WO2009053511A1 - Método para mejorar la tolerancia a la salinidad - Google Patents

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sodium
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Juan Pedro NAVARRO AVIÑO
José Rafael LÓPEZ MOYA
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Navarro Avino Juan Pedro
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    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)

Definitions

  • the field of the present invention is within the area of molecular biology, and in particular in the involvement of plant genes in sodium detoxification processes, the use of transformed organisms constitutively or inducedly expressing these genes, and methods of bioremediation for media recovery.
  • the present invention relates to the set-up of a tool and a specific method to improve the tolerance to the salinity of living organisms and eliminate sodium (Na + ) from water, soil, sludge and any other means containing this element, based on the use of the gene of the phytokelatin synthase of Nicotiana glauca.
  • Soil salinization is one of the most important problems that agriculture has for its development.
  • Global climate change produces an increase in water stress, a cosubstantial factor of saline stress, since the water deficit is also the cause of the increase in salt concentrations in soils.
  • NaCI sodium chloride
  • the Na + can enter the cell through several types of channels, “voltage-dependent cation channels” and “voltage-independent cation channels” (VIC).
  • VICs are the main route of entry of Na + to plant cells (Xiong L et al. (2002) in SaIt Tolerance. The Arabidopsis Book (American Society of Plant Biologists, pp 1-22).
  • the voltage-dependent K + transporters can facilitate the entry of Na + ; for example, Arabidopsis AtHKTI (sodium transporter with sequence homology to the potassium transporters of the HKT family), is involved in the conduction of Na + from stems to roots.This recirculation seems to play an important role in the tolerance of plants to saline stress ⁇ Berthomieu P et al. (2003) EMBOjournal 22: 2004-2014).
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 28) The variation in the membrane potential (values ⁇ 130 mV) facilitates the entry of Na + Hyperpolation in the plasma yeast membrane is produced by the absence of the PMP3 gene ⁇ SNA1)
  • the homologs in A thaliana are RCI2A and RCI2B (BLT101 in wheat) Overexpression of RCI2A can alleviate the suppression of growth and photo-oxidative damage by reducing the entry of Na + into the roots (Mitsuya S et al (2006) Physiology Pla ⁇ tarum 12895-102)
  • the Na + is evacuated out of the cells by means of Na 4 VH + anti-carriers, located in the plasma membrane. Accordingly, the overexpression of the SOS1 gene of A thaliana, which codes for the Na + / H + anti-carrier SOS1 plasma membrane improves salinity tolerance (Shi H et al (2003) Nat biotechnol 21 81-85) In addition to the extrusion of Na + ions, one of the most important causes of salinity tolerance is compartmentalization in Ia vacuole The proton gradient that facilitates antiportation is produced by H + -ATPases and H + -piophosphatases (PPasas) vacuolar Transgenic plants that overexpress AVP1, H + -PP vacuolar, show a saline tolerance that correlates with increased content ionic within the plants ⁇ Yamaguchi Tet al (2005) Trends Plant Sci 10615-620) Likewise, plants that overexpress AtNHXI (Na + / H + vacu
  • Osmolytes also play an important role in salinity tolerance. They protect against the loss of water and changes in the structure of the plasma membrane as a result of eliminating the toxic effects of ROS ("Reactive Oxygen Species") generated by the Psalm stress Prolina , glycine, betaine, trehalose, mannitol and sorbitol, produced in a manner
  • ROS reactive Oxygen Species
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) abundant and accumulated in cells treated with salt, they represent an important component in the responses to saline stress (Sahia C. et al. (2006) Physiol Plant 127: 1-9). Overexpression of enzymes involved in the ROS detoxification route (SOD 1 CAT, GST, APX, GPX) results in an increase in tolerance to saline stress (Xiong L, Zhu JK (2002)).
  • Transgenic tobacco seeds that overexpress a cDNA encoding an enzyme with glutathione S-transferase (GST) and glutathione peroxidase (GPX) activity, grow faster than control seeds when exposed to low temperatures and saline stress (Roxas VP , Smith RK, Jr, Alien ER, Alien RD (1997) Nat biotechnol 15: 988-991).
  • GST glutathione S-transferase
  • GPX glutathione peroxidase
  • glioxalase I g'y I
  • glioxalase Il gly II
  • the enzymes glioxalase I (g'y I) and glioxalase Il (gly II) are necessary for the detoxification of methylglyoxal and confer salinity tolerance in transgenic tobacco plants (Singla-Pareek SL, Reddy MK, Sopory SK (2003) Proc Nati Acad Sci USA 100: 14672-14677).
  • the EhHOG gene which encodes a MAPK that has an essential role in the osmoregulation route of yeast and other eukaryotes, was isolated from Eurotium herbariorum from the Dead Sea.
  • MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase
  • osmoprotectants which are compatible solutes such as proline (amino acids), glycine-betaine, dehydrin and sugars (mannitol, trehalose, etc.) that function as osmolytes and protect the proline (amino acids), glycine-betaine, dehydrin and sugars (mannitol, trehalose, etc.) that function as osmolytes and protect the proline (amino acids), glycine-betaine, dehydrin and sugars (mannitol, trehalose, etc.) that function as osmolytes and protect the
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) dehydration cells, and therefore of turgor loss, improve root maintenance and shoot in response to water deficit
  • AtHKTI is a Na + transporter inside the Arabidopsis thahana root ⁇ Rus et al, Plant Physiology 1362500-2511 (2001) is made, theoretically, the overexpression of this gene in a plant would allow a greater entry of Na + by the roots of individuals modified with said gene
  • PCs phytokelatins
  • PCS phytochelatma synthase
  • the PCS gene of different species has been used to improve the tolerance and accumulation of heavy metals in various plant species as a solution to the problem of soil contamination by these pollutants, that is, the chosen plants have been given a greater capacity to tolerate and, what is more interesting, to accumulate, by phytoextraction, heavy metals Thus, the PCS seems to play an essential role in Ia
  • the present invention also provides a method for reducing or eliminating sodium from any medium (solid, liquid or gas) containing said alkali metal, which consists of using PCSs in a living organism whose ability to combat the effects of Ia salinity is limited, and subtracting it from a specific medium through its accumulation in it
  • the method object of the present invention has significant advantages over the procedures developed in the state of the art to combat salinity.
  • it is a simple and very useful application method, since it allows the direct application to the contaminated medium, What is supposed, in the case of salimzados soils, to avoid the loss of soil by superficial washing of the runoff waters of those soils that do not allow the growth of wild plants
  • FIG. 1 Comparison between NgPCSI and known PCSs.
  • Identical amino acids are in black In gray catalytic triad formed by Cys 56, Hys162 and Asp180 similar to papain (papain-like) indispensable for catalysis
  • Rootless tree built with the neighbor-jommg method (Clustal W) The bars represent the genetic distance (0 1 substitutions per site)
  • the coding sequences of PCS genes are detailed below, the species and the access number are in brackets AhPCSI ( Arabidopsis hallen, AAS45236 1), AtPCSI (Arabidopsis thaliana, AAD16046 1), AtPCS2 (Arabidopsis thaliana, AAK94671 1), AsPCS (Allium sativum, AA013809 1), AyPCS (Athy ⁇ m yokoscense, BAB64960I 1 (Brassica BAB64960I 1) ), BnPCS (Brassica napus, CAK24968 1), CdPCS ⁇ Cyonodon dactylon, AAO13810 2), CePCS (Caenorhabditis elegans, NP_4964575 3), GmhPCS (homo-phytochelatm syntha
  • Figure 2 Comparative growth in Cd 2+ and NaCI.
  • the figure shows the comparison of growth rates vector pYES2NgPCS1l empty vector pYES2 in cells without NaCI and in cells with NaCI versus incubation time (in hours)
  • the cells were grown at an OD of 1 to 600 nm, and inoculated at a concentration of 10 6 cells per me in a liquid medium without NaCI or with 0 6 M, 0 7 M, and 1 4 M C growth.
  • REPLACEMENT SHEET (Regia 28) growth differences that are not due to the types of stress specifically studied since the mere presence of the vector pYES2NgPCS1 in yeast produces differences D. Comparison of the optical density between cells without NaCI and with NaCI 1.4 M. Growth model in minimal medium represented by OD versus the time in hours measured during a period of 4 days of growth Differences in absolute value of growth are observed for the 4 times chosen E. Relative content of intracellular concentration of Na +. The comparison of the intracellular concentration of Na + in cells containing the empty pVES2 vector and cells containing pYES2INgPCS1 Yeast cells were grown at an OD of 0 6 to 600 nm. The NaCI was added to a final concentration of 1 4 M. in cells with empty pYES2 they were taken as 100%
  • FIG. 3 Expression of TaPCSI in hydroponic media and soils.
  • Figure 4 Scheme of transfer DNA (tDNA). LB left end, LR right end, P promoter, G gene of interest, T terminator, GRA antibiotic resistance gene
  • the object of the invention is the NgPCSI gene that encodes the phytokelatin synthase of Nicotiana glauca with sequence SEQ ID NO 1
  • NgPCSI gene in a method to improve salinity tolerance and sodium accumulation of any living organism is also an object of the invention.
