WO2009063110A1 - Método para la identificación de compuestos que inducen o inhiben estrés del retículo endoplásmico o estrés oxidativo - Google Patents

Método para la identificación de compuestos que inducen o inhiben estrés del retículo endoplásmico o estrés oxidativo Download PDF

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Fernando VALDIVIESO ÁMATE
María Jesús BULLIDO GÓMEZ-HERAS
Ana MARTÍNEZ GARCÍA
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    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the present invention relates, in general, to a method for
  • Said method is based on a cellular neurodegeneration model useful for the identification of potentially useful compounds for the treatment or prevention of a neurodegenerative disease.
  • Neurodegenerative diseases are chronic and progressive processes that are characterized by selective and symmetric losses of neurons in the motor, sensory and cognitive systems. These diseases are growing alarmingly in the 15 developed countries due to various factors, including the gradual aging of the population and changes in lifestyle. There is still no adequate treatment for these diseases.
  • ROS Reactive oxygen species
  • SOD superoxide dismutase
  • glutathione glutathione
  • AD Alzheimer's disease
  • PD Parkinson's disease
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Treatments that lead to potentiation of antioxidant mechanisms can slow the progression of some of the mentioned diseases.
  • Endoplasmic Reticulum Stress The endoplasmic reticulum (ER) is the place for protein synthesis and post-translational changes for the correct folding of proteins, it is the common transport route to deliver proteins to their proper destination within the cell and It is also a deposit of Ca 2+ .
  • the high concentration of Ca 2+ in the ER lumen compared to the concentration in the cell cytoplasm is important both for cell signaling and for the correct processing of newly synthesized proteins.
  • the ER exercises quality control over proteins, ensuring correct processing of the final product that is crucial for the normal functioning of the cell.
  • the folding capacity of the ER can be increased by increasing the expression of its folding machinery and chaperones such as BIP / GRP78 and GRP94 and increasing the size of the ER and, on the other hand, decreasing the protein load by silencing of translation and transcription and eliminating misfolded and signalized proteins as such.
  • the ER initiates an alarm signal to the immune system via NF- ⁇ B, and an excessive and / or prolonged ERE leads to "cellular suicide", usually by an apoptotic process.
  • a common sign of neurodegenerative diseases is the accumulation and deposits of proteins with erroneous folding that affect several signaling pathways that ultimately lead to neuronal death.
  • RIE Integrated Stress Response
  • Eukaryotic cells respond to misfolded proteins in the ER, amino acid deprivation or oxidative conditions by reversibly phosphorylating the eIF2 ⁇ factor.
  • This phosphorylation inhibits the general synthesis of proteins by promoting the expression of the isoform 4 of the transcription activating factor (ATF4), and thus activating the expression of targets involved in UPR, such as Chop.
  • ATF4 transcription activating factor
  • RIE Integrated Stress Response
  • the cell may drift into apoptotic and / or autophagic processes.
  • DDIT3 gene (DNA-Damaze-Inducible Transcript 3)
  • the DDIT3 gene (DNA-Damage-Inducible Transcript 3), also known as
  • CHOP-10 CCAAT / enhancer binding protein (C / EBP) Homologous Protein -10
  • CHOP CHOP
  • CEBPZ CEBP ⁇
  • GADDl 53 Rowth Arrest and DNA-Damage inducible gene 153
  • MGC4154 encodes a protein that is commonly known like Chop.
  • Chop is a bZip transcription factor that is activated in response to agents that somehow alter the folding machinery of the ER. It can form homo or heterodimers with other members of the C / EBP family, but the heterodimers do not bind to the classic C / EBP binding sites, such that, from the point of view of these target sites, Chop is a inhibitor of These transcription factors. However, Chop homodimers are capable of binding to specific sequences other than the classic C / EBP. Thus, Chop has a dual role in inhibiting the function of C / EBPs and activating other different target genes. It has been seen that CHOP overexpression and Chop protein microinjection leads to cell cycle arrest and / or apoptosis, while mice deficient in this gene show reduced apoptosis in response to
  • ERE and deficiencies in its expression can protect cells from apoptosis produced by ERE.
  • the present invention relates, in general, to a method for the identification of compounds potentially useful for the treatment or prevention of a neurodegenerative disease comprising the steps of: a) contacting a cell with a candidate compound in any degree of purity wherein said cell expresses a DNA construct comprising: i) the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant of the same; and ii) a reporter gene operatively coupled to said promoter region; and b) detect reporter gene expression; wherein the tested compound is identified as suitable for the treatment or prevention of said neurodegenerative disease if it causes a variation in the expression of the reporter gene in the opposite direction to the existing alteration of the levels of DDIT3 in neurodegenerative disease compared to the alteration of the expression in the absence of said compound or if it causes an alteration in the expression of the reporter gene in the same sense as the alteration that is desired to be achieved in the levels of DDIT3.
  • the present invention relates to methods for the identification of
  • the present invention further relates to a method for the diagnosis of a neurodegenerative disease in a subject, or to determine the predisposition of a subject to suffer from a neurodegenerative disease, or to determine the stage or severity of the disease in a subject, or to monitor the effect of therapy administered to a subject with said disease, which comprises determining the presence or absence of the polymorphism identified in SEQ ID NO: 2 of DDIT3 in a biological sample of said subject.
  • the present invention relates to a method for the regulated expression of a gene of interest that comprises introducing into a cell a construction comprising the nucleotide sequence identified in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the present invention relates to a gene construct comprising a DNA sequence comprising the nucleotide sequence identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof as well as an expression vector, with a cell and with a non-human animal comprising said construction.
  • Figure 1 shows the transcriptional activity of the DDIT3 promoter in SK-N-MC cells transiently transfected with the two constructs pXP2 DDIT3 (-1507C) - Luciferase (panel A) and DDIT3 (-15O7G) - Luciferase (panel B). It is shown in beads (xlO 3 ) per mU of ⁇ -galactosidase in different culture conditions: basal (blade), EO (triangle), ERE (square) and RIE (circle). The data shown are obtained from the mean and standard errors of 7 triplicate kinetics experiments.
  • Figure 2 shows the transcriptional activity of the DDIT3 promoter in SK-N-MC cells stably transfected with the two pXP2 constructs
  • DDIT3 15O7C
  • DDIT3 15O7G
  • Luciferase panel A
  • DDIT3 -15O7G
  • beads xlO 3
  • basal blade
  • EO triangle
  • ERE square
  • RIE RIE
  • a cell line when stably transfected with a DNA construct comprising the nucleotide sequence of the DDIT3 gene promoter identified in SEQ ID NO: 1 operatively coupled to a reporter gene , said cell line may be particularly useful for use in screening methods for the identification of compounds that activate or inhibit the expression of the target gene and therefore, for the identification of compounds potentially useful for the treatment or prevention of a disease.
  • neurodegenerative disease refers to a disease associated with a progressive and specific loss of neurons (neuronal death), for example, Alexander's disease, Alper's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Ataxia telangiectasia , Batten disease, spongiform encephalopathy (BSE), cocaine syndrome, Corticobasal degeneration, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease, HIV-associated dementia, Kennedy disease, Krabbe disease, Lewy body dementia , the Machado-Joseph disease, multiple sclerosis, multiple systemic atrophy, Neuroborreliosis, Parkinson's disease, Pelizaeus-Merzbacher disease, Pick's disease, primary lateral sclerosis, prion diseases, Refsum's disease, Sandhoff's disease, Schilder's disease, schizophrenia, Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease, spinocerebellar ataxia, spinal
  • the promoter sequence comprises the nucleotide sequence identified in SEQ ID NO: 1 (variant -1507C).
  • the inventors have observed a greater response to endoplasmic reticulum stress in the event that the allelic variant of the promoter is the -1507C variant.
  • oxidative stress refers to a cellular alteration characterized by excessive production of ROS and a loss of efficacy of antioxidant defenses that leads to pathological states in the cells and causes tissue damage. .
  • ERP endoplasmic reticulum stress
  • the invention relates to a method for the identification of potentially useful compounds for the treatment or prevention of a neurodegenerative disease comprising the steps of: a) contacting a cell with a candidate compound in any degree of purity wherein said cell expresses a DNA construct comprising: i) the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof; and ii) a reporter gene operatively coupled to said promoter region and b) detect reporter gene expression; wherein the tested compound is identified as suitable for the treatment or prevention of said neurodegenerative disease if it causes a variation in the expression of the reporter gene in the opposite direction to the existing alteration of the levels of DDIT3 in neurodegenerative disease compared to the alteration of the expression in the absence of said compound or if it causes an alteration in the expression of the reporter gene in the same sense as the alteration that is desired to be achieved in the levels of DDIT3.
  • the method of the invention comprises the step of detecting the expression of a gene.
  • the person skilled in the art will notice that there are conventional techniques to determine the expression levels of a given gene in a given cell or biological sample such as RT-PCR, Northern blot and the like to determine mRNA expression or different types of immunoassays ( Western blot, ELISA, RIA, immunoprecipitation and the like) to determine protein expression.
  • the existing alteration of the levels of DDIT3 in neurodegenerative disease, and therefore, the alteration in the expression of the DDlTi reporter gene is an increase and, consequently, the change of expression in the reporter gene. which is indicative that the candidate compound can be used for the treatment or prevention of said disease is a decrease in expression.
  • the method of the invention involves contacting a cell with a candidate compound in any degree of purity.
  • a cell is meant, in the context of the present invention, any cell in which the promoter of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof can promote the expression of a gene operably coupled to said promoter.
  • the expression of a gene through a promoter requires the presence of transcription factors capable of recognizing binding sequences in said promoter.
  • the cells that may be the subject of the present invention include all those cells that express the transcription factors necessary for the transcriptional activation of the promoter under study.
  • the cells under study include higher eukaryotic cells, preferably mammalian cells.
  • the invention contemplates the use of any type of cell into which an expression vector can be introduced.
  • embryonic cells oocytes, sperm cells, embryonic stem cells
  • adult cells undifferentiated cells (fetal cells, tumor cells), differentiated cells, dividing cells, senescent cells, cultured cells and the like.
  • the cell used in the method of the invention is a SK-N-MC cell, corresponding to a human neuroblastoma cell line.
  • the DNA construct comprising the promoter of the gene under study operatively coupled to a reporter gene.
  • promoter is meant, in the context of the present invention, a region of DNA to which RNA polymerase binds and, therefore, allows the transcription of genes that are operatively associated therewith.
  • the present invention contemplates the use of the nucleotide sequence of the DDIT3 gene promoter identified in SEQ ID NO: 1 as well as a functionally equivalent variant thereof.
  • “Functionally equivalent variant of SEQ ID NO: 1” means all sequences derived from the sequence of SEQ ID NO: 1 by modification, insertion and / or deletion of one or more nucleotides, provided it is substantially maintained the ability to induce the expression of the gene that is operatively coupled to said sequence in a situation of cellular stress, in particular of the endoplasmic reticulum stress type.
  • substantially maintaining said ability to induce the expression of said gene it is understood that said variant maintains a promoter activity of at least 1.5 times the basal expression with respect to the sequence SEQ ID NO: 1.
  • said functionally equivalent variant is the one identified in SEQ ID NO: 2.
  • the polymorphism rs3847699, identified in SEQ ID NO: 2 is a single nucleotide polymorphism (SNP) in the DDIT3 gene that comprises a cytosine (C) transversion ) to Guanine (G) in nucleotide 120 of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • C cytosine
  • G Guanine
  • a promoter comprising the sequence of Nucleotides identified in SEQ ID NO: 2, is capable of being induced by both endoplasmic reticulum stress and oxidative stress.
  • “functionally equivalent variant of SEQ ID NO: 2” means all sequences derived from the sequence of SEQ ID NO: 2 by modification, insertion and / or deletion of one or more nucleotides, as long as it maintains the polymorphism identified above and as long as the ability to induce the expression of the gene that is operatively coupled to said sequence in a situation of cellular stress, in particular oxidative stress type, is maintained substantially.
  • said functionally equivalent variant is a variant that responds to endoplasmic reticulum stress and oxidative stress.
  • said gene means that said variant maintains a promoter activity of at least 1.5 times the basal expression with respect to the sequence SEQ ID NO: 2.
  • binding sites in the promoter regions object of the invention include those that can be determined by comparison with bases of binding sites of transcription factors such as TFSEARCH (Heinemeyer, T. et al., 1998, Nucleic Acid Res., 26: 364-370).
  • the nucleotide sequence of the DDIT3 promoter identified in SEQ ID NO: 1 or the functionally equivalent variant thereof is operatively coupled to a reporter gene whose expression can be easily detected.
  • Reporter genes that can be used in the context of the present invention include luciferase, green fluorescent protein (GFP) and variants thereof that emit fluorescence at different wavelengths (e.g., DS-Red or red fluorescent protein), chloramphenicol acetyltransferase , ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase and horseradish peroxidase.
  • said reporter gene is the gene that codes for luciferase.
  • the chimeric gene comprising the DDIT3 promoter and the reporter gene
  • the DNA construct is introduced into the cells under study using any of the methods of Transfection known to the person skilled in the art (see sections 9.1 to 9.5 in Ausubel, FM et al., Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; ringbou edition, 2003).
  • cells can be transfected by co-precipitation of DNA with calcium phosphate, DEAE-dextran, polibreon, electroporation, microinjection, liposome-mediated fusion, lipofection, retrovirus infection and biolistic transfection.
  • said host cell transiently expresses said DNA construct.
  • said cell stably expresses said DNA construct.
  • a gene that codes for resistance to a certain antibiotic so that those cell lines that have incorporated the DNA can be selected in the genome of those cell lines in which the DNA is in an extrachromosomal position.
  • the gene that allows the selection of cells can be provided as part of the same vector that contains the construction object of the invention or, alternatively, can be provided separately by co-transfection with a second plasmid containing said resistance gene.
  • the plasmid containing the DNA construct is contributed to the transfection mixture in a molar excess with respect to the resistance gene so that for each event of integration of the resistance gene there is a high probability of integration of the gene. which contains the promoter under study.
  • the plasmid containing the DNA construct is provided in an excess of at least 5 times with respect to the vector containing the resistance reporter.
  • Resistance markers suitable for selecting cell lines that have integrated the construction into the genome include positive selection markers such as the geneticin resistance gene, the neomycin resistance gene, which confers resistance to the G418 aminoglycoside, the gene of the hygromycin phosphotransferase that confers hygromycin resistance, the ODC gene, that confers resistance to the ornithine decarboxylase (2- (difluoromethyl) -DL-ornithine (DFMO) inhibitor, the dihydrofolate reductase gene that confers resistance to metrotexate, the gene from puromycin-N-acetyl transferase, which confers resistance to puromycin, the ble gene that confers resistance to zeocin, the adenosine deaminase gene that confers resistance to 9-beta-D-xylofuranosyl adenine, the cytosine deaminase gene, which allows cells grow in the presence of N- (phosphonacet
  • the selection gene is incorporated into a plasmid which may additionally include a promoter suitable for the expression of said gene in eukaryotic cells (for example, CMV or SV40 promoters), an optimized translation initiation site (for example a site that follows the so-called Kozak rules or an IRES), a polyadenylation site such as, for example, the polyadenylation site of SV40 or phosphoglycerate kinase, introns such as, for example, the intron of the beta-globulin gene.
  • a promoter suitable for the expression of said gene in eukaryotic cells for example, CMV or SV40 promoters
  • an optimized translation initiation site for example a site that follows the so-called Kozak rules or an IRES
  • a polyadenylation site such as, for example, the polyadenylation site of SV40 or phosphoglycerate kinase
  • introns such as, for example, the intron of the beta-globulin
  • the process of selecting cells that contain the DNA construct of interest stably integrated into the genome is carried out by a conventional selection process (see for example Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology (1997) 9.5.1-9.5.19).
  • the cells are transfected with the vector or mixtures of vectors and, after a recovery period, they are allowed to grow in a selective medium (either a medium containing the antibiotic against which the reporter confers resistance or a minimum medium that it contains the antimetabolite against which the reporter confers resistance).
