WO2009022897A2 - Composición farmacéutica sinergica, útil para inhibir la neovascularización (angiogénesis) corneal y retinal y de otros órganos en un humano o animal - Google Patents

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Definitions

  • Suramine suramin, suramine
  • suramin is a drug known for many years for the treatment of diseases caused by nematodes and protozoa. Its properties have also been described as an anti-neoplastic agent through several mechanisms: inhibition of tumor angiogenesis, increase in cellular sensitivity to cytotoxic substances (chemotherapy) and cytotoxic action itself.
  • Suramine may be referred to as the 8 - [[4-methyl-3 - [[3 - [[3 - [[2-methyl-5 - [(4,6,8-trisulfonaphthalen-1-yl) ”acid) carbamoyl] phenyl] carbamoyl] phenyl] carbamoyl] amino] benzoyl] amino] -naphthalen-1, 3,5-trisulfonic acid, of empirical formula C51 H40N6O23S6 and CAS number 145-63-1.
  • Bevacizumab a biologically active substance known for its anti-VEGF (vascular endothelial growth factor) effect, inhibits angiogenesis. It is used in colon cancer because of its antiangiogenic effect, reducing tumor growth and in the treatment of ophthalmological diseases that develop neovascularization, such as diabetic retinopathy, degeneration. macular related to exudative type age, and others.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Bevacizumab has been used in ophthalmology as an intravitreal agent in the treatment of proliferative diseases (neovascularization) of the eyes. In addition, it has been approved as a new indication for the treatment of breast cancer in several countries.
  • a new pharmaceutical composition comprising Suramine and Bevacizumab (hereinafter referred to as suramab) administered in a relatively low dose has a great antiangiogenic effect, of a synergistic nature, with greater intensity and duration than the effect produced by a single dose of Bevacizumab or Suramine.
  • the objective of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising Suramine, non-specific purinergic antagonist, and Bevacizumab, anti-VEGF substance, in the development of corneal angiogenesis.
  • the suramab administered intravenously markedly decreased the development of neovases in the cornea and had a significantly greater and lasting effect than that of the other animal groups during the 35 days of follow-up.
  • the results have revealed that suramab has a marked antiangiogenic effect, capable of stopping corneal neovascularization and in other parts of the body, becoming a new pharmacological agent for antiangiogenic treatment.
  • Another objective of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising Suramine, non-specific purinergic antagonist, and Bevacizumab, anti-VEGF substance, in the development of tumor angiogenesis and in the survival of the experimental animal.
  • CT26 cells colon adenocarcinoma
  • Figure 1 illustrates the development of corneal neovases 21 days after the injury: A) control; B) Bevacizumab; C) Suramine; D) suramab
  • Figure 2 shows the evolution of the neovases (neovascularization index) as a function of the time course (days) of the test for the four groups of animals
  • Figure 3 illustrates the percentage of survival over time (days) of the oncological angiogenesis model test for the four groups of animals up to 35 days
  • Figure 4 shows the tumor volume (average) in the Time course (days) of the oncological angiogenesis model test for the four groups of animals up to 31 days.
  • Figure 5 illustrates the tumor volume (average) at 31 days of the oncological angiogenesis model test for the four groups of animals.
  • the cornea located in the anterior part of the eye, is a transparent and avascular tissue.
  • Some ocular pathologies can cause loss of their avascularity and transparency, producing decrease or loss of vision. It is estimated that in the United States, 1.5 million patients develop corneal neovascularization, some of them with loss of vision, called blind cornea patients (Brodovsky SC, McCarty CA, Snibson G, Loughnan M, Sullivan L, Daniell M , Taylor HR. Management of alkali burns: an 1 1 -year retrospective review. Ophthalmology. 2000; 107: 1829-35).
  • corneal vessel invasion The most frequent causes of corneal vessel invasion (corneal neovascularization) are: eye infections such as herpes simplex virus, sequelae of diseases like Pemphigus and Steven Johnson Syndrome, giant Pterigion, and especially alkali burns.
  • eye infections such as herpes simplex virus, sequelae of diseases like Pemphigus and Steven Johnson Syndrome, giant Pterigion, and especially alkali burns.
  • the mentioned pathologies usually present with severe damage or destruction of the stem cells of the corneal limbus (stem cells), which would have the function of not allowing the entry of blood vessels through the corneal periphery (Dua HS, Joseph A, Shanmuganathan VA , Jones RE. Stem cell differentiation and the effects of deficiency. Eye 2003; 17: 877-85).
  • P2 receptors The cell surface receptors for extracellular nucleotides are called P2 receptors. These are activated by nucleotides such as purines and / or pyrimidines. P2 receptors are They are divided into two large groups: P2X and P2Y. P2X receptors are involved in the control of the flow of ions in the cell in response to ATP (adenosine triphosphate). P2X receptors participate in rapid neurotransmission and are found in large quantities in tissues with excitatory function. The subtypes P2X1, P2X2, P2X3, etc., are described in the bibliography. P2Y receptors belong to the family of receptors coupled to Protein G, and several types have also been found such as P2Y1, P2Y2, etc. (Abbracchio MP, Burnstock G. Purinoceptors: are there families of P2X and P2Y purinoceptors? Pharmacol Ther 1994; 64: 445-75).
  • P2 receptors are present in the sexual cells, in the retina and also in the cornea (Lazarowski E, Boucher R, Harden T. Mechanisms of relée of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol Pharmacol 2003; 64 (4): 785-95; Fries JE, Goczalik IM, Wheeler-Schilling TH, Kohler K, Guenther E, WoIf S, Wiedeman P, Bringmann A, Reichenbach A, Francke M, Pannicke T. Identification of P2Y receptor subtypes in human Muller glial cells by physiology, single cell RT-PCR, and immunohistochemistry. Invest Ophthalmol Vis Sci.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Bevacizumab rhuMAb VEGF
  • rhuMAb VEGF vascular endothelial growth factor
  • Bevacizumab is a monoclonal, humanized and recombinant antibody, which binds to VEGF-A preventing its action in the corresponding receptor and thus inhibits angiogenesis
  • Presta L Chen H, O Connor S, et al. Humanization of an antivascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders. Cancer Res 1997; 57: 4593-4599.
