WO2009095897A1 - Biomarkers for hypoxic situations and uses - Google Patents

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WO2009095897A1
WO2009095897A1 PCT/IB2009/050414 IB2009050414W WO2009095897A1 WO 2009095897 A1 WO2009095897 A1 WO 2009095897A1 IB 2009050414 W IB2009050414 W IB 2009050414W WO 2009095897 A1 WO2009095897 A1 WO 2009095897A1
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hif
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quantification
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Application number
PCT/IB2009/050414
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French (fr)
Inventor
Jean-Philippe Gérard Michel DALES
Monique Silvy
Jean Gabert
Original Assignee
Université de la Mediterranée
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Definitions

  • the invention relates to biomarkers for pathologies or cellular stress associated with hypoxic processes and more particularly relates to an in vitro method for the prognosis including survival in patients suffering from such pathologies or prognosis of recurrence in the body. case of cancer.
  • the ability of cells to respond to a decrease in oxygen partial pressure is essential for both normal embryo development and postnatal physiology.
  • hypoxia also plays a major role in the pathophysiology of diseases such as cancer.
  • the HIF-I factor (hypoxia inducible factor-1) is a regulator expressed in response to a decrease in the cellular oxygen partial pressure.
  • This active factor in particular, the genes involved in
  • Angiogenesis It is a major regulator of a large number of genes controlling oxygen homeostasis in many mammals.
  • HIF-I modifies the transcription of genes involved in erythropoiesis, iron metabolism, pH regulation, angiogenesis and glucose metabolism.
  • the proteins encoded by these genes increase the intake of oxygen or activate alternative metabolic pathways that do not require oxygen. Recent work has shown that these proteins are involved in the progression of tumors.
  • HIF-I is a protein composed of 2 subunits HIF-l ⁇ and HIF-1 ⁇ / ARNT. These subunits belong to the superfamily of the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors containing a PAS domain (PER-ARNT-SIM).
  • HIF-1 ⁇ is a common subunit to several transcription factors, whereas HIF-1 is only present in HIF-I. It is the only oxygen-regulated subunit that determines the activity of HIF-I. Hypoxia regulates the stability of HIF-l ⁇ and also affects its location in the cell, its ability to bind DNA, and the function of the transcriptional activity of the HIF-I complex.
  • HIF-l ⁇ is composed of 826 amino acids. Its N-terminal part contains the bHLH and PAS domains which are essential for DNA binding and dimerization and its carboxy-terminal part contains two transactivation domains and a nuclear localization signal.
  • the middle portion has a Pro-Ser-Thr domain of oxygen degradation (ODD, amino acids 401-603), which is responsible for the stability of HIF-l ⁇ .
  • ODD oxygen degradation
  • HIF-l ⁇ is encoded by the HIF1A locus on chromosome 14q21-q24, which codes for 15 exons resulting in a main transcript of about 8 kb.
  • Exons encode domains with different functionalities. Thus, exon 2 codes for the bHLH domain, whereas exons 3 to 8 encode the PAS domain.
  • the carboxy-terminal region, which comprises the transactivation and protein stability domains, is coded by exons 9 to 15.
  • HIF-l ⁇ is similar to wild type HIF-l ⁇ , but has 3 additional base pairs (TAGs), located at the junction between exons 1 and 2, resulting in a difference of 2 amino acids upstream of the bHLH domain.
  • TAGs additional base pairs
  • HIF-l ⁇ 736 is characterized by the absence of exon 14, which produces a shift of the reading frame and introduces a stop codon into the coding sequence after the motif
  • HIF-1CC 827 and HIF-1CC 736 activate the VEGF gene promoter under hypoxia conditions.
  • HIF-l ⁇ 557 which is induced by the Zn ion, lacks exon 12 and HIF-1CC 516 of exons 11 and 12.
  • HIF-1CC 557 (HIF-IaZ) and HIF-1 ⁇ 516 function in vitro as dominant negative isoforms of HIF-I.
  • HIF-l ⁇ 785 does not have exon 11 in the ODD domain.
  • the isoform is upstream regulated by 12-myristate acetate-13, reactive oxygen species and is also induced by heat and oxidative stress under normoxic conditions.
  • This variant contains all the functional domains and acts as a transcriptional activator.
  • HIF-1CC 785 increases tumor growth in vivo in the animal model.
  • the HIF-1CC 417 isoform lacks exon 10 and transactivation domains. This isoform functions as a HIF-l ⁇ partner.
  • the last hHIF-CCTe isoform is specifically expressed in the human testis. It is a dominant negative regulator of the HIF-I function.
  • the invention therefore aims to provide biomarkers of pathologies or cellular stress associated with hypoxic situations. More particularly, it relates to a new prognostic method on the evolution of a pathology or these stresses based on the use of such isoforms as biomarkers.
  • the invention therefore relates to biomarkers of pathologies and cellular stress associated with hypoxic situations, characterized in that it is one or more HIF-1 ⁇ TAG splice variants, at the transcriptional level or at the protein level, the pattern of 3 base pairs TAG being located between exons 1 and 2.
  • biomarkers are more specifically identified in a sample taken from a patient from the hypoxic tissue analyzed, hereinafter also referred to as "pathological sample” or in a biological fluid sample such as blood or urine, in particular for non-pathological situations.
  • the invention also relates to an in vitro method, for establishing a prognosis for example of a patient's survival, characterized in that it is applied to a pathological sample of a patient suffering from a disease with dysregulation of homeostasis. of oxygen and that it comprises the use as a biomarker, at the transcriptional level or at the protein level, of one or more HIF-1 ⁇ TAG splice variants, the 3-base pair motif TAG being situated between the exons 1 and 2.
  • the prognostic method defined above is characterized in that the quantification relates to the mRNAs of said variants.
  • the quantification is carried out by RQ-PCR.
  • said prognostic method is characterized in that the quantification relates to the protein variants.
  • Quantification is then preferably carried out by immunohistochemical methods, using antibodies specific for said isoforms.
  • the quantification of protein variants is performed by mass spectrometry.
  • the prognostic method defined above is of major interest in the medical field and especially in oncology.
  • the application of the method of the invention is of considerable value for the monitoring and implementation of in place of a treatment adapted to the case to be treated.
  • an increase, in the pathological sample (invasive adenocarcinoma) tested, of the level of the HIF-I ⁇ variant TAG quantified with respect to a reference value, is indicative of a greater Tumor aggressiveness.
  • said increase is indicative of a high probability of the occurrence of metastases.
  • lymph node status was found to be associated with expression of the TAG HIF-1 ⁇ variant.
  • Histopronotic grade of tumors appeared to be associated with the total expression of HIF-l ⁇ , that of HIF-l ⁇ variants TAG and HIF-l ⁇ 516 .
  • Immunohistochemical expression by adenocarcinomas of estrogen and progesterone receptors has been found to be inversely correlated with the expression of HIF-1 ⁇ variants TAG and HIF-1 ⁇ 516 .
  • the method of prognosis of the invention thus has a great interest in evaluating the risk of development of the disease, the stage of the disease, its progression or its remission over time, the probability of metastasis, survival without metastasis, the effectiveness of a chemotherapy treatment, radiotherapy and / or hormone therapy.
  • the method of the invention is also advantageously usable in the case of cellular stress such as those observed during sports effort, whatever the category of effort.
  • the invention also provides a kit for implementing the above prognostic method.
  • a kit for implementing the above prognostic method.
  • Such a kit is characterized in that it comprises:
  • FIGS. 1 to 7 represent, respectively: FIG. 1, the combination of primers and probes used to detect the mRNAs of all the HIF-l ⁇ transcripts and of 4 isoforms resulting from alternative splicing; Figures 2 to 6, the relationship between the tissue type and the expression profile of HIF-1 ⁇ isoforms; FIG. 7, a Kaplan-Meier plot illustrating the survival without metastasis in breast cancer patients as a function of the level of HIF-1CC TAG mRNA.
  • Trained pathologist physicians are required to collect fresh tissue fragments immediately after the intraoperative diagnosis. They are immediately stored in liquid nitrogen at -80 ° C. Immunodetection studies are carried out on tissue sections 5 microns thick.
  • Ventana Gene II with Ventana kits (Ventana, Arlington, Arizona).
  • the number of microvessels in the most vascularized areas (called hot spots) is estimated using an x20 lens with a Zeiss Axioplan microscope.
  • the average value of the number of vessels of the 4 fields is retained as the final value.
  • Frozen tissues (25 to 50 mg) were homogenized in 0.5 mL of Trizol reagent (Life Technologies), with a lysis matrix D, in a FastPrep machine (Q BlOgene), for 6 cycles of 30 sec at 6 m / s.
  • Chloroform 100 ⁇ L is added to each sample and mixed vigorously for 15 seconds, and incubated for 3 minutes. at room temperature.
  • the phases are separated by centrifugation (12000 g for 15 min at 4 ° C), and the aqueous phase is transferred to a clean tube.
  • Isopropanol 250 ⁇ L is added to each of the samples, which is then mixed by inversion and incubated for 10 minutes. at room temperature.
  • RNA pellet is recovered by centrifugation (12000 g for 10 min at 4 ° C), washed with 1 mL of ice-cold 75% ethanol, air-dried, and it is resuspended in 15 ⁇ l of RNase-free distilled water.
  • the RNA concentration is determined spectrophotometrically by measuring the optical density at 260 nm.
  • One ⁇ g of RNA is subjected to reverse transcription with 200 U of MMLV reverse transcriptase, following the EAC protocol (Gabert et al., 2003).
  • the final cDNA is diluted to a final volume of 50 ⁇ L.
  • the cDNA of HEK 293 cells is amplified using the following primers, located in exons 1 and 2: sense sequence (SEQ ID No. 1),
  • the conditions of the PCR amplification are: 35 cycles of 30 s at 95 ° C, 1 min. at 55 ° C, 1 min. at 72 ° C and a last elongation at 72 ° C for 10 min.
  • the PCR product was separated by electrophoresis on a 2% agarose gel.
  • the interesting bands are cut, purified (High Pure Purification kit, Roche Diagnosis) and cloned into the pCRII TOPO vector (TOPO-TA cloning kit,
  • the amplification and quantification of the HIF-1 ⁇ variants is carried out on the MX3000P system (Stratagene).
