer based on phosphoroamidite method, and 5, end is phosphorylated.
  • synthesis is performed from the end of the sense strand (3, AAC ⁇ ) marked with 3, to the 5 'end ( ⁇ ' UGA) of the sense strand.
  • Polyethylene glycol is not particularly limited.
  • polyethylene glycol having a molecular weight of about 60 to 60000, more preferably about 120 to 3000, more preferably about 180 to 1,200, and particularly preferably about 180 to 600 is used. It is preferable to use it. Also, It is preferable to use a reagent for a spacer used in a nucleic acid synthesizer.
  • a loop containing A (adenine), a polyethylene glycol linker, and U (uracil) is attached to the 5th and 5th ends of the sense strand.
  • an RNA strand is synthesized from the 3rd end of the antisense strand to any break site.
  • the antisense strand is synthesized from the 3 'end (UCA) to the end of the antisense strand marked with 5, and phosphorylated at the 5' end with a phosphorylating reagent.
  • the number of bases of the sense strand and antisense strand produced in this step is preferably not the same so that at least one base pairing occurs.
  • the difference in the number of bases is more preferably 1 to 25 bases, and further preferably 5 to 15 bases.
  • a loop portion containing polyethylene glycol is synthesized.
  • the loop part containing A (adenine), polyethylene dallicol linker, and U (uracil) is attached to the 5th and the end of the antisense strand.
  • the antisense strand RNA is synthesized from the 3 'end (UCC) of the antisense strand to the end of the antisense strand to which 5' is attached, and the 5 'end is phosphorylated with a phosphorylating reagent.
  • UCC 3 'end
  • a linear single-stranded nucleic acid complex can be produced.
  • RNA ligase eg, T 4 RNA ligase
  • ligase reaction conditions for example, incubation in a buffer solution containing polyethylene glycol (PEG), BSA or the like is preferably performed at low temperature to room temperature for about 20 hours. Addition of polyethylene glycol improves the yield of dumbbell-type nucleic acid complex, and addition of BSA can prevent ligase inactivation.
  • the extraction of the dumbbell-type nucleic acid complex is not particularly limited, but it is preferable to extract the dumbbell-type nucleic acid complex using a black mouth form to remove the excess polyethylene dalycol contained in the reaction solution.
  • a dumbbell-shaped nucleic acid complex having a DNA or DNA-RNA chimera loop portion can also be prepared, recovered and purified in the same manner as in the above (1) to (3).
  • An example of the preparation of such a dumbbell-shaped nucleic acid complex (Db-23D7; a dumbbell-shaped nucleic acid complex consisting of a stem consisting of 23 base pairs and a loop portion containing DNA) is shown in FIG.
  • FIG. 4 shows an example of analysis of a dumbbell-shaped nucleic acid complex produced by the above method using a denatured polyacrylamide gel.
  • the short arrow in Fig. 4 shows the band of the product ligated at only one site with T4 RNA ligase, and the long arrow shows the band of the target product (dumbbell nucleic acid complex) ligated at both sites.
  • the dashed arrow indicates the band of the linear single-stranded nucleic acid complex synthesized in the above (1) and (2) used as a raw material for the dumbbell nucleic acid complex.
  • dumbbell nucleic acid complex of the present invention is introduced into a eukaryotic cell or eukaryote,
  • dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention has high in vivo stability (for example, stability in blood) and exhibits an effect in a sustained and sustained release manner. Can do. It is also considered highly safe for living bodies.
  • the dumbbell nucleic acid complex can be introduced into cells by, for example, the electroporation method, the microinjection method, the lipofussion method, the calcium phosphate method, and the like.
  • dumbbell nucleic acid complex When RNA interference is performed in vivo, the dumbbell nucleic acid complex can be introduced into animals or plants by, for example, local administration, intravenous administration, or a method using a gene gun.
  • the dumbbell-shaped nucleic acid complex introduced into the cell is cleaved by the intracellular dicer, and double-stranded RNA (siRNA) having an RNA interference action is generated in the cell (Fig. 1).
  • si RNA becomes a single strand, forms an RNA induced silencing complex (RI SC), recognizes the target mRNA complementary to the single-stranded RNA, degrades the mRNA, As a result, the expression of the target gene is suppressed.
  • RI SC RNA induced silencing complex
  • a pharmaceutical composition comprising a circular single-stranded nucleic acid complex
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a circular single-stranded nucleic acid complex (dumbbell nucleic acid complex) as an active ingredient.
  • the compounding amount of the dumbbell nucleic acid complex pharmaceutical composition is, for example, 0.1% by weight, 0.5% by weight, 1% by weight, 3% by weight, 5% by weight, or 10% with respect to the total amount of the composition. % By weight, 20% by weight, 30% by weight, 40% by weight, 50% by weight, 60% by weight, 70% by weight, 80% by weight, 90% by weight, 100% by weight, but not limited thereto.
  • liquid preparations for example, liquid preparations (solutions, suspensions, emulsions, etc.), solid preparations (lyophilized preparations at the time of use), ribosomes (cationic liposomes are preferred)
  • examples include encapsulated preparations.
  • Administration can be systemic or local. With regard to systemic administration, recent synthetic siRNA administration to mice and hamsters resulted in effective silencing of the target gene, and the amount and activity of endogenous microRNA (miRNA) were observed. it has been confirmed there was no O uohn, M. et al Effective RNAi- mediated gene silencing without interruption of the endogenous microRNA pathway Nature 449, 745 -.. the 747 (2007)) (the route of administration, parenteral administration is preferred E.g. intradermal or subcutaneous administration, rectal Administration, transmucosal administration, intravenous administration and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a pharmaceutically acceptable excipient or diluent (eg, physiological saline, sterile water, Ringer's solution), an additive, such as a pharmaceutically acceptable, depending on the formulation, dosage form, etc. It may contain extra buffering agents, isotonic agents, stabilizers, etc.
  • a pharmaceutically acceptable excipient or diluent eg, physiological saline, sterile water, Ringer's solution
  • an additive such as a pharmaceutically acceptable, depending on the formulation, dosage form, etc. It may contain extra buffering agents, isotonic agents, stabilizers, etc.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be changed according to the sex, weight, age, severity, and symptom of the patient.
  • the application of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include treatment of cancer, genetic diseases, infectious diseases caused by viruses and the like.
  • the functions of genes and proteins that are specifically expressed in cancer cells can be suppressed using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention having a 23 base pair stem (SEQ ID NO: 7 to 13), and double-stranded RNA (si RN A, SEQ ID NO: 5 and) as a control of the dumbbell-shaped nucleic acid complex of the present invention 6) was designed (Fig. 5).
  • the control siRNA is described as siRNA-1.
  • D b means dumbbell type
  • 23 means that the dumbbell type nucleic acid complex has a 23 base pair stem
  • PEG means loop. Means that the part contains polyethylene dallicol.
  • P EG uu contains polyethylene dallicol in the loop, and also contains RNA that forms the protruding ends of UU (two consecutive uracils) in the double-stranded RNA that is generated when cleaved with Dicer Means “D 3”, “D 5” and
  • D7 means that the loop contains three, five, and seven DNAs, respectively.
  • the upper sequence indicates the sense strand sequence
  • the lower sequence indicates the antisense strand.
  • the sequence shown in bold indicates the complementary sequence to the target RNA.
  • the boxed area is the control s i R
  • RNA portion common to NA-1 and all dumbbell-shaped nucleic acid complexes is shown.
  • Da A (adenine), C. (cytosine), G. (guanen) and: L (thymine) in the loop part of the nbel type nucleic acid complex indicate 2'-deoxynucleotides.
  • the thick line shown in the loop portion of the dumbbell-shaped nucleic acid complex indicates a linker of polyethylene dalycol (PEG).