  • It is used in combined chemotherapy for the treatment of colon cancer, preventing tumor growth due to its angiostatic effect (Saunders M, Iveson T.
  • Bevacizumab as a potent inhibitor of inflammatory corneal angiogenesis and lymphangiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007; 48: 2545-2552; DeStaphene J, Kim T. Topical bevacizumab therapy for corneal neovascularization. Aren Ophthalmol 2007; 125: 834-836).
  • the neo-vessel formation was quantified giving a value of 0 to
  • the measurement of the vessels was performed on digital images taken with the Nikon Coolpix 5700 Digital Camera (Nikon, Tokyo, Japan) at 9, 15, 21 and 35 days post-injury (Zheng M, Schwarz MA, Lee S, Kumaraguru U, Rouse BT, Control of stromal keratitis by inhibition of neovascularization, Am J Pathol, 2001 Sep; 159 (3): 1021-9).
  • a solution of suramab, composed of Bevacizumab (3 mg / kg) and hexa-sodium Suramine (10 mg / kg) in 5 my physiological saline solution (CINa, 0.9%) was administered intravenously in the same way.
  • Four groups of three animals each were thus constituted: a group treated with Suramine, a group treated with Bevacizumab, a group treated with suramab and the remaining group without treatment (control group).
  • the suramab solution was obtained by the following procedure:
  • Bevacizumab (0.36 ml of a 100 mg / 4 ml vial of Avastin, Roche, wholesome Aires, Argentina) were added to the previously prepared Suramine solution, and the 5 ml of the resulting mixture was kept under refrigeration at 4 o C until the moment of its application.
  • the resulting suramab was injected with a butterfly catheter by channeling the atrial vein and by slow intravenous infusion for 15 to 20 minutes. Postoperative control
  • the first clinical examination was performed and then continued every three days. It was carried out using an operating microscope or a magnifying glass for surgeries and photos were taken with a Nikon Coolpix 5700 digital camera. The INV registration was done at 9, 15, 21 and 35 days in all animals. The average NV of each group was used to perform the comparative analysis.
  • C. Suramab Group: (n 10).
  • Bevacizumab, Suramina and suramab had an inhibitory effect of neovascularization over 35 days.
  • the proposed invention relates to a synergistic pharmaceutical composition, useful for inhibiting corneal and retinal neovascularization (angiogenesis), and other organs, in a human or animal, comprising, in a vehicle or carrier pharmaceutically acceptable:
  • the present invention relates to a synergistic pharmaceutical composition, useful for inhibiting corneal and retinal neovascularization, and other organs, in a human or animal, comprising, in a pharmaceutically acceptable carrier or carrier: approximately 75% by weight of Suramine, or the equivalent of one of its pharmaceutically acceptable salts; and about 25% by weight of Bevacizumab; wherein said percentages are with respect to the sum of the weights of both active principles.
  • the present invention relates to a synergistic, injectable pharmaceutical composition, useful for inhibiting corneal and retinal neovascularization, and other organs, in a human or animal, comprising: approximately 0.18% by weight of Suramine, or the equivalent of one of its pharmaceutically acceptable salts; and about 0.06% by weight of Bevacizumab; the rest being a pharmaceutically acceptable vehicle or carrier, wherein the percentages are given with respect to the total weight of the pharmaceutical composition.
  • compositions of the present invention may be in the pharmaceutical form of a composition for injection by intravenous, intravitreal or subconjunctival route, or for topical administration.
  • Angiogenesis (neovascularization) associated with cancer disease
  • the growth of the tumor volume is related to the greater or lesser vascularization of the tumor, through which the tumor cells are nourished.
  • Bevacizumab, Suramine and suramab had an inhibitory effect of tumor neovascularization (angiogenesis) over 31 days, manifested through a reduction in tumor volume compared to the control group.
  • tumor neovascularization angiogenesis
  • only suramab produced a statistically significant reduction.
  • the present invention demonstrates that suramab is a proven effective agent to reduce corneal angiogenesis in a classic corneal neovascularization model (Bocci G, Danesi R, Benelli U, lnnocenti F, Di Paolo A, Fogli S, Del Taca M. Inhibitory effect of suramin in rat models of angiogenesis in vitro and in vivo Cancer Chemother Pharmacol 1999; 43 (3): 205-12; Zheng M, Schwarz MA, Lee S, Kumaraguru U, Rouse BT. Control of stromal keratitis by inhibition of neovascularization Am J Pathol. 2001 Sep; 159 (3): 1021-9).
  • the degree of inhibition of angiogenesis is significantly higher using suramab than using the single treatment of Bevacizumab or Suramine.
  • the marked difference remained throughout the follow-up period.
  • the administered dose of each of the suramab component molecules (10 mg / kg Suramine + 3 mg / kg Bevacizumab) is less than that administered in a single form of Suramine (20 mg / kg) and Bevacizumab (5 mg / kg).
  • Half of the dose, administered in combination shows a greater effect and duration. Therefore, we have been able to observe a synergistic effect of the suramab components.