  • the combination of primers and probes used to detect the mRNAs of four known alternative splicing isoforms is illustrated in Figure 1.
  • the given scheme illustrates the combination of primers and probes used for the detection of mRNAs of 4 alternative splicing variants. of HIF-l ⁇ .
  • Each box represents an exon numbered from 1 to 15.
  • the primers are designated by an arrowhead and the probes by a thick continuous line.
  • the mRNA of the wild-type HIF-l ⁇ sequence (HIF-l ⁇ w ⁇ ) consists of 15 exons and 14 introns.
  • HIF-l ⁇ 827 and HIF-l ⁇ 736 by alternative splicing of exons 13-15 (HIF-l ⁇ 736 ), by alternative splicing of exons 11-13 (HIF-l ⁇ 557 ), and by alternative splicing of exons 10- 13 (HIF-l ⁇ 516).
  • the primers of exons 5 and 6 (star) are suitable for the quantification of all the transcripts known today for HIF-l ⁇ sequences, including HIF-l ⁇ wt .
  • the primer pairs of exons 13 and 15, 11 and 13, and 10 and 13 are suitable for the specific detection of HIF-l ⁇ variants 736, HIF-l ⁇ and HIF-l ⁇ 557 516 respectively.
  • the primers of exons 1 and 2 allow the detection of the mRNA of the two isoforms HIF-l ⁇ 827 and HIF-l ⁇ 736 (designated HIF-1 ⁇ TAG in these results).
  • Table 1 details the oligonucleotide sequences of the primers and probes used as well as their position on the exons to detect and amplify splice variants of HIF-l ⁇ mRNAs.
  • the TBP gene is amplified.
  • TATA Binding Protein The transcript of the TBP gene is used as a control gene
  • the amplifications are carried out with 5 .mu.l of diluted cDNA, in a total volume of 25 .mu.l containing 12.5 .mu.l of TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) and each of the sense and antisense primers and the probe.
  • the concentration of primers and probes for each amplicon was optimized (Table 1).
  • the conditions of the RQ-PCR reaction for the amplification of the genes are as follows: 50 ° C. for 2 min., Denaturation step of 10 min. at 95 ° C. followed by 50 cycles of 30 s at 95 ° C., 1 min of hybridization and extension at 60 ° C. for all the transcripts, except for HIF-1 ⁇ TAG , with 1 min. at 62 ° C.
  • RQ-PCR reactions are performed in duplicate on the cDNA of each sample. Standard curves for quantification were plotted using splice variant specific plasmid dilutions ranging from 10 6 to 1 copy, and the copy number (NC) of each isoform was determined.
  • the results of the amplifications are expressed by RQ-PCR in the form of the NC ratio of each isoform of HIF-l ⁇ / NC of the control gene, also called normalized copy number ( NCN), with TBP as a control gene.
  • Samples containing an NC of TBP ⁇ 500 copies are considered to be of poor quality and are excluded from the study.
  • the specificity of the PCR amplifications was previously verified by means of sequencing the PCR products.
  • Bonferroni Since the expression level of breast cancer samples has a non-Gaussian distribution, non-parametric tests are used.
  • An average of 16.9 (standard deviation ⁇ 5.1) lymph nodes is found in excision of axillary lymph nodes, and 22 patients have metastatic lymph nodes. All patients underwent axillary lymph node excision, combined with local excision with margins of safety or a mastectomy, in the same ward.
  • Post-surgical treatment includes radiotherapy and chemotherapy for large and / or advanced tumors performed by the same group of oncologists. The duration of the follow-up varies from 9 to 162 months. The 2004 records show that, of 53 patients, 22 patients relapsed, of whom 18 died, and 7 survived. Survival without metastases is calculated as the duration after the operation until the date of metastasis.
  • HIF-l ⁇ mRNAs The level of expression of HIF-l ⁇ mRNAs was determined in each of 82 normal breast tissue samples or benign lesions and adenocarcinomas. Splice variants of HIF-l ⁇ were detected in all normal tissue samples or benign lesions and breast adenocarcinomas at varying levels.
  • Figures 2 to 6 show the distribution of HIF-1 ⁇ mRNA expression levels for each tissue category.
  • HIF-1 ⁇ TAG mRNA is the most dominant isoform of all HIF-l ⁇ transcripts in all tissues, whereas only low levels of HIF-l ⁇ isoforms are found 736 , HIF-l ⁇ 516 and HIF-l ⁇ 557 .
  • the level of expression of the HIF-1 ⁇ TAG splice variant mRNA is similar to the total expression level of the HIF-l ⁇ sequences.
  • the level of expression of the mRNA of the splice variants of HIF-l ⁇ 736 and HIF-l ⁇ 516 is 100 times lower than that of HIF-l ⁇ TAG
  • the level of expression of the HIF-variant mRNA is l ⁇ 557 is 1000 times lower than that of HIF-l ⁇ TAG .
  • HIF-l ⁇ variants we then study the presence of correlations between the level of mRNA of HIF-l ⁇ variants and the clinicopathological characteristics of tumors in order to test certain hypotheses concerning function.
  • the mRNA level of each HIF-l ⁇ variant was determined in tumor samples from 53 breast cancer patients, and compared to lymph node status, tumor grade, tumor size, the status of estrogen receptors (ERs) and progesterone receptor (PR) status. It is also compared to the microvascular density of tumors.
  • ERs estrogen receptors
  • PR progesterone receptor
  • Estrogen receptor status negative 16 14.2 (7.3) 0.024 20.8 (11.9) 0.005 0.25 (0 19) 0.06 0.03 (0.03) 0.002 0.004 (0.007) 0.015 positive 32 (8.8) 12.7 (17.1) 0.25 (0.31) 0.02 (0.02) 0.002 (0.002)
  • Progesterone receptor negative status 24 11.8 (7.3) NS 20.08 (17.8) 0.033 0.23 (0.19) 0.08 0.03 0.03 0.012 0.000 ( 0.006) 0.08 positive 26 10.8 (9.4) 11.3 (12.3) 0, 2 (0.34) 0.01 (0.01) 0.002 (0.002)
  • HIF-l ⁇ TAG mRNA only 0.037.
  • the presence of peritumoral vascular emboli is correlated with the total mRNA level of the HIF-l ⁇ sequences
  • HIF-1 ⁇ TAG and HIF-1 ⁇ 516 mRNA levels are inversely correlated with the status of ERs and PRs. There is no significant association between the levels of HIF-l ⁇ mRNA studied and the microvascular size or density of the tumors.
  • ER estrogen receptor
  • the level of expression of other HIF-1 ⁇ transcripts is not associated with prognosis (not shown).
  • the level of HIF-l ⁇ TAG mRNA is not a significant independent prognostic variable.
  • Figure 7 is a Kaplan-Meier chart for breast cancer patients and illustrates the survival without metastases as a function of HIF-1 ⁇ TAG mRNA level.

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Abstract

The invention relates to the use of one or more HIF-lαTAG splicing variants, wherein the TAG motif is between exons 1 and 2, as transcriptional-level or protein-level biomarkers for pathological conditions or for cellular stress associated with hypoxic situations.

Description

Biomarqueurs de situations hypoxiques et applications Biomarkers of hypoxic situations and applications
L' invention se rapporte à des biomarqueurs pour des pathologies ou du stress cellulaire associés à des processus hypoxiques et a plus particulièrement pour objet une méthode in vitro pour le pronostic notamment de survie chez des patients souffrant de telles pathologies ou de pronostic de récidive dans le cas de cancers.The invention relates to biomarkers for pathologies or cellular stress associated with hypoxic processes and more particularly relates to an in vitro method for the prognosis including survival in patients suffering from such pathologies or prognosis of recurrence in the body. case of cancer.
La capacité des cellules à répondre à une diminution de la pression partielle en oxygène est essentielle à la fois pour un développement normal de l'embryon et la physiologie postnatale.The ability of cells to respond to a decrease in oxygen partial pressure is essential for both normal embryo development and postnatal physiology.
L'hypoxie joue aussi un rôle majeur dans la physiopathologie de maladies telles que le cancer.Hypoxia also plays a major role in the pathophysiology of diseases such as cancer.
Le facteur HIF-I (hypoxia inducible factor-1) est un régulateur exprimé en réponse à une diminution de la pression partielle en oxygène cellulaire. Ce facteur active, en particulier, les gènes impliqués dansThe HIF-I factor (hypoxia inducible factor-1) is a regulator expressed in response to a decrease in the cellular oxygen partial pressure. This active factor, in particular, the genes involved in
1' angiogénèse . Il constitue un régulateur principal d'un grand nombre de gènes contrôlant l' homéostasie de l'oxygène chez de nombreux mammifères.Angiogenesis. It is a major regulator of a large number of genes controlling oxygen homeostasis in many mammals.
Ainsi, HIF-I modifie la transcription de gènes impliqués dans l' érythropoïèse, le métabolisme du fer, la régulation du pH, l' angiogénèse et le métabolisme du glucose.Thus, HIF-I modifies the transcription of genes involved in erythropoiesis, iron metabolism, pH regulation, angiogenesis and glucose metabolism.
Les protéines codées par ces gènes augmentent l'apport d'oxygène ou activent les voies métaboliques alternatives qui ne nécessitent pas d'oxygène. Des travaux récents ont montré que ces protéines sont impliquées dans la progression des tumeurs.The proteins encoded by these genes increase the intake of oxygen or activate alternative metabolic pathways that do not require oxygen. Recent work has shown that these proteins are involved in the progression of tumors.
HIF-I est une protéine composée de 2 sous-unités HIF-lα et HIF-lβ/ARNT. Ces sous-unités appartiennent à la superfamille des facteurs de transcription bHLH (basic helix-loop-helix) contenant un domaine PAS (PER-ARNT- SIM) .HIF-I is a protein composed of 2 subunits HIF-lα and HIF-1β / ARNT. These subunits belong to the superfamily of the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors containing a PAS domain (PER-ARNT-SIM).
