FR2927092A1

FR2927092A1 - HYPOXIC SITUATIONS BIOMARKERS AND APPLICATIONS

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Publication number: FR2927092A1
Application number: FR0800557A
Authority: FR
Original assignee: LA MEDITERRANEE ETABLISSE, University of
Current assignee: LA MEDITERRANEE ETABLISSE, University of
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2009-08-07
Also published as: WO2009095897A1

Abstract

L'invention se rapporte à des biomarqueurs pour des pathologies ou du stress cellulaire associés à des processus hypoxiques et a plus particulièrement pour objet une méthode in vintro de pronostic notamment de survie chez des patients souffrant de telles pathologies ou de pronostic de récidive dans le cas de cancers. On utilise comme biomarqueurs au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique un ou plusieurs variants d'épissage HIF-1alpha<TAG>, le motif TAG étant situé entre les exons 1 et 2.The invention relates to biomarkers for pathologies or cellular stress associated with hypoxic processes and more particularly relates to an in vintro method of prognosis, in particular of survival in patients suffering from such pathologies or of prognosis of recurrence in the case of of cancers. One or more HIF-1alpha <TAG> splice variants are used as biomarkers at the transcriptional level or at the protein level, the TAG motif being located between exons 1 and 2.

Description

- 1 - Biomarqueurs de situations hypoxiques et applications - 1 - Biomarkers of hypoxic situations and applications

L'invention se rapporte à des biomarqueurs pour des pathologies ou du stress cellulaire associés à des processus hypoxiques et a plus particulièrement pour objet une méthode in vitro pour le pronostic notamment de survie chez des patients souffrant de telles pathologies ou de pronostic de récidive dans le cas de cancers. The invention relates to biomarkers for pathologies or cellular stress associated with hypoxic processes and more particularly relates to an in vitro method for the prognosis, in particular of survival in patients suffering from such pathologies or for the prognosis of recurrence in the disease. cancer cases.

La capacité des cellules à répondre à une diminution de la pression partielle en oxygène est essentielle à la fois pour un développement normal de l'embryon et la physiologie postnatale. L'hypoxie joue aussi un rôle majeur dans la physiopathologie de maladies telles que le cancer. The ability of cells to respond to a decrease in oxygen partial pressure is essential for both normal development of the embryo and postnatal physiology. Hypoxia also plays a major role in the pathophysiology of diseases such as cancer.

Le facteur HIF-1 (hypoxia inducible factor-l) est un 20 régulateur exprimé en réponse à une diminution de la pression partielle en oxygène cellulaire. Ce facteur active, en particulier, les gènes impliqués dans l'angiogénèse. Il constitue un régulateur principal d'un grand nombre de gènes contrôlant l'homéostasie de 25 l'oxygène chez de nombreux mammifères. HIF-1 (hypoxia inducible factor-1) is a regulator expressed in response to a decrease in cellular oxygen partial pressure. This factor activates, in particular, the genes involved in angiogenesis. It is a primary regulator of a large number of genes controlling oxygen homeostasis in many mammals.

Ainsi, HIF-1 modifie la transcription de gènes impliqués dans l'érythropoïèse, le métabolisme du fer, la régulation du pH, l'angiogénèse et le métabolisme du 30 glucose. Les protéines codées par ces gènes augmentent l'apport15 - 2 d'oxygène ou activent les voies métaboliques alternatives qui ne nécessitent pas d'oxygène. Des travaux récents ont montré que ces protéines sont impliquées dans la progression des tumeurs. Thus, HIF-1 alters the transcription of genes involved in erythropoiesis, iron metabolism, pH regulation, angiogenesis and glucose metabolism. The proteins encoded by these genes increase oxygen supply15 - 2 or activate alternative metabolic pathways that do not require oxygen. Recent work has shown that these proteins are involved in the progression of tumors.

HIF-1 est une protéine composée de 2 sous-unités HIF-la et HIF-1(3/ARNT. Ces sous-unités appartiennent à la superfamille des facteurs de transcription bHLH (basic helix-loop-helix) contenant un domaine PAS (PER-ARNT- SIM). HIF-1 is a protein composed of 2 subunits HIF-1a and HIF-1 (3 / ARNT. These subunits belong to the superfamily of bHLH (basic helix-loop-helix) transcription factors containing a PAS domain ( PER-ARNT-SIM).

HIF-1(3 est une sous-unité commune à plusieurs facteurs de transcription, alors que HIF-la est uniquement présente dans HIF-l. Il s'agit de la seule sous-unité régulée par l'oxygène qui détermine l'activité de HIF-l. L'hypoxie régule la stabilité de HIF-la et affecte également sa localisation dans la cellule, sa capacité à lier l'ADN et la fonction de l'activité transcriptionnelle du complexe HIF-1. HIF-1 (3 is a subunit common to several transcription factors, whereas HIF-1a is only present in HIF-1. It is the only subunit regulated by oxygen that determines the activity Hypoxia regulates the stability of HIF-1a and also affects its location in the cell, its ability to bind DNA and the function of the transcriptional activity of the HIF-1 complex.

HIF-la est composée de 826 acides aminés. Sa partie N-terminale contient les domaines bHLH et PAS qui sont essentiels pour la liaison à l'ADN et la dimérisation et sa partie carboxy-terminale contient deux domaines de transactivation et un signal de localisation nucléaire. HIF-1a is made up of 826 amino acids. Its N-terminal part contains the bHLH and PAS domains which are essential for DNA binding and dimerization and its carboxy-terminal part contains two transactivation domains and a nuclear localization signal.

La partie médiane comporte un domaine Pro-Ser-Thr de dégradation de l'oxygène (ODD, acides aminés 401-603), qui est responsable de la stabilité de HIF-la.30 - 3 La régulation du messager de HIF-la n'a été que récemment documentée. HIF-la est codée par le locus HIF1A situé sur le chromosome 14g2l-q24, qui code pour 15 exons résultant en 5 un transcrit principal de 8 kb environ. The middle part contains an oxygen degradation Pro-Ser-Thr domain (ODD, amino acids 401-603), which is responsible for the stability of HIF-la. 30 - 3 Regulation of the HIF-la n messenger has only recently been documented. HIF-1a is encoded by the HIF1A locus on chromosome 14g21-q24, which encodes 15 exons resulting in a major transcript of about 8 kb.

Les exons codent pour des domaines à fonctionnalités différentes. Ainsi, l'exon 2 code pour le domaine bHLH, alors que les exons 3 à 8 codent pour le domaine PAS. La 10 région carboxy-terminale, qui comprend les domaines de transactivation et de stabilité des protéines, est codée par les exons 9 à 15. The exons code for domains with different functionalities. Thus, exon 2 encodes the bHLH domain, while exons 3 to 8 encode the PAS domain. The carboxy-terminal region, which comprises the transactivation and stability domains of proteins, is encoded by exons 9 to 15.

Sept variants d'épissage alternatif ou isoformes de HIF- 15 la ont été rapportés. Des activités différentes ont été décrites pour ces isoformes dans les lignées cellulaires humaines. Seven alternative splice variants or isoforms of HIF-1a have been reported. Different activities have been described for these isoforms in human cell lines.

HIF-la$27 est similaire au type sauvage HIF-la, mais 20 comporte 3 paires de bases additionnelles (TAG), situées à la jonction entre les exons 1 et 2, ce qui entraîne une différence de 2 acides aminés en amont du domaine bHLH. HIF-la $ 27 is similar to wild type HIF-la, but 20 has 3 additional base pairs (TAGs), located at the junction between exons 1 and 2, resulting in a difference of 2 amino acids upstream of the bHLH domain .

HIF-1a736 est caractérisé par l'absence de l'exon 14, ce 25 qui produit un décalage du cadre de lecture et introduit un codon stop dans la séquence codante après le motif I1e735. Cette isoforme conserve toute la structure, à l'exception du domaine C terminal de transactivation (TAD) et d'une partie du domaine à propriétés 30 inhibitrices(ID). - 4 Des travaux ont montré que HIF-la827 et HIF-1a736 activent le promoteur du gène VEGF dans des conditions d'hypoxie. HIF-1a736 is characterized by the absence of exon 14, which produces a reading frame shift and introduces a stop codon into the coding sequence after the I1e735 motif. This isoform retains all of the structure except for the C terminal transactivation domain (TAD) and part of the inhibitory property (ID) domain. - 4 Work has shown that HIF-la827 and HIF-1a736 activate the promoter of the VEGF gene under conditions of hypoxia.