  • the doses of Suramine used for the development of suramab have been indicated as non-toxic to the human organism (Villalona-Calero MA, Wientjes MG, Otterson GA, Kanter S, Young D, Murgo AJ, Fisher B, DeHoff C, Chen D, Yeh TK, Song S, Grever M, Au JL. Phase I Study of Low Dose suramin as a chemosensitizer in patients with advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2003; Aug 15; 9 (9): 3303-1 1 ) while the doses of Bevacizumab used for the same purpose are those recommended for patients with colon cancer (1996 - 2006, Products Roche SAQ and I., wholesome Aires).
  • Intravitreal Bevacizumab for Diabetic Macular Edema. Results from the Pan- American Collaborative Retina Stud and Group at 6-Month Follow-up. Ophthalmology 2007, 114 (4) 743-750, Rabena M, Pieramici D, Castellarin A, Nasir M, Avery R. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of macular edema secondary to branch retinal vein occlusion. Retina 2007; 27 (4): 419-425).
  • corneal neovascularization shows how Bevacizumab (Avastin) administered parenterally and subconjunctively markedly decreased the presence of corneal neovases (Bock F, Onderka J, Dietrich T, Bachmann B, Kruse F, Paschke M, Zahn G, Cursiefen C Bevacizumab as a potent inhibitor of inflammatory corneal angiogenesis and lymphangiogenesis Invest Ophthalmol Vis Sci 2007; 48: 2545-2552; M Erdurmus and Totan Y. Subconjunctival bevacizumab for corneal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2007 / doi 10,1007-7 -0587-4).

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Abstract

Una composición farmacéutica sinérgica, útil para inhibir Ia neovascularización (angiogénesis) corneal y retinal, y de otros órganos, en un humano o animal, caracterizada porque comprende, en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable: 60 a 90 % en peso de Suramina, o el equivalente de una de sus sales farmacéuticamente aceptables; y 40 a 10 % en peso de Bevacizumab; en donde dichos porcentajes son con respecto a Ia suma de los pesos de ambos principios activos. Dicha composición farmacéutica sinérgica se presenta bajo Ia forma de una composición inyectable por vía endovenosa, intravítrea o subconjuntival, o bajo Ia forma para Ia administración tópica.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA SINERGICA, ÚTIL PARA INHIBIR LA
NEOVASCULARIZACIÓN (ANGIOGÉNESIS) CORNEAL Y RETINAL Y DE
OTROS ÓRGANOS. EN UN HUMANO O ANIMAL
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La Suramina (suramin, suramine) es una droga conocida desde hace muchos años para el tratamiento de enfermedades causadas por nematodos y protozoos. También se han descrito sus propiedades como agente anti-neoplásico a través de varios mecanismos: inhibición de Ia angiogénesis de tumores, incremento de Ia sensibilidad celular a sustancias citotóxicas (quimioterapia) y acción citotóxica por si misma.
Químicamente, Ia Suramina puede ser denominada como el ácido 8-[[4-metil-3-[[3-[[3-[[2-metil-5-[(4,6,8-trisulfonaftalen-1 - il)carbamoil]fenil]carbamoil]fen¡l]carbamoil]amino]benzoil]amino]- naftalen-1 ,3,5-trisulfónico, de fórmula empírica C51 H40N6O23S6 y número CAS 145-63-1.
El Bevacizumab, una sustancia biológicamente activa conocida por su efecto anti-VEGF (vascular endothelial growth factor), inhibe Ia angiogénesis. Se Ia utiliza en el cáncer de colón por su efecto antiangiogénico disminuyendo el crecimiento tumoral y en el tratamiento de enfermedades oftalmológicas que desarrollan neovascularización, como Ia retinopatía diabética, Ia degeneración macular relacionada con Ia edad tipo exudativa, y otras.
Recientemente el Bevacizumab se ha utilizado en oftalmología como un agente intravitreo en el tratamiento de las enfermedades proliferativas (neovascularización) de los ojos. Además, se Io ha aprobado como nueva indicación para el tratamiento de cáncer de mama en varios países.
De manera inesperada y sorprendente, se ha encontrado que una nueva composición farmacéutica que comprende Suramina y Bevacizumab (denominada en adelante suramab) administrada en una dosis relativamente baja posee gran efecto antiangiogénico, de carácter sinérgico, con mayor intensidad y duración que el efecto producido por una monodosis de Bevacizumab o de Suramina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
ASPECTOS MÉDICOS
A) Angiogénesis corneal
El objetivo de Ia presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende Suramina, antagonista purinérgico no específico, y Bevacizumab, sustancia anti-VEGF, en el desarrollo de Ia angiogénesis corneal.
Para tales propósitos, se utilizó un método bien conocido para inducir neovascularización en Ia cornea. La aparición de vasos de neoformación en Ia córnea fue documentada a través de una cámara digital a Io largo de un período de 35 días. El efecto de suramab (Suramina + Bevacizumab) en animales fue comparado con el de otros tres grupos de animales tratados con Bevacizumab, tratados con Suramina y sin ningún tipo de tratamiento (grupo de control).
El suramab administrado por vía endovenosa, disminuyó marcadamente el desarrollo de neovasos en Ia cornea y tuvo un efecto significativamente mayor y duradero que el de los otros grupos animales durante los 35 días de seguimiento. Los resultados han revelado que el suramab tiene un marcado efecto antiangiogénico, capaz de detener Ia neovascularización corneal y en otros lugares del organismo, constituyéndose en un nuevo agente farmacológico para el tratamiento antiangiogénico.
B) Angiogenesis tumoral
Otro objetivo de Ia presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende Suramina, antagonista purinérgico no específico, y Bevacizumab, sustancia anti-VEGF, en el desarrollo de Ia angiogenesis tumoral y en Ia sobrevida del animal de experimentación.