  • Another object of the invention is the use of the NgPCSI gene in a method to recover a salted medium by modified organisms that express a phytochelatma synthase encoded by SEQ ID NO 1 or sequences that have at least 35% similarity with SEQ ID NO 1
  • phytokelatins obtained in vivo or in vitro by enzymatic reaction mediated by phytochelatma smtase encoded by SEQ ID NO 1, or sequences with at least 35% similarity, such as sodium chelants, is the object of the invention
  • the invention relates to an isolated sequence of a nucleic acid that codes for the Nicotiana glauca phytochelatma synthase (NgPCSI), characterized by SEQ ID NO 1
  • encodes refers to the inherent property of specific nucleotide sequences in a polynucleotide such as gene, cDNA or mRNA that serves as a template for the synthesis of polymers and macromolecules in biological processes or in processes carried out in vitro.
  • a vector comprising SEQ ID NO 1 is contemplated.
  • said vector is a plasmid.
  • Another main embodiment of the invention refers to a stable transgenic organism (genetically modified cell or organism) comprising the sequence SEQ ID NO 1
  • Nicotiana glauca phytochelatma synthase located in the cytoplasm, is the enzyme that mediates the production of phytokelatins (PCs), using glutathione (GSH) as a substrate
  • PCs phytokelatins
  • GSH glutathione
  • Overexpression of NgPCSI results in an increase in tolerance to Na + , in addition to the tolerance to heavy metals already observed in other PCSs
  • the mechanism by which an improvement of the tolerance is produced is the chelation, by means of the PCs, of Na + ions and the subsequent seclusion in vacuoles of the PC- complexes Na +
  • Another main aspect of the invention relates to the use of the sequence SEQ ID NO 1 to improve the tolerance to salinity and / or accumulation of sodium (Na + ) in a living organism (animal, plant or microorganism)
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) Sequences with at least 35% similarity of SEQ ID NO 1 cover those genes that have phytokelatin synthase function, that is, from euca ⁇ otas such as the Caenorhabditis elegans worm and bacteria to plants (which have a higher similarity)
  • the transformation phase is carried out by any of the methods known in the state of the art.
  • a vector comprising SEQ ID NO 1 or a sequence with the minus 35% similarity with SEQ ID NO 1 and, subsequently, said vector is introduced into the living organism
  • the term "functional" refers to the regulatory sequences having an effect on the functionality of the gene in what refers to the transcription (start and end) and translation (start and end) of the messenger RNA and others not described
  • regulatory sequences contemplated in the present invention are promoters and other less common as certain introns, the transcription term sequences and the start and end sequences for the subsequent translation of messenger RNA
  • the constitutive expression of the PCS produces an improvement in the growth of yeasts and plants so that it can be used to solve vain problems (a) the cultivation of numerous plants in salinized soils or in waters with saline contamination, which can generate two direct benefits, Ia revalonzaconstruissus of lands abandoned by the salinization thanks to the production of biomass as well as the restoration of the same to return to be cultivated and (b) the cultivation of microorganisms modified in media with saline contamination to reduce the salt content of said media
  • the living organism used in the method of the present invention is a yeast, preferably Saccharomyces cerevisiae
  • the living organism is a plant, preferably Nicotiana glauca
  • sequence SEQ ID No1 is contemplated to reduce or eliminate sodium from a liquid, solid or gaseous medium
  • This application has allowed the development of a method to reduce or eliminate Na + from a liquid, solid or gaseous medium based on the following stages
  • Ii identify the transformed organisms in i) by antibiotic selection, nor sow the sahnized medium with the organisms identified in n), iv cultivate the organisms for an adequate period of time, and v collect the organisms
  • the process of genetic transformation is carried out by electroporation.
  • these cells are also considered in the present invention as transgenic organisms although they are not directly used in the sodium binding in a salinized medium but serve as an amplifying medium in the case of E coli and as an instrument of infection in the case of A tumefaciens
  • the collection of organisms will be done by flocculation, precipitation, centrifugation or any other method that allows to separate the microorganisms that have accumulated salts from the medium
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) In the case of using plants that express the gene to eliminate salts from a salinized medium, the plant will be collected, crushed before or after being dried and the remains will be discharged to a waste dump according to the legislation
  • PCs phytokelatins
  • Example 1 The phytokelatin synthase of N. glauca is very similar to the homologue of N. tabacum
  • the new protein was compared with PCS of A thahana (accession number AAD16046 1 ), N tabacum (access number AY235426) and T aestivum (access number AAD50592 1), resulting in the following identity percentage 96% in relation to NtPCSI, 64% compared to AtPCSI and 59% with TaPCSI
  • AAD16046 1 accession number
  • AAD50592 1 accession number 96% in relation to NtPCSI
  • 64% compared to AtPCSI 64% compared to AtPCSI and 59% with TaPCSI
  • This high identity among the sequences of PCSs of plants belonging to different families, such as Brassicaceae, Poaceae and Solanaceae indicated a high conservation and, therefore, an important role of these proteins in plant rowing.
  • Example 2 Overexpression of NgPCSI in yeasts leads to a tolerance to Cd 2 * and an accumulation and tolerance to Na 4 .
  • NgPCSI can also confer tolerance to Cd 2+ This is especially evident in this work from experiments carried out at a concentration of 100 ⁇ M ( Figure 2A) This fact is completely in accordance with the previous results obtained in which the overexpression of TaPCSI in yeasts was produced under similar conditions of Cd 2+ concentration and using the same vector
  • NgPCSI conferred tolerance to Na + when it was overexpressed in yeasts at concentrations of NaCl ranging from 0.6 to 1 M ( Figure 2A), which indicated a relevant function for this type of enzyme in the tolerance to psalm stress beyond paper.
  • Figure 2A The growth mediated by NgPCSI with saline stress treatment was also investigated by analyzing the kinetics of the growth rates at NaCI concentrations of 0.6 and 0.7 M ( Figure 2B)
  • Figure 2B At both concentrations , cells containing pYES2NgPCS1 showed a clear initial growth disadvantage compared to the empty vector pYES2
  • the concentration 0.7 IvI produced a greater growth difference than 0.6 M 1 and therefore higher concentrations Vadas of NaCI produced a superior improvement of growth mediated by NgPCSI Consequently, with 1.4M NaCI, the growth of yeast cells was improved by the presence of Ng
  • NgPCS1 improve the tolerance to NaCI, for example, by increasing only water retention, but not the accumulation of NaCP, or does it improve tolerance and accumulation?
  • the toxicity of NaCI can be divided into two components of water stress and Na + damage. Therefore, it arose
  • NgPCS1 improve the tolerance to NaCI, for example, by increasing only water retention, but not the accumulation of NaCP, or does it improve tolerance and accumulation?
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) accumulation of Na + in the cytoplasm of yeast cells with or without NgPCSI, showing that NgPCSI leads to a greater accumulation of Na + within yeast cells that contain the vector pYES2NgPCS1 ( Figure 2E)
  • the binary vector pBI121 (Clontech) was used for the transformation.
  • the GUS gene of the binary vector was replaced by the DNA coding for the TaPCSI wheat phytokelatin synthase by means of the SamHI and ECL136II restriction sites.
  • the introduction of the plasmid was carried out. obtained, containing the TaPCSI cDNA, in Agrobacterium tumefa ⁇ e ⁇ s C58C1R ⁇ fR and later the transfer was made by infection to N glauca plants.
  • the new construction was electroporated in Agrobacterium tumefaciens cells.
  • the transformants were selected in LB plates with kanamycin and contacted with discs of 1 cm in diameter for 10 minutes with a suspension of A tumefaciens containing the desired construction
  • the seeds of the different transgenic lines obtained were collected and that one was selected those that contained one or several integrations in the genome of the plant, recovering those that were able to grow in the presence of the antibiotic kanamycin
  • the last step consisted of checking if the integration of the TaPCSI cDNA to the genome of Nicotiana glauca significantly improved the tolerance to Na + of the plant
  • the study of the tolerance to Na + was carried out by germinating the transgenic seeds in a substrate with vermiculite and dolomite as well as in hydroponic conditions, applying NaCI at 7 and 2 weeks respectively, up to a final concentration of 200, 300 and 500 mM
  • the submerged seeds were placed in Pet ⁇ plates with a medium prepared with 6 g / liter agar, salts of MS ⁇ Murashige T, Skoog F (1962) Physiol Pla ⁇ t 15473-497), and sucrose 10 g / liter at pH 5.7 buffered with MES (2- [N-morpholyn] ethanesulfonic acid) 0.25 g / liter
  • MES - [N-morpholyn] ethanesulfonic acid
  • the coding DNA was synthesized from 2 ⁇ g of the total RNA isolated from N glauca leaves by means of the reverse transcnptase of M-MuLV (Moloney mu ⁇ na leukemia virus) with oligo primer (dT) 18 (Fermentation kit of synthesis of the First strand coding DNA) according to the procedures recommended in the kit
  • M-MuLV Moloney mu ⁇ na leukemia virus
  • oligo primer (dT) 18 Fermentation kit of synthesis of the First strand coding DNA
  • a microliter of the coding DNA produced was used as a template in a conventional 50 ⁇ L PCR reaction. Design of the primers for the polymerase chain reaction (PCR) was observed.
