WO2009063111A1 - Método y kit para predecir la supervivencia de pacientes con linfoma de células del manto - Google Patents
Método y kit para predecir la supervivencia de pacientes con linfoma de células del manto Download PDFInfo
- Publication number
- WO2009063111A1 WO2009063111A1 PCT/ES2008/000707 ES2008000707W WO2009063111A1 WO 2009063111 A1 WO2009063111 A1 WO 2009063111A1 ES 2008000707 W ES2008000707 W ES 2008000707W WO 2009063111 A1 WO2009063111 A1 WO 2009063111A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- genes
- tnfrsf10b
- slc29a2
- pole2
- ran
- Prior art date
Links
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 title claims abstract description 66
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 44
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102100029910 DNA polymerase epsilon subunit 2 Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 101000864190 Homo sapiens DNA polymerase epsilon subunit 2 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 108091006544 SLC29A2 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000045002 Equilibrative nucleoside transporter 2 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 claims abstract description 20
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 5
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims 1
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000011309 routine diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006311 Cyclin D1 Human genes 0.000 description 1
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036329 Cyclin-dependent kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100024829 DNA polymerase delta catalytic subunit Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100021699 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Human genes 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000684275 Homo sapiens ADP-ribosylation factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000868333 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000945639 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000909198 Homo sapiens DNA polymerase delta catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000896557 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Proteins 0.000 description 1
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101001130437 Homo sapiens Ras-related protein Rap-2b Proteins 0.000 description 1
- 101000838456 Homo sapiens Tubulin alpha-1B chain Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031421 Ras-related protein Rap-2b Human genes 0.000 description 1
- 108091006179 SLC29 Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102100028969 Tubulin alpha-1B chain Human genes 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009104 chemotherapy regimen Methods 0.000 description 1
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
Definitions
- the present invention relates to diagnostic and prognostic methods for malignant tumors, in particular malignant lymphomas, and more particularly to diagnostic and prognostic methods for mantle cell lymphoma.
- the mantle cell lymphoma is a differentiated subtype of non-Hodgkin B-cell lymphoma (NHL-B) characterized by the translocation t (11; 14) (q13; 32) and the overexpression of the Cyclin D1.
- NEL-B non-Hodgkin B-cell lymphoma
- the clinical course of these patients can be very variable.
- the LCM shows an aggressive clinical behavior with little response to existing treatments, and the average survival of the LCM patients after diagnosis is between 3 and 5 years. However, some patients die from the disease in less than 6 months, while others survive more than 10 years.
- the current therapeutic approaches for LCM patients are fairly uniform and rarely reflect this widely variable clinical behavior.
- the strongest predictor of survival in patients with LCM was identified by analyzing the gene expression profiles of a large series of patients with LCM (Rosenwald A. et al., "The proliferation gene expression signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts survival in mantle cell lymphoma ", Cancer CeII, 2003, vol. 3, p. 185- 197).
- a molecular predictor was constructed based on the gene expression of 20 genes associated with the proliferation that allowed the definition of prognosis subgroups of patients with LCM in that the average survival differed by about 6 years.
- Ki-67 The potential indirect marker Ki-67 measured by immunohistochemistry has attracted a lot of attention recently.
- the present inventors have developed a precise and quantitative model of the survival of LCM patients based on gene expression that implies a minimum number of genes and is applicable in the diagnostic routine in both frozen fresh tissues and in formalin fixed tissues and included in paraffin (FFIP) of patients with LCM.
- FFIP paraffin
- the present invention provides a method of predicting the survival of a patient suffering from a mantle cell lymphoma, the steps comprising (a) obtaining a sample from said patient; (b) measuring the expression level of at least four genes selected from the group consisting of: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 and TNFRSF10B in said sample; and (c) compare the level of expression of each of the genes measured with the expression of one or more endogenous control genes.
- the test of the present invention allows a prediction Quantitative clinical course of LCM patients at the time of diagnosis, based on gene expression measures of at least four of the five genes referenced above.
- the test of the invention is applicable in most cases of LCM with frozen tissue and / or FFIP available.
- the high expression of RAN, MYC, POLE2 and SLC29A2 is related to a worse prognosis, while the increased expression of.
- the test of the present invention allows a quantitative prediction of the clinical course of LCM patients at the time of diagnosis, based on gene expression measures of at least four of the five genes referenced above.
- the test of the invention is applicable in most cases of LCM with frozen tissue and / or FFIP available.
- the high expression of RAN; MYC, POLE2 and SLC29A2 is related to a worse prognosis, while the increased expression of TNFRSF10B correlates with a more favorable clinical course.
- the Ki-67 index is able to define risk groups in FFIP samples of patients with LCM.
- the evaluation of the Ki-67 index is based on individual microscopic observations made by a pathologist. Most of the published series represent research carried out in a single institution. For example, in a recent multicentre study of immunohistochemistry, it was found that the variation between laboratories in the staining and titration procedures of K ⁇ -67 was surprisingly high.
- the test of the present invention provides a quantitative measure of the levels of gene expression associated with proliferation, improving the predictive capacity of existing immunohistochemical techniques that are mostly semi-quantitative (Rosenwald et al. Up). As illustrated below, the test seems superior, since it better discriminates the survival of patients, and is more objective than the immunohistochemical measure of the Ki-67 index, its application being possible using an automated technical platform. By integrating this approach in future studies of LCM, it seems possible to carry out a step towards an LCM therapy adapted to the risk of suffering the disease. This is of great importance, since with the method according to the present invention it is possible to determine how aggressive a lymphoma is and, therefore, it is possible to establish the appropriate treatment for the patient. Therefore, with the method of invention, more individualized and risk-adapted strategies can be tested in prospective clinical processes.
- the tissue of the sample is fresh, frozen or fixed in formalin and included in paraffin.