Para tal fin, se utilizó un modelo animal bien conocido. Brevemente, se inocularon células CT26 (adenocarcinoma de colon), en forma subcutánea, en Ia región dorso-lateral de ratones. Al 7o día de inoculación se formaron 4 grupos de animales que recibieron por vía intravenosa distintos tratamientos: suramab, bevacizumab, suramina, solución fisiológica (control). Se midieron los tumores tres veces por semana, se calculó el volumen tumoral siguiendo una fórmula conocida y se evaluó Ia sobrevida de los animales. Los grupos tratados fueron comparados con el grupo control.
Sólo el grupo tratado con suramab presenta una disminución estadísticamente significativa del volumen tumoral a los 31 días respecto al grupo control. Además, es el grupo que posee el porcentaje mayor de sobrevida a los 35 días.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS
La Figura 1 ilustra el desarrollo de neovasos corneales 21 días después de Ia lesión: A) control; B) Bevacizumab; C) Suramina; D) suramab
La Figura 2 se muestra Ia evolución de los neovasos (índice de neovascularización) en función del transcurso del tiempo (días) del ensayo para los cuatro grupos de animales
La Figura 3 ¡lustra el porcentaje de sobrevida en el transcurso del tiempo (días) del ensayo del modelo de angiogénesis oncológica para los cuatro grupos de animales hasta los 35 días
La Figura 4 muestra el volumen tumoral (promedio) en el transcurso del tiempo (días) del ensayo del modelo de angiogénesis oncológica para los cuatro grupos de animales hasta los 31 días.
La Figura 5 ilustra el volumen tumoral (promedio) a los 31 días del ensayo del modelo de angiogénesis oncológica para los cuatro grupos de animales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I. ANGIOGÉNESIS
I.1.- Introducción
La córnea, ubicada en Ia parte anterior del ojo, es un tejido transparente y avascular. Algunas patologías oculares pueden causar pérdida de su avascularidad y transparencia, produciendo disminución o pérdida de Ia visión. Se estima que en los Estados Unidos, un millón y medio de pacientes desarrollan neovascularización corneal, algunos de ellos con pérdida de Ia visión, llamados pacientes ciegos por cornea (Brodovsky SC, McCarty CA, Snibson G, Loughnan M, Sullivan L, Daniell M, Taylor HR. Management of alkali burns: an 1 1 -year retrospective review. Ophthalmology. 2000; 107: 1829-35). Las causas más frecuentes de Ia invasión de vasos en córnea (neovascularización corneal) son: infecciones oculares como el virus herpes simple, secuelas de enfermedades como el Pénfigo y el Síndrome de Steven Johnson, Pterigion gigantes, y especialmente las quemaduras con álcalis. Las patologías mencionadas suelen cursar con daño severo o destrucción de las células troncales del limbo corneal (stem cells), las cuales tendrían Ia función de no permitir el ingreso de vasos sanguíneos a través de Ia periferia corneal (Dua HS, Joseph A, Shanmuganathan VA, Jones RE. Stem cell differentiation and the effects of deficiency. Eye 2003;17:877-85).
El manejo de Ia neovascularización corneal continua siendo complejo, aunque se hayan logrado avances en el tratamiento de esta patología. Casos que se podrían beneficiar de un transplante convencional de cornea tienen mal pronóstico debido a Ia frecuente recurrencia de neovascularización. La experiencia demuestra que es necesario disminuir significativamente Ia neovascularización antes de realizar el transplante de córnea convencional (Garg P, Krishna PV, Stratis AK, Gopinathan U. The valué of corneal transplantation ¡n reducing blindness. Eye. 2005;19:1 106-14).
Nuevos tratamientos como por ejemplo el transplante de stem- cells de limbo corneal se encuentran en una etapa inicial de desarrollo. Sin embargo, en los pocos casos reportados no es raro encontrar recurrencia de Ia neovascularización corneal.
Los receptores de Ia superficie celular para nucleótidos extracelulares se denominan receptores P2. Estos son activados por nucleótidos como las purinas y/o pirimidinas. Los receptores P2 se dividen en dos grandes grupos: P2X y P2Y. Los receptores P2X están involucrados en el control del flujo de iones en Ia célula en respuesta al ATP (adenosin trifosfato). Los receptores P2X participan en Ia neurotransmisión rápida y se encuentran en gran cantidad en los tejidos con función excitatoria. Los subtipos P2X1 , P2X2, P2X3, etc., se encuentran descriptos en Ia bibliografía. Los receptores P2Y pertenecen a Ia familia de receptores acoplados a Proteína G, y también se han encontrado varios tipos como el P2Y1 , P2Y2, etc. (Abbracchio MP, Burnstock G. Purinoceptors: are there families of P2X and P2Y purinoceptors? Pharmacol Ther 1994;64:445-75).
Los receptores P2 se encuentran presentes en las células guales, en Ia retina y también en Ia cornea (Lazarowski E, Boucher R, Harden T. Mechanisms of reléase of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol Pharmacol 2003; 64 (4):785-95; Fries JE, Goczalik IM, Wheeler- Schilling TH, Kohler K, Guenther E, WoIf S, Wiedeman P, Bringmann A, Reichenbach A, Francke M, Pannicke T. Identification of P2Y receptor subtypes in human Muller glial cells by physiology, single cell RT-PCR, and immunohistochemistry. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Aug; 46 (8): 3000-7; Wang L, Karlsson L, Moses S, Hultgardh- Nilsson A, Andersson M, Borna C, Gudbjártsson T, Jern S, Erlinge D. P2 receptor expression profiles ¡n human vascular smooth muscle and endothelial cells. J Cardiovasc Pharmacol 2002 Dec; 40 (6): 841- 53; Li Y, Holtzclaw LA, Russell JT. Muller cell Ca2+ waves evoked by purinergic receptor agonists in slices of rat retina. J Neurophysiol 2001 Feb; 85 (2): 986-94; Fujihara T, Murakami T1 Fujita H, Nakamura M, Nakata K. Improvement of corneal barrier function by the P2Y(2) agonist INS365 in a rat dry eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jan; 42 (1 ): 96-100). Se han encontrado activados, con una mayor inmunoreactividad, en enfermedades de Ia retina (Morigiwa K, Quan M, Murakami M, Yamashita M, Fukuda Y. P2 Purinoceptor expression and functional changes of hypoxia-activated cultured rat retinal microglia. Neurosci Lett. 2000;282:153-6). Estudios experimentales en animales sobre desprendimiento de retina demostraron una inmunoreactividad positiva de los receptores P2Y2 especialmente en las capas internas de Ia retina, lográndose una clara identificación de ellos en células guales como en astrocitos y células de Muller. Sin embargo, después de 7 días de evolución del desprendimiento de retina ya se expresaba el receptor P2Y2 en otras partes de Ia retina (Uhlmann S, Bringmann A, Uckermann O, Pannicke T, Weick M, Ulbricht E, Goczalik I, Reichenbach A, Wiedemann P, Francke M. Early glial cell reactivity in experimental retinal detachment: effect of suramin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003 Sep; 44 (9): 41 14-22).