HIF-lβ est une sous-unité commune à plusieurs facteurs de transcription, alors que HIF-lα est uniquement présente dans HIF-I. Il s'agit de la seule sous-unité régulée par l'oxygène qui détermine l'activité de HIF-I. L'hypoxie régule la stabilité de HIF-lα et affecte également sa localisation dans la cellule, sa capacité à lier l'ADN et la fonction de l'activité transcriptionnelle du complexe HIF-I.HIF-1β is a common subunit to several transcription factors, whereas HIF-1 is only present in HIF-I. It is the only oxygen-regulated subunit that determines the activity of HIF-I. Hypoxia regulates the stability of HIF-lα and also affects its location in the cell, its ability to bind DNA, and the function of the transcriptional activity of the HIF-I complex.
HIF-lα est composée de 826 acides aminés. Sa partie N- terminale contient les domaines bHLH et PAS qui sont essentiels pour la liaison à l'ADN et la dimérisation et sa partie carboxy-terminale contient deux domaines de transactivation et un signal de localisation nucléaire.HIF-lα is composed of 826 amino acids. Its N-terminal part contains the bHLH and PAS domains which are essential for DNA binding and dimerization and its carboxy-terminal part contains two transactivation domains and a nuclear localization signal.
La partie médiane comporte un domaine Pro-Ser-Thr de dégradation de l'oxygène (ODD, acides aminés 401-603), qui est responsable de la stabilité de HIF-lα. La régulation du messager de HIF-lα n'a été que récemment documentée .The middle portion has a Pro-Ser-Thr domain of oxygen degradation (ODD, amino acids 401-603), which is responsible for the stability of HIF-lα. The regulation of the HIF-lα messenger has only recently been documented.
HIF-lα est codée par le locus HIFlA situé sur le chromosome 14q21-q24, qui code pour 15 exons résultant en un transcrit principal de 8 kb environ.HIF-lα is encoded by the HIF1A locus on chromosome 14q21-q24, which codes for 15 exons resulting in a main transcript of about 8 kb.
Les exons codent pour des domaines à fonctionnalités différentes. Ainsi, l'exon 2 code pour le domaine bHLH, alors que les exons 3 à 8 codent pour le domaine PAS. La région carboxy-terminale, qui comprend les domaines de transactivation et de stabilité des protéines, est codée par les exons 9 à 15.Exons encode domains with different functionalities. Thus, exon 2 codes for the bHLH domain, whereas exons 3 to 8 encode the PAS domain. The carboxy-terminal region, which comprises the transactivation and protein stability domains, is coded by exons 9 to 15.
Sept variants d'épissage alternatif ou isoformes de HIF- la ont été rapportés. Des activités différentes ont été décrites pour ces isoformes dans les lignées cellulaires humaines .Seven alternative splice variants or isoforms of HIF-1a have been reported. Different activities have been described for these isoforms in human cell lines.
HIF-lα est similaire au type sauvage HIF-lα, mais comporte 3 paires de bases additionnelles (TAG) , situées à la jonction entre les exons 1 et 2, ce qui entraîne une différence de 2 acides aminés en amont du domaine bHLH.HIF-lα is similar to wild type HIF-lα, but has 3 additional base pairs (TAGs), located at the junction between exons 1 and 2, resulting in a difference of 2 amino acids upstream of the bHLH domain.
HIF-lα736 est caractérisé par l'absence de l'exon 14, ce qui produit un décalage du cadre de lecture et introduit un codon stop dans la séquence codante après le motifHIF-lα 736 is characterized by the absence of exon 14, which produces a shift of the reading frame and introduces a stop codon into the coding sequence after the motif
Ile735. Cette isoforme conserve toute la structure, à l'exception du domaine C terminal de transactivationIsland 735 . This isoform retains the entire structure, except for the C terminal transactivation domain
(TAD) et d'une partie du domaine à propriétés inhibitrices (ID) . - A -(TAD) and a part of the domain with inhibitory properties (ID). - AT -
Des travaux ont montré que HIF-lCC827 et HIF-lCC736 activent le promoteur du gène VEGF dans des conditions d'hypoxie.Work has shown that HIF-1CC 827 and HIF-1CC 736 activate the VEGF gene promoter under hypoxia conditions.
HIF-lα557, qui est induit par l'ion Zn, est dépourvu de l'exon 12 et HIF-lCC516 des exons 11 et 12. HIF-lCC557 (HIF- IaZ) et HIF-lα516 fonctionnent in vitro comme des isoformes dominants négatifs de HIF-I.HIF-lα 557 , which is induced by the Zn ion, lacks exon 12 and HIF-1CC 516 of exons 11 and 12. HIF-1CC 557 (HIF-IaZ) and HIF-1α 516 function in vitro as dominant negative isoforms of HIF-I.
HIF-lα785 est dépourvu de l'exon 11 dans le domaine ODD. L' isoforme est régulée en amont par le 12-myristate acétate-13, les espèces réactives d'oxygène et elle est également induite par la chaleur et des stress oxydatifs dans des conditions normoxiques. Ce variant contient tous les domaines fonctionnels et agit comme activateur transcriptionnel . HIF-lCC785 augmente la croissance tumorale in vivo dans le modèle animal.HIF-lα 785 does not have exon 11 in the ODD domain. The isoform is upstream regulated by 12-myristate acetate-13, reactive oxygen species and is also induced by heat and oxidative stress under normoxic conditions. This variant contains all the functional domains and acts as a transcriptional activator. HIF-1CC 785 increases tumor growth in vivo in the animal model.
L' isoforme HIF-lCC417 est dépourvue de l'exon 10 et des domaines de transactivation . Cette isoforme fonctionne comme un partenaire de HIF-lβ.The HIF-1CC 417 isoform lacks exon 10 and transactivation domains. This isoform functions as a HIF-lβ partner.
La dernière isoforme hHIF-CCTe est spécifiquement exprimée dans le testicule humain. Il s'agit d'un régulateur dominant négatif de la fonction HIF-I.The last hHIF-CCTe isoform is specifically expressed in the human testis. It is a dominant negative regulator of the HIF-I function.
Les données de la littérature sur ces isoformes sont issues d'études ayant porté sur des lignées cellulaires humaines in vitro, mais n'apportent aucune information sur l'expression de ces isoformes in vivo et sur leur fonction biologique, notamment dans le cancer humain. Les travaux des inventeurs ont au contraire porté sur des biopsies de tissus humains et ont concerné l'étude de l'expression de certaines isoformes de HIF-lα et de leur fonction biologique dans les pathologies avec dérégulation de l' homéostasie de l'oxygène, comme le cancer. Ils ont ainsi mis en évidence une expression différentielle des ARNm de certaines isoformes de HIF-lα dans certains adénocarcinomes invasifs mammaires.The literature data on these isoforms are derived from studies on human cell lines in vitro, but do not provide any information on the expression of these isoforms in vivo and on their biological function, particularly in human cancer. The work of the inventors has instead focused on biopsies of human tissues and concerned the study of the expression of certain isoforms of HIF-lα and their biological function in pathologies with deregulation of oxygen homeostasis, like cancer. They thus demonstrated a differential expression of the mRNAs of certain isoforms of HIF-lα in certain mammary invasive adenocarcinomas.
En comparant les niveaux d'expression des isoformes dans des lésions bénignes et des adénocarcinomes invasifs, il est ainsi apparu, de manière surprenante, que certaines isoformes étaient surexprimées dans les adénocarcinomes invasifs. De même, il est apparu que certaines isoformes étaient indicatives d'une plus grande agressivité tumorale .By comparing isoform expression levels in benign lesions and invasive adenocarcinomas, it was surprisingly found that some isoforms were overexpressed in invasive adenocarcinomas. Similarly, it was found that some isoforms were indicative of greater tumor aggressiveness.
On mesure l'intérêt de tels résultats qui permettent, notamment, d'améliorer l'évaluation de l'agressivité du développement d'un processus pathologique, tout particulièrement de l'agressivité tumorale et d'orienter des stratégies thérapeutiques par les équipes médicales impliquées dans le traitement de la pathologie.We measure the interest of such results which make it possible, in particular, to improve the evaluation of the aggressiveness of the development of a pathological process, in particular of the tumor aggressiveness and to guide therapeutic strategies by the medical teams involved. in the treatment of pathology.
Ces résultats ont été également confirmés dans des situations de stress cellulaire.These results were also confirmed in situations of cellular stress.
L' invention vise donc à fournir des biomarqueurs de pathologies ou de stress cellulaires associés à des situations hypoxiques. Elle vise plus particulièrement une nouvelle méthode de pronostic sur l'évolution d'une pathologie ou de ces stress basée sur l'utilisation de telles isoformes comme biomarqueurs.The invention therefore aims to provide biomarkers of pathologies or cellular stress associated with hypoxic situations. More particularly, it relates to a new prognostic method on the evolution of a pathology or these stresses based on the use of such isoforms as biomarkers.
Elle porte également sur de nouveaux outils pour la réalisation de cette méthode et pour l'exploitation des résultats obtenus aux fins de suivi et de traitement de ces pathologies.It also covers new tools for the realization of this method and for the exploitation of the results obtained for the purpose of monitoring and treating these pathologies.
Elle concerne ainsi en outre les applications médicales de cette méthode, en particulier en oncologie, avec le développement de thérapies innovantes ciblées sur les isoformes de HIF-lα surexprimées comme évoqué ci-dessus.It also relates to the medical applications of this method, in particular in oncology, with the development of innovative therapies targeted on HIF-lα isoforms overexpressed as mentioned above.
L' invention vise donc des biomarqueurs de pathologies et de stress cellulaires associés à des situations hypoxiques, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-lαTAG, au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique, le motif de 3 paires de base TAG étant situé entre les exons 1 et 2.The invention therefore relates to biomarkers of pathologies and cellular stress associated with hypoxic situations, characterized in that it is one or more HIF-1α TAG splice variants, at the transcriptional level or at the protein level, the pattern of 3 base pairs TAG being located between exons 1 and 2.