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) After carrying out the PCR experiments using different combinations, only two bands with the expected size of 1.5 Kb were obtained, corresponding in both cases to the primers FW1 / RV1 and FW2 / RV2 using an agarose gel with TAE buffer at 1%, the PCR reactions were carried out and extracted by freezing-pressure of the cut band and precipitation of the DNA by 1/50 volumes of 5M NaCl and 2 volumes of absolute EtOH After measuring the concentration of DNA in a spectrophotometer NanoDrop ND-1000, the amplified fragments were cloned into the pGEM-T Easy vector (Promega, Southampton, RU)
  • E coh DH5 ⁇ was used as a host After selecting the correct transformants and isolating the plasmid DNA (Marligen bioscience, rapid plasmid isolation system), the cloned fragments were sequenced on an ABI Pnsm DNA sequencer (Perkin-Elmer) using the T7 sites and SP6 located in the vector Both complete sequences of the 1.5 Kb fragments were aligned with NtPCSI using William Pearson's LALIGN program and a 93% identity was observed in the sequence of the FW1 / RV1 fragment.
  • the sequence of the second fragment, FW2 / RV2 revealed an identity of 91% between nucleotides 592 and 1501 of the sequence coding for NtPCSI
  • the alignment of both sequence fragments resulted in the same nucleotide composition between position 592 and the termination codon Sequence C- Correct terminal corresponding to the RV1 primer was tested using the second NgPCSI sequenced fragment directionally subcloned into the Kpn ⁇ / S sites amHI of the expression vector pYES2 by a new PCR amplification with primers FW2 and RV2 and with the additional sequences Kpn ⁇ and ⁇ amHI, respectively
  • pYES2 includes the E ri Amp r gene, the selectable yeast marker URA3 and the inducible GAL1 promoter for the expression in yeast cells E co /; it was transformed by electroporation and the transformants were selected for Amp r
  • Yeast cells were grown in 20 ml of SD with appropriate to an absorbance at 600 nm of 0.6 , then amino acids, NaCI was added to a final concentration of 1.4 M NaCI and incubated at 28 0 C with shaking (150 rpm) for 3 hours, centrifuged for 5
  • REPLACEMENT SHEET (Rule 26) minutes at 7,000 rpm (Beckman JA-20 rotor, 4 0 C), and washed four times with 10 ml of a solution containing 20 mM MgCl 2 and 1.5 M sorbitol Finally, the intracellular content was extracted by incubation with 0.5 ml of 20 mM MgCl 2 for 12 minutes at 95 0 C After centrifugation for 2 minutes at maximum speed, aliquots of the supernatant were analyzed with an atomic absorption spectrometer (Vanan) in the flame emission mode
  • the superoxide anion O 2 " was detected, as described by Yamamoto Y ⁇ t al (2002) Plant Physiol 12863-72, using dihydroetidium (DHE), a reduced form of ethidium bromide, which is not fluorescent and can passively pass through the membrane of live cells Once in the cell, it is oxidized to give a fluorescent dye that binds to nearby DNA.
  • DHE dihydroetidium

Abstract

La presente invención se refiere a un método específico para mejorar la tolerancia a la salinidad de organismos vivos y eliminar el sodio (Na+) de aguas, suelos, lodos y cualquier otro medio que contenga este elemento, basado en el empleo de la secuencia aislada de un ácido nucléico que codifica para la fitoquelatina sintase de Nicotiana glauca.

Description

MÉTODO PARA MEJORAR LA TOLERANCIA A LA SALINIDAD
CAMPO DE LA INVENCIÓN
El campo de Ia presente invención se encuentra dentro del área de Ia biología molecular, y en particular en Ia implicación de genes de plantas en los procesos de detoxificación de sodio, el uso de organismos transformados expresando de forma constitutiva o inducida estos genes, y métodos de biorremediación para Ia recuperación de medios. Así, Ia presente invención se refiere a Ia puesta a punto de una herramienta y un método específico para mejorar Ia tolerancia a Ia salinidad de organismos vivos y eliminar el sodio (Na+) de aguas, suelos, lodos y cualquier otro medio que contenga este elemento, basado en el empleo del gen de Ia fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La salinización del suelo es uno de los problemas más importantes que tiene Ia agricultura para su desarrollo. El cambio climático global produce un incremento en el estrés hídrico, factor cosustancial del estrés salino, ya que el déficit hídrico es también Ia causa del incremento de las concentraciones de sal en los suelos.
Es sabido que Ia concentración de sal en el interior de Ia célula de muchos organismos se mantiene alrededor de 50-150 mM, Io que beneficia a Ia estructura proteica, por ejemplo, debido a las fuerzas electrostáticas. Sin embargo, una concentración de 300-500 mM inhibe las reacciones metabólicas alterando el balance entre las fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas (Serrano R (1996) Int Rev of Cyt 165:1-52.).
La respuesta de las células al cloruro sódico (NaCI) se articula por un grupo de diversos mecanismos:
El Na+ puede entrar en Ia célula a través de varios tipos de canales, "voltage-dependent catión channels" y "voltage-independent catión channels" (VIC). Los VIC son Ia principal ruta de entrada de Na+ a las células de las plantas (Xiong L et al. (2002) in SaIt Tolerance. The Arabidopsis Book (American Society of Plant Biologists, pp 1-22). Debido a Ia similitud entre Na+ y K+, los transportadores de K+ dependientes de voltaje pueden facilitar Ia entrada de Na+; Por ejemplo, AtHKTI de Arabidopsis (transportador de sodio con homología de secuencia a los transportadores de potasio de Ia familia HKT), está implicado en Ia conducción de Na+ de tallos a raíces. Esta recirculación parece jugar un importante papel en Ia tolerancia de las plantas al estrés salino {Berthomieu P et al. (2003) EMBOjournal 22:2004-2014).
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 28) La variación en el potencial de membrana (valores < 130 mV) facilita Ia entrada de Na+ La hiperpolaπzación en Ia membrana plasmática de levadura es producida por Ia ausencia del gen PMP3 {SNA1) Los homólogos en A thaliana son RCI2A y RCI2B (BLT101 en trigo) La sobreexpresión de RCI2A puede aliviar Ia supresión del crecimiento y los daños foto-oxidativos reduciendo Ia entrada de Na+ en las raices (Mitsuya S et al (2006) Physiologia Plaπtarum 12895-102)
El papel que el Ca2+ juega en el intrincado grupo de respuestas a NaCI ha sido clarificado recientemente en vanos aspectos La sobre-expresión de ACA4 (Ca2+ ATPasa vacuolar de Arabidopsis thaliana) en levadura aumenta Ia tolerancia a sal {Geisler M et al (2000) Plant Physiol 124 1814-1827)
El Na+ es evacuado fuera de Ia células por medio de antiportadores Na4VH+, localizados en Ia membrana plasmática De acuerdo con esto, Ia sobre-expresión del gen SOS1 de A thaliana, que codifica para el antiportador de Na+/H+ de membrana plasmática SOS1, mejora Ia tolerancia a salinidad (Shi H et al (2003) Nat biotechnol 21 81-85) Además de Ia extrusión de iones Na+, una de las causas más importantes de Ia tolerancia a salinidad es su compartimentalización en Ia vacuola El gradiente de protones que facilita el antiporte se produce por H+-ATPasas y H+-pιrofosfatasas (PPasas) vacuolares Las plantas transgénicas que sobreexpresan AVP1, H+-PPasa vacuolar, muestran una tolerancia salina que está correlacionada con el aumento del contenido iónico dentro de las plantas {Yamaguchi Tet al (2005) Trends Plant Sci 10615-620) Asimismo, plantas que sobreexpresan AtNHXI (antiportador vacuolar Na+/H+ de Arabidopsis thaliana) fueron capaces de crecer, florecer y producir semillas en presencia de 20OmM NaCI en plantas transgénicas de Brassica napus {Zhang H-X Et al (2001) Proc Nati Acad Sa USA 98 12832-12836) y tomate transgénico (Zhang H-X et al (2001) Nat biotechnol 19 765-768) La sobreexpresión de AgNHXI (procedente de Ia planta halófita Atrφlex gmelmi), BnNHXI (Brassica napus), HbNHXI {Hordeum brevisubculatum) y GhNHXI (Gossipyum hirsutum) también juegan el mismo papel (Yamaguchi T et al (2005) Trends Plant Sc/ 10 615-620) La expresión heteróloga de TsVP (H+-PPasa clonada de Thellungiella halophila) en Ia levadura mutante enal (bomba que elimina Na+ fuera de Ia célula) suprime Ia hipersensibilidad a Na+ La planta de Tabaco transgénica que sobre-expresa TsVP consigue un 60% más de peso seco que el tipo salvaje cuando se expone a 300 mM NaCI (Gao F et al (2006) J Exp Bot 573259-3270)
Los osmolitos también juegan un papel relevante en Ia tolerancia a salinidad Protegen contra Ia pérdida de agua y cambios en Ia estructura de Ia membrana plasmática como consecuencia de eliminar los efectos tóxicos de los ROS ("Reactive Oxygen Species") generados por el estrés salmo Prolina, glicina, betaina, trehalosa, manitol y sorbitol, producidos de manera
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) abundante y acumulados en células tratadas con sal, representan un componente importante en las respuestas a estrés salino (Sahia C. et al. (2006) Physiol Plant 127:1-9). La sobreexpresión de enzimas implicadas en Ia ruta de detoxificaciόn de ROS (SOD1 CAT, GST, APX, GPX) resulta en un incremento de Ia tolerancia a estrés salino (Xiong L, Zhu J-K (2002)). Semillas de tabaco transgénico que sobre-expresan un cDNA que codifica para un enzima con actividad glutatión S-transferasa (GST) y glutatión peroxidasa (GPX), crecen más rápido que las semillas control cuando son expuestas a bajas temperaturas y estrés salino (Roxas V-P, Smith R-K, Jr, Alien E-R, Alien R-D (1997) Nat biotechnol 15:988-991). Las enzimas glioxalasa I (g'y I) y glioxalasa Il (gly II) son necesarias para Ia detoxificación de metilglioxal y confieren tolerancia a salinidad en plantas transgénicas de tabaco (Singla-Pareek S-L, Reddy M-K, Sopory S-K (2003) Proc Nati Acad Sci USA 100:14672-14677).