  • a selective medium either a medium containing the antibiotic against which the reporter confers resistance or a minimum medium that it contains the antimetabolite against which the reporter confers resistance.
  • the selection marker it may be convenient to remove said marker from the cells, particularly if the cells are to be transfected with another selection marker.
  • recombinases can be used, in particular the Cre / Lox system.
  • the cells are grown in the presence of progressively higher concentrations of the selection agent, resulting in a selection of the cells that have undergone an amplification of the genes that confer resistance to such an agent and, usually, of the adjacent regions. or intermediate.
  • DHFR is used as the selection marker and the selection of cell lines in which there is an amplification of said gene is carried out in the presence of geneticin.
  • a cell is considered to express a marker stably when the expression of said marker does not decrease with successive proliferation cycles, regardless of the presence in the culture medium of selection agent.
  • the cell is contacted with a compound or preparation whose effect on transcription of the reporter gene is desired to study .
  • a compound or preparation whose effect on transcription of the reporter gene is desired to study .
  • any possible way of bringing the candidate compound into the cell expressing the DNA construct is included.
  • the candidate compound is a low molecular weight molecule
  • the candidate compound is a high molecular weight molecule (for example, biological polymers such as a nucleic acid or a protein), it is necessary to provide the means for that molecule to access the cellular interior.
  • the candidate molecule is a nucleic acid
  • conventional methods for transfection can be used, as described above for the introduction of the DNA construct.
  • the candidate compound is a protein
  • the cell can contact both the protein directly and the nucleic acid that encodes it coupled to elements that allow transcription / translation once they are inside the cell. For this, any of the methods mentioned above can be used to allow entry into the cell interior.
  • a variant of the protein to be studied that has been modified with a peptide that is capable of promoting translocation of the protein into the cell, such as the Tat peptide derived from the TAT protein of HIV-I, the third helix of the home domain of the Antennapedia protein of D.melanogaster, the VP22 protein of the herpes simplex virus and arginine oligomers (Lindgren, A. et al, 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21: 99- 103, Schwarze, SR et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21: 45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol.
  • a peptide that is capable of promoting translocation of the protein into the cell such as the Tat peptide derived from the TAT protein of HIV-I, the third helix of the home domain of the Antennapedia protein of D.melanogaster, the VP22 protein of the herpes simplex virus and arginine
  • the compound to be tested is not isolated but is found to be part of a more or less complex mixture either derived from a natural source or part of a library of compounds.
  • the library may have been preselected to contain compounds that can access the cell interior more easily.
  • the compounds can be selected based on certain parameters such as size, lipophilicity, hydrophilicity, ability to form hydrogen bonds.
  • the method of the invention additionally comprises one or more stages (c) of fractionation of the tested mixture and the repetition of steps (a), (b) and (c) with each of the fractions obtained until the compound is isolated in the mixture that is suitable for the treatment or prevention of neurodegenerative disease.
  • Methods for fractionation of compounds present in a mixture include chromatography (thin-film, gas or gel molecular exclusion, affinity), crystallization, distillation, filtration, precipitation, sublimation, extraction, evaporation, centrifugation, mass spectrometry, adsorption and the like.
  • the compounds to be tested may be part of an extract obtained from a natural source.
  • the natural source can be animal, vegetable obtained from any environment, including, without limitation, extracts from terrestrial, aerial, marine and similar organisms.
  • the method of the invention includes the determination of the activity of the protein encoded by the reporter gene.
  • the activity ratio of the reporter gene is at least 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 and up to 100 will be considered.
  • the method of detecting reporter gene expression involves bringing the cells into contact with a compound that can generate a colored or fluorescent product in the presence of the product encoded by the reporter gene.
  • chromogenic substrates such as p-nitrophenyl phosphate (p-NPP), 5-bromo-4chloro 3-indolyl phosphate / tetrazolium nitroblue (BCIP / NPT), Fast-Red / naphthol-AS-TS phosphate or fluorogenic substrates of the type 4-methylumbelliferyl phosphate (4-MUP), 2- (5'-chloro-2'-phosphoryloxyphenyl) -6-chloro-4- (3H) -quinazolinone (CPPCQ) , 3,6-fluorescein diphosphate (3,6-FDP), Fast Blue BB, Fast Red TR or diazonium salts of Fast Red Violet LB.
  • p-NPP p-nitrophenyl phosphate
  • BCIP / NPT 5-brom
  • chromogenic substrates of the type 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS), o-phenylenediamine (OPT), 3.3 ', 5.5 can be used '-tetramethylbenzidine (TMB), o-dianisidine, 5- amino salicylic acid, 3-dimethylamino benzoic acid (DMAB) and 3-methyl-2- benzothiazolinhydrazone (MBTH), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) and 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or fluorogenic substrates of the type 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetic acid, reduced phenoxazines and reduced benzothiazines, including the Amplex ® Red and Amplex UltraRed reagents and the reduced dihydroxanthenes.
  • ABTS 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazolin
  • the reporter gene encodes a glucosidase
  • chromogenic substrates of the type o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside (o-NPG), p-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside and 4- methylumbelliferyl- ⁇ -D-galactoside can be used (MUG) for ⁇ -D-galactosidase and fluorogenic substrates of the beta-D-galactopyranoside resorufin type, fluorescein digalactoside (FDG), fluorescein diglucuronide, 4-methylumbelliferyl beta-D-galactopyranoside, carboxymbelliferyl beta-D-galactopranoside and beta-D-coumarin galactopyranoside.
  • FDG fluorescein digalactoside
  • FDG fluorescein diglucuronide
  • 4-methylumbelliferyl beta-D-galactopyranoside carboxymbelliferyl beta-D
  • the reporter gene encodes the luciferase and detection is performed by measuring the emitted luminescence by said enzyme in the presence of ATP.
  • Luminescence is determined using commercial kits, such as the enhanced luciferase assay kit (Analytical Luminescence Laboratory, MI).
  • the method of the invention is used to identify compounds suitable for the treatment or prevention of a neurodegenerative disease wherein said disease is characterized by an increase in the expression of the DDIT3 gene and where the change in expression in the reporter gene it is a decrease in the expression of said DDlTS gene.
  • the inventors have observed that, surprisingly, a different stimulus response capacity is produced depending on the allelic variant (-1507C or -1507G) of the DDlTi gene promoter analyzed.
  • allelic variant 1507C or -1507G
  • the present invention relates to a method for the identification of compounds that induce endoplasmic reticulum stress in a cell comprising the steps of: a) contacting a cell with a candidate compound at any degree of purity wherein said cell stably expresses a DNA construct comprising: i) the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof; and ii) a reporter gene operatively coupled to said promoter region and b) detect reporter gene expression; wherein the test compound is identified as the inducer of said stress if it causes a variation in the expression of the reporter gene where the change is an increase in expression compared to the alteration of the expression in the absence of said compound.
  • said functionally equivalent variant is that identified in SEQ ID NO: 2.
  • the present invention relates to a method for the identification of compounds that induce oxidative stress in a cell comprising the steps of: a) contacting a cell with a candidate compound in any degree of purity wherein said cell stably expresses a DNA construct comprising: i) the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 2 or a functionally equivalent variant thereof; and ii) a reporter gene operatively coupled to said promoter region and b) detect reporter gene expression; wherein the test compound is identified as the inducer of said stress if it causes a variation in the expression of the reporter gene where the change is an increase in expression compared to the alteration of the expression in the absence of said compound.
  • the term "functionally equivalent variant” as used herein refers to any variant of the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 2 that maintains the ability of said promoter to be induced by oxidative stress.
  • the present invention relates to a method for the identification of compounds that inhibit endoplasmic reticulum stress in a cell comprising the steps of: a) placing a cell in conditions of endoplasmic reticulum stress, wherein said cell stably expresses a DNA construct comprising: i) the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof; and ii) a reporter gene operatively coupled to said promoter region; b) contacting said cell with a candidate compound in any degree of purity; and c) detect reporter gene expression; wherein the tested compound is identified as an inhibitor of said stress if it causes a variation in the expression of the reporter gene where the change is a decrease in expression compared to the alteration of the expression in the absence of said compound.
  • the gene promoter region comprising: i) the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof; and ii) a reporter gene operatively
  • DDIT3 identified in SEQ ID NO: 1 responds more to ERE than the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 2, both respond to this type of cellular stress. Therefore, in a particular embodiment of the invention, said functionally equivalent variant is that identified in SEQ ID NO: 2.
  • the method of the invention includes any possible way of bringing said cell into a condition of endoplasmic reticulum stress.
  • said stress condition is achieved by exposing said cell to a protein N-glycosylation inhibitor.
  • said protein N-glycosylation inhibitor is tunicamycin.
  • the present invention relates to a method for the identification of compounds that inhibit oxidative stress in a cell comprising the steps of: a) placing a cell in oxidative stress stress conditions, wherein said cell expresses stably a DNA construct comprising: i) the promoter region of the DDIT3 gene identified in SEQ ID NO: 2 or a functionally equivalent variant thereof; and ii) a reporter gene operatively coupled to said promoter region; b) contacting said cell with a candidate compound in any degree of purity; and c) detect reporter gene expression; wherein the tested compound is identified as a stress inhibitor if it causes a variation in the expression of the reporter gene where the change is a decrease in expression compared to the alteration of expression in the absence of said compound.
  • the method of the invention includes any possible way of bringing said cell into an oxidative stress condition.
  • Illustrative, non-limiting examples of compounds that induce oxidative stress in a cell and that can be employed in step (a) of the present method include thiol reactive agents such as phenylarsine oxide, sodium arsenite, mercury chloride, chloride Cadmium, zinc chloride, free radical generators such as hydrogen peroxide, t-butyl hydroperoxide, eumene hydroperoxide, etc.
  • reactive oxygen species subject the body to oxidative stress.
  • said stress condition is achieved by exposing said cell to a superoxide anion release inducer.
  • said inducer is the Xanthine / Xanthine Oxidase system.
  • the present invention relates to a method for the diagnosis of a neurodegenerative disease in a subject, or to determine the predisposition of a subject to suffer from a neurodegenerative disease, or to determine the stage or severity of the disease in a subject.
  • polymorphism refers to a variation in the nucleotide sequence of a particular place of DNA among individuals of the same population.
  • the polymorphism identified in SEQ ID NO: 2 is a polymorphism of a single nucleotide (SNP) in the DDIT3 gene that comprises a cytosine (C) to Guanine (G) transversion.
  • SNP single nucleotide
  • C cytosine
  • G Guanine
  • said polymorphism is identified with the dbSNP code rs3847699.
  • the detection of polymorphism in the DDIT3 gene in the method of the invention can be carried out by means of multiple procedures known to the person skilled in the art, which involve the isolation of the nucleic acid from a biological sample from the subject to be evaluated.
  • Isolation of the nucleic acid from the biological sample can be carried out by procedures known to the person skilled in the art. Such methods may be found, for example, in Sambrook et al, 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual.”, 3 ⁇ d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, VoI.. 1-3.
  • the present invention is not limited by the source of nucleic acid, but the biological sample may comprise blood, saliva, amniotic fluid, tissue, etc.
  • the biological sample from the subject is a tissue sample comprising a nucleic acid, preferably DNA or RNA.
  • Systems and methods for the detection of gene associated polymorphisms include, but are not limited to, hybridization methods and array technology (eg technology available from Aclara BioSciences, Affymetrix, Agilent Technologies, Inc., etc.), reaction-based methods in polymerase chain (eg TAQMAN, Applera Corp., GENECODE system, Erigen, etc.), rolling circle extension assays, invasive excision assays, use of mass spectroscopy, hybridization assays using a polymorphism complementary probe, assay of primer extension, enzymatic cleavage methods, NASBA, sandwich hybridization methods, methods employing molecular markers, ligase chain reaction and the like.
  • array technology eg technology available from Aclara BioSciences, Affymetrix, Agilent Technologies, Inc., etc.
  • reaction-based methods in polymerase chain eg TAQMAN, Applera Corp., GENECODE system, Erigen, etc.
  • rolling circle extension assays eg TAQMAN,
  • the invention relates to a gene construct comprising a DNA sequence comprising the nucleotide sequence identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof.
  • Said gene construct of the invention further comprises elements that regulate the expression of said DNA sequence.
  • regulatory elements include promoters and enhancers. Promoters are typically positioned at 5 'position with respect to the transcription or translation initiation site. Enhancers are capable of influencing gene expression when they are in a 5 'or 3' position with respect to the cDNA or when they are part of an intron.
  • Regulatory sequences include, in addition to promoters, sequences that facilitate translation, intron processing signals, termination codons, signal sequences, internal ribosome binding sites (IRES) and polyadenylation signals.
  • said functionally equivalent variant is that identified in SEQ ID NO: 2.
  • said gene construct additionally comprises the nucleotide sequence of a gene of operationally linked interest.
  • Said gene can be, for example, a marker or gene that codes for a motif or for a phenotype that subsequently allows the selection of a host cell transformed, transfected or infected with said construct or with an expression vector comprising said gene construct.
  • markers include antibiotic resistance genes, toxic compound resistance genes, and, in general, all those that allow genetically transformed cells to be selected.
  • the invention relates to an expression vector comprising a gene construct of the invention that is operatively coupled with a sequence that regulates the expression of said gene construct.
  • a gene construct of the invention that is operatively coupled with a sequence that regulates the expression of said gene construct.
  • the vector of the invention can be used to transform, transfect or infect cells capable of being transformed, transfected or infected by said vector. Said cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • the invention relates to a cell comprising a construct of the invention or a vector of the invention, for which said cell has been able to be transformed, transfected or infected with a construct or vector provided by this invention.
  • Transformed, transfected or Infected can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al., 1989, cited supra].
  • said host cell is an animal cell transfected or infected with an appropriate vector. Suitable host cells include prokaryotic cells, yeasts and eukaryotic cells.
  • said cell is selected from a mammalian cell, a plant cell, a yeast and a bacterium.
  • Preferred host cells are eukaryotic cells.
  • said cell is a cell of a SK-N-MC human neuroblastoma cell line.
  • the invention relates to a cell that expresses a gene construct that comprises
  • ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof; and (ii) a gene of interest operatively coupled to said promoter region.
  • said functionally equivalent variant is that identified in SEQ ID NO: 2.
  • said cell is a cell of a SK-N-MC human neuroblastoma cell line.
  • the invention relates to the use of a cell of the invention for the identification of compounds suitable for the treatment or prevention of a neurodegenerative disease that has altered levels of DDIT3 or in which it is necessary to alter the levels of DDlTi .
  • a cell comprising a construction or a vector of the invention can be contacted with a candidate compound in any degree of purity and, therefore, can be used for the identification of compounds for the treatment or prevention of a neurodegenerative disease
  • said neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alexander's disease, Alper's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Ataxia telangiectasia, Batten's disease, spongiform encephalopathy (BSE), cocaine syndrome, Corticobasal degeneration, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease, HIV-associated dementia, Kennedy disease, Krabbe disease, Lewy body dementia, Machado-Joseph disease, multiple sclerosis, multiple systemic atrophy, Neuroborreliosis, Parkinson's disease, Pelizaeus-Merzbacher disease, Pick's disease, primary lateral sclerosis , Prion diseases, Refsum's disease, Sandhoff's disease, Schilder's disease, schizophrenia, Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease, spinocerebellar ataxia, spinal muscular atrophy, Steele-Richardson-Olszewski disease, Tab
  • the described constructs, vectors or cells of the invention can be used to obtain a transgenic non-human animal that has, inserted in its genome, the nucleotide sequence of the construct of the invention.
  • the invention relates to a transgenic animal that comprises the construction of the invention.
  • the invention relates to a transgenic non-human animal, hereinafter transgenic non-human animal of the invention, containing, inserted in its genome, a construction of the invention.
  • the transgenic non-human animal of the invention is a vertebrate, mammal, preferably a rodent, more preferably a mouse or a rat.
  • said non-human animal is a fish.
  • the transgenic non-human animal of the invention may have any genetic background known to those skilled in the art by the person skilled in the art, that is, said transgenic non-human animal can be derived from a wild-type animal.