Ces biomarqueurs sont plus spécialement identifiés dans un prélèvement chez un patient provenant du tissu hypoxique analysé, désigné également ci-après « échantillon pathologique » ou dans un prélèvement de fluide biologique tel que sang ou urine, notamment pour des situations non pathologiques. L'invention vise aussi une méthode in vitro, pour établir un pronostic par exemple de survie d'un patient, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à un échantillon pathologique d'un patient atteint d'une maladie avec dérégulation de l' homéostasie de l'oxygène et qu'elle comprend l'utilisation comme biomarqueur, au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique, d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-lαTAG, le motif de 3 paires de base TAG étant situé entre les exons 1 et 2.These biomarkers are more specifically identified in a sample taken from a patient from the hypoxic tissue analyzed, hereinafter also referred to as "pathological sample" or in a biological fluid sample such as blood or urine, in particular for non-pathological situations. The invention also relates to an in vitro method, for establishing a prognosis for example of a patient's survival, characterized in that it is applied to a pathological sample of a patient suffering from a disease with dysregulation of homeostasis. of oxygen and that it comprises the use as a biomarker, at the transcriptional level or at the protein level, of one or more HIF-1α TAG splice variants, the 3-base pair motif TAG being situated between the exons 1 and 2.
La méthode de pronostic de l'invention est plus particulièrement caractérisée en ce qu'elle comprend :The prognostic method of the invention is more particularly characterized in that it comprises:
- la quantification du ou des variants d'épissage HIF- lαTAG dans l'échantillon pathologique provenant dudit patient ;the quantification of the HIF-1 TAG splice variant (s) in the pathological sample from said patient;
- la comparaison à une valeur de référence définie comme la valeur médiane d'une pluralité de mesures de quantification des variants d'épissage HIF-lαTAG sur des échantillons pathologiques appartenant à des individus différents .comparison with a reference value defined as the median value of a plurality of measurements of HIF-1α TAG splice variants on pathological samples belonging to different individuals.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la méthode de pronostic définie ci-dessus est caractérisée en ce que la quantification porte sur les ARNm desdits variants .According to a preferred embodiment of the invention, the prognostic method defined above is characterized in that the quantification relates to the mRNAs of said variants.
De manière avantageuse, la quantification est effectuée par RQ-PCR. Selon un autre mode de réalisation, ladite méthode de pronostic est caractérisée en ce que la quantification porte sur les variants protéiques.Advantageously, the quantification is carried out by RQ-PCR. According to another embodiment, said prognostic method is characterized in that the quantification relates to the protein variants.
La quantification est alors effectuée de préférence par des méthodes immunohistochimiques, à l'aide d'anticorps spécifiques desdites isoformes.Quantification is then preferably carried out by immunohistochemical methods, using antibodies specific for said isoforms.
Des plaques sur lesquelles sont déposés les échantillons à analyser sont alors incubées avec les anticorps, la quantité d'anticorps fixée est avantageusement déterminée selon des techniques classiques.Plates on which the samples to be analyzed are deposited are then incubated with the antibodies, the amount of antibody fixed is advantageously determined according to conventional techniques.
En variante, la quantification des variants protéiques est réalisée par spectrométrie de masse.Alternatively, the quantification of protein variants is performed by mass spectrometry.
La méthode de pronostic définie ci-dessus présente un intérêt majeur dans le domaine médical et tout particulièrement en oncologie.The prognostic method defined above is of major interest in the medical field and especially in oncology.
Dans le cas par exemple du cancer du sein, qui représente le cancer le plus fréquent chez la femme, dont l'incidence est en augmentation constante, l'application de la méthode de l'invention présente une valeur considérable pour le suivi et la mise en place d'un traitement adapté au cas à traiter.In the case, for example, of breast cancer, which is the most common cancer in women, whose incidence is constantly increasing, the application of the method of the invention is of considerable value for the monitoring and implementation of in place of a treatment adapted to the case to be treated.
En effet, à ce jour, seuls cinq paramètres pronostiques consensuels sont reconnus et permettent de définir trois catégories de risques chez les patientes opérées d'un cancer du sein : risque « faible », « intermédiaire » ou « élevé » de décès ou de survenue de récidive. Quatre de ces paramètres reposent sur des critères cliniques et histologiques : âge des patientes, taille tumorale, grade histologique et emboles vasculaires péritumoraux . Un seul critère repose sur un test immunochimique et correspond à l'expression de la molécule RER2/neu par les cellules tumorales évaluée à l'aide de kits commerciaux pour des techniques d' immunohistochimie ou d'hybridation in situ.In fact, to date, only five consensus prognostic parameters have been recognized and make it possible to define three risk categories for patients who have had breast cancer: "low", "intermediate" or "low" risk. "High" death or recurrence. Four of these parameters are based on clinical and histological criteria: age of patients, tumor size, histological grade and peritumoral vascular emboli. A single criterion is based on an immunochemical test and corresponds to the expression of the RER2 / neu molecule by the tumor cells evaluated using commercial kits for immunohistochemistry or in situ hybridization techniques.
Ces méthodes et produits existants ne permettent toutefois qu'une appréciation approximative du pronostic des patientes atteintes d'un cancer du sein. En particulier, la pratique montre que des patientes appartenant au groupe dit « à risque intermédiaire » reçoivent des traitements inadaptés (hormonothérapie versus chimiothérapie) .These existing methods and products, however, allow only an approximate assessment of the prognosis of patients with breast cancer. In particular, practice shows that patients belonging to the so-called "intermediate risk" group receive inadequate treatment (hormone therapy versus chemotherapy).
Comme illustré par les résultats rapportés dans les exemples, une augmentation, dans l'échantillon pathologique (adénocarcinome invasif) testé, du taux du ou des variants HIF-lαTAG quantifiés par rapport à une valeur de référence, est indicative d'une plus grande agressivité tumorale.As illustrated by the results reported in the examples, an increase, in the pathological sample (invasive adenocarcinoma) tested, of the level of the HIF-Iα variant TAG quantified with respect to a reference value, is indicative of a greater Tumor aggressiveness.
Ainsi, selon l'état de la tumeur, ladite augmentation est indicative d'une forte probabilité de l'apparition de métastases .Thus, depending on the state of the tumor, said increase is indicative of a high probability of the occurrence of metastases.
Dans le groupe des adénocarcinomes, le statut ganglionnaire s'est révélé associé à l'expression du variant HIF-lαTAG. Le grade histopronostique des tumeurs est apparu associé à l'expression totale de HIF-lα, à celle des variants HIF-lαTAG et HIF-lα516. L'expression immunohistochimique par les adénocarcinomes des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone se sont révélés inversement corrélés à l'expression des variants HIF-lαTAG et HIF-lα516.In the adenocarcinoma group, lymph node status was found to be associated with expression of the TAG HIF-1α variant. Histopronotic grade of tumors appeared to be associated with the total expression of HIF-lα, that of HIF-lα variants TAG and HIF-lα 516 . Immunohistochemical expression by adenocarcinomas of estrogen and progesterone receptors has been found to be inversely correlated with the expression of HIF-1α variants TAG and HIF-1α 516 .
La méthode de pronostic de l'invention présente ainsi un grand intérêt pour évaluer le risque de développement de la maladie, le stade de la maladie, sa progression ou sa rémission dans le temps, la probabilité de métastases, la survie sans métastase, l'efficacité d'un traitement de chimiothérapie, radiothérapie et/ou hormonothérapie .The method of prognosis of the invention thus has a great interest in evaluating the risk of development of the disease, the stage of the disease, its progression or its remission over time, the probability of metastasis, survival without metastasis, the effectiveness of a chemotherapy treatment, radiotherapy and / or hormone therapy.
La méthode de l'invention est également avantageusement utilisable dans le cas de stress cellulaires tels que ceux observés au cours de l'effort sportif, quelle que soit la catégorie d'effort.The method of the invention is also advantageously usable in the case of cellular stress such as those observed during sports effort, whatever the category of effort.
Selon un autre aspect, l'invention vise également un kit pour la mise en œuvre de la méthode de pronostic ci- dessus . Un tel kit est caractérisé en ce qu' il comprend :In another aspect, the invention also provides a kit for implementing the above prognostic method. Such a kit is characterized in that it comprises:
- des amorces de PCR ou des anticorps anti-HIF-lαTAG le cas échéant immobilisés sur un support solide,PCR primers or anti-HIF-1α TAG antibodies, if appropriate immobilized on a solid support,
- des réactifs nécessaires pour la quantification des variants d'épissage HIF-lαTAG au niveau des ARNm ou au niveau protéique .reagents necessary for the quantification of HIF-lα TAG splice variants at the level of the mRNAs or at the protein level.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent qui font référence aux figures 1 à 7, qui représentent, respectivement : la figure 1, la combinaison d'amorces et de sondes utilisée pour détecter les ARNm de l'ensemble des transcrits HIF-lα et de 4 isoformes résultant d'épissage alternatif; les figures 2 à 6, la relation entre le type de tissu et le profil d'expression des isoformes de HIF-la; - la figure 7, un graphique selon Kaplan-Meier illustrant la survie sans métastase chez des patientes atteintes d'un cancer du sein en fonction du niveau d'ARNm de HIF-lCCTAG.Other characteristics and advantages of the invention are given in the following examples which make FIGS. 1 to 7, which represent, respectively: FIG. 1, the combination of primers and probes used to detect the mRNAs of all the HIF-lα transcripts and of 4 isoforms resulting from alternative splicing; Figures 2 to 6, the relationship between the tissue type and the expression profile of HIF-1α isoforms; FIG. 7, a Kaplan-Meier plot illustrating the survival without metastasis in breast cancer patients as a function of the level of HIF-1CC TAG mRNA.
Matériels et méthodesMaterials and methods
Patients et échantillons de tissus mammairesPatients and breast tissue samples
On soumet des échantillons de tissus mammaires, obtenus conformément aux recommandations éthiques locales en vigueur, à une congélation instantanée dans de l'azote liquide. On fixe dans le formol des coupes parallèles de tissus, on les inclut dans de la paraffine à température ambiante, puis on les traite de façon habituelle. On procède à une analyse d'échantillons tissulaires prélevés sur 29 cas normaux/bénins et 53 carcinomes mammaires invasifs. On obtient des échantillons de tissus mammaires normaux à partir de tissus non tumoraux adjacents, prélevés sur des patientes traitées pour un cancer du sein. On prélève des lésions bénignes sur des patientes subissant une opération chirurgicale pour une adénose ou un adénofibrome . On diagnostique des carcinomes entre le 9 septembre 1989 et le le mai 1996. Aucune des 53 patientes n'a fait l'objet d'une radiothérapie ou d'une chimiothérapie avant l'opération chirurgicale. La durée du suivi varie de 9 à 162 mois (moyenne = 80 mois, écart-type = 43) . À des fins statistiques, on choisit un nombre approximativement égal de patientes à survie globale longue (n = 31) et à survie globale courte (n = 22) .Breast tissue specimens, obtained in accordance with local ethical guidelines, are subjected to instantaneous freezing in liquid nitrogen. Parallel sections of tissue are fixed in formalin, embedded in paraffin at room temperature, and then treated in the usual way. Tissue samples from 29 normal / benign cases and 53 invasive breast carcinomas were analyzed. Normal breast tissue samples are obtained from adjacent non-tumor tissues from patients treated for breast cancer. Benign lesions are taken from patients undergoing surgery for adenosis or adenofibroma. Carcinomas were diagnosed between 9 September 1989 and May 1996. None of the 53 patients underwent radiotherapy or chemotherapy before surgery. The duration of the follow-up varies from 9 to 162 months (average = 80 months, standard deviation = 43). For statistical purposes, an approximately equal number of patients with long overall survival (n = 31) and short overall survival (n = 22) are selected.