La Suramina actúa bloqueando los receptores purinérgicos. Sin embargo, también se Ia ha encontrado bloqueando otros receptores de moléculas angiogénicas como el FGF y el VEGF (Kathir KM, Kumar TK, Yu C. Understanding the mechanism of the antimitogenic activity of suramin. Biochemistry. 2006 Jan 24; 45 (3): 899-906).
Es ampliamente conocido el rol que cumple el VEGF (vascular endothelial growth factor) en Ia angiogénesis en distintos lugares del cuerpo humano. El Bevacizumab (rhuMAb VEGF) es un anticuerpo monoclonal, humanizado y recombinante, que se une al VEGF-A impidiendo su acción en el receptor correspondiente y de esta manera inhibe Ia angiogénesis (Presta L, Chen H, O Connor S, et al. Humanization of an antivascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders. Cáncer Res 1997; 57: 4593-4599). Se Io utiliza en Ia quimioterapia combinada para el tratamiento del cáncer de colon, impidiendo el crecimiento tumoral por su efecto angiostático (Saunders M, Iveson T. Management of advanced colorectal cáncer: state of the art. BMJ 2006, 95:131 -38). Con esta indicación está autorizado en nuestro país (1996 - 2006, Productos Roche S. A. Q. e I., Buenos Aires). En oftalmología se Io utiliza actualmente para el tratamiento de enfermedades que cursan con neovascularización retinal y son causas frecuentes de ceguera como Ia degeneración macular relacionada con Ia edad de tipo exudativa y Ia retinopatía diabética. Además, recientes investigaciones señalan Ia posibilidad de uso para neovascularización corneal (Bock F, Onderka J, Dietrich T, Bachmann B, Kruse F, Paschke M, Zahn G, Cursiefen C. Bevacizumab as a potent inhibitor of inflammatory corneal angiogenesis and lymphangiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48: 2545-2552; DeStafeno J, Kim T. Topical bevacizumab therapy for corneal neovascularization. Aren Ophthalmol 2007; 125: 834-836).
A las publicaciones de otros investigadores se suman los trabajos realizados en nuestra institución según los cuales monodosis de Bevacizumab y monodosis de Suramina reducen Ia neovascularización corneal y retinal (Gallo JE, Sarman S, Mancini J, van der Ploeg I , Croxatto JO, Kvanta A. Suramin Inhibits Experimental Retinal Neovascularization. Possible Role of Purinergic P2 Receptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006 47: E-Abstract 3224, López E, Croxatto JO, Kvanta A1 Gallo JE. Effect of Bevacizumab (Avastin) and Suramin in a Rabbit Model of Corneal Neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007 48: E- Abstract 1717). Basándonos en estos hechos nos propusimos evaluar Ia eficacia del suramab, (una composición farmacéutica que comprende Suramina y Bevacizumab) para inhibir Ia angiogenesis corneal en un modelo animal clásico de neovascularización corneal (Fujihara T, Murakami T, Fujita H, Nakamura M, Nakata K. Improvement of corneal barrier function by the P2Y(2) agonist INS365 in a rat dry eye model.
Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jan; 42 (1 ): 96-100; Klepeis VE, Weinger I1 Kaczmarek E, Trinkaus-Randall V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J CeII Biochem. 2004 Dec 15; 93 (6): 1115-33; Cursiefen C, Cao J, Chen L et al. Inhibition of hem and lymphangiogenesis after normal-risk corneal transplantation by neutralising VEGF promotes graft survival. Invest Ophthalmol Vis Sci 2004; 45: 2666-2673) y Ia angiogénesis asociada al cáncer en un modelo animal utilizando células de adenocarcinoma de colon.
11.2.- Ejemplos
11.2.1.- Material y Métodos
Modelo de Neovascularización corneal
Luego de anestesiar un conejo blanco de raza neocelandeza de 3 kg. con una inyección intramuscular de midazolam y clorhidrato de Ketamina, se realizó Ia instilación de proparacaína tópica (Anestalcon, Alcon, Argentina) en el ojo y se colocó un blefarostato en el ojo derecho. Durante 20 segundos se embebieron discos de papel de filtro Whatman de 7 mm de diámetro en solución de NaOH 1 N. Se colocó con una pinza el disco de papel sobre Ia parte central de Ia córnea dejándolo por 2 minutos. Inmediatamente después se lavó Ia zona lesionada con 15 mi de solución fisiológica salina (CINa, 0,9 %) durante un minuto. El mismo procedimiento se llevó a cabo en 12 conejos del mismo color, raza y peso.