  • DDIT3 is a transcription factor that is activated in response to agents that induce cellular stress, in particular stresses that alter the folding machinery of the ER and factors that cause oxidative stress. Therefore, said promoter can be used in the expression of a gene of interest in a regulated manner, such as an inducible protein expression system.
  • the present invention relates to a method for the regulated expression of a gene of interest comprising: a) introducing into a cell a construction comprising the nucleotide sequence identified in SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent variant thereof wherein said sequence is operatively coupled to said gene of interest; b) subject the cell to conditions that generate endoplasmic reticulum stress and, optionally, c) recover from the cell the product resulting from the expression of the gene of interest.
  • said functionally equivalent variant refers to a variant that responds or is induced under conditions of endoplasmic reticulum stress.
  • said functionally equivalent variant is that identified in SEQ ID NO: 2.
  • said stress conditions are achieved by exposing said cell to a protein N-glycosylation inhibitor.
  • said protein N-glycosylation inhibitor is tunicamycin.
  • the invention in another aspect relates to a method for the regulated expression of a gene of interest comprising: a) introducing into a cell a construction comprising comprising the nucleotide sequence identified in SEQ ID NO: 2 or a functionally variant equivalent thereof where said sequence is operatively coupled to said gene of interest, b) subject the cell to conditions that generate oxidative stress and, optionally, c) recover from said cell the product resulting from the expression of the gene of interest.
  • said stress conditions are achieved by exposing said cell to an inducer of superoxide anion release in the cell.
  • said inducer is the Xanthine / Xanthine Oxidase system.
  • telomere sequence is subcloned into pcDNA3, Invitrogen and subsequently cloned into plasmid pXP2 that has no promoter activity per se (Nordeen, SK (1988) "Luciferase repórter gene vectors for analysis of promoters and enhancers.” Biotechniques 6 (5): 454-8).
  • the plasmid that was used as a control in the transient transfection experiments was the pSV- ⁇ -galactosidase construct, from Promega.
  • the region corresponding to nucleotides -1626 to +60 was amplified by PCR, taking as +1 the start of transcription (nucleotides 20059232 to 20027547 of the reference sequence NT_029419 of the NCBI database) to from genomic DNA of an individual presenting the allelic form - 1507C.
  • Said region of the promoter of the amplified DDIT3 gene corresponds to the nucleotide sequence identified in SEQ ID NO: 1.
  • the oligonucleotides for the PCR include restriction targets to facilitate cloning by creating, after restriction, two cohesive ends (indicated as underlined text) and tails to facilitate cutting by the restriction enzyme of the target (in lowercase):
  • Chop-PromL 5 'tat here cata gct TGC CAC CCG CTC ATC TTT 3' (SEQ ID NO: 4)
  • the following PCR conditions were used (Biotools reagents, except nucleotides, Applied Biosystems): 50ng of DNA Genomic were incubated with 75mM Tris HCl, pH 9.0, 1mM Cl 2 Mg, 1 unit Taq polymerase, 200 ⁇ M nucleotides and 0.8 ⁇ M oligonucleotides, in a PCR program that included an initial denaturation at 94 0 C 5 minutes, 40 cycles of 94 ° C 30 seconds, 55 0 C 30 seconds and 72 0 C 1 minute and a final elongation of 72 0 C 10 minutes, in the GeneAmp PCR System 9600 thermal cycler, from Perkin Elmer.
  • Amplified products were purified with the "QIAquick ® PCR Purification kif ⁇ Qiagen, subjected to enzymatic digestion for 16 hours at 37 0 C in buffer 2 (New England Biolabs) with 10 units of BamHl (New England Biolabs) and Hind ⁇ (promoter of DDIT3) and these digested amplified were band purified with the "QIAquick GeI Extraction kif ⁇ of Qiagen.
  • the digested and purified promoter was inserted into the plasmid pcDNA3, which had previously been digested and purified in the same manner as the corresponding promoter, using the "Quick Ligation Kif ⁇ of New England Biolabs, according to manufacturer's recommended instructions, 10 minutes at room temperature.
  • Competent XLl-Blue bacteria were transformed by thermal shock
  • Plasmid pXP2 has the 5 'cloning site at the beginning of the luciferase gene coding sequence. This enzyme catalyzes a reaction that, in the presence of luciferin, generates photon emission. Thus, luciferase activity can be measured in a luminometer that quantifies the emitted flash, and in this way, the measure of luciferase activity is a quantitative indicator of the transcriptional activity of the cloned promoter region in plasmid pXP2, which directs its expression .
  • allelic variant -1507G was obtained by mutagenesis directed with the "QuickChange ® Site-directed Mutagenesis kif ⁇ de
  • Ddit3-MutU 5'ACT TTG CAT TCT GGG TGG TGC GTT TT 3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Ddit3-MutL 5'AAA ACG CAC CAC CCA GAA TGC AAA GT 3' (SEQ ID NO: 6)
  • the PCR program consisted of an initial denaturation at 95 0 C for 30 seconds and 16 cycles of 95 0 C 30 seconds and 68 0 C 10 minutes in the same thermal cycler where the PCR was performed. Subsequently, the PCR product was incubated at 37 ° C for 1 hour with Dpn / to remove the original plasmid.
  • Competent bacteria were transformed and the plasmid DNA was purified in the same manner as described for the first allelic variant.
  • the sequence of all the constructions generated was checked in the Sequencing service of the Madrid Science Park (PCM).
  • the human neuroblastoma cell line SK-N-MC ⁇ American Type Culture Collection, ATCC, ref. HTB-IO). It was grown in monolayer on 10 cm diameter culture plates (PlOO, from Falcon) and was kept in a minimum essential medium (MEM -Gibco-), supplemented with 10% of Fetal Bovine Serum (Sigma) decomplemented for 30 minutes at 56 0 C, non-essential amino acids (L-alanine
  • the cells were grown at 37 ° C in a humidified atmosphere with 7% CO 2 .
  • the cell used was tested for ⁇ -galactosidase activities, as an indicator of transfection efficiency, and luciferase, as an indicator of the transcriptional activity of promoters:
  • EDTA both of Merck-, 470 ⁇ M potassium salt of Luciferin -Promega- and 530 ⁇ M ATP -Boehringer Mannheim-); alternatively, the one of the Luciferase Assay System kit -Proms-.
  • the luminescence emission is recorded in a Monolight 2010 (Analytical Luminiscence Laboratory) luminometer.
  • the transcriptional activity of the different constructs is expressed as the relative activity luciferase / ⁇ -galactosidase.
  • Plasmids pXP2-DDIT3 (constructs -1507C or - 1507G) and pcDNA3 are mixed in a 90:10 ratio to transfect 16 ⁇ g of DNA (14.4 ⁇ g of pXP2 and 1.6 ⁇ g of pcDNA3) per plate with Lipofectamine Plus, as indicated from the manufacturer, in relation to DNA: Lipofectamine 1: 4, for 5 hours.
  • the cells of the P100 plate are collected by trypsinization with a trypsin solution 500 mg / 1 (Disco) and EDTA 160 mg / 1 (Merck) and transfection dilutions are seeded 1/2, 1/10, 1/100 and 1/1000 The next day, and from there every 3 or 4 days
  • Antibiotic resistant clones are isolated by aspiration with an automatic pipette and seeded in an M24 for expansion. Luciferase expression is analyzed and lines that have the highest luciferase activity are maintained. In addition, a normalization of the amount of construction pXP2 is performed based on the number of cells.
  • cell DNA is purified from half the volume resulting from lysis with the High Puré PCR Témplate Preparation kit and real-time PCRs are performed on the Applied Biosystems AbiPrism ® 7900HT Sequence Detection System in the universal conditions of PCR indicated by the manufacturer: the amount of plasmid in the extract is determined by amplifying a fragment of the luciferase gene with the oligonucleotides:
  • XXO Xanthine / Xanthine-Oxidase
  • Tn (2.5 ⁇ g / ml in DMSO, all from Sigma), which is an antibiotic produced by Streptomyces lysosuperficus that inhibits the N-glycosylation of proteins.
  • XXO and Tn are added simultaneously in the amounts already indicated.
  • the treatments were carried out in a timely manner, collecting at a certain point (normally 18 hours), or in kinetics, collecting points for 24 hours at 3-hour intervals.
  • plasmid containing the 5 'DDTTi promoter linked to the luciferase coding sequence was obtained. This construction was used to perform directed mutagenesis on it and thus obtain the other allelic variant: - 1507G (DDIT3 promoter).
  • the plasmids were sequenced in the PCM, determining that the promoter sequence coincided with that published with accession number NT 029419 from the NCBI database, nucleotides from 20059232 to 20057547.
  • the SK-N-MC human neuroblastoma cell line was stably transfected with the plasmid construction of pXP2 with the DDIT3 promoter (a construct for each allele of -1507, C and G) already described, together with pcDNA3, which confers resistance to the antibiotic Geneticina, to select the cell clones that have acquired the plasmids.
  • Plasmids with the DDlTS promoter region were employed in transient and stable transfection experiments in SK-N-MC cells.
  • the cells were transfected using lipofectamine, which forms complexes with the plasmids, and which are what the cells capture. Subsequently, they were treated according to models developed in the laboratory to simulate stress situations (oxidative and / or reticulum) for sufficient time to allow cells to express luciferase, which is the activity that is tested to determine the transcriptional activity of the cloned promoters in response to these stimuli.
  • FIG. 1 shows the transcriptional activity of the two constructs in the different culture conditions over time.
  • Luciferase Accounts (xlO "3 ) are represented per milliunit of ⁇ -galactosidase; points were collected for analysis every 3 hours until a final time of 24.
  • the cloned promoter region contains the minimum elements necessary to maintain the capacity of the DDIT3 gene to respond to stress, so that the two plasmids generated (pXP2 DDIT3 (-1501C) and pXP2 DDIT3 ⁇ - ⁇ 507 XJ)) are useful for testing the activation of the DDIT3 gene and, indirectly, because this gene is a witness to the induction of cell death by apoptosis, to test the neurotoxic or neuroprotective activity of compounds.
  • Punctual and kinetic experiments of different culture conditions were performed on SK-N-MC cells expressing the luciferase enzyme stably under the regulation of the DDIT3 promoter with allelic variants C and G at position -1507 (lines CI and G7, respectively).
  • Luciferase activity counts were normalized with respect to the plasmid load per cell and with respect to the number of cells as described above. It was found that the plasmid load was the same for both cell lines and that it was not altered by the treatments used.
  • Figure 2 shows the results obtained during a 24-hour treatment, collecting points every 3 hours, expressed in normalized luciferase activity, which measures the transcriptional activity of the DDIT3 promoter for both allelic variants (- 1507 C and G) during the treatment.
  • Cl cell line (DDIT3 -15070 (Fig. 2. panel A).
  • a transcriptional activity can be observed after 9 hours of treatment in response to the stimulus greater than the activity observed in baseline conditions, with a maximum activity at 15 hours.
  • ERE levels high enough to lead cells to apoptosis are found in individuals with RE overload, as could be the case with individuals with mutations. In this case, the functional alteration produced by the mutation and / or the endoplasmic reticulum overload would be strong enough to reach Chop levels that would lead the cells to apoptosis.
  • DDIT3 This overexpression of DDIT3 in response to ERE could explain the observed effect of interaction between polymorphism and the age of onset of symptoms: in younger mature individuals there may be an overload of ER leading to ERE, but it has not yet occurred. EO due to aging. Thus, homozygous individuals for the allelic variant -1507C would have levels of DDIT3 expression greater than that of individuals carrying the variant -1507G, which causes the cells to apoptosis, thus advancing the age of onset of symptoms. of the illness. In response to RIE, the transcriptional levels are matched in both allelic variants, obtaining maximum transcriptional levels. As it is a convergence of stress, oxidative and ER, multiple transcription factors are likely to be acting that, in their totality, mask the differential effect on the transcriptional activity depending on the allelic variant presented.
  • transient transfection assays were performed on SK-N-MC cells and stable transfectant lines were generated, and the expression was studied under basic culture conditions and in response to stress inducers related to neurodegeneration and AD. In transient transfection assays
  • results obtained indicate that all the stimuli to which the cells have been subjected make it possible to see an alteration of the promoter activity after 6 hours of treatment; specifically, the transcriptional activity observed after treatments with the Xanthine / Xanthine Oxidase system, which generates EO, with tunicamycin, to produce ERE, and with both treatments together, which generates
  • the activity in basal culture conditions does not differ between them, the response to stimuli is different.
  • the -1507G variant seems to respond less to ERE and more to EO than the -1507C variant. This could be due to the fact that in the position where the rs3847699 polymorphism is located there is a binding site of transcription factors related to the response to the stimuli.
  • human transcription factors RREB-I and LBP-I c / CP2 / LSF (CP2) could bind to the region between the positions of -1500 to -1519 and from -1505 to -1515, respectively, but only in case the allelic variant is G.
  • the transcription factor CP2 (TFCP 2 gene, location 12ql3) has been related to AD, in that an association between a polymorphism (AJG) of the 3'UTR region of the gene and the disease has been described. It has been seen that the 3'UTR region binds to proteins, so that the A allele, protective against EA, has a weaker binding than the G allele.
  • This factor regulates the expression of other genes that have already been related With AD (GSK3, ⁇ -2 macroglobulin, NFKB, interleukin 1 or TNF), you can modulate the activation of different viruses, such as HSV-I, and interact with the Fe65 protein, which regulates the internalization and processing of APP.
  • the polymorphism studied in the promoter region of DDIT3 has, as the data shown here suggests, an impact on the ability of this gene to respond to different stimuli because said polymorphism affects the binding of CP2 or other transcription factors, and that It is the differential response to stress-inducing stimuli that is responsible for the association with the age of onset of Alzheimer's disease that the inventors have observed.
  • the response to stimuli of the two cell lines generated, as well as their differential response to oxidative stress (EO) and the endoplasmic reticulum (ERE) indicates that these two lines (and the plasmids used to generate them) are very useful tools to test the ability of compounds to: activate the DDIT3 gene, induce or inhibit oxidative and endoplasmic reticulum stress, as well as induce or inhibit neuronal death by apoptosis (neuroprotection assays).

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Abstract

La presente invención, se relaciona con un método para la identificación de compuestos productores o inhibidores de estrés de retículo endoplásmico o de estrés oxidativo. Dicho método se basa en la transformación de células de manera estable con un vector que exprese un gen reportero bajo el control del promotor del gen DDIT3 (también denominado CHOP). Este promotor comprende los nucleótidos del -1626 al +60 de dicho gen, habiendo dos varantes del mismo: -1507 C/G. Mientras que la variante -1507 C no se activa en condiciones de estrés oxidativo, la -1507 G responde frente a este estímulo de manera acusada. Por otro lado, ambos promotores se activan en situación de estrés de retículo endoplásmico, o en situación combinada de ambas condiciones.

Description

MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS QUE INDUCEN O INHIBEN ESTRÉS DEL RETÍCULO ENDOPLÁSMICO O ESTRÉS OXIDATIVO.
La presente invención se relaciona, en general, con un método para la
5 identificación de compuestos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Dicho método se basa en un modelo celular de neurodegeneración útil para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa.
10 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las enfermedades neurodegenerativas son procesos crónicos y progresivos que están caracterizados por pérdidas selectivas y simétricas de neuronas en los sistemas motor, sensorial y cognitivo. Estas enfermedades están creciendo alarmantemente en los 15 países desarrollados debido a diversos factores, entre ellos, el paulatino envejecimiento de la población y los cambios en el estilo de vida. No existe todavía ningún tratamiento adecuado para dichas enfermedades.