HIF-1a557, qui est induit par l'ion Zn, est dépourvu de 5 l'exon 12 et HIF-1a516 des exons 11 et 12. HIF-1a557 (HIF- laZ) et HIF-1a516 fonctionnent in vitro comme des isoformes dominants négatifs de HIF-l. HIF-la785 est dépourvu de l'exon 11 dans le domaine ODD. 10 L'isoforme est régulée en amont par le 12-myristate acétate-13, les espèces réactives d'oxygène et elle est également induite par la chaleur et des stress oxydatifs dans des conditions normoxiques. Ce variant contient tous les domaines fonctionnels et agit comme activateur 15 transcriptionnel. HIF-1a785 augmente la croissance tumorale in vivo dans le modèle animal. HIF-1a557, which is induced by the Zn ion, lacks exon 12 and HIF-1a516 from exons 11 and 12. HIF-1a557 (HIF-laZ) and HIF-1a516 function in vitro as dominant isoforms HIF-1 negatives. HIF-la785 lacks exon 11 in the ODD domain. The isoform is upstream regulated by 12-myristate acetate-13, reactive oxygen species and is also induced by heat and oxidative stresses under normoxic conditions. This variant contains all functional domains and acts as a transcriptional activator. HIF-1a785 increases tumor growth in vivo in the animal model.

L'isoforme HIF-la417 est dépourvue de l'exon 10 et des domaines de transactivation. Cette isoforme fonctionne 20 comme un partenaire de HIF-1(3. The HIF-la417 isoform lacks exon 10 and transactivation domains. This isoform functions as a partner of HIF-1 (3.

La dernière isoforme hHIF-aTe est spécifiquement exprimée dans le testicule humain. Il s'agit d'un régulateur dominant négatif de la fonction HIF-l. 25 Les données de la littérature sur ces isoformes sont issues d'études ayant porté sur des lignées cellulaires humaines in vitro, mais n'apportent aucune information sur l'expression de ces isoformes in vivo et sur leur 30 fonction biologique, notamment dans le cancer humain. - 5 The latest hHIF-aTe isoform is specifically expressed in the human testis. It is a dominant negative regulator of HIF-1 function. The data in the literature on these isoforms come from studies which have carried out on human cell lines in vitro, but do not provide any information on the expression of these isoforms in vivo and on their biological function, in particular in cancer. human. - 5

Les travaux des inventeurs ont au contraire porté sur des biopsies de tissus humains et ont concerné l'étude de l'expression de certaines isoformes de HIF-la et de leur fonction biologique dans les pathologies avec dérégulation de l'homéostasie de l'oxygène, comme le cancer. Ils ont ainsi mis en évidence une expression différentielle des ARNm de certaines isoformes de HIF-la dans certains adénocarcinomes invasifs mammaires. The work of the inventors, on the contrary, focused on biopsies of human tissues and concerned the study of the expression of certain isoforms of HIF-1α and of their biological function in pathologies with deregulation of oxygen homeostasis, like cancer. They have thus demonstrated a differential expression of the mRNAs of certain HIF-la isoforms in certain invasive mammary adenocarcinomas.

En comparant les niveaux d'expression des isoformes dans des lésions bénignes et des adénocarcinomes invasifs, il est ainsi apparu, de manière surprenante, que certaines isoformes étaient surexprimées dans les adénocarcinomes invasifs. De même, il est apparu que certaines isoformes étaient indicatives d'une plus grande agressivité tumorale. By comparing the expression levels of isoforms in benign lesions and invasive adenocarcinomas, it thus appeared, surprisingly, that certain isoforms were overexpressed in invasive adenocarcinomas. Likewise, it appeared that certain isoforms were indicative of greater tumor aggressiveness.

On mesure l'intérêt de tels résultats qui permettent, notamment, d'améliorer l'évaluation de l'agressivité du développement d'un processus pathologique, tout particulièrement de l'agressivité tumorale et d'orienter des stratégies thérapeutiques par les équipes médicales impliquées dans le traitement de la pathologie. We can measure the interest of such results which make it possible, in particular, to improve the assessment of the aggressiveness of the development of a pathological process, especially tumor aggressiveness and to guide therapeutic strategies by the medical teams involved. in the treatment of pathology.

Ces résultats ont été également confirmés dans des situations de stress cellulaire. These results have also been confirmed in situations of cellular stress.

L'invention vise donc à fournir des biomarqueurs de 30 pathologies ou de stress cellulaires associés à des situations hypoxiques. - 6 - Elle vise plus particulièrement une nouvelle méthode de pronostic sur l'évolution d'une pathologie ou de ces stress basée sur l'utilisation de telles isoformes comme biomarqueurs. The invention therefore aims to provide biomarkers for pathologies or cellular stresses associated with hypoxic situations. - 6 - It relates more particularly to a new method of prognosis on the evolution of a pathology or of these stresses based on the use of such isoforms as biomarkers.

Elle porte également sur de nouveaux outils pour la réalisation de cette méthode et pour l'exploitation des résultats obtenus aux fins de suivi et de traitement de ces pathologies. It also relates to new tools for carrying out this method and for using the results obtained for the purpose of monitoring and treating these pathologies.

Elle concerne ainsi en outre les applications médicales de cette méthode, en particulier en oncologie, avec le développement de thérapies innovantes ciblées sur les isoformes de HIF-la surexprimées comme évoqué ci-dessus. It thus also relates to the medical applications of this method, in particular in oncology, with the development of innovative therapies targeted on the isoforms of HIF-la overexpressed as mentioned above.

L'invention vise donc des biomarqueurs de pathologies et de stress cellulaires associés à des situations hypoxiques, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-laTAC, au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique, le motif de 3 paires de base TAG étant situé entre les exons 1 et 2. The invention is therefore aimed at biomarkers of pathologies and cellular stress associated with hypoxic situations, characterized in that it is one or more HIF-laTAC splicing variants, at the transcriptional level or at the protein level, the motif of 3 TAG base pairs being located between exons 1 and 2.

Ces biomarqueurs sont plus spécialement identifiés dans un prélèvement chez un patient provenant du tissu hypoxique analysé, désigné également ci-après échantillon pathologique ou dans un prélèvement de fluide biologique tel que sang ou urine, notamment pour des situations non pathologiques.30 - 7 These biomarkers are more specifically identified in a sample from a patient originating from the hypoxic tissue analyzed, also referred to below as a pathological sample or in a sample of biological fluid such as blood or urine, in particular for non-pathological situations.

L'invention vise aussi une méthode in vitro, pour établir un pronostic par exemple de survie d'un patient, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à un échantillon pathologique d'un patient atteint d'une maladie avec dérégulation de l'homéostasie de l'oxygène et qu'elle comprend l'utilisation comme biomarqueur, au niveau transcriptionnel ou au niveau protéique, d'un ou plusieurs variants d'épissage HIF-lîTAG, le motif de 3 paires de base TAG étant situé entre les exons 1 et 2. The invention also relates to an in vitro method, for establishing a prognosis, for example of survival of a patient, characterized in that it is applied to a pathological sample from a patient suffering from a disease with deregulation of homeostasis. oxygen and that it comprises the use as a biomarker, at the transcriptional or protein level, of one or more HIF-1TAG splice variants, the 3 base pair TAG motif being located between exons 1 and 2.

La méthode de pronostic de l'invention est plus particulièrement caractérisée en ce qu'elle comprend : - la quantification du ou des variants d'épissage HIF- lîTAG dans l'échantillon pathologique provenant dudit patient ; - la comparaison à une valeur de référence définie comme la valeur médiane d'une pluralité de mesures de quantification des variants d'épissage HIF-laTAG sur des échantillons pathologiques appartenant à des individus différents. The prognosis method of the invention is more particularly characterized in that it comprises: the quantification of the HIF-1TAG splice variant (s) in the pathological sample originating from said patient; - comparison with a reference value defined as the median value of a plurality of quantification measurements of the HIF-laTAG splicing variants on pathological samples belonging to different individuals.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la méthode de pronostic définie ci-dessus est caractérisée en ce que la quantification porte sur les ARNm desdits variants. According to a preferred embodiment of the invention, the prognosis method defined above is characterized in that the quantification relates to the mRNAs of said variants.

De manière avantageuse, la quantification est effectuée par RQ-PCR.30 Selon un autre mode de réalisation, ladite méthode de pronostic est caractérisée en ce que la quantification porte sur les variants protéiques. Advantageously, the quantification is carried out by RQ-PCR. According to another embodiment, said prognosis method is characterized in that the quantification relates to the protein variants.

La quantification est alors effectuée de préférence par des méthodes immunohistochimiques, à l'aide d'anticorps spécifiques desdites isoformes. The quantification is then preferably carried out by immunohistochemical methods, using antibodies specific for said isoforms.

Des plaques sur lesquelles sont déposés les échantillons à analyser sont alors incubées avec les anticorps, la quantité d'anticorps fixée est avantageusement déterminée selon des techniques classiques. Plates on which are deposited the samples to be analyzed are then incubated with the antibodies, the quantity of antibody fixed is advantageously determined according to conventional techniques.

En variante, la quantification des variants protéiques 15 est réalisée par spectrométrie de masse. Alternatively, quantification of protein variants is performed by mass spectrometry.

La méthode de pronostic définie ci-dessus présente un intérêt majeur dans le domaine médical et tout particulièrement en oncologie. 20 Dans le cas par exemple du cancer du sein, qui représente le cancer le plus fréquent chez la femme, dont l'incidence est en augmentation constante, l'application de la méthode de l'invention présente une valeur 25 considérable pour le suivi et la mise en place d'un traitement adapté au cas à traiter. The prognosis method defined above is of major interest in the medical field and more particularly in oncology. In the case, for example, of breast cancer, which represents the most frequent cancer in women, the incidence of which is constantly increasing, the application of the method of the invention is of considerable value for monitoring and the implementation of a treatment adapted to the case to be treated.