Hay una clara conexión entre el estrés oxidativo y el osmótico a través de las llamadas " Mitogen-Activated Protein Kinase" (MAPK). El gen EhHOG, que codifica una MAPK que tiene un papel esencial en Ia ruta de osmoregulación de levadura y otros eucariotas, fue aislado de Eurotium herbariorum del mar muerto. Cuando EhHOG fue sobreexpresado en el mutante hog1 de S. cerevisiae, el crecimiento y Ia morfología aberrante de hog1 fueron restaurados en condiciones de alto estrés osmótico (Jin Y, Weining S, Nevo E (2005) Proc Nati Acad Sci USA 102:18992-18997).
Varios genes inducidos por estrés salino pertenecen a Ia familia LEA. Son conocidos diversos tipos de LEA de Arabidopsis; RD {"Responsive to Dehydration"), COR ("COId-Regu/afecí"), LTI ("Low Temperature-lnduced"), KIN {"cold indυced'). Todos estos tipos son inducidos por estrés salino, hídrico, bajas temperaturas y ABA. El arroz transgénico que sobre-expresa SNAC1 (" STRESS-RESPONSIVE NAC 1") es más sensible a ABA y pierde agua más lentamente por el cierre de los estomas, SNAC 1 puede mejorar Ia tolerancia a Ia sequía y a Ia salinidad en arroz. (Hu H. et al. (2006) Proc Nati Acad Sci USA 103:12987-12992).
La sensibilidad de las plantas a Ia presencia de sodio no es, por tanto, una característica inherente a las mismas, ya que se conocen diversas adaptaciones, tanto en tierra como en mar, a altas concentraciones salinas, como es el caso de las plantas halófitas. Esto indica que Ia tolerancia puede ser resuelta por transferencia génica. Hasta Ia fecha, los genes descritos en Ia defensa contra el estrés salino estaban implicados en transporte, extrusión, osmoprotección, antiportadores vacuolares, factores de transcripción, etc.
En las últimas décadas se han desarrollado plantas que contienen diversos grupos de moléculas que sirven para aliviar los efectos de Ia salinidad. Por ejemplo, los osmoprotectantes, que son solutos compatibles como prolina (aminoácidos), glicina-betaina, dehidrina y azúcares (manitol, trehalosa, etc) que funcionan como osmolitos y protegen las
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) células de Ia deshidrataαón, y por tanto de Ia pérdida de turgor, mejoran el mantenimiento de las raíces y se disparan en respuesta al déficit de agua
En Agosto de 1999 Eduardo Blumwald, científico argentino que trabajaba en Toronto, publica Ia utilización de un antiportador vacuolar de Arabidopsis thahana que expulsa H+ al citoplasma mientras acepta iones Na+ (patente n° CA2323756 y posteriormente patente US6936750) Esto permite que las plantas que Io sobreexpresan puedan vivir en ambientes salinos altos
En Agosto de 2001 el mismo investigador, ahora en Davis, Universidad de California, hace publica Ia obtención de una planta de tomate genéticamente modificada que crece y se desarrolla en agua de irrigación salada Es importante subrayar que aunque a Io largo del siglo pasado un buen número de investigadores ha estado tratando de desarrollar variedades de cosecha tolerantes a sal usando técnicas de mejora clásica, ninguno de los esfuerzos dio los resultados esperados
En 2001 se hace pública Ia demostración de que AtHKTI es un transportador de Na+ al interior de Ia raíz de Arabidopsis thahana {Rus et al, Plant Physiology 1362500-2511 (2001) Por tanto, teóricamente, Ia sobre-expresión de este gen en una planta permitiría una mayor entrada de Na+ por las raíces de los individuos modificados con dicho gen
En Ia solicitud de patente española n° 2173019, publicada en 2002, se define el empleo del gen de Ia ATPasa de sodio de Neurospora crassa en Ia mejora de Ia tolerancia a Ia salinidad
Ahora, los autores de Ia presente invención han desarrollado un método para mejorar Ia tolerancia a Ia salinidad basado, por primera vez, en el empleo de moléculas capaces de unirse directamente al sodio para bloquear su acción tóxica dentro de Ia célula
Estas moléculas son las fitoquelatinas (PCs) Las PCs son péptidos ricos en cistelna que no están codificados genéticamente Su síntesis se inicia o induce por Ia presencia de metales pesados, como el cadmio, con el concurso de Ia enzima fitoquelatma sintasa (PCS) que utiliza GSH como sustrato para formar el péptido [γ-Glu-Cys]n=2-11-Gly (PCs) (Steffens, J C (1990) The heavy metal-binding pβptides of plants Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 41,533- 575)
El gen de Ia PCS de diferentes especies ha sido utilizado para mejorar Ia tolerancia y acumulación de metales pesados en diversas especies vegetales como solución al problema de contaminación de suelos por estos contaminantes, es decir, se ha dotado a las plantas elegidas de una mayor capacidad de tolerar y, Io que es más interesante, acumular, mediante fitoextracción, metales pesados Así, Ia PCS parece desempeñar un papel esencial en Ia
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 28) regulación del equilibrio celular de iones de metales pesados ' libres" y complejados mediante un mecanismo sencillo y eficaz (Erwm G et al (1989) Proc Nati Acad Sa USA 86 6838-6842) Además, muchos autores sugirieron anteriormente que las PC pueden desempeñar un papel en Ia detoxificación de metales pesados (Cobbett C (2002) Annu Rev Plant Biol 53 159-182) Esto ha dado como resultado patentes de genes que codifican para fitoquelatinas sintasas (US6489537 y US 6844485), pero, en ningún caso se han empleado para combatir Ia salinidad, de modo que Ia propuesta que aquí se plantea genera un nuevo método para afrontar Ia contaminación por sales o salinización
Por otro lado, existen en el estado de Ia técnica métodos no biológicos empleados para Ia restauración de suelos salmo-sódicos que suelen consistir en Ia adición de sulfato de calcio (yeso) para facilitar el intercambio catiónico y esperar diversos lavados por Ia lluvia de los cationes sustituidos Sm embargo, Ia migración a horizontes más profundos de las sales no es Ia solución al problema puesto que podría ascender de nuevo por capilandad o contaminar acuiferos
A este respecto, Ia presente invención también proporciona un procedimiento para reducir o eliminar sodio de un medio cualquiera (sólido, liquido o gaseoso) que contiene dicho metal alcalino, que consiste en utilizar PCSs en un organismo vivo cuya capacidad de combatir los efectos de Ia salinidad es limitada, y sustraerlo de un medio concreto por medio de su acumulación en éste
Además de emplear en este método secuencias ya conocidas que codifican para PCSs de diferentes especies, los autores de Ia presente invención han secuenciado por primera vez el gen de Ia PCS de Nicotiana glauca, el cual puede expresarse de forma constitutiva o inducida en N glauca o en cualquier otro organismo vivo con tolerancia a Ia salinidad limitada
El método objeto de Ia presente invención presenta ventajas significativas respecto a los procedimientos desarrollados en el estado de Ia técnica para combatir Ia salinidad Por una parte, es un método de aplicación sencilla y de gran utilidad, ya que permite Ia aplicación directa al medio contaminado, Io que supone, en el caso de suelos salimzados, evitar Ia pérdida de suelo por lavado superficial de las aguas de escorrentía de aquellos suelos que no permiten el crecimiento de plantas silvestres Además, presenta ventajas de tipo económico ya que aprovecha Ia capacidad de los organismos vivos para disminuir Ia erosión y/o acumular las sales