Estrés Oxidativo (EO)
20 Las especies reactivas de oxígeno (ROS, "reactive oxygen species"), tales como el radical de oxígeno superóxido (O2") o peróxido de hidrógeno (H2O2), se producen durante los procesos metabólicos normales y realizan varias funciones útiles. Las células están dotadas con varios mecanismos para controlar los niveles de estos agentes oxidativos, por ejemplo, superóxido dismutasa (SOD), glutatión o vitamina E. En
25 condiciones fisiológicas normales, existe un equilibrio entre ROS y estos mecanismos antioxidativos. Una producción excesiva de ROS y una pérdida de eficacia de las defensas antioxidativas pueden conducir a estrés oxidativo celular y por tanto, a estados patológicos en las células y provocar daño tisular. Este acontecimiento parece producirse de manera más espectacular en las neuronas, por su alta tasa de actividad
30 metabólica, y por tanto, parece estar relacionado con una serie de procesos, enfermedades y síndromes degenerativos, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y esquizofrenia. Los tratamientos que conducen a una potenciación de los mecanismos antioxidativos pueden ralentizar la progresión de algunas de las enfermedades mencionadas.
Se sabe que durante el envejecimiento normal el cerebro sufre alteraciones morfológicas y funcionales que afectan a los árboles dendríticos, sinapsis, neurotransmisión, circulación y metabolismo, y estos cambios se ven reflejados en los sistemas motor y sensorial, en el sueño, memoria y aprendizaje. Entre los cambios neuronales producidos por la edad se incluyen la disminución de la homeostasis del
Ca2+ y de la sensibilidad de los sistemas, dopaminérgico, colinérgico, opiáceo y de catecolaminas. Cada vez más, parece que en estas alteraciones tiene que ver una mayor susceptibilidad a los efectos a largo plazo del EO, disfunción mitocondrial (que aumenta con la edad) y daño por inflamación.
Estrés de Retículo Endoplásmico (ERE) El retículo endoplásmico (RE) es el lugar para la síntesis de proteínas y cambios postraduccionales para el correcto plegamiento de las proteínas, es la ruta de transporte común para suministrar proteínas a su destino apropiado dentro de la célula y es también un depósito de Ca2+. La alta concentración de Ca2+ que hay en el lumen del RE respecto a la concentración en el citoplasma celular es importante tanto para señalización celular como para el correcto procesamiento de las proteínas de nueva síntesis. El RE ejerce el control de calidad sobre las proteínas, asegurando un procesamiento correcto del producto final que es crucial para el funcionamiento normal de la célula. Sólo las proteínas que por las modificaciones post-traduccionales se pliegan correctamente pasan al aparato de Golgi, mientras que aquéllas que no han terminado su plegamiento o están plegadas incorrectamente quedan retenidas en el RE para terminar el proceso o se señalizan para su degradación. Además de esta función de plegamiento de proteínas, el RE es el lugar de síntesis de esteróles y lípidos. Cualquier alteración en alguno de estos procesos es causa de ERE.
Distintas situaciones fisiológicas o patológicas que afecten al plegamiento proteico y/o a la homeostasis del Ca2+, como privación de glucosa, infecciones virales o la expresión de proteínas imitantes incapaces de plegarse, pueden ser causa de ERE por acumulación de proteínas mal plegadas, y entonces se produce en las células una respuesta a este estrés, activándose la respuesta a proteínas no-plegadas (Unfolded Protein Response, UPR). El plegamiento de proteínas in vivo requiere una maquinaria de plegamiento en el RE que se puede sobrecargar, resultando en una acumulación de proteínas mal plegadas y entonces se activa la respuesta UPR para tratar de restablecer el estado normal en el RE.
En estos casos, se puede aumentar la capacidad de plegamiento del RE aumentando la expresión de su maquinaria de plegamiento y de chaperonas como BÍP/GRP78 y GRP94 y aumentando el tamaño del RE y, por otro lado, disminuyendo la carga de proteínas mediante un silenciamiento de la traducción y transcripción y eliminando las proteínas mal plegadas y señalizadas como tal. Cuando estos mecanismos no son capaces de remediar la situación de estrés, el RE inicia una señal de alarma al sistema inmune vía NF-κB, y un ERE excesivo y/o prolongado conduce al "suicidio celular", normalmente por un proceso apoptótico.
Un signo común de las enfermedades neurodegenerativas es la acumulación y los depósitos de proteínas con plegamiento erróneo que afectan a varias rutas de señalización que conducen finalmente a la muerte neuronal. Algunos autores consideran que el estrés del RE está relacionado con varias enfermedades neurodegenerativas tales como EA, EP, ELA, Huntington y encefalopatías espongiformes transmisibles (EET).
Por tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos procedimientos para la identificación de compuestos terapéuticos para el tratamiento enfermedades neurodegenerativas, en particular, de enfermedades neurodegenerativas que cursan con estrés oxidativo y/o estrés de retículo endoplásmico y que conducen a la muerte neuronal.
Respuesta Integrada a Estrés (RIE)
Las células eucariotas responden a las proteínas mal plegadas en el RE, privación de aminoácidos o a condiciones oxidantes fosforilando de forma reversible al factor eIF2α. Esta fosforilación inhibe la síntesis general de proteínas promoviendo la expresión de la isoforma 4 del factor activador de la transcripción (ATF4), y activando así la expresión de dianas implicadas en UPR, como Chop. Se trata de una Respuesta Integrada a Estrés (RIE) que regula el metabolismo de aminoácidos y la resistencia al estrés oxidativo; además de adaptar a las células a ERE. De esta manera, ante situaciones de estrés prolongado, la célula puede derivar hacia procesos apoptóticos y/o autofágicos.
Gen DDIT3 (DNA-Damaze-Inducible Transcript 3) El gen DDIT3, (DNA-Damage-Inducible Transcript 3), también conocido como
CHOP-10 (CCAAT/ enhancer binding protein (C/EBP) Homologous Protein -10), CHOP, CEBPZ (CEBPζ), GADDl 53 (Growth Arrest and DNA-Damage inducible gene 153) o MGC4154 codifica para una proteína que se conoce habitualmente como Chop.
Chop es un factor de transcripción bZip que se activa en respuesta a agentes que alteren de algún modo la maquinaria de plegamiento del RE. Puede formar homo o heterodímeros con otros miembros de la familia C/EBP, pero los heterodímeros no se unen a los sitios clásicos de unión C/EBP, de tal forma que, desde el punto de vista de estos sitios diana, Chop es inhibidor de estos factores de transcripción. Sin embargo, los homodímeros de Chop sí son capaces de unirse a otras secuencias específicas diferentes de las clásicas C/EBP. Así, Chop tiene un papel dual inhibiendo la función de C/EBPs y activando otros genes diana diferentes. Se ha visto que la sobreexpresión de CHOP y la microinyección de la proteína Chop conduce a parada del ciclo celular y/o a apoptosis, mientras que ratones deficientes en este gen muestran apoptosis reducida en respuesta a
ERE, y deficiencias en su expresión pueden proteger a las células de la apoptosis producida por ERE.
En las enfermedades neurodegenerativas se observa una acumulación de proteínas mal plegadas. En el caso de la EA, se ha observado que mutaciones en el gen PSENl aumentan los niveles de proteína Chop. De hecho, se ha observado que se da una respuesta al estrés exagerada en células con mutaciones en PSENl, si bien este nivel de respuesta tan elevado se debía a una mayor traducción del mensajero Chop, más que a un mayor nivel de transcripción.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona, en general, con un método para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que comprende las etapas de: a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora; y b) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como adecuado para el tratamiento o prevención de dicha enfermedad neurodegenerativa si provoca una variación en la expresión del gen reportero en sentido contrario a la alteración existente de los niveles de DDIT3 en la enfermedad neurodegenerativa en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto o si provoca una alteración en la expresión del gen reportero en el mismo sentido que la alteración que se desea conseguir en los niveles de DDIT3. En otros aspectos adicionales, la presente invención se refiere a métodos para la identificación de compuestos que inducen o inhiben estrés de retículo endoplásmico y/o estrés oxidativo en una célula.
La presente invención se refiere además a un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, o para determinar la predisposición de un sujeto a padecer una enfermedad neurodegenerativa, o para determinar el estadio o severidad de la enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha enfermedad, que comprende determinar la presencia o ausencia del polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 de DDIT3 en una muestra biológica de dicho sujeto. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende introducir en una célula una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Por otro lado, la presente invención se relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma así como con un vector de expresión, con una célula y con un animal no- humano que comprenden dicha construcción. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra la actividad transcripcional del promotor de DDIT3 en células SK-N-MC transfectadas transitoriamente con las dos construcciones pXP2 DDIT3(-1507C) - Luciferasa (panel A) y DDIT3(-15O7G) - Luciferasa (panel B). Se muestra en cuentas (xlO 3) por mU de β-galactosidasa en distintas condiciones de cultivo: básales (aspa), EO (triángulo), ERE (cuadrado) y RIE (círculo). Los datos mostrados se obtienen de la media y errores estándares de 7 experimentos de cinética por triplicado.
La Figura 2 muestra la actividad transcripcional del promotor de DDIT3 en células SK-N-MC transfectadas establemente con las dos construcciones pXP2
DDIT3(-15O7C) - Luciferasa (panel A) y DDIT3(-15O7G) - Luciferasa (panel B). Se muestra en cuentas (xlO 3) normalizado por el número de células en distintas condiciones de cultivo: básales (aspa), EO (triángulo), ERE (cuadrado) y RIE (círculo).
Los datos mostrados se obtienen de la media y errores estándares de 7 experimentos de cinética por triplicado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han puesto de manifiesto que cuando se transfecta de forma estable una línea celular con una construcción de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del promotor del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 acoplada operativamente a un gen reportero, dicha línea celular puede ser particularmente útil para su uso en métodos de screening para la identificación de compuestos que activan o que inhiben la expresión del gen diana y por tanto, para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa asociada a una expresión deficiente de DDIT3.
Tal como aquí se utiliza, el término "enfermedad neurodegenerativa" se refiere a una enfermedad asociada con una pérdida progresiva y específica de neuronas (muerte neuronal), por ejemplo, la enfermedad de Alexander, la enfermedad de Alper, esclerosis lateral amiotrófica, Ataxia telangiectasia, la enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme (BSE), síndrome de cocaína, degeneración Corticobasal, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, la enfermedad de Kennedy, la enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpos Lewy, la enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis múltiple, atrofia sistémica múltiple, Neuroborreliosis, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, la enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades por priones, la enfermedad de Refsum's, la enfermedad de Sandhoff, la enfermedad de Schilder, esquizofrenia, la enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinal, la enfermedad de Steele-Richardson- Olszewski, Tabes dorsalis, la enfermedad inflamatoria cerebral, etc.
Asimismo, los inventores han observado que, sorprendentemente, se produce una capacidad de respuesta a estímulos diferente en función de la variante alélica del promotor del gen DDIT3 presente. Así, los inventores han observado que en el caso de que dicha secuencia presente el polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 (variante
-1507G) se produce una respuesta significativa a estrés oxidativo, mientras que dicha respuesta a estrés oxidativo no se observa cuando la secuencia del promotor comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 (variante -1507C). Por otro lado, los inventores han observado una mayor respuesta a estrés de retículo endoplásmico en el caso de que la variante alélica del promotor es la variante -1507C.
El término "estrés oxidativo" (EO), tal como aquí se emplea, se refiere a una alteración celular caracterizada por una producción excesiva de ROS y una pérdida de eficacia de las defensas antioxidativas que conduce a estados patológicos en las células y provoca daño tisular.
El término "estrés de retículo endoplásmico" (ERE), tal como aquí se emplea, se refiere a una alteración en la función del RE que conduce a la acumulación de proteínas no plegadas dentro del mismo, induciendo un estado denominado generalmente como estrés del RE (ERE). Por tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que comprende las etapas de: a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora y b) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como adecuado para el tratamiento o prevención de dicha enfermedad neurodegenerativa si provoca una variación en la expresión del gen reportero en sentido contrario a la alteración existente de los niveles de DDIT3 en la enfermedad neurodegenerativa en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto o si provoca una alteración en la expresión del gen reportero en el mismo sentido que la alteración que se desea conseguir en los niveles de DDIT3. Así, el método de la invención comprende la etapa de detectar la expresión de un gen. El experto en la materia advertirá que existen técnicas convencionales para determinar los niveles de expresión de un gen determinado en una determinada célula o muestra biológica tales como las RT-PCR, Northern blot y similares para determinar la expresión del ARNm o distintos tipos de inmunoensayos (Western blot, ELISA, RIA, inmunoprecipitación y similares) para determinar la expresión de la proteína.
En una forma preferida de realización, la alteración existente de los niveles de DDIT3 en la enfermedad neurodegenerativa, y por tanto, la alteración en la expresión del gen reportero de DDlTi, es un aumento y, consiguientemente, el cambio de expresión en el gen reportero que es indicativa de que el compuesto candidato puede ser usado para el tratamiento o prevención de dicha enfermedad es una disminución de expresión.
En una primera etapa, el método de la invención implica poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza. Por "célula" se entiende, en el contexto de la presente invención, cualquier célula en donde el promotor del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma puede promover la expresión de un gen operativamente acoplado a dicho promotor. En general, la expresión de un gen a través de un promotor requiere la presencia de factores de transcripción capaces de reconocer secuencias de unión en dicho promotor. Así, las células que pueden ser objeto de la presente invención incluyen todas aquellas células que expresen los factores de transcripción necesarios para la activación transcripcional del promotor objeto de estudio. Aunque es posible reconstituir la expresión de dichos reporteros en células de muy distinto origen, es preferible el uso de células que expresan dichos factores de transcripción de forma endógena y constitutiva. Así, en una forma preferida de realización, las células objeto de estudio incluyen células eucariotas superiores, preferentemente células de mamíferos. La invención contempla el uso de cualquier tipo de célula en la que se pueda introducir un vector de expresión. Así, es posible la utilización de células embrionarias (oocitos, células de esperma. células troncales embrionarias), células adultas, células no diferenciadas (células fetales, células tumorales), células diferenciadas, células en división, células senescentes, células en cultivo y similares. En una forma preferida de realización, la célula que se usa en el método de la invención es una célula SK-N-MC, correspondiente a una línea celular de neuroblastoma humano. Una vez que se ha seleccionado la célula en la que se va a expresar la construcción de ADN, es necesario incorporar de forma estable en dicha célula la construcción de ADN que comprende el promotor del gen objeto de estudio operativamente acoplado a un gen reportero. Por "promotor" se entiende, en el contexto de la presente invención, una región de ADN a la que se une la ARN polimerasa y que, por tanto, permite la transcripción de genes que se encuentran asociadas operativamente al mismo. La presente invención contempla el uso de la secuencia de nucleótidos del promotor del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 así como de una variante funcionalmente equivalente de la misma. Los inventores han observado que dicha secuencia promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 es capaz de inducirse ante estrés de retículo endoplásmico. Así, Por "variante funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1" se entiende todas aquellas secuencias derivadas de la secuencia de SEQ ID NO: 1 mediante modificación, inserción y/o deleción de uno o más nucleótidos, siempre y cuando se mantenga sustancialmente la capacidad de inducir la expresión del gen que se encuentra operativamente acoplado a dicha secuencia ante una situación de estrés celular, en particular de tipo estrés de retículo endoplásmico. Por mantener "sustancialmente" dicha capacidad de inducir la expresión de dicho gen se entiende que dicha variante mantiene una actividad promotora de, al menos, 1,5 veces la expresión basal respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1. En una realización particular, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2. El polimorfismo rs3847699, identificado en la SEQ ID NO: 2, es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen DDIT3 que comprende una transversión de Citosina (C) a Guanina (G) en el nucleótido 120 de la secuencia SEQ ID NO: 1. Los inventores han observado que un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos identificado en la SEQ ID NO: 2, es capaz de inducirse tanto por estrés de retículo endoplásmico como por estrés oxidativo. Así, por "variante funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 2" se entiende todas aquellas secuencias derivadas de la secuencia de SEQ ID NO: 2 mediante modificación, inserción y/o deleción de uno o más nucleótidos, siempre y cuando mantenga el polimorfismo identificado anteriormente y siempre y cuando se mantenga sustancialmente la capacidad de inducir la expresión del gen que se encuentra operativamente acoplado a dicha secuencia ante una situación de estrés celular, en particular de tipo estrés oxidativo. En una forma preferida de realización, dicha variante funcionalmente equivalente es una variante que responde ante estrés de retículo endoplásmico y estrés oxidativo. Por mantener "sustancialmente" dicha capacidad de inducir la expresión dicho gen se entiende que dicha variante mantiene una actividad promotora de, al menos, 1,5 veces la expresión basal respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2.