En effet, à ce jour, seuls cinq paramètres pronostiques consensuels sont reconnus et permettent de définir trois 30 catégories de risques chez les patientes opérées d'un cancer du sein : risque faible , intermédiaire ou - 9 Indeed, to date, only five consensual prognostic parameters are recognized and allow three categories of risk to be defined in patients operated on for breast cancer: low risk, intermediate or - 9

élevé de décès ou de survenue de récidive. Quatre de ces paramètres reposent sur des critères cliniques et histologiques : âge des patientes, taille tumorale, grade histologique et emboles vasculaires péritumoraux. Un seul critère repose sur un test immunochimique et correspond à l'expression de la molécule HER2/neu par les cellules tumorales évaluée à l'aide de kits commerciaux pour des techniques d'immunohistochimie ou d'hybridation in situ. high death or recurrence. Four of these parameters are based on clinical and histological criteria: patient age, tumor size, histological grade and peritumoral vascular emboli. A single criterion is based on an immunochemical test and corresponds to the expression of the HER2 / neu molecule by the tumor cells evaluated using commercial kits for immunohistochemistry or in situ hybridization techniques.

Ces méthodes et produits existants ne permettent toutefois qu'une appréciation approximative du pronostic des patientes atteintes d'un cancer du sein. En particulier, la pratique montre que des patientes appartenant au groupe dit à risque intermédiaire reçoivent des traitements inadaptés (hormonothérapie versus chimiothérapie). These existing methods and products, however, only allow an approximate assessment of the prognosis of patients with breast cancer. In particular, practice shows that patients belonging to the so-called intermediate risk group receive unsuitable treatments (hormone therapy versus chemotherapy).

Comme illustré par les résultats rapportés dans les exemples, une augmentation, dans l'échantillon pathologique (adénocarcinome invasif) testé, du taux du ou des variants HIF-laTAC quantifiés par rapport à une valeur de référence, est indicative d'une plus grande agressivité tumorale. As illustrated by the results reported in the examples, an increase, in the pathological sample (invasive adenocarcinoma) tested, in the level of the HIF-laTAC variant (s) quantified compared to a reference value, is indicative of a greater aggressiveness. tumor.

Ainsi, selon l'état de la tumeur, ladite augmentation est indicative d'une forte probabilité de l'apparition de métastases. Thus, depending on the state of the tumor, said increase is indicative of a high probability of the appearance of metastases.

Dans le groupe des adénocarcinomes, le statut ganglionnaire s'est révélé associé à l'expression du variant HIF-1aT. Le grade histopronostique des tumeurs est apparu associé à l'expression totale de HIF-la, à celle des variants HIF-lîTAC et HIF-1a516 L'expression immunohistochimique par les adénocarcinomes des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone se sont révélés inversement corrélés à l'expression des variants HIF- laTAG et HIF- la516 La méthode de pronostic de l'invention présente ainsi un grand intérêt pour évaluer le risque de développement de la maladie, le stade de la maladie, sa progression ou sa rémission dans le temps, la probabilité de métastases, la survie sans métastase, l'efficacité d'un traitement de chimiothérapie, radiothérapie et/ou hormonothérapie. In the group of adenocarcinomas, lymph node status has been shown to be associated with the expression of the HIF-1aT variant. The histopronostic grade of the tumors appeared to be associated with the total expression of HIF-la, with that of the HIF-lîTAC and HIF-1a516 variants. Immunohistochemical expression by adenocarcinomas of the estrogen and progesterone receptors were found to be inversely correlated with the expression of the variants HIF- laTAG and HIF- la516 The prognosis method of the invention is thus of great interest for evaluating the risk of development of the disease, the stage of the disease, its progression or its remission over time, the likelihood of metastasis, survival without metastasis, the effectiveness of chemotherapy, radiotherapy and / or hormone therapy.

La méthode de l'invention est également avantageusement utilisable dans le cas de stress cellulaires tels que ceux observés au cours de l'effort sportif, quelle que soit la catégorie d'effort. The method of the invention can also be advantageously used in the case of cellular stresses such as those observed during sports effort, regardless of the category of effort.

Selon un autre aspect, l'invention vise également un kit pour la mise en oeuvre de la méthode de pronostic ci-dessus. Un tel kit est caractérisé en ce qu'il comprend : - des amorces de PCR ou des anticorps anti-HIF-la TAG le 25 cas échéant immobilisés sur un support solide, - des réactifs nécessaires pour la quantification des variants d'épissage HIF-lîTAG au niveau des ARNm ou au niveau protéique. According to another aspect, the invention also relates to a kit for implementing the above prognosis method. Such a kit is characterized in that it comprises: - PCR primers or anti-HIF-la TAG antibodies, where appropriate immobilized on a solid support, - reagents necessary for the quantification of the HIF splicing variants - TAG at the mRNA level or at the protein level.

30 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent qui font - 11 - référence aux figures 1 à 7 qui représentent, respectivement : - la figure 1, la combinaison d'amorces et de sondes utilisée pour détecter les ARNm de l'ensemble des transcrits HIF-1a et de 4 isoformes résultant d'épissage alternatif; - les figures 2 à 6, la relation entre le type de tissu et le profil d'expression des isoformes de HIF-la; - la figure 7, un graphique selon Kaplan-Meier illustrant la survie sans métastase chez des patientes atteintes d'un cancer du sein en fonction du niveau d'ARNm de HIF- laTAG . Other characteristics and advantages of the invention are given in the examples which follow which make reference to FIGS. 1 to 7 which represent, respectively: FIG. 1, the combination of primers and probes used to detect the mRNAs of all the HIF-1a transcripts and of 4 isoforms resulting from alternative splicing; - Figures 2 to 6, the relationship between the type of tissue and the expression profile of the isoforms of HIF-1a; - Figure 7, a Kaplan-Meier graph illustrating metastasis-free survival in breast cancer patients as a function of the level of HIF-laTAG mRNA.

Matériels et méthodes Patients et échantillons de tissus mammaires On soumet des échantillons de tissus mammaires, obtenus conformément aux recommandations éthiques locales en vigueur, à une congélation instantanée dans de l'azote liquide. On fixe dans le formol des coupes parallèles de tissus, on les inclut dans de la paraffine à température ambiante, puis on les traite de façon habituelle. On procède à une analyse d'échantillons tissulaires prélevés sur 29 cas normaux/bénins et 53 carcinomes mammaires invasifs. On obtient des échantillons de tissus mammaires normaux à partir de tissus non tumoraux adjacents, prélevés sur des patientes traitées pour un cancer du sein. On prélève des lésions bénignes sur des patientes subissant une opération chirurgicale pour une adénose ou un adénofibrome. On diagnostique des carcinomes entre le 9 septembre 1989 et le le mai 1996. Aucune des - 12 - Materials and Methods Patients and Breast Tissue Samples Breast tissue samples, obtained in accordance with applicable local ethical guidelines, are subjected to instant freezing in liquid nitrogen. Parallel sections of tissue are fixed in formalin, embedded in paraffin at room temperature, and then processed in the usual way. Tissue samples from 29 normal / mild cases and 53 invasive breast carcinomas were analyzed. Normal breast tissue samples are obtained from adjacent non-tumor tissue taken from patients treated for breast cancer. Benign lesions are taken from patients undergoing surgery for adenosis or adenofibroma. Carcinoma was diagnosed between September 9, 1989 and May 1996. None of the - 12 -

53 patientes n'a fait l'objet d'une radiothérapie ou d'une chimiothérapie avant l'opération chirurgicale. La durée du suivi varie de 9 à 162 mois (moyenne = 80 mois, écart-type = 43). À des fins statistiques, on choisit un nombre approximativement égal de patientes à survie globale longue (n = 31) et à survie globale courte (n = 22). 53 patients were not subjected to radiotherapy or chemotherapy before surgery. The duration of follow-up varies from 9 to 162 months (mean = 80 months, standard deviation = 43). For statistical purposes, approximately equal numbers of patients with long overall survival (n = 31) and short overall survival (n = 22) are selected.

Facteurs cliniques et pathologiques On obtient le statut des ganglions lymphatiques, la taille des tumeurs, la présence d'emboles vasculaires péritumoraux ainsi que le type et le grade histologiques des tumeurs à partir de rapports pathologiques. On détermine le statut des récepteurs aux oestrogènes et à la progestérone par méthode immunohistochimique sur des coupes incluses dans de la paraffine. Clinical and Pathological Factors Lymph node status, tumor size, presence of peritumoral vascular emboli, and tumor type and histological grade are obtained from disease reports. The status of estrogen and progesterone receptors is determined immunohistochemically on sections embedded in paraffin.