Facteurs cliniques et pathologiques On obtient le statut des ganglions lymphatiques, la taille des tumeurs, la présence d' emboles vasculaires péritumoraux ainsi que le type et le grade histologiques des tumeurs à partir de rapports pathologiques. On détermine le statut des récepteurs aux œstrogènes et à la progestérone par méthode immunohistochimique sur des coupes incluses dans de la paraffine.Clinical and Pathological Factors Lymph node status, tumor size, presence of peritumoral vascular emboli, and histological type and grade of tumors are obtained from pathological reports. The status of estrogen and progesterone receptors is determined by immunohistochemistry on sections embedded in paraffin.
Densité microvasculaire des tumeursMicrovascular Density of Tumors
On fait prélever, par des médecins pathologistes, des fragments de tissus frais juste après le diagnostic peropératoire . On les conserve aussitôt dans de l'azote liquide à -800C. On réalise des études d' immunodétection sur coupes tissulaires de 5 micromètres d'épaisseurTrained pathologist physicians are required to collect fresh tissue fragments immediately after the intraoperative diagnosis. They are immediately stored in liquid nitrogen at -80 ° C. Immunodetection studies are carried out on tissue sections 5 microns thick.
(Cryostat, Leica CM 3050, Leica Microsystèmes, Rueil Malmaison, France) . On effectue des réactions à(Cryostat, Leica CM 3050, Leica Microsystems, Rueil Malmaison, France). We make reactions to
1 ' immunoperoxydase en utilisant un anticorps monoclonalImmunoperoxidase using a monoclonal antibody
(5, 6 E) anti-humain de souris CD31/PECAM (Novocastra,(5, 6 E) mouse anti-human CD31 / PECAM (Novocastra,
Tebu, Le Perray-en-Yvelines, France) et l'automateTebu, Le Perray-en-Yvelines, France) and the automaton
Ventana Gène II avec des kits Ventana (Ventana, Tucson, Arizona) . On évalue le nombre de microvaisseaux dans les zones les plus vascularisées (appelées points chauds) en utilisant un objectif x20 avec un microscope Zeiss Axioplan. On retient la valeur moyenne du nombre de vaisseaux des 4 champs en tant que valeur finale.Ventana Gene II with Ventana kits (Ventana, Tucson, Arizona). The number of microvessels in the most vascularized areas (called hot spots) is estimated using an x20 lens with a Zeiss Axioplan microscope. The average value of the number of vessels of the 4 fields is retained as the final value.
Extraction de l'ARN et transcription inverseRNA extraction and reverse transcription
On homogénéise les tissus congelés (25 à 50 mg) dans 0,5 mL de réactif Trizol (Life Technologies), avec une matrice de lyse D, dans une machine FastPrep (Q BlOgene) , pendant 6 cycles de 30 s à un réglage de 6 m/s. On ajoute du chloroforme (100 μL) à chaque échantillon et on mélange vigoureusement pendant 15 s, puis on laisse incuber pendant 3 min. à température ambiante. On sépare les phases par centrifugation (12 000 g pendant 15 min. à 4°C), et on transfère la phase aqueuse dans un tube propre. On ajoute de 1 ' isopropanol (250 μL) à chacun des échantillons, que l'on mélange ensuite par inversion et que l'on laisse incuber pendant 10 min. à température ambiante. On récupère un culot d'ARN par centrifugation (12 000 g pendant 10 min. à 4°C), on le lave avec 1 mL d'éthanol à 75% refroidi sur de la glace, on le sèche à l'air, et on le remet en suspension dans 15 μL d'eau distillée exempte de RNase. On détermine la concentration en ARN par spectrophotométrie, en mesurant la densité optique à 260 nm. On soumet 1 μg d'ARN à une transcription inverse avec 200 U de transcriptase inverse MMLV, en suivant le protocole EAC (Gabert et al., 2003). On dilue l'ADNc final dans un volume final de 50 μL .Frozen tissues (25 to 50 mg) were homogenized in 0.5 mL of Trizol reagent (Life Technologies), with a lysis matrix D, in a FastPrep machine (Q BlOgene), for 6 cycles of 30 sec at 6 m / s. Chloroform (100 μL) is added to each sample and mixed vigorously for 15 seconds, and incubated for 3 minutes. at room temperature. The phases are separated by centrifugation (12000 g for 15 min at 4 ° C), and the aqueous phase is transferred to a clean tube. Isopropanol (250 μL) is added to each of the samples, which is then mixed by inversion and incubated for 10 minutes. at room temperature. An RNA pellet is recovered by centrifugation (12000 g for 10 min at 4 ° C), washed with 1 mL of ice-cold 75% ethanol, air-dried, and it is resuspended in 15 μl of RNase-free distilled water. The RNA concentration is determined spectrophotometrically by measuring the optical density at 260 nm. One μg of RNA is subjected to reverse transcription with 200 U of MMLV reverse transcriptase, following the EAC protocol (Gabert et al., 2003). The final cDNA is diluted to a final volume of 50 μL.
Identification des variants d'épissage (quantification) On utilise des plasmides pCR3 contenant les séquences HIF-lα827 et HIF-lα736 avec une insertion TAG, fournis par J. Pouyssegur (Centre Lacassagne, Nice,Identification of splice variants (quantification) pCR3 plasmids containing the HIF-lα 827 and HIF-lα 736 sequences are used with a TAG insertion, provided by J. Pouyssegur (Center Lacassagne, Nice,
France). Pour les autres variants d'épissage, on amplifie l'ADNc de cellules HEK 293 en utilisant les amorces suivantes, situées dans les exons 1 et 2 : séquence sens (SEQ ID N° 1),France). For the other splice variants, the cDNA of HEK 293 cells is amplified using the following primers, located in exons 1 and 2: sense sequence (SEQ ID No. 1),
5 ' -CCGGCGGCGCGAACGACAAG-3 et séquence anti-sens (SEQ ID N° 2),5'-CCGGCGGCGCGAACGACAAG-3 and antisense sequence (SEQ ID NO: 2),
5 ' -TGCGAACTCACATTATGTGG-3 ' , ou les amorces situées dans les exons 10 et 14 : séquence sens (SEQ ID N° 3),5 '-TGCGAACTCACATTATGTGG-3', or the primers located in exons 10 and 14: sense sequence (SEQ ID NO: 3),
5 ' -TGACCCTGCACTCAATCAAG-3 ' et séquence anti-sens (SEQ ID N° 4),5'-TGACCCTGCACTCAATCAAG-3 'and antisense sequence (SEQ ID NO: 4),
5 ' -AGTAGCTGCATGTACGTCTG-3 ' .5 '-AGTAGCTGCATGTACGTCTG-3'.
Les conditions de l'amplification par PCR sont : 35 cycles de 30 s à 95°C, 1 min. à 55°C, 1 min. à 72°C et une dernière élongation à 72°C pendant 10 min.The conditions of the PCR amplification are: 35 cycles of 30 s at 95 ° C, 1 min. at 55 ° C, 1 min. at 72 ° C and a last elongation at 72 ° C for 10 min.
Après l'amplification, on sépare le produit de PCR par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2%. On découpe les bandes intéressantes, on les purifie (trousse High Pure Purification, Roche Diagnosis) et on les clone dans le vecteur pCRII TOPO (trousse de clonage TOPO-TA,After amplification, the PCR product was separated by electrophoresis on a 2% agarose gel. The interesting bands are cut, purified (High Pure Purification kit, Roche Diagnosis) and cloned into the pCRII TOPO vector (TOPO-TA cloning kit,
Invitrogen) . Après purification des plasmides (plasmideInvitrogen). After purification of the plasmids (plasmid
Nucleospin, Macherey Nagel) et vérification des séquences, on prépare des dilutions en série à 1/10 dans l'ARN d'.E. coli (Roche Diagnosis) afin de générer une courbe étalon de RQ-PCR.Nucleospin, Macherey Nagel) and sequence verification, 1/10 serial dilutions were prepared in the E. RNA. coli (Roche Diagnosis) to generate a standard RQ-PCR curve.
Analyse PCR quantitative en temps réelReal time quantitative PCR analysis
On réalise l'amplification et la quantification des variants HIF-la sur le système MX3000P (Stratagene) . La combinaison d'amorces et de sondes utilisée pour détecter les ARNm de quatre isoformes à épissage alternatif connus est illustrée sur la figure 1. Le schéma donné illustre la combinaison des amorces et sondes utilisées pour la détection des ARNm de 4 variants d' épissage alternatif de HIF-lα. Chaque boite représente un exon numéroté de 1 à 15. Les amorces sont désignées par une tête de flèche et les sondes par une ligne continue épaisse. L 'ARNm de la séquence HIF-lα de type sauvage (HIF-lαwτ) se compose de 15 exons et de 14 introns .The amplification and quantification of the HIF-1α variants is carried out on the MX3000P system (Stratagene). The combination of primers and probes used to detect the mRNAs of four known alternative splicing isoforms is illustrated in Figure 1. The given scheme illustrates the combination of primers and probes used for the detection of mRNAs of 4 alternative splicing variants. of HIF-lα. Each box represents an exon numbered from 1 to 15. The primers are designated by an arrowhead and the probes by a thick continuous line. The mRNA of the wild-type HIF-lα sequence (HIF-lα wτ ) consists of 15 exons and 14 introns.