  • n of the formula of polyethylene glycol: 1 [(CH 2 ) 2 —O] n _ is 4.
  • D b-23 consisting only of RNA was designed with the same sequence except that DN A in the loop part of D b—23 D 3 was replaced with the corresponding RNA. did.
  • dumbbell-type nucleic acid complex double-stranded RNA
  • dumbbell-type RNA were designed by targeting the sequence of the firefly luciferase expression vector pGL3-Contro1.
  • the linear single-stranded nucleic acid complex used as the raw material for the dumbbell-shaped nucleic acid complex was synthesized by a nucleic acid synthesizer (GeneWorldH8_SE) based on the phosphoramidite method.
  • D b-23 P EG and D b _ 23D 7 shown in Figure 5 are the same as shown in Figure 2 (SEQ ID NO: 1 and 2) and Figure 3 (SEQ ID NO: 3 and 4), respectively. 3.
  • RNA at the end to the loop and the RNA at the 5 'end of the antisense strand was synthesized with a nucleic acid synthesizer, and the 5' end was phosphorylated.
  • a linear single-stranded nucleic acid complex is synthesized with a nucleic acid synthesizer from the RNA at the 3 ′ end of the antisense strand to the loop and the RNA at the 5 ′ end of the sense strand, and the 5 ′ end is phosphorylated. Oxidized.
  • a linear single-stranded nucleic acid complex as a raw material for another dumbbell-shaped complex shown in FIG. 5 was synthesized in the same manner.
  • RNA uses either 2'_O—TBDMS protector (Proligo) or 2'—O—TOM protector (Glen Research), and 5'-terminal phosphate contains chemical phosphorylation. Use 7 Reagent (Glen Research). In addition, Spacer Phosphoramidite 18 (Glen Research) was used for the PEG of the norap portion. The RNA was deprotected according to a conventional method, and the full-length product was purified using a denatured polyacrylamide gel.
  • linear single-stranded RNA that is the raw material of the control siRNA_1
  • linear single-stranded RNA used as the starting material for comparison Db-23 linear single-stranded RNA in which part of the loop part is linked to 4 or 5 bases at both ends of the sense strand, and A linear single-stranded RNA in which the remainder of the loop portion was linked to 5 or 4 bases at both ends of the antisense strand was synthesized and purified using the nucleic acid synthesizer.
  • the reaction solution using T 4 RNA ligase was finally made to have the following composition.
  • the two 5 'phosphorylated linear single-stranded nucleic acid complexes synthesized and purified in (a) above are lO OmM Tris— HC 1 (pH H 7.5)
  • dumbbell nucleic acid complex The amount of the two linear single-stranded nucleic acid complexes used as the raw material for the dumbbell-shaped nucleic acid complex is 1
  • both D b-23 P EG and D b-23 D 7 were about 50%.
  • the band containing the target substance is visualized and cut out by UV shadowing, finely ground, and then eluted with an elution buffer (0.2 M NaCl, 10 mM EDTA (pH 8.
  • Control siRNA-1 was prepared by mixing and annealing the sense strand and antisense strand prepared in (a) above, and siRNA-1 was collected by ethanol precipitation and purified by PAGE .
  • the comparative Db-23 is prepared by mixing and annealing the linear single-stranded RNA containing the sense strand prepared in (a) above and the linear single-stranded RNA containing the antisense strand. Ligated with T4 RN A ligase.
  • the reaction conditions for T4 RNA ligase are from the above reaction scale of 2.5 mL to 25 ju L, and the concentration of T4 RNA ligase from 0.2 to 0.4 unity ⁇ 1 force, etc., and 2.0 unit ⁇ L.
  • the procedure was the same as above except that the mixture was heated at 90 ° C for 3 minutes to 65 at 5 ° C and incubated at room temperature for about 20 hours at 11 ° C for 20 hours.
  • Db-23 was recovered by ethanol precipitation and purified by PAGE.
  • the control siRNA_l and the comparative Db-23 are about 30% and about 40% after 2 hours, respectively, whereas the dumbbells of the present invention Both type nucleic acid complexes were stable (Figs. 6 and 7).
  • D b-23 PEG and D b-23D 7 remained at 70% or more after 8 hours, and were found to exhibit high blood stability.
  • HL 60 cells (RIKEN CELL BANK) were cultured and cell extracts were prepared. Mix so that the final concentration is 1 OmgZmL protein, each dumbbell-shaped nucleic acid complex or control siRNA-1 and the comparative Db-23 is 2.5 ⁇ , and incubate at 37 ° C, 0.5, A portion of the reaction mixture was sampled after 1, 2, and 4 hours. This was analyzed by 15% native PAGE, the gel was stained with SYBR Green I, and the band was visualized and quantified.
  • RNA interference effect of the dumbbell nucleic acid complex in cultured mammalian cells was measured.
  • N I H 3 T 3 cells (RIKEN CELL BANK) in 10% susceptible fetal serum (F C S,
  • each dumbbell-shaped nucleic acid complex and control siRNA—1 Cotransformation was performed using the reagent GeneSilencer (Genlantis) according to the protocol attached to the transformation reagent. Concentration conditions at the time of transfection were 0.2 np GL 3 -C ontrol /0.02 / zgp RL—TKZ 25 nM each dumbbell-type nucleic acid complex or control si RNA-1 (final amount 100 ⁇ L )
  • the above-mentioned cells were added with 55.6 / zL of DMEM medium without serum, and a mixed solution for transfection having the following composition was added.
  • the luciferase expression level was quantified using the Dual-luciferase Reporter Assay System (promega) according to the attached protocol (conditions: reagent volume 30 ⁇ L, delay time 2 seconds, read time as 1 0 seconds. equipment Wallac ARV0 SX 1420 Multilabel Counter) 0 comparison, the condition of the buffer only (control) was also evaluated in the same way.
  • the emission intensity of firefly luciferase was corrected by the emission intensity of Renilla luciferase, an internal standard.
  • siRNA-1 and Db_23D3 have almost the same activity. Furthermore, sufficient inhibitory activity was observed, such as Db-23D7 and Db-23PEG, although not as much as siRNA.
  • dumbbell-type nucleic acid complex has sufficient stability in serum and cell extract, and also exhibits sufficient RNA interference effect in mammalian cells.
  • Double-stranded RNA can have RNA interference effects.
  • the circular single-stranded nucleic acid complex of the present invention has in vivo stability (for example, blood stability) superior to conventional double-stranded RNA, and has a sustained and sustained release effect in RNA interference. It has an exceptional effect that it can be used. Accordingly, it is possible to provide a pharmaceutical product containing a circular single-stranded nucleic acid complex that has sustained and sustained release properties and can impart an RNA interference effect. This medicine can be administered systemically or directly to the affected area, and the dose can be reduced.
  • a circular single-stranded nucleic acid complex having high in-vivo stability can be easily and efficiently produced by the production method of the present invention.
  • dumbbell nucleic acid complex of the present invention is expected to have a wide range of applications in the fields of medicine and agriculture.
  • the dumbbell nucleic acid complex of the present invention for various purposes such as drug development, agricultural chemical development, elucidation of functions of specific genes and proteins in plants or animals or their cells, e.g., elucidation of functions by knockout method, etc. Can be used.