- RNA in tumor tissues preventing subsequent analysis by molecular techniques such as quantitative RT-PCR. This is because these techniques are based on certain genes (marker genes) that can be broken into fragments if the sample is processed (ie, frozen, fixed in formalin or included in paraffin). If the marker genes are broken into fragments, the information obtained from these tests does not reflect the real situation of the patient.
- the test of the present invention can be carried out using samples from the processed patients. This is due to the fact that the amplicons designed for the fragments of the genes that make up the test of the invention are not affected when they are subjected to conservation techniques such as freezing, formalin fixation and inclusion in paraffin, among others. This is very important since the information provided by the test of the invention (by the quantitative measurement of the levels of gene expression of at least four of the genes mentioned above) reflects with great precision the situation of the patient. In the experiments included below, the success of the qRT-PCR analysis of mRNA derived from FFIP tissues depended largely on the small sizes of the amplicons (optimally up to 80 bp).
- the level of expression of four genes selected from the group consisting of: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 and TNFRSF10B is measured.
- the expression level of MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 and TNFRSF10B is measured.
- RAN is a small GTP binding protein that belongs to the superfamily of RAS and is required for the translocation of RNA and proteins through the nuclear pore complex, as well as for the control of DNA synthesis and cell cycle progression .
- the gene sequence is available in the Genbank database with reference number NC_000012.10.
- MYC is a transcription factor that plays a key role in cell cycle progression and apoptosis.
- the deregulation of MYC by mutation, overexpression or chromosomal rearrangements are common events in hematological malignancies.
- the gene sequence is available in the Genbank database with the reference number NC_000008.9.
- TNFRSF10B is a member of the TNF receptor superfamily that mediates an apoptotic signal through its activation by the TRAIL cytokine.
- the gene sequence is available in the Genbank database with reference number NT_023666.17.
- POLE2 is the epsilon B subunit of DNA polymerase and, consequently, is involved in the replication of DNA, its repair and recombination and the control functions of the cell cycle.
- the gene sequence is available in the Genbank database with reference number NC_000014.7.
- SLC29A2 is a member of the SLC29 family of nucleoside transporters that carry a diverse range of nucleosides from purine and pyrimidine.
- the gene sequence is available in the Genbank database with reference number NC 000011.8.
- the levels of gene expression are measured by the chain reaction of the quantitative polymerase in real time.
- the size of the amplicon for each of the MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 and TNFRSF10B genes is equal to or less than 80 base pairs.
- Endogenous control genes are well known in the art as internal genes used when the expression of a particular gene has to be measured. These genes do not change their expression levels during the development of the cell, the treatment or the state of the mantle cell lymphoma.
- the endogenous control gene is B2M.
- the present invention provides a kit for carrying out the method according to the first aspect of the invention, comprising suitable means for measuring the level of expression of at least four of the genes selected from the group consisting of : MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 and TNFRSF10B and one or more endogenous control genes.
- suitable means comprise two pairs of oligonucleotides suitable as primers for the amplification of at least four of the genes selected from the group consisting of: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 and TNFRSF10B and one or more endogenous control genes.
- the kit comprises two pairs of oligonucleotides suitable as primers for the amplification of the MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 and TNFRSF10B genes. Even more preferably, the kit comprises substances required to carry out the polymerase chain reaction in real time. Even more preferably, the endogenous control gene is B2M.
- the method and kit according to the present invention are simple because they involve a minimum number of quantitative genes, applicable in routine diagnosis to a wide variety of samples, and provide a capacity for prediction of the survival of patients with LCM higher than current methods.
- FIG. 1 represents the value of the C index according to the number of genes included in the predictor of survival.
- a model of four or five genes according to the present invention predicts survival with great precision. Survival predictors composed of 4/5 genes are superior compared to the predictive value of the proliferation rate of Ki-67.
- FIG. 2 represents the Kaplan-Meier curves to visualize survival groups according to the predictor of five genes in A) tumor samples of frozen fresh tissues from 73 patients with LCM; and B) FFIP samples from 42 patients with LCM.
- Each line represents a subset of LCM patients defined by the predictor value of 5 genes and survival data.
- the application of the 5 gene model resulted in the definition of subgroups of MCL that differed in an average survival of more than 5 years in the case of fresh frozen tumor samples (FIG. 2A), and 3 years in the case of FFIP samples ( FIG. 2B).
- Frozen tumor samples from 73 newly diagnosed mantle cell lymphoma (LCM) patients were obtained from the Pathology Institute of the University of Würzburg and the Clinical Hospital of Barcelona. 15 of the 73 samples of LCM had been included in a previous study based on gene expression. Tumor samples fixed in formalin and included in paraffin (FFPI) corresponding to 13 of the 73 LCM patients as well as FFPI samples of 57 independent LCM cases, including 22 cases of the Kiel Pathology Institute, were obtained for the validation of the results. Of these, 42 tumors had amplifiable cDNA. The diagnosis was established according to the WHO criteria, and the study was approved by the Ethical Committee of each institution.
- FFPI paraffin
- LCM Mantle Cell Lymphoma
- FFIP fixed in formalin, included in paraffin
- M woman
- H male
- n.d. not available
- RNA of the frozen samples was obtained using the TRIzol® reagent and following the manufacturer's instructions (Invitrogen Life Technologies®, Carlsbad, CA, USA).
- the RNA of the FFIP samples was obtained as it had been described above with minor modifications. The detailed protocol is found in the supplementary information.
- the integrity of the RNA was examined with the Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies®, Palo Alto, CA, USA). Complementary DNA synthesis was carried out from 1 ⁇ g of total RNA with the High Capacity cDNA Archive Kit reagent (Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA) and following the manufacturer's instructions.
