WO2008127139A1 - Colorants d'indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l'analyse de macromolécules biologiques - Google Patents

Colorants d'indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l'analyse de macromolécules biologiques Download PDF

Info

Publication number
WO2008127139A1
WO2008127139A1 PCT/RU2007/000172 RU2007000172W WO2008127139A1 WO 2008127139 A1 WO2008127139 A1 WO 2008127139A1 RU 2007000172 W RU2007000172 W RU 2007000172W WO 2008127139 A1 WO2008127139 A1 WO 2008127139A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
carboxybutyl
cooh
mmol
sulfobutyl
Prior art date
Application number
PCT/RU2007/000172
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexandr Vasilievich Chudinov
Viktoria Evgenievna Kuznetsova
Alexandr Sergeevich Zasedatelev
Viktor Evgenievich Barsky
Original Assignee
Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta Rossiiskoi Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta Rossiiskoi Akademii Nauk filed Critical Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta Rossiiskoi Akademii Nauk
Priority to EA200901123A priority Critical patent/EA200901123A1/ru
Priority to PCT/RU2007/000172 priority patent/WO2008127139A1/ru
Priority to EP07834942A priority patent/EP2157088A4/en
Publication of WO2008127139A1 publication Critical patent/WO2008127139A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/18—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/18—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D209/24—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with an alkyl or cycloalkyl radical attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/08—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines
    • C09B23/083—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines five >CH- groups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • This invention relates to fluorescent indocyanine dyes and their derivatives for the analysis of biological macromolecules.
  • the invention relates to a method for producing these compounds.
  • Fluorescence labeling is one way to identify the results of biological analysis in immunological and hybridization analysis, in particular, in the technology of biological microarrays, in microscopic cytometry, in flow cytometric sorting, etc.
  • the analyte is initially detected using the complementary compound. Then, the number of specific complexes formed is measured by the fluorescence intensity of the label.
  • the fluorophore core of polymethine dyes consists of two heterocyclic fragments connected by a conjugated polymethine chain of atoms.
  • the maxima of the absorption and fluorescence of the fluorophore strongly depend on the length of the polymethine chain and the nature of the heterocyclic fragments, and to a lesser extent on the nature of the substituents and the site of their binding to the fluorophore.
  • Coefficient of molar extinction and quantum yield of fluorescence, i.e. the ability to absorb energy and fluoresce strongly depends on the molecular environment of the fluorophore, on the type of substituents and their attachment to the fluorophore.
  • Dyes having reactive chemical groups i.e. capable of turning into active groups after activation and covalently binding to other molecules, they are used in biological analyzes for fluorescence labeling of biomolecules, proteins, nucleic acids, etc. Most often, a carboxyl group (-COOH) is used for this purpose, which is associated with the amino group of the biomolecule.
  • the requirements for the properties of the fluorescent label are somewhat different. Among the common The requirements include the following:
  • the label should not impede the formation of the maximum number of specific complexes of the analyte and the fluorescently labeled probe
  • the label should provide maximum sensitivity and accuracy of instrumental registration of the number of specific complexes formed
  • Polymethine dyes are derivatives of indole, indocyanine dyes, and are characterized by high efficiency, fluorescence brightness in combination with satisfactory chemical stability and light fastness.
  • Each new carboxyl-containing indolenin serves as the basis for obtaining a new series of indocyanine dyes with different substituents and, accordingly, with different properties.
  • the above dyes have some disadvantages.
  • the reactive group R 3 of the dye is attached to the 1 position of the indolenin fragment, then it is located in the same plane as the substituent R 4 and experiences steric difficulties on the part of this group.
  • the probe (biomolecule) attached to the carboxyl group located on the R 3 substituent will also experience steric difficulties on the part of the R 4 substituent, which may prevent the formation of the maximum number of specific complexes of the analyte and the fluorescently labeled probe.
  • Dyes with a reactive group Ri attached at the 3 position of the indolenin fragment through the pentamethylene chain of atoms Ri - (CH 2 ) 5 COOH also have their drawbacks.
  • FIG. 2. Molecular extinction coefficients of dyes in methanol and PBS.
  • FIG. 3. Quantum yield of fluorescence of dyes in methanol and PBS.
  • FIG. 4 Relative fluorescence efficiency of dyes. Excitation and recording at maxima of absorption and fluorescence.
  • FIG. 5 Relative fluorescence dye efficiency. Excitation 655nm. Registration 690nm.
  • FIG. 6 Relative fluorescence efficiency of dyes. Excitation 635nm. Registration 670nm.
  • FIG. 10 Photo and microchip diagram after analysis, where: 1 - protein A concentration in the gel (0.4 mg / ml), 2 - protein A concentration in the gel (0.2 mg / ml), 3 - protein A concentration in the gel (0.1 mg / ml), 4 - concentration of protein A in the gel (0.05 mg / ml), 5 - concentration of protein A in the gel (0.025 mg / ml), 6 - concentration of protein A in the gel (0.013 mg / ml), 7 - concentration of protein A in the gel (0.006 mg / ml), 8 - empty gel.
  • the aim of the invention are indocyanine dyes containing two heterocyclic ring systems linked by a polymethine linker linker and containing a carboxyl group attached to the heterocyclic fragment through a polymethylene chain, for use as fluorescent labels for biological materials.
  • Such compounds proposed in this invention are compounds of General formula (I).
  • Ri represents —CH 3 ; - (CH 2 ) 4 COOH;
  • R 2 represents —CH 3 ; - (CH 2 ) 2 COOH; -H; -SO 3 " ;
  • R 3 represents —C 2 H 5 ; - (CH 2 ) 4 SO 3 ⁇ ;
  • R 4 represents —C 2 H 5 ; - (CH 2 ) 4 SO 3 ⁇ ;
  • R 5 represents —H; -CH 3 ;
  • R 6 represents —H; -CH 3 ; -SO 3 " .
  • Ri represents - (CH 2 ) 4 COOH
  • R 2 represents —H; -CH 3 ; -SO 3 " ;
  • R 3 is —C 2 H 5 ;-( CH 2 ) 4 SO 3 ⁇
  • R 4 represents —C 2 Hs; - (CH 2 ) 4 SO 3 ⁇ ;
  • R 5 represents —H; -CH 3 ;
  • R 6 represents —H; -CH 3 ; -SO 3 " ;
  • Ri represents —CH 3 ;
  • R 2 represents - (CH 2 ) 2 COOH
  • R 3 represents —C 2 H 5 ; - (CH 2 ) 4 SO 3 " ;
  • R 4 represents —C 2 H 5 ; - (CH 2 ) 4 SO 3 " ;
  • R 5 represents —H
  • R 6 represents —H; -CH 3 ; -SO 3 "
  • a distinctive feature of dyes (A) from dyes that are disclosed in the above publications is the following: 1) four methylene groups are separated from the indolenine fragment from the indolenine fragment, as opposed to five, as in the above analogues; 2) the method for producing the intermediate product - keto acid used to synthesize the corresponding indolenin is different from that disclosed in the publications [WO 02/26891 Al; EP1211294 Al).
  • the compounds of the invention are distinguished by:
  • a distinctive feature of dyes (B) from dyes, which are disclosed in the above publications, is the following: 1) 2 methylene groups are separated from the reactive carboxyl group from the indolenin fragment, and not one or the absence thereof, as in the above analogues; 2) the method for producing the intermediate product - indolenine containing a carboxyl function used for the synthesis of the corresponding dyes, is different from that disclosed in the publications (Mapk A.JG et al, Apal. Chem., 1995, vol. 67, pp. 1742-1748; Soothwisk et al., Satoteru, 1990; 11 (3): 418-30; Lip Y. Et al., Biocop. Chet., 2002, vol. 13, pp. 605-610).
  • the compounds of the invention are distinguished by:
  • the value of the coefficient of molecular extinction of the dye (B5) is about 200,000 (table 1, Fig. 2). Quantum yield of fluorescence in methanol for (B4) is 0.19, and for (B5) it is 0.17 (table 1, Fig. 3).
  • the detection sensitivity of dye-labeled oligonucleotides (B5) on a portable fluorescence biochip image analyzer with a semiconductor laser light source (655 nm / 690 nm, 40 mW) is 5xO "18 mol.
  • monosulfonated (electrically neutral) compounds (Al) - (A9), (Bl) - (VZ) are limitedly soluble in water; disulfonated electronegative) compounds (AlO) - (A22), (B4) - (B6) are well soluble in water; trisulfonated (twice electronegative) (A23) - (A29), (B7) and tetrasulfonated (triple electronegative) (AZO) are very soluble in water.
  • indodicarbocyanine dyes of formulas (A) and (B) are optimal for labeling biomolecules, since the biomaterial in the wavelength range between 600-800 nm has low intrinsic fluorescence. It is economically feasible to use inexpensive semiconductor lasers as a light source for them. In this case, a high fluorescent signal is observed.
  • the lower sensitivity threshold of oligonucleotides marked with dye (AlO) and located in the hydrogel cells of the biological microarray reaches 3 attomol (3xlO * 18 mol).
  • the dyes of formula (I) do not affect the stability of all other components of the analysis.
  • a dye of the formula (AlO) does not affect the stability of all other components of the working mixtures and solutions of the diagnostic test system when they are stored at room temperature for 1 year.
  • the concept of sensitivity of fluorescence analysis is determined by the absolute sensitivity of the label, which can be represented by the product of the molecular extinction coefficient and the fluorescence quantum yield ( ⁇ * ⁇ ).
  • the absolute sensitivity of indodicarbocyanines (A1-A30, Bl-B7) was determined at the corresponding maxima of absorption and fluorescence in methanol and phosphate-saline aqueous solutions. The values were normalized to the maximum value obtained for the dye (AZO) in PBS (table 1).
  • Dyes AlO, A22, A23, A25, ⁇
  • dyes AlO, A22, A25, A29, ⁇
  • PBS Fig. 4
  • the relative fluorescence efficiency at the wavelength of excitation and registration of the device (635 nm / 670 nm) was also determined. It turned out that in methanol the highest values correspond to dyes (Al, AlO, AIl, A23), and in PBS - (AlO, A22, A25, A29, AZO) (table 1, Fig. 6).
  • inventive dyes of the formulas (A) and (B) are suitable for use as fluorescent tags for conducting hybridization analysis using biological microarrays.
  • Another object of the invention is a method for producing a compound according to the invention (Scheme 2).
  • one indin deerin was introduced into the condensation reaction.
  • the progress of the reaction was monitored spectrophotometrically, with the disappearance of the ⁇ max 237 and 280 nm peaks characteristic of indolenins and the appearance of a new signal ⁇ max 440 nm characteristic of the intermediate.
  • heating at 118 ° C for 1-3 hours is sufficient.
  • indodicarbocyanine was carried out in two different ways - using diisopropylethylamine or anhydrous potassium acetate as a condensing agent. All synthesized indodicarbocyanines were isolated by reverse phase chromatography in the acetonitrile-0.05M TEAA system by gradient elution from 0 to 50% acetonitrile. Then, their sodium salts, succinimide or paranitrophenyl ethers were obtained. The yield of indodicarbocyanines was from 4 to 72%, depending on the structure of the compound.
  • the preparation methods for different dyes differ in the order of mixing of the reagents, the type of condensing agent, the ratio of solvents, temperature and reaction time.
  • Another object of the invention is a method for producing intermediates and precursors of compounds of the invention (Schemes 3-19).
  • the starting compound for the synthesis of indolenin (6) containing a functional group in the 3 position is 6-methyl-7-oxo-octanoic acid (5) (Scheme 3).
  • Acetylation of cyclohexanone was carried out by 2 methods. Direct acetylation of cyclohexanone using acetic anhydride and a complex of trifluoride boro-acetic acid and acetylation through 1 - morpholino-cyclohexene (1).
  • 2-Acetyl-2-methylcyclohexanone was obtained by the action of methyl iodide on a solution of 2-acetylcyclohexanone (2) in methyl alcohol.
  • keto acid methyl ester was synthesized using lithium methylate (4).
  • the starting compound for the synthesis of indolenin containing a functional group in the 5th position is p-carboxyethylphenylhydrazine hydrochloride (19) (Scheme 10).
  • Nitrile (15) was obtained from p-nitroaniline by the action of a solution of acrylonitrile in acetone on the diazonium salt formed during the reaction.
  • I-nitrocinnamic acid nitrile (16) was obtained by boiling a water-ethanol solution of propionic acid nitrile (15) in the presence of sodium acetate.
  • i-Nitrocinnamic acid (17) was obtained by acid hydrolysis of the corresponding nitrile.
  • I-carboxyethylphenylhydrazine hydrochloride (19) was obtained by reduction in the acidic medium of the diazonium salt, which was formed during reactions.
  • the carboxyethyl derivative of trimethylindolenine (20) was obtained from p-carboxyethylphenylhydrazine hydrochloride (19) and methyl isopropylketone in glacial acetic acid in the presence of potassium acetate without isolating the hydrazone formed during the reaction.
  • Polymethine bridges were prepared as follows (Scheme 19). The reaction of ethyl vinyl ether and triethyl orthoformate in the presence of boron trifluoride etherate gave tetraethyl acetal malonic aldehyde (36). Further, under the action of aniline hydrochloride, compound (37) was obtained.
  • Another object of the invention are methods of using compounds of the general formula (I) as fluorescent dyes for the analysis of biologically macromolecules.
  • the indicated application is as follows.
  • Hybridization analysis using fluorescently-labeled primers is carried out as follows. Chemically, on an automatic DNA synthesizer, oligonucleotides, primers containing a 5 'end of the oligonucleotide, a phosphate group with an aliphatic aminoline are obtained. The structure of the primer corresponds to the structure of the plot of the putative DNA molecule to be analyzed. Then the oligonucleotide with aminoline is labeled with one of the dyes (A) or (B). Dyes are used in the form of the corresponding active derivatives - 7V-hydroxycyccinimide or ⁇ - ⁇ -nitrophenyl ethers.
  • the reaction is carried out in a carbonate-bicarbonate buffer solution in a mixture of an organic solvent with water.
  • the fluorescently-labeled primers obtained in this way are used in the polymerase chain reaction (PCR). No inhibitory effect of markers was found. If the structure of the analyzed DNA corresponds to the structure of the primers used, then the production, amplification, of the PCR product occurs.
  • the fluorescently-labeled amplicon is hybridized on a microchip. According to the results of hybridization of labeled oligonucleotides on microarrays, it follows that a dye containing sulfo groups has a greater signal and discrimination value compared to hydrophobic dyes.
  • the microchip represents hydrogel cells located on a substrate with oligonucleotide probes immobilized inside the cells.
  • the cell diameter is approximately 100 microns.
  • oligonucleotide probes of various structures In cells in which the structure of the probe corresponds to the structure of the amplicon, the amplicon binds to a durable complex, duplex. In those cells in which the structure of the probe does not correspond to the structure of the amplicon, amplicon binding does not occur.
  • the results of the analysis are evaluated by the intensity of the fluorescent signals in the cells of the biochip. In the cells in which the fluorescently-labeled amplicon binds to the probe, an intense fluorescence signal is observed. To register signals using a fluorescence microscope equipped with a computer with special software.
  • the inventive dyes are characterized by extremely high registration sensitivity up to 3 attol (3 * 10 ⁇ 18 mol);
  • the relative light fastness of the claimed dyes is higher for dyes not containing substituents in the phenyl ring of the indolenin fragment of the dye.
  • inventive indodicarbocyanine dyes (A1-A30, B1-B7) can be successfully used as fluorescent markers in a hybridization analysis on biological microarrays, both oligonucleotide and protein.
  • Another object of the invention are intermediates for the synthesis of compounds of the invention, selected from the group consisting of: 2,3-dimethyl-3- (4-carboxybutyl) indolene (compound 6); potassium salt of 2,3-dimethyl-3- (4-carboxybutyl) -5-sulfoindolenin (compound 8); 3- (4-carboxybutyl) -2,3,5-trimethylindolene (compound 10); 5-carboxyethyl-2,3,3-trimethylindolelenine (compound 20); 2,3-dimethyl-3- (4-carboxybutyl) -7V-ethylindoleninium iodide (compound 21); 2,3-dimethyl-3- (4-carboxybutyl) -N- (4-sulfobutyl) indolene (compound 22); 3- (4-carboxybutyl) -N- (4-sulfobutyl) -2,3,5-trimethyl
  • reaction mass is kept for 12 h at room temperature.
  • reaction mass is transferred to a round bottom flask equipped with a reflux condenser and a mechanical stirrer, a solution of concentrated hydrochloric acid (50.4 ml) in water (126 ml) is added, and the mixture is boiled with continuous stirring for 5 hours.
  • Method B In a two-necked heart-shaped flask equipped with a reflux condenser and a mechanical stirrer, place cyclohexanone (5.2 ml; 4.9 g; 0.05 mol) and acetic anhydride (9.5 ml; 10.2 g; 0.1 mole). The reaction mass is cooled and BF 3 * 2CH 3 COOH complex (13.9 ml; 18.8 g; 0.1 mol) is added in one go. The mixture was stirred at room temperature for one day. Then, in a round-bottom flask equipped with a reflux condenser and a mechanical stirrer, three-water sodium acetate (27.2 g; 0.2 mol) and water (150 ml) are placed.
  • reaction mixture is transferred from the heart-shaped flask into the resulting solution, and the emulsion is boiled under vigorous stirring for 3 hours.
  • the reaction mixture is extracted with ether (3 * 80 ml).
  • the ether extracts were combined, washed with saturated sodium hydrogen carbonate solution until until gas ceases to stand out, and dried MgSO 4.
  • a nitrite solution is added dropwise sodium (20.6 g; 0.3 mol) in water (60 ml) at such a rate that the temperature of the reaction mass does not rise above 5 ° C. Then the resulting solution is filtered off and with vigorous stirring, a solution of tin chloride (124 g; 0.65 mol) in concentrated hydrochloric acid (124 ml) is added to a solution cooled to 5 ° C. The precipitate was collected on a filter, suspended in water (500 ml) and made basic with 40% sodium hydroxide solution to pH 12.
  • 5-Cylpho-2,3,3-trimethylindolenein (4.77 g; 0.02 mol) was dissolved by heating in methanol (25 ml). To the resulting solution was added dropwise a solution of potassium hydroxide (1.35 g; 0.024 mol) in methanol (16 ml). Isopropyl alcohol (50 ml) is then added. The precipitate is filtered off, dried in a vacuum desiccator over P 2 Os.
  • 5-Sulfo-2,3,3-trimethylindolelenine potassium salt (compound 1 1) is obtained in the form of brilliant plates of light beige color with a yield of 4.7 g (85%). ⁇ ma ⁇ 260 nm.
  • reaction mixture is extracted with diethyl ether (3 * 200 ml).
  • the ether extracts are dried with magnesium sulfate.
  • a stream of dry hydrogen chloride is passed through an ether solution of 2,4-xylyl hydrazine.
  • the precipitate formed is filtered off, washed with ether and dried in a vacuum desiccator over P 2 O 5 .
  • 2,4-Xylylhydrazine hydrochloride (compound 13) is obtained in a yield of 18.5 g (35.8%). ⁇ max 281 nm.
  • Mass spectrum (MALDI) (CgH] 2 N 2): found m / z 137.2, calculated m / z 136.19.
  • Example 14 Obtaining 2, 3, 3, 5, 7-pentamethylindolenine (compound 14).
  • Method A A mixture of nitrile and-nitrocinnamic acid (compound 16) (17.4 g; 0.1 mol) and concentrated phosphoric acid (350 ml) was heated at 150 ° C for 2 hours. After cooling to room temperature, the mixture was transferred to ice water (4 l). The resulting precipitate was filtered off and dried. Obtain 18.3 g of technical product 17. The technical product is dissolved in 1 l of 0.12 M sodium hydroxide and treated with charcoal (3.5 g). The resulting solution was filtered, and concentrated hydrochloric acid was added dropwise to the filtrate to a pH of ⁇ 2. The precipitate which separated out was collected by filtration, washed with water, dried at 90 ° C. 17.7 g (92%) of i-nitrocinnamic acid (compound 17) were obtained as yellow needles. Mp 283.5 ° C.
  • I-carboxyethylphenylhydrazine hydrochloride (compound 19) (216 mg; 1 mmol), anhydrous potassium acetate (196 mg; 2.0 mmol), 3-methyl-2-butanone (147 ⁇ l; 118.1 mg; 1) are placed in a glass vial , 37 mmol), acetic acid (1 ml) and heated for 1 h at 1 18 0 C. Then the solvents are removed, the residue is dissolved in chloroform, washed with water, saturated sodium chloride solution and dried with sodium sulfate. Chloroform is removed, and the oily residue is recrystallized from a mixture of ethyl acetate: hexane, 1: 10.
  • Example 25 Obtaining the potassium salt of 2,3-dimethyl-3- (4-carboxybutyl) -. / V- (4-sulfobutyl) -5-sulfo-indolenine (compound 25)
  • the potassium salt of 2,3-dimethyl-3- (4-carboxybutyl) -5-sulfoindolenine (compound 8) (0.6 g; 1.65 mmol) and 1.4-butanesultone (1.0 ml) are placed in a glass vial. .
  • the suspension is heated at 11 ° C for 50 hours.
  • the reaction mixture cooled to room temperature is triturated with diethyl ether.
  • the precipitate formed is collected on a filter, washed with diethyl ether and dried in a vacuum desiccator over P 2 Os.
  • Ethyl orthoformate (50.0 ml; 44.55 g; 0.3 mol) and boron trifluoride etherate (0.5 ml) are placed in a three-necked flask equipped with a reflux condenser, a mechanical stirrer, a thermometer and a dropping funnel.
  • Vinyl ethyl ether (27 ml; 20.3 g; 0.28 mol) is added dropwise to the reaction mass heated to 3O 0 C so that the temperature of the mixture does not rise above 36-38 ° C.
  • anhydrous potassium carbonate (3 g; 0.02 mol) was added to the reaction mass and stirred at room temperature for another 2 hours.
  • Malonic dialdehyde dianyl hydrochloride (compound 37) is obtained in the form of orange-yellow small crystals with a yield of 4.2 g (89%).
  • Mass spectrum (MALDI) (Ci 5 Hi 5 N 2 + ): found m / z 224.5, calculated m / z 223.29 ⁇ -NMR (DMSO-db), ⁇ (ppm): 6.48 (2H, t, ⁇ -CH), 7.4 (UN, s, ArH), 8.9 (2H, t, ⁇ , ⁇ '-CH), 12.49 (2H, d, NH)
  • Example 38 Obtaining 3- (4-carboxybutyl) -. / V- (4-sulfobutyl) -3,3 ', 3' - trimethyl-TV'-ethylindodicarbocyanine (compound Al)
  • the reaction products are preliminarily purified by flash chromatography on an RP-18 column. Then, the target compound is isolated by reverse-phase chromatography on an RP-18 column in the system of acetonitrile-0.05 M triethlammonium acetate (TEAA) by gradient elution from 0 to 50% acetonitrile.
  • TEAA triethlammonium acetate
  • the solvents are removed, and the residue is diluted with water, again applied to an RP-18 column, washed with 0, IM NaCl solution, water, then isolated by reverse phase chromatography in acetonitrile-water by gradient elution from 0 to 50% acetonitrile.
  • the solvent was removed in vacuo, the residue was dried in a vacuum desiccator over P 2 O 5 .
  • Example 39 Obtaining 3- (4-carboxybutyl) - / V- (4-sulfobutyl) -3,3 ', 3', 5'-tetramethyl-UV'-ethylindodicarbocyanine (compound A2)
  • Example 40 Obtaining 3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3', 5 ', 7'-pentamethyl-N- (4-sulfobutyl) -N'-ethylindinedocobocyanine (compound AZ)
  • Example 43 Obtaining 3,3 ', 3', 5,5 ', 7'-hexamethyl-3- (4-carboxybutyl) -N- (4-cyclophobyl) -N'-ethylindinedocobocyanine (compound A6)
  • Example 46 Obtaining 7V, N'-diethyl-3- (4-carboxybutyl) -5-sulfo-3,3 ', 3' - trimethylindodicarbocyanine (compound A9)
  • the reaction products are preliminarily purified by flash chromatography on an RP-18 column. Then, the target compound is isolated by reverse phase chromatography in an acetonitrile-0.05M TEAA system by gradient elution from 0 to 50% acetonitrile. The solvents are removed, the residue is diluted with water, again applied to an RP-18 column, washed with O, 1M NaCl, water, then isolated by reverse phase chromatography in an acetonitrile-water system by gradient elution from 0 to 50% acetonitrile. The solvents are removed in vacuo, the residue is dried in a vacuum desiccator over P 2 O 5 .
  • Example 47 Obtaining the sodium salt of ./V, ⁇ ' ' -di (4-cylobutythyl) -3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3' -trimethylindodicarbocyanine (compound Al 0)
  • Example 48 Obtaining the sodium salt of 3- (4-carboxybutyl) - / V- (4-sulfobutyl) -5 '-cylpho-3.3', 3 ', -trimethyl-N'-ethylindinedocobocyanine (compound AI l)
  • Example 49 Obtaining the sodium salt of N, N'-di (4-cylobobyl) -3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3', 5 '-tetramethylindodicarbocyanine (compound Al 2)