El experto en la materia advertirá que secuencias funcionalmente equivalentes a las regiones promotoras anteriormente indicadas se pueden obtener siempre y cuando las regiones esenciales dentro de dichas secuencias responsables de la unión de los factores de transcripción se mantengan intactas. El experto en la materia apreciará que los sitios de unión en la regiones promotoras objeto de la invención incluyen aquellos que pueden determinarse mediante comparación con bases de sitios de unión de factores de transcripción tales como TFSEARCH (Heinemeyer,T. et al., 1998, Nucleic Acid Res., 26:364-370).
La secuencia de nucleótidos del promotor de DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o la variante funcionalmente equivalente de la misma se encuentra acoplado de forma operativa a un gen reportero cuya expresión se pueda detectar con facilidad. Genes reporteros que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP) y variantes de la misma que emiten fluorescencia a distintas longitudes de onda (por ejemplo, DS-Red o proteína fluorescente roja), cloranfenicol acetiltransferasa, β-galactosidasa, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano. En una realización particular, dicho gen reportero es el gen que codifica para la luciferasa.
Una vez construido el gen quimérico que comprende el promotor de DDIT3 y el gen reportero, éste debe introducirse en una célula hospedadora. La construcción de ADN se introduce en las células objeto de estudio usando cualquiera de los métodos de transfección conocidos para el experto en la materia (véase secciones 9.1 a 9.5 en Ausubel, F.M. et al., Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; ringbou edition, 2003). En particular, las células se pueden transfectar mediante co- precipitación de ADN con fosfato calcico, DEAE-dextrano, polibreon, electroporación, microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección, infección por retrovirus y transfección biolística.
En una realización particular de la invención, dicha célula hospedadora expresa de forma transitoria dicha construcción de ADN. En otra realización particular, dicha célula expresa de forma estable dicha construcción de ADN. Así, con el fin de obtener expresión estable de la construcción de ADN objeto de la invención, es necesario incluir en la transfección un gen que codifique para resistencia a un determinado antibiótico, de forma que se puedan seleccionar aquellas líneas celulares que han incorporado el ADN en el genoma de aquellas líneas celulares en las que el ADN se encuentra en posición extracromosómica. El gen que permite seleccionar las células se puede aportar formando parte del mismo vector que contiene la construcción objeto de la invención o, alternativamente, se puede aportar separadamente mediante co-transfección con un segundo plásmido que contiene dicho gen de resistencia. En este último caso, el plásmido que contiene la construcción de ADN se aporta a la mezcla de transfección en un exceso molar con respecto al gen de resistencia de forma que por cada evento de integración del gen de resistencia exista una alta probabilidad de integración del gen que contiene el promotor objeto de estudio. Preferiblemente, el plásmido que contiene la construcción de ADN se aporta en un exceso de al menos 5 veces con respecto al vector que contiene el reportero de resistencia.
Marcadores de resistencia adecuados para seleccionar líneas celulares que han integrado la construcción en el genoma incluyen marcadores de selección positiva como por ejemplo el gen de resistencia a geneticina, el gen de resistencia a la neomicina, que confiere resistencia al aminoglucósido G418, el gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a higromicina, el gen ODC, que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa (2-(difluorometil)-DL-ornitina (DFMO), el gen de la dihidrofolato reductase que confiere resistencia a metrotexato, el gen de la puromicina- N-acetil transferasa, que confiere resistencia a puromicina, el gen ble que confiere resistencia a zeocina, el gen de la adenosina deaminasa que confiere resistencia a 9- beta-D-xilofuranosil adenina, el gen de la citosina deaminasa, que permite a las células crecer en presencia de N-(fosfonacetil)-L-aspartato, timidina kinasa, que permite a las células crecer en presencia de aminopterina, el gen de Xantina-guanina fosforibosiltransferasa, que permite a las células crecer en presencia de xantina y ausencia de guanina, el gen trpB de E.coli que permite a las células crecer en presencia de indol en lugar de triptófano, el gen hisD de E.coli, que permite a las células el usar histidinol en lugar de histidina. El gen de selección se incorpora en un plásmido que puede incluir, adicionalmente, un promotor adecuado para la expresión de dicho gen en células eucariotas (por ejemplo, los promotores CMV o SV40), un sitio optimizado de iniciación de la traducción (por ejemplo un sitio que sigue las denominadas reglas de Kozak o un IRES), un sitio de poliadenilación como, por ejemplo, el sitio de poliadenilación del SV40 o de la fosfoglicerato quinasa, intrones como, por ejemplo, el intrón del gen de la beta-globulina.
El proceso de selección de células que contienen la construcción de ADN de interés integrada de forma estable en el genoma se lleva a cabo mediante un proceso de selección convencional (véase por ejemplo Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology (1997) 9.5.1-9.5.19). Para ello, se transfectan las células con el vector o mezclas de vectores y, tras un periodo de recuperación, se dejan crecer en un medio selectivo (bien un medio que contiene al antibiótico frente al que el reportero confiere resistencia o bien un medio mínimo que contiene el antimetabolito frente al cual el reportero confiere resistencia). Las colonias celulares que crecen en medio selectivo se aislan y se vuelven a dejar crecer en medio selectivo. Una vez que se han obtenido células que son capaces de crecer durante repetidos ciclos de proliferación en presencia del marcador de selección, puede ser conveniente el eliminar dicho marcador de las células, particularmente si las células van a ser transfectadas con otro marcador de selección. Para ello, se pueden usar recombinasas, en particular el sistema Cre/Lox. Alternativamente, es posible amplificar el número de copias del marcador de selección, lo que resulta en una amplificación simultánea del número de copias del gen de interés con el consiguiente aumento de su expresión. Para ello, las células se hacen crecer en presencia de concentraciones progresivamente superiores de agente de selección, lo que resulta en una selección de las células que han sufrido una amplificación de los genes que confieren resistencia a tal agente y, normalmente, de las regiones adyacentes o intermedias. Preferiblemente se usa DHFR como marcador de selección y la selección de líneas celulares en las que existe una amplificación de dicho gen se lleva a cabo en presencia de geneticina.
Normalmente, se considera que una célula expresa un marcador de forma estable cuando la expresión de dicho marcador no disminuye con sucesivos ciclos de proliferación, independientemente de la presencia en el medio de cultivo de agente de selección.
Una vez que se dispone de una línea celular que ha integrado en su genoma de forma estable la construcción de ADN de acuerdo a la invención, la célula se pone en contacto con un compuesto o preparación cuyo efecto sobre la transcripción del gen reportero se desee estudiar. Por "poner en contacto" una célula con el compuesto candidato se incluye, según la presente invención, cualquier posible forma de llevar el compuesto candidato hasta el interior de la célula que expresa la construcción de ADN. Así, en caso de que el compuesto candidato sea una molécula de bajo peso molecular, es suficiente con añadir dicha molécula al medio de cultivo. En caso de que el compuesto candidato sea una molécula de alto peso molecular (por ejemplo, polímeros biológicos tales como un ácido nucleico o una proteína), es necesario aportar los medios para que esa molécula pueda acceder al interior celular. En caso de que la molécula candidata sea un ácido nucleico, pueden usarse métodos convencionales para transfección, según se ha descrito anteriormente para la introducción de la construcción de ADN. En caso de que el compuesto candidato sea una proteína, la célula puede ponerse en contacto tanto con la proteína directamente como con el ácido nucleico que la codifica acoplado a elementos que permitan su transcripción /traducción una vez que se encuentren en el interior celular. Para ello, se pueden usar cualquiera de los métodos mencionados anteriormente para permitir su entrada al interior celular. Alternativamente, es posible poner en contacto la célula con una variante de la proteína que se desea estudiar que ha sido modificada con un péptido que sea capaz de promover la translocación de la proteína al interior celular, tales como el péptido Tat derivado de la proteína TAT de HIV-I, la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia de D.melanogaster, la proteína VP22 del virus del herpes simplex y oligómeros de arginina (Lindgren, A. et al, 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al. , 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol. Therapy 8:143-150 y Snyder, E.L. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393). En un caso particular, el compuesto a ensayar no se encuentra aislado sino que se encuentra formando parte de una mezcla más o menos compleja bien derivada de una fuente natural o bien formando parte de una biblioteca de compuestos. Ejemplos de bibliotecas de compuestos que pueden ser ensayadas según el método de la presente invención incluyen, sin limitación, bibliotecas de péptidos incluyendo tanto péptidos como análogos peptídicos que comprenden D-amino ácidos o péptidos que comprenden enlaces no peptídicos, bibliotecas de ácidos nucleicos incluyendo ácidos nucleicos con enlaces no fosfodiester del tipo de fosforotioato o ácidos nucleicos peptídicos, bibliotecas de anticuerpos, de carbohidratos, de compuestos de bajo peso molecular, preferiblemente moléculas orgánicas, de peptidomiméticos, y similares. En el caso de que se use una biblioteca de compuestos orgánicos de bajo peso molecular, la biblioteca puede haber sido preseleccionada para que contengan compuestos que puedan acceder al interior celular con mayor facilidad. Así, los compuestos de pueden seleccionar en base a determinados parámetros tales como tamaño, lipofilicidad, hidrofilicidad, capacidad de formar puentes de hidrógeno.
En caso de que el compuesto candidato se encuentre formando parte de una mezcla de mayor o menor complejidad, el método de la invención comprende adicionalmente una o varias etapas (c) de fraccionamiento de la mezcla ensayada y la repetición de los pasos (a), (b) y (c) con cada una de las fracciones obtenidas hasta que se aisla el compuesto en la mezcla que es adecuado para el tratamiento o la prevención de la enfermedad neurodegenerativa. Métodos para el fraccionamiento de compuestos presentes en una mezcla incluyen cromatografía (en capa fina, de gases o de exclusión molecular en gel, de afinidad), cristalización, destilación, filtración, precipitación, sublimación, extracción, evaporación, centrifugación, espectrometría de masas, adsorpción y similares. Alternativamente, los compuestos a ensayar pueden estar formando parte de un extracto obtenido de una fuente natural. La fuente natural puede ser animal, vegetal obtenido de cualquier entorno, incluyendo, sin limitación, extractos de organismos terrestres, aéreos, marinos y similares.
En una segunda etapa, el método de la invención incluye la determinación de la actividad de la proteína codificada por el gen reportero. Preferiblemente, a la vez que se lleva a cabo la determinación de la actividad del gen reportero en presencia de los compuestos a ensayar, es necesario efectuar determinaciones en paralelo de la actividad transcripcional basal en presencia de únicamente el medio de cultivo y/o del vehículo en el que se encuentra disuelto el compuesto a ensayar o en el que se han preparado los extractos a ensayar. Generalmente, aquellos compuestos o extractos con actividad promotora de la transcripción se manifestarán porque darán valores superiores a 1 de la relación entre actividad transcripcional en presencia del compuesto o del extracto candidato y en presencia de vehículo. Preferiblemente, se considerarán compuestos o extractos positivos aquellos en los que la relación de actividad del gen reportero sea de al menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 y hasta 100.
El método de detección de la expresión del gen reportero implica la puesta en contacto de las células con un compuesto que puede generar un producto coloreado o fluorescente en presencia del producto codificado por el gen reportero. Así, si la enzima es la fosfatasa alcalina, se pueden usar substratos cromogénicos del tipo del p-nitrofenil fosfato (p-NPP), 5-bromo-4cloro 3-indolil fosfato/tetrazolio nitroblue (BCIP/NPT), Fast-Red/naftol-AS-TS fosfato o substratos fluorogénicos del tipo de 4-metilumbeliferil fosfato (4-MUP), 2-(5 '-cloro-2'-fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona (CPPCQ), 3,6-fluoresceína difosfato (3,6-FDP), Fast Blue BB, Fast Red TR o sales de diazonio de Fast Red Violet LB.
Si el gen reportero codifica una peroxidasa, se pueden usar substratos cromogénicos del tipo de 2,2-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), o-fenilenediamina (OPT), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5- amino salicílico, ácido 3-dimetilamino benzoico (DMAB) y 3-metil-2- benzotiazolinhidrazona (MBTH), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) y 3,3'- diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) o substratos fluorogénicos del tipo del ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacetico, fenoxazines reducidas y benzotiazines reducidas, incluyendo los reactivos Amplex® Red y Amplex UltraRed y los dihidroxantenos reducidos.
Si el gen reportero codifica una glucosidasa, se pueden usar substratos cromogénicos del tipo de o-nitrofenil-β-D-galactosido (o-NPG), p-nitrofenil-β-D- galactosido y 4- metilumbeliferil-β-D-galactosido (MUG) para la β-D-galactosidasa y substratos fluorogénicos del tipo de la resorufina beta-D-galactopiranosido, digalactosido de fluoresceína (FDG), diglucurónido de fluoresceína, 4-metilumbeliferil beta-D-galactopiranosido, carboxiumbeliferil beta-D-galactopiranosido y beta-D- galactopiranosido de cumarina. En una forma preferida de realización, el gen reportero codifica para la luciferasa y la detección se efectúa midiendo la luminiscencia emitida por dicha enzima en presencia de ATP. La luminiscencia se determina usando kits comerciales, como por ejemplo, el kit de enhanced luciferase assay (Analytical Luminescence Laboratory, MI).
En una forma de realización preferida, el método de la invención se utiliza para identificar compuestos adecuados para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa en donde dicha enfermedad se caracteriza por un aumento en la expresión del gen DDIT3 y en donde el cambio de expresión en el gen reportero es una disminución de la expresión de dicho gen DDlTS.
Como se ha mencionado anteriormente, los inventores han observado que, sorprendentemente, se produce una capacidad de respuesta a estímulos diferente en función de la variante alélica (-1507C ó -1507G) del promotor del gen DDlTi analizada. Así, en el análisis funcional del polimorfismo de la región promotora de
DDIT3 los inventores han observado una respuesta a EO en el caso de la variante -
1507G (SEQ ID NO: 2) que no se observa para la variante -1507C (SEQ ID NO: 1), y una respuesta a ERE mayor en el caso de la variante - 1507C.
Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la identificación de compuestos que inducen estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de: a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora y b) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como inductor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es un aumento de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.
Los inventores han observado que, aunque la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 responde más a ERE que la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2, ambas responden a este tipo de estrés celular. Por tanto, en una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la identificación de compuestos que inducen estrés oxidativo en una célula que comprende las etapas de: a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora y b) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como inductor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es un aumento de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.
El término "variante funcionalmente equivalente" tal como aquí se emplea se refiere a cualquier variante de la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2 que mantiene la capacidad de dicho promotor de inducirse por estrés oxidativo.
Asimismo, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de: a) poner una célula en condiciones de estrés de retículo endoplásmico, en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora; b) poner en contacto dicha célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza; y c) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como inhibidor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es una disminución de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto. Como se ha mencionado anteriormente, aunque la región promotora del gen
DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 responde más a ERE que la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2, ambas responden a este tipo de estrés celular. Por tanto, en una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2. Para llevar a cabo la etapa (a) del método, es decir, para poner una célula en condiciones de estrés de retículo endoplásmico, el método de la invención incluye cualquier forma posible de llevar dicha célula a una condición de estrés de retículo endoplásmico. Como se ha mencionado anteriormente, existen distintas situaciones fisiológicas o patológicas que pueden afectar al plegamiento proteico y/o a la homeostasis del Ca2+, como privación de glucosa, infecciones virales o la expresión de proteínas mutantes incapaces de plegarse y que pueden ser causa de ERE. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha condición de estrés se alcanza mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N-glicosilación de proteínas. En una realización más particular, dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina. Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés oxidativo en una célula que comprende las etapas de: a) poner una célula en condiciones de estrés de estrés oxidativo, en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora; b) poner en contacto dicha célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza; y c) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como inhibidor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es una disminución de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.