Les variants indiqués dans la figure 1 sont générés par une insertion TAG entre 1 ' exon 1 et 1 ' exon 2The variants shown in Figure 1 are generated by a TAG insertion between exon 1 and exon 2
(HIF-lα827 et HIF-lα736) , par épissage alternatif des exons 13-15 (HIF-lα736) , par épissage alternatif des exons 11-13 (HIF-lα557) , et par épissage alternatif des exons 10-13 (HIF-lα516) .(HIF-lα 827 and HIF-lα 736 ), by alternative splicing of exons 13-15 (HIF-lα 736 ), by alternative splicing of exons 11-13 (HIF-lα 557 ), and by alternative splicing of exons 10- 13 (HIF-lα 516).
Les amorces des exons 5 et 6 (étoile) sont appropriées à la quantification de tous les produits de transcription connus aujourd'hui des séquences HIF-lα, y compris HIF-lαwt.The primers of exons 5 and 6 (star) are suitable for the quantification of all the transcripts known today for HIF-lα sequences, including HIF-lα wt .
Les paires d'amorces des exons 13 et 15, 11 et 13, et 10 et 13 sont appropriées à la détection spécifique des variants HIF-lα736, HIF-lα557 et HIF-lα516 respectivement.The primer pairs of exons 13 and 15, 11 and 13, and 10 and 13 are suitable for the specific detection of HIF-lα variants 736, HIF-lα and HIF-lα 557 516 respectively.
Les amorces des exons 1 et 2 permettent la détection de 1 'ARNm des deux isoformes HIF-lα827 et HIF-lα736 (désignées par HIF-lαTAG dans ces résultats) .The primers of exons 1 and 2 allow the detection of the mRNA of the two isoforms HIF-lα 827 and HIF-lα 736 (designated HIF-1α TAG in these results).
Le tableau 1 détaille les séquences oligonucléotidiques des amorces et des sondes utilisées ainsi que leur position sur les exons pour détecter et amplifier les variants d'épissage des ARNm de HIF-lα. 1 1FF33,, aammoorrccee sseennss ; R, amorce antisens ; P, sonde oligonucléotidique . Table 1 details the oligonucleotide sequences of the primers and probes used as well as their position on the exons to detect and amplify splice variants of HIF-lα mRNAs. 1 1 FF 33 ,, aammoorrccee sseennss; R, antisense primer; P, oligonucleotide probe.
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On procède en outre à une amplification du gène TBPIn addition, the TBP gene is amplified.
(TATA Binding Protein) . On utilise le produit de transcription du gène TBP en tant que gène de contrôle(TATA Binding Protein). The transcript of the TBP gene is used as a control gene
(Ginestier et al.), comme décrit précédemment (Bieche et al.) .(Ginestier et al.), As previously described (Bieche et al.).
On réalise les amplifications avec 5 μL d'ADNc dilué, dans un volume total de 25 μL contenant 12,5 μL de TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) et chacune des amorces sens et antisens ainsi que la sonde. On a optimisé la concentration des amorces et des sondes pour chaque amplicon (tableau 1) .The amplifications are carried out with 5 .mu.l of diluted cDNA, in a total volume of 25 .mu.l containing 12.5 .mu.l of TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) and each of the sense and antisense primers and the probe. The concentration of primers and probes for each amplicon was optimized (Table 1).
Les conditions de la réaction de RQ-PCR pour l'amplification des gènes sont les suivantes : 500C pendant 2 min., étape de dénaturation de 10 min. à 95°C suivie de 50 cycles de 30 s à 95°C, 1 min d'hybridation et d'extension à 600C pour tous les produits de transcription, sauf pour HIF-lαTAG, avec 1 min. à 62°C. On réalise les réactions de RQ-PCR en double, sur 1 'ADNc de chaque échantillon. On trace des courbes étalon, pour la quantification, en utilisant des dilutions de plasmide spécifiques du variant d'épissage allant de 106 à 1 copies, et on détermine le nombre de copies (NC) de chaque isoforme. Afin de corriger les variations de qualité/quantité d'ARN, on exprime les résultats des amplifications par RQ-PCR sous la forme du rapport NC de chaque isoforme de HIF-lα/NC du gène de contrôle, également appelé nombre de copies normalisé (NCN) , avec TBP en tant que gène de contrôle. On considère que les échantillons contenant un NC de TBP < 500 copies sont de mauvaise qualité, et on les exclut de l'étude. On a vérifié préalablement la spécificité des amplifications par PCR au moyen d'un séquençage des produits de PCR.The conditions of the RQ-PCR reaction for the amplification of the genes are as follows: 50 ° C. for 2 min., Denaturation step of 10 min. at 95 ° C. followed by 50 cycles of 30 s at 95 ° C., 1 min of hybridization and extension at 60 ° C. for all the transcripts, except for HIF-1α TAG , with 1 min. at 62 ° C. RQ-PCR reactions are performed in duplicate on the cDNA of each sample. Standard curves for quantification were plotted using splice variant specific plasmid dilutions ranging from 10 6 to 1 copy, and the copy number (NC) of each isoform was determined. In order to correct the variations in quality / quantity of RNA, the results of the amplifications are expressed by RQ-PCR in the form of the NC ratio of each isoform of HIF-lα / NC of the control gene, also called normalized copy number ( NCN), with TBP as a control gene. Samples containing an NC of TBP <500 copies are considered to be of poor quality and are excluded from the study. The specificity of the PCR amplifications was previously verified by means of sequencing the PCR products.
Analyse statistiqueStatistical analysis
On évalue les différences entre les groupes d'échantillons de tissus mammaires (tissu normaux ou lésions bénignes/carcinome canalaire/carcinome lobulaire) en termes de leur concentration en ARNm de HIF-lα, en utilisant le test ANOVA et le test post-hoc deDifferences between groups of mammary tissue samples (normal tissue or benign lesions / ductal carcinoma / lobular carcinoma) are evaluated in terms of their HIF-lα mRNA concentration, using the ANOVA test and the post-hoc test.
Bonferroni . Étant donné que le niveau d'expression des échantillons de cancer du sein présente une distribution non Gaussienne, on utilise des tests non paramétriquesBonferroni. Since the expression level of breast cancer samples has a non-Gaussian distribution, non-parametric tests are used.
(de Spearman, Mann-Whitney et Kruskal-Wallis) pour l'analyse de la corrélation avec les paramètres cliniques et pathologiques. La survie sans métastase est calculée comme l'intervalle de temps séparant la date de chirurgie et la date de survenue des métastases. On utilise le test du log-rank de Kaplan-Meier et les modèles de régression (univariée et multivariée) de Cox pour comparer la survie et identifier des prédicteurs de survie, p ≤ 0,05 définit la signification statistique. On réalise toutes les analyses statistiques à l'aide du logiciel SPSS, version 13.0.1 (SPSS Inc.) .(from Spearman, Mann-Whitney and Kruskal-Wallis) for the analysis of correlation with clinical and pathological parameters. Survival without metastasis is calculated as the time interval between the date of surgery and the date of metastasis. Using the Kaplan-Meier log-rank test and Cox's univariate and multivariate regression models to compare survival and identify predictors of survival, p ≤ 0.05 defines the statistical significance. All statistical analyzes are performed using SPSS software, version 13.0.1 (SPSS Inc.).
RésultatsResults
Paramètres cliniques et pathologiquesClinical and pathological parameters
Les caractéristiques des tissus sont résumées dans le tableau 2. On prélève des tissus mammaires normaux ou lésions bénignes sur 29 patientes âgées de 12 à 79 ans (moyenne = 44,7 ans, écart-type = 16,9). Les échantillons tumoraux sont des adénocarcinomes invasifs deThe tissue characteristics are summarized in Table 2. Normal breast tissue or benign lesions are taken from 29 patients aged 12 to 79 years (mean = 44.7 years, SD = 16.9). The samples tumors are invasive adenocarcinomas of
53 patientes souffrant de cancer du sein précoce53 patients with early breast cancer
(stade I, II ou III), diagnostiqué entre le 9 septembre(stage I, II or III), diagnosed between 9 September
1989 et le le mai 1996, dans le Service de gynécologie oncologique de l'Hôpital de la Conception à Marseille. On prélève les échantillons tumoraux sur des patientes âgées de 30 à 84 ans (moyenne = 54 ans, écart-type = 11,4) . On identifie chacune des zones respectives au microscope et les échantillons mammaires sont disséqués par le médecin pathologiste juste après exérèse, avant d'être soumis à une congélation instantanée dans de l'azote liquide. A des fins statistiques, on choisit un nombre approximativement égal de patientes à survie globale longue (> 90 mois) (n = 31) et à survie globale courte (< 60 mois) (n = 22) . La taille moyenne des tumeurs est de 23,47 mm (écart-type = 12,3) et 3 tumeurs ont une largeur ≤ 10 mm, 25 ont une largeur > 10 mm et ≤ 20 mm, 23 ont une largeur > 20 mm et ≤ 50 mm, et 2 ont une largeur > 50 mm. On procède à un examen histologique des échantillons chirurgicaux sur des coupes incluses dans de la paraffine colorées à 1 ' hématoxyline-éosine-saffran . Les tumeurs correspondent à des carcinomes canalaires (n = 41) et à des carcinomes lobulaires (n = 12) . On réévalue le grade des tumeurs, initialement évalué selon le score de Scarff Bloom et Richardson, en utilisant le score de Elston et Ellis. On trouve une moyenne de 16,9 (écart-type ± 5,1) ganglions lymphatiques dans l'excision des ganglions axillaires, et 22 patientes ont des ganglions métastatiques . Toutes les patientes subissent une excision au niveau des ganglions axillaires, combinée à une excision locale large avec marges de sécurité ou à une mastectomie, dans le même service. Le traitement post-chirurgical comprend une radiothérapie et une chimiothérapie pour les tumeurs larges et/ou de stade avancé, réalisées par le même groupe d' oncologues . La durée du suivi varie de 9 à 162 mois. Les registres de 2004 montrent que, sur 53 patientes, 22 patientes ont rechuté, parmi lesquelles 18 sont décédées, et 7 ont survécu. On calcule la survie sans métastases comme étant la durée après l'opération jusqu'à la date d'apparition de métastases. 1989 and May 1996, in the Department of Gynecology Oncology Conception Hospital in Marseille. Tumor specimens are collected from patients aged 30 to 84 years (mean = 54 years, SD = 11.4). Each of the respective areas is identified under the microscope and the mammary specimens are dissected by the pathologist immediately after excision, before being subjected to instantaneous freezing in liquid nitrogen. For statistical purposes, an approximately equal number of patients with long (> 90 months) (n = 31) and short (<60 months) overall survival (n = 22) were selected. The average tumor size is 23.47 mm (standard deviation = 12.3) and 3 tumors have a width ≤ 10 mm, 25 have a width> 10 mm and ≤ 20 mm, 23 have a width> 20 mm and ≤ 50 mm, and 2 have a width> 50 mm. Histological examination of the surgical specimens was performed on sections embedded in paraffin stained with hematoxylin-eosin-saffran. The tumors correspond to ductal carcinomas (n = 41) and lobular carcinomas (n = 12). The grade of tumors, initially evaluated according to the Scarff Bloom and Richardson score, is re-evaluated using the Elston and Ellis score. An average of 16.9 (standard deviation ± 5.1) lymph nodes is found in excision of axillary lymph nodes, and 22 patients have metastatic lymph nodes. All patients underwent axillary lymph node excision, combined with local excision with margins of safety or a mastectomy, in the same ward. Post-surgical treatment includes radiotherapy and chemotherapy for large and / or advanced tumors performed by the same group of oncologists. The duration of the follow-up varies from 9 to 162 months. The 2004 records show that, of 53 patients, 22 patients relapsed, of whom 18 died, and 7 survived. Survival without metastases is calculated as the duration after the operation until the date of metastasis.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0001
Niveau d'expression différentielle des variants d'épissage de HIF-lα dans les tissus mammaires normaux ou lésions bénignes et les adénocarcinomesDifferential expression level of HIF-lα splice variants in normal breast tissues or benign lesions and adenocarcinomas
On détermine le niveau d'expression des ARNm de HIF-lα dans chacun des 82 échantillons de tissus mammaires normaux ou lésions bénignes et des adénocarcinomes. On détecte des variants d'épissage de HIF-lα dans tous les échantillons de tissus normaux ou lésions bénignes et des adénocarcinomes du sein à des niveaux variables.The level of expression of HIF-lα mRNAs was determined in each of 82 normal breast tissue samples or benign lesions and adenocarcinomas. Splice variants of HIF-lα were detected in all normal tissue samples or benign lesions and breast adenocarcinomas at varying levels.