Densité microvasculaire des tumeurs On fait prélever, par des médecins pathologistes, des fragments de tissus frais juste après le diagnostic peropératoire. On les conserve aussitôt dans de l'azote liquide à -80°C. On réalise des études d'immunodétection sur coupes tissulaires de 5 micromètres d'épaisseur (Cryostat, Leica CM 3050, Leica Microsystèmes, Rueil Malmaison, France). On effectue des réactions à l'immunoperoxydase en utilisant un anticorps monoclonal (5,6 E) anti-humain de souris CD31/PECAM (Novocastra, Tebu, Le Perray-en-Yvelines, France) et l'automate Ventana Gene II avec des kits Ventana (Ventana, Tucson, Arizona). On évalue le nombre de microvaisseaux dans les zones les plus vascularisées (appelées points chauds) en - 13 - Microvascular density of tumors Fragments of fresh tissue are taken by pathologists immediately after intraoperative diagnosis. They are immediately stored in liquid nitrogen at -80 ° C. Immunodetection studies are carried out on tissue sections 5 micrometers thick (Cryostat, Leica CM 3050, Leica Microsystèmes, Rueil Malmaison, France). Immunoperoxidase reactions were performed using a CD31 / PECAM mouse anti-human monoclonal antibody (5.6 E) (Novocastra, Tebu, Le Perray-en-Yvelines, France) and the Ventana Gene II machine with Ventana kits (Ventana, Tucson, Arizona). The number of microvessels in the most vascularized areas (called hot spots) is evaluated by - 13 -

utilisant un objectif x20 avec un microscope Zeiss Axioplan. On retient la valeur moyenne du nombre de vaisseaux des 4 champs en tant que valeur finale. using a x20 objective with a Zeiss Axioplan microscope. The average value of the number of vessels in the 4 fields is retained as the final value.

Extraction de l'ARN et transcription inverse On homogénéise les tissus congelés (25 à 50 mg) dans 0,5 mL de réactif Trizol (Life Technologies), avec une matrice de lyse D, dans une machine FastPrep (Q BlOgene), pendant 6 cycles de 30 s à un réglage de 6 m/s. On ajoute du chloroforme (100 gL) à chaque échantillon et on mélange vigoureusement pendant 15 s, puis on laisse incuber pendant 3 min. à température ambiante. On sépare les phases par centrifugation (12 000 g pendant 15 min. à 4°C), et on transfère la phase aqueuse dans un tube propre. On ajoute de l'isopropanol (250 L) à chacun des échantillons, que l'on mélange ensuite par inversion et que l'on laisse incuber pendant 10 min. à température ambiante. On récupère un culot d'ARN par centrifugation (12 000 g pendant 10 min. à 4°C), on le lave avec 1 mL d' éthanol à 75% refroidi sur de la glace, on le sèche à l'air, et on le remet en suspension dans 15 L d'eau distillée exempte de RNase. On détermine la concentration en ARN par spectrophotométrie, en mesurant la densité optique à 260 nm. On soumet 1 gg d'ARN à une transcription inverse avec 200 U de transcriptase inverse MMLV, en suivant le protocole EAC (Gabert et al., 2003). On dilue l'ADNc final dans un volume final de 50 L. RNA extraction and reverse transcription The frozen tissues (25 to 50 mg) are homogenized in 0.5 mL of Trizol reagent (Life Technologies), with a lysis matrix D, in a FastPrep machine (Q BlOgene), for 6 30 s cycles at a setting of 6 m / s. Chloroform (100 gL) is added to each sample and mixed vigorously for 15 sec, then incubated for 3 min. at room temperature. The phases are separated by centrifugation (12,000 g for 15 min. At 4 ° C), and the aqueous phase is transferred to a clean tube. Isopropanol (250 L) is added to each of the samples, which is then mixed by inversion and allowed to incubate for 10 min. at room temperature. An RNA pellet is recovered by centrifugation (12,000 g for 10 min. At 4 ° C), washed with 1 mL of ice-cold 75% ethanol, air dried, and it is resuspended in 15 L of distilled RNase-free water. The RNA concentration is determined by spectrophotometry, by measuring the optical density at 260 nm. 1 gg of RNA is reverse transcribed with 200 U of MMLV reverse transcriptase, following the EAC protocol (Gabert et al., 2003). The final cDNA is diluted to a final volume of 50 L.

Identification des variants d'épissage (quantification)_ 30 On utilise des plasmides pCR3 contenant les séquences HIF-1î827 et HIF-1x736 avec une insertion TAG, - 14 - Identification of Splice Variants (Quantification) Plasmids pCR3 containing the sequences HIF-1827 and HIF-1x736 were used with a TAG insertion.

fournis par J. Pouyssegur (Centre Lacassagne, Nice, France). Pour les autres variants d'épissage, on amplifie l'ADNc de cellules HEK 293 en utilisant les amorces suivantes, situées dans les exons 1 et 2 : séquence sens (SEQ ID N° 1), 5'-CCGGCGGCGCGAACGACAAG-3 et séquence anti-sens (SEQ ID N° 2), 5'-TGCGAACTCACATTATGTGG-3', ou les amorces situées dans les exons 10 et 14 : 10 séquence sens (SEQ ID N° 3), 5'-TGACCCTGCACTCAATCAAG-3' et séquence anti-sens (SEQ ID N° 4), 5'-AGTAGCTGCATGTACGTCTG-3'. Les conditions de l'amplification par PCR sont : 15 35 cycles de 30 s à 95°C, 1 min. à 55°C, 1 min. à 72°C et une dernière élongation à 72°C pendant 10 min. Après l'amplification, on sépare le produit de PCR par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2%. On découpe les bandes intéressantes, on les purifie (trousse High 20 Pure Purification, Roche Diagnosis) et on les clone dans le vecteur pCRII TOPO (trousse de clonage TOPO-TA, Invitrogen). Après purification des plasmides (plasmide Nucleospin, Macherey Nagel) et vérification des séquences, on prépare des dilutions en série à 1/10 dans 25 l'ARN d'E. coli (Roche Diagnosis) afin de générer une courbe étalon de RQ-PCR. provided by J. Pouyssegur (Center Lacassagne, Nice, France). For the other splice variants, the cDNA of HEK 293 cells is amplified using the following primers, located in exons 1 and 2: sense sequence (SEQ ID No. 1), 5'-CCGGCGGCGCGAACGACAAG-3 and anti sequence. -sense (SEQ ID No. 2), 5'-TGCGAACTCACATTATGTGG-3 ', or the primers located in exons 10 and 14: 10 sense sequence (SEQ ID No. 3), 5'-TGACCCTGCACTCAATCAAG-3' and anti sequence -sense (SEQ ID No. 4), 5'-AGTAGCTGCATGTACGTCTG-3 '. The conditions for PCR amplification are: 15 cycles of 30 s at 95 ° C, 1 min. at 55 ° C, 1 min. at 72 ° C and a final elongation at 72 ° C for 10 min. After amplification, the PCR product is separated by electrophoresis on a 2% agarose gel. The bands of interest are cut out, purified (High Pure Purification kit, Roche Diagnosis) and cloned into the pCRII TOPO vector (TOPO-TA cloning kit, Invitrogen). After purification of the plasmids (Nucleospin, Macherey Nagel plasmid) and verification of the sequences, serial dilutions of 1/10 in RNA of E. coli (Roche Diagnosis) in order to generate an RQ-PCR standard curve.

Analyse PCR quantitative en temps réel On réalise l'amplification et la quantification des 30 variants HIF-la sur le système MX3000P (Stratagene). 2927092 - 15 - Quantitative Real-Time PCR Analysis Amplification and quantification of the HIF-1α variants was performed on the MX3000P system (Stratagene). 2927092 - 15 -