Resultado de Ia Neovascularización (score)
Se cuantificó Ia formación de neovasos dándole un valor de 0 a
4 a cada cuadrante según el grado de crecimiento centrípeto del vaso mas largo (en incrementos de 1 mm, es decir, 0 = 0 mm; 1 = igual o menor de 1 mm; 2 = mayor de 1 y hasta 2 mm; 3 = mayor de 2 y hasta 3 mm; 4 = mayor de 3 mm.). La suma de los cuatro cuadrantes brindó el índice de neovascularización (INV) de ese ojo. La medición de los vasos se realizó sobre imágenes digitales tomadas con Ia cámara Nikon Coolpix 5700 Digital Camera (Nikon, Tokyo, Japan) a los 9, 15, 21 y 35 días post-lesión (Zheng M, Schwarz MA, Lee S, Kumaraguru U, Rouse BT. Control of stromal keratitis by inhibition of neovascularization. Am J Pathol. 2001 Sep; 159 (3): 1021 -9).
Administración de monodosis de Suramina, Bevacizumab y suramab
Treinta minutos después de realizar Ia lesión corneal se inyectó a través de una bomba de infusión endovenosa 20 mg/kg de Suramina hexa-sódica (Biomol International, PA, USA) disuelta en 5 mi de solución fisiológica salina (CINa, 0,9 %) durante 20 minutos. El Bevacizumab (Roche, Buenos Aires, Argentina) se administró de igual manera con una dosis de 5 mg/kg disuelta en 5 mi de solución fisiológica salina (CINa, 0,9 %). Una solución de suramab, compuesta por Bevacizumab (3 mg/kg) y Suramina hexa-sódica (10 mg/kg) en 5 mi solución fisiológica salina (CINa, 0,9 %) se administró por vía endovenosa de igual modo. Quedaron así constituidos cuatro grupos de tres animales cada uno: un grupo tratado con Suramina, un grupo tratado con Bevacizumab, un grupo tratado con suramab y el grupo restante sin tratamiento (grupo de control).
La solución de suramab se obtuvo mediante el siguiente procedimiento:
30 mg de Suramina hexa-sódica se disolvieron en 4,64 mi de solución fisiológica salina (NaCI, 0,9 %) mediante agitación continua durante 4 minutos.
9 mg de Bevacizumab (0,36 mi de una ampolla de Avastin de 100 mg /4 mi, Roche, Buenos Aires, Argentina) se agregaron a Ia solución de Suramina preparada previamente, y los 5 mi de Ia mezcla resultante se conservaron bajo refrigeración a 4o C hasta el momento de su aplicación.
El suramab resultante se inyectó con catéter mariposa canalizando Ia vena auricular y mediante perfusión endovenosa lenta durante 15 a 20 minutos. Control postoperatorio
A las 24hs de realizar Ia lesión se realizó el primer examen clínico y luego se continuó cada tres días. Se llevó a cabo utilizando un microscopio operador o una lupa para cirugías y se tomaron fotos con una cámara digital Nikon Coolpix 5700. El registro del INV se realizó a los 9, 15, 21 y 35 días en todos los animales. El I NV promedio de cada grupo se utilizó para realizar el análisis comparativo.
Modelo de Angiogénesis oncológica
Se inocularon 5 x 105 células CT26 (adenocarcinoma de colon), en forma subcutánea, en Ia región dorso-lateral de ratones Balb/c. Al 7o día de inoculación se formaron 4 grupos de animales que recibieron por vía iv (en Ia vena de Ia cola) distintos tratamientos.
Administración de monodosis de Suramina, Bevacizumab y suramab
a. Grupo Bevacizumab: (n =10), 5 mg/Kg (1 ratón = 30 gr, aprox 0.15 mg por ratón) en 100 D l mi de solución fisiológica (SF) con infusión lenta. b. Grupo Suramina: (n=10) 20 mg/Kg (1 ratón =30 gr, aprox 0.6 mg por ratón) en 100 Dl de SF con infusión lenta. c. Grupo Suramab: (n=10). Suramina 20 mg/Kg + Bevacizumab 5 mg/Kg (aprox 0.6 gr de suramina y 0.15 mg de bevacizumab por ratón) en 100 Dl de SF con infusión lenta. d. Grupo control: (n= 7). SF 100 Dl con infusión lenta
Control postoperatorio Se midieron los tumores tres veces por semana. Para calcular el volumen tumoral se utilizó Ia siguiente fórmula: (diámetro mayor * el cuadrado del diámetro menor)/2. Los animales con tumores de volumen mayor o igual a 8000 mm3 fueron sacrificados.
La sobrevida se consideró hasta el día 35 post inoculación del tumor.
2.2.2.- Resultados
Neovascularización corneal
Los resultados obtenidos para los cuatro grupos de animales se muestran en Ia siguiente tabla: TABLA 1 - PROMEDIOS DE ÍNDICES DE NEOVASCULARIZACION
Figure imgf000018_0001
El Bevacizumab, Ia Suramina y el suramab tuvieron un efecto inhibidor de Ia neovascularización a Io largo de los 35 días.
Sin embargo, como puede observarse claramente en Ia tabla 1 previa así como en las Figuras 1 y 2 , Ia aplicación de suramab tuvo un efecto significativamente mayor y de naturaleza sinérgica en el grado de inhibición de neovasos durante los 35 días de seguimiento.
De acuerdo con los resultados experimentales precedentes, Ia invención propuesta se refiere a una composición farmacéutica sinérgica, útil para inhibir Ia neovascularización (angiogénesis) corneal y retinal, y de otros órganos, en un humano o animal, que comprende, en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable:
60 a 90 % en peso de Suramina, o el equivalente de una de sus sales farmacéuticamente aceptables; y
40 a 10 % en peso de Bevacizumab; en donde dichos porcentajes son con respecto a Ia suma de los pesos de ambos principios activos.