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Comparación entre NgPCSI y PCSs conocidas. A. Alineamientos CLUSTAL W de Ia secuencia de aminoácidos de PCS1 de Nicotiana glauca (NgPCSI), N. Tabacum (NtPCSI), A. thaliana (AtPCSI) y T. aestivum (TaPCSI). Los aminoácidos idénticos están en negro En gris tríada catalítica formada por Cys 56, Hys162 y Asp180 similar a papaína (papain-like) indispensable para Ia catálisis B. Perfil de hidropatía de Kyte-doolittle de NgPCSL Los valores próximos a 2 indican aquellas zonas de Ia enzima que están probablemente insertas en Ia membrana C. Análisis filogenético de PCSs de diferentes especies. Árbol sin raíz construido con el método neighbour-jommg (Clustal W) Las barras representan Ia distancia genética (0 1 sustituciones por sitio) A continuación se detallan las secuencias codificantes de genes PCS, las especies y el numero de acceso están entre paréntesis AhPCSI (Arabidopsis hallen, AAS45236 1), AtPCSI (Arabidopsis thaliana, AAD16046 1), AtPCS2 (Arabidopsis thaliana, AAK94671 1), AsPCS (Allium sativum, AA013809 1), AyPCS (Athyπυm yokoscense, BAB64932 1), BjPCSI (Brassica júncea, BAB85602 1), BnPCS (Brassica napus, CAK24968 1), CdPCS {Cyonodon dactylon, AAO13810 2), CePCS (Caenorhabditis elegans, NP_4964575 3), GmhPCS (homo- phytochelatm synthase, Glycm max, AAL78384 1), NgPCSI (Nicotiana glauca), NtPCSI (Nicotiana tabacum, AAO74500 1), LsPCSI (Lactuca sativa, AAU93349 1), QPCS1 (Lotus japomcus, AAQ01752 1), LjPCS2 (Lotus japomcus AAT80341 1), LjPCS3 (Lotus japomcus, AAY81940), OsPCS (Onza sativa, AAO13349 2), PvPCS (Ptens vittata, AAT11885 1), SpPCS (Schizosaccharomyces pombe, Q10075), SrPCS (Sesbama rostrata, AAY83876 1), StPCS (Solanum tuberosum, CAD68109 1), TcPCSI (Thlaspi caerulescens, AAT07467 1), TjPCS (Thlaspi japomcum, BAB93119 1), TaPCS (Tnticum aestivum, AAD50592 1) and TIPCS (Thypha latifolia, AAG22095 3)
Figura 2. Crecimiento comparativo en Cd2+ y NaCI. A. Expresión de NgPCSI en levadura en un medio que contiene Cd2+ y Na+. Test de goteo Células (DO a 600 nm de aproximadamente 1 4) en fase de crecimiento estacionaria se depositaran en diluciones senadas en un medio mínimo SD (1% de sacarosa/1% de galactosa) suplementado con los aminoácidos apropiados y NaCI 0, 06, 0 7, 1 M y CdCI2 100μM, respectivamente Las figuras muestran el crecimiento de diluciones 1 20 tras 3 días (4 días para Ia concentración 1 M) B. Crecimiento de células de levadura expresando NgPCSI en un medio con NaCI 0.6 y 0.7 M. La figura muestra Ia comparación de ratios de crecimiento vector pYES2NgPCS1l vector pYES2 vacío en células sin NaCI y en células con NaCI frente a tiempo de incubación (en horas) Las células fueron crecidas a una DO de 1 a 600 nm, e inoculadas a una concentración de 106 células por mi en un medio líquido sin NaCI o con NaCI 0 6 M, 0 7 M, y 1 4 M C. Comparación de ratios de crecimiento vector pYES2NgPCS1 ¡vector pYES2 vacío en células sin NaCI y con NaCI 1.4 M. Los ratios han sido empleados para minimizar aquellas
HOJA DE REEMPLAZO (Regia 28) diferencias de crecimiento que no son debidas a los tipos de estrés específicamente estudiados ya que Ia sola presencia del vector pYES2NgPCS1 en levaduras produce diferencias D. Comparación de Ia densidad óptica entre células sin NaCI y con NaCI 1.4 M. Modelo de crecimiento en medio mínimo representado por DO frente al tiempo en horas medido durante un periodo de 4 días de crecimiento Las diferencias en valor absoluto de crecimiento se observan para los 4 tiempos elegidos E. Contenido relativo de concentración intracelular de Na+. La comparación de Ia concentración intracelular de Na+ en células que contienen el vector pVES2 vacío y células que contienen pYES2INgPCS1 Las células de levadura fueron crecidas a una DO de 0 6 a 600 nm El NaCI fue añadido a una concentración final de 1 4 M Los valores en células con pYES2 vacío fueron tomados como el 100%
Figura 3. Expresión de TaPCSI en medios hidropónicos y suelos. A. Crecimiento de Ia planta en condiciones hidropónicas. WT fenotipo salvaje (wild type), TaPCSI plantas que sobreexpresan TaPCSI B. crecimiento en macetas L1, L2, y L3 son tres líneas diferentes que contienen TaPCSI sobreexpresado C. Microscopía confocal de tejidos radiculares. Se empleo DHE como informador de estrés oxidativo Control sin NaCl Las líneas modificadas L1 y L3 fueron elegidas como representantes de 4 repeticiones
Figura 4: Esquema del ADN de transferencia (tDNA). LB extremo izquierdo, LR extremo derecho, P promotor, G gen de interés, T terminador, GRA gen de resistencia a antibiótico
OBJETO DE LA INVENCIÓN
En primer lugar, es objeto de Ia invención el gen NgPCSI que codifica Ia fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca con secuencia SEQ ID NO 1
Es también objeto de Ia invención el empleo del gen NgPCSI en un método para mejorar Ia tolerancia a salinidad y acumulación de sodio de cualquier organismo vivo
Otro objeto de Ia invención es el empleo del gen NgPCSI en un método para recuperar un medio salmeado mediante organismos modificados que expresen una fitoquelatma sintasa codificada por SEQ ID NO 1 o secuencias que tengan al menos un 35% de similaπdad con SEQ ID NO 1
Finalmente, es objeto de Ia invención el empleo de las fitoquelatinas obtenidas m vivo o m vitro por reacción enzimática mediada por Ia fitoquelatma smtasa codificada por Ia SEQ ID NO 1 , o secuencias con al menos un 35% de similaπdad, como quelantes de sodio
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un aspecto principal, Ia invención se refiere a una secuencia aislada de un ácido nucleico que codifica para Ia fitoquelatma sintasa de Nicotiana glauca (NgPCSI), caracterizada por Ia SEQ ID NO 1
El término "codifica' se refiere a Ia propiedad inherente de secuencias especificas de nucleótidos en un polinucleótido tal como gen, cDNA o mRNA que sirve como molde para Ia síntesis de polímeros y macromoléculas en procesos biológicos o en procesos llevados a cabo m vitro
En otra realización principal de Ia invención se contempla un vector que comprende Ia SEQ ID NO 1 De forma preferida, dicho vector es un plásmido
Otra realización principal de Ia invención, se refiere a un organismo transgenico estable (célula u organismo modificado genéticamente) que comprende Ia secuencia SEQ ID NO 1
La fitoquelatma sintasa de Nicotiana glauca (NgPCSI), localizada en el citoplasma, es el enzima que media Ia producción de fitoquelatinas (PCs), utilizando glutatión (GSH) como sustrato La sobreexpresión de NgPCSI tiene como resultado un aumento de Ia tolerancia a Na+, además de Ia tolerancia a metales pesados ya observada en otras PCSs El mecanismo por el cual se produce una mejora de Ia tolerancia es Ia quelación, por medio de las PCs, de iones Na+ y Ia posterior reclusión en vacuolas de los complejos PC-Na+
Asi pues, otro aspecto principal de Ia invención se refiere al empleo de Ia secuencia SEQ ID NO 1 para mejorar Ia tolerancia a salinidad y/o acumulación de sodio (Na+) en un organismo vivo (animal, vegetal o microorganismo)
Esto ha permitido a los autores de Ia presente invención el desarrollo de un método para mejorar Ia tolerancia a Ia salinidad y/o acumulación de Na+ en un organismo vivo que comprende las siguientes etapas
transformación del organismo vivo con Ia SEQ ID NO 1, o una secuencia con al menos un 35% de similandad con Ia SEQ ID NO 1, y - expresión de Ia secuencia (SEQ ID NO 1 , o Ia secuencia con al menos un 35% de similandad con Ia SEQ ID NO 1), controlada por secuencias regulatonas funcionales en el organismo vivo