La combinaison d'amorces et de sondes utilisée pour détecter les ARNm de quatre isoformes à épissage alternatif connus est illustrée sur la figure 1. Le schéma donné illustre la combinaison des amorces et 5 sondes utilisées pour la détection des ARNm de 4 variants d'épissage alternatif de HIF-la. Chaque boite représente un exon numéroté de 1 à 15. Les amorces sont désignées par une tête de flèche et les sondes par une ligne continue épaisse. L'ARNm de la séquence HIF-la de type sauvage (HIF-lawT) se compose de 15 exons et de 14 introns. Les variants indiqués dans la figure 1 sont générés par une insertion TAG entre l'exon 1 et l'exon 2 (HIF- 1x827 et HIF-lx736), par épissage alternatif des exons 13-15 (HIF-lî736), par épissage alternatif des exons 11-13 (HIF-1a557), et par épissage alternatif des exons 10-13 (HIF-1a516) Les amorces des exons 5 et 6 (étoile) sont appropriées à la quantification de tous les produits de transcription connus aujourd'hui des séquences HIF-la, y compris HIF-la"t. Les paires d'amorces des exons 13 et 15, 11 et 13, et 10 et 13 sont appropriées à la détection spécifique des variants HIF-1x736, HIF-1a557 et HIF-1î516 respectivement. Les amorces des exons 1 et 2 permettent la détection de l'ARNm des deux isoformes HIF-1î827 et HIF-1cc736 (désignées par HIF-laT dans ces résultats). Le tableau 1 détaille les séquences oligonucléotidiques des amorces et des sondes utilisées ainsi que leur position sur les exons pour détecter et - 16 - amplifier les variants d'épissage des ARNm de HIF-la. 1Fa, amorce sens ; R, amorce antisens ; P, sonde oligonucléotidique. - 17 - Tableau 1 Oligonucléotide Position Séquence (5' -> 3') Concentration des amorces et des sondes dans le (exon) mélange réactionnel (nM) Fa gTACCCTAACTAgCCgAggAAgAA 300 HIF-la 6 R gTg AAT gTg gCC TgT gCA gT 300 (toutes isoformes) jonction P Atg AAC ATA Aag TCT gCA ACA Tgg Aag gTA TTg 200 5-6 1 F gCgCgAACgACAAgAAAAATAg 50 HIF-laTA~ 2 R TggCAACTgATgAgCAAgCT 300 2 P ATgCAgCCAgATCTCggCgAAgTAAA 200 jonction F TCACTTTTTCAAgCAgTAggAATTATTTAg 600 13-15 HIF 1a736 15 R TAATTCTTCACCCTgCAgTAggTTT 600 15 P TgA CCA gTT Atg ATT gTg Aag TTA Atg CTC CTATACAAgg 200 11 F TgTggATAgTgATATggTCAATgAATT 300 HIF-1a557 13 R TAgTATCTTTggATTTAgTTCTTCCTCAgg 300 jonction P AAgCAAACCCATTTTCTACTCAgAACTACA 200 11-13 F AgACACCTAgTCCTTCCgATgg 600 HIF-1a516 13 R AAgCTAgTATCTTTggATTTAgTTCTTCCT 600 jonction AgCACTAgACAAAgTTCACCTgAgAACTaCAgT 200 10 13 - 18 - On procède en outre à une amplification du gène TBP (TATA Binding Protein). On utilise le produit de transcription du gène TBP en tant que gène de contrôle (Ginestier et al.), comme décrit précédemment (Bieche 5 et al.). On réalise les amplifications avec 5 gL d'ADNc dilué, dans un volume total de 25 gL contenant 12,5 L de TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) et chacune des amorces sens et antisens ainsi que la sonde. 10 On a optimisé la concentration des amorces et des sondes pour chaque amplicon (tableau 1). Les conditions de la réaction de RQ-PCR pour l'amplification des gènes sont les suivantes : 50°C pendant 2 min., étape de dénaturation de 10 min. à 95°C 15 suivie de 50 cycles de 30 s à 95°C, 1 min d'hybridation et d'extension à 60°C pour tous les produits de transcription, sauf pour HIF-lîTA~, avec 1 min. à 62°C. On réalise les réactions de RQ-PCR en double, sur l'ADNc de chaque échantillon. On trace des courbes étalon, pour la 20 quantification, en utilisant des dilutions de plasmide spécifiques du variant d'épissage allant de 106 à 1 copies, et on détermine le nombre de copies (NC) de chaque isoforme. Afin de corriger les variations de qualité/quantité d'ARN, on exprime les résultats des 25 amplifications par RQ-PCR sous la forme du rapport NC de chaque isoforme de HIF-la/NC du gène de controle, également appelé nombre de copies normalisé (NCN), avec TBP en tant que gène de contrôle. On considère que les échantillons contenant un NC de TBP < 500 copies sont de 30 mauvaise qualité, et on les exclut de l'étude. - 19 - On a vérifié préalablement la spécificité des amplifications par PCR au moyen d'un séquençage des produits de PCR. The combination of primers and probes used to detect mRNAs of four known alternative splicing isoforms is shown in Figure 1. The given scheme illustrates the combination of primers and 5 probes used for detection of mRNAs of 4 splice variants. alternative of HIF-la. Each box represents an exon numbered from 1 to 15. Primers are designated by an arrowhead and probes by a solid solid line. Wild-type HIF-1α (HIF-lawT) mRNA consists of 15 exons and 14 introns. The variants shown in Figure 1 are generated by TAG insertion between exon 1 and exon 2 (HIF-1x827 and HIF-1x736), by alternative splicing of exons 13-15 (HIF-1736), by alternative splicing. exons 11-13 (HIF-1a557), and by alternative splicing of exons 10-13 (HIF-1a516) The primers of exons 5 and 6 (star) are suitable for the quantification of all the transcription products known today HIF-1α sequences, including HIF-1α "t. Primer pairs of exons 13 and 15, 11 and 13, and 10 and 13 are suitable for the specific detection of HIF-1x736, HIF-1a557 and HIF variants -11516 respectively The primers of exons 1 and 2 allow the detection of the mRNA of the two isoforms HIF-1827 and HIF-1cc736 (designated as HIF-laT in these results). Table 1 details the oligonucleotide sequences of the primers and of the probes used as well as their position on the exons to detect and amplify the splice variants of the mRNAs of HIF-la. 1Fa, primer e meaning; R, reverse primer; P, oligonucleotide probe. - 17 - Table 1 Oligonucleotide Position Sequence (5 '-> 3') Concentration of primers and probes in the (exon) reaction mixture (nM) Fa gTACCCTAACTAgCCgAggAAgAA 300 HIF-la 6 R gTg AAT gTg gCC TgT gCA gT 300 (all isoforms) P junction Atg AAC ATA TCT GCA ACA TGG Aag Aag AWg TTg 200 5-6 1 50 F gCgCgAACgACAAgAAAAATAg HIF-lATA ~ 2 R 2 P 300 TggCAACTgATgAgCAAgCT ATgCAgCCAgATCTCggCgAAgTAAA junction 200 F 600 13-15 TCACTTTTTCAAgCAgTAggAATTATTTAg HIF 1a736 TAATTCTTCACCCTgCAgTAggTTT 15 R 15 600 P TgA CCA GTT ATT GTG Atg Aag Atg TTA CTC CTATACAAgg 200 11 F 300 TgTggATAgTgATATggTCAATgAATT HIF-1a557 13 R TAgTATCTTTggATTTAgTTCTTCCTCAgg 300 PN junction AAgCAAACCCATTTTCTACTCAgAACTACA 200 11-13 600 F AgACACCTAgTCCTTCCgATgg HIF-1a516 13 R AAgCTAgTATCTTTggATTTAgTTCTTCCT AgCACTAgACAAAgTTCACCTgAgAACTaCAgT junction 600 200 10 13 - 18 - The procedure in addition to amplification of the TBP gene (TATA Binding Protein). The transcription product of the TBP gene is used as a control gene (Ginestier et al.), As described previously (Bieche 5 et al.). Amplifications are carried out with 5 gL of diluted cDNA, in a total volume of 25 gL containing 12.5 L of TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) and each of the sense and antisense primers as well as the probe. The concentration of primers and probes was optimized for each amplicon (Table 1). The conditions of the RQ-PCR reaction for gene amplification are as follows: 50 ° C for 2 min., Denaturation step of 10 min. at 95 ° C followed by 50 cycles of 30 s at 95 ° C, 1 min of hybridization and extension at 60 ° C for all transcripts except for HIF-ILTA ~, with 1 min. at 62 ° C. RQ-PCR reactions are performed in duplicate, on the cDNA of each sample. Standard curves are plotted for quantification using plasmid dilutions specific for the splice variant ranging from 106 to 1 copies, and the copy number (NC) of each isoform is determined. In order to correct for variations in RNA quality / quantity, the results of the RQ-PCR amplifications are expressed as the NC ratio of each HIF-1α / NC isoform of the control gene, also called normalized copy number. (NCN), with TBP as the control gene. Samples containing an NC of TBP <500 copies were considered to be of poor quality, and were excluded from the study. The specificity of the PCR amplifications was previously checked by sequencing the PCR products.

Analyse statistique On évalue les différences entre les groupes d'échantillons de tissus mammaires (tissu normaux ou lésions bénignes/carcinome canalaire/carcinome lobulaire) en termes de leur concentration en ARNm de HIF-la, en utilisant le test ANOVA et le test post-hoc de Bonferroni. Étant donné que le niveau d'expression des échantillons de cancer du sein présente une distribution non Gaussienne, on utilise des tests non paramétriques (de Spearman, Mann-Whitney et Kruskal-Wallis) pour l'analyse de la corrélation avec les paramètres cliniques et pathologiques. La survie sans métastase est calculée comme l'intervalle de temps séparant la date de chirurgie et la date de survenue des métastases. On utilise le test du log-rank de Kaplan-Meier et les modèles de régression (univariée et multivariée) de Cox pour comparer la survie et identifier des prédicteurs de survie. p <_ 0,05 définit la signification statistique. On réalise toutes les analyses statistiques à l'aide du logiciel SPSS, version 13.0.1 (SPSS Inc.). Statistical analysis Differences between groups of breast tissue samples (normal tissue or benign lesions / ductal carcinoma / lobular carcinoma) in terms of their HIF-1α mRNA concentration were evaluated using the ANOVA test and the post-test. hoc of Bonferroni. Since the expression level of breast cancer samples has a non-Gaussian distribution, nonparametric tests (Spearman, Mann-Whitney and Kruskal-Wallis) are used for the analysis of correlation with clinical parameters and pathological. Metastasis-free survival is calculated as the time interval between the date of surgery and the date of onset of metastases. Kaplan-Meier log-rank test and Cox regression models (univariate and multivariate) are used to compare survival and identify predictors of survival. p <_ 0.05 defines statistical significance. All statistical analyzes were performed using SPSS software, version 13.0.1 (SPSS Inc.).