Más preferentemente, Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica sinérgica, útil para inhibir Ia neovascularización corneal y retinal, y de otros órganos, en un humano o animal, que comprende, en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable: aproximadamente 75 % en peso de Suramina, o el equivalente de una de sus sales farmacéuticamente aceptables; y aproximadamente 25 % en peso de Bevacizumab; en donde dichos porcentajes son con respecto a Ia suma de los pesos de ambos principios activos.
De manera aun más preferencial, Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica sinérgica, inyectable, útil para inhibir Ia neovascularización corneal y retinal, y de otros órganos, en un humano o animal, que comprende: aproximadamente 0,18 % en peso de Suramina, o el equivalente de una de sus sales farmacéuticamente aceptables; y aproximadamente 0,06 % en peso de Bevacizumab; siendo el resto un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable, en donde los porcentajes están dados con respecto al peso total de Ia composición farmacéutica.
Preferentemente en estas composiciones farmacéuticas sinérgicas, inyectables, el 0,18 % en peso de Suramina se encuentra bajo Ia forma de su sal hexa-sódica. Finalmente, se considera que las composiciones de Ia presente invención pueden estar bajo Ia forma farmacéutica de una composición inyectable por vía endovenosa, intravítrea o subconjuntival, o para Ia administración tópica.
Angiogenesis (neovascularización) asociada a enfermedad oncológica
Como es sabido, el crecimiento del volumen tumoral está relacionado con Ia mayor o menor vascularización del tumor, a través de Ia cual se nutren las células tumorales. En nuestro ensayo experimental el Bevacizumab, Ia Suramina y el suramab tuvieron un efecto inhibidor de Ia neovascularización (angiogenesis) tumoral a Io largo de los 31 días, manifestado a través de una reducción del volumen tumoral comparado con el grupo control. Sin embargo, sólo el suramab produjo una reducción estadísticamente significativa.
Además es importante destacar que el porcentaje de sobrevida a los 35 d ías fue mayor en el grupo de animales tratado con suramab. Como puede observarse en las Figuras 3 a 5, Ia aplicación de suramab tuvo un efecto significativamente mayor y de naturaleza sinérgica en el grado del crecimiento del volumen tumoral (por inhibición de neovasos) a los 31 d ías de seguimientoy de porcentaje mayor de sobrevida a los 35 días. 2.2.3.- Discusión y Conclusiones
La presente invención demuestra que el suramab es un agente probadamente eficaz para reducir Ia angiogénesis corneal en un modelo clásico de neovascularización corneal (Bocci G, Danesi R, Benelli U, lnnocenti F, Di Paolo A, Fogli S, Del Taca M. Inhibitory effect of suramin in rat models of angiogénesis in vitro and in vivo. Cáncer Chemother Pharmacol 1999; 43 (3): 205-12; Zheng M, Schwarz MA, Lee S, Kumaraguru U, Rouse BT. Control of stromal keratitis by inhibition of neovascularization. Am J Pathol. 2001 Sep; 159 (3): 1021 -9). El grado de inhibición de Ia angiogénesis es significativamente mayor utilizando suramab que usando el tratamiento único de Bevacizumab o de Suramina. La marcada diferencia se mantuvo durante todo el período de seguimiento. La dosis administrada de cada una de las moléculas componentes de suramab (10 mg/kg Suramina + 3 mg/kg Bevacizumab) es menor a Ia administrada en forma única de Suramina (20 mg/kg) y Bevacizumab (5 mg/kg). La mitad de Ia dosis, administrada de manera combinada, muestra un efecto y duración mayor. Por Io tanto, hemos podido observar un efecto sinérgico de los componentes de suramab. Parece razonable pensar que esta sinergia se basa en el mecanismo diferente de acción de Ia Suramina (bloqueando receptores celulares) y el Bevacizumab (uniéndose el péptido circulante). Un efecto sinérgico similar hemos encontrado en el ensayo realizado con un modelo animal de angiogénesis tumoral utilizando una concentración distinta del suramab. La dosis administrada de cada una de las moléculas componentes de suramab (20 mg/kg Suramina + 5 mg/kg Bevacizumab) es igual a Ia administrada en forma única de Suramina (20 mg/kg) y Bevacizumab (5 mg/kg). Sin embargo, una misma dosis, administrada de manera combinada, muestra un efecto y duración mayor.
Las dosis de Suramina utilizadas para el desarrollo de suramab han sido señaladas como no tóxicas para el organismo humano (Villalona-Calero MA, Wientjes MG, Otterson GA, Kanter S, Young D, Murgo AJ, Fisher B, DeHoff C, Chen D, Yeh TK, Song S, Grever M, Au JL. Phase I Study of Low Dose suramin as a chemosensitizer in patients with advanced non-small cell lung cáncer. Clin Cáncer Res 2003; Aug 15; 9 (9): 3303-1 1 ) mientras que las dosis de Bevacizumab utilizadas para el mismo fin son las recomendadas para pacientes con cáncer de colon (1996 - 2006, Productos Roche S. A. Q. e I., Buenos Aires).