  • Example 50 Obtaining the sodium salt of iV, ⁇ f'-di (4-cyfobutyl) -3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3', 5 ', 7' -pentamethylindodicarbocyanine (compound A 13)
  • Example 52 Obtaining the sodium salt of 3- (4-carboxybutyl) -5-sylpho-iV- (4-sylphobutyl) -3,3 ', 3', 5 '-tetramethyl-N'-ethylindodicarbocyanine (compound Al 5)
  • Example 53 Obtaining the sodium salt of 3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3', 5 ', 7'-pentamethyl-5-sylpho-jV- (4-sulphobutyl) -N'-ethylindinedocarbocyanine (compound A16)
  • Example 54 Obtaining the sodium salt of ⁇ . / V'-di (4-sulfobutyl) -3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3', 5-tetramethylindicarbocyanine (compound Al 7)
  • Example 55 Obtaining the sodium salt of 3- (4-carboxybutyl) -N- (4-cyclobutyl) -5 '-cylpho-3.3', 3 ', 5-tetramethyl-N'-ethylindinedocobocyanine (compound A18)
  • Example 56 Obtaining the sodium salt of ⁇ N'-di (4-cybobutyl) -3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3', 5,5'-pentamethylindodicarbocyanine (compound Al 9)
  • Example 57 Obtaining the sodium salt of 3.3 ', 3', 5.5 ', 7'-hexamethyl-jV. / V'-di (4-sulfobutyl) -3 - (4-carboxybutyl) -indicarbocyanine (compound A20 )
  • Example 58 Obtaining the sodium salt of 3- (4-carboxybutyl) -N '- (4-cyclofuobyl) -5-cylpho-3,3', 3 '-trimethyl-TV-ethylindodicarbocyanine (compound A21)
  • Example 59 Obtaining the sodium salt of 5,5'-dicylpho-N, 7V'-diethyl-3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3' -trimethylindodicarbocyanine (compound A22)
  • Example 60 Obtaining the disodium salt of N, ⁇ g '-di (4-cybyl-butyl) -3- (4-carboxybutyl) -5' -cyl-3,3 ', 3' -trimethylindodicarbocyanine (compound A23)
  • Disodium salt ⁇ f ⁇ f'-di (4-cybylbutyl) -3- (4-carboxybutyl) -5 '-sulfo-3,3', 3 '-trimethylindodicarbocyanine (compound A23) is obtained analogously to the synthesis Lf. / V'-diethyl-3- (4-carboxybutyl) -5-sulfo-3,3 ', 3' -trimethylindodicarbocyanine
  • Example 61 Obtaining the disodium salt of N, iV'-di (4-cybyl-butyl) -3- (4-carboxybutyl) -5-cyl-3,3 ', 3' -trimethylindodicarbocyanine (compound A24)
  • Example 62 Obtaining disodium salt of 5,5'-dicylpho-3- (4-carboxybutyl) - N- (4-cylobutyl) -3,3 ', 3-trimethyl-N'-ethylindodicarbocyanine (compound A25)
  • the disodium salt of 5,5-dicylpho-3- (4-carboxybutyl) -N- (4-cylo-butyl) -3,3 ', 3'-trimethyl-N'-ethylindinedocobocyanine (compound A25) is obtained analogously to the synthesis of UV, N'- diethyl-3- (4-carboxybutyl) -5-sulfo-3,3 ', 3' - trimethylindodicarbocyanine (compound A9) in the following reagent ratios: (1 stage) potassium salt of 2,3-dimethyl-3- (4-carboxybutyl ) -.
  • Example 63 Obtaining the disodium salt of N, N'-di (4-cybobutyl) -3- (4-carboxybutyl) -5-sulfo-3,3 ', 3', 5 '-tetramethylindodicarbocyanine (compound A26)
  • the disodium salt of N, N'-di (4-cypbutybyl) -3 - (4-carboxybutyl) -5-sulfo-3.3 ', 3', 5 '-tetramethylindodicarbocyanine (compound A26) is obtained analogously to synthesis ./V, jV'-diethyl-3- (4-carboxybutyl) -5-sulfo-3,3 ', 3' - trimethylindodicarbocyanine (compound A9) in the following reagent ratios: (1 stage) potassium salt of 2,3-dimethyl-3- ( 4-carboxybutyl) -.
  • Disodium salt was prepared N, ⁇ g '-di (4-cylfobytil) -3- (4-kapbokcibytil) - 3,3', 3 ', 5', 7'-pentametil-5-cylfoindodikapbotsianina (compound A27) in a yield of 7 mg (4%). Spectral characteristics see table. Mass spectrum (MALDI) (Cs9H 5 oN 2 ScSs 2 ⁇ ): found m / z 820.5, calculated m / z 819.02.
  • Example 65 Obtaining disodium salt of ⁇ . / V'-di (4-cybyl-butyl) -3- (4-carboxybyl) -5 '-cyl-3.3', 3 ', 5-tetramethylindicarbocyanine (compound A28)
  • Example 66 Obtaining disodium salt of 5,5'-dicylpho-3- (4-carboxybutyl) - ⁇ f '- (4-cyclophobyl) -3,3', 3 '-trimethyl-iV-ethylindodicarbocyanine (compound A29)
  • Example 67 Obtaining the trisodium salt of 5,5'-dicylpho-7V, 7V'-di (4-sulfobutyl) -3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3' -trimethylindodicarbocyanine (compound AZO)
  • the trisodium salt of 5,5'-dicylpho-7V, N'-di (4-sulphobutyl) -3- (4-carboxybutyl) -3,3 ', 3' -trimethylindodicarbocyanine (AZO compound) is obtained analogously to the synthesis of ⁇ fjV'-diethyl 3- (4-carboxybutyl) -5-sulfo-3,3 ', 3' - trimethylindodicarbocyanine (compound A9) in the following reagent ratios: (1 stage) potassium salt of 2,3-dimethyl-3- (4-carboxybutyl) - iV- (4- sulphobutyl) -5-sylphoindolenin (compound 25) (99.9 mg; 0.2 mmol), malonic dialdehyde dianyl hydrochloride (compound 37) (51.8 mg; 0.2 mmol), acetic anhydride (700 ⁇ l),
  • Example 69 Obtaining N, N'-diethyl-5-carboxyethyl-5'-sulfo-3,3,3 ', 3 - tetramethylindodicarbocyanine (compound B2)
  • ⁇ N'-Diethyl-5-carboxyethyl-5'-sylphoindio-dicarbocyanine (compound B2) is prepared analogously to the synthesis of ⁇ N'-diethyl-3- (4-carboxybutyl) -5-cylpho-3,3 ', 3', trimethylinodicarbocarbon ) with the following reagent ratios: (1 stage) 5-sylpho-2,3,3-trimethyl-N-ethylindolenein (compound 29) (53.3 mg; 0.2 mmol), malano dialdehyde dianyl hydrochloride (compound 37) ( 58.7 mg; 0.23 mmol), acetic anhydride (1.5 ml), acetic acid (0.5 ml); (2 stage) 5-carboxyethyl-2,3,3-trimethyl -.
  • Example 70 Preparation of 5-carboxyethyl -. / V 7 -cylphobythyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl -. / V-ethylindodicarbocyanine (Compound B3)
  • Example 71 Obtaining the sodium salt of 7V. / V'-dicylphobyl-5-carboxyethyl-3,3,3 ', 3', 5'-pentamethyldindicarbocyanine (compound B4)
  • Example 72 Obtaining the sodium salt of N, N'-dicylphobythyl-5-carboxyethyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindicarbocyanine (compound B5)
  • Example 73 Obtaining the sodium salt of 5-carboxyethyl-5'-sylpho -. / V-sylphobythyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl- ⁇ f'-ethylindodicarbocyanine (compound B6)
  • Example 74 Obtaining the disodium salt of N, N'-dicylphobutyl-5-carboxyethyl-5'-sulfo-3,3,3 ', 3'-tetramethylindodicarbocyanine (compound B7)
  • Example 75 Obtaining hydroxysuccinimide esters of sodium salts of indodicarbocyanine dyes (Al-AZO)
  • Example 76 Obtaining hydroxysuccinimide esters of sodium salts of indodicarbocyanine dyes (B1-B7)
  • Example 77 Labeling of an oligonucleotide
  • the stained oligonucleotide is isolated by HPLC, control is carried out at a wavelength of 254 nm, a flow rate of 1 ml / min, gradient elution from 20% of system B in system A to 100% B in 30 minutes, where A is 0.1 M TEAA, B is 50% acetonitrile solution in A.
  • the stained oligonucleotide is dried in vacuum at 4O 0 C. The yield of labeled oligonucleotide is -70%.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ИНДОЦИАНИНОВЫЕ КРАСИТЕЛИ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ ДЛЯ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение касается флуоресцентных индоцианиновых красителей и их производных для анализа биологических макромолекул. Кроме того, изобретение касается способа получение указанных соединений.
Уровень техники, к которой относится изобретение
Флуоресцентное маркирование является одним из способов выявления результатов биологического анализа в иммунологическом и гибридизационном анализе, в частности, в технологии биологических микрочипов, в микроскопической цитометрии, в проточном цитометрическом сортинге и т.д. Во всех этих методах анализируемое соединение первоначально выявляют с помощью комплементарного соединения. Затем количество образовавшихся специфических комплексов измеряют по интенсивности флуоресценции метки.
Известно, что флуорофорное ядро полиметиновых красителей состоит из двух гетероциклических фрагментов, соединенных сопряженной полиметиновой цепочкой атомов. Максимумы поглощения и флуоресценции флуорофора сильно зависят от длины полиметиновой цепочки и природы гетероциклических фрагментов и в меньшей степени - от природы заместителей и места их связывания с флуорофором. Коэффициент молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции, т.е. способность поглощать энергию и флуоресцировать, сильно зависят от молекулярного окружения флуорофора, от типа заместителей и места их присоединения к флуорофору.
Красители, имеющие реактивные химические группы, т.е. способные после активации превращаться в активные группы и ковалентно связываться с другими молекулами, используются в биологических анализах для флуоресцентного маркирования биомолекул, белков, нуклеиновых кислот и др. Чаще всего для этих целей используют карбоксильную группу (-COOH), которую связывают с аминогруппой биомолекулы.
В зависимости от способов постановки и регистрации результатов анализа требования к свойствам флуоресцентной метки несколько различны. К числу общих требований относятся следующие:
1. метка не должна препятствовать образованию максимального количества специфических комплексов анализируемого соединения и флуоресцентно меченого зонда;
2. метка должна обеспечить максимальную чувствительность и точность инструментальной регистрации количества образовавшихся специфических комплексов;
3. процедура получения маркированных препаратов, используемых в анализе, должна быть воспроизводимой и методически не сложной;
4. свойства препаратов в процессе маркирования должны максимально сохраняться, ухудшение должно быть минимальным.
Полиметиновые красители являются производными индола, индоцианиновые красители, и отличаются высокой эффективностью, яркостью флуоресценции в сочетании с удовлетворительной химической стабильностью и светостойкостью.
Для связывания с биомолекулами в молекулу индоцианинового красителя вводят реактивную карбоксильную группу. Однако свойства биомолекул, маркированных различными флуоресцентными метками на основе одного флуорофора, сильно различаются между собой. Природа заместителей и места их связывания с флуорофором влияют на растворимость, образование молекулярных агрегатов, яркость флуоресценции маркированных биомолекул и их специфических комплексов. Ориентация метки флуорофора относительно маркированной биомолекулы и длина полиметиленовой цепочки, отдаляющей флуорофор от биомолекулы, существенно сказываются на неспецифическом связывании маркированных биомолекул. В итоге заместители, входящие в молекулу флуоресцентной метки, существенно влияют на чувствительность биоанализа в целом.
Заранее предсказать природу заместителей и места их связывания с флуорофором с целью получения наиболее эффективной флуоресцентной метки невозможно. С целью поиска новых эффективных флуоресцентных меток в известные флуорофоры вводят различные заместители, изменяют места присоединения реактивной карбоксильной группы к гетероциклическому фрагменту флуорофора, изменяют длину полиметиленовой цепочки, отдаляющей карбоксильную группу от флуорофора. Индоцианиновые красители получают конденсацией двух, одинаковых или различных, индоленинов и полиметинового предшественника (схема 1). Затем следует процедура выделения и очистки целевого продукта из реакционной массы сложного состава.
Figure imgf000004_0001
Индоленины, содержащие различные не реактивные заместители - алкильные-, сульфо-, сульфоалкильные, конденсированные арильные, известны давно. Также известны полиметиновые предшественники.
Каждый новый карбоксилсодержащий индоленин служит основой для получения нового ряда индоцианиновых красителей с различными заместителями и соответственно с различными свойствами.
В публикациях (Маdеr О. еt аl, Вiосопjиgаtе Сhет, 2004, vоl. 15, рр.70-78; Мапк А.J.G. еt аl, Апаl. Сhет., 1995, vоl 67, рр. 1742-1748; Миjитdаr R.B., еt аl, Вiосоjисg. Сhет. 1993, vоl. 4, No.2. рр.105-111) описаны индоцианиновые красители, у которых реактивная карбоксильная группа присоединена в 1 положении индоленинового фрагмента - к гетероциклическому атому азота через полиметиленовую цепочку атомов (R3=-(CH2)5COOH, где Ri, R2, R4, R5, R6 - различные алкильные-, сульфо-, сульфоалкильные и конденсированные арильные заместители).
В публикациях {Мапк А.J.G. еt аl, Апаl. Сhет. ,1995, vоl. 67, рр. 1742-1748; Sоиthwiск еt аl, Суtотеtrу, 1990;ll(3):418-30; Liп Y. Et аl, Вiосопjис. Сhет., 2002, vоl. 13, рр. 605-610) описаны индоцианиновые соединения, у которых реактивная карбоксильная группа присоединена в 5 положении индоленинового фрагмента непосредственно и через один метилен (R2=-COOH и -CH2COOH, где Ri , R3, R4, R5, R6 - различные алкильные-, сульфо-, сульфоалкильные и конденсированные арильные заместители). В публикациях (WO 02/26891 Al; EP 1211294 Al) описаны индоцианиновые красители, у которых реактивная карбоксильная группа присоединена в 3 положении индоленинового фрагмента через пентаметиленовую цепочку атомов ( Ri = -(CH2)5COOH, где Ri, R2, R4, R5, R6 - различные алкильные-, сульфо-, сульфоалкильные и конденсированные арильные заместители).
Однако выше указанные красители имеют некоторые недостатки. В частности, если реактивная группа R3 красителя присоединена к 1 положению индоленинового фрагмента, то она расположена в одной плоскости с заместителем R4 и испытывает стерические затруднения со стороны этой группы. Соответственно зонд (биомолекула), присоединенный к карбоксильной группе, расположенной на заместителе R3, также будет испытывать стерические затруднения со стороны заместителя R4, что может препятствовать образованию максимального количества специфических комплексов анализируемого соединения и флуоресцентно-меченого зонда.
Аналогичные недостатки и для красителей, у которых реактивная карбоксильная группа R2 присоединена в 5 положении индоленинового фрагмента непосредственно и через один метилен R2= -COOH и -CH2COOH. Зонд, присоединенный к карбоксильной группе, расположенной на заместителе R2, будет находиться в непосредственной близости от объемного флуорофора, что также может препятствовать образованию максимального количества специфических комплексов анализируемого соединения и флуоресцентно меченого зонда.
Красители с реактивной группой Ri, присоединенной в 3 положении индоленинового фрагмента через пентаметиленовую цепочку атомов Ri= -(CH2)5COOH тоже имеют свои недостатки. Пентаметиленовая цепочка, отдаляющая флуорофор от реактивной карбоксильной группы, сильно гидрофобна, что может привести к скручиванию этой цепочки в водных растворах, в которых производится биоанализ. Это приведет к тому, что зонд и молекула флуорофора будут находиться в непосредственной близости, что также может препятствовать образованию максимального количества специфических комплексов анализируемого соединения и флуоресцентно меченого зонда.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Нормированные спектры поглощения и флуоресценции: — краситель формулы (I) (Ri=-CH3, R3= -(CH2)5COOH, =-SO3 "; R4 -C2H5; R2=R5=R6=H) и краситель (AlO).
Фиг. 2. Коэффициенты молекулярной экстинкции красителей в метаноле и PBS. Фиг. 3. Квантовый выход флуоресценции красителей в метаноле и PBS.
Фиг. 4. Относительная эффективность флуоресценции красителей. Возбуждение и регистрация в максимумах поглощения и флуоресценции.
Фиг. 5. Относительная эффективность флуоресценции красителей. Возбуждение 655нм. Регистрация 690нм.
Фиг. 6. Относительная эффективность флуоресценции красителей. Возбуждение 635нм. Регистрация 670нм.
Фиг. 7. Зависимость интенсивности флуоресценции от времени при облучении красителей на биочипе полупроводниковым лазерным источником света (655 нм / 690 нм, 40 мВт): 1 - краситель (Bl); 2 - краситель (AlO); 3 - краситель (B6); 4 - краситель формулы (I) (R,=-CH3j R3= -(CH2)5COOH, =-SO3 "; R4^-C2H5; R2=R5=R6=H); 5 - краситель (B5); 6 - краситель формулы (I) (Ri-CH3, R2-SO3 ", R3= -(CH2)5COOH, R4^-(C2H)4SO3 ", R5=Re=-H); 7 - краситель формулы (I) (R,=-CH3, R3= -(CH2)5COOH, R4^-(C2H)4SO3 ", R2=R5=R6=-H); 8 - краситель (B4).
Фиг. 8. Определение сравнительной чувствительности обнаружения маркированных синтетических олигонуклеотидов на портативном флуоресцентном анализаторе изображений биочипов с полупроводниковым лазерным источником света (655 нм / 690 нм, 40 мВт): 1 - краситель формулы (I) (R3= -(CH2)5COOH, Ri=R5= -CH3, R2=Rб=-SO3 "; R4,= -C2H5); 2 - краситель формулы (I) (R,= -CH3, R3= -(CH2)5COOH, R4,= -C2H5; R2=R5=R6= -H); 3 - краситель (AlO); 4 - краситель (B5).
Фиг. 9. Обнаружение мутации микобактерии туберкулеза (лейцин 531) на микрочипах при использовании красителя формулы (I) (R]=CH3, R3=-(CH2)5COOH, - SO3 ", R4=C2H5; R2=R5=R6=H) и красителя (AlO).
Фиг. 10. Фотография и схема микрочипа после проведения анализа, где: 1 - концентрация белка А в геле (0.4 мг/мл), 2 - концентрация белка А в геле (0.2 мг/мл), 3 - концентрация белка А в геле (0.1 мг/мл), 4 - концентрация белка А в геле (0.05 мг/мл), 5 - концентрация белка А в геле (0.025 мг/мл), 6 - концентрация белка А в геле (0.013 мг/мл), 7 - концентрация белка А в геле (0.006 мг/мл), 8 - пустой гель.
Фиг. 11. Зависимость нормированного сигнала флуоресценции от концентрации иммобилизованного в геле белка А: 1 - краситель формулы I (Ri=-CH3, R2=Rs=R6-H; R3= -(CH2)5COOH, R4^-C2H5), 2 - краситель (AlO).
Сущность изобретения
Целью изобретения являются индоцианиновые красители, содержащие две гетероциклические кольцевые системы, связанные полиметиновой линкерной связью и содержащие карбоксильную группу, присоединенную к гетероциклическому фрагменту через полиметиленовую цепочку, для использования их в качестве флуоресцентных меток для биологических материалов. Такими соединениями, предлагаемыми в данном изобретении, являются соединения общей формулы (I).
Figure imgf000007_0001
где:
Ri представляет собой -CH3; -(CH2)4COOH;
R2 представляет собой -CH3; -(CH2)2COOH; -H; -SO3 ";
R3 представляет собой -C2H5; -(CH2)4SO3 ~;
R4 представляет собой -C2H5; -(CH2)4SO3 ~;
R5 представляет собой -H; -CH3;
R6 представляет собой -H; -CH3; -SO3 ".
В частности, соединения, условно отнесенные к соединениям группы А, соответствующие общей формуле (А)
Figure imgf000008_0001
где:
Ri представляет собой -(CH2)4COOH;
R2 представляет собой -H; -CH3; -SO3 ";
R3 представляет собой -C2H5;-(CH2)4SO3 ~
R4 представляет собой -C2Hs; -(CH2)4SO3 ~;
R5 представляет собой -H; -CH3;
R6 представляет собой -H; -CH3; -SO3 ";
а также соединения, условно отнесенные к соединениям группы В, соответствующие общей формуле (В)
Figure imgf000008_0002
где:
Ri представляет собой -CH3;
R2 представляет собой -(CH2)2COOH;
R3 представляет собой -C2H5; -(CH2)4SO3 ";
R4 представляет собой -C2H5; -(CH2)4SO3 ";
R5 представляет собой -H;
R6 представляет собой -H; -CH3; -SO3 "
Предлагаемые индоцианиновые красители (А) характеризуются тем, что их реактивная карбоксильная группа присоединена в 3 положении индоленинового фрагмента через тетраметиленовую цепочку атомов (Ri=-(CH2)4COOH, где R2, R3, R4, R5, R6 - алкильные-, сульфо- и сульфоалкильные заместители).
Предлагаемые индоцианиновые соединения (В) характеризуются тем, что их реактивная карбоксильная группа присоединена в 5 положении индоленинового фрагмента через диметиленовую цепочку атомов (R2=-(CH2)2COOH, где Ri, R2, R3, R4, R5, R6 - алкильные-, сульфо- и сульфоалкильные заместители).
Отличительной чертой красителей (А) от красителей, которые раскрыты в указанных выше публикациях, является следующее: 1) реактивную карбоксильную группу отделяют от индоленинового фрагмента четыре метиленовые группы, а не пять, как в перечисленных аналогах; 2) способ получения полупродукта - кетокислоты, используемого для синтеза соответствующего индоленина, отличен от такового, раскрытого в публикациях [WO 02/26891 Al; EP1211294 Al).
Указанные структурные отличия предлагаемых красителей (А) приводят к ряду неожиданных свойств у соединений по изобретению. Соединения по изобретению отличают:
- повышенная светостойкость, повышенная химическая устойчивость и термостойкость при использовании в качестве флуоресцентных меток для биомолекул в технологии биологических микрочипов, как нуклеотидных, так и белковых.
Показано, что при непрерывном облучении на флуоресцентном микроскопе на длине волны 655 нм время полураспада красителей формулы (I) сильно различается: для красителя (AlO) время полураспада составляет 7 ч, для красителя формулы (I) (Ri= -CH3; R2= -SO3 "; R3= -(CH2)5COOH, R4=^CHj)4SO3 "; R5=R6=-H) составляет 2,5 ч, для красителя формулы (I) (R,=-CH3; R2=R5=Rб=-H, R3= -(CH2)5COOH, R4= - (CH2)4SO3 ~) составляет 1,5 ч (фиг. 7).
- повышенная чувствительность регистрации флуоресценции при использовании в качестве флуоресцентных меток для биомолекул в технологии биологических микрочипов, как нуклеотидных, так и белковых.
Значения коэффициента молекулярной экстинкции красителей (Al), (AlO) и (A23) в метаноле превышают 240000, а красителей (AlO) и (АЗО) в водном фосфатно- солевом буферном растворе (PBS) превышают 230000 (таблица 1, фиг. 2), в то время как у красителя формулы (I) (Ri=-CH3, R2=R6=^O3 "; R3= -(CH2)5COOH, R4^C2H5; R5=-H) значения ε в метаноле и водном фосфатно-солевом буферном растворе составляют 167000 и 174000 соответственно. Квантовый выход флуоресценции красителей (A25) и (A29) в метаноле превышает 0.33, а красителей (A25) и (АЗО) в PBS больше 0.30 (таблица 1, фиг. 3), тогда как у красителя формулы (I) (Ri=-CH3, R2=R6=-SOз~; R3= -(CH2)SCOOH, R4=- C2Hs; R5=-H) значения Ф в метаноле и водном фосфатно-солевом буферном растворе составляют 0.32 и 0.27 соответственно.
Была определена относительная эффективность флуоресценции заявляемых красителей, при этом наибольшее значение эффективности получено для красителя (АЗО) в PBS при возбуждении и регистрации в максимумах поглощения и флуоресценции и принято за единицу (таблица 1, фиг. 4-6). Были получены следующие данные:
- при возбуждении и регистрации в максимумах поглощения и флуоресценции значение относительной эффективности флуоресценции превышает 0.80 для красителей (AlO), (A22), (A23), (A25) и (АЗО) в метаноле и для красителей (A22), (A25) и (АЗО) в PBS (таблица 1, фиг. 4), тогда как значения для красителя формулы (I) (Ri=-CH3, R2=Rб=-SO3 "; R3= -(CH2)5COOH, R4^C2H5; R5=-H) составляют 0.69 в метаноле и 0.67 в PBS;
- при возбуждении на длине волны 655 нм и регистрации на 690 нм значение относительной эффективности флуоресценции превышает 0.25 для красителей (A25) и (АЗО) в метаноле и больше 0.18 для красителей (A24) и (АЗО) в PBS (таблица 1, фиг. 5), в то время как значения для красителя формулы (I) (Ri-CH3, R2=Rб=-SO3 ~; R3= -(CH2)5COOH, R4^C2H5; R5=-H) составляют 0.18 в метаноле и 0.11 в PBS;
- при возбуждении на длине волны 635 нм и регистрации на 670 нм значение относительной эффективности флуоресценции превышает 0.50 для красителей (Al), (АН) и (A23) в метаноле и больше 0.45 для красителей (A22), (A25) и (АЗО) в PBS (таблица 1, фиг. 6), в то время как значения для красителя формулы (I) (Ri=- CH3, R2=R6=-SOз~; R3= -(CH2)5COOH, R4=^-C2H5; R5=-H) составляют 0.44 в метаноле и 0.38 в PBS;
Чувствительность регистрации олигонуклеотидов, маркированных красителем (AlO) и находящихся в гидрогелевых ячейках биологического микрочипа, на портативном флуоресцентном анализаторе изображений биочипов с полупроводниковым лазерным источником света (655 нм / 690 нм, 40 мВт) составляет ЗхlО"18 моль, а для красителей формулы (I) (Ri=-CH3, R2=R6^-SO3 "; R3= -(CH2)5COOH, R4^-C2H5, R5,=-H) и (R,=-CH3, R2=R5=R6=-H; R3= -(CH2)5COOH, R4 =^-C2H5) значение чувствительности регистрации составляет 5x10" моль (фиг. 8)
Указанные свойства красителей (Al)-(AЗO) чрезвычайно важны для флуоресцентного маркирования при практическом использовании в биоанализе.
Отличительной чертой красителей (В) от красителей, которые раскрыты в указанных выше публикациях, является следующее: 1) реактивную карбоксильную группу от индоленинового фрагмента отделяют 2 метиленовые группы, а не одна или отсутствие таковой, как в перечисленных аналогах; 2) способ получения полупродукта - индоленина, содержащего карбоксильную функцию, используемого для синтеза соответствующих красителей, отличен от такового, раскрытого в публикациях (Мапк А.J.G. еt аl, Апаl. Chem.,1995, vоl. 67, рр. 1742-1748; Sоиthwiск еt аl., Суtотеtrу, 1990; 11(3): 418-30; Liп Y. Et аl., Вiосопjис. Сhет., 2002, vоl. 13, рр. 605- 610).
Указанные структурные различия предлагаемых красителей (В) приводят к ряду неожиданных свойств у соединений по изобретению. Соединения по изобретению отличают:
- повышенная светостойкость, повышенная химическая устойчивость и термостойкость при использовании в качестве флуоресцентных меток для биомолекул в технологии биологических микрочипов, как нуклеотидных, так и белковых.
Показано, что при непрерывном облучении на флуоресцентном микроскопе на длине волны 655 нм время полураспада красителей формулы (I) сильно различается: для красителя (B6) время полураспада составляет 4,5 ч, для красителя формулы (I) (R,= -CH3; R2= -SO3 "; R3= -(CH2)5COOH, R4=-(CH2)4SO3 "; R5=R6=-H) составляет 2,5 ч, для красителя формулы (I) (R,=-CH3; R2=R5=R6=-H, R3= -(CH2)5COOH, R4= - (CH2^SO3 ") составляет 1,5 ч (фиг. 7).
- за счет увеличения длины полиметиленовой цепочки, и, соответственно, удаления флуорофорного ядра метки от маркируемой молекулы, повышается способность к образованию специфических комплексов;
- увеличивается чувствительность и точность инструментальной регистрации количества образовавшихся специфических комплексов.
Значение коэффициента молекулярной экстинкции красителя (B5) составляет около 200000 (таблица 1, фиг. 2). Квантовый выход флуоресценции в метаноле для (B4) равен 0.19, а для (B5) - 0.17 (таблица 1, фиг. 3). Квантовый выход флуоресценции в ацетонитриле для красителей формулы (I) (Ri= -CH3, R2= -COOH, R3= R4= -(CH2J4SO3 " R5=R6= -H) и (R1= -CH3, R2= -CH2COOH, R3= R4= -(CH2J4SO3- R5=R6= -H) равен 0.12 и 0.16 соответственно (Мапк А.J.G. еt аl, Апаl. Chem.,1995, vоl. 67, рр. 1742-1748).