Les figures 2 à 6 donnent la distribution des niveaux d'expression des ARNm de HIF-lα pour chaque catégorie de tissu.Figures 2 to 6 show the distribution of HIF-1α mRNA expression levels for each tissue category.
L ' ARNm de HIF-lαTAG est l' isoforme la plus dominante de tous les produits de transcription de HIF-lα dans l'ensemble des tissus, alors que l'on ne trouve que de faibles niveaux des isoformes de HIF-lα736, HIF-lα516 et HIF-lα557. Le niveau d'expression de 1 'ARNm des variants d'épissage HIF-lαTAG est similaire au niveau d'expression totale des séquences HIF-lα. Le niveau d'expression de l'ARNm des variants d'épissage de HIF-lα736 et HIF-lα516 est 100 fois inférieur à celui de HIF-lαTAG, et le niveau d'expression de l'ARNm du variant HIF-lα557 est 1 000 fois inférieur à celui de HIF-lαTAG. On n'observe aucune différence statistiquement significative du niveau d'expression totale des séquences HIF-lα entre les tissus normaux ou lésions bénignes et les adénocarcinomes (figure 2) . De même, le niveau d'expression des ARNm de HIF-lαTAG et de HIF-lα557 est similaire entre les deux catégories de tissus (figures 3 et 4) . Il est intéressant de noter que le niveau des ARNm de HIF-lα516 est plus élevé dans le groupe des carcinomes canalaires que dans celui des tissus normaux ou lésions bénignes (p = 0,012) (figure 5), bien que leur niveau d'expression soit très faible et qu'on l'augmente de façon très modeste. Les ARNm de HIF-lα736 ont tendance à présenter une corrélation avec le phénotype malin, mais sans signification statistique (p = 0,053) (figure 6).HIF-1α TAG mRNA is the most dominant isoform of all HIF-lα transcripts in all tissues, whereas only low levels of HIF-lα isoforms are found 736 , HIF-lα 516 and HIF-lα 557 . The level of expression of the HIF-1α TAG splice variant mRNA is similar to the total expression level of the HIF-lα sequences. The level of expression of the mRNA of the splice variants of HIF-lα 736 and HIF-lα 516 is 100 times lower than that of HIF-lα TAG , and the level of expression of the HIF-variant mRNA is lα 557 is 1000 times lower than that of HIF-lα TAG . There is no statistically significant difference in the level of total expression of HIF-lα sequences between normal or benign lesions and adenocarcinomas (Figure 2). Similarly, the expression level of mRNA of HIF-lα and HIF-TAG lα 557 is similar between the two classes of tissues (Figures 3 and 4). It is interesting to note that the level of HIF-lα 516 mRNA is more high in the ductal carcinoma group than in normal tissue or benign lesions (p = 0.012) (Figure 5), although their level of expression is very low and increased very modestly. The HIF-1α 736 mRNAs tend to correlate with the malignant phenotype, but without statistical significance (p = 0.053) (Figure 6).
Corrélation entre les variants d'épissage de HIF-lα et les caractéristiques clinicopathologiques des tumeursCorrelation between HIF-lα splice variants and clinicopathological features of tumors
On étudie ensuite la présence de corrélations entre le niveau d'ARNm des variants de HIF-lα et les caractéristiques clinicopathologiques des tumeurs dans le but de tester certaines hypothèses concernant la fonction. On détermine le niveau d'ARNm de chaque variant de HIF-lα dans des échantillons tumoraux de 53 patientes atteintes de cancer du sein, et on le compare au statut des ganglions lymphatiques, au grade de la tumeur, à la taille de la tumeur, au statut des récepteurs aux œstrogènes (ER) et au statut des récepteurs à la progestérone (PR) . On le compare également à la densité microvasculaire des tumeurs.We then study the presence of correlations between the level of mRNA of HIF-lα variants and the clinicopathological characteristics of tumors in order to test certain hypotheses concerning function. The mRNA level of each HIF-lα variant was determined in tumor samples from 53 breast cancer patients, and compared to lymph node status, tumor grade, tumor size, the status of estrogen receptors (ERs) and progesterone receptor (PR) status. It is also compared to the microvascular density of tumors.
Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 3. Le tableau 3 ci-après donne plus particulièrement les caractéristiques clinicopathologiques et la densité microvasculaire des tumeurs ainsi que la relation qui existe avec le niveau d'ARNm des variants d'épissage de HIF-la (n = 53) . Tableau 3The results obtained are given in Table 3. Table 3 below gives more particularly the clinicopathological characteristics and the microvascular density of the tumors as well as the relationship which exists with the level of mRNA of the splice variants of HIF-1 ( n = 53). Table 3
HIF-lα HIF-lα™ HIF-lα736 HIF-lα516 HIF-lα557 totalHIF-lα HIF-lα ™ HIF-lα 736 HIF-lα 516 HIF-lα 557 total
Nb deNumber of
Caractéristique moyenne (écart- moyenne I noyenne moyenne patientes moyenne P type) P (écart-type) P (écart- P (écart- P (écart- type) type) type)Mean characteristic (mean deviation I average patient mean kernel P type) P (standard deviation) P (deviation - P (deviation - P (standard deviation) type) type)
Statut des ganglions lymphatiques négatif 25 10 (9) NS 10,9 (10,9) 0,037 0, 19 (0, 29) NS 0, 02 (0,03) NS 0, 003 (0,006) NS positif 22 12,8 (7,8) 21,1 (19,21) 0, 26 (0, 28) 0, 03 (0,03) 0, 002 (0,002)Lymph node status negative 25 10 (9) NS 10.9 (10.9) 0.037 0, 19 (0, 29) NS 0.02 (0.03) NS 0.003 (0.006) NS positive 22 12.8 (7.8) 21.1 (19.21) 0.26 (0.28) 0.33 (0.03) 0.002 (0.002)
Taille de la tumeurSize of the tumor
≤ 20 mm 28 10,2 (8,3) NS 12,4 (13,2) NS 0, 17 (0, 26) NS o, 02 (0,03) NS 0, 003 (0,005) NS≤ 20 mm 28 10.2 (8.3) NS 12.4 (13.2) NS 0, 17 (0, 26) NS o, 02 (0.03) NS 0, 003 (0.005) NS
> 20 mm 25 11,8 (8,3) 17,3 (17,4) 0, 25 (0 28) o, 02 (0,02) 0, 002 (0,002)> 20 mm 11.8 (8.3) 17.3 (17.4) 0.25 (O 28) 0.02 (0.02) 0.002 (0.002)
GradeGrade
1, 2 35 9,2 (7,7) 0,048 11,8 (12,34) 0,048 0, 19 (0 3) NS 0, 02 (0,02) 0,02 0, 002 (0,002) NS1, 2 9.2 (7.7) 0.048 11.8 (12.34) 0.048 0, 19 (0 3) NS 0.02 (0.02) 0.02 0.002 (0.002) NS
3 17 14,6(8,7) 21,48 (19,4) 0, 23 (0 2) 0, 03 (0,03) 0, 004 (0,007)3 17 14.6 (8.7) 21.48 (19.4) 0.23 (0 2) 0.03 (0.03) 0.004 (0.007)
Emboles vasculaire péritumoraux absent 12 8 (9) 0,028 9,64 (10,1) NS 0, 19 (0 36) NS 0, 01 (0,02) 0,008 0, 002 (0,002) NS présent 40 11,9 (8,06) 16,6 (16,6) 0, 20 (0 24) 0, 03 (0,03) 0, 003 (0,005)Peritumoral vascular emboli absent 12 8 (9) 0.028 9.64 (10.1) NS 0, 19 (0 36) NS 0, 01 (0.02) 0.008 0, 002 (0.002) NS present 40 11.9 (8) , 06) 16.6 (16.6) 0.20 (024) 0.03 (0.03) 0.003 (0.005)
Statut des récepteurs aux œstrogènes négatif 16 14,2 (7,3) 0,024 20,8 (11,9) 0,005 0, 25 (0 19) 0,06 0, 03 (0,03) 0,002 0, 004 (0,007) 0,015 positif 32 10 (8,8) 12,7 (17,1) 0, 20 (0 ,31) 0, 02 (0,02) 0, 002 (0,002)Estrogen receptor status negative 16 14.2 (7.3) 0.024 20.8 (11.9) 0.005 0.25 (0 19) 0.06 0.03 (0.03) 0.002 0.004 (0.007) 0.015 positive 32 (8.8) 12.7 (17.1) 0.25 (0.31) 0.02 (0.02) 0.002 (0.002)
Statut des récepteurs à la progestérone négatif 24 11,8 (7,3) NS 20,08 (17,8) 0,033 0, 23 (0 ,19) 0,08 0, 03 (0,03) 0,012 0, 004 (0,006) 0,08 positif 26 10,8 (9,4) 11,3 (12,3) 0, 2 (0, 34) 0 01 (0,01) 0 002 (0,002)Progesterone receptor negative status 24 11.8 (7.3) NS 20.08 (17.8) 0.033 0.23 (0.19) 0.08 0.03 0.03 0.012 0.000 ( 0.006) 0.08 positive 26 10.8 (9.4) 11.3 (12.3) 0, 2 (0.34) 0.01 (0.01) 0.002 (0.002)
Densité microvasculaire de la tumeurMicrovascular density of the tumor
(faible/forte) NS NS NS NS NS (weak / strong) NS NS NS NS NS
Le statut des ganglions lymphatiques est significativement associé au niveau d'ARNm de HIF-lαTAG seulement (p = 0,037) . On trouve une association à signification statistique entre le grade de la tumeur et le niveau d'ARNm total des séquences HIF-lα (p = 0,048), de HIF-lαTAG (p = 0,048) et de HIF-lα516 (p = 0,02). La présence d'emboles vasculaires péritumoraux est corrélée avec le niveau d'ARNm total des séquences HIF-lαThe status of the lymph nodes is significantly associated with the level of HIF-lα TAG mRNA only (p = 0.037). A statistically significant association was found between tumor grade and total mRNA level of HIF-lα (p = 0.048), HIF-lα TAG (p = 0.048) and HIF-lα 516 (p = 0.02). The presence of peritumoral vascular emboli is correlated with the total mRNA level of the HIF-lα sequences
(p = 0,028) et avec le niveau d'ARNm de HIF-lα516 (p = 0,008) . On observe également, de façon particulièrement intéressante, que les niveaux d'ARNm de HIF-lαTAG et de HIF-lα516 sont inversement corrélés avec le statut des ER et des PR. On ne trouve aucune association significative entre les niveaux d'ARNm de HIF-lα étudiés et la taille ou la densité microvasculaire des tumeurs.(p = 0.028) and with the HIF-1α 516 mRNA level (p = 0.008). It is also particularly interesting to observe that the HIF-1α TAG and HIF-1α 516 mRNA levels are inversely correlated with the status of ERs and PRs. There is no significant association between the levels of HIF-lα mRNA studied and the microvascular size or density of the tumors.