En consecuencia, el suramab podría constituirse en una nueva alternativa para el tratamiento de enfermedades oncológicas, en un momento en el cual se discuten estrategias distintas para el tratamiento de estas enfermedades (Schmoll H, Sargent D. Single agent fluorouracil for first-line treatment of advanced colorectal cáncer as standard? Lancet 2007, 370: 105-107; Koopman M, Antonini N, Douma J, WaIs J et al. Sequential versus combination chemotherapy with capecitabine, irinotecan, and oxaliplatin in advanced colorectal cáncer (CAIRO): a phase III randomised controlled trial. Lancet 2007; 370: 135-42; Ramaswamy S. Rational design of cancer-drug combinations. NEJM 2007; 357 (3): 299-300; Seymour M, Maughan T, Ledermann J et al. Different strategies of sequential and combination chemoíherapy for patients with poor prognosis advanced colorectal cáncer (MR FOCUS): a randomised controlled trial. Lancet 2007; 370: 143-52). La angiogénesis patológica retinal, como ocurre en Ia retinopatía del prematuro, es una causa importante de ceguera en niños nacidos prematuramente (Gallo JE, Lennerstrand G. A population-based study of ocular abnormalities in premature children aged 5 to 10 years. Am J Ophthalmol 1991 May 15; 111 (5): 539-47), dando inicio al desarrollo de Ia proliferación vitreo-retinal que habitualmente conduce al desprendimiento de retina y posterior ceguera. Un mecanismo similar de proliferación vitreo-retinal ocurre en Ia etapa final de Ia retinopatía diabética. Estas enfermedades, así como aquellas que cursan con neovascularización corneal causando "ceguera por córnea", podrían beneficiarse del tratamiento con suramab.
El tratamiento actual del edema macular diabético, de Ia retinopatía diabética proliferativa (con neovasos) y de Ia degeneración macular de tipo exudativo es a través de una inyección intravítrea (intravitreal) de una droga antiangiogénica, que es necesario repetir con frecuencia en Ia mayoría de los casos (R. Lazic, N. Gabric. Verteporfin Therapy and Intravitreal Bevacizumab Combined and Alone ¡n Choroidal Neovascularization due to Age- Related Macular Degeneration. Ophthalmology 2007, 114: (6), 1 179- 1 185, Augustin AJ, PuIs S, Offermann I. Triple therapy for choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration: verteporfin PDT, bevacizumab, and dexamethasone. Retina 2007; 27 (2):133-40, Yanyali A, Aytug B, Horozoglu F, Nohutcu A. Bevacizumab (Avastin) for diabetic macular edema in previously vitrectomized eyes. Am J Ophthalmol 2007; 144 (1 ):124-6, Arevalo F, Fromow-Guerra J, Quiroz-Mercado H, Sánchez J, Wu L, Maia M, Berrocal M, Solis-Vivanco A, Farah M, and Pan-American Collaborative Retina Study Group. Primary Intravitreal Bevacizumab (Avastin) for Diabetic Macular Edema. Results from the Pan- American Collaborative Retina Study Group at 6-Month Follow-up. Ophthalmology 2007, 114 (4) 743-750, Rabena M, Pieramici D, Castellarin A, Nasir M, Avery R. Intravitreal bevacizumab (Avastin) ¡n the treatment of macular edema secondary to branch retinal vein occlusion. Retina 2007; 27 (4): 419-425). Considerando el mayor efecto y duración del suramab parecería lógico esperar una reducción de Ia frecuencia de estas inyecciones, con Ia ventaja de disminuir el riesgo de contraer una infección intraocular severa (endoftalmitis) y de minimizar Ia repetición de un procedimiento invasivo en el paciente.
Recientes trabajos sobre neovascularización corneal muestran como el Bevacizumab (Avastin) administrado por vía parenteral y subconjuntivalmente disminuyó marcadamente Ia presencia de neovasos en córnea (Bock F, Onderka J, Dietrich T, Bachmann B, Kruse F, Paschke M, Zahn G, Cursiefen C. Bevacizumab as a potent inhibitor of inflammatory corneal angiogenesis and lymphangiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48: 2545-2552; M Erdurmus and Totan Y. Subconjunctival bevacizumab for corneal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2007; doi 10.1007/s00417-007-0587-4). Resultados todavía muy preliminares se han reportado en Ia administración tópica (DeStafeno J, Kim T. Topical bevacizumab therapy for corneal neovascularization. Arch Ophthalmol 2007; 125: 834-836). La investigación llevada a cabo tuvo como objetivo evaluar el efecto de suramab (composición farmacéutica que comprende Suramina y Bevacizumab) para inhibir Ia neovascularización corneal y Ia asociada a un cáncer en dos modelos animales. Los resultados han sido ciertamente muy favorables.

Claims

REIVINDICACIONES
1 .- Composición farmacéutica sinérgica, útil para inhibir Ia neovascularización (angiogénesis) corneal y retinal, y de otros órganos, en un humano o animal, caracterizada porque comprende, en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable:
60 a 90 % en peso de Suramina, o el equivalente de una de sus sales farmacéuticamente aceptables; y
40 a 10 % en peso de Bevacizumab; en donde dichos porcentajes son con respecto a Ia suma de los pesos de ambos principios activos.
2.- La composición farmacéutica de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizada porque comprende, en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable: aproximadamente 75 % en peso de Suramina, o el equivalente de una de sus sales farmacéuticamente aceptables; y aproximadamente 25 % en peso de Bevacizumab; en donde dichos porcentajes son con respecto a Ia suma de los pesos de ambos principios activos.
3.- La composición farmacéutica de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizada porque comprende: aproximadamente 0, 18 % en peso de Suramina, o el equivalente de una de sus sales farmcacéuticamente aceptables; y aproximadamente 0,06 % en peso de Bevacizumab; siendo el resto un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable, en donde los porcentajes están dado con respecto al peso total de Ia composición farmacéutica.
4.- La composición farmacéutica de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizada porque comprende: aproximadamente 0,18 % en peso de Suramina bajo Ia forma de su sal hexa-sódica; y aproximadamente 0,06 % en peso de Bevacizumab; siendo el resto un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable, en donde los porcentajes están dado con respecto al peso total de Ia composición farmacéutica
5.- La composición farmacéutica de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizada porque es una composición inyectable por vía endovenosa, intravítrea o subconjuntival, o es para Ia administración tópica.
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