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Las secuencias con al menos un 35% de similandad de Ia SEQ ID NO 1 abarcan aquellos genes que tengan función fitoquelatina sintasa, es decir, desde eucaπotas como el gusano Caenorhabditis elegans y bacterias hasta plantas (que tienen una similaπdad más alta)
La fase de transformación se lleva a cabo por cualquiera de los métodos conocidos en el estado de Ia técnica En una realización particular, en una primera etapa se lleva a cabo Ia construcción de un vector que comprenda Ia SEQ ID NO 1 o una secuencia con al menos un 35% de similaπdad con Ia SEQ ID NO 1 y, posteriormente, se introduce dicho vector en el organismo vivo
Para mejorar Ia tolerancia a sodio en un organismo vivo es necesario que éste exprese el gen de Ia secuencia introducida bajo el control transcπpcional de una secuencia regulatona que puede ser constitutiva (siempre facilitando Ia expresión) o inducida (facilitando Ia expresión sólo si hay sodio)
En Ia presente invención, el término "funcionales" hace referencia a que las secuencias regulatoπas tengan efecto sobre Ia funcionalidad del gen en Io que se refiere a Ia transcripción (comienzo y terminación) y traducción (inicio y terminación) del RNA mensajero y otras no descritas
Entre las secuencias regulatoπas contempladas en Ia presente invención están los promotores y otras menos comunes como determinados intrones, las secuencias de término de Ia transcripción y las secuencias de inicio y término para Ia traducción posterior del RNA mensajero
La fitoquelatina sintasa de Ia especie Nicotiana glauca puede expresarse por tanto de forma constitutiva o inducida en N glauca o en cualquier otro organismo vivo cuya capacidad de combatir los efectos de Ia salinidad es limitada
La expresión constitutiva de Ia PCS produce una mejora en el crecimiento de levaduras y plantas de modo que puede utilizarse para resolver vanos problemas (a) el cultivo de numerosas plantas en suelos salinizados o en aguas con contaminación salina, que puede generar dos beneficios directos, Ia revalonzación de tierras abandonadas por Ia salinización gracias a Ia producción de biomasa así como Ia restauración de las mismas para volver a ser cultivadas y (b) el cultivo de microorganismos modificados en medios con contaminación salina para reducir el contenido en sales de dichos medios
En una realización particular, el organismo vivo empleado en el método de Ia presente invención es una levadura, de forma preferida Saccharomyces cerevisiae
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) En otra realización particular, el organismo vivo es una planta, preferiblemente Nicotiana glauca
En otro aspecto principal de Ia invención, se contempla el empleo de Ia secuencia SEQ ID No1 para reducir o eliminar sodio de un medio liquido, sólido o gaseoso
Esta aplicación ha permitido el desarrollo de un método para reducir o eliminar Na+ de un medio liquido, sólido o gaseoso basado en las siguientes etapas
i transformar organismos vivos con Ia SEQ ID NO 1 o una secuencia con al menos un 35% de similaπdad con Ia SEQ ID NO 1,
Ii identificar los organismos transformados en i) mediante selección con antibiótico, ni sembrar el medio sahnizado con los organismos identificados en n), iv cultivar los organismos durante un periodo de tiempo adecuado, y v recolectar los organismos
De forma preferida, el proceso de transformación genética se lleva a cabo por electroporación Con ello se consiguen células huésped de Eschenchia coli o Agrobacteπum tumefaαens que portan un vector con el inserto deseado (después de ser seleccionadas con el antibiótico correspondiente) Como se ha aclarado anteriormente, estas células también se consideran en Ia presente invención como organismos transgénicos aunque no se empleen directamente en Ia unión de sodio en un medio salinizado sino que sirven como medio amplificador en el caso de E coli y como instrumento de infección en el caso de A tumefaciens
Para llevar a cabo el proceso de eliminación de sodio es necesario tener Ia segundad de que los organismos empleados contienen el transgén insertado en su genoma o bien Io expresen por mediación de vectores Asi, para conseguir organismos que expresen Ia secuencia SEQ ID NO 1, o una secuencia similar en al menos un 35%, es necesario llevar a cabo una fase de selección La selección se lleva a cabo con antibióticos, ya que el organismo transgénico incorpora a través del vector un gen de resistencia a antibióticos (GRA) Éste se encuentra localizado junto al gen de SEQ ID NO 1 , entre los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) que definen las regiones flanqueantes del ADN de transferencia (tDNA) (figura 4)
En el caso de emplear microorganismos que expresen el gen para eliminar las sales de un medio salimzado, Ia recolección de los organismos se hará por floculación, precipitación, centrifugación o cualquier otro método que permita separar los microorganismos que han acumulado las sales del medio
HQJA DE REEMPLAZO (Regla 26) En el caso de emplear plantas que expresen el gen para eliminar las sales de un medio salinizado, se recolectará Ia planta, se triturará antes o después de ser secada y los restos serán vertidos a un vertedero de residuos conforme a Ia legislación
Finalmente, en otra realización principal de Ia invención, se contempla el uso de fitoquelatinas (PCs), obtenidas m vivo o m vitro por reacción enzimática mediada por Ia fitoquelatina sintasa codificada por Ia SEQ ID NO 1, o secuencias con al menos un 35% de similandad, como quelantes de sodio
Ejemplos
Ejemplo 1. La fitoquelatina sintasa de N. glauca es muy similar al homólogo de N. tabacum
El diseño de cebadores en zonas conservadas de Ia región codificante del gen de PCS de N tabacum condujo a Ia amplificación de un fragmento de PCR de un tamaño esperado (1 ,5 Kb) El marco de lectura abierto codificó una proteína (NgPCSI) con una masa molecular de 55,14 kD, 501 residuos de aminoácidos y un pl de 6,32 El perfil de hidropatía se correlacionó con una proteína citoplasmática (figura 1B) La nueva proteina se comparó con Ia PCS de A thahana (número de acceso AAD16046 1), N tabacum (número de acceso AY235426) y T aestivum (número de acceso AAD50592 1), dando como resultado el siguiente porcentaje de identidad el 96% en relación con NtPCSI, el 64% en comparación con AtPCSI y el 59% con TaPCSI Esta alta identidad entre las secuencias de PCSs de plantas que pertenecen a diferentes familias, tales como Brassicaceae, Poaceae y Solanaceae, indicó una elevada conservación y, por tanto, un importante papel de estas proteínas en el remo vegetal El porcentaje de identidad entre las secuencias de proteínas de Ia PCS más investigada de T aestivum (TaPCSI) y Ia PCS de A thaliana (AtPCSI) fue de un 58%, similar al porcentaje encontrado para Ia nueva PCS notificada de N glauca y Ia PCS de T aestivum (59%) De manera coherente, Cys56, Hys162 y Asp180 descritas como una tríada catalítica similar a papaína (papain-like) indispensable para Ia catálisis (Rea P-A (2006) Proc Nati Acad Sci USA 103507- 508), también estaban conservadas en NgPCSI (figura 1A) Se obtuvo un árbol sin raíz con 24 secuencias de PCSs relacionadas con Ia estructura primaria prevista de NgPCSI (Blastp de Ia base de datos NCBI, figura 1C) Se identificaron las siguientes entre las agrupaciones ("clusters") separadas Ia familia de Ia agrupación de Brassicaceae formada por los géneros Arabidopsis, Brassica y Thlaspi, y los géneros Nicotiana y Solanum que pertenecen a Ia familia de la agrupación de Solanaceae
Ejemplo 2. La sobreexpresión de NgPCSI en levaduras conduce a una tolerancia al Cd2* y a una acumulación y tolerancia al Na4.