- the inventors selected 33 genes with a potential prognostic and pathogenic impact on LCM. These genes were analyzed using a TaqMan ® low density array platform of our own design (Micro Fluidic Cards, Applied Biosystems ® ). In particular, the selection included genes involved in the proliferation signature (Rosenwald et al., Above), cell cycle, apoptosis, nucleoside transport and metabolic processes. The predesigned tests chosen are found in Table 2. The qRT-PCR was performed using the ABI Prism ® 7900 HT Sequence Detection system under standard conditions (Applied Biosystems ® ). The primary data was analyzed with the Sequence Detector System (SDS) version 2.1 (Applied)
- the qRT-PCR based predictor was tested on a series of routine LCM samples fixed in formalin and included in paraffin (FFIP) (Supplementary Table 2 ).
- FFIP paraffin
- the amplicon size of the pre-designed trials chosen for the low density array platform (Micro Fluidic Cards) was greater than 100 bp. These amplicons did not show amplification or very late in the FFIP samples. For this reason, the assays were modified slightly to reduce the size of the amplicons and optimize the performance of the qRT-PCR, as described in the Material and Methods section.
- 18 cases of the initial series were selected that had tumor tissues in FFIP obtained from the same biopsy at diagnosis and subsequently analyzed using the optimized trials. 13 of the 18 samples (72%) were successful in the amplification of all five genes using the modified qRT-PCR assays.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
El linfoma de células del manto (LCM) es un subtipo diferenciado de linfoma no-Hodgkin de células B (LNH-B). La invención proporciona un método y un kit para la predicción de la supervivencia de un paciente que sufre un LCM, basado en la medida del nivel de expresión de al menos cuatros genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B en la muestra del paciente. El método y kit son simples por implicar un número mínimo de genes, cuantitativos, aplicables en el diagnóstico de rutina a una gran variedad de muestras, y proporcionan una capacidad de predicción de la supervivencia de los pacientes con LCM más elevada que los métodos actuales.
Description
Método v kit para predecir Ia supervivencia de pacientes con linfoma de células del manto
La presente invención se relaciona con métodos de diagnóstico y pronóstico de tumores malignos, en particular, linfomas malignos, y más particularmente con métodos de diagnóstico y pronóstico del linfoma de células del manto.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El linfoma de células del manto (LCM) es un subtipo diferenciado de linfoma no-Hodgkin de células B (LNH-B) caracterizado por Ia translocación t(11 ;14)(q13;32) y Ia sobreexpresión de Ia Ciclina D1. El curso clínico de estos enfermos puede ser muy variable. Generalmente, el LCM muestra un comportamiento clínico agresivo con poca respuesta a los tratamientos existentes en Ia actualidad, y Ia supervivencia media de los pacientes de LCM después del diagnóstico se sitúa entre los 3 y 5 años. De todos modos, algunos pacientes mueren por Ia enfermedad en menos de 6 meses, mientras que otros sobreviven más de 10 años. Las aproximaciones terapéuticas actuales para los pacientes de LCM son bastante uniformes y raramente reflejan este comportamiento clínico ampliamente variable.
En los últimos años, se han llevado a cabo muchos intentos para identificar marcadores clínicos, histológicos y moleculares que permitan estratificar los pacientes de LCM en diferentes grupos de riesgo. Morfológicamente, se han identificado dos variantes de LCM, llamadas variantes típica o clásica y blastoide. Los casos de LCM blastoides muestran un comportamiento clínico peor. Genéticamente, las alteraciones que afectan Ia maquinaria del ciclo celular y las vías de respuesta al daño del ADN parecen ser características del LCM. Las alteraciones genéticas secundarias en LCM afectan frecuentemente reguladores clave de estas vías y también se asocian con un comportamiento clínico inferior.
El predictor más fuerte de Ia supervivencia en los pacientes con LCM se identificó mediante el análisis de los perfiles de expresión génica de una serie grande de pacientes con LCM (Rosenwald A. et al., "The proliferation gene expression signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts survival in mantle cell lymphoma", Cáncer CeII, 2003, vol. 3, p. 185-
197). En particular, se construyó un predictor molecular basado en Ia expresión génica de 20 genes asociados con Ia proliferación que permitió Ia definición de subgrupos pronóstico de pacientes con LCM en que Ia supervivencia media difería en cerca de 6 años. Este predictor de Ia supervivencia demostró ser superior a otros marcadores moleculares pronóstico tanto solos como en combinación y por Io tanto se vio como un integrador de múltiples eventos oncogénicos (Rosenwald et al., arriba). La plataforma técnica basada en microarrays actualmente no es factible para su aplicación en Ia rutina clínica.
El marcador indirecto potencial Ki-67 medido por inmunohistoquímica ha atraído mucha atención recientemente. En diversos estudios, índice elevados de Ki-67 en células tumorales de LCM se relacionaron con menor supervivencia de los pacientes y Ia medida de Ia proliferación de las células tumorales a través de K¡-67 es ahora parte del procedimiento de rutina diagnóstica en muchos centros de linfoma. De todos modos, las técnicas inmunohistoquímicas son sólo semicuantitativas y, en un reciente estudio multicéntrico de ¡nmunohistoquímica, Ia concordancia entre los procedimientos de tinción y valoración de Ki-67 en diversos laboratorios con experiencia fue menos que satisfactoria.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los presentes inventores han desarrollado un modelo preciso y cuantitativo de Ia supervivencia de los pacientes de LCM basado en Ia expresión génica que implica un mínimo número de genes y es aplicable en Ia rutina diagnóstica tanto en tejidos frescos congelados como en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFIP) de pacientes con LCM.