Expression des variants d'épissage de HIF-lα et survie des patientesExpression of splice variants of HIF-lα and survival of patients
La force de l'association des caractéristiques clinicopathologiques des tumeurs (statut des ganglions lymphatiques, taille de la tumeur, grade de la tumeur, emboles vasculaires péritumoraux, statut des ER et des PR, densité microvasculaire de la tumeur) et du niveau d'expression des ARNm de HIF-lα avec la survie sans métastases est présentée dans le tableau 4 ci-dessous. Ce tableau donne les résultats d'une analyse de la survie sans métastases basée sur une régression univariée et multivariée de Cox, chez des patientes atteintes de cancer du sein, en tenant compte des paramètres clinicopathologiques, de la densité microvasculaire de la tumeur et du niveau des ARNm de HIF-lα.
Figure imgf000028_0001
The strength of the association of clinicopathological features of tumors (lymph node status, tumor size, tumor grade, peritumoral vascular emboli, ER and RA status, microvascular tumor density) and level of expression HIF-lα mRNA with survival without metastasis is shown in Table 4 below. This table gives the results of a metastasis-free survival analysis based on univariate and multivariate Cox regression in breast cancer patients, taking into account clinicopathological parameters, microvascular tumor density, and HIF-lα mRNAs.
Figure imgf000028_0001
Les résultats obtenus montrent que le statut des ganglions lymphatiques (p = 0,003), le statut des récepteurs aux œstrogènes (ER) (p = 0,035), le statut des récepteurs à la progestérone (p = 0,004) et le niveau des ARNm de HIF-lαTAG (p = 0,03) sont significativement prédictifs de la survie sans métastases .The results obtained show lymph node status (p = 0.003), estrogen receptor (ER) status (p = 0.035), progesterone receptor status (p = 0.004), and HIF mRNA level. -lα TAG (p = 0.03) are significantly predictive of survival without metastases.
Les patientes atteintes de cancer du sein qui présentent un haut niveau d'expression d'ARNm de HIF-lαTAG (seuil médian = 9,95) ont beaucoup plus de risques de rechuter. Le niveau d'expression des autres produits de transcription de HIF-lα n'est pas associé au pronostic (non représenté) .Breast cancer patients with high levels of HIF-lα TAG mRNA expression (median threshold = 9.95) have a much higher risk of relapse. The level of expression of other HIF-1α transcripts is not associated with prognosis (not shown).
L'analyse multivariée de Cox permet de déterminer que le statut des ganglions lymphatiques (p = 0,002) et le statut des PR (p = 0,025) sont des prédicteurs indépendants de la survie sans métastases. Le niveau d'ARNm de HIF-lαTAG n'est pas une variable pronostique indépendante significative.Multivariate Cox analysis determined that lymph node status (p = 0.002) and RA status (p = 0.025) were independent predictors of survival without metastasis. The level of HIF-lα TAG mRNA is not a significant independent prognostic variable.
La figure 7 est un graphique selon Kaplan-Meier pour des patientes atteintes de cancer du sein et il illustre la survie sans métastases en fonction du niveau d'ARNm de HIF-lαTAG Figure 7 is a Kaplan-Meier chart for breast cancer patients and illustrates the survival without metastases as a function of HIF-1α TAG mRNA level.
(seuil médian = 9, 95) chez les patientes atteintes de cancer du sein (p = 0,03). (median threshold = 9, 95) in breast cancer patients (p = 0.03).
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Claims

REVENDICATIONS
1 - Utilisation comme biomarqueurs au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique de pathologies ou du stress cellulaire associés à des situations hypoxiques, d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-lαTAG, le motif TAG étant situé entre les exons 1 et 2.1 - Use as biomarkers at the transcriptional level or at the protein level of pathologies or cellular stress associated with hypoxic situations, of one or more HIF-1α TAG splice variants, the TAG motif being located between exons 1 and 2.
2 - Méthode in vitro de pronostic de survie d'un patient, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à un échantillon pathologique d'un patient atteint d'une pathologie avec dérégulation de l' homéostasie de l'oxygène et qu'elle comprend l'utilisation comme biomarqueur, au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique, d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-lαTAG, le motif TAG étant situé entre les exons 1 et 2.2 - In vitro survival prognosis method of a patient, characterized in that it is applied to a pathological sample of a patient suffering from a pathology with dysregulation of oxygen homeostasis and that it comprises the use as a biomarker, at the transcriptional level or at the protein level, of one or more HIF-lα TAG splice variants, the TAG motif being located between exons 1 and 2.
3 - Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend : la quantification du ou des variants d'épissage dans l'échantillon provenant dudit patient ;3 - Method according to claim 2, characterized in that it comprises: the quantification of the splice variant or variants in the sample from said patient;
- la comparaison à une valeur de référence définie comme la valeur médiane d'une pluralité de mesures de quantification des variants d'épissage HIF-lαTAG sur des échantillons pathologiques appartenant à des individus différents.comparison with a reference value defined as the median value of a plurality of measurements of HIF-1α TAG splice variants on pathological samples belonging to different individuals.
4 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la quantification porte sur les ARNm desdits variants.4 - Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the quantification relates to the mRNA of said variants.
5 - Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que la quantification est effectuée par RQ-PCR. 6 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la quantification porte sur les variants protéiques.5 - Method according to claim 4, characterized in that the quantification is carried out by RQ-PCR. 6 - Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the quantification relates to the protein variants.
7 - Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que la quantification est effectuée par des méthodes d' immunohistochimie, à l'aide d'anticorps ou par spectrométrie de masse.7 - Method according to claim 6, characterized in that the quantification is carried out by immunohistochemistry methods, using antibodies or by mass spectrometry.
8 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est appliquée en oncologie.8 - Method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that it is applied in oncology.
9 - Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à un échantillon de tissu de cancer du sein.9 - Method according to claim 8, characterized in that it is applied to a sample of breast cancer tissue.
10 - Méthode selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce qu'une augmentation, dans l'échantillon testé, du taux du ou des variants quantifiés par rapport à une valeur de référence, est indicative d'une agressivité tumorale.10 - Method according to claim 8 or 9, characterized in that an increase in the sample tested, the rate of the quantified variant or variants relative to a reference value, is indicative of tumor aggressiveness.
11 - Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite augmentation est indicative d'une forte probabilité de métastases .11 - Method according to claim 10, characterized in that said increase is indicative of a high probability of metastasis.
12 - Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, pour mesurer l'efficacité d'un traitement .12 - Application of the method according to any one of claims 2 to 11, for measuring the effectiveness of a treatment.
13 - Kit pour la mise en œuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend :13 - Kit for implementing the method according to any one of claims 2 to 12, characterized in that it comprises:
- des amorces de PCR ou des anticorps anti-HIF-lαTAG le cas échéant immobilisés sur un support solide, - des réactifs nécessaires pour la quantification des variants d'épissage HIF-lαTAG au niveau des ARNm ou au niveau protéique . PCR primers or anti-HIF-1α TAG antibodies, if appropriate immobilized on a solid support, reagents necessary for the quantification of HIF-lα TAG splice variants at the level of the mRNAs or at the protein level.
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