HOJA DE REEMPLAZO (Regia 26) La clonación e investigación de diferentes PCSs condujo a Ia conclusión de que estos genes pueden conferir acumulación y tolerancia al Cd2+ {Clemens S ef al (1999) EMBO J 18 3325-
3333 27) Tal como se esperaba, NgPCSI también puede conferir tolerancia al Cd2+ Esto es especialmente evidente en este trabajo a partir de los experimentos llevados a cabo a una concentración de 100 μM (figura 2A) Este hecho está completamente de acuerdo con los resultados anteriores obtenidos en los que se producía Ia sobreexpresión de TaPCSI en levaduras en condiciones similares de concentración de Cd2+ y usando el mismo vector
(Clemens S ef al (1999)), Io que establece una función homologa de ambos genes TaPCSI y NgPCSI junto con una similitud estructural
NgPCSI confirió tolerancia al Na+ cuando se sobreexpresó en levaduras a concentraciones de NaCI que oscilaban desde 0,6 hasta 1 M (figura 2A), Io que indicó una función relevante para este tipo de enzima en Ia tolerancia al estrés salmo más allá del papel bien conocido desempeñado en Ia acumulación de metales pesados También se investigo el crecimiento mediado por NgPCSI con tratamiento de estrés salino analizando Ia cinética de las proporciones de crecimiento a concentraciones de NaCI de 0,6 y 0,7 M (figura 2B) A ambas concentraciones, las células que contenían pYES2NgPCS1 mostraron una clara desventaja de crecimiento inicial en comparación con el vector vacío pYES2 Sin embargo, tras 22 horas de tratamiento, las células expuestas a una concentración 0,6 M primero y a OJ M después, demostraron un mejor crecimiento que las células control Finalmente, Ia concentración 0,7 IvI produjo una mayor diferencia de crecimiento que 0,6 M1 y por tanto concentraciones más elevadas de NaCI produjeron una mejora superior del crecimiento mediado por NgPCSI En consecuencia, con NaCI 1,4 M se mejoró el crecimiento de células de levadura mediante Ia presencia de NgPCSI en dichas células (figura 2C) Tal como se observo a concentraciones 0,6 M y 0,7 M, aunque no hubo una diferencia perceptible en las proporciones de crecimiento durante las primeras 22 horas, el efecto producido por pYES2NgPCS1 aumentó con el tiempo, Io que condujo a una mayor diferencia al final de las mediciones, Io que constató una respuesta tardía mediada por NgPCSI en Ia tolerancia al Na+ Las condiciones de crecimiento experimental llevadas a cabo en este trabajo, que favorecen el crecimiento lento (medio mínimo sintético, sin glucosa libre), permitieron una mejor evaluación de los factores que estimulan el crecimiento en condiciones de estrés salino Hubo un aumento en Ia diferencia de DO600 a favor de las células que contenían pYES2NgPCS1, que se apreció claramente tras 39 horas de tratamiento y que aumentó espectacularmente a las 97 horas (figura 2D), Io que indicó que NgPCSI mejoraba drásticamente Ia tolerancia a Ia salinidad Sm embargo, Ia toxicidad del NaCI puede dividirse en dos componentes estrés hidnco y daño por Na+ Por tanto, surgió Ia siguiente pregunta ¿,NgPCS1 mejora Ia tolerancia al NaCI, por ejemplo, aumentando sólo Ia retención de agua, pero no Ia acumulación de NaCP ¿O mejora Ia tolerancia y Ia acumulación? Con el fin de responder a esta pregunta, se analizó Ia
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) acumulación de Na+ en el citoplasma de células de levaduras con o sin NgPCSI, demostrándose que NgPCSI conduce a una mayor acumulación de Na+ dentro de las células de levadura que contienen el vector pYES2NgPCS1 (figura 2E)
Ejemplo 3. Las fitoquelatinas confieren tolerancia al Na* en plantas y atenúan el estrés oxidativo.
Con el fin de probar Ia capacidad de Ia PCS para mejorar Ia tolerancia al Na+ en plantas, se hicieron crecer especímenes de N glauca que sobreexpresaban una PCS de trigo (TaPCSI) probada previamente para determinar Ia acumulación de metales pesados (Gisbert C et al (2003) Biochem Biophys Res Commun 303440-445) (Martínez M et al J (2006) Chemosphere 64478-48524)
El vector binario pBI121 (Clontech) fue usado para Ia transformación El gen GUS del vector binario fue sustituido por el DNA codificante de Ia fitoquelatina sintasa de trigo TaPCSI mediante los sitios de restricción SamHI y ECL136II A continuación, se llevó a cabo Ia introducción del plásmido obtenido, conteniendo el cDNA TaPCSI, en Agrobacterium tumefaαeπs C58C1RιfR y posteriormente se realizo la transferencia mediante infección a plantas de N glauca La nueva construcción fue electroporada en células de Agrobacterium tumefaciens Los transformantes se seleccionaron en placas de LB con kanamicina y se pusieron en contacto con discos de 1 cm de diámetro durante 10 minutos con una suspensión de A tumefaciens conteniendo Ia construcción deseada Tras generar plantas adultas por medio del programa de regeneración in vitro de explantes de N glauca resistentes a kanamicina, se recolectaron las semillas de las diferentes líneas transgénicas conseguidas y se seleccionaron aquellas que contenían una o vanas integraciones en el genoma de Ia planta, recuperando aquellas que eran capaces de crecer en presencia del antibiótico kanamicina El último paso consistió en comprobar si Ia integración del cDNA de TaPCSI al genoma de Nicotiana glauca mejoraba apreciablemente Ia tolerancia a Na+ de Ia planta El estudio de Ia tolerancia a Na+ fue llevado a cabo germinando las semillas transgénicas en un sustrato con vermiculita y dolomita asi como en condiciones hidropónicas, aplicando a las 7 y 2 semanas respectivamente NaCI, hasta una concentración final de 200, 300 y 500 mM
Se hicieron evidentes dos aspectos En primer lugar, ambos tipos de especímenes, los de tipo silvestre y los que sobreexpresaban PCS, siguieron exactamente el mismo patrón de crecimiento en relación con las concentraciones de NaCI probadas, Io que indicó un efecto neto de PCS en Ia tolerancia al NaCI (figura 3A) En segundo lugar, los especímenes de W glauca necesitaban NaCI para mejorar el crecimiento, al menos en las condiciones hidropónicas probadas en este trabajo Ambos tipos de plantas siguieron el mismo patrón, pero las OMG (Organismo Modificado Genéticamente) mostraron un mejor crecimiento en todos los casos
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Esta similitud en los patrones de crecimiento sólo difirió en un factor de mejora indicando que Ia sobreexpresión de TaPCSI en N glauca con NaCI es transparente en el sentido de que el gen no cambia el equilibrio interno dentro de Ia célula y sólo mejora Ia cantidad de sal metabolizada Cuando se analizo Ia halotolerancia en medios sólidos, las plantas también mostraron el patrón típico observado en las condiciones hidropónicas (figura 3B) Tal como se determinó en los cultivos hidropónicos, Ia presencia de NaCI mejoró el crecimiento y confirmó que 200 mM es Ia concentración de NaCI óptima para todas las plantas utilizadas en el experimento, incluso mejor que en ausencia de NaCI Sm embargo, el crecimiento a 350 mM y 500 mM fue anómalamente alto considerando Ia magnitud de Ia superficie foliar En relación con el papel desempeñado por Ia PCS, Ia tolerancia observada en NaCI 500 mM fue especialmente evidente puesto que los especímenes de tipo silvestre no pudieron sobrevivir
El estrés oxidativo resultó atenuado por Ia PCS (L1 y L3, figura 3C) La PCS sólo aumentó Ia tendencia natural de N glauca cuantitativamente para lograr un crecimiento mejorado con NaCI
Materiales y métodos empleados
Cultivos, transformación y ensayos de crecimiento de levaduras
En este estudio se utilizó Ia cepa de Saccharomyces cerevisiae, YPH499 (MATa ura3-52 leu2Δi Iys2-8O1 Ade2-101 trp1Δ63, hιs3-D200) Para los ensayos de crecimiento en medios sólidos y líquidos, se hicieron crecer las células de S cerevisiae en medio mínimo sintético (SD) con o sin un 2% de agar bacto, respectivamente, que contenia un 1% de sacarosa, un 1% de galactosa, un 0 7% de base nitrogenada para levaduras sin aminoácidos y con sulfato amónico (Pronadisa) y MES-Tns 50 mM (pH 6,0) El medio SD se complementó con adenina (30 μg/ml), histidina (30 μg/ml), leucina (100 μg/ml), lisina (100 μg/ml) y tπptófano (80 μg/ml) La transformación mediante el procedimiento con acetato de litio y Ia selección de los transformantes en levaduras se llevó a cabo tal como se ha descrito (Ito H, Fukuda Y1 Murata K1 Kimura A (1983) J Bactenol 153 163-168), y utilizando el marcador URA3 para Ia selección en levaduras Las células de levaduras que llevan el vector vacio pY£S2 se utilizaron como control negativo Para investigar Ia cinética del estrés salino, se hicieron crecer las células hasta una DO a 600 nm de 1, aproximadamente, y se inocularon a una concentración de 106 células por mi en medio líquido sin NaCI o conteniendo 0,6 M, 0,7 M y 1,4 M de NaCI Para los ensayos de goteo, se hicieron crecer las células hasta Ia saturación en SD diluido con agua (1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/100, 1/1 000 y 1/10 000), y se distribuyeron mediante réplica plater 8 x 6 array (Sigma-Aldπch) en placas que contenían 0,6 M, 0 7 M y 1 M de NaCI y CdCI2 100 μM
HOJA DE REEMPLAZO (Regía 26) Materiales vegetales