Así, en un aspecto Ia presente invención proporciona un método de predicción de Ia supervivencia de un paciente que sufre un linfoma de células del manto, comprendiendo los pasos de (a) obtener una muestra de dicho paciente; (b) medir el nivel de expresión de al menos cuatros genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B en dicha muestra; y (c) comparar el nivel de expresión de cada uno de los genes medidos con Ia expresión de uno o más genes control endógenos. El test de Ia presente invención permite una predicción
cuantitativa del curso clínico de los pacientes de LCM en el momento del diagnóstico, basado en las medidas de expresión génica de al menos cuatro de los cinco genes referenciados más arriba. Ventajosamente el test de Ia invención es aplicable en Ia mayoría de casos de LCM con tejido congelado y/o FFIP disponible. La alta expresión de RAN, MYC, POLE2 y SLC29A2 se relaciona con un peor pronóstico, mientras que Ia expresión incrementada de. El test de Ia presente invención permite una predicción cuantitativa del curso clínico de los pacientes de LCM en el momento del diagnóstico, basado en las medidas de expresión génica de al menos cuatro de los cinco genes referenciados más arriba. Ventajosamente el test de Ia invención es aplicable en Ia mayoría de casos de LCM con tejido congelado y/o FFIP disponible. La alta expresión de RAN; MYC, POLE2 y SLC29A2 se relaciona con un peor pronóstico, mientras que Ia expresión incrementada de TNFRSF10B correlaciona con un curso clínico más favorable.
Por otro lado, como se ha mencionado arriba el índice Ki-67 es capaz de definir grupos de riesgo en muestras FFIP de pacientes con LCM. La evaluación del índice Ki-67 se basa en observaciones microscópicas individuales hechas por un patólogo. La mayoría de las series publicadas representan investigaciones llevadas a cabo en una única institución. Por ejemplo, en un reciente estudio multicéntrico de ¡nmunohistoquímica, se encontró que Ia variación entre laboratorios en los procedimientos de tinción y valoración de K¡-67 era sorprendentemente alta.
El test de Ia presente invención proporciona una medida cuantitativa de los niveles de expresión de genes asociados a Ia proliferación mejorando Ia capacidad predictiva de las técnicas inmunohistoquímicas existentes que en su mayoría son semicuantitativas (Rosenwald et al..arriba). Como se ¡lustra más abajo, el test parece superior, ya que discrimina mejor Ia supervivencia de los pacientes, y es más objetivo que Ia medida inmunohistoquímia del índice Ki-67, siendo posible su aplicación usando una plataforma técnica automatizada. Mediante Ia integración de esta aproximación en estudios futuros de LCM, parece posible Ia realización de un paso adelante hacia una terapia de LCM adaptada al riesgo a sufrir Ia enfermedad. Esto es de gran importancia, ya que con el método de acuerdo con Ia presente invención es posible determinar cómo de agresivo es un linfoma y, por Io tanto, es posible establecer el tratamiento apropiado para el paciente. Por Io tanto, con el
método de invención, se pueden probar en procesos clínicos prospectivos estrategias más individualizadas y adaptadas al riesgo.
En una realización del primer aspecto de Ia invención el tejido de Ia muestra es fresco, congelado o fijado en formol e incluido en parafina.
Las técnicas inmunohistoquímicas conocidas necesitan que Ia muestra esté en fresco. Los ácidos nucleicos del material FFIP están frecuentemente degradados debido al proceso de fijación con formol. Además, Ia fijación química modifica Ia estructura del ARN en tejidos tumorales impidiendo el análisis subsiguiente por técnicas moleculares como Ia RT-PCR cuantitativa. Esto es debido a que estas técnicas se basan en ciertos genes (genes marcadores) que se pueden romper en fragmentos si Ia muestra se procesa (es decir, congelada, fijada en formol o incluida en parafina). Si los genes marcadores se rompen en fragmentos, Ia información obtenida de estos tests no refleja Ia situación real del paciente. Esto significa que cuando el médico tiene que determinar Ia supervivencia del paciente, el tiempo pasado entre Ia extracción de Ia muestra (tejido) y el análisis tiene que ser cuanto más corto mejor para evitar Ia fragmentación de los genes marcadores presentes en Ia muestra del paciente y, por tanto, para evitar Ia pérdida de información que se necesita para hacer Ia estimación real del tiempo de supervivencia del paciente.
Sorprendentemente, el test de Ia presente invención puede llevarse a cabo usando muestras de los pacientes procesadas. Esto se debe al hecho que los amplicones diseñados para los fragmentos de los genes que componen el test de Ia invención no se encuentran afectados cuando se someten a técnicas de conservación como Ia congelación, Ia fijación en formol e inclusión en parafina, entre otras. Esto es muy importante ya que Ia información proporcionada por el test de Ia invención (por Ia medida cuantitativa de los niveles de expresión génica de al menos cuatro de los genes mencionados más arriba) refleja con gran precisión Ia situación del paciente. En los experimentos incluidos más abajo, el éxito del análisis de qRT-PCR de ARNm derivado de tejidos FFIP dependió en gran parte de los tamaños pequeños de los amplicones (óptimamente hasta 80 pb). Usando ensayos optimizados de qRT-PCR fue posible amplificar ARN de cerca del 75% de las muestras de archivo examinadas. Más importante, el porcentaje
de éxito entre los casos más recientes recogidos como parte de estudios clínicos prospectivos llegó al 86% que está en el rango de las tinciones de Ki- 67 analizables en un estudio reciente.
En otra realización del primer aspecto de Ia invención, se mide el nivel de expresión de cuatro genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B. Preferiblemente, se mide el nivel de expresión de MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B.
RAN es una pequeña proteína de unión a GTP que pertenece a Ia superfamília de RAS y se requiere para Ia translocación del ARN y proteínas a través del complejo del poro nuclear, así como para el control de Ia síntesis del ADN y Ia progresión del ciclo celular. La secuencia del gen se encuentra disponible en Ia base de datos Genbank con el número de referencia NC_000012.10.
MYC es un factor de transcripción que juega un papel clave en Ia progresión del ciclo celular y Ia apoptosis. La desregulación de MYC por mutación, sobreexpresión o reordenamientos cromosómicos son eventos comunes en malignidades hematológicas. La secuencia del gen se encuentra disponible en Ia base de datos Genbank con el número de referencia NC_000008.9.
TNFRSF10B es un miembro de Ia superfamilia de receptores TNF que media una señal apoptótica mediante su activación por Ia citoquina TRAIL. La secuencia del gen se encuentra disponible en Ia base de datos Genbank con el número de referencia NT_023666.17.