Para llevar a cabo la etapa (a) del método, es decir, para poner una célula en condiciones de estrés oxidativo, el método de la invención incluye cualquier forma posible de llevar dicha célula a una condición de estrés oxidativo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de compuestos que inducen estrés oxidativo en una célula y que pueden ser empleados en la etapa (a) del presente método incluyen agentes reactivos de tiol como el óxido de fenilarsina, arsenito de sodio, cloruro de mercurio, cloruro de cadmio, cloruro de zinc, generadores de radicales libres como el peróxido de hidrógeno, el hidroperóxido de t-butilo, el hidroperóxido de eumeno, etc. Como se ha mencionado anteriormente, especies reactivas de oxígeno (ROS) someten al organismo a un estrés oxidativo. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha condición de estrés se alcanza mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido. En una realización más particular, dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa.
El término "variante funcionalmente equivalente" tal como aquí se emplea se refiere a cualquier variante de la región promotora del gen DDITi identificada en la SEQ ID NO: 2 que mantiene la capacidad de dicho promotor de inducirse por estrés oxidativo. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, o para determinar la predisposición de un sujeto a padecer una enfermedad neurodegenerativa, o para determinar el estadio o severidad de la enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha enfermedad, que comprende determinar la presencia o ausencia del polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 del gen DDIT3 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de dicho polimorfismo es indicativo de dicha enfermedad, o de mayor predisposición de dicho sujeto a padecer dicha enfermedad, o de mayor severidad de la enfermedad, o de la no respuesta a la terapia en relación con un sujeto que no presenta dicho polimorfismo.
Según aquí se emplea, el término "polimorfismo" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una misma población. El polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen DDIT3 que comprende una transversión de Citosina (C) a Guanina (G). En una realización más particular, dicho polimorfismo se identifica con el código dbSNP rs3847699.
La detección del polimorfismo en el gen DDIT3 en el método de la invención, puede realizarse por mediante múltiples procedimientos conocidos por el experto en la materia, los cuales implican el aislamiento del ácido nucleico de una muestra biológica procedente del sujeto que se quiere evaluar.
El aislamiento del ácido nucleico de la muestra biológica puede realizarse por procedimientos conocidos por el experto en la materia. Dichos procedimientos pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y cois., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3τd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., VoI. 1-3.
Además, la presente invención no está limitada por la fuente de ácido nucleico, sino que la muestra biológica puede comprender sangre, saliva, fluido amniótico, tejido, etc. Así, en una realización particular de la invención, la muestra biológica procedente del sujeto es una muestra de tejido que comprende un ácido nucleico, preferentemente, ADN o ARN.
Posteriormente al aislamiento del ácido nucleico, se procede a la detección del polimorfismo. Sistemas y métodos para la detección de polimorfismos asociados a genes incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridación y tecnología array (e.g. tecnología disponible de Aclara BioSciences, Affymetrix, Agilent Technologies, Inc., etc), métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (e.g. TAQMAN, Applera Corp., GENECODE system, Erigen, etc.), ensayos de extensión de círculo rodante, ensayos de excisión invasiva, uso de espectroscopia de masas, ensayos de hibridación empleando una sonda complementaria al polimorfismo, ensayo de extensión de cebadores, métodos de escisión enzimática, NASBA, métodos de hibridación en sandwich, métodos que emplean marcadores moleculares, reacción en cadena de la ligasa y similares. Métodos de llevar a cabo la detección de polimorfismos se describen en Sambrook y cois., 2001 (citado at suprá) y en la solicitud de patente US2007/0105128. En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. Dicha construcción génica de la invención comprende, además, elementos que regulan la expresión de dicha secuencia de ADN. Dichos elementos reguladores incluyen promotores y potenciadores. Los promotores se encuentran típicamente posicionados en posición 5' con respecto al sitio de iniciación de la transcripción o traducción. Los potenciadores son capaces de influenciar la expresión de genes cuando se encuentran en posición 5 'o 3 'con respecto al ADNc o cuando se encuentran formando parte de un intrón. Secuencias reguladoras incluyen, además de promotores, secuencias que facilitan la traducción, señales de procesamiento para los intrones, codones de terminación, secuencias señales, sitios internos de unión al ribosoma (IRES) y señales de poliadenilación. En una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
Ventajosamente, dicha construcción génica comprende, adicionalmente, la secuencia de nucleótidos de un gen de interés operativamente unida. Dicho gen puede ser, por ejemplo, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que posteriormente permita la selección de una célula hospedadora transformada, transfectada o infectada con dicha construcción o con un vector de expresión que comprenda dicha construcción génica. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos marcadores incluyen genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos, y, en general, todos aquellos que permitan seleccionar a las células transformadas genéticamente.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector de expresión que comprende una construcción génica de la invención que está operativamente acoplado con una secuencia que regula la expresión de dicha construcción génica. El experto en la materia advertirá que el tipo de vector adecuado para la expresión de los ácidos nucleicos y construcciones génicas de la invención dependerá de la célula en el que se desee expresar dicha construcción génica. El vector de la invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende una construcción de la invención o un vector de la invención, para lo cual dicha célula ha podido ser transformada, transfectada o infectada con una construcción o vector proporcionado por esta invención. Células transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una célula animal transfectada o infectada con un vector apropiado. Células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas, levaduras y células eucariotas. En una realización particular, dicha célula se selecciona entre una célula de mamífero, una célula vegetal, una levadura y una bacteria. Las células hospedadoras preferidas son células eucariotas. En una realización preferida de la invención, dicha célula es una célula de una línea celular de neuroblastoma humano SK- N-MC.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que expresa una construcción génica que comprende
(i) la región promotora del gen DDIT3 que comprende la secuencia de SEQ
ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y (ii) un gen de interés acoplado operativamente a dicha región promotora.
En una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
En otra realización particular, dicha célula es una célula de una línea celular de neuroblastoma humano SK-N-MC.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una célula de la invención para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que cursa con niveles alterados de DDÍT3 o en la que es necesario alterar los niveles de DDlTi. Según se ha mencionado anteriormente, una célula que comprende una construcción o un vector de la invención, puede ponerse en contacto con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza y, por tanto, puede emplearse para la identificación de compuestos para el tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa.
En una realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo formado por la enfermedad de Alexander, la enfermedad de Alper, esclerosis lateral amiotrófica, Ataxia telangiectasia, la enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme (BSE), síndrome de cocaína, degeneración Corticobasal, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, la enfermedad de Kennedy, la enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpos Lewy, la enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis múltiple, atrofia sistémica múltiple, Neuroborreliosis, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, la enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, Prion diseases, la enfermedad de Refsum's, la enfermedad de Sandhoff, la enfermedad de Schilder, esquizofrenia, la enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinal, la enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, Tabes dorsalis y la enfermedad inflamatoria cerebral.
Las construcciones, los vectores o las células descritos de la invención pueden emplearse para obtener un animal no-humano transgénico que presenta, insertada en su genoma, la secuencia de nucleótidos de la construcción de la invención. Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un animal transgénico que comprende la construcción de la invención.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un animal no-humano transgénico, en adelante animal no-humano transgénico de la invención, que contiene, insertado en su genoma, una construcción de la invención. En una realización particular de la invención, el animal no-humano transgénico de la invención es un vertebrado, mamífero, preferiblemente un roedor, más preferiblemente un ratón o una rata. En otra realización particular de la invención, dicho animal no-humano es un pez. El animal no-humano transgénico de la invención puede presentar cualquier fondo genético de los conocidos en el estado de la técnica por el experto en la materia, es decir, dicho animal no-humano transgénico puede proceder de un animal tipo salvaje
(wt) o bien de un animal no-humano con un fondo genético que incorpore algún marcador molecular relacionado, directa o indirectamente, con una enfermedad neurodegenerativa.
DDIT3 es un factor de transcripción que se activa en respuesta a agentes que inducen estrés celular, en particular estreses que alteran la maquinaria de plegamiento del RE y factores que causan estrés oxidativo. Por tanto, dicho promotor puede emplearse en la expresión de un gen de interés de forma regulada, tal como un sistema inducible de expresión de proteínas.
Así, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende: a) introducir en una célula una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha secuencia se encuentra operativamente acoplada a dicho gen de interés; b) someter la célula a condiciones que generan estrés de retículo endoplásmico y, opcionalmente, c) recuperar de la célula el producto resultante de la expresión del gen de interés.
El término "variante funcionalmente equivalente" tal como aquí se emplea se refiere a una variante que responda o se induzca bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico. Así, en una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
En una realización particular, dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N-glicosilación de proteínas. Más particularmente, dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.
En otro aspecto la invención se relaciona con un método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende: a) introducir en una célula una construcción que comprende que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha secuencia se encuentra operativamente acoplada a dicho gen de interés, b) someter la célula a condiciones que generan estrés oxidativo y, opcionalmente, c) recuperar de dicha célula el producto resultante de la expresión del gen de interés.
En una realización particular de la invención, dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido en la célula. En una realización preferida, dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa.
En lo siguiente, la presente invención se explica adicionalmente mediante ejemplos. En ningún caso deberá ser interpretado como una limitación del ámbito de la invención tal y como se define en las reivindicaciones. EJEMPLO 1
I. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Plásmídos y clonajes
El promotor de DDIT3 amplificado por PCR se subclona en pcDNA3, de Invitrogen y posteriormente se clona en el plásmido pXP2 que no tiene actividad promotora per se (Nordeen, S.K. (1988) "Luciferase repórter gene vectors for analysis of promoters and enhancers." Biotechniques 6(5): 454-8). El plásmido que se empleó como control en los experimentos de transfección transitoria fue la construcción pSV-β- galactosidasa, de Promega.
1.1. Clonaje de la región promotora del gen DDIT3 (variante -1507 C) en un plásmido conteniendo un gen "repórter"
Para el gen de DDIT3 se amplificó por PCR la región correspondiente a los nucleótidos -1626 a +60 , tomando como +1 el inicio de la transcripción (nucleotidos 20059232 a 20027547 de la secuencia de referencia NT_029419 de la base de datos del NCBI) a partir de ADN genómico de un individuo que presentaba la forma alélica - 1507C. Dicha región del promotor del gen DDIT3 amplificada corresponde con la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1.
Los oligonucleótidos para la PCR (Invitrogen) incluyen sendas dianas de restricción para facilitar el clonaje creando tras la restricción sendos extremos cohesivos (indicadas como texto subrayado) y unas colas para facilitar el corte por la enzima de restricción de la diana (en minúsculas):
Chop-PromU: 5' cta gta gct tea atC CGG CCT TGT GAC AGT TTC T 3' (SEQ ID NO: 3)
Chop-PromL: 5' tat acá cta caá gct TGC CAC CCG CTC ATC TTT 3' (SEQ ID NO: 4) Se utilizaron las siguientes condiciones de PCR (reactivos de Biotools, excepto los nucleótidos, de Applied Biosystems): 50ng de ADN genómico se incubaron con 75mM de Tris HCl, pH 9.0, 1 mM de Cl2Mg, 1 unidad de Taq polimerasa, 200 μM de nucleótidos y 0,8 μM de oligonucleótidos, en un programa de PCR que incluía una desnaturalización inicial a 940C 5 minutos, 40 ciclos de 94°C 30 segundos, 55 0C 30 segundos y 72 0C 1 minuto y una elongación final de 720C 10 minutos, en el termociclador GeneAmp PCR System 9600, de Perkin Elmer.
Los productos amplificados se purificaron con el "QIAquick® PCR Purification kif\ de Qiagen, se sometieron a digestión enzimática durante 16 horas a 370C en tampón 2 (New England Biolabs) con 10 unidades de BamHl (New England Biolabs) y de Hindϊñ (promotor de DDIT3) y estos amplificados digeridos se purificaron de banda con el "QIAquick GeI Extraction kif\ de Qiagen.
Posteriormente, el promotor digerido y purificado se insertó en el plásmido pcDNA3, que previamente había sido digerido y purificado de la misma manera que el promotor correspondiente, utilizando el "Quick Ligation Kif\ de New England Biolabs, según instrucciones recomendadas por el fabricante, 10 minutos a temperatura ambiente.
Se transformaron bacterias XLl-Blue competentes mediante choque térmico
(42 C 30 segundos), y se crecieron en medio selectivo (LB: 5 gramos de extracto de levadura, 10 gramos de Triptona-Peptona -ambas de Difco— y 10 gramos de NaCl - Merck- por litro, con 100 μg/ml ampicilina -Roche-). El ADN plasmídico fue extraído de las bacterias transformadas empleando el hit "WizarcF Plus SV Minipreps", de Promega.
Para subclonar la región promotora en pXP2 se extrajo mediante restricción desde pcDNA3 con las mismas condiciones y enzimas de restricción empleadas en los pasos anteriores, se purificó de banda y se ligaron en pXP2, también digerido y purificado de la manera ya descrita. Se transformaron bacterias competentes y el ADN plasmídico fue extraído de las mismas por el método ya descrito.
Una vez comprobada la secuencia, se realizaron MaxiPreps con el "QIAGEN® Plasmid Purification kit", de Qiagen, según indicaciones del fabricante, para obtener una cantidad de plásmido suficiente para las posteriores transfecciones celulares.
El plásmido pXP2 tiene el sitio de clonaje en 5' al inicio de la secuencia codificante del gen de la luciferasa. Esta enzima cataliza una reacción que, en presencia de luciferina, genera emisión de fotones. Así, la actividad luciferasa se puede medir en un luminómetro que cuantifica el destello emitido, y de esta forma, la medida de la actividad luciferasa es un indicador cuantitativo de la actividad transcripcional de la región promotora clonada en el plásmido pXP2, que dirige su expresión. 1.2. Generación de la variante -1507G mediante mutagénesis dirigida
La otra variante alélica, de aquí en adelante variante -1507G, se obtuvo por mutagénesis dirigida con el "QuickChange® Site-directed Mutagénesis kif\ de
Stratagene, según indicaciones del fabricante. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados se indica a continuación, señalando con subrayado la base a mutar (fabricados por Invitrogen):
Ddit3-MutU: 5'ACT TTG CAT TCT GGG TGG TGC GTT TT 3'(SEQ ID NO: 5) Ddit3-MutL: 5'AAA ACG CAC CAC CCA GAA TGC AAA GT 3' (SEQ ID NO: 6)
El programa de PCR consistió en una desnaturalización inicial a 95 0C durante 30 segundos y 16 ciclos de 950C 30 segundos y 68 0C 10 minutos en el mismo termociclador donde se realizó la PCR. Posteriormente, se incubó el producto de PCR a 37°C durante 1 hora con Dpn/para eliminar el plásmido original.
Se transformaron bacterias competentes y se purificó el ADN plasmídico de la misma manera ya descrita para la primera variante alélica. La secuencia de todas las construcciones generadas fue comprobada en el servicio de Secuenciación del Parque Científico de Madrid (PCM).
2. Líneas Celulares
Se ha utilizado la línea celular de neuroblastoma humano SK-N-MC {American Type Cultura Collection, ATCC, ref. HTB-IO). Se creció en monocapa sobre placas de cultivo de 10 cm de diámetro (PlOO, de Falcon) y se mantuvo en medio mínimo esencial (MEM -Gibco-), suplementado con 10% de Suero Bovino Fetal (Sigma) descomplementado durante 30 minutos a 56 0C, aminoácidos no esenciales (L-alanina
39.2 mg/1, L-asparraginaΗ2θ 60 mg/1, L-ácido aspártico 53.2 mg/1, L-ácido glutámico 58.8 mg/1 y L-prolina 46 mg/1, todos de Merck), L-glutamina 4 mM -Merck-, piruvato sódico 1 mM -Merck-, y gentamicina 50 μg/ml -Sigma-.
Las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera humidificada con CO2 al 7%.