Para el experimento en invernadero, se esterilizaron semillas de N glauca (tipo silvestre) y tres lineas transgénicas de F3 diferentes (TaP12, TaP17 y TaP18, líneas Ll1 L2 y L3, respectivamente) de Ia siguiente forma se sumergieron las semillas en lejía comercial al 30%, más un 0,01% de detergente Tritón X-100 durante 7 minutos para evitar el crecimiento fύngico y bacteriano, después se llevó a cabo un segundo lavado utilizando una disolución de etanol al 70% en agua con un 0,01% de Tritón X-100 Finalmente, se lavaron las semillas durante cinco repeticiones consecutivas con agua desionizada durando cada una 5 minutos para eliminar cualquier resto de disolución desinfectante Las semillas sumergidas se colocaron en placas Petπ con un medio preparado con agar 6 g/litro, sales de MS {Murashige T, Skoog F (1962) Physiol Plaπt 15473-497), y sacarosa 10 g/litro a pH 5,7 tamponado con MES (ácido 2-[N- morfolιno]etanosulfónιco) 0,25 g/litro A los diez días (cuando se habían desarrollado las primeras hojas), se transplantaron tres plántulas por linea y tratamiento a macetas que contenían vermiculita y dolomita en las mismas proporciones y se cubrieron con película durante algunos días para obtener mejores condiciones aclimatadas Las plantas de seis semanas se colocaron en una bandeja diferente para cada tratamiento y se regaron una vez a Ia semana con o sin NaCI 200, 350 ó 500 mM durante 2 semanas Para el experimento m vitro, se colocaron tres plántulas para WT (tipo silvestre) y cada línea de N glauca, que crecían en condiciones estériles tal como se describió en (Gisbert C et al (2003) Biochem Biophys Res Commun 303 440-445), en tubos Falcon de 50 mi que contenían agua MiIIiQ con o sin NaCI 200, 350 y 500 mM a temperatura ambiente en un agitador suave (25 rpm en un agitador ELMI S4) durante 7 días
Clonación de NgPCSI
El ADN codificante fue sintetizado a partir de 2 μg del ARN total aislado de hojas de N glauca mediante Ia transcnptasa reversa de M-MuLV (virus de Ia leucemia muπna de Moloney) con cebador de olιgo(dT)18 (kit Fermentas de síntesis del ADN codificante de Ia primera hebra) según los procedimientos recomendados en el kit Un microlitro del ADN codificante producido se utilizó como molde en una reacción de PCR convencional de 50 μL Diseño de los cebadores para Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) se observó el dominio conservado en el extremo N-terminal para NtPCSI, AtPCSI, TaPCSI, B]PCSI y OsPCSI Se diseñaron dos cebadores diferentes en el extremo 5', FW1 (SEQ ID NO 2) y FW2 (SEQ ID NO 3) Las secuencias codificantes en Ia región C-terminal analizadas para este gen están menos conservadas que las del extremo N-termmal Por tanto, se usó Ia secuencia de ARN mensajero de NtPCSI y se diseñaron tres cebadores diferentes RV1 (SEQ ID NO 4), RV2 (SEQ ID NO 5) y RV3 (SEQ ID NO 6)
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Tras llevar a cabo los experimentos de PCR usando diferentes combinaciones, sólo se obtuvieron dos bandas con el tamaño esperado de 1,5 Kb, correspondiendo en ambos casos a los cebadores FW1/RV1 y FW2/RV2 Utilizando un gel de agarosa con tampón TAE al 1%, se llevaron a cabo las reacciones de PCR y se extrajeron mediante congelación-presión de Ia banda cortada y precipitación del ADN mediante 1/50 volúmenes de NaCI 5 M y 2 volúmenes de EtOH absoluto Tras medir Ia concentración de ADN en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pGEM-T Easy (Promega, Southampton, RU)
Se utilizó E coh DH5α como huésped Tras seleccionar los transformantes correctos y aislar el ADN plasmídico (Marligen bioscience, sistema rápido de aislamiento de plásmidos), se secuenciaron los fragmentos clonados en un secuenciador de ADN ABI Pnsm (Perkin-Elmer) usando los sitios T7 y SP6 localizados en el vector Ambas secuencias completas de los fragmentos de 1,5 Kb se alinearon con NtPCSI usando el programa LALIGN de William Pearson y se observó una identidad del 93% en Ia secuencia del fragmento FW1/RV1 La secuencia del segundo fragmento, FW2/RV2, reveló una identidad del 91% entre los nucleótidos 592 y 1501 de Ia secuencia codificante de NtPCSI La alineación de ambos fragmentos de secuencia dio como resultado Ia misma composición de nucleótidos entre Ia posición 592 y el codón de terminación La secuencia C-terminal correcta que corresponde al cebador RV1 se probó utilizando el segundo fragmento secuenciado NgPCSI se subclonó direccionalmente en los sitios Kpn\ /SamHI del vector de expresión pYES2 mediante una nueva amplificación por PCR con los cebadores FW2 y RV2 y con las secuencias adicionales Kpn\ y βamHI, respectivamente pYES2 incluye el gen Ampr de E coli, el marcador de levaduras seleccionable URA3 y el promotor inducible GAL1 para Ia expresión en células de levaduras E co/; se transformó mediante electroporación y los transformantes se seleccionaron para Ampr El ADN plasmídico del clon correcto que contenía NgPCSI en pYES2 se transformó en Ia cepa de levadura YPH499 y se seleccionó tal como se describió anteriormente Las secuencias de NgPCSI, NtPCSI, AtPCSI y TaPCSI se alinearon con el programa CLUSTAL W (Thompson J-D, Higgms D-G, Gibson T-J (1994) Nucleic Aαds Res 22 4673-4680) Se construyó un perfil de hidropatía de Kyte-Doolittle para conocer el carácter hidropático de NgPCSI [Kyte J, Dooltttle R (1982) J Mol Biol 157 105-132)
Medición de las concentraciones intracelulares de Na*
Se crecieron células de levadura en 20 mi de SD con los aminoácidos apropiados a una absorbancia a 600 nm de 0,6 Entonces, se añadió NaCI hasta una concentración final de NaCI 1,4 M y se incubó a 280C con agitación (150 rpm) durante 3 horas, se centrifugó durante 5
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) minutos a 7 000 rpm (rotor Beckman JA-20, 40C), y se lavó cuatro veces con 10 mi de una disolución que contenía MgCI2 20 mM y sorbitol 1,5 M Finalmente, se extrajo el contenido intracelular mediante incubación con 0,5 mi de MgCI2 20 mM durante 12 minutos a 950C Tras Ia centrifugación durante 2 minutos a Ia velocidad máxima, se analizaron alícuotas del sobrenadante con un espectrómetro de absorción atómica (Vanan) en el modo de emisión de llama
Determinación de O?
Se detectó el anión superóxido O2 ", tal como describe Yamamoto Y βt al (2002) Plant Physiol 12863-72, usando dihidroetidio (DHE), una forma reducida de bromuro de etidio, que no es fluorescente y puede atravesar pasivamente Ia membrana de las células vivas Una vez en Ia célula, se oxida para dar un colorante fluorescente que se une al ADN cercano Se observó producción de O2 " en las raíces de N glauca tras Ia tinción de las raíces con DHE 10 μM en CaCI2 100 μM, a pH 4,75 durante 13 3O h Se obtuvieron imágenes de fluorescencia con un microscopio confocal invertido Leica TCS SL Para Ia detección del DHE, se excitaron muestras a 488 nm usando un láser de argón y se recogió Ia emisión entre 550 y 620 nm Se repitieron los experimentos con microscopía confocal y fluorescencia al menos cinco veces con resultados similares Se hicieron crecer semillas de N glauca durante un periodo de seis semanas en medio MS tal como se describió en los materiales vegetales El DHE se suministró tras nueve días de adaptación a las condiciones hidropónicas
HOJA DE REEMPLAZO (Regía 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1 Secuencia aislada de un ácido nucleico que codifica para Ia fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca caracterizada por Ia SEQ ID NO 1 Vector que comprende Ia secuencia de Ia reivindicación 1 Vector, según Ia reivindicación 2, donde dicho vector es un plasmido Organismo modificado genéticamente con Ia secuencia de Ia reivindicación 1
5 Empleo de Ia secuencia de Ia reivindicación 1 para mejorar Ia tolerancia a salinidad y/o acumulación de sodio en organismos vivos Método para mejorar Ia tolerancia a Ia salinidad y/o acumulación de sodio en un organismo vivo que comprende las siguientes etapas a transformación del organismo vivo con Ia SEQ ID NO 1 o una secuencia con al menos un 35% de similandad con Ia SEQ ID NO 1, y b expresión de Ia secuencia controlada por secuencias regulatonas funcionales en el organismo vivo
7 Método, según Ia reivindicación 6, donde el organismo vivo es una levadura
8 Método, según Ia reivindicación 7, donde Ia levadura es Saccharomyces cerevisiae
9 Método, según Ia reivindicación 6, donde el organismo vivo es una planta 10 Método, según Ia reivindicación 9, donde Ia planta es Nicotiana glauca
11 Empleo de Ia secuencia de Ia reivindicación 1 para reducir o eliminar sodio de un medio liquido, sólido o gaseoso
12 Método para reducir o eliminar sodio de un medio liquido, sólido o gaseoso basado en las siguientes etapas a transformar organismos vivos con Ia SEQ ID NO 1 o una secuencia con al menos un 35% de similaπdad con Ia SEQ ID NO 1, b identificar los organismos transformados en a) mediante selección con antibiótico, c sembrar el medio salimzado con los organismos identificados en b), d cultivar los organismos durante un periodo adecuado, y e recolectar los organismos
13 Empleo de fitoquelatinas obtenidas in vivo o m vitro por reacción enzimática mediada por Ia fitoquelatina sintasa codificada por Ia SEQ ID NO 1, o secuencias con al menos un 35% de similaπdad, como quelantes de sodio
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