POLE2 es Ia subunidad epsilon B de Ia ADN polimerasa y, por consiguiente, está implicada en Ia replicación del ADN, su reparo y recombinación y las funciones de control del ciclo celular. La secuencia del gen se encuentra disponible en Ia base de datos Genbank con el número de referencia NC_000014.7.
SLC29A2 es un miembro de Ia familia SLC29 de transportadores de nucleósidos que transportan un rango diverso de nucleósidos de Ia purina y Ia pirimidina. La secuencia del gen se encuentra disponible en Ia base de datos Genbank con el número de referencia NC 000011.8.
En una realización del primer aspecto de Ia invención, los niveles de expresión génica se miden por Ia reacción en cadena de Ia polimerasa cuantitativa a tiempo real.
En otra realización del primer aspecto de Ia invención, el tamaño del amplicón para cada uno de los genes MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B es igual o menor que 80 pares de bases.
Los genes control endógenos son bien conocidos en Ia materia como genes internos usados cuando Ia expresión de un gen particular se tiene que medir. Estos genes no cambian sus niveles de expresión durante el desarrollo de Ia célula, el tratamiento o el estado del linfoma de células del manto.
En otra realización del primer aspecto de Ia invención, el gen control endógeno es B2M.
En un segundo aspecto, Ia presente invención proporciona un kit para llevar a cabo el método de acuerdo con el primer aspecto de Ia invención, que comprende medios adecuados para medir el nivel de expresión de al menos cuatro de los genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B y de uno o más genes control endógenos. Preferiblemente, los medios adecuados comprenden dos pares de oligonucleótidos adecuados como cebadores para Ia amplificación de al menos cuatro de los genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B y de uno o más genes control endógenos. Más preferiblemente, el kit comprende dos pares de oligonucleótidos adecuados como cebadores para Ia amplificación de los genes MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B. Aún más preferiblemente, el kit comprende substancias requeridas para llevar a cabo Ia reacción en cadena de Ia polimerasa en tiempo real. Aún más preferiblemente, el gen control endógeno es B2M.
El método y kit de acuerdo con Ia presente invención son simples por implicar un número mínimo de genes, cuantitativos, aplicables en el diagnóstico de rutina a una gran variedad de muestras, y proporcionan una capacidad de
predicción de Ia supervivencia de los pacientes con LCM más elevada que los métodos actuales.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 representa el valor del índice C de acuerdo con el número de genes incluidos en el predictor de Ia supervivencia. Un modelo de cuatro o cinco genes de acuerdo con Ia presente invención predice Ia supervivencia con gran precisión. Los predictores de supervivencia compuestos por 4/5 genes son superiores comparados con el valor predictivo del índice de proliferación de Ki-67.
La FIG. 2 representa las curvas de Kaplan-Meier para visualizar los grupos de supervivencia de acuerdo con el predictor de cinco genes en A) muestras tumorales de tejidos frescos congelados de 73 pacientes con LCM; y B) muestras FFIP de 42 pacientes con LCM. Cada línea representa un subgrupo de pacientes de LCM definido por el valor del predictor de 5 genes y los datos de supervivencia. La aplicación del modelo de 5 genes resultó en Ia definición de subgrupos de MCL que diferían en una supervivencia media de más de 5 años en el caso de muestras tumorales frescas congeladas (FIG. 2A), y 3 años en el caso de muestras FFIP (FIG. 2B).
EJEMPLOS
A) Selección de casos
Muestras tumorales congeladas de 73 pacientes de linfoma de células del manto (LCM) recién diagnosticados se obtuvieron del Instituto de Patología de Ia Universidad de Würzburg y del Hospital Clínico de Barcelona. 15 de las
73 muestras de LCM habían sido incluidas en un estudio previo basado en Ia expresión génica. Muestras tumorales fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPI) correspondientes a 13 de los 73 pacientes de LCM así como muestras en FFPI de 57 casos de LCM independientes, incluyendo 22 casos del Instituto de Patología de Kiel, se obtuvieron para Ia validación de los resultados. De estos, 42 tumores tenían ADNc amplificable. El diagnóstico se estableció de acuerdo con los criterios de Ia OMS, y el estudio se aprobó por el Comité Ético de cada institución. Entre los 73 casos de LCM con material congelado disponible, 54 mostraban una morfología típica y 19 correspondían a Ia variante blastoide. Entre el grupo independiente de 42 casos de MCL con muestra FFIP, 35 eran variantes típicas y 7 blastoides. La tinción inmunohistoquímica para K¡-67 y Ia evaluación de Ia fracción de proliferación se realizó como ya se había descrito previamente (Tabla 1 , Tabla Suplementaria 1).