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Abstract

 本発明は、センス鎖RNA配列と、センス鎖RNA配列に相補的なアンチセンス鎖RNA配列と、センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる2つのループ部分を含む環状1本鎖核酸複合体であって、センス鎖とアンチセンス鎖が対合してステムを形成し、ループ部分がポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される、環状1本鎖核酸複合体に関する。

Description

環状 1本鎖核酸複合体およびその製造方法
技術分野
本発明は、 環状 1本鎖核酸複合体、 その製造方法、 および環状 1本鎖核酸複合 体を用いた医薬組成物に関する。 明
背景技術
RNA干渉法は、 化学合成された 2本鎖 RN Aを用いる方法と、 プラスミ ドべ クタ一を用いる方法に大別される。 この R N A干渉法を用レ、た医薬品開発が現在 進められているが、 後者のプラスミ ドベクターを用いた場合、 人体への安全性が 問題となることから、 前者の化学合成された 2本鎖 RNAを用いる医薬品の開発 が期待されている。
しかしながら、 2本鎖 RNAは、 生体に投与すると細胞内のヌクレアーゼで容 易に分解されてしまい、 生体内で不安定であるという問題があった。
2本鎖 RNAの生体内での安定性を高めるため、 非天然ヌクレオシドを導入し た RNA鎖が開発された。 しかし、 安定性は高くなるが生物活性は下がってしま うことが問題となっていた。 さらに、 非天然ヌクレオシドが生体に与える毒性も 未知であり、 医薬品への応用は難しかった。
2本鎖 RN Aの生体内での安定性を向上させる別のアプローチから、 環状 1本 鎖 RNA (ダンベル型 RNA) が開発された。 ダンベル型 RNAは 2本鎖 RNA の両端がループ状に閉じているために、 RNA末端がなくなり、 細胞内において ダイサーなどの特異的酵素以外は、 分解酵素ェキソヌクレアーゼなどの基質とな りにくく、 分解されにくいという特徴を持つ。 そのようなダンベル型 RNAとし て、 例えば非特許文献 1に記載されているダンベル型 RNAが挙げられる。 該ダ ンベル型 R N Aは 2本鎖 R N Aと比較してヒ ト血清を加えたバッファー中で安定 であることが非特許文献 1に記載されている。
また、 特許文献 1には、 抗インフルエンザウイルス剤としてのダンベル型 RN A— DN Aキメラ核酸が記載されている。 該ダンベル型核酸は、 インフルエンザ ウィルス遺伝子を直接攻撃するアンチセンス法に用いられるものである。 該ダン ベル型核酸のステム部分は DNAとそれに相補的な RNAが対合してなり、 ルー プ部分はオリゴヌクレオチドまたはエチレンダリコール化合物残基からなる。 該 ダンベル型核酸が細胞内に入ると、 リボヌクレアーゼ Hにより分解または切断さ れて、 アンチセンス DNA部分が遊離すると考えられる。
特許文献 1 特開平 1 1一 1 3 7260号
非特許文献 1 Abe, N. , Abe, H. , & Ito, Y. Dumbbell- Shaped Nanocircular RNAs for RNA Interference. Journal of the American Chemical Society 129, 15108-15109 (2007) 発明の開示
本発明は、 RNA干渉法に用いられる環状 1本鎖核酸複合体、 その製造方法、 および該環状 1本鎖核酸複合体を用いた医薬組成物を提供することを課題とする。 本発明者らは、 環状 1本鎖核酸複合体のステム部分を連結する 2つのループ部 分を、 ポリアルキレングリコール、 DNA、 DNAと RNAのキメラ、 これらの 誘導体、 またはこれらの組合せにすることにより、 生体内安定性が向上し、 かつ 細胞内で RN A干渉作用を示し、 ならびに環状 1本鎖核酸複合体を簡易に効率よ く製造できること等を見出し、 本発明を完成した。
本発明の特徴は要約すると以下の通りである。
[1] センス鎖 RNA配列と、 センス鎖 RNA配列に相補的なアンチセンス鎖 R N A配列と、 センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異な る 2つのループ部分を含む環状 1本鎖核酸複合体であって、 センス鎖とアンチセ ンス鎖が対合してステムを形成し、 ループ部分がポリアルキレングリコール、 D NA、 DNAと RNAのキメラ、 これらの誘導体、 およびこれらの組合せからな る群から選択されることを特徴とする、 環状 1本鎖核酸複合体。
[2] 細胞内で RNA干渉作用を有する 2本鎖 RNAに変換される、 [1] に記載 の環状 1本鎖核酸複合体。
[3] ステムを形成する RNA配列が、 標的 RNA配列と 80〜 1 00%の同一 性を有する、 [1] または [2] に記載の環状 1本鎖核酸複合体。
[4]ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、 [ 1 ]〜 [3] のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体。
[5] ステムの長さが 1 9〜3 1塩基である、 [1]〜 [4] のいずれかに記載の 環状 1本鎖核酸複合体。
[6] [1]〜 [5] のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体の製造方法であつ て、 以下の工程:
(1) センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状 1本鎖核 酸複合体、 およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線 状 1本鎖核酸複合体を作製する工程、 および
(2) センス鎖の一部とセンス鎖の残部、 およびアンチセンス鎖の一部とアンチ センス鎖の残部を連結する工程
を含む製造方法。
[7] [1]〜 [5] のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体の製造方法であつ て、 以下の工程:
(1) センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、 および
(2) センス鎖とアンチセンス鎖で形成された 2本鎖 RNAの両端に、 ループ部 分を連結する工程
を含む製造方法。
[8] [1]〜 [5] のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体を真核細胞に導入 し、 標的 RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、 該タン パク質をコ'一ドする遺伝子の発現を in vitroで抑制する方法。
[9] [1]〜 [5] のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体を非ヒ ト動物、 植 物、 またはそれらの細胞に導入し、 標的 RNAを不能にしてタンパク質への翻訳 を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法
[ 1 0 ] [ 1:]〜 [ 5 ] のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体を有効成分とし て含む、 医薬組成物。
本明細書において 「環状 1本鎖核酸複合体」 は、 「ダンベル型核酸複合体」 とも いう。 「ダンベル型核酸複合体」 とは、 センス鎖とアンチセンス鎖が相補的に对合 してステムを形成し、 ステムの両端のそれぞれに、 センス鎖とアンチセンス鎖を 連結するループが形成され、 環状 1本鎖核酸複合体の全体の形状としてダンベル 状になっているものをいう。また、「核酸複合体」とは、 DNAと RNAの複合体、 ポリアルキレンダリコールと RN Aの複合体、 または DNAとポリアルキレング リコールと RN Aの複合体をいう。
本明細書において 「DNAと RNAのキメラ」 とは、 01^八配列と1 ]^ 配列 の任意の組合せからなるハイプリッドをいい、 その組合せはどのような形でもよ く、 例えば、 DNAが連続しているブロックと RNAが連続しているブロックが 連結されていてもよく、 双方の複数のプロックがランダムに混ざって連結されて いてもよく、 DNAと RNAが 1つずつ交互に連結されてもよい。