3. Transfección de células y medida de la actividad transcripcional La colección de plásmidos generada se empleó para la transfección transitoria y estable de células de neuroblastoma humano SK-N-MC. 3.1. Transfección transitoria con las construcciones pXP2-DDIT3
El día previo a la transfección se siembran 2 x 105 células por pocilio en una placa de 24 pocilios (M24, de Falcon). Se transfectan 0,7 μg de ADN por pocilio mezclando los plásmidos pXP2-DDIT3 y pSV-β-galactosidasa en una relación 1:1 (0,35 μg de pXP2 y 0,35 μg de β-gal) con Lipofectamina Plus (de Life Technologies), siguiendo las indicaciones del fabricante, en relación ADN: Lipofectamina 1 :3 y dejando la incubación de las células con el plásmido 5 horas. A las 24 horas de la transfección se hace el tratamiento a las células para ver la respuesta al estímulo.
Para analizar las células transfectadas con construcciones que expresan luciferasa, tras lavar con Tampón Fosfato Salino (PBS) (8 g/1 NaCl, 0,2 g/1 KCl, 2,89 g/1
HNa2(PO4)2 12 H2O y 0,2 g/1 HK(PO4), todo de Merck), se lisan las células con 200 μl del kit "CeIl Culture Lysis Reagenf\ de Promega (25 mM Tris pH 7,8 con H3PO4, 2 mM CDTA, 2 mM DTT, 10% glicerol y 1% Tritón X-IOO). Para facilitar la lisis se deja
10 minutos a temperatura ambiente y después se someten las células a un ciclo de congelación (mínimo 2 horas a -70 C) y descongelación a temperatura ambiente; para desechar los restos celulares grandes se centrifugan las muestras a 13.000 r.p.m. durante
10 minutos.
El Usado celular fue ensayado para las actividades β-galactosidasa, como indicador de la eficiencia de la transfección, y luciferasa, como indicador de la actividad transcripcional de los promotores:
- Ensayo de actividad β-galactosidasa. Se incuban 50 μl de Usado celular en una placa de E.L.I.S.A. con 50 μl de sustrato de enzima (2 mM MgCl2 - Merck-, 100 mM β-mercaptoetanol -Sigma-, 120 mM Na2HPO4, 80 mM NaH2PO4 -ambos de Cario Erba- y 1.33 mg/ml de ONPG (2-Nitrofenil-β-D- galactopiranósido) -Sigma—). Esta reacción origina un producto coloreado cuya concentración se mide como absorbancia a 415 nm en un lector de placas de E.L.I.S.A. (Modelo 680, de BioRad).
- Ensayo de actividad luciferasa. Se miden 40 μl de Usado celular añadiendo 100 μl de reactivo de la enzima (20 mM Tricina, 1,07 mM MgCO4, 33,3 mM DTT, 270 μM Coenzima A -todo de Sigma-, 2,67 mM MgSO4, 0,1 mM
EDTA -ambos de Merck-, 470 μM sal potásica de Luciferina -Promega- y 530 μM ATP -Boehringer Mannheim-); alternativamente, se empleó el del kit Luciferase Assay System -Promega-. La emisión de luminiscencia se registra en un luminómetro Monolight 2010 (Analytical Luminiscence Laboratory).
La actividad transcripcional de las diferentes construcciones se expresa como la actividad relativa luciferasa/β-galactosidasa.
3.2. Transfección estable con la construcción de pXP2-DDIT3
Dos días antes de la transfección, se siembran 3 x 106 células en una placa de cultivo PlOO. Se mezclan los plásmidos pXP2-DDIT3 (construcciones -1507C o - 1507G) y pcDNA3 en una relación 90:10 para transfectar 16 μg de ADN (14.4 μg de pXP2 y 1,6 μg de pcDNA3) por placa con Lipofectamina Plus, según indicaciones del fabricante, en relación ADN: Lipofectamina 1 :4, durante 5 horas.
Se recogen las células de la placa P100 mediante tripsinización con una solución de tripsina 500 mg/1 (Disco) y EDTA 160 mg/1 (Merck) y se siembran diluciones de la transfección 1/2, 1/10, 1/100 y 1/1000. Al día siguiente, y a partir de ahí cada 3 ó 4 días
(2 veces en semana), se sustituye el medio por medio fresco con Geneticina 400 μg/ml —
Gibco- hasta obtener clones aislados.
Se aislan los clones resistentes al antibiótico por aspiración con una pipeta automática y se siembran en una M24 para su expansión. Se analiza la expresión de luciferasa y se mantienen las líneas que tienen mayor actividad luciferasa. Además, se realiza una normalización de la cantidad de construcción pXP2 en función del número de células. Para esto, se purifica el DNA celular de la mitad del volumen resultante de la lisis con el kit High Puré PCR Témplate Preparation y se realizan PCRs a tiempo real en el aparato AbiPrism® 7900HT Sequence Detection System, de Applied Biosystems en las condiciones universales de PCR indicadas por el fabricante: se determina la cantidad de plásmido que hay en el extracto amplificando un fragmento del gen de la luciferasa con los oligonucleótidos:
5'CCT TGA TTG ACA AGG ATG GAT GGC 3' (SEQ ID NO: 7) y 5'CAT CGT CGG GAA GAC CTG CCA CGC CC 3' (SEQ ID NO: 8) y se calcula su cantidad relativa en función del número de células mediante el ensayo de
Applied Biosystems Hs99999901_sl, para cuantificar la cantidad de 18S, constante en la célula. 4. Tratamientos celulares
Para inducir estrés oxidativo (EO) se emplea el sistema Xantina / Xantina- Oxidasa (XXO) (Xantina 10 μM -Sigma- en NaOH 0,ImM -Merck- y Xantina- Oxidasa 50 mU/ml -Roche-), que produce liberación de aniones superóxido (O2"). Para inducir estrés de retículo endoplásmico (ERE) se emplea Tunicamicina
(Tn) (2,5 μg/ml en DMSO, todo de Sigma), que es un antibiótico producido por Streptomyces lysosuperficus que inhibe la N-glicosilación de las proteínas.
Para la convergencia de ambos estreses (RIE) se añade XXO y Tn simultáneamente en las cantidades ya indicadas. Los tratamientos se realizaron de manera puntual, recogiendo a un determinado punto (normalmente, 18 horas), o en cinéticas, recogiendo puntos durante 24 horas a intervalos de 3 horas.
II. RESULTADOS
1. Obtención de las construcciones plasmídicas empleadas
Se clonó en el vector de expresión pcDNA3 un producto amplificado que abarca la región entre las posiciones -1626 a +60 (promotor de DDIT3, forma alélica -1507C), tomando la posición +1 en el inicio de la transcripción. Posteriormente se extrajo por restricción la región promotora desde pcDNA3 para subclonarlas en el vector pXP2.
De esta manera, se obtuvo un plásmido que contenía el promotor de DDTTi unido en 5' a la secuencia codificante de la luciferasa. Esta construcción fue empleada para realizar sobre ella la mutagénesis dirigida y así obtener la otra variante alélica: - 1507G (promotor de DDIT3). Los plásmidos fueron secuenciados en el PCM, determinando que la secuencia promotora coincidía con la publicada con número de acceso NT 029419 de la base de datos del NCBI, nucleotidos del 20059232 al 20057547.
2. Obtención de dos líneas celulares que expresan de forma estable la luciferasa bajo el control del promotor de DDITS
Se cotransfectó de forma estable la línea celular de neuroblastoma humano SK- N-MC con la construcción plasmídica de pXP2 con el promotor de DDIT3 (una construcción para cada alelo del -1507, C y G) ya descrita, junto con pcDNA3, que confiere resistencia al antibiótico Geneticina, para seleccionar los clones celulares que han adquirido los plásmidos.
Se aislaron y amplificaron 16 colonias resistentes a Geneticina y se analizó su expresión basal de luciferasa. En los clones para los que se obtenían cuentas de luciferasa de al menos orden 104 por volumen de ensayo, se analizó su carga de la construcción de plásmido pXP2 normalizado en función del número de células y también la expresión de luciferasa en condiciones básales y en respuesta a estímulos. Los resultados obtenidos para cada clon celular se detallan en la Tabla 1.
-1507C -1507G
CLON Luciferasa % copias CLON Luciferasa % copias
(cuentas) pXP2 / (cuentas) pXP2 /
18S 18S
Cl 69.198 6,05 Gl 1.841 nd
C2 69.198 4,66 G2 25.168 82,73
C3 70.883 3,31 G3 64.915 8,36
C4 147.104 3,46 G4 318.561 24,90
C5 145 nd G5 112.015 34,74
C6 145.213 3,77 G6 218 nd
C7 222.361 17,25 G7 62.890 6,97
C8 4.778 nd G8 3.240 nd
Tabla 1. Análisis de los clones transfectados establemente con las construcciones en pXP2 DDIT3(-15O7C) - Luciferasa y DDIT3(-1507G) - Luciferasa. Para cada variante alélica de la posición -1507 del promotor de DDIT3 se indica, en cada clon analizado, las cuentas de luciferasa obtenidas en un 10% de extracto celular proveniente de un pocilio de M24 al 80% de confluencia y, en el caso de determinarse, la cantidad de copias relativas a la cantidad de 18S del extracto (nd, no determinado).
Se realizó la caracterización de las colonias Cl (alelo -1507C) y G7 (alelo - 1507G) por tener tanto un crecimiento celular como una carga plasmídica similares. 3. Estudio de la actividad transcripcional del promotor de DDIT3
Los plásmidos con la región promotora de DDlTS fueron empleados en experimentos de transfección transitoria y estable en células SK-N-MC.
Las células fueron transfectadas empleando lipofectamina, que forma complejos con los plásmidos, y que son los que las células captan. Posteriormente, fueron tratadas según modelos puestos a punto en el laboratorio para simular situaciones de estrés (oxidativo y/o de retículo) durante suficiente tiempo como para permitir a las células expresar luciferasa, que es la actividad que se ensaya para determinar la actividad transcripcional de los promotores clonados en respuesta a estos estímulos.
3.1. En células transfectadas transitoriamente
Se realizaron experimentos puntuales y de cinética de diferentes condiciones de cultivo en células SK-N-MC que expresan transitoriamente la enzima luciferasa bajo la regulación del promotor de DDIT3 con las variantes alélicas C y G en la posición -1507. En la Figura 1 se muestra la actividad transcripcional de las dos construcciones en las diferentes condiciones de cultivo a lo largo del tiempo. Se representan las Cuentas de Luciferasa (xlO"3) por miliunidad de β-galactosidasa; se recogieron puntos para su análisis cada 3 horas hasta un tiempo final de 24.
En respuesta a las diferentes condiciones de cultivo se observa que, para ambas variantes alélicas, hay una ligera estimulación de la actividad transcripcional en respuesta a las condiciones de cultivo de EO y una activación más acusada en respuesta a las condiciones de ERE y de RIE.
A la luz de estos datos, se puede afirmar que la región promotora clonada contiene los elementos mínimos necesarios para mantener la capacidad de respuesta del gen DDIT3 a estrés, por lo que los dos plásmidos generados (pXP2 DDIT3(-1501C) y pXP2 DDIT3{-\ 507 XJ)) son útiles para ensayar la activación del gen DDIT3 e, indirectamente, por ser este gen un testigo de la inducción de muerte celular por apoptosis, para ensayar la actividad neurotóxica o neuroprotectora de compuestos.
3.2. En células transfectadas establemente (Líneas celulares estables Cl (-1507 C) y G7 (-1507 G)
Se realizaron experimentos puntuales y de cinética de diferentes condiciones de cultivo en células SK-N-MC que expresan la enzima luciferasa de forma estable bajo la regulación del promotor de DDIT3 con las variantes alélicas C y G en la posición -1507 (líneas CI y G7, respectivamente).
Las cuentas de actividad luciferasa se normalizaron respecto a la carga plasmídica por célula y respecto al número de células según se ha descrito anteriormente. Se comprobó que la carga plasmídica era la misma para ambas líneas celulares y que no se alteraba por los tratamientos utilizados.
En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos durante un tratamiento de 24 horas recogiendo puntos cada 3 horas, expresados en actividad luciferasa normalizada, que mide la actividad transcripcional del promotor DDIT3 para ambas variantes alélicas (- 1507 C y G) durante el tratamiento.
En condiciones básales, se observa que la actividad transcripcional se mantiene prácticamente constante a lo largo de todo el estudio, sin apreciar diferencias estadísticamente significativas entre ambas variantes. A grosso modo, se observa para ambas líneas celulares una estimulación muy acusada en respuesta a las condiciones de cultivo de ERE y de RIE.
El análisis detallado del comportamiento de las líneas en respuesta a los diferentes estímulos mostró que: Línea celular Cl (DDIT3 -15070 (Fig. 2. panel A).
• En condiciones de EO, la actividad transcripcional del promotor se mantiene prácticamente constante a lo largo del tiempo, sin apreciar diferencias estadísticamente significativas respecto a la observada en condiciones básales.
• En condiciones de ERE, se empieza a observar a partir de las 6 horas de tratamiento un aumento progresivo de la actividad transcripcional estadísticamente significativa hasta llegar a valores máximos en torno a las
15-18 horas de tratamiento.
• En condiciones de RIE, la actividad transcripcional es similar a la ya descrita en condiciones de ERE, pero con unos niveles de actividad transcripcional ligeramente inferiores en RIE que en ERE. Línea celular G7 ÍDDIT3 -1507G) (Fig. 2. panel B).
• En condiciones de EO se puede observar a partir de las 9 horas de tratamiento una actividad transcripcional en respuesta al estímulo mayor que la actividad observada en condiciones básales, con un máximo de actividad a las 15 horas.
• En condiciones de ERE, también se empieza a observar un aumento progresivo a lo largo del tiempo de la actividad transcripcional, estadísticamente significativo a partir de las 6 horas de tratamiento hasta alcanzar un máximo en torno a las 15 horas. En el caso de esta variante alélica, el nivel de actividad transcripcional máximo no alcanza los niveles a los que llega la variante -1507C.
• En condiciones de RIE, el perfil de actividad transcripcional es similar al ya descrito en condiciones de ERE, pero observando mayor respuesta, de manera que a partir de las 15 horas de tratamiento la diferencia entre estas dos respuestas (RIE y ERE) es estadísticamente significativa.
En resumen, este estudio muestra una diferencia de comportamiento de los alelos C y G en respuesta a EO, así como a las condiciones de RIE respecto a los de
ERE. Para cuantificar esta diferencia, se utilizaron los datos correspondientes a 15 horas de cultivo, tiempo en que la actividad transcripcional alcanzaba el máximo en todos los cultivos, aunque este comportamiento diferente se mantiene para todos los tiempos superiores a este tiempo. Los resultados de la comparación, expresando la actividad transcripcional en veces respecto a las condiciones básales de cultivo, se muestran en la
Tabla 2.
Activación del promotor de DDIT3 por Estrés Oxidativo (EO), de Retículo Endoplásmico (ERE) y su combinación (RIE)
-1507C -1507G
EO 1.1 ± 0.2 1.8 ± 0.2 *
ERE 4.6 ± 0.4 3.4 ± 0.3 *
RIE 4.1 ± 0.4 4.3 ± 0.4
Tabla 2. Actividad luciferasa de las células transfectadas establemente con las construcciones pXP2 - DDIT3 - Luciferasa (-1507C o -1507G) a las 15 horas de tratamiento, respecto a las células no tratadas, en veces ± el error estándar de la media. (*) Significativo respecto al alelo C (t de Student p<0.05). DISCUSIÓN
Papel del polimorfismo del promotor del gen DDIT3 sobre la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer.
En el análisis funcional del polimorfismo de la región promotora de DDIT3 los inventores han observado una capacidad de respuesta a estímulos diferente en función de la variante alélica analizada. Los resultados experimentales indican una respuesta a
EO en el caso de la variante -1507G que no se observa para la variante -1507C, lo que conduce a una mayor actividad transcripcional del promotor con esta variante polimórfica en respuesta a EO, lo que podrían conferir a las células una mayor predisposición a la apoptosis dirigida por este gen en condiciones de EO.