Tabla 1
Abreviaturas: LCM, Linfoma de Células del Manto; FFIP, Fijado en formol, incluido en parafina; M: mujer; H: varón; n.d., no disponible
B) Extracción de ARN y PCR de transcripción reversa
El ARN de las muestras congeladas se obtuvo usando el reactivo TRIzol® y siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen Life Technologies®, Carlsbad, CA, USA). El ARN de las muestras FFIP se obtuvo como se había
descrito anteriormente con pequeñas modificaciones. El protocolo detallado se encuentra en Ia información suplementaria. La integridad del ARN se examinó con el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies®, Palo Alto, CA, USA). La síntesis del ADN complementario se llevó a cabo a partir de 1 μg de RNA total con el reactivo High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
C) RT-PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR)
Los inventores seleccionaron 33 genes con un potencial impacto pronóstico y patogénico en LCM. Estos genes se analizaron usando una plataforma de arrays de baja densidad TaqMan® de diseño propio (Micro Fluidic Cards, Applied Biosystems®). En particular, Ia selección incluyó genes implicados en Ia signatura de proliferación (Rosenwald et al., arriba), ciclo celular, apoptosis, transporte de nucleósidos y procesos metabólicos. Los ensayos prediseñados escogidos se encuentran en Ia Tabla 2. La qRT-PCR se realizó usando el sistema ABI Prism®7900 HT Sequence Detection en condiciones estándares (Applied Biosystems®). Los datos primarios se analizaron con el programa Sequence Detector System (SDS) versión 2.1 (Applied
Biosystems®). Dos genes control se incluyeron en el estudio: 18S (obligatorio para Ia técnica) y β2-microglobulina (B2M, escogido de acuerdo con trabajos anteriores (Rosenwald et al., arriba). Los niveles de expresión génica se calcularon más adelante mediante el método de 2"ΔΔCt usando 18S y B2M como genes control endógenos (Tabla Suplementaria 2). Un caso de LCM de Ia serie se utilizó como calibrador matemático. Para una realización óptima de Ia qRT-PCR en material FFIP se redujo el tamaño del amplicón de cuatro genes a menos de 80 pb, porqué el ARN del material FFIP está muy degradado debido a los procesos de fijación en formol. El éxito del análisis de qRT-PCR con ARNm derivado de tejidos FFIP normalmente depende de los tamaños cortos del amplicón (óptimamente hasta 80 pb). De este modo, se escogieron ensayos prediseñados optimizados para SLC29A2 (Hs01546959_g1 ) y TNFRSF10B (Hs01043164_m1 ), y se modificaron sondas/pares de cebadores (utilizando el programa Primer Express®, Applied Biosystems®) para MYC (Sonda: 5'-CTTAGAGGTTGCTCAGACAA-3' (SEQ ID NO: 1 ), Cebador sentido: 5OGCAGCACAGTATGAGCACG-3' (SEQ ID NO: 2), Cebador antisentido: 5'-ATCCTCATCCGGGAGAGCA-3' (SEQ ID
NO: 3)) y RAN (Sonda: δ'-AGGAGGAACAAGAAGAT-S' (SEQ ID NO: 4), Cebador sentido: 5'-CACCACCAGCAGCGACTCT-3' (SEQ ID NO: 5), Cebador antisentido: 5'-ACAGAAACAACATCGATTTCTTCCT-3' (SEQ ID NO: 6)). Los niveles de expresión génica se calcularon como se ha descrito anteriormente usando B2M como gen control endógeno. El amplicón de POLE2 ya tenía menos de 80 pb (Tabla 2).
Tabla 2
* : Valor - ΔΔCT calculado de acuerdo con el gen control B2M.
# :Valor del material congelado (tarjetas m¡crofluídicas)/Valor del FFIP
&: Suma de los datos de expresión para los genes, cambiando el signo para TNFRSF10B.
D) Análisis estadístico
La supervivencia se estimó con el método Kaplan-Meier y se comparó por tests logrank. Se utilizaron los modelos de riesgos proporcionales de Cox multivariados para identificar los mejores subgrupos de genes con valor pronóstico. Las ratios de riesgo y los intervalos de confianza del 95% se estimaron a partir de los modelos y los tests de las ratios de semejanza se utilizaron para obtener significación estadística. La precisión predictiva se calculó usando el área bajo Ia curva ROC (Receiver Operating Characteristic) (C-index) derivada del estadístico D de Sommers adaptado para las observaciones censuradas. Se utilizó Ia validación interna por bootstrap del
procedimiento de selección stepwise para obtener Ia precisión predictiva corregida para un mejor ajuste. Los p-valores menores de 0.05 se consideraron significativos.
E) Resultados
E.1. Características de los pacientes con LCM
Los detalles clínicos e histológicos, los datos de supervivencia e información del índice Ki-67 para cada paciente se proporcionan en Ia Tabla 1 y en Ia Tabla Suplementaria 1. De forma importante, no se observaron diferencias entre las muestras de LCM congeladas y de FFIP en relación a Ia distribución de Ia media de edad, género, características histológicas, media de Ia supervivencia e índice medio de Ki-67 (Tabla 1 ). La gran mayoría (78%) de los pacientes con LCM recibieron una terapia basada en antraciclina
(Protocolos CHOP o similares) como tratamiento de primera línea, el 10% recibieron un régimen de quimioterapia intensificada (en su mayoría hiperCVAD), el 6% no recibieron quimioterapia y en el 6% Ia terapia era desconocida. No se observaron diferencias entre los grupos de tratamiento en Ia distribución de géneros, características histológicas y supervivencia global. El grupo con tratamiento intensificado incluía pacientes jóvenes (p=0.002) y estaba enriquecido para los tumores con ratios de proliferación incrementadas (Ki-67≥40%), aunque esta característica no era estadísticamente significativa (p=0.18).
E.2. Desarrollo de Ia RT-PCR cuantitativa a tiempo real basada en el predictor de Ia supervivencia en muestras de LCM congeladas.
Primero, se investigaron los niveles de expresión génica de los 33 genes seleccionados (Tabla 2) en muestras tumorales de tejido fresco congelado de 73 pacientes con LCM por qRT-PCR para construir un predictor cuantitativo de Ia supervivencia en muestras congeladas. En un análisis univariado usando B2M como gen control, 10 de los 33 genes se asociaban significativamente con Ia supervivencia, y estos genes se encuentran marcados con un asterisco en Ia Tabla 2 (p-value<0.05). Cuando se utilizó 18S como gen control, los niveles de expresión de estos 10 genes también se asociaban significativamente con Ia supervivencia demostrando Ia robustez
de los genes de referencia escogidos y Ia plataforma de arrays. Dos genes adicionales mostraron una significación límite (CDC2, p=0.053 y TUBA1B, p=0.054). Más importante, todos estos genes están implicados en el proceso biológico de Ia proliferación y 10 de los 12 genes se incluyeron en Ia signatura de proliferación basada en Ia expresión génica descrita anteriormente (Rosenwald et al., arriba). Este hallazgo subraya el valor pronóstico de Ia signatura de proliferación en muestras tumorales de LCM y confirma su valor en una serie grande e independiente de casos.