本明細書において 「標的 RNA」 とは、 RN A干渉法において発現を抑制した い遺伝子の mRN Aまたはその前駆体 RN Aをいう。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2008- 035310号の明細書 およぴ または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のダンベル型核酸複合体を模式的に示す。
図 2は、 本発明のダンベル型核酸複合体の製造方法の概略を示す。
図 3は、 本発明のダンベル型核酸複合体の製造方法の概略を示す。
図 4は、 本発明のダンベル型核酸複合体等の電気泳動像を示す。
図 5は、 本発明のダンベル型核酸複合体および 2本鎖 RN Aの構造を示す。 図 6は、 血清を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複 合体、 ダンベル型 RN Aおよび 2本鎖 RN Aの電気泳動像を示す。
図 7は、 血清を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複 合体、 ダンベル型 RN Aおよび 2本鎖 RN Aの電気泳動像のバンドによる定量結 果の経時的変化 (残存率) を示す。
図 8は、 細胞抽出液を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型 核酸複合体、 ダンベル型 R N Aおよび 2本鎖 R N Aの電気泳動像を示す。
図 9は、 細胞抽出液を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型 核酸複合体、 ダンベル型 RNAおよび 2本鎖 RN Aの電気泳動像のバンドによる 定量結果の経時的変化 (残存率) を示す。
図 1 0は、 哺乳動物培養細胞における本発明のダンベル型核酸複合体おょぴ 2 本鎖 RN Aの RN A干渉効果を示す。 発明を実施するための最良の形態
1. 環状 1本鎖核酸複合体
本発明の環状 1本鎖核酸複合体(以下「ダンベル型核酸複合体」 ともいう) は、 RNA干渉作用を提供し得るものである。 RN A干渉作用は、 細胞内または生体 内で、 標的 RN Aと相補的な配列を持つ小 RN A分子が標的 RN Aに結合し、 そ れを分解するか、 または翻訳を抑制する作用である。
本発明のダンベル型核酸複合体は、 センス鎖 RN A配列と、 センス鎖 RN A配 列に実質的に相補的なアンチセンス鎖 RN A配列と、 センス鎖とアンチセンス鎖 の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる 2つのループ部分を含む環状 1本鎖核 酸複合体である。
アンチセンス鎖 RN A配列は、センス鎖 RN A配列に実質的に相補的であって、 RN A干渉において標的 RN Aと特異的に結合する配列である。 センス鎖とアン チセンス鎖は対合してステムを形成する。 センス鎖 RN A配列とアンチセンス鎖 RNA配列は、 具体的には、 標的 RNA配列およびそれに相補的な配列、 あるい は標的 RNA配列と 80〜1 00%の同一性を有する RNA配列およびそれに相 補的な配列を有する。 ここで 「同一性」 は、 2つの塩基配列にギャップを導入す るかまたはギヤップを導入しないで整列したときに、 総塩基数に対する同一塩基 数の割合 (%) を表す。 ステムの長さは、 RN A干渉作用を付与する限り、 特に 限定されないが、 例えば 1 9〜3 1塩基対、 好ましくは 20〜25塩基対、 より 好ましくは 20〜24塩基対、 さらに好ましくは 20〜23塩基対からなる。 センス鎖および またはアンチセンス鎖の RNAは、 修飾ヌクレオシドを含む 誘導体でもよい。 修飾ヌクレシドは、 塩基および糖部分の修飾体であり、 アルキ ル化体、 アルコキシル化体、 イノシン、 リボースの 2, 一O—アルキルまたは 2 ' —ハロゲン化体、 2 ', 4, 一 BNA化体などが挙げられる。 また、 ヌクレオチド のリン酸基部が修飾されてもよく、 リン酸基部の修飾体として、 ホスホロチォェ ート修飾ヌクレオチド、 メチルホスホネートなどが挙げられる。 また、 センス鎖 および またはアンチセンス鎖の塩基配列は、 RNA干渉作用を有する限り、 R N Aのみならず、 RNAと DNAのキメラであってもよレ、。 さらに、センス鎖に、 1〜 6個の塩基のミスマッチ、 好ましくは 1〜3個の塩基のミスマッチ、 さらに 好ましくは 1〜2個の塩基のミスマッチが含まれていてもよい。 塩基のミスマツ チが含まれると、 2本鎖 RNAがヘリケースにより 1本鎖 RNAに解離しやすく なると考 られる (Schwarz, D. S. , et al. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell 115, 199-208 (2003))。 ループ部分は、 ステムの両端に位 置し、 センス鎖の 5, 末端の RN Aとアンチセンス鎖の 3, 末端の RNAを連結 し、 またセンス鎖の 3 ' 末端の RNAとアンチセンス鎖の RNAの 5 ' 末端を連 結する。 ループ部分は、 ポリアルキレングリコール、 DNA、 DNAと RNAの キメラ、 これらの誘導体、 またはこれらの組合せで構成される。 これにより、 例 えば 2本鎖 RNA ( s i RNA),ループ部分が R N Aのみからなる環状 1本鎖 R NA、 またはヘアピン構造を有する 2本鎖 RNA ( s hRNA) と比較して、 よ り細胞内または生体内安定性が向上し、 R N A干渉においてより持続的および徐 放的な効果を発揮することができる。 ループの長さは特に限定されず、 ステムの 両端を連結できる長さであればよい。 たとえループが長くてもダイサ一による R N Aの切断は阻害されない。
ループ部分のポリアルキレンダリコールは特に限定されないが、 生体安全性が 高いことが好ましい。 これらは、 そのアルキレン部分が、 ハロゲン、 アルキル、 ヒ ドロキシ、 アルコキシ、 ァシル、 アルキルチオなどの非限定的置換基で置換さ れていてもよい誘導体を含む。 またモノマーの単位の炭素数が 1〜4のものが好 ましいが、 炭素数 5以上のもの、 例えば 5〜8のものでもよい。 ポリアルキレン グリコールとしては、 例えば、 ポリエチレングリコール、 ポリプロピレングリコ 一ノレ、 ポリブチレングリコー^^ ポリオキシエチレンォキシプロピレングリコー ル、 ポリオキシエチレンォキシブチレングリコール、 ポリオキシエチレンポリオ キシプロピレンダリコール、 ポリオキシエチレンポリォキシブチレンダリコール などが挙げられる。 本発明においてはポリエチレンダリコールが特に好ましい。 ポリエチレンダリコールは、 式: _0— [(CH2) 2-0-] n— (式中、 nは 特に限定されなレ、が、好ましくは n=l〜 1 000、より好ましくは n = 2〜50、 さらに好ましくは 3〜20、 特に好ましくは 3〜 1 0である。) で表される。 ポリ アルキレンダリコールの一方または両方の水酸基はリン酸エステル化されていて もよい。
ループ部分の DNA、 または DNAと RNAのキメラは、 ループの長さとして 1塩基以上であればよく、 好ましぐは 2〜20塩基、 より好ましくは 6〜 1 2塩 基、 さらに好ましくは 7〜 1 1である。 ループ部分の核酸配列は、 実質的に相補 鎖を形成しない配列を含んでいれば特に限定されない。 相補鎖を形成しない D N A配列の例としては、 GATTAGTCACT (配列番号 1 4)、 AGAGAAC TT (配列番号 1 5)、 TTCAAGAGA (配列番号 1 6)、 TGTGCTGT C (配列番号 1 7) などが挙げられる。 該 DNA配列の一部は、 各 DNAに対応 する RN Aに置換されていてもよレ、。 DNAまたはRNAは修飾ヌクレオシドを 含む誘導体でもよい。 修飾ヌクレオシドは、 塩基および糖部分の修飾体であり、 アルキル化体、 アルコキシル化体、 イノシン、 リボースの 2, 一O—ァノレキルま たは 2 ' —ハロゲン化体、 2', 4 ' —BNA化体などが挙げられる。 また、 ヌク レオチドのリン酸基部が修飾されてもよく、 リン酸基部の修飾体として、 ホスホ ロチォエート修飾ヌクレオチド、メチルホスホネートなどが挙げられる。さらに、 ループ部分の核酸配列中の任意の位置にポリアルキレンダリコールが含まれてい てもよい。 さらにまた、 ループ部分にペプチドが含まれてもよい。
2. 環状 1本鎖核酸複合体の製造方法
本発明の環状 1本鎖核酸複合体 (ダン ^ル型核酸複合体) は、 以下の工程:
( 1 ) センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状 1本鎖核 酸複合体、 およびセンス鎖の残部とループ部分とァンチセンス鎖の残部を含む線 状 1本鎖核酸複合体を作製する工程、 および
(2) センス鎖の一部とセンス鎖の残部、 およびアンチセンス鎖の一部とアンチ センス鎖の残部を連結する工程、
を含む製造方法で作製することができる。
あるいは、 以下の工程: (1) センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、 および
(2) センス鎖とアンチセンス鎖で形成された 2本鎖 RNAの両端に、 ループ部 分を連結する工程、
を含む製造方法で作製することができる。
ダンベル型核酸複合体のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、 標的となる遺伝子 の発現を抑制できるように、標的遺伝子の塩基配列から設計する。標的遺伝子は、 一般に真核生物由来の遺伝子であり、好ましくは動物や植物由来の遺伝子である。 設計は、 複数のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製してそれぞれ抑制効率を確 認してもよいが、 例えば s i RNA設計用アルゴリズムなどによる設計を利用し て も よレヽ (参照文献 : J.A.Jaeger et al. , Methods in Enzymology (1989) 183:281- 306 ;D. H.Mathews et al., J. Mol. Biol. (1999) 288:911-940)。 設計時 には、 標的遺伝子と類似した配列を持つ標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制す ること (Off target効果) がないようにすることが望ましい。 また、 ダンベル型 核酸複合体が細胞内または生体内でダイサ一により切断されたときに、 センス鎖 およびアンチセンス鎖を含む生じた 2本鎖 RNAの 3 '末端が、 1〜3個の U (ゥ ラシル) の突出末端となるように配列を設計してもよい。 センス鎖およびアンチ センス鎖の長さは特に限定されないが、 例えば 1 9〜3 1塩基、 好ましくは 20 〜25塩基、 より好ましくは 20〜 24塩基、 さらに好ましくは 20〜 23塩基 の長さで設計する。 具体的な標的遺伝子は特に限定されないが、 例えば過剰発現 される疾患関連遺伝子、 ウィルス性遺伝子など、 具体的には、 白血病の a b l / b c r遺伝子、 加齢性黄斑変性症の V EG F遺伝子、 肝炎の HCV遺伝子などが 挙げられる。
ループ部分は、ポリアルキレングリ コール、 DNA、 DNAと RNAのキメラ、 これらの誘導体、 あるいはこれらの組合せとし、 ループ部分の塩基配列は、 上記 に示したように、 実質的に相補鎖を形成しない配列を含む。
センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状 1本鎖核酸複 合体、 およびセンス鎖の残部とループ部分とァンチセンス鎖の残部を含む線状 1 本鎖核酸複合体の作製は、 市販の核酸合成機および試薬を用いて行うことができ る。 合成した線状 1本鎖核酸複合体の 5 ' 末端をリン酸化する。 これらの線状 1 本鎖核酸複合体を混合すると、 センス鎖とアンチセンス鎖が部分的に対合し、 か つセンス鎖の一部とセンス鎖の残部の間およびアンチセンス鎖の一部とアンチセ ンス鎖の残部の間に切れ目があるステムが形成される。 この切れ目を酵素的また は化学的に連結し、 ダンベル型核酸複合体を製造する。 酵素的に連結するには、 リガーゼを用いればよく、 リガーゼは T 4 RN Aリガーゼが好ましい。化学的に 連結するには、 縮合剤を用いればよく、 縮合剤はジシクロへキシルイミ ドなどが 好ましく、 リン酸エステルとして連結することができる。
あるいは、 センス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、 センス鎖とアンチセ ンス鎖を混合して 2本鎖 RNAを形成させ、 この 2本鎖 RNAの両端にループ部 分を連結して、 ダンベル型核酸複合体を製造してもよい。 ループ部分がポリアル キレングリコールを含む場合は、 核酸の 5' 末端をリン酸化し、 核酸にポリアル キレンダリコールをリン酸化エステルにより連結する力、、 ポリアルキレンダリコ ールの両端をリン酸エステル化し、 核酸の 3, 末端および 5 ' 末端と連結するこ とができる。あるいは、ループ部分が DNA、 DNAと RNAのキメラの場合は、 合成したセンス鎖、 アンチセンス鎖およびループ部分の 5 ' 末端をリン酸化し、 ループ部分と 2本鎖 RN Aの各末端を上記酵素的または化学的に連結することが できる。
以下、 図 2を参照しながら、 ダンベル型核酸複合体 (D b— 23 P EG ; 23 塩基対からなるステムとポリエチレンダリコールを含むループ部分からなるダン ベル型核酸複合体) の製造方法の を具体的に説明する。 図中、 ステムにおいて 上段の RN A鎖はセンス鎖であり、 下段の RN A鎖はアンチセンス鎖である。
(1) センス鎖 RN A配列の任意の切れ目部位から 5, 末端まで、 例えばホス ホロアミダイ ト法に基づく核酸合成機で RNA鎖を合成し、 5, 末端をリン酸化 する。 図 2でいえば、 3, が付されているセンス鎖の端 (3, AAC · · · ) か らセンス鎖の 5' 末端 ( · · ' UGA) まで合成する。
次に、 ポリエチレングリコールを含むループ部分を合成する。 ポリエチレング リコールは特に限定されないが、 例えば分子量約 60〜60000、 より好まし くは約 1 20〜3000、 さらに好ましくは約 1 80〜1 200、 特に好ましく は約 1 80〜600のポリエチレンダリコールを用いることが好ましい。 また、 核酸合成機で用いられるスぺーサー用の試薬を用いることが好ましい。 図 2でい えば、 センス鎖の 5, 末端に、 A (アデニン)、 ポリエチレングリコールのリンカ 一、 U (ゥラシル) を含むループ部分を結合する。
さらに、 アンチセンス鎖の 3, 末端から任意の切れ目部位まで RNA鎖を合成 する。 図 2でいえば、 アンチセンス鎖の 3 ' 末端 (UCA) から 5, が付されて いるアンチセンス鎖の端まで合成し、 リン酸化試薬で 5 ' 末端をリン酸化する。 この工程により、 線状 1本鎖核酸複合体が作製できる。
なお、 この工程で作製されるセンス鎖とアンチセンス鎖の塩基の数は、 少なく とも 1つの塩基の対合が生じるように、 同じでないことが好ましい。 塩基の数の 違いは、 1〜25塩基であることがより好ましく、 5〜 1 5塩基であることが更 に好ましい。
(2)上記(1) で合成したアンチセンス鎖配列の残部の RN A鎖を合成する。 図 2でいえば、 3 ' が付されているアンチセンス鎖の端 (3, GCG · · · ) か らアンチセンス鎖の 5, 末端 ( · · · GGA) まで合成する。
次に、 ポリエチレングリコールを含むループ部分を合成する。 図 2でいえば、 アンチセンス鎖の 5, 末端に、 A (アデニン)、 ポリエチレンダリ コールのリンカ 一、 U (ゥラシル) を含むループ部分を結合する。
さらに、 センス鎖の残部の RNA鎖を合成する。 図 2でいえば、 アンチセンス 鎖 RNAの 3, 末端 (UCC) から 5' が付されているアンチセンス鎖の端まで 合成し、 リン酸化試薬で 5 ' 末端をリン酸化する。 この工程により、 線状 1本鎖 核酸複合体が作製できる。
(3) 上記 (1) で作製した線状 1本鎖核酸複合体と、 (2) で作製した線状 1 本鎖核酸複合体を混合する。 (1) で作製した線状 1本鎖核酸複合体に含まれるセ ンス鎖と、 (2) で作製した線状 1本鎖核酸複合体に含まれるアンチセンス鎖が対 合して、 ステムを形成し、 図 2に示すように、 ステムに 2つの切れ目があるダン ベル型核酸複合体が形成される。