Résultats Paramètres cliniques et pathologiques Les caractéristiques des tissus sont résumées dans le tableau 2. On prélève des tissus mammaires normaux ou lésions bénignes sur 29 patientes âgées de 12 à 79 ans (moyenne = 44,7 ans, écart-type = 16,9). Les échantillons - 20 - Results Clinical and pathological parameters The characteristics of the tissues are summarized in Table 2. Normal breast tissue or benign lesions were taken from 29 patients aged 12 to 79 years (mean = 44.7 years, standard deviation = 16.9) . Samples - 20 -

tumoraux sont des adénocarcinomes invasifs de 53 patientes souffrant de cancer du sein précoce (stade I, II ou III), diagnostiqué entre le 9 septembre 1989 et le le mai 1996, dans le Service de gynécologie oncologique de l'Hôpital de la Conception à Marseille. On prélève les échantillons tumoraux sur des patientes âgées de 30 à 84 ans (moyenne = 54 ans, écart-type = 11,4). On identifie chacune des zones respectives au microscope et les échantillons mammaires sont disséqués par le médecin pathologiste juste après exérèse, avant d'être soumis à une congélation instantanée dans de l'azote liquide. A des fins statistiques, on choisit un nombre approximativement égal de patientes à survie globale longue (> 90 mois) (n = 31) et à survie globale courte 60 mois) (n = 22). La taille moyenne des tumeurs est de 23,47 mm (écart-type = 12,3) et 3 tumeurs ont une largeur <_ 10 mm, 25 ont une largeur > 10 mm et <_ 20 mm, 23 ont une largeur > 20 mm et 50 mm, et 2 ont une largeur > 50 mm. On procède à un examen histologique des échantillons chirurgicaux sur des coupes incluses dans de la paraffine colorées à l'hématoxyline-éosine-saffran. Les tumeurs correspondent à des carcinomes canalaires (n = 41) et à des carcinomes lobulaires (n = 12). On réévalue le grade des tumeurs, initialement évalué selon le score de Scarff Bloom et Richardson, en utilisant le score de Elston et Ellis. On trouve une moyenne de 16,9 (écart-type 5,1) ganglions lymphatiques dans l'excision des ganglions axillaires, et 22 patientes ont des ganglions métastatiques. Toutes les patientes subissent une excision au niveau des ganglions axillaires, combinée à une excision locale large avec marges de sécurité ou à - 21 - tumors are invasive adenocarcinomas of 53 patients suffering from early breast cancer (stage I, II or III), diagnosed between September 9, 1989 and May 1996, in the Oncological Gynecology Department of the Hôpital de la Conception in Marseille . Tumor samples are taken from patients aged 30 to 84 years (mean = 54 years, standard deviation = 11.4). Each of the respective areas is identified under a microscope and the breast samples are dissected by the pathologist immediately after excision, before being subjected to instant freezing in liquid nitrogen. For statistical purposes, an approximately equal number of patients with long overall survival (> 90 months) (n = 31) and short overall survival 60 months) (n = 22) are selected. The average tumor size is 23.47mm (standard deviation = 12.3) and 3 tumors are <_ 10mm wide, 25 are> 10mm wide and <_ 20mm, 23 are> 20mm wide mm and 50 mm, and 2 have a width> 50 mm. Surgical specimens were histologically examined on paraffin-embedded sections stained with hematoxylin-eosin-saffron. The tumors correspond to ductal carcinomas (n = 41) and to lobular carcinomas (n = 12). The tumor grade, initially assessed using the Scarff Bloom and Richardson score, is reassessed using the Elston and Ellis score. An average of 16.9 (standard deviation 5.1) lymph nodes was found in axillary node excision, and 22 patients had metastatic nodes. All patients undergo axillary lymph node excision, combined with wide local excision with safety margins or at - 21 -

une mastectomie, dans le même service. Le traitement post-chirurgical comprend une radiothérapie et une chimiothérapie pour les tumeurs larges et/ou de stade avancé, réalisées par le même groupe d'oncologues. La durée du suivi varie de 9 à 162 mois. Les registres de 2004 montrent que, sur 53 patientes, 22 patientes ont rechuté, parmi lesquelles 18 sont décédées, et 7 ont survécu. On calcule la survie sans métastases comme étant la durée après l'opération jusqu'à la date d'apparition de métastases. - 22 -Tableau 2 Répartition des caractéristiques cliniques et pathologiques de patientes atteintes de cancer du sein Paramètre Nb de patientes Nb de patientes présentant des métastases Âge, années < 50 50 Ganglion lymphatique positif (22 N+) 0 1-3 4-9 >- 10 Taille de la tumeur (mm) <_ 10 10-20 20-50 > 50 Grade histologique 1 2 3 Type histologique tubulaire lobulaire Invasion vasculaire péritumorale (EB) absente présente Statut des ER ER (+) ER (-) Statut des PR PR (+) PR (-) 21 30 a mastectomy, in the same department. Post-surgical treatment includes radiotherapy and chemotherapy for large and / or advanced tumors, performed by the same group of oncologists. The duration of follow-up varies from 9 to 162 months. The 2004 registers show that, out of 53 patients, 22 patients relapsed, of which 18 died, and 7 survived. The metastasis-free survival is calculated as the time after the operation to the date of onset of metastasis. - 22 -Table 2 Distribution of clinical and pathological characteristics of breast cancer patients Parameter No. of patients No. of patients with metastases Age, years <50 50 Positive lymph node (22 N +) 0 1-3 4-9> - 10 Tumor size (mm) <_ 10 10-20 20-50> 50 Histological grade 1 2 3 Tubular lobular histological type Peritumoral vascular invasion (EB) absent present Status of ER ER (+) ER (-) Status of PR PR (+) PR (-) 21 30

25 11 4 7 25 11 4 7

3 25 23 2 3 25 23 2

9 26 17 9 26 17

41 12 41 12

12 40 12 40

32 16 32 16

26 24 8 13 1 13 8 26 24 8 13 1 13 8

18 4 18 4

4 18 4 18

10 10 10 10

6 16 - 23 - 6 16 - 23 -

Niveau d'expression différentielle des variants d'épissage de HIF-la dans les tissus mammaires normaux ou lésions bénignes et les adénocarcinomes On détermine le niveau d'expression des ARNm de HIF-la dans chacun des 82 échantillons de tissus mammaires normaux ou lésions bénignes et des adénocarcinomes. On détecte des variants d'épissage de HIF-la dans tous les échantillons de tissus normaux ou lésions bénignes et des adénocarcinomes du sein à des niveaux variables. Les figures 2 à 6 donnent la distribution des niveaux d'expression des ARNm de HIF-la pour chaque catégorie de tissu. L'ARNm de HIF-laTAC est l'isoforme la plus dominante de tous les produits de transcription de HIF-la dans l'ensemble des tissus, alors que l'on ne trouve que de faibles niveaux des isoformes de HIF-1a736, HIF-la516 et HIF-la557. Le niveau d'expression de l'ARNm des variants d'épissage HIF-laTAC est similaire au niveau d'expression totale des séquences HIF-la. Le niveau d'expression de l'ARNm des variants d'épissage de HIF-la736 et HIF-1a516 est 100 fois inférieur à celui de HIF-laTZ, et le niveau d'expression de l'ARNm du variant HIF-la557 est 1 000 fois inférieur à celui de HIF-laTAG On n'observe aucune différence statistiquement significative du niveau d'expression totale des séquences HIF-la entre les tissus normaux ou lésions bénignes et les adénocarcinomes (figure 2). De même, le niveau d'expression des ARNm de HIF-laTAC et de HIF-1a557 est similaire entre les deux catégories de tissus (figures 3 et 4). Il est intéressant de noter que le niveau des ARNm de HIF-1a516 est plus - 24 - Differential expression level of HIF-la splice variants in normal breast tissue or benign lesions and adenocarcinomas The level of expression of HIF-la mRNAs in each of 82 samples of normal breast tissue or benign lesions is determined. and adenocarcinomas. HIF-1α splice variants were detected in all normal tissue samples or benign lesions and breast adenocarcinomas at varying levels. Figures 2-6 show the distribution of HIF-1α mRNA expression levels for each tissue class. HIF-laTAC mRNA is the most dominant isoform of all HIF-la transcripts in all tissues, while only low levels of the HIF-1a736 isoforms, HIF are found -la516 and HIF-la557. The level of expression of the mRNA of the HIF-laTAC splice variants is similar to the level of total expression of the HIF-la sequences. The mRNA expression level of the splice variants of HIF-la736 and HIF-1a516 is 100 times lower than that of HIF-laTZ, and the mRNA expression level of the variant HIF-la557 is 1 000 times lower than that of HIF-laTAG No statistically significant difference is observed in the level of total expression of the HIF-la sequences between normal tissues or benign lesions and adenocarcinomas (FIG. 2). Likewise, the level of expression of HIF-laTAC and HIF-1a557 mRNAs is similar between the two tissue categories (Figures 3 and 4). Interestingly, the level of HIF-1a516 mRNAs is more - 24 -

élevé dans le groupe des carcinomes canalaires que dans celui des tissus normaux ou lésions bénignes (p = 0,012) (figure 5), bien que leur niveau d'expression soit très faible et qu'on l'augmente de façon très modeste. Les ARNm de HIF-lî736 ont tendance à présenter une corrélation avec le phénotype malin, mais sans signification statistique (p = 0,053) (figure 6). elevated in the ductal carcinoma group than in that of normal tissues or benign lesions (p = 0.012) (Figure 5), although their level of expression is very low and very modestly increased. HIF-1736 mRNAs tend to correlate with the malignant phenotype, but without statistical significance (p = 0.053) (Figure 6).