Tabla 3
Cuando los métodos estadísticos stepwise se aplicaron a los datos usando replicados de muestras bootstrap, los genes más frecuentemente seleccionados en los modelos pronóstico que comprendían entre uno y cinco genes eran los siguientes: MYC (45%), RAN (35%), SLC29A2 (31 %), HPRT1 (28%), POLE2 (26%), TNFRSF10B (25%) y CDKN3 (24%). Usando los datos de expresión génica de estos genes, se ajustaron todos los modelos posibles y se estudiaron aquellos con un menor error de predicción. El mejor predictor de Ia supervivencia se componía de los cinco genes RAN, MYC, TNFRSF10B, POLE2 y SLC29A2 (Índice-C= 0.762, Índice-C corregido para el ajuste usando bootstrap= 0.71 , 95%CI= 0.65-0.76). Es remarcable el hecho que un predictor compuesto por cuatro genes también proporciona una información precisa (Índice-C= 0.754) (Tabla 3, FIG. 1 y Tabla Suplementaria 2). En el modelo, niveles de expresión aumentados de RAN, MYC, POLE2 y SLC29A2 se correlacionaron con menor supervivencia, mientras que altos niveles de TNFRSF10B se asociaron con mayor supervivencia. Ya que todos los cinco genes incluidos en el modelo tenían coeficientes similares, se calculó un valor pronóstico simplificado usando coeficientes idénticos (+1 ; -1
para TNFRSF10B). La aplicación de este modelo resultó en Ia definición de subgrupos de LCM que diferían en una supervivencia media de más de 5 años (FIG. 2A1 logrank p-valor=1.1e"06). Ya que los tumores con índices elevados de Ki-67 se encontraban enriquecidos (pero no eran estadísticamente diferentes) en los pacientes con LCM y tratamiento intensificado, el ajuste del modelo en función del tratamiento resultó en un p- valor de significación similar (logrank p-valor=1.7e~07). El predictor de cinco genes y el índice Ki-67 demostraron estar correlacionados (Correlación de Pearson=0.58). De todos modos, los dos proporcionaron un valor pronóstico independiente en un modelo multivariado con los dos factores. Más importante, el predictor de cinco genes era superior comparado con el poder predictivo del índice de proliferación K¡-67 (p-valor <0.0001 para el predictor de cinco genes ajustado para K¡-67).
E.3. Aplicación del predictor de cinco genes en tejido de rutina fijado en formol e incluido en parafina (FFIP)
Para evaluar el potencial del modelo de cinco genes para su aplicación general en Ia rutina diagnóstica, se probó el predictor basado en qRT-PCR en una serie de muestras de LCM de rutina fijadas en formol e incluidas en parafina (FFIP) (Tabla Suplementaria 2). Para 4 de los 5 genes del modelo, el tamaño del amplicón de los ensayos prediseñados escogidos para Ia plataforma de arrays de baja densidad (Micro Fluidic Cards) era mayor de 100 pb. Estos amplicones no mostraban amplificación o bien muy tardía en las muestras de FFIP. Por esta razón, los ensayos se modificaron levemente para reducir el tamaño de los amplicones y optimizar el rendimiento de Ia qRT-PCR, como se describe en Ia sección de Material y Métodos. En un primer paso, un grupo de 22 muestras congeladas de LCM seleccionado al azar, que eran parte de Ia serie inicial, se utilizaron para probar los ensayos de qRT-PCR modificados. Este análisis demostró una correlación excelente entre los ensayos originales prediseñados y los modificados (p-valor<0.0001 ). En un segundo paso, se seleccionaron 18 casos de Ia serie inicial que tenían tejidos tumorales en FFIP obtenidos de Ia misma biopsia al diagnóstico y se analizaron subsecuentemente usando los ensayos optimizados. 13 de las 18 muestras (72%) tuvieron éxito en Ia amplificación de todos los cinco genes usando los ensayos de qRT-PCR modificados. Aunque las muestras de FFIP generalmente amplificaron a valores CT mayores, los niveles de expresión
génica normalizados obtenidos del ARN extraído de los tejidos en FFIP eran comparables a los obtenidos de los tejidos congelados (Correlación de Pearson=0.77, p=0.002).
E.4. Validación del predictor de supervivencia de cinco genes en una serie independiente de muestras tumorales de LCM en FFIP
Para una posterior validación en un grupo de datos independientes, se examinó el funcionamiento del predictor de cinco genes en una serie adicional de 57 muestras de LCM con datos clínicos y bloques de tejido en FFIP disponibles. 42 de las 57 muestras FFIP (74%) amplificaron para todos los cinco genes del modelo (Tabla 1 , Tabla Suplementaria 1 y Tabla Suplementaria 2). Más importante, Ia ratio de éxito entre los casos más recientes (1998-2003) obtenidos como parte de procesos clínicos prospectivos fue del 86%. En esta serie independiente de casos, el modelo predijo con éxito Ia supervivencia de los pacientes con LCM (logrank p- valor=0.011 , ajustado para el tratamiento 0.023). Como ilustración, las curvas de Kaplan-Meier se muestran en Ia FIG. 2B mostrando tres subgrupos que difieren en una supervivencia media de más de 3 años (FIG. 2B). De todos modos es destacable que el modelo de cinco genes predice Ia supervivencia de forma lineal con un tiempo de supervivencia predicho definido para cada paciente individual. En Ia serie de validación, el índice de proliferación Ki-67 también era un predictor significativo de Ia supervivencia (p-valor=0.008).
Claims
1. Método para predecir Ia supervivencia de un paciente que sufre un linfoma de células del manto, comprendiendo los pasos de (a) obtener una muestra de dicho paciente; (b) medir el nivel de expresión de al menos cuatros genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B en dicha muestra; y (c) comparar el nivel de expresión de cada uno de los genes medidos con Ia expresión de uno o más genes control endógenos.