縮合剤または RN Aリガーゼ、例えば T 4 RN Aリガーゼを添加して、 この 2 つの切れ目を連結する。 即ち、 (1) で作製した線状 1本鎖核酸複合体のセンス鎖 の一部と (2) で作製した線状 1本鎖核酸複合体のセンス鎖の残部、および、 (1) で作製した線状 1本鎖核酸複合体のアンチセンス鎖の一部と (2) で作製した線 状 1本鎖核酸複合体のアンチセンス鎖の残部を連結する。 図 2でいえば、 センス 鎖の 3 ' が付されている Aと 5, が付されている Cを連結し、 アンチセンス鎖の 5 ' が付されている Cと 3, が付されている Gを連結する。
リガーゼの反応条件は、 例えば、 ポリエチレングリコール (PEG)、 B SAな どを含む緩衝液中で低温〜室温下で約 20時間のィンキュベーションが好ましい。 ポリエチレングリコールを加えることによりダンベル型核酸複合体の収率が向上 し、 B S Aを加えることにより リガーゼの失活を防ぐことができる。 ダンベル型 核酸複合体の抽出は、 特に限定されないが、 クロ口ホルムを用いてダンベル型核 酸複合体を抽出し、 反応液に含まれる余分なポリエチレンダリコールを除去する ことが好ましい。
DNAまたは DNA— RNAキメラのループ部分を有するダンベル型核酸複合 体も、 上記 (1) 〜 (3) と同様にして作製し、 回収、 精製することができる。 そのようなダンベル型核酸複合体 (D b— 23D 7 ; 23塩基対からなるステム と DNAを含むループ部分からなるダンベル型核酸複合体) の作製の例を図 3に 示す。
作製したダンベル型核酸複合体は、 高速液体クロマトグラフィー、 ゲル電気泳 動法、 ェキソヌクレアーゼによる分解を調べる試験等で、 ダンベル型核酸複合体 が作製されたかどうかを確認し、 回収、 精製することが好ましい。 上記方法で作 製したダンベル型核酸複合体を変性ポリアクリルアミ ドゲルで分析した例を図 4 に示す。 図 4の短い矢印は、 T 4 RNAリガーゼで 1ケ所のみ連結した生成物の バンドを示し、 長い矢印は、 2ケ所とも連結した目的生成物 (ダンベル型核酸複 合体) のバンドを示す。 破線の矢印は、 ダンベル型核酸複合体の原料として用い た、 上記 (1) および (2) で合成した線状 1本鎖核酸複合体のバンドを示す。 3. 遺伝子の発現を抑制する方法
本発明のダンベル型核酸複合体を真核細胞または真核生物に導入し、 標的 RN
Aを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することができる。 該細胞は、 ヒ ト細 胞を含む動物細胞、 植物細胞などを含む。 本発明のダンベル型核酸複合体は、 生 体内安定性 (例えば血中安定性) が高く、 持続的、 徐放的に効果を発揮すること ができる。 また、 生体に対する安全性も高いと考えられる。
in vitroで RN A干渉法を行う場合、 ダンベル型核酸複合体を、 例えばエレク トロポレーシヨン法、 マイクロインジェクション法、 リポフエクシヨン法、 リン 酸カルシウム法などで細胞に導入することができる。
in vivo で RN A干渉法を行う場合、 ダンベル型核酸複合体を、 例えば局所投 与、 静脈内投与、 遺伝子銃を用いる方法などで、 動物または植物に導入すること ができる。
細胞内に導入されたダンベル型核酸複合体は、 細胞内のダイサ一により切断を 受け、 RNA干渉作用のある 2本鎖 RNA ( s i RNA) が細胞内で生じる (図 1)。 s i RNAが 1本鎖となり、 RNA誘導サイレンシング複合体(RNA induced silencing complex (R I SC)) を形成し、 1本鎖 R N Aと相補的な配列の標的 mRNAを認識して、 mRNAを分解し、 結果として標的遺伝子の発現が抑制さ れる。
4. 環状 1本鎖核酸複合体を含む医薬組成物
本発明の医薬組成物は、 環状 1本鎖核酸複合体 (ダンベル型核酸複合体) を有 効成分として含む。 ダンベル型核酸複合体の医薬組成物 の配合量は、 組成物の 全量に対して、 例えば 0. 1重量%、 0. 5重量%、 1重量%、 3重量%、 5重 量%、 1 0重量%、 20重量%、 30重量%、 40重量%、 50重量%、 60重 量%、 70重量%、 80重量%、 90重量%、 1 00重量%でぁるが、 これらに 限定されない。
本発明の医薬組成物の剤形としては、 例えば液体製剤 (溶液剤、 懸濁剤、 乳濁 剤など)、 固体製剤 (用時調製の凍結乾燥剤など)、 リボソーム (カチオン性リポ ソームが好ましい) 封入製剤などが挙げられる。 投与は全身投与、 局所投与を問 わない。 全身投与に関しては、 最近、 マウスとハムスターに合成 s i RNAを全 身投与したところ、 標的遺伝子の効果的なサイレンシングが起き、 しかも内在性 マイクロ RNA (m i RNA) の量や活性に影響が認められなかったことが確認 れてい O uohn, M. et al. Effective RNAi— mediated gene silencing without interruption of the endogenous microRNA pathway. Nature 449, 745 - 747 (2007) ) ( 投与経路としては、 非経口投与が好ましく、 例えば皮内または皮下投与、 直腸内 投与、 経粘膜投与、 静脈内投与などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、 製剤化、 剤形等に応じて、 製薬上許容される賦形剤ま たは希釈剤 (生理食塩水、 滅菌水、 リンゲル液など)、 添加剤、 例えば医薬上許容 ざれる緩衝剤、 等張化剤、 安定化剤などを含めてもよい。
また、 本発明の医薬組成物の投与量は、 患者の性別、 体重、 年齢、 重篤度、 症 状などに応じて変更し得る。
本発明の医薬組成物の適用は特に限定されないが、 癌、 遺伝子疾患、 ウィルス 等による感染症などの治療が挙げられる。 例えば癌の治療では、 本発明の医薬組 成物を用いて癌細胞で特異的に発現する遺伝子やタンパク質の機能を抑制するこ とができる。
以下、 実施例により本発明を更に具体的に説明するが、 これらの実施例は本発 明を限定するものではない。 実施例 1
(A) ダンベル型核酸複合体等の設計
23塩基対のステムを有する本発明のダンベル型核酸複合体 (配列番号 7〜1 3)、および本発明のダンベル型核酸複合体の対照として 2本鎖 RN A ( s i RN A、 配列番号 5および 6) を設計した (図 5)。 図中、 対照の s i RNAは、 s i RNA— 1と記載する。 また、 設計された各ダンベル型の名前において、 「D b」 はダンベル型を意味し、 「23」はダンベル型核酸複合体が 23塩基対のステムを 有することを意味し、 「PEG」 はループ部分にポリエチレンダリコールを含むこ とを意味する。 「P EG u u」 はループ部分にポリエチレンダリコールを含み、 か つダイサ一で切断されたときに生じる 2本鎖 RNAに UU (連続した 2つのゥラ シル) の突出末端を形成する RNAを含むことを意味し、 「D 3」、 「D 5」 および
「D 7」 は、 ループ部分に DNAをそれぞれ 3つ、 5つ、 7つ含むことを意味す る。 対照の s i RNA— 1 と各ダンベル型核酸複合体のステムにおいて、 上段の 配列はセンス鎖配列、 下段の配列はアンチセンス鎖を示す。 太字で示された配列 は、 標的 RNAに対する相補配列を示す。 四角で囲まれた部分は、 対照の s i R
NA- 1と各ダンベル型核酸複合体の全てに共通な 2本鎖 RNA部分を示す。 ダ ンベル型核酸複合体のループ部分の A (アデニン)、 C. (シトシン)、 G. (グァェ ン) および: L (チミン) は、 2 ' —デォキシヌクレオチドであることを示す。 ダ ンベル型核酸複合体のループ部分に示された太線は、ポリエチレンダリコール(P EG) のリンカ一を示す。 ここでポリエチレングリコールの式:一 [(CH2) 2 — O] n_の nは 4である。 また、 比較として、 D b— 23 D 3のループ部分の DN Aが対応する RN Aに置換されている以外は同じ配列を持つ、 RNAのみか らなるダンベル型 RNA (D b - 23) を設計した。
なお、 本実施例では、 ホタルルシフェラーゼ発現ベクター p GL 3— C o n t r o 1の配列を標的として、 上記ダンベル型核酸複合体、 2本鎖 RNAおよびダ ンベル型 RN Aを設計した。
(B) ダンベル型核酸複合体等の作製
(a)線状 1本鎖核酸複合体等の合成
ダンベル型核酸複合体の原料となる線状 1本鎖核酸複合体は、 全てホスホロァ ミダイ ト法に基づき核酸合成機 (GeneWorldH8_SE) により合成した。 例えば、 図 5に示す D b - 23 P EGおよび D b _ 23D 7は、図 2 (配列番号 1および 2) および図 3 (配列番号 3および 4) にそれぞれ示すように、 センス鎖の切れ目の 3, 末端の RNAからループ部分、 アンチセンス鎖の切れ目の 5 ' 末端の RNA まで、 核酸合成機で線状 1本鎖核酸複合体を合成し、 5 ' 末端をリン酸化した。 また、 アンチセンス鎖の切れ目の 3 ' 末端の RNAからループ部分、 センス鎖の 切れ目の 5' 末端の RNAまで、 核酸合成機で線状 1本鎖核酸複合体を合成し、 5 ' 末端をリン酸化した。 図 5に示す他のダンベル型複合体の原料の線状 1本鎖 核酸複合体も同様にして合成した。
アミダイ ト試薬としては、 RNAは 2 ' _O— TBDMS保護体(Proligo)また は 2' — O— TOM保護体(Glen Research)のどちらかを使用し、 5' 末端リン酸 ィ匕には Chemical Phosphorylation Reagent (Glen Research)を用レヽ 7こ。 た、 ノレ ープ部分の P E Gには Spacer Phosphoramidite 18 (Glen Research)を使用した。 RNAの脱保護は定法に従い、 変性ポリアクリルアミ ドゲルにより完全鎖長の生 成物を精製した。
対照の s i RNA_ 1の原料となる線状 1本鎖 RNAについては、 上記核酸合 成機を用いて合成し、 精製した。 比較の D b— 23の原料となる線状 1本鎖 RN Aについては、 センス鎖の両末端にそれぞれ、 ループ部分の一部が 4または 5塩 基連結された線状 1本鎖 RNA、 およびアンチセンス鎖の両末端にそれぞれ、 ル ープ部分の残部が 5または 4塩基連結された線状 1本鎖 RNAを、 上記核酸合成 機を用いて合成し、 精製した。
(b)T 4 RNAリガーゼを用いたライゲーション反応によるダンベル型核酸 複合体の作製
T 4 RNAリガーゼを用いた反応液は、 最終的に以下の組成となるようにし た。
2 μ M 線状 1本鎖核酸複合体
0. 2〜0. 4ユニット i L T 4 RNAリガーゼ
0. 006% B S A
25% PEG6000
50 mM T r i s— HC 1 ( p H 7. 5)
Figure imgf000017_0001
1 0 mM DTT
1 mM ATP
(反応スケール 2. 5 mL)
具体的には、 上記(a)で合成、 精製した 2つの 5' リン酸化線状 1本鎖核酸複合 体を、 2つで 4 Μとなるよう、 l O OmM T r i s— HC 1 (p H 7. 5)、
20 mM Mg C l 2、 20mM DTT, 2 mM A T P緩衝液( 2 x緩衝液、 最終的な反応液量の半分量) に溶解し、 90°Cで 3分間加熱後、 その後室温まで 徐冷した。 その後、 B SA水溶液、 PEG 6000水溶液、 T4 RNAリガ一 ゼを上記反応液の組成になるように加え、室温で約 20時間ィンキュベートした。 反応液 (2. 5 mL) を、 クロ口ホルム (2. 5 mL) で 2回抽出し (PEG 6
000の除去)、 アルコール沈殿して RN Aを回収し、変性 PAGEを用いて環化 体を単離した (1 0%PAGE、 7M尿素、 25%ホルムアミ ド、 1 χΤΒΕ、 l mm厚)。 図 4に電気泳動像を示す。 図 4において、 長い矢印が示すバンドが環 化体(ダンベル型核酸複合体)である。 ここでのダンベル型核酸複合体の収率は、 ダンベル型核酸複合体の原料として用いた 2つの線状 1本鎖核酸複合体の量を 1
00 %とすると、 D b— 23 P E Gおよび D b— 23 D 7のいずれも約 50 %で あった。 UV shadowing法で目的物を含むバンドを可視化して切り出し、 細かく粉 碎した後、溶出バッファー (0. 2M N a C l、 1 0 mM EDTA (pH8.
0)) 4 mLで 3回抽出した。 Sep- Pakカートリッジを用いて脱塩 (50%ァセト 二トリル水 6mLで溶出) し、 遠心エバポレーターを用いて濃縮し、 さらに酢酸 ナトリゥム塩存在下でアルコール沈殿した。 得られた核酸複合体は超純水に溶解 し、 適宜希釈後 UV吸収スぺク トルを測定し、 溶液濃度を定量した。 収率は、 ダ ンベル型核酸複合体の原料として用いた 2つの線状 1本鎖核酸複合体の量を 1 0
0 %とすると、 D b— 23 P EGおよび D b— 23 D 7で約 1 0〜 25 %であつ た。 他のダンベル型核酸複合体の収率も同程度であった。
(c) s i RNAぉょびD b - 23の作製
対照の s i RNA— 1は、上記(a)で作製したセンス鎖およびアンチセンス鎖を 混合してァニ一リングさせて作製し、 エタノール沈殿により s i RNA— 1を回 収し、 PAGEで精製した。
比較の D b - 23は、上記(a)で作製したセンス鎖を含む線状 1本鎖 RNAおよ びアンチセンス鎖を含む線状 1本鎖 RN Aを混合してァニーリングさせ、 ループ 部分を T4 RN Aリガーゼで連結して作製した。 T4 RN Aリガーゼの反応条 件は、 上記反応スケール 2. 5mLから 25 ju Lにし、 上記 T4 RNAリガーゼ の濃度 0. 2〜0. 4ュニットノ μ 1力、ら 2. 0ュニッ ト μ Lにし、上記 90 °C で 3分間加熱から 6 5 で 5分間加熱にし、 上記室温で約 20時間ィンキュベー トから 1 1°Cで 20時間インキュベートにした以外は、 上記と同様とした。 エタ ノール沈殿により D b— 23を回収し、 PAGEで精製した。
(C) 血清中のダンベル型核酸複合体の生物学的安定性試験
5 μΜの各ダンベル型核酸複合体、 または対照の s i RNA— l、 比較の Db
— 23を、 1 Xァニーリングバッファー(1 00 mM酢酸力リウム、 30 mM H
EPE S—KOH ( p H 7. 4)、 2 mM酢酸マグネシウム) 中で 90°C、 3分間 加熱後、 徐冷した。 この核酸溶液 4 Lとゥシ血清 (Gibco) 1 6 /z Lを混合し、
37 °Cでインキュベートした。 2、 4、 6、 8時間後に反応液の一部をサンプリ ングし、 1 5%未変性 PAGEで分析した。 SYBR G r e e n Iを用いて ゲルを染色し、 バンドを可視化、 定量した。
バンドによる定量結果の経時的変化をみると、 対照の s i RNA_ l、 比較の D b— 23は、 2時間後、 それぞれ約 30 %、 約 40 %になるのに対して、 本発 明のダンベル型核酸複合体は、 いずれも安定であった (図 6および図 7)。 特に、 D b— 23 PEGと D b— 23D 7は、 8時間以降も 70%以上が残存しており、 高い血中安定性を示すことが明らかとなった。
(D) 細胞抽出液中のダン ル型核酸複合体の生物学的安定性試験
HL 60細胞 (RIKEN CELL BANK) を培養し、 細胞抽出液を調製した。 終濃度が タンパク質 1 OmgZmL、 各ダンベル型核酸複合体または対照の s i RNA— 1、 比較の D b— 23が 2. 5 μΜとなるよう混合し、 3 7°Cでインキュベート し、 0. 5、 1、 2、 4時間後に反応液の一部をサンプリングした。 これを 1 5% 未変性 PAGEで分析し、 SYBR G r e e n Iを甩いてゲルを染色し、 バ ンドを可視化、 定量した。
バンドによる定量結果の経時的変化をみると、 対照の s i RNA— 1は、 1時 間ですでに 40%以下に分解されるのに対して、 本発明のダンベル型核酸複合体 は極めて安定であり、特に D b— 23D 7は最も安定であった(図 8および図 9)。 01)— 2307は、 4時間後もほとんど分解されずに残っていた。
(E) 哺乳動物培養細胞系を用いたダンベル型核酸複合体の RN A干渉効果の測 定
デュアルルシフェラーゼレポーターアツセィシステム (promega) を用レ、、 ダン ベル型核酸複合体の哺乳動物培養細胞における RN A干渉効果を測定した。
N I H 3 T 3細胞 (RIKEN CELL BANK) を 1 0 %ゥシ胎児血清 ( F C S、
Invitro/Gibco) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、 GIBC0) 培地中 で 3 7°C、 5%C〇2下で培養した。 9 6穴プレートに、 1 00 μ Lずつ、 1.