Este hecho podría explicar que el riesgo asociado en individuos de edad avanzada con la EA al hecho de ser portador del alelo G en este sitio polimórfico, porque se trata de individuos que, por el mismo proceso de envejecimiento hay un EO intrínseco que genera unos niveles transcripcionales superiores que en el caso del alelo protector, C. Esto podría ocurrir si hubiese un factor activador de la transcripción que se activara en respuesta a EO y que se uniera exclusivamente a la variante polimórfica - 1507G.
En cuanto a la diferencia observada en respuesta a ERE, si bien ambas variantes presentan capacidad de respuesta transcripcional, ésta es mayor en el caso de -1507C, donde se alcanzan valores transcripcionales máximos. Unos niveles de ERE suficientemente elevados como para conducir a las células a apoptosis se encuentran en individuos con sobrecarga del RE, como podría ser el caso de individuos con mutaciones. En este caso, la alteración funcional producida por la mutación y/o la sobrecarga de retículo endoplásmico sería lo suficientemente fuerte como para alcanzar unos niveles de Chop que condujesen las células a apoptosis.
Esta sobreexpresión de DDIT3 en respuesta a ERE podría explicar el efecto observado de interacción entre el polimorfismo y la edad de aparición de los síntomas: en los individuos maduros más jóvenes puede haber una sobrecarga del RE que conduzca a ERE, pero aún no se ha producido el EO debido al envejecimiento. De este modo, los individuos homocigotos para la variante alélica -1507C presentarían unos niveles de expresión de DDIT3 mayor que la de los individuos portadores de la variante -1507G, que abocara a las células a apoptosis, adelantando así la edad de aparición de los síntomas de la enfermedad. En respuesta a RIE se igualan los niveles transcripcionales en ambas variantes alélicas, obteniendo niveles transcripcionales máximos. Como se trata de una convergencia de estreses, oxidativo y de RE, probablemente estén actuando múltiples factores de transcripción que, en su totalidad, enmascaren el efecto diferencial en la actividad transcripcional en función de la variante alélica presentada.
Funcionalidad de las variantes alélicas -1507 C y G del promotor del gen DDlTS
Con el fin de analizar si este polimorfismo podría causar diferencias a nivel de expresión del gen, se realizaron ensayos de transfección transitoria en células SK-N-MC y se generaron líneas transfectantes estables, y se estudió la expresión en condiciones básales de cultivo y en respuesta a inductores de estrés relacionados con la neurodegeneración y la EA. En ensayos de transfección transitoria
Los resultados obtenidos indican que todos los estímulos a los que se ha sometido a las células permiten ver una alteración de la actividad promotora a partir de las 6 horas de tratamiento; en concreto, la actividad transcripcional observada tras los tratamientos con el sistema Xantina / Xantina Oxidasa, que genera EO, con tunicamicina, para producir ERE, y con ambos tratamientos conjuntamente, que genera
RIE, aumenta significativamente, con un comportamiento similar al observado para el promotor de DDIT3 endógeno.
Por otra parte, las dos variantes alélicas tienen un comportamiento similar en estos ensayos. En las líneas neuronales trasfectantes estables
Se observa que estas líneas se comportan de forma similar a lo descrito en las transfecciones transitorias pero, a diferencia de lo que allí ocurría, aquí si se observa un comportamiento diferencial según el alelo que porte la línea celular estable:
Si bien la actividad en condiciones de cultivo básales no se diferencia entre ellas, la respuesta a los estímulos sí es diferente. En concreto, la variante -1507G parece responder menos a ERE y más a EO que la variante -1507C. Este hecho podría ser debido a que en la posición donde se encuentra el polimorfismo rs3847699 hubiera un sitio de unión de factores de transcripción relacionados con la respuesta a los estímulos. De hecho, con programas de predicción de sitios de transcripción, encontramos que los factores de transcripción humanos RREB-I y LBP-I c/CP2/LSF (CP2) se podrían unir a la región entre las posiciones de -1500 a -1519 y de -1505 a -1515, respectivamente, pero solamente en el caso de que la variante alélica presente sea G. El factor de transcripción CP2 (gen TFCP 2, localización 12ql3) ha sido relacionado con la EA, en cuanto a que se ha descrito una asociación entre un polimorfismo (AJG) de la región 3'UTR del gen y la enfermedad. Se ha visto que la región 3'UTR se une a proteínas, de manera que el alelo A, protector frente a la EA, tienen una unión más débil que el alelo G. Este factor regula la expresión de otros genes que ya han sido relacionados con la EA (GSK3, α-2macroglobulina, NFKB, interleukina 1 o TNF), puede modular la activación de distintos virus, como HSV-I, e interacciona con la proteína Fe65, que regula la internalización y el procesamiento del APP.
Es posible que el polimorfismo estudiado en la región promotora de DDIT3 tenga, como sugieren los datos aquí mostrados, una repercusión en la capacidad de respuesta de este gen a distintos estímulos porque dicho polimorfismo afecte la unión de CP2 u otros factores de transcripción, y que sea la respuesta diferencial a estímulos inductores de estrés la responsable de la asociación con la edad de inicio de la enfermedad de Alzheimer que los inventores han obsevado.
La respuesta a estímulos de las dos líneas celulares generadas, así como su respuesta diferencial al estrés oxidativo (EO) y del retículo endoplásmico (ERE) indica que estas dos líneas (y los plásmidos utilizados para generarlas) son unas herramientas muy útiles para ensayar la capacidad de compuestos para: activar el gen DDIT3, inducir o inhibir el estrés oxidativo y del retículo endoplásmico, así como inducir o inhibir la muerte neuronal por apoptosis (ensayos de neuroprotección).

Claims

REIVINDICACIONES
1 Método para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que comprende las etapas de: a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora y b) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como adecuado para el tratamiento o prevención de dicha enfermedad neurodegenerativa si provoca una variación en la expresión del gen reportero en sentido contrario a la alteración existente de los niveles de DDIT3 en la enfermedad neurodegenerativa en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto o si provoca una alteración en la expresión del gen reportero en el mismo sentido que la alteración que se desea conseguir en los niveles de DDIT3.
2 Un método según la reivindicación 1, en el que dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
3 Un método según la reivindicación 1 ó 2, donde dicha enfermedad neurodegenerativa cursa con un aumento en los niveles de expresión de DDIT3 y en donde el cambio de expresión en el gen reportero que se detecta en la etapa (b) es una disminución de expresión.
4 Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo formado por la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Alexander, la enfermedad de Alper, esclerosis lateral amiotrófica, Ataxia telangiectasia, la enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme bovina (BSE), síndrome de cocaína, degeneración corticobasal, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, la enfermedad de Kennedy, la enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpos Lewy, la enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis múltiple, atrofia sistémica múltiple, Neuroborreliosis, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, la enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades por priones, la enfermedad de Refsum, la enfermedad de Sandhoff, la enfermedad de Schilder, esquizofrenia, la enfermedad de Spielmeyer-Vogt- Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinal, la enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, Tabes dorsalis y la enfermedad inflamatoria cerebral.
Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha célula es una célula SK-N-MC.
Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde si el compuesto candidato se encuentra formando parte de una mezcla, el método comprende adicionalmente una o varias etapas (c) de fraccionamiento de la mezcla ensayada y la repetición de los pasos (a), (b) y (c) con cada una de las fracciones obtenidas hasta que se aisla el compuesto en la mezcla que es adecuado para el tratamiento o la prevención de la enfermedad neurodegenerativa.
Un método para la identificación de compuestos que inducen estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de: a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora y b) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como inductor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es un aumento de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.
Un método según la reivindicación 7, en el que dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
Un método para la identificación de compuestos que inducen estrés oxidativo en una célula que comprende las etapas de: a) poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDlTi identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante fiαncionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora y b) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como inductor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es un aumento de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.
Un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de: a) poner una célula en condiciones de estrés de retículo endoplásmico, en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDlTi identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora; b) poner en contacto dicha célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza; y c) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como inhibidor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es una disminución de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.
Un método según la reivindicación 10, en el que dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N- glicosilación de proteínas, a tapsigargina o a una bajada de temperatura..
Método según la reivindicación 12, donde dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.
Un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés oxidativo en una célula que comprende las etapas de: a) poner una célula en condiciones de estrés de estrés oxidativo, en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende: i) la región promotora del gen DDlTS identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y ii) un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora; b) poner en contacto dicha célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza; y c) detectar la expresión del gen reportero; en donde el compuesto ensayado es identificado como inhibidor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es una disminución de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto. 15 Método según las reivindicación 14, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido o de radicales libres en la célula.
16 Método según la reivindicación 15, donde dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa o agua oxigenada.
17 Un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, o para determinar la predisposición de un sujeto a padecer una enfermedad neurodegenerativa, o para determinar el estadio o severidad de la enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha enfermedad, que comprende determinar la presencia o ausencia del polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 del gen DDIT3 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de dicho polimorfismo es indicativo de dicha enfermedad, o de mayor predisposición de dicho sujeto a padecer dicha enfermedad, o de mayor severidad de la enfermedad, o de la no respuesta a la terapia en relación con un sujeto que no presenta dicho polimorfismo.
18 Método según la reivindicación 17, donde dicha enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo formado por la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Alexander, la enfermedad de Alper, esclerosis lateral amiotrófica, Ataxia telangiectasia, la enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme bovina (BSE), síndrome de cocaína, degeneración corticobasal, la enfermedad de Creutzfeldt- Jakob, la enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, la enfermedad de
Kennedy, la enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpos Lewy, la enfermedad de Machado- Joseph, esclerosis múltiple, atrofia sistémica múltiple, Neuroborreliosis, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, la enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades por priones, la enfermedad de Refsum, la enfermedad de Sandhoff, la enfermedad de Schilder, esquizofrenia, la enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinal, la enfermedad de Steele-Richardson- Olszewski, Tabes dorsalis y la enfermedad inflamatoria cerebral. Una construcción génica que comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.
Construcción génica según la reivindicación 19, donde dicha variante presenta el polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2.
Una construcción génica según la reivindicación 19 ó 20, que comprende, adicionalmente, la secuencia de nucleótidos de un gen de interés operativamente unida.
Un vector de expresión que comprende una construcción génica según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.
Una célula que comprende una construcción génica según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, o un vector de expresión según la reivindicación 22.
Una célula que expresa una construcción génica que comprende a) la región promotora del gen DDIT3 que comprende la secuencia de SEQ ID
NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y b) un gen de interés acoplado operativamente a dicha región promotora.
Célula según la reivindicación 24, donde dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
Una célula según las reivindicaciones 23 a 25 donde dicha célula es una célula SK-
N-MC.
Uso de una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que cursa con niveles alterados de DDIT3 o en la que es necesario alterar los niveles de DDIT3. Uso según la reivindicación 27, donde dicha enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo formado por la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Alexander, la enfermedad de Alper, esclerosis lateral amiotrófica, Ataxia telangiectasia, la enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme bovina (BSE), síndrome de cocaína, degeneración corticobasal, la enfermedad de Creutzfeldt- Jakob, la enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, la enfermedad de Kennedy, la enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpos Lewy, la enfermedad de Machado- Joseph, esclerosis múltiple, atrofia sistémica múltiple, Neuroborreliosis, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, la enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades por priones, la enfermedad de Refsum, la enfermedad de Sandhoff, la enfermedad de Schilder, esquizofrenia, la enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinal, la enfermedad de Steele-Richardson- Olszewski, Tabes dorsalis y la enfermedad inflamatoria cerebral.
Método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende a) introducir en una célula una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha secuencia se encuentra operativamente acoplada a dicho gen de interés; b) someter la célula a condiciones que generan estrés de retículo endoplásmico y, opcionalmente, c) recuperar de la célula el producto resultante de la expresión del gen de interés.
Un método según la reivindicación 29, en el que dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N- glicosilación de proteínas. Método según la reivindicación 31, donde dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.
Método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende a) introducir en una célula una construcción que comprende que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha secuencia se encuentra operativamente acoplada a dicho gen de interés, b) someter la célula a condiciones que generan estrés oxidativo y, opcionalmente, c) recuperar de dicha célula el producto resultante de la expresión del gen de interés.
Método según las reivindicación 33, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido en la célula.
Método según la reivindicación 34, donde dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, donde dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 1.
Un animal no-humano transgénico que contiene, insertado en su genoma, una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012094580A2 (en) 2011-01-07 2012-07-12 High Point Pharmaceuticals, Llc Compounds that modulate oxidative stress
WO2013122693A1 (en) * 2012-02-14 2013-08-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Electrocatalysts having mixed metal oxides
US10105450B2 (en) * 2013-03-15 2018-10-23 University Of Iowa Research Foundation Promoter compositions
CN107189986B (zh) * 2017-07-25 2020-08-11 南京大学 一种基于内质网应激的报告基因细胞株构建方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010007768A1 (en) * 2000-01-07 2001-07-12 Stephen B. Howell Quantification of cellular injury using expression of a fluorescent protein under the control of the gadd153 promoter
US20040142345A1 (en) * 2002-09-06 2004-07-22 David Ron Methods of screening test compounds using GADD34L, an eIF2alpha-specific phosphatase subunit
US20070105128A1 (en) 2000-12-27 2007-05-10 Yusuke Nakamura Detection of genetic polymorphisms

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010007768A1 (en) * 2000-01-07 2001-07-12 Stephen B. Howell Quantification of cellular injury using expression of a fluorescent protein under the control of the gadd153 promoter
US20070105128A1 (en) 2000-12-27 2007-05-10 Yusuke Nakamura Detection of genetic polymorphisms
US20040142345A1 (en) * 2002-09-06 2004-07-22 David Ron Methods of screening test compounds using GADD34L, an eIF2alpha-specific phosphatase subunit

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUSUBEL, F.M. ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1997, pages 9.5.1 - 9.5.19
DATABASE EMBL "Homo sapiens DNA-damage- inducible transcript 3 (DDTI3) gene. NIEHS-SNPs, Environmental Genome Project, NIEHS ES15478, Department of Genome Sciences.", XP008136599, Database accession no. AY880949 *
DEPARTMENT OF GENOME SCIENCES, 14 November 2006 (2006-11-14), ., Retrieved from the Internet <URL:http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/sva/ sva.pl?session=%2F...%2FSESSION10836-1231837563- 1 &index=2&view=56595 8049>> *
GUYTON, K. Z. ET AL.: "Induction of the mammalian stress response gene GADDI53 by oxidative stress: role of AP-1 element.", THE BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 314, no. PT 2, March 1996 (1996-03-01), pages 547 - 554, XP008136598 *
HEINEMEYER, T. ET AL., NUCLEIC ACID RES., vol. 26, 1998, pages 364 - 370
LINDGREN, A. ET AL., TRENDS PHARMACOL. SCI, vol. 21, 2000, pages 99 - 103
LUNDBERG, M ET AL., MOL. THERAPY, vol. 8, 2003, pages 143 - 150
NORDEEN, S.K.: "Luciferase reporter gene vectors for analysis of promoters and enhancers.", BIOTECHNIQUES, vol. 6, no. 5, 1988, pages 454 - 8
NOVOA, I. ET AL.: "Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2a.", THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 153, no. 5, May 2001 (2001-05-01), pages 1011 - 1021, XP008136596 *
PARK, J. S. ET AL.: "Isolation, characterization and chromosomal localization of the human GADD153 gene.", GENE, vol. 116, no. 2, July 1992 (1992-07-01), pages 259 - 267, XP008136600 *
SCHWARZE, S.R. ET AL., TRENDS PHARMACOL. SCI., vol. 21, 2000, pages 45 - 48
See also references of EP2221379A4
SNYDER, E.L.; DOWDY, S.F., PHARM. RES., vol. 21, 2004, pages 389 - 393
UBEDA, M. ET AL.: "CHOP gene expression in response to endoplasmic-reticular stress requires IFY interaction with different domains of a conserved DNA-binding element.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 28, no. 24, December 2000 (2000-12-01), pages 4987 - 4997, XP008136597 *

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