Corrélation entre les variants d'épissage de HIF-la et les caractéristiques clinicopathologiques des tumeurs On étudie ensuite la présence de corrélations entre le niveau d'ARNm des variants de HIF-lî et les caractéristiques clinicopathologiques des tumeurs dans le but de tester certaines hypothèses concernant la fonction. On détermine le niveau d'ARNm de chaque variant de HIF-la dans des échantillons tumoraux de 53 patientes atteintes de cancer du sein, et on le compare au statut des ganglions lymphatiques, au grade de la tumeur, à la taille de la tumeur, au statut des récepteurs aux œstrogènes (ER) et au statut des récepteurs à la progestérone (PR). On le compare également à la densité microvasculaire des tumeurs. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 3. Le tableau 3 ci-après donne plus particulièrement les caractéristiques clinicopathologiques et la densité microvasculaire des tumeurs ainsi que la relation qui existe avec le niveau d'ARNm des variants d'épissage de HIF-la (n = 53). - 25 - Tableau 3 Caractéristique Nb de HIF-la P HIF-laTAG P HIF-1a75 P HIF-1a516 P HIF-1a557 P patientes total moyenne (écart- moyenne moyenne moyenne moyenne type) (écart-type) (écart- (écart- (écart- type) type) type) Statut des ganglions lymphatiques 25 10 (9) NS 10,9 (10,9) 0,037 0,19 (0,29) NS 0,02 (0,03) NS 0,003 (0,006) NS négatif positif 22 12,8 (7,8) 21,1 (19,21) 0,26 (0,28) 0,03 (0,03) 0,002 (0,002) Taille de la tumeur 28 10,2 (8,3) NS 12,4 (13,2) NS 0,17 (0,26) NS 0,02 (0,03) NS 0,003 (0,005) NS _0 20 mm > 20 mm 25 11,8 (8,3) 17,3 (17,4) 0,25 (0,28) 0,02 (0,02) 0,002 (0,002) Grade 35 9,2 (7,7) 0,048 11,8 (12,34) 0,048 0,19 (0,3) NS 0,02 (0,02) 0,02 0,002 (0,002) NS 1, 2 3 17 14,6(8,7) 21,48 (19,4) 0,23 (0,2) 0,03 (0,03) 0,004 (0,007) Emboles vasculaire 12 8 (9) 0,028 9,64 (10,1) NS 0,19 (0,36) NS 0,01 (0,02) 0,008 0,002 (0,002) NS péritumoraux absent présent 40 11,9 (8,06) 16,6 (16,6) 0,20 (0,24) 0,03 (0,03) 0,003 (0,005) Statut des récepteurs 16 14,2 (7,3) 0,024 20,8 (11,9) 0,005 0,25 (0,19) 0,06 0,03 (0,03) 0,002 0,004 (0,007) 0,015 aux oestrogènes négatif positif 32 10 (8,8) 12,7 (17,1) 0,20 (0,31) 0,02 (0,02) 0,002 (0,002) Statut des récepteurs à 24 11,8 (7,3) NS 20,08 (17,8) 0,033 0,23 (0,19) 0,08 0,03 (0,03) 0,012 0,004 (0,006) 0,08 la progestérone négatif positif 26 10,8 (9,4) 11,3 (12,3) 0,2 (0,34) 0,01 (0,01) 0,002 (0,002) Densité microvasculaire NS NS NS NS NS de la tumeur (faible/forte) - 26 - Le statut des ganglions lymphatiques est significativement associé au niveau d'ARNm de HIF-laTAG seulement (p = 0,037). On trouve une association à signification statistique entre le grade de la tumeur et le niveau d'ARNm total des séquences HIF-la (p = 0,048), de HIF-laTAC (p = 0,048) et de HIF-1as16 (p = 0,02). La présence d'emboles vasculaires péritumoraux est corrélée avec le niveau d'ARNm total des séquences HIF-la (p = 0,028) et avec le niveau d'ARNm de HIF-1a516 (p = 0,008). On observe également, de façon particulièrement intéressante, que les niveaux d'ARNm de HIF-laTAG et de HIF-1a516 sont inversement corrélés avec le statut des ER et des PR. On ne trouve aucune association significative entre les niveaux d'ARNm de HIF-la étudiés et la taille ou la densité microvasculaire des tumeurs. Correlation between HIF-1a Splice Variants and Clinicopathologic Features of Tumors The presence of correlations between the mRNA level of HIF-1α variants and clinicopathologic features of tumors is then investigated in order to test certain hypotheses regarding function. The mRNA level of each HIF-α variant was determined in tumor samples from 53 breast cancer patients, and compared to lymph node status, tumor grade, tumor size, estrogen receptor (ER) status and progesterone receptor (PR) status. It is also compared to the microvascular density of tumors. The results obtained are given in Table 3. Table 3 below gives more particularly the clinicopathological characteristics and the microvascular density of the tumors as well as the relationship which exists with the level of mRNA of the splicing variants of HIF-la ( n = 53). - 25 - Table 3 Characteristic Nb of HIF-la P HIF-laTAG P HIF-1a75 P HIF-1a516 P HIF-1a557 P patients total mean (mean mean mean standard deviation) (standard deviation) (deviation - (standard deviation) standard) standard) Lymph node status 25 10 (9) NS 10.9 (10.9) 0.037 0.19 (0.29) NS 0.02 (0.03) NS 0.003 (0.006 ) NS negative positive 22 12.8 (7.8) 21.1 (19.21) 0.26 (0.28) 0.03 (0.03) 0.002 (0.002) Tumor size 28 10.2 ( 8.3) NS 12.4 (13.2) NS 0.17 (0.26) NS 0.02 (0.03) NS 0.003 (0.005) NS _0 20 mm> 20 mm 25 11.8 (8, 3) 17.3 (17.4) 0.25 (0.28) 0.02 (0.02) 0.002 (0.002) Grade 35 9.2 (7.7) 0.048 11.8 (12.34) 0.048 0.19 (0.3) NS 0.02 (0.02) 0.02 0.002 (0.002) NS 1, 2 3 17 14.6 (8.7) 21.48 (19.4) 0.23 ( 0.2) 0.03 (0.03) 0.004 (0.007) Vascular emboli 12 8 (9) 0.028 9.64 (10.1) NS 0.19 (0.36) NS 0.01 (0.02) 0.008 0.002 (0.002) Peritumoral NS absent present 40 11.9 (8.06) 16.6 (16.6) 0.20 (0.24) 0.03 (0.03) 0.003 (0.005) Receptor status 16 14.2 (7.3) 0.024 20.8 (11.9) 0.005 0.25 (0.19) 0.06 0.03 (0.03) 0.002 0.004 (0.007) 0.015 estrogen negative positive 32 10 (8.8) 12.7 (17.1) 0.20 (0 , 31) 0.02 (0.02) 0.002 (0.002) Receiver status at 24 11.8 (7.3) NS 20.08 (17.8) 0.033 0.23 (0.19) 0.08 0 0.03 (0.03) 0.012 0.004 (0.006) 0.08 progesterone negative positive 26 10.8 (9.4) 11.3 (12.3) 0.2 (0.34) 0.01 (0, 01) 0.002 (0.002) Tumor microvascular density NS NS NS NS NS (weak / strong) - 26 - Lymph node status was significantly associated with the mRNA level of HIF-laTAG only (p = 0.037). A statistically significant association was found between tumor grade and total mRNA level of HIF-la (p = 0.048), HIF-laTAC (p = 0.048) and HIF-1as16 (p = 0, 02). The presence of peritumoral vascular emboli is correlated with the level of total mRNA of HIF-1α sequences (p = 0.028) and with the level of HIF-1a516 mRNA (p = 0.008). It is also observed, in a particularly interesting way, that the mRNA levels of HIF-laTAG and of HIF-1a516 are inversely correlated with the status of ERs and PRs. No significant association was found between the levels of HIF-1α mRNA studied and the size or microvascular density of the tumors.

Expression des variants d'épissage de HIF-la et survie des patientes La force de l'association des caractéristiques clinicopathologiques des tumeurs (statut des ganglions lymphatiques, taille de la tumeur, grade de la tumeur, emboles vasculaires péritumoraux, statut des ER et des PR, densité microvasculaire de la tumeur) et du niveau d'expression des ARNm de HIF-la avec la survie sans métastases est présentée dans le tableau 4 ci-dessous. Ce tableau donne les résultats d'une analyse de la survie sans métastases basée sur une régression univariée et multivariée de Cox, chez des patientes atteintes de cancer du sein, en tenant compte des paramètres clinicopathologiques, de la densité microvasculaire de la tumeur et du niveau des ARNm de HIF-la. - 27 - Tableau 4 Caractéristiques Analyse univariée P Analyse multivariée P Exp. B (IC = 95%) Exp. B (IC = 95%) Age, ans < 50 1 0,22 50 1,63 Ganglion lymphatique positif 1 1 0,002 0 1-3 8,0 [2,6-24,3] 0,003 9,2 [2,3-37,5] 4-9 6,7 [1,5-29,6] 14,3 [2,4-83,6] 10 3,4 [0,8-14,4] 0,3 [0,04-3,3] Taille de la tumeur (mm) 1 1 0,084 _< 10 10-20 1,04 [0,13-8,50] 0,16 0,9 [0,08-9,5] 20-50 2,9 [0,38-22,6] 3,9 [0,3-45,2] > 50 2,5 [0,16-40] 9,1 [0,3-287] Grade (SBR) 0,52 1, 2 1 3 1,33 [0,55-3,22] Emboles vasculaire péritumoraux (EB) 1 0,15 absent présent 2,43 [0,71-8,27] ER 0,379 [0,15-0,94] 0,035 positif négatif 0,228 [0,08-0,64] 0,004 0,19 [0,04-0,81] 0,025 PR positif négatif 1,022 [0,99-1,057] 0,20 Densité microvasculaire de la tumeur Niveau des ARNm de HIF-laTAG 1,03 [1,003-1 , 05] 0,03 0,98 [0,95-1 ] 0,164 Les résultats obtenus montrent que le statut des ganglions lymphatiques (p = 0,003), le statut des récepteurs aux oestrogènes (ER) (p = 0,035), le statut des récepteurs à la progestérone (p = 0,004) et le niveau des ARNm de HIF-laTA (p = 0,03) sont significativement prédictifs de la survie sans métastases. Les patientes atteintes de cancer du sein qui présentent un haut niveau d'expression d'ARNm de HIF-laTAC (seuil médian = 9,95) ont beaucoup plus de risques de rechuter. Expression of HIF-1α splice variants and patient survival The strength of the association of clinicopathologic features of tumors (lymph node status, tumor size, tumor grade, peritumoral vascular emboli, status of RE and PR, tumor microvascular density) and the level of expression of HIF-1α mRNAs with metastasis-free survival is shown in Table 4 below. This table gives the results of an analysis of metastasis-free survival based on univariate and multivariate Cox regression in patients with breast cancer, taking into account clinicopathological parameters, tumor microvascular density and level. HIF-1α mRNAs. - 27 - Table 4 Characteristics Univariate analysis P Multivariate analysis P Exp. B (95% CI) Exp. B (95% CI) Age, years <50 1 0.22 50 1.63 Lymph node positive 1 1 0.002 0 1-3 8.0 [2.6-24.3] 0.003 9.2 [2.3 -37.5] 4-9 6.7 [1.5-29.6] 14.3 [2.4-83.6] 10 3.4 [0.8-14.4] 0.3 [0 , 04-3.3] Tumor size (mm) 1 1 0.084 _ <10 10-20 1.04 [0.13-8.50] 0.16 0.9 [0.08-9.5] 20-50 2.9 [0.38-22.6] 3.9 [0.3-45.2]> 50 2.5 [0.16-40] 9.1 [0.3-287] Grade (SBR) 0.52 1, 2 1 3 1.33 [0.55-3.22] Peritumoral vascular emboli (EB) 1 0.15 absent present 2.43 [0.71-8.27] ER 0.379 [ 0.15-0.94] 0.035 positive negative 0.228 [0.08-0.64] 0.004 0.19 [0.04-0.81] 0.025 PR positive negative 1.022 [0.99-1.057] 0.20 Density microvascular tumor Level of HIF-laTAG mRNA 1.03 [1.003-1.05] 0.03 0.98 [0.95-1] 0.164 The results obtained show that the status of the lymph nodes (p = 0.003) , estrogen receptor (ER) status (p = 0.035), progesterone receptor status (p = 0.004) and HIF-laTA mRNA level (p = 0.03) are significantly predictive of survival.without metastases. Breast cancer patients who have a high level of HIF-laTAC mRNA expression (median cutoff = 9.95) have a much higher risk of relapse.

Le niveau d'expression des autres produits de transcription de HIF-la n'est pas associé au pronostic (non représenté). L'analyse multivariée de Cox permet de déterminer que le statut des ganglions lymphatiques (p = 0,002) et le statut des PR (p = 0,025) sont des prédicteurs indépendants de la survie sans métastases. Le niveau d'ARNm de HIF-laTAG n'est pas une variable pronostique indépendante significative. La figure 7 est un graphique selon Kaplan-Meier pour des patientes atteintes de cancer du sein et il illustre la survie sans métastases en fonction du niveau d'ARNm de HIF-laTAc (seuil médian = 9,95) chez les patientes atteintes de cancer du sein (p = 0,03). The level of expression of other HIF-1α transcripts is not associated with prognosis (not shown). Cox multivariate analysis can determine that lymph node status (p = 0.002) and RA status (p = 0.025) are independent predictors of metastasis-free survival. The level of HIF-laTAG mRNA is not a significant independent prognostic variable. Figure 7 is a Kaplan-Meier graph for breast cancer patients and illustrates metastasis free survival as a function of HIF-laTAc mRNA level (median cutoff = 9.95) in cancer patients breast (p = 0.03).

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1 - Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, Barbany G, Cazzaniga G, Cayuela JM, Cave H, Pane F, Aerts JL, De Micheli D, Thirion X, Pradel V, Gonzalez M, Viehmann S, Malec M, Saglio G, van Dongen JJ. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003; 17: 2318-2357. 2 - Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adélaïde J, Chaffanet M, Mozziconacci MJ, Hassoun J, Viens P, Birnbaum D, Jacquemier J. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3):286-98. 3 - Bièche I, Laurendeau I, Tozlu S, Olivi M, Vidaud D, Lidereau R, Vidaud M. Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay. Cancer Res. 1999;59(12):2759-65. BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES 1 - Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, Barbany G, Cazzaniga G, Cayuela JM, Cave H, Pane F, Aerts JL, De Micheli D, Thirion X, Pradel V, Gonzalez M, Viehmann S, Malec M, Saglio G, van Dongen JJ. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003; 17: 2318-2357. 2 - Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adélaïde J, Chaffanet M, Mozziconacci MJ, Hassoun J, Viens P, Birnbaum D, Jacquemier J. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer . J Pathol. 2004; 202 (3): 286-98. 3 - Bièche I, Laurendeau I, Tozlu S, Olivi M, Vidaud D, Lidereau R, Vidaud M. Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay. Cancer Res. 1999; 59 (12): 2759-65.

Claims

1 - Use as biomarkers at the transcriptional level or at the protein level of pathologies or cellular stress associated with hypoxic situations, of one or more HIF-laTAC splicing variants, the TAG motif being located between exons 1 and

2. 2 - In vitro method of patient survival prognosis, characterized in that it is applied to a pathological sample from a patient suffering from a pathology with deregulation of oxygen homeostasis and that it comprises the use as a biomarker, at the transcriptional level or at the protein level, of one or more HIF-ILTAC splice variants, the TAG motif being located between exons 1 and 2.

3 - Method according to claim 2, characterized in that it comprises: - the quantification of the splicing variant (s) in the sample originating from said patient; - comparison with a reference value defined as the median value of a plurality of quantification measurements of the HIF-1TAG splice variants on pathological samples belonging to different individuals. 25

4 - Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the quantification relates to the mRNAs of said variants. 30

5 - Method according to claim 4, characterized in that the quantification is carried out by RQ-PCR.

6 - Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the quantification relates to the protein variants.

7 - Method according to claim 6, characterized in that the quantification is carried out by immunohistochemistry methods, using antibodies or by mass spectrometry.

8 - Method according to any one of claims 1 to 7 characterized in that it is applied in oncology.

9. A method according to claim 8, characterized in that it is applied to a sample of breast cancer tissue.

10 - Method according to claim 8 or 9, characterized in that an increase, in the sample tested, of the level of the quantified variant (s) relative to a reference value, is indicative of tumor aggressiveness.

11 - Method according to claim 10, characterized in that said increase is indicative of a high probability of metastases.

12 - Application of the method according to any one of claims 2 to 11, for measuring the effectiveness of a treatment. 30

13 - Kit for implementing the method according to any one of claims 2 to 12, characterized in that it comprises: - PCR primers or anti-HIF-la TAC antibodies where appropriate immobilized on a solid support, reagents necessary for the quantification of the HIF-laTZ splice variants at the mRNA level or at the protein level.