6 X 1 04 c e 1 1 /ゥエルとなるよう分注した。 さらに 3 7 °C、 5 % C O 2下で
24時間培養し、約 70%コンフルェン卜の状態で 2種のプラスミ ドベクター(p
G L 3 -C o n t r o 1および p RL_TK (内部標準)、 いずれも promega) と 各ダンベル型核酸複合体および対照の s i RNA— 1を、 トランスフエクシヨン 試薬 GeneSilencer (Genlantis)を用い、 トランスフヱクシヨン試薬添付のプロ ト コールに従い、 コ トランスフエクシヨンした。 トランスフエクシヨン時の濃度条 件は、 0. 2 n p GL 3 -C o n t r o l /0. 02 /z g p RL— TKZ 25 nM各ダンベル型核酸複合体または対照の s i RNA- 1 (最終量 1 00 μ L) とした。
具体的には、 上記細胞に血清を含まない DMEM培地 55. 6 /z Lを加えた状 態とし、下記の組成のトランスフエクション用混合溶液を添加することで行った。
GeneSilencer 1 β L
DMEM培地 2 5 L
s i RNA希釈液 2 • 5 L
DMEM培地 1 5 β L
RNA ( 5 p m o 1 / 1 ) 0 • 5 L
p GL 3-C o n t r o 1 (1 μ g μ 1 ) 0 • 2 β L
p R L -TK (0 • 1 μ 1 ) 0 2 μ L
44 4 β L
トランスフエクシヨン後、 3 7°C、 5 %C02下で 4時間インキュベートし、 20%血清入り DMEM培地 1 00 μ Lをそれぞれのゥエルに加えた。 3 7でで さらに 2 0時間インキュベート後、 Dual-luciferase Reporter Assay System (promega)を用い、 添付のプロ トコールに従いルシフェラーゼ発現量を定量した (条件:試薬量 30 μ L、 delay time 2秒、 read time 1 0秒。 機器 Wallac ARV0 SX 1420 Multilabel Counter) 0 比較として、 バッファーのみ (対照) の条件も同 様に評価した。 ホタルルシフェラーゼの発光強度は、 内部標準であるレニラルシ フェラーゼの発光強度により補正した。
結果を図 10に示す。 s i RNA- 1 と D b _ 23D 3は、 ほぼ同等の活性を 有していることが明らかとなった。 さらに、 D b— 23 D 7や D b— 23 P EG など、 s i RNAほどではないが十分な阻害活性が観察された。
以上の実施例から、 ダンベル型核酸複合体は、 血清中、 細胞抽出液中で十分な 安定性を有し、 また哺乳動物細胞において十分な RNA干渉効果を発揮すること が明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明の環状 1本鎖核酸複合体は、 細胞または生体内に投与されるとダイサー に特異的に認識され、両側のループ部分が切断されて 2本鎖 R N Aになり(図 1 )、 この 2本鎖 R N Aが R N A干渉作用を持ち得る。 本発明の環状 1本鎖核酸複合体 は、従来の 2本鎖 R N Aよりも優れた生体内安定性(例えば血中安定性)を有し、 かつ R N A干渉において持続的、 徐放的な効果を発揮し得るという格別優れた作 用効果を奏する。 従って、 持続性および徐放性を有し、 かつ R N A干渉作用を付 与し得る環状 1本鎖核酸複合体含有医薬品を提供することが可能となる。 この医 薬品は、 全身投与することも患部に直接投与することもでき、 かつその投与量を 減らすことが可能となる。
さらにまた、 本発明の製造方法により、 生体内安定性の高い環状 1本鎖核酸複 合体を簡易に効率よく製造することができる。
本発明のダンベル型核酸複合体は、 医学、 農学分野などでの広範な応用が期待 される。 例えば、 医薬品開発、 農薬開発、 植物又は動物あるいはそれらの細胞で の特定の遺伝子やタンパク質の機能の解明、 例えばノックァゥト法による機能の 解明など、 種々の目的のために本発明のダンベル型核酸複合体を使用することが できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1. センス鎖 RNA配列と、 センス鎖 RNA配列に相補的なアンチセンス鎖 RNA配列と、 センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異 なる 2つのループ部分を含む環状 1本鎖核酸複合体であって、 センス鎖とアンチ センス鎖が対合してステムを形成し、 ループ部分がポリアルキレンダリコール、 DNA、 DNAと RNAのキメラ、 これらの誘導体、 およびこれらの組合せから なる群から選択されることを特徴とする、 環状 1本鎖核酸複合体。
2. 細胞内で RNA干渉作用を有する 2本鎖 RNAに変換される、 請求項 1 に記載の環状 1本鎖核酸複合体。
3. ステムを形成する RN A配列が、 標的 RNA配列と 80〜 1 00%の同 一性を有する、 請求項 1または 2に記載の環状 1本鎖核酸複合体。
4. ポリアルキレングリコールがポリエチレングリ コールである、 請求項 1 〜 3のいずれか 1項に記載の環状 1本鎖核酸複合体。
5. ステムの長さが 1 9〜3 1塩基である、 請求項 1〜4のいずれか 1項に 記載の環状 1本鎖核酸複合体。
6. 請求項 1〜 5のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体の製造方法であ つて、 以下の工程 :
( 1 ) センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状 1本鎖核 酸複合体、 およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線 状 1本鎖核酸複合体を作製する工程、 および
(2) センス鎖の一部とセンス鎖の残部、 およびアンチセンス鎖の一部とアンチ センス鎖の残部を連結する工程
を含む製造方法。
7. 請求項 1〜 5のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体の製造方法であ つて、 以下の工程:
(1) センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、 および
(2) センス鎖とアンチセンス鎖で形成された 2本鎖 RNAの両端に、 ループ部 分を連結する工程 を含む製造方法。
8 . 請求項 1〜 5のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体を真核細胞に導 入し、 標的 R N Aを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、 該タ ンパク質をコードする遺伝子の発現を in vitroで抑制する方法。
9 . 請求項 1〜5のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体を非ヒ ト動物、 植物、 またはそれらの細胞に導入し、 標的 R N Aを不能にしてタンパク質への翻 訳を阻害することを含む、 該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方 法。
1 0 . 請求項 1〜5のいずれかに記載の環状 1本鎖核酸複合体を有効成分と して含む、 医薬組成物。
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