Чувствительность регистрации олигонуклеотидов, маркированных красителем (B5), на портативном флуоресцентном анализаторе изображений биочипов с полупроводниковым лазерным источником света (655 нм / 690 нм, 40 мВт) составляет 5xlO"18 моль.
Предлагаемые красители структур (А) и (В) в зависимости от заместителей в гетероциклическом фрагменте различаются спектральным диапазонам возбуждения и флуоресценции, суммарным электрическим зарядом и растворимостью в воде (таблица 1). Например, моносульфированные (электронейтральные) соединения (Al) - (A9), (Bl) - (ВЗ) ограниченно растворяются в воде; дисульфированные электроотрицательные) соединения (AlO) - (A22), (B4) - (B6) хорошо растворяются в воде; трисульфированные (дважды электроотрицательные) (A23) - (A29), (B7) и тетрасульфированные (трижды электроотрицательные) (АЗО) очень хорошо растворяются в воде.
Благодаря спектральным характеристикам в ближнем ИК-диапазоне, индодикарбоцианиновые красители формул (А) и (В) являются оптимальными для маркирования биомолекул, так как биоматериал в диапазоне длин волн между 600- 800 нм имеет низкую собственную флуоресценцию. В качестве источника света для них экономически целесообразно использовать недорогие полупроводниковые лазеры. В этом случае наблюдается высокий флуоресцентный сигнал.
Высокоэффективное обнаружение различных мутаций становится возможным при использовании гибридизации анализируемой ДНК с набором олигонуклеотидов, иммобилизованных в гелевых ячейках микрочипа. Анализируемая ДНК предварительно маркируется флуоресцентным красителем. Результаты гибридизации регистрируются при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность результирующего флуоресцентного сигнала в каждой ячейке микрочипа пропорциональна количеству образовавшихся дуплексов.
Существуют промышленные полупроводниковые лазеры с длинной волны 655 нм и 635 нм, которые пригодны для пентаметиновых красителей формулы (I). При использовании в качестве источника света лазера с длиной волны 655 нм флуоресценцию регистрируют, применяя светофильтр с пропусканием 690-730 нм. Для лазера с длиной волны 635 нм флуоресценцию регистрируют, используя светофильтр с пропусканием от 670 нм и более.
Далее представлены результаты использования красителей для данного способа анализа. Все красители формулы (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7) в виде соответствующих /V-гидроксисукцинимидных эфиров (для (А) Ri=-(CH2)4COOSu; для (В) R2=-(CH2)2COOSu) и иύрα-нитрофениловых эфиров (для (A) Ri= -(CH2)4COOpNP; для (В) R2=-(CH2)2COOpNP) с хорошим выходом маркируют олиrонуклеотиды, содержащие по 5 '-концу фосфатную группу с алифатическим аминолинком. При проведении реакции в карбонат-бикарбонатном буферном растворе при рН 9,0-9,2 в смешанном водно-органическом растворителе выход коньюгатов составляет 70 - 80%.
Установлено, что все красители формулы (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7) в составе коньюгатов с олигонуклеотидами не ингибируют полимеразную цепную реакцию. Количество и состав продуктов реакции одинаковы для немаркированных и маркированных олигонуклеотидов и зависят только от прочих условий проведения реакции.
Установлено, что чувствительность регистрации результатов полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, маркированных красителями формулы (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7), зависит от спектральных характеристик красителя и соответствия их спектральным характеристикам регистрирующего прибора (флуоресцентного микроскопа). Красители формулы (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7) отличаются чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации. При использовании портативного флуоресцентного микроскопа, разработанного в ИМБ РАН, с полупроводниковым лазерным источником света (655 нм,40 мВт; регистрация 690 нм) нижний порог чувствительности олигонуклеотидов, маркированных красителем (AlO) и находящихся в гидрогелевых ячейках биологического микрочипа, достигает 3 аттомоль (ЗхlО*18 моль). Тогда как для красителей формулы (I) (Ri=-CH3, R2=R6-SOf; R3= -(CH2)5COOH, R4 -C2H5, R5,=-H) и (R,=-CH3, R2=R5=R6-H; R3= - (CH2)5COOH, R4J-C2H5) это значение составляет 5*10"18 моль (фиг. 8).
Установлено, что воспроизводимость результатов анализа зависит от гидрофильно-гидрофобных свойств красителей. Воспроизводимость значений результатов анализа увеличивается в ряду несульфированные < моносульфированные
< дисульфированные < трисульфированные < тетрасульфированные красители. Наименьшая воспроизводимость свойственна несульфированным красителям, а наибольшая - три- и тетрасульфированным красителям.
Найдено, что красители формулы (I), не влияют на стабильность всех остальных компонентов анализа. Так, например, краситель формулы (AlO) не влияет на стабильность всех остальных компонентов рабочих смесей и растворов диагностической тест-системы при их хранении при комнатной температуре в течение 1 года.
Установлено, что все красители формулы (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7) обладают стабильностью, достаточной для проведения полного цикла анализа без заметного разложения красителя.
По совокупности свойств: чувствительность, стабильность, минимальное влияние на биохимические свойства маркированных олигонуклеотидов и белков, удобство в работе все красители формулы (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7) могут быть использованы в качестве флуоресцентных меток при разработке диагностических тест-систем.
Флуоресцентные свойства заявляемых красителей (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7) представлены в таблице 1. Введение метильной группы в пятое и седьмое положение индоленинового цикла приводит к батохромному сдвигу спектров поглощения и флуоресценции. Что касается остальных сульфосодержащих красителей, то оказалось, что их спектральные характеристики лежат примерно в одном диапазоне (λmax 648 нм, λет 669 HM) (фиг. 1).
Для всех заявляемых индодикарбоцианиновых красителей (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7) был найден коэффициент молекулярной экстинкции в метаноле и в водном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) (10 ммоль/л калий фосфатный буфер, концентрация хлорида натрия 0.9%, рН 7.4). Данные представлены в таблице 1. Наибольшее значение коэффициента молекулярной экстинкции (ε) в метаноле (>2,2xlO~5) получено для индодикарбоцианинов (Al, A8, A10-A12, A17, A23). В фосфатно-солевом буферном водном растворе (PBS) максимальное значение ε имеют красители (AlO, A23, АЗО) (фиг. 2).
Для всех заявляемых индодикарбоцианиновых красителей (I) (Al) - (АЗО) и (Bl) - (B7) был найден квантовый выход флуоресценции в метаноле и в водном фосфатно-солевом буферном растворе (таблица 1, фиг. 3). Измерения проводили относительно красителя формулы (I) (Ri-CH3, R2=R6-SO3 "; R3= -(CH2)SCOOH, R4,=- C2H5, R5,=-H), для которого квантовый выход флуоресценции и в PBS равен 0.27 (Маdеr О., К. Rеidеr, H. -J. Еgеlhаааf, R. Fisсhеr, R. Вrоск, Strисtиrе Рrореrtiеs оf Репtатеthiпе Iпdосуапiпе Dуеs: Idепtifiсаtiоп оf а Nеw Dуеsfоr Ыfе Sсiепсе Аррliсаtiопs. Вiосопjиgаtе Сhет, 2004, vоl. 15, рр. 70-78). Наибольшее значение квантового выхода флуоресценции (φ) в MeOH (-0,3) оказалось у красителей (AlO, A22, A25, A29, АЗО), а в PBS максимальное значение φ имеют красители (AlO, A22, A25, A29, АЗО).
Понятие чувствительности флуоресцентного анализа определяется абсолютной чувствительностью метки, которую можно представить произведением коэффициента молекулярной экстинкции на квантовый выход флуоресценции (ε*φ). Таким образом, была определена абсолютная чувствительность индодикарбоцианинов (A1-A30, Bl- B7) в соответствующих максимумах поглощения и флуоресценции в метанольном и фосфатно-солевом водном растворах. Значения были нормированы на максимальное значение, полученное для красителя (АЗО) в PBS (таблица 1). Наибольшее значение абсолютной чувствительности в метаноле имеют красители (AlO, A22, A23, A25, АЗО), а в PBS наибольшие значения чувствительности у красителей (AlO, A22, A25, A29, АЗО) (фиг. 4).
В наличии имеются 2 прибора с промышленными полупроводниковыми лазерными источниками света — 635 нм / 670 нм (20 мВт), 655 нм / 690 нм (40 мВт), причем преимуществами последнего являются высокая мощность и относительно низкая себестоимость.
Для определения наиболее подходящих под настройку прибора красителей была измерена их относительная эффективность флуоресценции на длине волны возбуждения и регистрации прибора (655 нм / 690 нм). Оказалось, что в метаноле наибольшие значения соответствуют красителям (A25) и (АЗО), а в PBS - (A19, A22, A25, A29, АЗО) (таблица 1, фиг. 5).
Также была определена относительная эффективность флуоресценции на длине волны возбуждения и регистрации прибора (635 нм / 670 нм). Оказалось, что в метаноле наибольшие значения соответствуют красителям (Al, AlO, AIl, A23), а в PBS - (AlO, A22, A25, A29, АЗО) (таблица 1, фиг. 6).
Исходя из полученных данных, можно сделать следующий вывод. Заявляемые красители формул (А) и (В) пригодны для использования в качестве флуоресцентных меток для проведения гибридизационного анализа с помощью биологических микрочипов.
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Другим объектом изобретения является способ получения соединения по изобретению (схема 2).
Figure imgf000025_0001
Синтез несимметричных индодикарбоцианиновых красителей формул (А) и (В) основан на реакции конденсации солей индолениния, содержащих активную метиленовую группу, и хлоргидрата малонового диальдегида (таблицы 2-8). В ходе реакции кроме целевого соединения образуются еще два побочных симметричных продукта.
На первой стадии в реакцию конденсации вводили один инд оленин. Ход реакции контролировали спектрофотометрически, при этом происходило исчезновение пиков λmax 237 и 280 нм, характерных для индоленинов, и появление нового сигнала λтах 440 нм, характерного для промежуточного соединения. Для полного протекания реакции достаточно нагревания при 118°C в течение 1-3 ч.
Вторую стадию получения индодикарбоцианина осуществляли двумя разными способами - при использовании диизопропилэтиламина или безводного ацетата калия в качестве конденсирующего агента. Все синтезированные индодикарбоцианины выделяли обращенно-фазовой хроматографией в системе aцeтoнитpил-0.05M TEAA градиентным элюированием от О до 50% ацетонитрила. Далее получали их натриевые соли, сукцинимидные или пара- нитрофениловые эфиры. Выход индодикарбоцианинов составил от 4 до 72% в зависимости от структуры соединения.
Методы получения для различных красителей различаются по порядку смешения реагентов, типу конденсирующего агента, соотношению растворителей, температуре и времени проведении реакции.
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Другим объектом изобретения является способ получения полупродуктов и предшественников соединений по изобретению (схемы 3-19).
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Исходным соединением для синтеза индоленина (6), содержащего функциональную группу в 3 положении, является 6-мeтил-7-oкcooктaнoвaя кислота (5) (схема 3). Ацетилирование циклогексанона проводили 2 методами. Непосредственное ацетилирование циклогексанона при использовании уксусного ангидрида и комплекса трифторидбора-диуксусная кислота и ацетилирование через 1 - морфолино-циклогексен (1). 2-Aцeтил-2-мeтилциклoгeкcaнoн был получен действием метил иодида на раствор 2-aцeтилциклoгeкcaнoнa (2) в метиловом спирте. Затем при помощи метилата лития синтезировали метиловый эфир кетокислоты (4). Гидролиз которого проводили разбавленной соляной кислотой, получая при этом кетокислоту (5). Конденсацией фенилгидразинов (7, 9) и 6-мeтил-7-oкco-oктaнoвoй кислоты (5) получали соответствующие индолениновые основания (6, 8, 10) (схема 4-6).
Конденсацией различных фенилгидразинов с метилизопропилкетоном были получены соответствующие индоленины (11, 12, 14) (схема 7-9).
Исходным соединением для синтеза индоленина, содержащего функциональную группу в 5 положении, является хлоргидрат п- карбоксиэтилфенилгидразина (19) (схема 10). Нитрил (15) получали из п- нитроанилина действием раствора акрилонитрила в ацетоне на образующуюся в ходе реакции диазониевую соль. Нитрил и-нитрокоричной кислоты (16) получали кипячением водно-этанольного раствора нитрила пропионовой кислоты (15) в присутствии ацетата натрия. я-Нитрокоричную кислоту (17) получали кислотным гидролизом соответствующего нитрила. Дальнейшее восстановление п- нитрокоричной кислоты (17) приводило к получению аминофенилпропионовой кислоты (18). Хлоргидрат и-карбоксиэтилфенилгидразина (19) получали восстановлением в кислой среде диазониевой соли, которая образовывалась в ходе реакции. Карбоксиэтильное производное триметилиндоленина (20) получали из хлоргидрата п-карбоксиэтилфенилгидразина (19) и метилизопрпилкетона в ледяной уксусной кислоте в присутствии ацетата калия без выделения образующегося в ходе реакции гидразона.
Сульфоалкилирование всех индолениновых оснований проводили в 1 ,2- дихлорбензоле или бутиронитириле при действии 1 ,4-бyтaнcyльтoнa (схема 11-18). N- Алкильные производные были получены действием этилиодида на раствор индоленина в ацетонириле.
Полиметиновые мостики получали следующим образом (схема 19). Реакцией этилвинилового эфира и триэтилортоформиата в присутствии эфирата трёхфтористого бора был получен тетраэтилацеталь малонового альдегида (36). Далее при действии анилин гидрохлорида было получено соединение (37).
Еще одним объектом изобретения являются способы применения соединений общей формулы (I) в качестве флуоресцентных красителей для анализа биологически макромолекул. Указанное применение заключается в следующем.
Гибридизационный анализ с использованием флуоресцентно-маркированных праймеров проводится следующим образом. Химическим путем на автоматическом ДНК-синтезаторе получают олигонуклеотиды, праймеры, содержащие по 5 '-концу олигонуклеотида фосфатную группу с алифатическим аминолинком. Строение праймера соответствует строению участка предполагаемой молекулы ДНК, которую будут анализировать. Затем олигонуклеотид с аминолинком маркируют одним из красителей (А) или (В). Красители используют в виде соответствующих активных производных - 7V-гидpoкcиcyкцинимидныx или яαрα-нитрофениловых эфиров. Реакцию проводят в карбонат-бикарбонатном буферном растворе в смеси органического растворителя с водой. Полученные таким путем флуоресцентно- маркированные праймеры используют в полимеразной цепной реакции (ПЦР). При этом ингибирующего влияния маркеров не выявлено. Если строение анализируемой ДНК соответствует строению используемых праймеров, то происходит наработка, амплификация, продукта ПЦР. Получают продукт полимеразной цепной реакции, ампликон, который содержит флуоресцентную метку. Флуоресцентно-меченный ампликон гибридизуют на микрочипе. По результатам гибридизации маркированных олигонуклеотидов на микрочипах следует, что краситель, содержащий сульфогруппы, обладает большим сигналом и значением дискриминации по сравнению с гидрофобными красителями.
Микрочип представляет собой расположенные на подложке ячейки из гидрогеля с иммобилизованными внутри ячеек олигонуклеотидными зондами. Диаметр ячеек приблизительно 100 микрон. В разных ячейках находятся олигонуклеотидные зонды различного строения. В ячейках, в которых строение зонда соответствует строению ампликона, происходит связывание ампликона в прочный комплекс, дуплекс. В тех ячейках в которых строение зонда не соответствует строению ампликона не происходит связывания ампликона. Результаты анализа оценивают по интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках биочипа. В ячейках, в которых произошло связывание флуоресцентно-меченного ампликона с зондом, наблюдается интенсивный сигнал флуоресценции. Для регистрации сигналов используют флуоресцентный микроскоп, снабженный компьютером со специальным программным обеспечением.
Была определена сравнительная чувствительность обнаружения маркированных синтетических олигонуклеотидов на портативном флуоресцентном анализаторе изображений биочипов с полупроводниковым лазерным источником света (фиг. 8). Были взяты биочипы с ячейками, содержащими различные концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов. Наибольшая чувствительность регистрации оказалась для красителя (AlO), превысив таковую для красителя формулы (I) (R3= -(CH2)5COOH, R1=R5^CH3, R2=Rб=-SO3 ~; R4^-C2H5) в 1,6 раза.
На фиг. 9 представлены результаты обнаружения мутации микобактерии туберкулеза с помощью гибридизации на микрочипах при использовании красителя формулы (I) (R,=-CH3, R3= -(CH2)5COOH, =-SO3 "; R4^-C2H5; R2=R5=R6=-H) и красителя (AlO). Дискриминация на втором графике в два раза больше, это означает, что чувствительность обнаружения мутации на биочипах при использовании красителя (AlO) выше.
Другим примером использования заявляемых красителей формул (А) и (В) является их применение в качестве флуоресцентных меток в технологии белковых микрочипов. К растворам IgG в исходных концентрациях 6.5 мг/мл добавляли соответственно сукцинимидные эфиры красителя формулы I (R1-CH3, R2=R5=R6-H; R3= -(CH2)5COOH, R45-C2Hs) и красителя (AlO). Окрашивание проводили при перемешивании в бикарбонатном буфере в течение 4 ч при 4°C. Избыток красителя отделяли на спин-колонке с сефадекс G-25. Окрашенные антитела проверяли на микрочипе с иммобилизованным белком А в различных концентрациях (фиг. 10).
Сигналы от ячеек регистрировали с помощью исследовательского флуоресцентного микроскопа, при этом наблюдали зависимость флуоресценции от концентрации иммобилизованного белка (фиг. 11).
Нормированный сигнал флуоресценции для красителя (AlO) больше, чем для красителя формулы I (R,=-CH3, R2=R5=Rό=-H; R3= -(CH2)5COOH, R4^-C2H5), что означает, что чувствительность регистрации белков на биочипах при использовании красителя (AlO) выше.
Гибридизационный анализ с использованием заявляемых красителей формул (А) и (В) характеризуется следующими особенностями:
- заявляемые красители в составе коньюгатов с олигонуклеотидами не ингибируют полимеразную цепную реакцию;
- заявляемые красители отличаются чрезвычайно высокой чувствительность регистрации до 3 аттомоль (3*10~18 моль);
- воспроизводимость результатов анализа увеличивается с увеличением количества сульфогрупп в молекуле заявляемых красителей;
- относительная светостойкость заявляемых красителей выше для красителей не содержащих заместителей в фенильном кольце индоленинового фрагмента красителя.
Исходя из вышеизложенного следует, что заявляемые индодикарбоцианиновые красители (A1-A30, B1-B7) могут успешно использоваться в качестве флуоресцентных маркеров в гибридизационном анализе на биологических микрочипах, как олигонуклеотидных, так и белковых.
Еще одним объектом изобретения являются промежуточные соединения, для синтеза соединений по изобретению, выбираемые из группы, состоящей из: 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-индoлeнин (соединение 6); калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфoиндoлeнин (соединение 8); 3-(4-кapбoкcибyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 10); 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 20); 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-7V-этилиндoлeниний иодид (соединение 21); 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22); 3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 23); 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-Λf-этилиндoлeнин (соединение 24); калиевая соль 2 ,3 -димeтил-3 -(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-5 - сульфоиндоленина (соединение 25);
5-кapбoкcиэтил-Λf-cyльфoбyтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 34); 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтил-N-этилиндoлeниний иодид (соединение 35).
Подробное описание изобретения
Предпочтительные примеры соединений, способов их получения и применения по изобретению
Пример 1. Получение 1 -морфолиноциклогексена (соединение 1)
Figure imgf000045_0001
Соединение 1
Смесь морфолина (100,0 мл; 100,1 г; 1,15 моль), циклогексанона (99,5 мл; 94,2 г; 0,96 моль), толуола (190 мл) и «-тoлyoлcyльфoкиcлoты (1 г) кипятят в круглодонной колбе, снабженной обратным холодильником и насадкой Дина-Старка до прекращения отделения воды (~6 ч). Затем толуол удаляют, а остаток фракционируют в вакууме. Собирают фракцию с Tкип=114°C/8мм рт. ст. Получают 1- морфолиноциклогексен (соединение 1) с выходом 111,1 г (69,2%). Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1.55 (2H, м, 4-CH2); 1.67 (2H, м, 3-CH2); 2.05 (4H, м, 5-CH2, 6-CH2); 2.77 (4H, т, J 5, 2'-CH2, 6'-CH2); 3.72 (4H, т, J 5, 3'-CH2, 5'-CH2); 4.66 (IH, т, J 4, 2-CH)
Пример 2. Получение 2-aцeтилциклoгeкcaнoнa (соединение 2)
Figure imgf000045_0002
Соединение 2
Метод А. В трехгорлую колбу, снабженную обратным холодильником, механической мешалкой, термометром и капельной воронкой, помещают безводный хлороформ (475 мл), 1-мopфoлинoциклoгeкceн (соединение 1) (63,0 г; 0,38 моль) и перегнанный над натрием триэтиламин (56,7 мл; 41,28 г; 0,41 моль). К охлажденной до 0°C реакционной массе по каплям добавляют раствор ацетилхлорида (27,7 мл; 30,61 г; 0,39 моль) в безводном хлороформе (140 мл) с такой скоростью, чтобы температура смеси не поднималась выше 0°C. Дополнительно перемешивают при охлаждении на льду 1 ч, затем реакционную массу выдерживают 12 ч при комнатной температуре. Далее реакционную массу переносят в круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником и механической мешалкой, добавляют раствор концентрированной соляной кислоты (50,4 мл) в воде (126 мл) и кипятят при непрерывном перемешивании в течение 5 ч. После охлаждения хлороформенный слой отделяют, промывают водой порциями по 200 мл (до рН 5-6), насыщенным раствором хлорида натрия и сушат сульфатом натрия. Хлороформ удаляют, а остаток фракционируют в вакууме. Собирают фракцию с Tкип=102-104°C/10 мм рт. ст. Получают 2-aцeтилциклoгeкcaнoн (соединение 2) с выходом 29,0 г (55%). Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1.67 (4H, м, 4-CH2, 5-CH2); 2.1 (ЗН, с, COCH3); 2.31 (4H, м, 3-CH2, 6-CH2); 15.9 (IH, с, 2-CH)
Метод Б. В двугорлую сердцевидную колбу, снабженную обратным холодильником и механической мешалкой, помещают циклогексанон (5,2 мл; 4,9 г; 0,05 моль) и уксусный ангидрид (9,5 мл; 10,2 г; 0,1 моль). Реакционную массу охлаждают и в один прием вводят BF3*2CH3COOH комплекс (13,9 мл; 18,8 г; 0,1 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Затем в круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником и механической мешалкой, помещают трехводный ацетат натрия (27,2 г; 0,2 моль) и воду (150 мл). В полученный раствор переносят реакционную массу из серцевидной колбы и эмульсию кипятят при интенсивном перемешивании в течение 3 ч. Далее реакционную массу экстрагируют эфиром (3*80 мл). Эфирные экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия до тех пор, пока не перестает выделяться газ, и сушат MgSO4. Эфир удаляют, а остаток фракционируют в вакууме в токе азота. Собирают фракцию с Tкип=105-108oC/17 мм рт. ст. Получают 2-aцeтилциклoгeкcaнoн (соединение 2) с выходом 3,8 г (54,4%). Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1.69 (4H, м, 4-CH2, 5-CH2); 2.13 (ЗН, с, 2-COCH3); 2.33 (4H, м, 3-CH2, 6-CH2); 15.8 (IH, с, 2-CH)
Пример 3. Получение 2-aцeтил-2-мeтилциклoгeкcaнoнa (соединение 3)
Figure imgf000047_0001
Соединение 3
В трехгорлую круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, механической мешалкой и термометром, при охлаждении на льду помещают метиловый спирт (83 мл), 2-aцeтилциклoгeкcaнoн (соединение 2) (29,0 г; 26,9 мл; 0,21 моль) и метил иодид (44,0 г; 19,3 мл; 0,31 моль). К реакционной массе при перемешивании добавляют по каплям раствор гидроксида натрия (8,27 г; 0,21 моль) в воде (41,4 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 ч, а затем кипятят с обратным холодильником 2 ч. Далее охлажденную реакционную массу переносят в делительную воронку, добавляют воду (85 мл) и экстрагируют хлороформом (2*85 мл). Хлороформенные экстракты объединяют и промывают 2M rидроксидом натрия (200 мл), насыщенным раствором хлорида натрия (100 мл) и сушат MgSO4. Растворитель удаляют, а остаток фракционируют в вакууме в токе азота. Собирают фракцию с TKИп =127-128°C/32 мм рт. ст. Получают 2-aцeтил-2- метилциклогексанон (соединение 3) с выходом 23,8 г (74,7%).
Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1 -23 (ЗН, с, 2-CH3); 1.41-1.48 (IH, м, 4-CH2); 1.61-1.69 (ЗН, м, 4-CH2, 5-CH2); 1.93-1.99 (IH, м, 3-CH2); 2.09 (ЗН, с, 2-COCH3); 2.25-2.34 (IH, м, 3- CH2); 2.42-2.48 (2H, м, 6-CH2)
Пример 4. Получение метилового эфира 6-мeтил-7-oкcooктaнoвoй кислоты (соединение 4)
Figure imgf000047_0002
Соединение 4
В двугорлую колбу, снабженную обратным холодильником и механической мешалкой, помещают безводный метиловый спирт (52,4 мл) и маленькими кусочками добавляют металлический литий (0,5 г; 0,071 моль). К полученному раствору добавляют 2-aцeтил-2-мeтилциклoгeкcaнoн (соединение 3) (10,0 г; 0,0648 моль) и смесь кипятят в течение 1 ч, а затем выдерживают при комнатной температуре в течение 12 ч. Далее реакционную массу подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 5, суспензию переносят в делительную воронку, добавляют воду (55 мл) и экстрагируют эфиром до обесцвечивания водной фазы. Эфирные экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида натрия и сушат MgSO4. Растворитель удаляют, а остаток фракционируют в вакууме. Собирают фракцию с Tкип=139-145°C/20 мм рт. ст. Получают метиловый эфир 6-мeтил-7-oкcooктaнoвoй кислоты (соединение 4) с выходом 6,2 г (52%).
Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1 -06 (ЗН, д, 6-CH3); 1.23-1.35 (ЗН, м, 5-CH2, 4-CH2); 1.56- 1.69 (ЗН, м, 3-CH2, 4-CH2); 2.11 (ЗН, с, 8-CH3); 2.28 (2H, т, J 7.5, 2-CH2); 2.49 (IH, м, 6- CH)
Пример 5. Получение 6-мeтил-7-oкcooктaнoвoй кислоты (соединение 5)
Figure imgf000048_0001
Соединение 5
Смесь разбавленной (2:1) соляной кислоты (37 мл) и метилового эфира 6- мeтил-7-oкcooктaнoвoй кислоты (соединение 4) (9, 11 г; 0,049 моль) кипятят при перемешивании в течение 6 ч. В результате реакции образуются два несмешивающихся слоя. Реакционную массу экстрагируют эфиром. Эфирные экстракты объединяют. Растворитель удаляют, а остаток фракционируют в вакууме. Собирают фракцию с Tкип=100-143°C/0, 1-0,01 мм рт. ст. Получают 6-мeтил-7- оксооктановую кислоту (соединение 5) с выходом 5,9 г (75%).
Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1.06 (ЗН, д, 6-CH3); 1.25-1.39 (ЗН, м, 5-CH2, 4-CH2); 1.58- 1.69 (ЗН, м, 3-CH2, 4-CH2); 2.12 (ЗН, с, 8-CH3); 2.33 (2H, т, J 7.5, 2-CH2); 2.5 (IH, м, 6- CH).
Пример 6. Получение 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-индoлeнинa (соединение 6)
Figure imgf000048_0002
Соединение 6 В стеклянный флакон помещают 6-мeтил-7-oкcooктaнoвyю кислоту (соединение 5) (723,3 мг; 4,2 ммоль), фенилrидразин (454,2 мг; 413,7 мкл; 4,2 ммоль) и ледяную уксусную кислоту (4,2 мл). Смесь нагревают при 1 18°C в течение 3,5 ч. Растворитель удаляют, маслянистый остаток растворяют в хлороформе. Хлороформенный раствор промывают водой, насыщенным раствором хлорида натрия, сушат MgSO4. Растворитель удаляют, а остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат - гексан, 0,6:2. Получают 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)- индоленин (соединение 6) в виде желто-оранжевого порошка с выходом 0,8 г (78%). λmax 256 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci5HigNO2): найдено m/z 246.3, рассчитано m/z 245.32.
Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 0.56-0.81 (2H, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.28 (ЗН, с, 3- CH3); 1.43-1.51 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 1.76-1.92 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.13-2.21 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.24 (ЗН, с, 2-CH3); 7.18-7.54 (4H, м, ArH)
Пример 7. Получение фенилгидразин-я-сульфокислоты (соединение 7)
Figure imgf000049_0001
Соединение 7
.Сульфаниловую кислоту (52,0 г; 0,3 моль) и углекислый натрий (16,5 г; 0,06 моль) растворяют при нагревании в воде (200 мл). Полученный раствор отфильтровывают и к нему добавляют по каплям концентрированную серную кислоту (35,0 г; 19,1 мл; 0,36 моль), при этом выпадает белый осадок. К суспензии при охлаждении на льду и перемешивании добавляют раствор нитрита натрия (21 ,0 г; 0,3 моль) в воде (50 мл) с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше 120C. Дополнительное перемешивание продолжают еще в течение 15 минут. Выделившийся осадок диазосоединения собирают фильтрацией и промывают небольшим количеством ледяной воды.
К раствору сульфита натрия (84,8 г; 0,67 моль) в воде (250 мл) при перемешивании и охлаждении на льду с солью добавляют влажное диазосоединение порциями с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы была ниже 5°C. Дополнительно перемешивают 1 ч. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют по каплям концентрированную соляную кислоту (200 мл), при этом выпадает осадок. Для полного обесцвечивания смеси добавляют цинковую пыль (2 г). Реакционную массу выдерживают 12 ч при комнатной температуре. Осадок собирают фильтрацией, промывают холодной водой и сушат на воздухе. Получают фенилrидразин-и- сульфокислоту (соединение 7) с выходом 41,7 г (74%).
Пример 8. Получение калиевой соли 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5- сульфоиндоленина (соединение 8)
Figure imgf000050_0001
Соединение 8
Смесь фeнилгидpaзин-/7-cyльфoкиcлoты (соединение 7) (1,8 г; 9,7 ммоль), 6- мeтил-7-oкcooктaнoвoй кислоты (соединение 5) (2,0 г; 1 1,6 ммоль) и ледяной уксусной кислоты (15 мл) кипятят при перемешивании в течение 8 ч, затем добавляют дополнительное количество уксусной кислоты и обрабатывают активированным углем. Растворитель удалят, а остаток растворяют в метаноле (10 мл). К полученному растовору добавляют по каплям раствор гидроксида калия (600 мг; 10,56 ммоль) в метаноле (7 мл), изопропиловый спирт (15 мл) и диэтиловый эфир (2 мл). Образовавшийся осадок собирают фильтрацией и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают калиевую соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 8) с выходом 3,47 г (83%). λmax 258 нм. Масс-спектр (MALDI) (C15H19NO5S): найдено m/z 327.2, рассчитано m/z 325.38.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 0.45-0.7 (2H, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 1.31 (ЗН, с, 3-CH3); 1.36 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 1.88-2.14 (4H, м, CH2CHICH2CHICOOH); 7.53 (IH, д, ArH), 7.8 (2H, м, ArH)
Пример 9. Получение 4-тoлилгидpaзинa гидрохлорида (соединение 9)
Figure imgf000050_0002
Соединение 9
К охлажденной до 0°C смеси я-толуидина (32,2 г; 0,3 моль) и концентрированной соляной кислоты (220 мл) добавляют по каплям раствор нитрита натрия (20,6 г; 0,3 моль) в воде (60 мл) с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше 5°C. Затем полученный раствор отфильтровывают и при интенсивном перемешивании добавляют в охлажденный до 50C раствор хлорида олова (124 г; 0,65 моль) в концентрированной соляной кислоте (124 мл). Выпавший осадок собирают на фильтр, суспендируют в воде (500 мл) и подщелачивают 40% раствором гидроксида натрия до рН 12. Реакционную массу экстрагируют диэтиловым эфиром (3*200 мл). Эфирные экстракты сушат MgSO4. Затем через эфирный раствор и-толилгидразина пропускают ток сухого хлористого водорода. Выпавший осадок собирают на фильтр, промывают эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают 4-тoлилгидpaзин гидрохлорид (соединение 9) с выходом 30,2 г (63%). λmaχ 283 нм. Масс-спектр (MALDI) (C7H1ON2): найдено m/z 122.1, рассчитано m/z 122.17. Η-ЯМР (D2O), D (м.д.): 2.11 (ЗН, с, CH3), 6.79 (2H, д, ArH), 7.06 (2H, д, ArH)
Пример 10. Получение 3-(4-кapбoкcибyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 10)
Figure imgf000051_0001
Соединение 10
Смесь 4-тoлилгидpaзин гидрохлорида (соединение 9) (825 мг; 5,2 ммоль), ледяной уксусной кислоты (8 мл), 6-мeтил-7-oкcooктaнoвoй кислоты (соединение 5) (913 мг; 5,3 ммоль) и безводного ацетата калия (980 мг; 10 ммоль) кипятят при перемешивании в течение 6 ч. Растворитель удаляют, а остаток растворяют в хлороформе. Хлороформенный раствор промывают водой, насыщенным раствором хлорида натрия, а затем сушат MgSO4. Растворитель удаляют, а остаток перекристаллизовывают из смеси диэтиловый эфир - гексан, 1 :10. Получают 3-(4- кapбoкcибyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 10) в виде темно-оранжевого порошка с выходом 1,13 г (83,7%). λmax 254 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci6H2iNO2): найдено m/z 260.7, рассчитано m/z 259.34.
Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 0.6-0.83 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.25 (ЗН, с, 3-CH1); 1.46 (2H, м, CHZCH2CH2CH2COOH); 1.72-1.88 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.09- 2.18 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.28 (ЗН, с, 2-CHз); 2.37 (ЗН, с, 5-CH2), 7.01-7.4 (ЗН, м, ArH), 10.11 (IH, с, COOH)
Пример 11. Получение калиевой соли 5-cyльфo-2,3,3-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 1 1)
Figure imgf000052_0001
Соединение 11
Смесь фенилгидразин-и-сульфокислоты (соединение 7) (1 1,3 г; 0,06 моль), 3- мeтил-2-бyтaнoнa (6,2 г; 7,72 мл; 0,072 моль) и ледяной уксусной кислоты (34 мл) кипятят в течение 3 ч, а затем выдерживают 12 ч при O0C. Выпавший осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном и сушат в вакуум-эксикаторе над P2Os. Получают 5-cyльфo-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин с выходом 5,1 г (71,3%). Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 1-28 (6H, с, C(CHi)2); 7.47-7.79 (ЗН, м, ArH)
5-Cyльфo-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (4,77 г; 0,02 моль) растворяют при нагревании в метаноле (25 мл). К полученному раствору добавляют по каплям раствор гидроксида калия (1,35 г; 0,024 моль) в метаноле (16 мл). Затем добавляют изопропиловый спирт (50 мл). Осадок отфильтровывают, сушат в вакуум-эксикаторе над P2Os. Получают калиевую соль 5-cyльфo-2,3,3-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 1 1) в виде блестящих пластинок светло-бежевого цвета с выходом 4,7 г (85%). λmaχ 260 нм. Масс-спектр (MALDI) (CцH]2NOзS~): найдено m/z 239.0, рассчитано m/z 238.28. Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 1.19 (6H, с, C(CHi)2); 2.19 (6H, с, 2-CH3); 7.41-7.7 (ЗН, м, ArH)
Пример 12. Получение 2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнинa (соединение 12)
Figure imgf000052_0002
Соединение 12
Смесь З-мeтил-2-бyтaнoнa (7 мл; 5,6 г; 0,065 моль), 4-тoлилгидpaзин гидрохлорида (соединение 9) (11,0 г; 0,069 моль), безводного ацетата калия (13,9 г; 0,14 моль) и ледяной уксусной кислоты (70 мл) перемешивают при комнатной температуре 30 мин, а затем кипятят в течение 1 ч. Растворитель удаляют, а маслянистый остаток растворяют в хлороформе. Хлороформенный раствор промывают водой, насыщенным раствором хлорида натрия, а затем сушат MgSO4. Растворитель удаляют, а остаток фракционируют в вакууме водоструйного насоса в токе азота (Tкип=115°C/10 мм рт. ст.). Получают 2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнин (соединение 12) с выходом 9,53 г (79,5%). λmax 263 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci2Hi 5N): найдено m/z 173.9, рассчитано m/z 173.25.
Η-ЯМР (DMSOd6), δ (м.д.): 1.21 (6H, с, C(CEb)2), 2.17 (ЗН, с, 2-CH3), 2.32 (ЗН, с, 5- CH2), 7.05 (IH, д, 6-ArH), 7.19 (IH, с, 4-ArH), 7.28 (IH, д, 7-ArH)
Пример 13. Получение 2,4-кcилилгидpaзин гидрохлорида (соединение 13)
Figure imgf000053_0001
Соединение 13
К охлажденной до 0°C смеси 2,4-димeтилaнилинa (35,4 мл; 36,3 г; 0,3 моль) и концентрированной соляной кислоты (220 мл) добавляют по каплям раствор нитрита натрия (20,6 г; 0,3 моль) в воде (60 мл) с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше 5°C. Затем полученный раствор отфильтровывают и при интенсивном перемешивании добавляют в охлажденный до 5°C раствор хлорида олова (124,0 г; 0,65 моль) в концентрированной соляной кислоте (124 мл). Выпавший осадок отделяют фильтрацией, суспендируют в воде (500 мл) и подщелачивают 40% раствором гидроксида натрия до рН 12. Реакционную массу экстрагируют диэтиловым эфиром (3*200 мл). Эфирные экстракты сушат сульфатом магния. Затем через эфирный раствор 2,4-кcилилгидpaзинa пропускают ток сухого хлористого водорода. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают 2,4-кcилилгидpaзин гидрохлорид (соединение 13) с выходом 18,5 г (35,8%). λmax 281 нм. Масс-спектр (MALDI) (CgH]2N2): найдено m/z 137.2, рассчитано m/z 136.19.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 2.03 (ЗН, с, W-CH2), 2,08 (ЗН, с, ж-CH3), 6.72 (IH, с, ArH), 6.93 (2H, д, ArH)
Пример 14. Получение 2, 3,3, 5, 7-пeнтaмeтилиндoлeнинa (соединение 14).
Figure imgf000053_0002
Соединение 14 Смесь З-мeтил-2-бyтaнoнa (7 мл; 5,6 г; 0,065 моль), 2,4-кcилилгидpaзин гидрохлорида (соединение 13) (11,9 г; 0,069 моль), безводного ацетата калия (13,9 г; 0,14 моль) и ледяной уксусной кислоты (70 мл) перемешивают при комнатной температуре 30 мин, а затем кипятят в течение 1 ч. Растворитель удаляют, а маслянистый остаток растворяют в эфире. Эфирный раствор промывают водой, насыщенным раствором хлорида натрия, а затем сушат MgSO4. Растворитель удаляют, а остаток фракционируют в вакууме водоструйного насоса в токе азота (TKИп =132°C/20 мм рт. ст.). Получают 2,3,3,5,7-пeнтaмeтилиндoлeнин (соединение 14) с выходом 8,3 г (63,7%). V13x 265 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci3Hi7N): найдено m/z 188.5, рассчитано m/z 187.28.
Η-ЯМР (DMSO-d6), δ (м.д.): 1 -43 (6H, с, C(CHa)2), 2.35 (ЗН, с, 2-CH1), 2.48 (ЗН, с, 5- CH3), 2.66 (ЗН, с, 7-CH3), 7.12 (IH, с, ArH), 7.33 (IH, с, ArH)
Пример 15. Получение нитрила α-xлop-β-(я-нитpoфeнил)-пpoпиoнoвoй кислоты (соединение 15)
Figure imgf000054_0001
Соединение 15
В колбу помещают я-нитроанилин (1 1,5 г; 0,083 моль), воду (60 мл), концентрированную соляную кислоту (62 мл) и нагревают до полного растворения выделяющегося хлоргидрата и-нитроанилина. Затем реакционную массу охлаждают до начала кристаллизации, добавляют мелко колотый лед (50 г) и к полученной суспензии при сильном перемешивании добавляют по каплям раствор нитрита натрия (5,9 г; 0,083 моль) в воде (13,8 мл). Ход реакции контролируют по иодкрахмальной бумажке. К полученному раствору при перемешивании добавляют раствор акрилонитрила (4,43 г; 0,083 моль) в ацетоне (37,5 мл), кристаллический CuSθ4*5H2O (2,5 г; 0,01 моль) и смесь выдерживают в течение суток при комнатной температуре. Затем выделившийся осадок отфильтровывают и промывают водой. Осадок переносят в колбу с водой (250 мл) и примеси удаляют перегонкой с водяным паром. После сбора 500 мл конденсата перегонку прекращают. Кубовый остаток охлаждают на льду и водный слой удаляют обратной фильтрацией. Твердый остаток растворяют в метаноле (100 мл), обрабатывают активированным углем (1 г), раствор фильтруют горячим и добавляют воду (300 мл). Смесь выдерживают ночь при +50C. Выпавший осадок отфильтровывают и сушат при 8O0C. Получают нитрил α-xлop-β-(«- нитpoфeнил)-пpoпиoнoвoй кислоты (соединение 15) с выходом 14,3 г (82%). Т.пл. 110-1 H0C (из метанола).
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ(м.д.): 3.55 (2H, м, CH2CH(Cl)CN), 5.64 (IH, т, J 7.0, CH2CH(Cl)CN), 7.65-8.26 (4H, д, J 9.0, ArH)
Пример 16. Получение нитрила гс-нитрокоричной кислоты (соединение 16)
Figure imgf000055_0001
Соединение 16
Смесь нитрила α-xлop-/?-(«-нитpoфeнил)-пpoпиoнoвoй кислоты (соединение 15) (10,5 г; 0,05 моль), ацетата натрия (15,0 г; 0,18 моль), воды (40 мл) и этилового спирта (90 мл) кипятят в течение 4 ч. Затем в реакционную массу добавляют воду (150 мл) и выдерживают при +50C до полной кристаллизации. Полученный осадок собирают фильтрацией, растворяют в этаноле (200 мл), обрабатывают активированным углем (1,5 г), раствор фильтруют горячим. К фильтрату добавляют воду (400 мл) и выдерживают ночь при +50C. Выпавший осадок собирают фильтрацией и сушат. Получают 8,2 г технического соединения 16. После дополнительной перекристаллизации из спирта (200 мл) получают нитрил п- нитрокоричной кислоты (соединение 16) в виде желтых игл с выходом 4,1 г (47%). Т.пл. 2010C (из этанола).
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 6.72 (IH, д, J 16.5, CHCHCN), 7.81 (IH, д, J 16.5, CHCHCN), 7.79-8.29 (4H, д, J 9.0, ArH)
Пример 17. Получение и-нитрокоричной кислоты (соединение 17)
Figure imgf000056_0001
Соединение 17
Метод А. Смесь нитрила и-нитрокоричной кислоты (соединение 16) (17,4 г; 0,1 моль) и концентрированной фосфорной кислоты (350 мл) нагревают при 1500C в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь переносят в ледяную воду (4 л). Полученный осадок отфильтровывают и сушат. Получают 18,3 г технического продукта 17. Технический продукт растворяют в 1 л 0,12M гидроксида натрия и обрабатывают углем (3,5 г). Полученный раствор отфильтровывают и к фильтрату добавляют по каплям концентрированную соляную кислоту до pH~2. Выделившийся осадок собирают фильтрацией, промывают водой, сушат при 900C. Получают 17,7 г (92%) я-нитрокоричной кислоты (соединение 17) в виде желтых игл. Т.пл. 283.5°C.
Метод Б. При проведении реакции с техническим нитрилом я-нитрокоричной кислоты (соединение 16) по той же методике получают 11,2 г (58%) я-нитрокоричной кислоты (соединение 17).
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 6.74 (IH, д, J 16.5, CHCHCOOH), 7.69 (IH, д, J 16.5, CHCHCOOH), 7.96-8.25 (4H, д, J 9.0, ArH)
Пример 18. Получение хлоргидрата 3-(я-aминoфeнил)-пpoпиoнoвoй кислоты (соединение 18)
Figure imgf000056_0002
Соединение 18
В колбу помещают 5% Рd/С (400 мг), уксусную кислоту (80 мл) и п- нитрокоричную кислоту (соединение 17) (3,86 г; 20 ммоль). Смесь гидрируют при интенсивном перемешивании в токе водорода при атмосферном давлении и комнатной температуре в течение 2,5 ч. Реакционную массу отфильтровывают и фильтрат упаривают. Маслянистый остаток растворяют в смеси 5M HCl (7 мл) и воды (30 мл), обрабатывают активированным углем при нагревании. Отфильтрованный от угля раствор упаривают, остаток сушат в вакуум-эксикаторе над P2Os и KOH. Получают хлоргидрат 3-(п-aминoфeнил)-пpoпиoнoвoй кислоты (соединение 18) с выходом 3,87 г (96%).
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 2.53 (2H, т, J 7.5, CH2CHiCOOH), 2.83 (2H, т, J 7.5, CH2CH2COOH), 7.28-7.35 (4H, д, J 8.5, ArH), 10.31 (с, 2H, NH2)
Пример 19. Получение я-карбоксиэтилфенилгидразина (соединение 19)
Figure imgf000057_0001
Соединение 19
В трехгорлую колбу, снабженную механической мешалкой и термометром, помещают хлоргидрат 3-(я-aминoфeнил)-пpoпиoнoвoй кислоты (соединение 18) (2,01 г; 10 ммоль), концентрированную соляную кислоту (35 мл) и при охлаждении добавляют по каплям под слой жидкости раствор нитрита натрия (0,69 г, 10 ммоль) в воде (0,9 мл) с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше -5°C. Затем в течение 30 мин температуру повышают до 00C. Смесь вновь охлаждают до -5°C и добавляют охлажденный до -18°C раствор SnCl2*2H2O (10 г; 44 ммоль) в концентрированной соляной кислоте (15 мл) с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше -50C. Смесь дополнительно перемешивают при -5°C в течение 30 мин и выдерживают при +5°C сутки. Выпавшие кристаллы собирают фильтрацией и промывают охлажденной до - 18°C концентрированной соляной кислотой (3*2 мл). Получают п- карбоксиэтилфенилгидразин гидрохлорид (соединение 19) с выходом 1,62 г (75%). Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 2.47 (2H, т, J 7.5, CH2CHzCOOH), 2.73 (2H, т, J 7.5, CHiCH2COOH), 6.91-7.13 (4H, д, J 8.5, ArH), 10.27 (ЗН, с, NHNH2)
Пример 20. Получение 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 20).
Figure imgf000058_0001
Соединение 20
В стеклянный флакон помещают я-карбоксиэтилфенилгидразин гидрохлорид (соединение 19) (216 мг; 1 ммоль), безводный ацетат калия (196 мг; 2,0 ммоль), 3- мeтил-2-бyтaнoн (147 мкл; 118,1 мг; 1,37 ммоль), уксусную кислоту (1 мл) и нагревают в течение 1 ч при 1 180C. Затем растворители удаляют, остаток растворяют в хлороформе, промывают водой, насыщенным раствором хлорида натрия и сушат сульфатом натрия. Хлороформ удаляют, а маслянистый остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат: гексан, 1 :10. Осадок собирают фильтрацией и сушат в вакуум -эксикаторе над P2Os и KOH. Получают 5- кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 20) с выходом 118 мг (55%). λmaχ 262 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci4Hi7NO2): найдено m/z 232.3, рассчитано m/z 231.29. Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1.27 (6H, с, C(CHiIz), 2.27 (ЗН, с, ССНз), 2.68 (2H, т, J 8, CH2CHiCOOH), 3.00 (2H, т, J 8, CH2CH2COOH), 7.12-7.46 (ЗН, д, J 8.5, ArH)
Пример 21. Получение 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-этилиндoлeниний иодида (соединение 21)
Figure imgf000058_0002
Соединение 21
В стеклянный флакон помещают 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-индoлeнин (соединение 6) (49,1 мг; 0,2 ммоль), этилиодид (1 мл), ацетонитрил (0,4 мл) и нагревают при 700C в течение 20 ч. По окончанию нагревания растворитель удаляют в вакууме, а остаток промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-7V-этилиндoлeнин (соединение 21) с выходом 76,2 мг (95%). λmax 279 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci7H24NO2 +): найдено m/z 274.4, рассчитано m/z 274.38.
Η-ЯМР (CDC13), D (м.д.): 0.52-0.78 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.25 (ЗН, с, 3- CH3); 1.38-1.49 (2H9 м, CHZCH2CH2CH2COOH); 1.62 (ЗН, т, CH2CHi), 1.70-1.81 (2H, м, CH2CHICH2CH2COOH); 2.18 (2H, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 2.28 (ЗН, с, 2-CH3); 4.73 (2H, м, CHzCH3), 7.5-7.68 (4H, м, ArH)
Пример 22. Получение 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-Лг-(4-cyльфoбyтил)- индоленина (соединение 22)
Figure imgf000059_0001
Соединение 22
В стеклянный флакон помещают 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-индoлeнин (соединение 6) (637,8 мг; 2,6 ммоль), 1 ,4-бyтaнcyльтoн (708,1 мг; 526,6 мкл; 5,2 ммоль), 1 ,2-диxлopбeнзoл (4,2 мл) и нагревают при 1 18°C в течение 25 ч. Растворитель декантируют, а маслянистый остаток затирают с диэтиловым эфиром. Образовавшийся осадок собирают фильтрацией, промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-/V- (4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22) в виде темно-вишневого порошка с выходом 0,98 г (98,9%). λmax 280 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci9H27NO5S): найдено m/z 382.0, рассчитано m/z 381.49.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 0.38-0.68 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.23-1.35 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 1.43 (ЗН, с, 3-CH3); 1.71-1.81 (2H, м, CH2CH2CHICH2SO3); 1.92-2.2 (6H, м, CH2CHZCH2CH2COOH, CH2CHICH2CH2SO3); 2.84 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.41 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CH2SO3); 7.18-7.7 (4H, м, ArH)
Пример 23. Получение 3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5- триметилиндоленин (соединение 23)
Figure imgf000059_0002
Соединение 23
В стеклянный флакон помещают 3-(4-кapбoкcибyтил)-2,3,5- триметилиндоленин (соединение 10) (400 мг; 1,55 ммоль), 1 ,4-бyтaнcyльтoн (422 мг; 315 мкл; 3,.l ммоль), 1 ,2-диxлopбeнзoл (2,6 мл) и нагревают при 118°C в течение 50 часов. Растворитель декантируют, а маслянистый остаток затирают с диэтиловым эфиром. Образовавшийся осадок собирают на фильтр, промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P2Os. Получают 3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4- cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 23) в виде в виде темно- вишневого порошка с выходом 0,58 г (95%). λmax 286 нм. Масс-спектр (MALDI) (C2OH29NO5S): найдено m/z 396.7, рассчитано m/z 395.51.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 0.41-0.67 (2H, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 1.25 (2H, м, CH2CHICH2CH2COOH); 1.39 (ЗН, с, 3-CH3); 1.75 (4H, м, CH2CHICH2CH2SO3); 1.94 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 2.05 (6H, м, CH7CH7CH7CH7COOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.32 (ЗН, с, 5-CH3); 4.37 (2H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 7.31-7.56 (ЗН, м, ArH)
Пример 24. Получение 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-Λf- этилиндоленина (соединение 24)
Figure imgf000060_0001
Соединение 24
В стеклянный флакон помещают калиевую соль 2,3-димeтил-3-(4- кapбoкcибyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 8) (0,5 г; 1,38 ммоль), этилиодид (1,08 г; 550 мкл; 6,9 ммоль) и 1,2-диxлopбeнзoл (25 мкл). Суспензию нагревают при 720C в течение 50 ч. По окончанию нагревания растворитель декантируют, осадок промывают ацетоном, собирают на фильтр и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-N-этилиндoлeнин (соединение 24) с выходом 0,47 г (96%). λmax 266 нм. Масс-спектр (MALDI) (CiVH23NO5S): найдено m/z 354.2 , рассчитано m/z 353.43.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 0.58-0.72 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.49 (т, ЗН, CH2CH3), 1.56 (ЗН, с, 3-CH2); 1.61 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.14 (4H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 4.5 (м, 2H, CH2CH3); 7.9 (IH, д, ArH), 8.06 (2H, м, ArH)
Пример 25. Получение калиевой соли 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 25)
Figure imgf000061_0001
Соединение 25
В стеклянный флакон помещают калиевую соль 2,3-димeтил-3-(4- кapбoкcибyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 8) (0,6 г; 1,65 ммоль) и 1,4- бутансультон (1,0 мл). Суспензию нагревают при 1 18°C в течение 50 ч. Охлажденную до комнатной температуры реакционную массу затирают с диэтиловым эфиром. Образовавшийся осадок собирают на фильтр, промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P2Os. Получают калиевую соль 2,3-димeтил-3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 25) с выходом 0,8 г (97%). λmax 268 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci9H26NO8S2 "): найдено m/z 461.1, рассчитано m/z 460.54.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 0.64-0.77 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.39 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.58 (ЗН, с, 3-CHз); 1.68-1.75 (2H, м, CH7CH7CH2CH7SOO; 1.95-2.06-2.31 (6H, м, CH2CH2CH2CH2COOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.89 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CHZSO3); 4.51 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CH2SO3); 7.7 (IH, д, ArH), 8.04 (IH, с, ArH)
Пример 26. Получение N-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 26)
Figure imgf000061_0002
Соединение 26
В стеклянный флакон помещают 2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (414 мг; 417,3 мкл; 2,6 ммоль), 1 ,4-бyтaнcyльтoн (708,1 мг; 526,6 мкл; 5,2 ммоль), 1 ,2-диxлopбeнзoл (4,2 мл) и нагревают при 118°C в течение 25 ч. Растворитель декантируют, а остаток затирают с диэтиловым эфиром. Образовавшийся осадок собирают на фильтр, промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают N- (4-cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 26) в виде темно-вишневого порошка с выходом 0,75 г (97,4%). λmax 278 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci5H2iNO3S): найдено m/z 296.0, рассчитано m/z 295.40.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 1 -44 (6H, с, C(CHз)2); 1-77 (2H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.02 (2H, м, CH2CHZCH2CH2SO3); 2.84 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CHZSO3); 4.39 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CH2SO3); 7.49-7.68 (4H, м, ArH)
Пример 27. Получение 2,3,3-тpимeтил-./V-этилиндoлeниний иодида (соединение 27)
Figure imgf000062_0001
Соединение 27
Смесь 2,3,3-тpимeтилиндoлeнинa (1,35 г; 1,36 мл; 8,48 ммоль), этилиодида (5,5 мл) и ацетонитрила (5 мл) при перемешивании кипятят в токе азота в течение 18 ч. По окончанию нагревания в охлажденную до комнатной температуры реакционную массу добавляют безводный диэтиловый эфир (30 мл). Выпавшие кристаллы собирают на фильтр и перекристаллизовывают из изопропанола (5 мл). Получают 2,3,3-тpимeтил-N-этилиндoлeниний иодид (соединение 27) с выходом 2,46 г (91,9%). λmax 278 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci3Hi8N+): найдено m/z 189.3, рассчитано m/z 188.29.
Η-ЯМР (CDC13), D (м.д.): 1.64 (9H, м, CH2CHi, C(CH3J2), 3.14 (ЗН, с, 2-CH2), 4.75 (2H, м, CH2CH3), 7.56-7.72 (4H, м, ArH)
Пример 28. Получение калиевой соли 5-cyльфo-N-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3- триметилиндоленина (соединение 28)
Figure imgf000062_0002
Соединение 28
В стеклянный флакон помещают калиевую соль 5-cyльфo-2,3,3- триметилиндоленина (соединение 1 1) (0,6 г; 2,16 ммоль), 1 ,4-бyтaнcyльтoн (882,4 мг; 660 мкл; 6,48 ммоль) и 1,2-диxлopбeнзoл (3,5 мл). Суспензию нагревают при 118°C в течение 30 ч. К охлажденной до комнатной температуры реакционной массе добавляют ацетон (10 мл). Осадок собирают на фильтр, промывают эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают калиевую соль 5-cyльфo-./V-(4-cyльфoбyтил)-
2,3,3-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 28) в виде ярко-розового порошка с выходом 0,78 г (87,6%). λmax 274 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci 5H20NO6S2 "): найдено rn/z 375.6, рассчитано m/z 374.45.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 1.43 (6H, с, C(CHз)2); 1.74 (2H, м, CH2CH2CHICH2SO3); 1.95 (2H, м, CH2CHICH2CH2SO3); 2.81 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.38 (2H, т, J 7.5, CHICH2CH2CH2SO3); 7.49-7.68 (ЗН, м, ArH)-
Пример 29. Получение 2,3,3-тpимeтил-5-cyльфo-7V-этилиндoлeнинa (соединение 29)
Figure imgf000063_0001
Соединение 29
Суспензию калиевой соли 5-cyльфo-2,3,3-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 11) (5,54 г; 20 ммоль), этилиодида (20 мл) и 1 ,2-диxлopбeнзoлa (5 мл) при перемешивании нагревают в течение 50 ч. По окончанию нагревания растворитель декантируют и добавляют большой избыток ацетона. Образовавшиеся кристаллы собирают на фильтр, промывают ацетоном для удаления иодида калия и сушат в вакуум-эксикаторе над P2Os. Получают 2,3,3-тpимeтил-5-cyльфo-/V-этилиндpлeнин (соединение 29) с выходом 5,31 г (99%). λmax 228 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci3Hi7NO3S): найдено m/z 268.4, рассчитано m/z 267.35.
Η-ЯМР (D2O), D (м.д.): 1.43 (9H, м, CH2CHз, C(CtLb), 4.36 (м, 2H, CH2CH3), 7.63 (д, IH, 7-ArH), 7.75 (д, IH, 6-ArH), 7.97 (с, IH, 4-ArH)
Пример 30. Получение N-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнинa (соединение 30)
Figure imgf000063_0002
Соединение 30
Смесь 2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнинa (соединение 12) (1,3 г; 7,5 ммоль), 1 ,4- бутансультона (3,4 г; 4,5 мл; 25 ммоль) и 1 ,2-диxлopбeнзoлa (10,0 мл) нагревают при интенсивном перемешивании в течение 8 ч при 12O0C. По окончанию нагревания в охлажденную до комнатной температуры реакционную массу добавляют ацетон (40 мл), выпавшие кристаллы собирают фильтрацией и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают N-cyльфoбyтил-2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнин (соединение 30) с выходом 2,26 г (89,9%). λmax 288 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci4H23NO3S): найдено m/z 310.8, рассчитано m/z 309.42.
Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 1-39 (6H, с, C(CHi)2), 1.73 (2H, м, CH2CH2CHZCH2SO3), 2.07 (2H, м, CH2CH2CH2CH2SO3), 2.3 (с, ЗН, 5-CHз), 2.81 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CHZSO3), 4.46 (2H, т, J 7.5, CHZCH2CH2CH2SO3), 7.28-7.52 (ЗН, м, ArH)
Пример 31. Получение 2,3,3,5-тeтpaмeтил-7V-этилиндoлeниний иодида (соединение 31)
Figure imgf000064_0001
Соединение 31
Смесь 2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнинa (соединение 12) (1,47 г; 8,48 ммоль) и этилиодида (5,5 мл) при перемешивании кипятят в токе азота в течение 15 ч. По окончанию нагревания в охлажденную до комнатной температуры реакционную массу добавляют безводный диэтиловый эфир (30 мл). Выпавшие кристаллы собирают фильтрацией и перекристаллизовывают из кипящего изопропанола (3 мл). Получают 2,3,3,5-тeтpaмeтил-N-этилиндoлeниний иодид (соединение 31) с выходом 1,14 г (40,7%). λmах 283 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci4H20N+): найдено m/z 201.3, рассчитано m/z 202.32.
Η-ЯМР (CDC13), D (м.д.): 1.59 (ЗН, т, CH2CH3), 1.61 (6H, с, C(CHj)2), 2.45 (ЗН, с, 2- CH2), 3.09 (ЗН, с, 5-CH2), 4.70 (2H, м, CH2CH3), 7.33 (2H, д, 4,6-ArH), 7.55 (IH, д, 7- ArH)
Пример 32. Получение 2,3,3,5,7-пeнтaмeтил-/V-(4-cyльфoбyтил)индoлeнинa (соединение 32)
Figure imgf000064_0002
Соединение 32
В стеклянный флакон помещают 2,3,3,5,7-пeнтaмeтилиндoлeнин (соединение 14) (187 мг; 1 ммоль), 1 ,4-бyтaнcyльтoн (272 мг; 200 мкл, 2 ммоль), 1 ,2-диxлopбeнзoл (1,6 мл) и нагревают при 118°C в течение 30 ч. В реакционную массу добавляют диэтиловый эфир. Образовавшийся осадок собирают фильтрацией, сушат в вакуум- эксикаторе над P2O5. Получают 2,3,3,5,7-пeнтaмeтил-N-(4-cyльфoбyтил)-индpлeнин (соединение 32) в виде светло-коричневого порошка с выходом 0,25 г (77%). λmax 282 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci7H25NO3S): найдено m/z 323.9, рассчитано m/z 323.45. Η-ЯМР (D2O), δ (м.д.): 1.41 (6H, с, C(CHi)2); 1-74 (2H, м, CH2CH2CHICH2SO3); 2.03 (2H, м, CH2CHICH2CH2SO3); 2.38 (ЗН, с, 5-CH2), 2.63 (ЗН, с, 7-CH3), 2.81 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CHISO3); 4.38 (2H, т, J 7.5, CH2CH2CH2CH2SO3); 7.43-7.61 (2H, м, ArH)
Пример 33. Получение 2,3,3,5,7-пeнтaмeтил-Λf-этилиндoлeниний иодида (соединение 33)
Figure imgf000065_0001
Соединение 33
Смесь 2,3,3,5,7-пeнтaмeтилиндoлeнинa (соединение 14) (1,59 г; 8,48 ммоль), этилиодида (5,5 мл) и ацетонитрила (5 мл) при перемешивании кипятят в токе азота в течение 15 ч. По окончанию нагревания в охлажденную до комнатной температуры реакционную массу добавляют безводный диэтиловый эфир (30 мл). Выпавшие кристаллы собирают фильтрацией и перекристаллизовывают из изопропанола (4 мл). Получают 2,3,3,5,7-пeнтaмeтил-N-этилиндoлeниний иодид (соединение 33) с выходом 0,8 г (27,6%). λmax 291 нм. Масс-спектр (MALDI) (Ci5H22N+): найдено m/z 216.7, рассчитано m/z 216.34.
Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1.57 (9H, м, C(CHi)2, CH2CH_з), 2.39 (ЗН, с, 2-CH3), 2.69 (ЗН, с, 5-CH2), 3.06 (ЗН, с, 7-CH2), 4.83 (2H, м, CH2CHi), 7.07 (с, 2H, ArH)
Пример 34. Получение 5-кapбoкcиэтил-./V-cyльфoбyтил-2,3,3- триметилиндоленина (соединение 34)
Figure imgf000066_0001
Соединение 34
В стеклянный флакон помещают 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 20) (231 мг; 1 ммоль), 1 ,4-бyтaнcyльтoн (162 мкл; 216 мг; 1,6 ммоль), бутиронитрил (2,2 мл) и нагревают в течение 22 ч при 1 180C. Охлажденную до комнатной температуры реакционную массу затирают с абсолютным диэтиловым эфиром. Образовавшийся осадок собирают фильтрацией и сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5 и KOH. Получают 5-кapбoкcиэтил-./V-cyльфoбyтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 34) с выходом 300 мг (86%). λmax 284 нм. Масс-спектр (MALDI) (CiSH2SNO5S): найдено m/z 368.2, рассчитано m/z 367.46.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1.51 (с, 6H, C(CHз)2), 1 -73 (т, 2H, CH7CH7CH2CH7SOi), 1.96 (т, 2H, CH2CH2CH2CH2SO3), 2.61 (т, J 7.5, 2H, CH2CH2COOH), 2.81 (с, ЗН, CH1), 2.95 (т, J 7.5, 2H, CHzCH2COOH), 4.46 (м, 2H, NCHi), 7.47-7.93 (м, ЗН, ArH)-
Пример 35. Получение 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтил-./V-этилиндoлeниний иодид (соединение 35)
Figure imgf000066_0002
Соединение 35
В стеклянный флакон помещают 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 20) (231 мг; 1 ммоль), этилиодид (500 мкл; 975 мг; 5.5 ммоль), ацетонитрил (2,2 мл) и нагревают в течение 15 ч при 1 180C. Затем охлаждают до комнатной температуры, добавляют абсолютный диэтиловый эфир (2 мл) и выдерживают при -180C в течение суток. Полученные кристаллы собирают фильтрацией и сушат в вакуум-эксикаторе над P2Oj и KOH. Получают 5- кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтил-/V-этилиндoлeниний иодид (соединение 35) с выходом 377 мг (97%). λmax 284 нм. Масс-спектр (MALDI) (C) 6H2iNO2): найдено m/z 259.8, рассчитано m/z 259.34.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1.44 (т, J 7.0, ЗН, CH2CHз), 1 -52 (с, 6H, C(CHi)2), 2.62 (т, J 7.5, 2H, CH2CH2COOH), 2.80 (с, ЗН, СНз), 2.96 (т, J 7.5, 2H, CHiCH2COOH), 4.47 (к, J 7.0, 2H, CH2CH3), 7.47-7.86 (м, ЗН, ArH)
Пример 36. Получение биc-(диэтилaцeтaль) малонового диальдегида (соединение 36)
Figure imgf000067_0001
Соединение 36
В трехгорлую колбу, снабженную обратным холодильником, механической мешалкой, термометром и капельной воронкой, помещают этилортоформиат (50,0 мл; 44,55 г; 0,3 моль) и эфират трехфтористого бора (0,5 мл). К нагретой до 3O0C реакционной массе по каплям добавляют винилэтиловый эфир (27 мл; 20,3 г; 0,28 моль) с такой скоростью, чтобы температура смеси не поднималась выше 36-38°C. Дополнительно перемешивают при комнатной температуре еще 1 ч. Затем в реакционную массу добавляют безводный карбонат калия (3 г; 0,02 моль) и перемешивают при комнатной температуре еще в течение 2 ч. Образовавшийся осадок отфильтровывают, а фильтрат фракционируют в вакууме в токе азота. Собирают фракцию с Tкип=101-102°C/12 мм рт. ст. Получают биc-(диэтилaцeтaль) малонового диальдегида (соединение 36) с выходом 43 г (69,2%). Масс-спектр (MALDI) (CnH24O4): найдено m/z 221.5, рассчитано m/z 220.31.
Η-ЯМР (CDC13), δ (м.д.): 1-20 (12H, т, OCH2CH3), 1.96 (2H, т, CH2), 3.46-3.71 (8H, м, OCHzCH3), 4.62 (2H, т, CH)
Пример 37. Получение хлоргидрата дианила малонового диальдегида (соединение 37)
Figure imgf000067_0002
Соединение 37
Смесь хлоргидрата анилина (4,72 г; 36,4 ммоль) и метанола (6 мл) нагревают до образования гомогенного раствора, к которому добавляют по каплям диэтилацеталь малонового диальдегида (соединение 36) (4,0 г, 18,2 ммоль). Затем суспензию кипятят в течение 10 мин, охлаждают до комнатной температуры, добавляют воду (500 мл) и выдерживают при +5°C в течение 24 ч. Образовавшийся осадок собирают фильтрацией, промывают ледяной водой и сушат в вакуум- эксикаторе над P2O5 и KOH. Получают хлоргидрат дианила малоновоrо диальдегида (соединение 37) в виде оранжево-желтых мелких кристаллов с выходом 4,2 г (89%). Масс-спектр (MALDI) (Ci5Hi5N2 +): найдено m/z 224.5, рассчитано m/z 223.29 Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 6.48 (2H, т, β-СН), 7.4 (ЮН, с, ArH), 8.9 (2H, т, α,α'-CH), 12.49 (2H, д, NH)
Пример 38. Получение 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '- триметил-ТV'-этилиндодикарбоцианина (соединение Al)
Figure imgf000068_0001
Соединение Al
1 Стадия. В стеклянный флакон помещают 2,3,3-тpимeтил-Λf-этилиндoлeниний иодид (соединение 27) (63,2 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусную кислоту (300 мкл) и нагревают в течение 2 ч при 1180C. По окончанию нагревания растворитель удаляют в вакууме.
2 Стадия. Остаток растворяют в уксусном ангидриде (1,7 мл) и добавляют раствор 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнинa (соединение 22) (80,1 мг; 0,21 ммоль) в смеси диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Реакционную массу выдерживают при комнатной температуре в течение суток.
Выделение. Продукты реакции предварительно очищают флэш- хроматографией на колонке RP- 18. Затем целевое соединение выделяют обращенно- фазовой хроматографией на колонке RP- 18 в системе aцeтoнитpил-0,05 M триэтламмонийацетат (TEAA) градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляют, а остаток разбавляют водой, вновь наносят на колонку RP-18, промывают 0, IM раствором NaCl, водой, затем выделяют обращенно-фазовой хроматографией в системе ацетонитрил-вода градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворитель удаляют в вакууме, остаток сушат в вакуум- эксикаторе над P2O5. Получают 3-(4-кapбoкcибyтил)-7V-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3'- триметил-УV'-этилиндодикарбоцианина (соединение Al) с выходом 45,7 мг (37,5%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C35H44N2O5S): найдено m/z 606.6, рассчитано m/z 604.80.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.43 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 1.24-1.31 (5H, м, CH2CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.64 (9H, с, 3,3',3'-CHi); 1.73 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 1.89 (2H, м, CH2CH7CH7CH7COOH); 2.18 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.41 (ЗН, м, CH2CH2CH2CHICOOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.12 (4H, м, CH2CH3, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.26 (IH, д, J 13.5, α'- CH); 6.41 (IH, д, J 13.5, α-СЩ 6.57 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.21-7.61 (8H, м, ArH); 8.32 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 39. Получение 3-(4-кapбoкcибyтил)-/V-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3',5'- тетраметил-УV'-этилиндодикарбоцианина (соединение A2)
Figure imgf000069_0001
Соединение A2
3-(4-Kapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 ',5 '-тетраметил-iV- этилиндодикарбоцианина (соединение A2) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-/V-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-тpимeтил-./V7-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3,3,5- тетраметил-N-этилиндолениний иодид (соединение 31) (67 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (1,7 мл), 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22) (80,1 мг; 0,21 ммоль), смесь диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают 3-(4-кapбoкcибyтил)- N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 ',5 '-тeтpaмeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнин (соединение A2) с выходом 40,2 мг (31,9%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C36H46N2O5S): найдено m/z 619.3, рассчитано m/z 618.83. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.22-1.35 (5H, м, CH2CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.64 (9H, с, 3,3',3'-CHз); 1.73 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.01 (2H, м, CH7CH7CH7CH7COOH); 2.18 (IH, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 2.37 (ЗН, с, 5'-CH2); 2.45 (ЗН, м, CH2CH2CH2CHZCOOH, CH2CH2CH2CHZSO3); 4.12 (4H, м, CH2CIh, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.32 (2H, м, α,α'-CH); 6.55 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.21-7.55 (7H, м, ArH); 8.27 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 40. Получение 3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3',3 ',5',7'-пeнтaмeтил-N-(4- cyльфoбyтил)-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение АЗ)
Figure imgf000070_0001
Соединение АЗ
3-(4-Kapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ',7 '-пeнтaмeтил-iV-(4-cyльфoбyтил)-N'- этилиндодикарбоцианина (соединение АЗ) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3'-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3,3,5,7- пентаметил-N-этилиндолениний иодид (соединение 33) (68,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (1,7 мл), 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-/V-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22) (80,1 мг; 0,21 ммоль), смесь диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают 3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ',7 '-пeнтaмeтил-jV-(4-cyльфoбyтил)-7V'- этилиндодикарбоцианин (соединение АЗ) с выходом 19,3 мг (20,2%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C37H48N2O5S): найдено m/z 633.6, рассчитано m/z 632.85.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.49 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.33 (5H, м, CH2CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.64 (9H, с, 3,3',3'-CH3); 1.72 (4H, м, CH2CH2CHICH2SO3); 2.01 (2H, м, CH2CH7CH7CH7COOH); 2.14 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.31 (ЗН, с, 5'-CH2); 2.4 (ЗН, м, CH2CH2CH2CHZCOOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.59 (ЗН, с, 7'-CH2); 4.06 (2H, м, CHzCH3); 4.27 (2H, м, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.35 (2H, м, α,α'-CH); 6.56 (IH, т, J 12.0, γ- CH); 6.99-7.54 (6H, м, ArH); 8.29 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 41. Получение 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 ',5- тетраметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение A4)
Figure imgf000071_0001
Соединение A4
3-(4-Kapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3',5-тeтpaмeтил-./V'- этилиндодикарбоцианина (соединение A4) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3'-тpимeтил-Λ/''-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3,3-тpимeтил- /V-этилиндолениний иодид (соединение 27) (63,2 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (1,7 мл), 3-(4- кapбoкcибyтил)-iV-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 23) (83,1 мг; 0,21 ммоль), смесь диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают 3-(4-кapбoкcибyтил)- N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 ',5-тeтpaмeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнин (соединение A4) с выходом 23,1 мг (18,3%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C36H46N2O5S): найдено m/z 619.1, рассчитано m/z 618.83. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.76 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.21-1.35 (5H, м, CH2CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.64 (9H, с, 3,3',3'-CH1); 1.73 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 1.99 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 2.16 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.36 (ЗН, с, 5-CHз); 2.44 (ЗН, м, CH2CH2CH2CHICOOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.1 (4H, м, CH2CH3, CHICH2CH2CH2SO3); 6.3 (2H, м, α,α'-CH); 6.54 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.22-7.53 (7H, м, ArH); 8.26 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 42. Получение 3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3',5,5'-пeнтaмeтил-УV-(4- cyльфoбyтил)-/V'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A5)
Figure imgf000071_0002
Соединение A5
3-(4-Kapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5,5 '-пeнтaмeтил-jV-(4-cyльфoбyтил)-7V'- этилиндодикарбоцианина (соединение A5) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3'-тpимeтил-7Vг'-этилиндoдикapбoциaнинa
(соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3,3,5- тетраметил-УV-этилиндолениний иодид (соединение 31) (67 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (1 мл), 3-(4-кapбoкcибyтил)-/V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 23) (84 мг; 0,21 ммоль), смесь диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают 3-(4-кapбoкcибyтил)- 3,3 ',3 ',5,5 '-пeнтaмeтил-7V-(4-cyльфoбyтил)-./V'-этилиндoдикapбoциaнин (соединение A5) с выходом 35 мг (27,2%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс- спектр (MALDI) (C37H4SN2O5S): найдено m/z 632.2, рассчитано m/z 632.85. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.47 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.75 (IH, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 1.23-1.35 (5H, м, CH2CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.63 (9H, с, 3,3',3'-CHз); 1.74 (4H, м, CH2CHICH2CH2SO3); 1.93 (2H, м, CH2CH7CH7CH7COOH); 2.13 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.36 (6H, с, 5,5'-CH3); 2.43 (ЗН, м, CH2CH2CH2CH2COOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.09 (4H, м, CHzCH3, CHICH2CH2CH2SO3); 6.22 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.36 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.52 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.18-7.42 (6H, м, ArH); 8.25 (2H, т, J 13, β.β'-СЮ
Пример 43. Получение 3,3 ',3',5,5 ',7'-гeкcaмeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4- cyльфoбyтил)-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A6)
Figure imgf000072_0001
Соединение A6
3,3 ',3 ',5,5 ',7 '-Гeкcaмeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-7V'- этилиндодикарбоцианина (соединение A6) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3 '-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3,3,5,7- пeнтaмeтил-Λг-этилиндoлeниний иодид (соединение 33) (68,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (1,7 мл), 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 23) (80,1 мг; 0,21 ммоль), смесь диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают
3,3 ',3 ',5,5 ',7 '-гeкcaмeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-7V-(4-cyльфoбyтил)-N'- этилиндодикарбоцианина (соединение A6) с выходом 22,2 мг (17,1%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C38HSoN2O5S): найдено m/z 647.2, рассчитано m/z 646.88.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.5 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.34 (5H, м, CH2CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.64 (9H, с, 3,3',3'-CHз); 1-74 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.02 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 2.17 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.33 (6H, с, 5,5'-CHз); 2.41 (ЗН, м, CH2CH2CH2CHICOOH, CH2CH2CH2CHISO3); 2.6 (ЗН, с, 7'-CHз); 4.09 (2H, м, CHiCH3); 4.27 (2H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.36 (2H, м, α,α'-CH); 6.55 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.1- 7.6 (5H, м, ArH); 8.3 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 44. Получение Λ/,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3'- триметилиндодикарбоцианина (соединение A7)
Figure imgf000073_0001
Соединение A7
ΛζN'-Диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианин (соединение A7) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3 '-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3-димeтил-З- (4-кapбoкcибyтил)-N-этилиндoлeниний иодид (соединение 21) (80,2 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (72,5 мг; 0,28 ммоль), уксусный ангидрид (3 мл), ацетилхлорид (65 мкл); (2 стадия) 5-cyльфo-2,3,3- триметил-N-этилиндоленин (соединение 29) (133,7 мг; 0,5 ммоль), уксусный ангидрид (3 мл), диизопропилэтиламин (120 мкл; 161,7 мг; 1,25 ммоль). Получают УV,УV'-диэтил- 3-(4-кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение A7) с выходом 31 мг (26,9%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C33H4ON2O5S): найдено m/z 577 '. O, рассчитано m/z 576.75. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.46 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.75 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.23-1.33 (8H, м, CH2CHз, CH2CHICH2CH2COOH); 1.68 (9H, с, 3,3',3'-CHз); 1-89 (2H, м, CH1CH2CH2CH2COOH); 2.16 (IH, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 2.4 (IH, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 4.13 (4H, м, CHzCH3); 6.26 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.34 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.56 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.2-7.8 (7H, м, ArH); 8.35 (2H, т, J 13, β,β'-CH)
Пример 45. Получение 3-(4-кapбoкcибyтил)-УV'-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3'- триметил-УV-этилиндодикарбоцианина (соединение A8)
Figure imgf000074_0001
Соединение A8
3-(4-Kapбoкcибyтил)-УV'-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-триметил-N- этилиндодикарбоцианин (соединение A8) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3 '-тpимeтил-Λг'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3-димeтил-З- (4-кapбoкcибyтил)-Λг-этилиндoлeниний иодид (соединение 21) (80,2 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (72,5 мг; 0,28 ммоль), уксусный ангидрид (3 мл), ацетилхлорид (65 мкл); (2 стадия) УV-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3- триметилиндоленин (соединение 26) (148,7 мг; 0,5 ммоль), уксусный ангидрид (3 мл), диизопропилэтиламин (120 мкл; 161,7 мг; 1,25 ммоль). Получают 3-(4- кapбoкcибyтил)-N'-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3'-тpимeтил-Λг-этилиндoдикapбoциaнин (соединение A8) с выходом 34 мг (28%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C35H44N2OsS): найдено m/z 605.7, рассчитано m/z 604.80. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.79 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.2-1.35 (5H, м, CH2OJi, CH2CHICH2CH2COOH); 1.65-1.81 (13H, м, 3,3',3'-CHз, CH2CHZCH2CH2SO3); 2.02 (2H, м, CHZCH2CH2CH2COOH); 2.17 (IH, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 2.34 (ЗН, м, CH7CH7CH7CH2COOH, CH2CH2CH2CHZSO3); 4.12 (4H, м, CH2CH3, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.35 (2H, м, α,α'-CH); 6.58 (IH, м, γ-СН); 7.22-7.61 (8H, м, ArH); 8.3 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 46. Получение 7V,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9)
Figure imgf000075_0001
Соединение A9
1 Стадия. В стеклянный флакон помещают 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5- сульфо-iV-этилиндоленин (соединение 24) (70,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл) и уксусную кислоту (350 мкл). Смесь нагревают в течение 2 ч при 1 18°C.
2 Стадия. В реакционную массу добавляют 2,3,3-тpимeтил-Λ^-этилиндoлeниний иодид (соединение 27) (66,2 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (98,1 мг; 1 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусную кислоту (350 мкл) и нагревают дополнительно 2 ч.
Выделение. Продукты реакции предварительно очищают флэш- хроматографией на колонке RP- 18. Затем целевое соединение выделяют обращенно- фазовой хроматографией в системе aцeтoнитpил-0.05M TEAA градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляют, остаток разбавляют водой, вновь наносят на колонку RP-18, промывают O,1M раствором NaCl, водой, затем выделяют обращенно-фазовой хроматографией в системе ацетонитрил-вода градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляют в вакууме, остаток сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают JV,./V'-ДИЭTИЛ-3-(4- кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3'-тpимeтилиндoдикapбoциaнин (соединение A9) с выходом 20,2 мг (17,5%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C33H4ON2O5S): найдено m/z 577.3, рассчитано m/z 576.75. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.47 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 1.24-1.36 (8H, м, CH2CHa, CH2CHICH2CH2COOH); 1.7 (9H, с, 3,3',3'-CH1); 1.9 (2H, м, CHZCH2CH2CH2COOH); 2.16 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.42 (IH, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 4.13 (4H, м, CH2CH3); 6.27 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.35 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.57 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.21-7.75 (7H, м, ArH); 8.34 (2H, т, Л 3, β,β'-CH)
Пример 47. Получение натриевой соли ./V,Λ'''-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение Al 0)
Figure imgf000076_0001
Соединение AlO
Натриевую соль iV,iV'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение AlO) получают аналогично синтезу N1N'- диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '-тpимeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) N-(4- cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 26) (59,1 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусную кислоту (160 мкл); (2 стадия) 2,3-димeтил-З- (4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22) (80,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (117 мг; 1,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл). Получают натриевую соль N,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение AlO) с выходом 71 мг (48%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C3VH47N2OgS"): найдено m/z 712.1, рассчитано m/z 711.91.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.45 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.32 (2H, м, CH2CHICH2CH2COOH); 1.65-1.8 (17H, м, 3,3',3'- CH3, CH2CH2CHZCH2SO3); 1.91 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.17 (IH, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 2.42 (5H, м, CH2CH2CH2CHICOOH, CH2CH2CH2CHZSO3); 4.09 (4H, м, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.37 (2H, м, α,α'-CH); 6.57 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.21- 7.6 (8H, м, ArH); 8.3 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 48. Получение натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-/V-(4- cyльфoбyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ',-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение AI l)
Figure imgf000076_0002
Соединение Al 1
Натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 '- триметил-тV'-этилиндодикарбоцианина (соединение AI l) получают аналогично синтезу натриевой соли Л^УV'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 5-cyльфo-2,3,3-тpимeтил-/V-этилиндoлeнин (соединение 29) (53,3 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (160 мкл); (2 стадия) 2,3- димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-7V-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22) (80,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (117 мг; 1,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл). Получают натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V- (4-cyльфoбyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ',-тpимeтил-УV-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение AI l) с выходом 31,5 мг (22,4%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс- спектр (MALDI) (C35H43N2OgS2 "): найдено m/z 684.3, рассчитано m/z 683.86. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.47 (IH, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.24-1.38 (5H, м, CH2CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.68 (13H, м, 3,3',3'-CH3, CH2CHICH2CH2SO3); 2.0 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 2.19 (I H, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.4 (ЗН, м, CH2CH2CH2CHICOOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.13 (4H, м, CH2CH3, CHICH2CH2CH2SO3); 6.26 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.43 (IH, д, J 13.5, α- CH); 6.57 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.23-7.79 (7H, м, ArH); 8.33 (2H, т, J 13, β,β'-CH)
Пример 49. Получение натриевой соли N,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 '-тетраметилиндодикарбоцианина (соединение Al 2)
Figure imgf000077_0001
Соединение Al 2
Натриевую соль N,7V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение А 12) получают аналогично синтезу 3- (4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3'-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) N-(4- cyльфoбyтил)-2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнин (61,9 мг; 0,2 ммоль) (соединение 30), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (160 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (1,7 мл), 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-iV-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22) (80,1 мг; 0,21 ммоль), смесь диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают натриевую соль Лf,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение А 12) с выходом 53,5 мг (35,7%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C38H^N2O8S2 "): найдено m/z 726.9, рассчитано m/z 725.94.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.47 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.79 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.32 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.65-1.8 (17H, м, 3,3',3'- CH1, CH2CHICHICH2SO3); 2.03 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.14 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.36 (4H, с, 5'-CH3, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.48 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.08 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.35 (2H, т, J 14, α,α'-CH); 6.57 (IH, т, J 12.5, γ-СН); 7.19-7.54 (7H, м, ArH); 8.3 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 50. Получение натриевой соли iV,Λf'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ', 7 '-пентаметилиндодикарбоцианина (соединение А 13)
Figure imgf000078_0001
Соединение Al 3
Натриевую соль ΛζN'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ', 7 '- пентаметилиндодикарбоцианина (соединение Al 3) получают аналогично синтезу натриевой соли ΛζN'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3,3,5,7-пeнтaмeтил-N-(4-cyльфoбyтил)индoлeнин (соединение 32) (64,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малоновоrо диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (200 мкл); (2 стадия) 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-/V-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22) (80,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (200 мг; 2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл). Получают натриевую соль УV,./V'-ди(4- cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ', 7 '-пентаметилиндодикарбоцианина (соединение Al 3) с выходом 8,2 мг (5,4%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (Q9H51 N2O8S2 ^): найдено m/z 741.2, рассчитано m/z 739.96.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.79 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.32 (2H, м, CH2CHICH2CH2COOH); 1.67-1.81 (17H, м, 3,3',3'- CH1, CH2CHICHZCH2SO3); 2.05 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.18 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.36 (4H, с, 5'-CH3, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.47 (4H, м,
CH2CH2CH2CH2SO3); 2.61 (ЗН, с, T-CR1); 4.12 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.37 (2H, т, J 14, α,α'-CH); 6.59 (IH, т, J 12.5, γ-СН); 7.21-7.55 (6H, м, ArH); 8.33 (2H, м, β,β'-CH) Пример 51. Получение натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-N-(4- cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-триметил-iV'-этилиндодикарбоцианина (соединение А 14)
Figure imgf000079_0001
Соединение А 14
Натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '- триметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение А 14) получают аналогично синтезу N,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 - триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-УVг-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 25) (99,9 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 2,3,3-тpимeтил-Λf- этилиндолениний иодид (соединение 27) (69,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (98 мг; 1 ммоль), уксусный ангидрид (350 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '- триметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение А 14) с выходом 10 мг (7,1%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C35H43N2O8S2): найдено m/z 683.1, рассчитано m/z 683.86.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 1.25-1.39 (5H, м, CH2CHs, CH2CHZCH2CH2COOH); 1.7 (13H, м, 3,3',3'-CH2, CH2CHICHICH2SO3); 2.04 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.21 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.4 (ЗН, м, CH2CH2CH2CH2COOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.12 (4H, м, CHiCH3, CHICH2CH2CH2SO3); 6.28 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.45 (IH, д, J 13.5, α- CH); 6.57 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.25-7.8 (7H, м, ArH); 8.35 (2H, т, J 13, β,β'-CH)
Пример 52. Получение натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-iV-(4- cyльфoбyтил)-3,3 ',3 ',5 '-тетраметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение Al 5)
Figure imgf000080_0001
Соединение Al 5
Натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 ',5 '- тeтpaмeтил-Λr'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al 5) получают аналогично синтезу 7V,УV'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 25) (99,9 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 2,3,3,5-тeтpaмeтил-7V- этилиндолениний иодид (соединение 31) (69,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (118 мг; 1,2 ммоль), уксусный ангидрид (350 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-./V-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3 ',5 '- тетраметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение Al 5) с выходом 13,3 мг (9,2%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C36H45N2O8S2 "): найдено m/z 697 'Л, рассчитано m/z 697.88.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.24 (ЗН, т, CH2CHз); 1.37 (2H5 м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.66 (9H, с, З.З'.З'-СНз); 1.74 (4H5 м, CH2CH2CHICH2SO3); 2.01 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.18 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.4 (4H, с, 5'-CHз, CH2CH2CH2CHZCOOH); 2.59 (2H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.12 (4H5 м, CHzCH3, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.23 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.42 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.57 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.23-7.75 (6H, м, ArH); 8.3 (2H, т, J 13, β.β'-СН)
Пример 53. Получение натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5',7'- пeнтaмeтил-5-cyльфo-jV-(4-cyльфoбyтил)-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A16)
Figure imgf000080_0002
Соединение Al 6
Натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ',7'-пeнтaмeтил-5-cyльфo-N-(4- cyльфoбyтил)-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение А 16) получают аналогично синтезу N, N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 25) (99,9 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 2,3,3,5,7-пeнтaмeтил-N- этилиндолениний иодид (соединение 33) (68,7 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (98,1 мг; 1 ммоль), уксусный ангидрид (350 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3',5',7'-пeнтaмeтил-5-cyльфo-N-(4- cyльфoбyтил)-7V'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A16) с выходом 8,5 мг (5,8%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C3VH47N2OsS2 "): найдено m/z 711.3, рассчитано m/z 711.91.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.5 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.79 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.35 (5H, м, CH2CHs, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.65 (9H, с, 3,3',3'-CHз); 1.75 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.05 (2H, м, CH2CH7CH7CH7COOH); 2.18 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.32 (6H, с, 5,5'-CH3); 2.42 (ЗН, м, CH2CH2CH2CHICOOH, CH2CH2CH2CHZSO3); 2.6 (ЗН, с, 7'-CH2); 4.08 (2H, м, CH2CH3); 4.28 (2H, м, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.37 (2H, м, α,α'-CH); 6.59 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.1- 7.59 (5H, м, ArH); 8.3 (2H, м, β.β'-СН)
Пример 54. Получение натриевой соли Λζ./V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5-тeтpaмeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al 7)
Figure imgf000081_0001
Соединение Al 7
Натриевую соль УV,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение А 17) получают аналогично синтезу 3- (4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3'-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) N-(4- cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 26) (59,1 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (150 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (1,7 мл), 3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 23) (83,1 мг, 0,21 ммоль), смесь диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают натриевую соль N,./V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение Al 7) с выходом 42,8 мг (28,6%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C3SH^N2OsS2 "): найдено m/z 725.1, рассчитано m/z 725.94.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.32 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.65-1.8 (17H, м, 3,3',3'- СНз, CH2CHZCH1CH2SO3); 2.00 (2H, м, CHZCH2CH2CH2COOH); 2.15 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.37 (4H, с, 5'-CH3, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.43 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.08 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.28 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.39 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.57 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.19-7.59 (7H, м, ArH); 8.28 (2H, т, J 13, β,β'-CH)
Пример 55. Получение натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4- cyльфoбyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ',5-тeтpaмeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A18)
Figure imgf000082_0001
Соединение Al 8
Натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ',5- тетраметил-iV'-этилиндодикарбоцианина (соединение А 18) получают аналогично синтезу Λг,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 5-cyльфo-2,3,3-тpимeтил-Λf-этилиндoлeнин (соединение 29) (53,3 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (200 мкл); (2 стадия) 3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 23) (84 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (236 мг; 2,4 ммоль), уксусный ангидрид (500 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V- (4-cyльфoбyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ',5-тeтpaмeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al 8) с выходом 25,5 мг (17,7%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C36H4SN2O8S2 "): найдено m/z 698.5, рассчитано m/z 697.88.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.49 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.22 (ЗН, т, CH2CHi); 1.36 (2H, м, CH7CH7CH7CH7COOH); 1.64 (9H, с, 3,3',3'-CHз); 1-74 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.02 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.17 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.38 (4H, с, 5-CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.59 (2H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.1 (4H, м, CH2CH^, CHICH2CH2CH2SO3); 6.21 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.43 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.56 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.2-7.77 (6H, м, ArH); 8.29 (2H, т, J 13, β,β'-CH)
Пример 56. Получение натриевой соли ΛζN'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5,5 '-пентаметилиндодикарбоцианина (соединение Al 9)
Figure imgf000083_0001
Соединение Al 9
Натриевую соль 7V,./V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5,5 '- пентаметилиндодикарбоцианина (соединение Al 9) получают аналогично синтезу 3- (4-кapбoкcибyтил)-ΛЦ4-cyльфoбyтил)-3,3',3 '-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) /V-(4- cyльфoбyтил)-2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнин (61,9 мг; 0,2 ммоль) (соединение 30) (62 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (200 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (1,7 мл), 3-(4-кapбoкcибyтил)-,/V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5- триметилиндоленина (соединение 23) (80,1 мг; 0,21 ммоль), смесь диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают натриевую соль /V,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5,5 '-пентаметилиндодикарбоцианина (соединение A19) с выходом 34,6 мг (22,6%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C39H5IN2O8S2 "): найдено m/z 741.0, рассчитано m/z 739.96.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.76 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.32 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.63 (17H, м, 3,3',3'-CH1, CH2CHZCHICH2SO3); 1.95 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 2.13 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.36 (6H, с, 5,5'-CH3); 2.41 (9H, м, CH7CH7CH7CH2COOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.07 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.32 (2H, м, α,α'-CH); 6.54 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.18-7.42 (6H, м, ArH); 8.26 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 57. Получение натриевой соли 3,3 ',3',5,5',7'-гeкcaмeтил-jV,./V'-ди(4- cyльфoбyтил)-3 -(4-кapбoкcибyтил)-индoдикapбoциaнинa (соединение A20)
Figure imgf000084_0001
Соединение A20
Натриевую соль 3,3 ',3',5,5',7'-гeкcaмeтил-Λ^N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-индoдикapбoциaнинa (соединение A20) получают аналогично синтезу N,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3,3,5,7-пeнтaмeтил-N-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 30) (64,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 35) (51,8 мг; 0,2 ммоль), 700 мкл уксусного ангидрида, 200 мкл уксусной кислоты; (2 стадия) 3-(4-кapбoкcибyтил)-jV-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтил-индoлeнин
(соединение 22) (84 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (200 мг; 2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (200 мкл). Получают натриевую соль 3,3',3 ',5,5',7'-гeкcaмeтил-N,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)- индодикарбоцианина (соединение A20) с выходом 7 мг (4,5%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C4OHs3N2O8S2 "): найдено m/z 755.4, рассчитано m/z 753.99.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.49 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.31 (2H, м, CH2CHZCH2CH2COOH); 1.65-1.79 (17H, м, 3,3',3'- СНз, CH2CHZCHZCH2SO3); 2.07 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.19 (IH, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 2.37 (7H, с, 5,5'-CH3, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.47 (4H, м, CH2CH2CH2CHISO3); 2.6 (ЗН, с, 7'-CHз); 4.1 (4H, м, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.39 (2H, т, J 14, α,α'-CH); 6.6 (IH, т, J 12.5, γ-СН); 7.24-7.54 (5H, м, ArH); 8.32 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 58. Получение натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-N'-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '-триметил-ТV-этилиндодикарбоцианина (соединение A21)
Figure imgf000085_0001
Соединение A21
Натриевую соль 3-(4-кapбoкcибyтил)-Λг'-(4-cyльфoбyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 - триметил-N-этилиндодикарбоцианина (соединение A21) получают аналогично синтезу ΛζN'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-7V-этилиндoлeнин (соединение 24) (70,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) УV-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 26) (62,0 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (196 мг; 2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл). Получают натриевую соль 3-(4- кapбoкcибyтил)-N'-(4-cyльфoбyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '-триметил-УV- этилиндодикарбоцианина (соединение A21) с выходом 28,5 мг (20,2%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C3SH43N2OsS2 "): найдено m/z 684.2, рассчитано m/z 683.86.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.5 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 1.21 (ЗН, т, CH2CHi); 1.34 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.66-1.79 (13H, м, 3,3',3'-CH3, CH2CHICHICH2SO3); 2.02 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 2.19 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.43 (ЗН, м, CH2CH2CH2CHZCOOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.12 (4H, м, CH2CH3, CHICH2CH2CH2SO3); 6.3 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.4 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.58 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.24-7.75 (7H, м, ArH); 8.35 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 59. Получение натриевой соли 5,5'-диcyльфo-N,7V'-диэтил-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение A22)
Figure imgf000086_0001
Соединение A22
Натриевую соль 5,5'-диcyльфo-Лг,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A22) получают аналогично синтезу N,N'- диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '-тpимeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3-димeтил-З- (4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-/V-этилиндoлeнин (соединение 24) (70,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 5-cyльфo-2,3,3- триметил-уV-этилиндоленин (соединение 29) (56,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (196 мг; 2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл). Получают натриевую соль 5,5'-диcyльфo-N,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A22) с выходом 18,3 мг (13,5%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C33H^N2O8S2 "): найдено m/z 656.5, рассчитано m/z 655.80.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.51 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.75 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.22-1.38 (8H, м, CH2CH3, CH2CHZCH2CH2COOH); 1.69 (9H, с, 3,3',3'-CHз); 2.04 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.21 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.43 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 4.14 (4H5 м, CH2CHQ; 6.33 (2H, м, α,α'-CH); 6.57 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.28-7.82 (6H, м, ArH); 8.35 (2H, м, β,β'- CH); 11.88 (IH, с, COOH)
Пример 60. Получение динатриевой соли N,Λг'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение A23)
Figure imgf000086_0002
Соединение A23
Динатриевую соль Λf Λf'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5 '-сульфо- 3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение A23) получают аналогично синтезу Лf./V'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина
(соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 5-cyльфo-vV-(4- cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 28) (82,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 2,3-димeтил-З- (4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22) (80,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (1 17 мг; 1,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают динатриевую соль TV, Λf'-ди(4-cyльфoбyтил)-3- (4-кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3'-тpимeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A23) с выходом 53,8 мг (32,1%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C37H46N2OnS3 2"): найдено m/z 789.6, рассчитано m/z 790.97. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.46 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.33 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.65-1.75 (17H, м, 3,3',3'- CH3, CH2CHICHICH2SO3); 2.02 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.16 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.39 (5H, м, CH2CH2CH2CH2COOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.09 (4H, м, CHICH2CH2CH2SO3); 6.38 (2H, м, α,α'-CH); 6.59 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.22- 7.79 (7H, м, ArH); 8-32 (2H, м, β,β'-CH); 11.9 (IH, с, COOH)
Пример 61. Получение динатриевой соли N,iV'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение A24)
Figure imgf000087_0001
Соединение A24
Динатриевую соль N,jV'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo- 3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение A24) получают аналогично синтезу /ЧiV'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 -триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 2 ,3 -димeтил-3 -(4-кapбoкcибyтил)-/V-(4-cyльфoбyтил)-5 -сульфоиндоленина (соединение 25) (99,9 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 7V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 26) (62 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (1 18 мг; 1,2 ммоль), уксусный ангидрид (350 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают динатриевую соль N,N'-дя(4- cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '-тpимeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A24) с выходом 40,5 мг (24,1%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C37H46N2Oi iS3 2~): найдено m/z 790.5, рассчитано m/z 790.97.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.52 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.38 (2H, м, CH2CHZCH2CH2COOH); 1.68-1.79 (21H, м, 3,3',3'- CH1, CH2CH2CH2CH2SO3); 1.91 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.15 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.39 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 4.09 (4H, м, CHICH2CH2CH2SO3); 6.37 (2H, м, α,α'-CH); 6.63 (IH, м, γ-СН); 122-1.1% (7H, м, ArH); 8.31 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 62. Получение динатриевой соли 5,5 '-диcyльфo-3-(4-кapбoкcибyтил)- N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 -триметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение A25)
Figure imgf000088_0001
Соединение A25
Динатриевую соль 5,5 -диcyльфo-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)- 3,3 ',3 '-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A25) получают аналогично синтезу УV,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфoинд оленина (соединение 25) (99,9 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 5-cyльфo-2,3,3-тpимeтил- N-этилиндоленин (соединение 29) (56,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (176 мг; 1,8 ммоль), уксусный ангидрид (350 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают динатриевую соль 5,5 '-диcyльфo-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '- триметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение A25) с выходом 46,4 мг (29,5%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C35H42N2OnS3 2"): найдено m/z 762.0, рассчитано m/z 762.91. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.51 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.76 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.21-1.36 (5H, м, CH2CH1, CH2CHSCH2CH2COOH); 1.65-1.78
(13H, м, 3,3',3'-CHз, CH2CHICHICH2SO3); 2.13 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 2.22 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.37 (ЗН, м, CH7CH7CH7CH2COOH, CH2CH2CH2CHISO3); 4.12 (4H5 м, CH2CH3, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.31 (IH, д, J 13.5, α'- CH); 6.42 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.6 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.3-7.8 (6H, м, ArH); 8.35 (2H, м, β.β'-СН)
Пример 63. Получение динатриевой соли N,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 ',5 '-тетраметилиндодикарбоцианина (соединение A26)
Figure imgf000089_0001
Соединение A26
Динатриевую соль N, N'-ди(4-cyп ьфoбyтил)-3 -(4-кapбoкcибyтил)-5 -сульфо- 3,3 ',3 ',5 '-тетраметилиндодикарбоцианина (соединение A26) получают аналогично синтезу ./V,jV'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 25) (99,9 мг, 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) УV-(4-cyльфoбyтил)-2, 3,3,5- тетраметилиндоленин (соединение 30) (80,1 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (176 мг, 1,8 ммоль), уксусный ангидрид (300 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают динатриевую соль jV,./V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo- 3,3 ',3 ',5 '-тетраметилиндодикарбоцианина (соединение A26) с выходом 68,8 мг (40,4%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C38H48N2OnS2 "): найдено m/z 804.2, рассчитано m/z 804.99.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.52 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CHZCH2COOH); 1.39 (2H, м, CH2CHICH2CH2COOH); 1.67 (18H, м, 3,3',3'-CHз, CH2CHICHICH2SO3, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.17 (2H, м, CH7CH7CH7CH7COOH); 2.37 (8H, м, 5'-CH3, CH2CH2CH2CHZCOOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.09 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.38 (2H, м, α,α'-CH); 6.59 (IH, м, γ-СН); 7.2-7.72 (6H, м, ArH); 8.32 (2H, м, β-β'-СН) Пример 64. Получение динатриевой соли iV,Л/7-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3',5 ',7'-пeнтaмeтил-5-cyльфoиндoдикapбoциaнинa (соединение A27)
Figure imgf000090_0001
Соединение A27
Динатриевую соль ΛζN'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ', 7 '- пeнтaмeтил-5-cyльфoиндoдикapбoциaнинa (соединение A27) получали аналогично синтезу N, N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 - триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 25) (99,9 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (200 мкл); (2 стадия) Λf-(4-cyльфoбyтил)- 2,3,3,5,7-пeнтaмeтилиндoлeнин (соединение 32) (64,7 мг; 0,2 ммоль), безводный ацетат калия (98,1 мг; 1 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают динатриевую соль N,Λг'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)- 3,3',3 ',5',7'-пeнтaмeтил-5-cyльфoиндoдикapбoциaнинa (соединение A27) с выходом 7 мг (4%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (Cз9H5oN2OцSз2~): найдено m/z 820.5, рассчитано m/z 819.02.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.48 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.3 (2H, м, CH2CHICH2CH2COOH); 1.68-1.83 (17H, м, 3,3',3'- CH3, CH2CHZCH2CH2SO3); 2.12 (2H, м, CHZCH2CH2CH2COOH); 2.21 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.4 (4H, с, 5'-CH3, CH2CH2CH2CHZCOOH); 2.48 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 2.62 (ЗН, с, 7'-CH3); 4.12 (4H, м, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.41 (2H, т, J 14, α,α'-CH); 6.58 (IH, т, J 12.5, γ-СН); 7.2-7.56 (5H, м, ArH); 8.35 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 65. Получение динатриевой соли Λζ./V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ', 5-тeтpaмeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A28)
Figure imgf000091_0001
Соединение A28
Динаτриевую соль N,7V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5 '-сульфо- 3,3 ',3 ',5-тeтpaмeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A28) получают аналогично синтезу ΛζN'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 5-cyльфo-./V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 28) (82,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (200 мкл); (2 стадия) 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5- триметилиндоленин (соединение 23) (84 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (350 мг; 3,6 ммоль), уксусный ангидрид (500 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают динатриевую соль ΛζiV'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ', 5- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение A28) с выходом 85,6 мг (50,3%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C38H48N2OnSa2"): найдено m/z 805.5, рассчитано m/z 804.99.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.45 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.77 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.32 (2H, м, CH2CHZCH2CH2COOH); 1.67 (17H, м, 3,3',3'-CHз, CH2CH2CHICH2SO3); 1.92 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.17 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.37 (8H, м, 5-CH3, CH7CH7CH7CH2COOH, CH2CH2CH2CH2SO3); 4.1 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.27 (IH, д, J 13.5, α'-СН); 6.41 (IH, д, J 13.5, α-СН); 6.58 (IH, т, J 12.0, γ-СН); 7.2-7.76 (6H, м, ArH); 8.28 (2H, м, β,β'-
CH)
Пример 66. Получение динатриевой соли 5,5'-диcyльфo-3-(4-кapбoкcибyтил)- Λf'-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-триметил-iV-этилиндодикарбоцианина (соединение A29)
Figure imgf000091_0002
Соединение A29 Натриевую соль 5,5'-диcyльфo-3-(4-кapбoкcибyтил)-./V'-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '- триметил-N-этилиндодикарбоцианина (соединение A29) получают аналогично синтезу Λζ iV'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-/V-этилиндoлeнин (соединение 24) (70,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 5-cyльфo-УV-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 28) (86,8 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (294 мг; 3 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл). Получают натриевую соль 5,5'-диcyльфo-3-(4-кapбoкcибyтил)-N'-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-тpимeтил-7V- этилиндодикарбоцианина (соединение A29) с выходом 29,7 мг (18,8%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C35H42N2Oi IS3 ~): найдено m/z 763.2, рассчитано m/z 762.91.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.52 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.73 (IH, м, CH2CH2CHICH2COOH); 1.22-1.35 (5H, м, CH2CHз, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.68 (15H, м, 3,3',3'-CHз, CH2CH2CHICH2SO3); 2.02 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.18 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 2.37 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 4.12 (4H, м, CHiCH3, CH2CH2CH2CH2SO3); 6.36 (2H, м, α,α'-CH); 6.59 (IH, м, γ-СН); 7.0-7.79 (6H, м, ArH); 8.35 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 67. Получение тринатриевой соли 5,5 '-диcyльфo-7V,7V'-ди(4- cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение АЗО)
Figure imgf000092_0001
Соединение АЗО
Тринатриевую соль 5,5'-диcyльфo-7V,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4- кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '-триметилиндодикарбоцианина (соединение АЗО) получают аналогично синтезу ΛfjV'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-iV-(4- cyльфoбyтил)-5-cyльфoиндoлeнинa (соединение 25) (99,9 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (51,8 мг; 0,2 ммоль), уксусный ангидрид (700 мкл), уксусная кислота (350 мкл); (2 стадия) 5-cyльфo-/V-(4- cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 28) (86,8 мг; 0,21 ммоль), безводный ацетат калия (236 мг; 2,4 ммоль), уксусный ангидрид (350 мкл), уксусная кислота (700 мкл). Получают тринатриевую соль 5,5'-диcyльфo-jV,./V'-ди(4- cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 -триметилиндодикарбоцианина (соединение АЗО) с выходом 77,8 мг (41,4%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс- спектр (MALDI) (C37H45N2Oi4S4 3"^): найдено m/z 870.0, рассчитано m/z 870.02. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 0.53 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 0.78 (IH, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.39 (2H, м, CH2CH2CH2CH2COOH); 1.67-1.81 (21H, м, 3,3',3'- CH1, CH2CH2CH2CHISO3); 1.92 (IH, м, CH2CH2CH2CHICOOH); 2.17 (2H, м, CHICH2CH2CH2COOH); 2.41 (IH, м, CH2CH2CH2CHZCOOH); 4.12 (4H, м, CHZCH2CH2CH2SO3); 6.39 (2H, м, α,α'-CH); 6.64 (IH, м, γ-СН); 7.25-7.81 (6H, м, ArH); 8.33 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 68. Получение 5-кapбoкcиэтил-N-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тeтpaмeтил-N'- этилиндодикарбоцианина (соединение В 1 )
Figure imgf000093_0001
Соединение Bl
5-Kapбoкcиэтил-N-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тeтpaмeтил-7V'- этилиндодикарбоцианина (соединение Bl) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyл ьфoбyтил)-3 ,3 ',3 '-триметил-ТV'-этилиндодикарбоцианина (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 2,3,3-тpимeтил- jV-этилиндолениний иодид (соединение 27) (53,5 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) 58,8 мг; 0,23 ммоль), уксусный ангидрид (1 мл), ацетилхлорид (64 мкл); (2 стадия) уксусный ангидрид (2 мл), 5-кapбoкcиэтил-N- cyльфoбyтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 34) (80,7 мг; 0,22 ммоль), 545 мкл смеси диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают 5-кapбoкcиэтил-N-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '- тетраметил-УV'-этилиндодикарбоцианина (соединение Bl) с выходом 57 мг (48%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C34H42N2O5S): найдено m/z 591.0, рассчитано m/z 590.77.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1 -26 (ЗН, т, J 7.0, CH2CH2), 1.63 (12H, с, C(CHi)2), 1-73 (4H, м, CH2CH2CHICH2SO3), 2.48 (2H, м, CH2CH2CH2CH2SO3), 2.58 (2H, т, J 7.5, CH2CHiCOOH), 2.88 (2H, т, J 7.5, CHiCH2COOH), 4.10 (4H, м, NСJЬ), 6.37 (2H, д, J 13.5, α,α' -CH), 6.56 (IH, т, J 12.0, γ-СН), 7.19-7.63 (6H, м, ArH), 8.31 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 69. Получение N,N'-диэтил-5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-3,3,3',3 - тетраметилиндодикарбоцианина (соединение B2)
Figure imgf000094_0001
Соединение B2
ΛζN'-Диэтил-5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфoиндoдикapбoциaнин (соединение B2) получают аналогично синтезу ΛζN'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 ',- триметилиндодикарбоцианина (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 5-cyльфo-2,3,3-тpимeтил-N-этилиндoлeнин (соединение 29) (53,3 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малоновоrо диальдегида (соединение 37) (58,7 мг; 0,23 ммоль), уксусный ангидрид (1,5 мл), уксусная кислота (0,5 мл); (2 стадия) 5- кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтил-./V-этилиндoлeниний иодид (соединение 35) (85,0 мг; 0,22 ммоль), безводный ацетат калия (120 мг; 1,2 ммоль), уксусный ангидрид (1,5 мл), уксусная кислота (0,5 мл). Получают ΛζN'-диэтил-5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-3,3,3 ',3 '- тетраметилиндодикарбоцианин (соединение B2) с выходом 60 мг (53%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C32H38N2OsS): найдено m/z 563.2, рассчитано m/z 562.72.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1.25 (6H, т, J 7.0, CH2CH3), 1.69 (2H, с, lQСНзh), 2.32 (2H, т, J 7.5, CH2CH2COOH), 2.86 (2H, т, J 7.5, CH2CH2COOH), 4.95 (4H, м, NCH2), 6.30 (2H, д, J 13.5, α,α'-CH), 6.58 (IH, т, J 12.0, γ-СН), 7.21-7.63 (6H, м, ArH), 8.31 (2H, м, β,β'-Ш)
Пример 70. Получение 5-кapбoкcиэтил-./V7-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тeтpaмeтил-./V- этилиндодикарбоцианина (соединение ВЗ)
Figure imgf000094_0002
Соединение ВЗ
5-Kapбoкcиэтил-/V'-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 -тетраметил-N- этилиндодикарбоцианин (соединение ВЗ) получают аналогично синтезу JV, N'-диэтил- 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 ',-тpимeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) N-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3- триметилиндоленин (соединение 26) (59,1 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (58,7 мг; 0,23 ммоль), уксусный ангидрид (1,5 мл), уксусная кислота (0,5 мл); (2 стадия) 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтил-/V- этилиндолениний иодид (соединение 35) (85,0 мг, 0,22 ммоль), безводный ацетат калия (120 мг; 1,2 ммоль), уксусный ангидрид (1,5 мл), уксусная кислота (0,5 мл). Получают 5-кapбoкcиэтил-N'-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тетраметил-ТV- этилиндодикарбоцианин (соединение ВЗ) с выходом 59 мг (50%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C34H42N2OsS): найдено m/z 592.8, рассчитано m/z 590.77. .
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1.28 (ЗН, с, CH2CHз), 1-67 (12H, с, C(CHj)2), 1-74 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3), 2.27 (2H, т, J 7.5, CH2CH2COOH), 2.48 (2H, м, CH2CH2CH2CH2SO3), 2.82 (2H, т, J 7.5, CHiCH2COOH), 4.13 (4H, м, NCH1), 6.30 (2H, д, J 13.5, α,α' -CH), 6.56 (IH, т, J 12.0, γ-СН), 7.24-7.58 (7H, м, ArH), 8.28 (2H, м, β,β'-
CH)
Пример 71. Получение натриевой соли 7V,./V'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил- 3,3,3 ',3 ',5'-пeнтaмeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение B4)
Figure imgf000095_0001
Соединение B4
Натриевую соль Λf,УV'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил-3,3,3 ',3',5'- пентаметилиндодикарбоцианина (соединение B4) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-Λf-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-тpимeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) N-(4- cyльфoбyтил)-2,3,3,5-тeтpaмeтилиндoлeнин (61,9 мг; 0.2 ммоль) (соединение 30), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (58,8 мг; 0,23 ммоль), уксусный ангидрид (1 мл), ацетилхлорид (64 мкл); (2 стадия) 3-(4-кapбoкcибyтил)-N- (4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 34) (80,7 мг; 0,22 ммоль), уксусный ангидрид (2 мл), 545 мкл смеси полученной из диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают натриевую соль N,N'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил-3,3,3 ',3 ',5'- пентаметилиндодикарбоцианина (соединение B4) с выходом 81 мг (55%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C37H47N2OgS2 "): найдено m/z 713.0, рассчитано m/z 711.91.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1.66 (12H, с, C(CH3J2), 1-74 (8H, м, CH2CH2CHZCH2SO3), 2.36 (ЗН, с, CH2), 2.42 (4H, м, CH2CH2CH2CHISO3), 2.86(2H, Т, J 7.5, CH2CHiCOOH), 3.44 (2H, м, CH2CH2COOH), 4.06 (4H, с, NCH2), 6.31 (2H, д, J 13.5, α,α'-CH), 6.56 (IH, т, J 12.0, γ-СН), 7.17-7.47 (6H, м, ArH), 8-26 (2H, т, β.β'-СН)
Пример 72. Получение натриевой соли N,N'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил- 3,3,3 ',3 '-тeтpaмeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение B5)
Figure imgf000096_0001
Соединение B5
Натриевую соль N,7V'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил-3,3,3 ',3 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение B5) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-тpимeтил-Λг'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) УV-(4- cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 26) (59,1 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (58,8 мг; 0,23 ммоль), уксусный ангидрид (1 мл), ацетилхлорид (64 мкл); (2 стадия) 3-(4-кapбoкcибyтил)-УV- (4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 34) (80,7 мг; 0,22 ммоль), уксусный ангидрид (2 мл), 545 мкл смеси полученной из диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг; 7,2 ммоль). Получают натриевую соль N,N'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил-3,3,3',3 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение B5) с выходом 104 мг (72%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C36H45N2OgS2 "): найдено m/z 699.0, рассчитано m/z 697.88.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1.67 (12H, с, C(CHj)2), 1-75 (8H, м, CH7CH7CH2CH7SOO, 2.36 (2H, т, J 7.5, CH2CHiCOOH), 2.43 (4H, м, CH2CH2CH2CHISO3), 2.85 (2H, т, J 7.5, CH2CH2COOH), 4.06 (4H, м, NCH2), 6.33 (2H, д, J 13.5, α,α'-CH), 6.58 (IH, т, J 12.0, γ- CH), 7.19-7.57 (7H, м, ArH), 8.28 (2H, м, β,β'-CH)
Пример 73. Получение натриевой соли 5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-./V- cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тетраметил-Λf'-этилиндодикарбоцианина (соединение B6)
Figure imgf000097_0001
Соединение B6
Натриевую соль 5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-7V-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тетраметил- N'-этилиндодикарбоцианина (соединение B6) получают аналогично синтезу 3-(4- кapбoкcибyтил)-ΛЦ4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-тpимeтил-УV'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) 5-cyльфo-2,3,3- триметил-N-этилиндоленин (соединение 29) (63,0 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдегида (соединение 37) (58,8 мг; 0,23 ммоль), уксусный ангидрид (1 мл), ацетилхлорида (64 мкл); (2 стадия) 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5- триметилиндоленин (соединение 34) (80,7 мг; 0,22 ммоль), уксусный ангидрид (2 мл), 545 мкл смеси полученной из диизопропилэтиламина (200 мкл; 269,5 мг; 2,1 ммоль) и уксусного ангидрида (800 мкл; 739,4 мг, 7,2 ммоль). Получают натриевую соль 5- кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-N-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тетраметил-N'- этилиндодикарбоцианина (соединение B6) с выходом 39 мг (28%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C34H4IN2O8S2 "): найдено m/z 670.8, рассчитано m/z 669.83.
Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1.23 (ЗН, т, J 7.0, CH2CHa), 1-67 (12H, с, C(CHs)2), 1.76 (4H, м, CH2CHZCHICH2SO3), 2.25 (2H, т, J 7.5, CH2CHiCOOH), 2.47 (2H, м, CH2CH2CH2CHISO3), 2.83 (2H, т, J 7.5, CHsCH2COOH), 4.90 (4H, м, NСНг), 6.32 (2H, д, J 13.5, α,α'-CH), 6.56 (IH, т, J 12.0, γ-СН), 7.23-7.62 (6H, м, ArH), 8.28 (2H, м, β,β'-
CH)-
Пример 74. Получение динатриевой соли N,N'-диcyльфoбyтил-5- кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-3,3,3 ',3 '-тетраметилиндодикарбоцианина (соединение B7)
Figure imgf000097_0002
Соединение B7 Динатриевую соль N,N'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-3,3,3 ',3 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение B7) получают аналогично синтезу N,N'- диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3',3 ',-тpимeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A9) при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) калиевая соль 5- cyльфo-/V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,3-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 28) (82,7 мг; 0,2 ммоль), хлоргидрат дианила малонового диальдеrида (соединение 37) (58,7 мг; 0,23 ммоль), уксусный ангидрид (2 мл), уксусная кислота (0,5 мл); (2 стадия) 3-(4- кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнинa (соединение 34) (80,7 мг; 0,22 ммоль), безводный ацетат калия (120 мг; 1,2 ммоль), уксусный ангидрид (1,5 мл), уксусная кислота (1 мл). Получают динатриевую соль N,N'-диcyльфoбyтил-5- кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-3,3,3',3 '-тетраметилиндодикарбоцианина (соединение B7) с выходом 55 мг (33%). Спектральные характеристики см. таблицу. Масс-спектр (MALDI) (C36H44N2On S3 2"): найдено m/z 111.6, рассчитано m/z 776.94. Η-ЯМР (DМSО-dб), δ (м.д.): 1-67 (12H, с, C(CHj)2), 1.75 (8H, м, CH7CH2CH2CH7SOO, 2.28 (2H, т, J 7.5, CH2CH2COOH), 2.44 (4H, м, CH2CH2CH2CH2SO3), 2.84 (2H, т, J 7.5, CHzCH2COOH), 4.09 (4H, м, NCH2), 6.25-6.61 (2H, д, J 13.5, α,α'-CH), 6.58 (IH, т, J 12.0, γ-СН), 7.26-7.75 (6H, м, ArH), 8.25 (2H, м, β,β'-CЩ.
Пример 75. Получение гидроксисукцинимидных эфиров натриевых солей индодикарбоцианиновых красителей (Аl-АЗО)
Figure imgf000098_0001
К раствору натриевой соли индодикарбоцианина (Аl-АЗО) (0,15 ммоль) в безводном диметилфорамиде (1 1 мл) добавляют ./V-гидроксисукцинимид (69,1 мг; 0,6 ммоль). Реакционную массу охлаждают до -180C и добавляют по каплям раствор дициклогексилкарбодиимида (61,9 мг; 0,3 ммоль) в безводном ДМФА (500 мкл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 суток. Затем разбавляют водой, отфильтровывают, фильтрат наносят на колонку RP- 18 и промывают водой (100 мл), затем элюируют смесью ацетонитрил - вода, 1 : 1. Растворитель удаляют, а остаток сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают гидроксисукцинимидные эфиры с выходом 75-80%.
Пример 76. Получение гидроксисукцинимидных эфиров натриевых солей индодикарбоцианиновых красителей (B1-B7)
Figure imgf000099_0001
К раствору натриевой соли индодикарбоцианина (B1-B7) (0,1 ммоль) в безводном диметилфорамиде (10 мл) добавляют ди-(iV-гидpoкcиcyкцинимидил)- карбонат (0,25 ммоль) и пиридин (0,25 ммоль). Полученную реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Затем смесь разбавляют водой, фильтрат наносят на колонку RP- 18 и промывают водой (100 мл), затем элюируют смесью ацетонитрил - вода, 1 : 1. Растворитель удаляют в вакууме, остаток сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5. Получают гидроксисукцинимидные эфиры с выходом порядка 75-80%.
Пример 77. Маркирование олигонуклеотида
К олигонуклеотиду 5'-CTCAGTTT-NH2-3' (200 нмоль) добавляют 0,1 M карбонат-бикарбонатный буфер (15 мкл) и ацетонирил (15 мкл), смесь тщательно перемешивают и охлаждают при -180C в течение 5 мин. Затем добавляют гидроксисукцинимидный эфир красителя (A1-A30, B1-B7) (~0,6 мг), перемешивают и оставляют на 24 ч при комнатной температуре. После чего добавляют 0,1 M TEAA (0,5 мл) и экстрагируют 1-бyтaнoлoм до полного обесцвечивания верхнего слоя. Окрашенный олигонуклеотид выделяют HPLC, контроль ведут на длине волны 254 нм, скорость потока 1 мл/мин, градиентное элюирование от 20% системы В в системе А до 100% В за 30 мин, где А - 0,1M TEAA, В - 50% раствор ацетонитрила в А. Окрашенный олигонуклеотид сушат в вакууме при 4O0C. Выход маркированного олигонуклеотида -70%.

Claims

Формула изобретения
1. Соединение общей формулы (I)
Figure imgf000100_0001
где:
Ri представляет собой -CH3; -(CH2)4COOH;
R2 представляет собой -CH3; -(CH2)2COOH; -H; -SO3 ";
R3 представляет собой -C2H5; -(CH2)4SO3 ";
R4 представляет собой -C2H5; -(CH2)4SO3 ~;
R5 представляет собой -H; -CH3;
R6 представляет собой -H; -CH3; -SO3 ". его производные и их соли.
2. Соединение по п. 1 общей формулы (А)
Figure imgf000100_0002
где:
Ri представляет собой -(CH2)4COOH; R? представляет собой -H; -CH3; -SO3 "; R3 представляет собой -C2H5;-(CH2)4SO3 " R4 представляет собой -C2H5; -(CH2)4SO3 ~; R5 представляет собой -H; -CH3; R6 представляет собой -H; -CH3; -SO3 "; его производные и их соли.
3. Соединение по п. 1 общей формулы (В) а также соединения, условно отнесенные к соединениям группы В, соответствующие общей формуле (В)
Figure imgf000101_0001
где:
Ri представляет собой -CH3;
R2 представляет собой -(CH2)2COOH;
R3 представляет собой -C2Hs; -(CH2^SO3 ";
R4 представляет собой -C2H5; -(CH2^SO3 ";
Rs представляет собой -H;
R6 представляет собой -H; -CH3; -SO3 " его производные и их соли.
4. Соединения общей формулы (I) по п.1, выбранные из группы, состоящей из: 3-(4-кapбoкcибyтил)-./V-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3'-тpимeтил-./V'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение Al);
3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3',5'-тетраметил-N'- этилиндодикарбоцианина (соединение A2);
3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3',3',5',7'-пeнтaмeтил-N-(4-cyльфoбyтил)-тV'- этилиндодикарбоцианина (соединение АЗ); 3-(4-кapбoкcибyтил)-Λ'-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3',5-тeтpaмeтил-N'- этилиндодикарбоцианина (соединение A4);
3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3',3',5,5'-пeнтaмeтил-N-(4-cyльфoбyтил)-N'- этилиндодикарбоцианина (соединение A5);
3,3',3',5,5',7'-гeкcaмeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-/V-(4-cyльфoбyтил)-./V'- этилиндодикарбоцианина (соединение A6);
ΛζN'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5'-cyльфo-3,3',3'-триметилиндодикарбоцианина (соединение A7);
3-(4-кapбoкcибyтил)-N'-(4-cyльфoбyтил)-3,3',3'-тpимeтил-Λг-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A8);
N,jV'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3',3',-тpимeтилиндoдикapбoциaнинa (соединение A9);
УV,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3',3'-триметилиндодикарбоцианина (соединение AlO); натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ',-тpимeтил-
N'-этилиндодикарбоцианина (соединение AIl); натриевой соли N,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение A12); натриевой соли Λ/,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ',T- пентаметилиндодикарбоцианина (соединение A13); натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-N-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '-триметил-N'- этилиндодикарбоцианина (соединение A14); натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-iV-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 ',5 '- тетраметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение Al 5); натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ',7'-пeнтaмeтил-5-cyльфo-Λf-(4- cyльфoбyтил)-N'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A16); натриевой соли N, УV'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение A17); натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-N-(4-cyльфoбyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ',5- тeтpaмeтил-/V'-этилиндoдикapбoциaнинa (соединение A18); натриевой соли N,iV'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5,5 '- пентаметилиндодикарбоцианина (соединение A19); натриевой соли 3,3 ',3 ',5,5 ' 7 -гeкcaмeтил-Λ';Λ'''-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)- индодикарбоцианина (соединение A20); натриевой соли 3-(4-кapбoкcибyтил)-N'-(4-cyльфoбyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '-триметил-ТV- этилиндодикарбоцианина (соединение A21); натриевой соли 5,5'-диcyльфo-N,N'-диэтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A22); динатриевой соли ΛζyV'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A23); динатриевой соли Λζ7V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение A24); динатриевой соли 5,5 '-диcyльфo-3-(4-кapбoкcибyтил)-УV-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '- триметил-N'-этилиндодикарбоцианина (соединение A25); динатриевой соли N,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-3,3 ',3 ',5 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение A26); динатриевой соли Λζj'V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 ',5 ',7'- пeнтaмeтил-5-cyльфoиндoдикapбoциaнинa (соединение A27); динатриевой соли Λг,7V'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-5 '-cyльфo-3,3 ',3 ',5- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение A28); динатриевой соли 5,5'-диcyльфo-3-(4-кapбoкcибyтил)-iV'-(4-cyльфoбyтил)-3,3 ',3 '- триметил-N-этилиндодикарбоцианина (соединение A29); тринатриевой соли 5,5 -диcyльфo-N,N'-ди(4-cyльфoбyтил)-3-(4-кapбoкcибyтил)-3,3 ',3 '- триметилиндодикарбоцианина (соединение АЗО);
5-кapбoкcиэтил-N-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3'-тeтpaмeтил-N'-этилиндoдикapбoциaнинa
(соединение Bl);
N,N'-диэтил-5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-3,3,3 ',3 '-тeтpaмeтилиндoдикapбoциaнинa
(соединение B2);
5-кapбoкcиэтил-Λ/7-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тeтpaмeтил-./V-этилиндoдикapбoциaнинa
(соединение ВЗ); натриевой соли N,//'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил-3,3,3 ',3',5'- пентаметилиндодикарбоцианина (соединение B4); натриевой соли iV,./V'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил-3,3,3',3 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение B5); натриевой соли 5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-./V-cyльфoбyтил-3,3,3 ',3 '-тетраметил-Λ/7- этилиндодикарбоцианина (соединение B6); динатриевой соли N,N'-диcyльфoбyтил-5-кapбoкcиэтил-5'-cyльфo-3,3,3 ',3 '- тетраметилиндодикарбоцианина (соединение B7).
5. Способ получения соединений общей формулы (I), включающий стадии: а) нагревание индоленинового основания и хлоргидрата дианила малонового диальдегида в смеси уксусный ангидрид - уксусная кислота или в уксусном ангидриде с добавлением ацетил хлорида; б) удаление растворителей в случае проведения второй стадии в присутствии диизопропилэтиламина; в) введение в реакционную массу второго индоленинового основания и проведение реакции при нагревании в смеси уксусный ангидрид-уксусная кислота с добавлением ацетата калия, выдерживание при комнатной температуре в течение суток в смеси уксусный ангидрид- диизопропилэтиламин; г) выделение нужного продукта реакции обращенно-фазовой хроматографией; д) получение натриевых солей индодикарбоцианинов; е) получение соответствующих N-гидроксисукцинимидных или пара- нитрофениловых эфиров красителей.
6. Способ по п. 5, в котором нагревание на стадии а) и стадии б) проводят в течение 2-3 часов при температуре 1 180C.
7. Способ по п. 5, в котором указанную хроматографию осуществляют на колонке RP- 18 в системе aцeтoнитpил-0,05 M триэтламмонийацетат.
8. Применение соединений общей формулы (I) в качестве флуоресцентных меток для анализа биологических макромолекул.
9. Применение по п. 8, при котором биологической макромолекулой является белковая молекула (пептид, полипептид).
10. Применение по п. 8, при котором биологической макромолекулой является нуклеиновая кислота (нуклеотидная последовательность).
11. Промежуточные (исходные) соединения для синтеза соединения по изобретению формулы (I), выбранные из группы, содержащей: 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-индoлeнин (соединение 6); калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфoиндoлeнин (соединение 8); 3-(4-кapбoкcибyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 10); 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 20); 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-/V-этилиндoлeниний иодид (соединение 21); 2,3-Димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-7V-(4-cyльфoбyтил)-индoлeнин (соединение 22);
3-(4-кapбoкcибyтил)-7V-(4-cyльфoбyтил)-2,3,5-тpимeтилиндoлeнин (соединение 23); 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-5-cyльфo-/V-этилиндoлeнин (соединение 24); калиевая соль 2,3-димeтил-3-(4-кapбoкcибyтил)-/V-(4-cyльфoбyтил)-5- сульфоиндоленина (соединение 25);
5-кapбoкcиэтил-N-cyльфoбyтил-2,3,3-тpимeтилиндoлeнин (соединение 34); 5-кapбoкcиэтил-2,3,3-тpимeтил-N-этилиндoлeниний иодид (соединение 35).
PCT/RU2007/000172 2007-04-11 2007-04-11 Colorants d'indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l'analyse de macromolécules biologiques WO2008127139A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200901123A EA200901123A1 (ru) 2007-04-11 2007-04-11 Флуоресцентные индоцианиновые красители и их производные для анализа биологических макромолекул
PCT/RU2007/000172 WO2008127139A1 (fr) 2007-04-11 2007-04-11 Colorants d'indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l'analyse de macromolécules biologiques
EP07834942A EP2157088A4 (en) 2007-04-11 2007-04-11 FLUORESCENT INDOCYANINE DYES AND DERIVATIVES THEREOF FOR THE ANALYSIS OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2007/000172 WO2008127139A1 (fr) 2007-04-11 2007-04-11 Colorants d'indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l'analyse de macromolécules biologiques

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008127139A1 true WO2008127139A1 (fr) 2008-10-23

Family

ID=39864142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2007/000172 WO2008127139A1 (fr) 2007-04-11 2007-04-11 Colorants d'indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l'analyse de macromolécules biologiques

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2157088A4 (ru)
EA (1) EA200901123A1 (ru)
WO (1) WO2008127139A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2204194A3 (en) * 2008-12-25 2010-09-08 Canon Kabushiki Kaisha Probe for a hair cell, and labelling method for a hair cell using the probe for a hair cell
RU2667070C1 (ru) * 2017-09-22 2018-09-14 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201010878D0 (en) * 2010-06-29 2010-08-11 Ge Healthcare As Dye compositiion and dye syntheses
CN103052690A (zh) * 2010-06-29 2013-04-17 通用电气医疗集团股份有限公司 染料组合物和染料合成
KR101309789B1 (ko) * 2011-01-26 2013-09-23 (주)프로테옴텍 티로신 산화물이 결합된 바이오 물질을 포함하는 단백질 검출용 조성물

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0342939A1 (en) * 1988-05-18 1989-11-23 Konica Corporation Silver halide photographic light sensitive material
DE19921234A1 (de) * 1999-05-07 2000-11-16 Few Chemicals Gmbh Wolfen Cyanin-Farbstoffe
WO2002026891A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Molecular Probes, Inc. Modified carbocyanine dyes and their conjugates
EP1211294A1 (en) 2000-11-28 2002-06-05 Innosense S.r.l. Improved process and method for the preparation of asymmetric monofunctionalised indocyanine labelling reagents and obtained compounds
WO2002066574A1 (de) * 2001-02-16 2002-08-29 Enderlein Joerg Fluoreszierende mikroteilchen
CN1702118A (zh) * 2005-06-06 2005-11-30 大连理工大学 生物分析用近红外中位氮、硫七甲川菁类荧光染料

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0342939A1 (en) * 1988-05-18 1989-11-23 Konica Corporation Silver halide photographic light sensitive material
DE19921234A1 (de) * 1999-05-07 2000-11-16 Few Chemicals Gmbh Wolfen Cyanin-Farbstoffe
WO2002026891A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Molecular Probes, Inc. Modified carbocyanine dyes and their conjugates
EP1211294A1 (en) 2000-11-28 2002-06-05 Innosense S.r.l. Improved process and method for the preparation of asymmetric monofunctionalised indocyanine labelling reagents and obtained compounds
WO2002066574A1 (de) * 2001-02-16 2002-08-29 Enderlein Joerg Fluoreszierende mikroteilchen
CN1702118A (zh) * 2005-06-06 2005-11-30 大连理工大学 生物分析用近红外中位氮、硫七甲川菁类荧光染料

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERTOLINO C.A. ET AL.: "Solvent effect on inducyanine dyes: A computational approach", CHEMICAL PHYSICS, vol. 330, 2006, pages 52 - 59, XP005846068 *
LIN Y ET AL., BIOCONJUC. CHEM., vol. 13, 2002, pages 605 - 610
LIN Y. ET AL., BIOCONJUC. CHEM., vol. 13, 2002, pages 605 - 610
MADER 0. ET AL.: "Structure Properties of Pentamethine Indocyanine Dyes: Identification of New Dyes for Life Science Applications", BIOCONJUGATE CHEM, vol. 15, 2004, pages 70 - 78, XP001222066, DOI: doi:10.1021/bc034191h
MADER O. ET AL., BIOCONJUGATE CHEM, vol. 15, 2004, pages 70 - 78
MADER O. ET AL.: "Structure property analysis of pentamethine indocyanine dyes: Identification of a new dye for life science applications", BIOCONJUGATE CHEM., 2004, pages 70 - 78, XP001222066 *
MANK A.J. G. ET AL., ANAL. CHEM., vol. 67, 1995, pages 1742 - 1748
MANK A.J.G. ET AL., ANAL. CHEM., vol. 67, 1995, pages 1742 - 1748
MUJUMBAR R.B. ET AL.: "Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups", CYTOMETRY, vol. 10, no. 1, 1989, pages 11 - 19, XP002403542 *
MUJUMDAR R.B. ET AL., BIOCOJUCG. CHEM, vol. 4, no. 2, 1993, pages 105 - 111
See also references of EP2157088A4 *
SOUTHWICK ET AL., CYTOMETRY, vol. 11, no. 3, 1990, pages 418 - 30

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2204194A3 (en) * 2008-12-25 2010-09-08 Canon Kabushiki Kaisha Probe for a hair cell, and labelling method for a hair cell using the probe for a hair cell
US8460639B2 (en) 2008-12-25 2013-06-11 Canon Kabushiki Kaisha Probe for a hair cell, and labelling method for a hair cell using the probe for a hair cell
RU2667070C1 (ru) * 2017-09-22 2018-09-14 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР

Also Published As

Publication number Publication date
EP2157088A4 (en) 2010-04-14
EA200901123A1 (ru) 2010-02-26
EP2157088A1 (en) 2010-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1322710B2 (en) Modified carbocyanine dyes and their conjugates
JP4943156B2 (ja) シアニン色素標識用試薬
EP2596065B1 (en) Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates
US5863753A (en) Chemically reactive unsymmetrical cyanine dyes and their conjugates
US9040561B2 (en) Methine-substituted cyanine dye compounds
US7446202B2 (en) Cyanine dye compounds
CA2380272C (en) Stable near-infrared (nir) marker dyes based on benzopyrylium-polymethines
JP2007016038A (ja) スルホインドシアニン染料の合成のための化合物及び合成方法
WO2011085532A1 (zh) 一类共轭链上β-位氮取代五甲川菁类荧光染料
WO2008127139A1 (fr) Colorants d&#39;indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l&#39;analyse de macromolécules biologiques
WO2005012579A2 (en) Homodimeric cyanine dye dimer comprising aromatic, heteroaromatic, cyclic or heterocyclic linker moiety in nucleic acid reporter molecules
AU2006200511B2 (en) Modified Carbocyanine Dyes and Their Conjugates
EP1770129B1 (en) Modified carbocyanine dyes and their conjugates
RU2637310C1 (ru) Флуоресцентно-меченые дезоксиуридинтрифосфаты
US6617458B2 (en) Alpha cyano methine and polymethine dyes for the labeling of biological subtrates
JP2023520536A (ja) 架橋ベンゾピリリウム塩に基づく高ストークスシフトを有する蛍光色素

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07834942

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200901123

Country of ref document: EA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007834942

Country of ref document: EP