2. Método según Ia reivindicación 1 , donde si el nivel de expresión de los genes RAN, MYC, POLE2 y SLC29A2 es mayor que el nivel de expresión del gen control endógeno y el nivel de expresión de TNFRSF10B es menor que el nivel de expresión del gen control endógeno se correlacionan con un peor pronóstico.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde Ia muestra es una muestra de tejido que es fresca, congelada o fijada en formol e incluida en parafina.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se mide el nivel de expresión de cuatro genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde se mide el nivel de expresión de MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los niveles de expresión génica se miden por Ia reacción en cadena de Ia polimerasa cuantitativa a tiempo real.
7. Método según Ia reivindicación 6, donde el tamaño del amplicón para cada uno de los genes MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B es igual o menor que 80 pares de bases.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el gen control endógeno es B2M.
9. Kit para llevar a cabo el método definido en Ia reivindicación 1 , que comprende medios adecuados para medir el nivel de expresión de al menos cuatro de los genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B y de uno o más genes control endógenos.
10. Kit según Ia reivindicación 9, donde los medios adecuados comprenden dos pares de oligonucleótidos adecuados como cebadores para Ia amplificación de al menos cuatro de los genes seleccionados del grupo que consiste en: MVC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B y de uno o más genes control endógenos.
11. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que comprende dos pares de oligonucleótidos adecuados como cebadores para Ia amplificación de los genes MYC1 RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B.
12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que comprende substancias requeridas para llevar a cabo Ia reacción en cadena de Ia polimerasa en tiempo real.
13. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el gen control endógeno es B2M.
14. Uso del kit como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en Ia predicción de Ia supervivencia de un paciente que sufre un linfoma de células del manto.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200703071A ES2334610B1 (es) | 2007-11-14 | 2007-11-14 | Metodo y kit para predecir la supervivencia de pacientes con linfoma de celulas del manto. |
| ESP200703071 | 2007-11-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2009063111A1 true WO2009063111A1 (es) | 2009-05-22 |
Family
ID=40638367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/ES2008/000707 WO2009063111A1 (es) | 2007-11-14 | 2008-11-14 | Método y kit para predecir la supervivencia de pacientes con linfoma de células del manto |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2334610B1 (es) |
| WO (1) | WO2009063111A1 (es) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2352777A1 (es) * | 2009-07-31 | 2011-02-23 | Hospital Clinic De Barcelona | Metodo y kit para el pronostico del linfoma de celulas del manto. |
-
2007
- 2007-11-14 ES ES200703071A patent/ES2334610B1/es active Active
-
2008
- 2008-11-14 WO PCT/ES2008/000707 patent/WO2009063111A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (8)
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2352777A1 (es) * | 2009-07-31 | 2011-02-23 | Hospital Clinic De Barcelona | Metodo y kit para el pronostico del linfoma de celulas del manto. |
| WO2011012763A3 (es) * | 2009-07-31 | 2011-08-11 | Hospital Clínic De Barcelona | Método y kit para el pronóstico de linfoma de células del manto |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2334610B1 (es) | 2011-01-27 |
| ES2334610A1 (es) | 2010-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2735993T3 (es) | Métodos para predecir el resultado clínico del cáncer | |
| Hartmann et al. | Five-gene model to predict survival in mantle-cell lymphoma using frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue | |
| ES2812105T3 (es) | Algoritmo y evaluación del perfil de expresión génica para determinar el pronóstico del cáncer de próstata | |
| ES2741745T3 (es) | Método para usar la expresión génica para determinar el pronóstico de cáncer de próstata | |
| JP6147755B2 (ja) | 乳癌の予後を予測する方法 | |
| CN105917008B (zh) | 用于前列腺癌复发的预后的基因表达面板 | |
| ES2651849T3 (es) | Algoritmo del perfil de expresión y test para el pronóstico del cáncer | |
| Kang et al. | Loss of E-cadherin and MUC2 expressions correlated with poor survival in patients with stages II and III colorectal carcinoma | |
| US20150309026A1 (en) | Methods of screening for cell proliferation or neoplastic disorders | |
| Young et al. | Tamoxifen sensitivity-related microRNA-342 is a useful biomarker for breast cancer survival | |
| US20070231822A1 (en) | Methods for the detection and treatment of cancer | |
| Molinari et al. | Biomarkers and molecular imaging as predictors of response to neoadjuvant chemoradiotherapy in patients with locally advanced rectal cancer | |
| WO2014071279A2 (en) | Gene fusions and alternatively spliced junctions associated with breast cancer | |
| EP3464630A1 (en) | Methods of diagnosing cancer using cancer testis antigens | |
| EP2342354B1 (en) | Molecular classifier for evaluating the risk of metastasic relapse in breast cancer | |
| ES2829415T3 (es) | Algoritmo de perfil de expresión génica para calcular una puntuación de recurrencia para un paciente con cáncer de riñón | |
| US20200105367A1 (en) | Methods of Incorporation of Transcript Chromosomal Locus Information for Identification of Biomarkers of Disease Recurrence Risk | |
| US20150247203A1 (en) | Composition for detecting the response of rectal adenocarcinomas to radiochemotherapy | |
| ES2914727T3 (es) | Algoritmos y métodos para evaluar los criterios clínicos tardíos en el cáncer de próstata | |
| US20110275089A1 (en) | Methods for predicting survival in metastatic melanoma patients | |
| Lerebours et al. | Hemoglobin overexpression and splice signature as new features of inflammatory breast cancer? | |
| Glenn et al. | Expression profiling of archival renal tumors by quantitative PCR to validate prognostic markers | |
| US20110065115A1 (en) | Methods for identifying an increased likelihood of recurrence of breast cancer | |
| ES2334610B1 (es) | Metodo y kit para predecir la supervivencia de pacientes con linfoma de celulas del manto. | |
| WO2013130465A2 (en) | Gene expression markers for prediction of efficacy of platinum-based chemotherapy drugs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 08850289 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 08850289 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |