RU2667070C1 - Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР - Google Patents
Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР Download PDFInfo
- Publication number
- RU2667070C1 RU2667070C1 RU2017133058A RU2017133058A RU2667070C1 RU 2667070 C1 RU2667070 C1 RU 2667070C1 RU 2017133058 A RU2017133058 A RU 2017133058A RU 2017133058 A RU2017133058 A RU 2017133058A RU 2667070 C1 RU2667070 C1 RU 2667070C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sulfo
- tetramethyl
- triphosphate
- aza
- oxo
- Prior art date
Links
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 title claims description 56
- -1 Deoxyuridine triphosphates Chemical class 0.000 title claims description 44
- 239000000975 dye Substances 0.000 title description 167
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical group [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 title description 29
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 title description 20
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N sulfamide Chemical group NS(N)(=O)=O NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims abstract description 10
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 133
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 13
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 125000005420 sulfonamido group Chemical group S(=O)(=O)(N*)* 0.000 claims description 6
- XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N sulfurochloridic acid Chemical compound OS(Cl)(=O)=O XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 125000000143 2-carboxyethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N trimethyl phosphate Chemical compound COP(=O)(OC)OC WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N palladium;triphenylphosphane Chemical compound [Pd].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 7
- UGJCNRLBGKEGEH-UHFFFAOYSA-N sodium-binding benzofuran isophthalate Chemical compound COC1=CC=2C=C(C=3C(=CC(=CC=3)C(O)=O)C(O)=O)OC=2C=C1N(CCOCC1)CCOCCOCCN1C(C(=CC=1C=2)OC)=CC=1OC=2C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O UGJCNRLBGKEGEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 35
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 26
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 25
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine group Chemical group N1=CCC2=CC=CC=C12 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 12
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentachloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)(Cl)Cl UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- DQWPFSLDHJDLRL-UHFFFAOYSA-N triethyl phosphate Chemical compound CCOP(=O)(OCC)OCC DQWPFSLDHJDLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SYBYTAAJFKOIEJ-UHFFFAOYSA-N 3-Methylbutan-2-one Chemical class CC(C)C(C)=O SYBYTAAJFKOIEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 3
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical class ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MWAGUKZCDDRDCS-UHFFFAOYSA-N 1-nitro-4-(4-nitrophenoxy)benzene Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 MWAGUKZCDDRDCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CQJAWZCYNRBZDL-UHFFFAOYSA-N 2-(methylazaniumyl)butanoate Chemical compound CCC(NC)C(O)=O CQJAWZCYNRBZDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 2-[di(propan-2-yl)amino]ethylsulfanyl-methylphosphinic acid Chemical compound CC(C)N(C(C)C)CCSP(C)(O)=O UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenesulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 6-amino-2-[[(e)-(3-formylphenyl)methylideneamino]carbamoylamino]-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1NC(=O)N\N=C\C1=CC=CC(C=O)=C1 SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N butyronitrile Chemical compound CCCC#N KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 150000008049 diazo compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- NCGWKCHAJOUDHQ-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;formic acid Chemical compound OC=O.OC=O.CCN(CC)CC NCGWKCHAJOUDHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 2
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 125000005504 styryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DYLIWHYUXAJDOJ-OWOJBTEDSA-N (e)-4-(6-aminopurin-9-yl)but-2-en-1-ol Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2C\C=C\CO DYLIWHYUXAJDOJ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- HUFDYAIAEFHOKI-UHFFFAOYSA-N 2,3,3-trimethylindol-1-ium-5-sulfonate Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C(C)=NC2=C1 HUFDYAIAEFHOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJXHFMCXXSYPIE-UHFFFAOYSA-N 2-(2-iodoethoxy)ethanol Chemical compound OCCOCCI FJXHFMCXXSYPIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQPQPXUDXQDVMK-UHFFFAOYSA-N 3-(3-fluorophenyl)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC(CC(O)=O)C1=CC=CC(F)=C1 IQPQPXUDXQDVMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDXQWYKOKYUQDN-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical class OC1CC(=O)NC1=O JDXQWYKOKYUQDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVRVNSHHLPQGCU-UHFFFAOYSA-N 6-bromohexanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCBr NVRVNSHHLPQGCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091029845 Aminoallyl nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- PSFABYLDRXJYID-VKHMYHEASA-N N-Methylserine Chemical compound CN[C@@H](CO)C(O)=O PSFABYLDRXJYID-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- PSFABYLDRXJYID-UHFFFAOYSA-N N-methyl-DL-serine Natural products CNC(CO)C(O)=O PSFABYLDRXJYID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910020939 NaC104 Inorganic materials 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N Phthalic anhydride Natural products C1=CC=C2C(=O)OC(=O)C2=C1 LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N butyl 2,2-difluorocyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CCCCOC(=O)C1CC1(F)F JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N iodoethane Chemical compound CCI HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- XXTISPYPIAPDGY-UHFFFAOYSA-N n,n-diphenylmethanimidamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1N(C=N)C1=CC=CC=C1 XXTISPYPIAPDGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- MHYFEEDKONKGEB-UHFFFAOYSA-N oxathiane 2,2-dioxide Chemical compound O=S1(=O)CCCCO1 MHYFEEDKONKGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- 150000004031 phenylhydrazines Chemical class 0.000 description 1
- QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M pinacyanol iodide Chemical class [I-].C1=CC2=CC=CC=C2N(CC)C1=CC=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=[N+]1CC QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 125000002568 propynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229950000244 sulfanilic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical class [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к новым соединениям, которые могут найти применение в медицине, характеризующимся структурной формулойили,где Rпредставляет собой -Н, -СН; Rпредставляет собой –Н, -СНОН, -(CH)S(O)CH; Rпредставляет собой -Н, pNP, NHS; n=0-5, m=1-3, Мпредставляет собой Na, Li, K, (CH)NH(где у=1,4). Предложенный способ получения указанных соединений состоит в непосредственной модификации натриевой соли соответствующего индоцианинового красителя, содержащей две сульфогруппы, путем превращения одной из сульфогрупп в положении 5 индоленинового фрагмента в карбоксиалкилсульфамидную группу. Предложены новые производные нуклеотидов, эффективные в качестве флуоресцентных меток для маркирования ДНК в ходе ПЦР, а также эффективный способ их получения. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 21 пр., 2 табл., 2 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области органической и биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины, а именно, к новым модифицированным нуклеозидтрифосфатам, содержащим индоцианиновый краситель, присоединенный через линкеры различного строения, включающие транс-алкеновую и гидрофильную сульфамидную группу, а также к новому способу получения цианиновых красителей с сульфамидоалкильной группой в положении 5 индоленинового фрагмента. Предлагаемые соединения и материалы на их основе могут быть использованы в качестве флуоресцентных меток для маркирования ДНК в ходе ПЦР.
Уровень техники
Нуклеозидтрифосфаты, меченые цианиновыми красителями ближнего ИК-диапазона, представляют особый интерес ввиду чрезвычайно высокой чувствительности их регистрации, что позволяет использовать их в качестве инструмента для решения задач молекулярной биологии и медицины. Красители различаются природой и расположением заместителей и функциональных групп, что приводит к различиям в суммарном электрическом заряде, пространственной ориентации относительно линкера, способности к неспецифической сорбции, другим межмолекулярным взаимодействиям, что отражается на эффективности флуоресцентно-меченных нуклеотидов включаться в ДНК, синтезируемую в ходе ПЦР, под действием матрично-зависимьгх ДНК-полимераз.
Авторами патента (Fluorescent nucleotides containing a cyanine, merocyanine or styryl dye for the detection of nucleic acid, European patent, 1152008, - 2001, Fuji photo film со., Япония) предложено в качестве флуоресцентных меток для получения флуоресцентно-меченного нуклеозидтрифосфата использовать водорастворимые цианиновые красители, содержащие сульфонамидную группу в положении 5, а карбоксиалкильную группу в положении 1. Авторами из мРНК путем обратной транскрипции получены флуоресцентно-меченные кДНК, которые затем использовали в ПЦР (метод ПЦР с применением обратной транскрипции). Для выявления влияния структуры красителей на интенсивность флуоресценции полученного ПЦР-продукта проведена реакция обратной транскрипции при использовании коммерчески-доступных Cy5-dUTP и Су3-dUTP конъюгатов (Amersham Pharmacia Biotech). Было обнаружено, что интенсивность флуоресценции маркированных полученными красителями Су5 и Су3 ПЦР-продуктов выше в 8 и 3.5 раза соответственно по сравнению с коммерчески-доступным продуктом Cy5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech).
В патенте (Improved process and method for the preparation of asymmetric monofunctionalised indocyanine labelling reagents and obtained compounds, European patent, 1211294, - 2002, Innosense S.r.l., Италия) для синтеза флуоресцентно-меченного dUTP предложено использовать водорастворимые индоцианиновые красители, содержащие в своей структуре от одной до трех сульфогрупп. Эффективность данных соединений для флуоресцентного маркирования ДНК в ходе ПЦР не указывается.
В патенте (Modified carbocyanine dyes and their conjugates, European patent, 1801165, - 2007, Molecular Probes Inc., США) фирмой Molecular Probes предложены новые индодикарбоцианиновые красители с карбоксипентильной группой в положении 3 индоленинового фрагмента. Синтезированные красители характеризуются высоким показателем молярного коэффициента экстинкции (до 250000 л⋅моль-1⋅см-1) и повышенным значением квантового выхода флуоресценции (0.34) по сравнению с индодикарбоцианиновыми красителями с карбоксипентильной группой в положении 1. При помощи синтезированного тетрасульфированного красителя получен флуоресцентно-меченый dUTP, который рекомендован для ник трансляции и метода in-vitro транскрипции, но не для ПЦР.
В патенте (Cyanine dye labeling reagents with meso-substitution, US patent, 2004186278, - 2004, Amersham Biosciences Corp., США) для получения флуоресцентно-меченного dUTP использовали цианиновые красители с заместителем в мезо-положении полиметиновой цепи. Введение цианогруппы в мезо-положение позволило авторам гипсохромно сместить полосы в спектрах возбуждения и флуоресценции на 40 нм. Маркированный dUTP далее использовали для получения флуоресцентно-меченых ПЦР-продуктов.
В патенте (New fluorescence cyanine labels containing a sulfamido linker arm, European patent, 1491591, - 2004, Visen medical inc., Италия) предложена серия флуоресцентных цианиновых красителей с карбоксильной группой, присоединенной через сульфамидоалкильную цепь в положении 5. Авторы утверждают, что такого рода красители имеют явное преимущество перед их аналогами - с карбоксиалкильной группой в положениях 1 и 5. Для синтеза красителей с сульфамидоалкильным заместителем применяли соответствующие модифицированные индолениновые основания, которые в свою очередь синтезировали из сульфоиндоленина через образование сульфохлорида. Сульфохлорид получали с выходом 60% из соответствующего сульфоиндоленина действием смесью пентахлорида фосфора и хлорокиси фосфора. Образовавшееся активное производное обрабатывали в пиридине гидрохлоридом трет-бутилового эфира аминокислоты, и с выходом 80% образовывался индоленин с сульфамидной группой в положении 5. Далее проводили сульфоалкилирование при помощи 1,4-бутансультона, и удаляли защитную группу нагреванием в смеси метанол/концентрированная соляная кислота. Краситель синтезировали, использую стандартную схему получения цианиновых красителей - из двух солей индолениния и дианила малонового альдегида в уксусном ангидриде с добавлением пиридина. По предложенной схеме синтезированы красители с различной длиной сопряженной полиметиленовой цепи - 3, 5 или 7 метиленовых групп и различными индолениновыми фрагментами. Были получены активные производные красителей - гидроксисукцинимдные эфиры, которые ковалентно присоединяли к 5-(3-амин-1-пропинил)-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфату. Предлагаемый метод получения красителей включает много стадий синтеза, требует установки и снятия защитных групп, что делает его чрезвычайно сложным в исполнении. Авторы данного патента в дезоксиуридинтрифосфатах используют линкер, включающий пропинильную и сульфамидную группу, однако отсутствуют данные по их синтезу, спектрально-люминесцентных характеристиках и возможности использования в ПЦР.
Авторами патентов (Fluorescent nucleotides containing a cyanine, merocyanine or styryl dye for the detection of nucleic acid, European patent, 1152008, - 2001, Fuji photo film со., Япония; Fluorescent cyanine dye, European patent, 1810998, - 2007, Ferrania Technologies S.p.A., Италия) предложен синтез цианинового красителя с сульфонамидной группой в положении 5 индоленинового цикла. Для этого предварительно получали соответствующие индолениновые основания циклизацией по Фишеру замещенных гидразинов и изопропилметилкетона с последующим алкилированием этил иодидом, 6-бромгексановой кислотой и 2-(2-йодоэтокси)-этанолом. Получение замещенных фенилгидразинов с сульфамидными заместителями в положении 5 является отдельной сложной и трудоемкой задачей.
В патенте (Biocompatible N, N-Disubstituted Sulfonamide-Containing Fluorescent Dye Labels, US patent, 20090130024, - 2009, VISEN MEDICAL, INC., США) представлены цианиновые красители с N,N'-дизамещенной карбоксиалкилсульфамидной группой, синтез которых осуществляли через предварительное получение соответствующих индолениновых оснований. Схема синтеза, используемая для получения модифицированных индоленинов аналогична схеме, представленной в патенте (New fluorescence cyanine labels containing a sulfamido linker arm, European patent, 1491591, - 2004, Visen medical inc., Италия).
Все вышеперечисленные способы получения цианиновых красителей с сульфамидным заместителем имеют ряд принципиальных недостатков: многостадийность, большие энергозатраты (высокая температура, давление и длительность процесса), необходимость использования специального оборудования, применение в качестве исходных реагентов аминокислот с защитной группой, что вызывает необходимость их предварительного получения. Получение замещенных солей индолениния сопровождается многочисленными побочными реакциями за счет их высокой реакционной способности. Выделение и очистка целевых индолениниевых солей методами кристаллизации не обеспечивает должной степени очистки, а хроматографическое разделение препаративных количеств практически невозможно. Чем больше химических стадий проводится на производных индолениния, тем больше они содержат примесей, что приводит к образованию многочисленных побочных продуктов на стадии синтеза красителей. Очистка таких красителей является отдельной сложной задачей.
Авторами патента (Sulfonyl Cyanine Dyes and Derivatives, US patent, 20100041901, - 2010, COMBINIX, INC., США) представлен синтез симметричных цианиновых красителей с сульфамидоалкильными заместителями. Для этого симметричный дисульфированный цианиновый краситель обрабатывали хлорокисью фосфора в DMF с образованием дисульфонилхлорида. Затем реакцией активного производного красителя и алифатического диамина получали соответствующий симметричный краситель. Реагент хлорокись фосфора в DMF, известный как реагент Вильсмейера-Хаака, обладает не только хлорирующим действием, но и эффективно формилирует ароматические соединения. Поэтому получение дисульфонилхлорида из дисульфированного красителя данным методом сопровождается образованием побочных продуктов, которые в свою очередь реагируют с алифатическими аминами. В итоге конечный продукт загрязнен трудноотделяемыми многочисленными примесями. Описанный способ синтеза цианиновых красителей с сульфамидным заместителем предлагается только для симметричных красителей.
К недостаткам данного способа синтеза цианиновых красителей с сульфамидным заместителем является невозможность получения асимметричного красителя с одной сульфамидной группой.
Таким образом, анализ имеющихся литературных данных показал, что описанные методы синтеза несимметричных цианиновых красителей с карбоксиалкилсульфамидным заместителем в положении 5 индоленинового фрагмента сложны и малоэффективны. Предложенный нами способ синтеза красителей, с карбоксиалкилсульфамидным заместителем в положении 5 индоленинового фрагмента, проще, эффективнее, позволяет варьировать химическое строение функциональных блоков, используемых при синтезе флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов. Флуоресцентно-меченные трифосфаты предложенной структуры воспринимаются матрично-зависимой Taq ДНК-полимеразой в качестве субстрата и флуоресцентно-меченные нуклеотиды эффективно включаются в ДНК синтезируемую в ходе ПЦР.
Раскрытие изобретения
Введение флуоресцентно-меченных нуклеотидов при помощи ДНК-полимераз в ходе ПЦР нашло широкое применение для маркирования ДНК. Однако, эффективность процесса маркирования сильно зависит от типа введенного красителя, а также строения линкера, связывающего нуклеиновое основание и флуорофор. Известно, что для модификации нуклеотидов лучше всего подходит положение 5 пиримидинового цикла, поскольку в двунитевых ДНК оно ориентировано в широкую бороздку и не ингибирует взаимодействие А/Т-оснований. В качестве меченых субстратов для ДНК-полимераз на основе 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата хорошим вариантом являются его производные с линкерами на основе Е-этена (транс-изомер этилена).
Целью настоящего изобретения явился синтез новых флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов, содержащих в положении 5 электронейтральный моносульфированный индокарбоцианиновый краситель, присоединенный через линкеры различного строения, включающие транс-алкеновую и гидрофильную сульфамидную группу, и их применение для маркирования ДНК в ходе ПЦР, а так же разработка способа получения цианиновых красителей с сульфамидоалкильным заместителем, входящих в состав новых модифицированных нуклеозид трифосфатов.
Поставленная цель достигается структурой заявляемого нового типа флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов общей формулы (А).
где:
R1 представляет собой -Н; -СН2ОН; -(CH2)2S(O)CH3;
R2 представляет собой -Н, -СН3;
n=0-5
m=1-3
M+ представляет собой H+, Na+, Li+, K+, [CH3(CH2)n](4-m)NHm +(где n=0-5, m=0-4).
Предлагаемые флуоресцентно-меченные трифосфаты общей формулы (А) характеризуются тем, что реактивная карбоксильная группа индоцианиновых красителей общей формулы (В), входящих в их состав, присоединена в 5 положении индоленинового фрагмента через гидрофильную сульфамидоалкильную цепочку атомов (где R1, R2 -алкильные-, гидрокси- и сульфоалкильные заместители).
где:
R1 представляет собой -Н, -СН3;
R2 представляет собой -Н; -СН2ОН; -(CH2)2S(O)CH3;
n=0-5
m=1-3
Указанные структурные отличия индоцианиновых красителей общей формулы (В), входящих в состав нуклеозидтрифосфатов (А), приводят к ряду отличительных свойств. Ось хромофора, проходящая через сопряженную полиметиновую цепочку связей красителя, является продолжением линкера, соединяющего его с пиримидиновым основанием. Изменение пространственной ориентации хромофора относительно молекулы нуклеотида и введение гидрофильного линкера оказывает положительное влияние на эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов в растущую цепь ДНК в ходе ПЦР. Для получения линкера, соединяющего молекулу красителя и dUTP, использовали следующие алифатические аминокислоты: аминоуксусную кислоту, 2-аминопропионовую кислоту, аминокапроновую кислоту, метионинсульфоксид, серии, N-метиламиноуксусную кислоту, N-метиламинобутановую кислоту.
Для выполнения поставленной цели разработан способ получения модифицированных индоцианиновых красителей общей формулы (В), позволяющий расширить номенклатуру исходных соединений для синтеза флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов формулы (А). Техническим результатом является введение требуемого заместителя в индольный каркас красителя, увеличение выходов и простота выделения и очистки продуктов реакции.
В основе заявляемого способа лежит непосредственная модификация индоцианинового красителя, содержащего две сульфогруппы, путем превращения одной из сульфогрупп в положении 5 индоленинового фрагмента в карбоксиалкил сульфамидную. Сущность способа заключается в предварительном получении сульфохлорида индоцианинового красителя путем взаимодействия сульфогруппы в положении 5 с PCl5 в триметилфосфате. Далее активное производное, полученное в реакции с PCl5, без выделения обрабатывали раствором аминокомпонента в бикарбонатном буферном растворе. Реакция проводится при +20°С и атмосферном давлении. Предлагаемый метод получения асимметричных красителей, «синтез в одном сосуде», позволяет получать асимметричный продукт с минимальным количеством стадий. Минимальное количество побочных продуктов упрощает процедуру выделения и очистки целевого красителя. Продукт реакции общей формулы (В) выделяют обращено-фазовой хроматографией на колонке C18-RP в системе ацетонитрил-0.1М ТЕАА в линейном градиенте концентраций от 0 до 50% ацетонитрила. Выход целевого продукта, содержащего карбоксиалкилсульфамидный заместитель, составляет 25-30% (в зависимости от структуры соединения).
Новизна настоящего изобретения состоит в том, что получение сульфамидной группы проводится путем непосредственной модификации функциональной группы, связанной с индолениновым ядром в структуре индоцианинового красителя, «синтез в одном сосуде». До сих пор такие модификации осуществлялись посредством многостадийного синтеза соответствующих замещенных индолениновых оснований с последующим получением цианиновых красителей.
Существенные отличия предлагаемого способа от аналогов:
1. Предлагаемый способ базируется на использовании в качестве исходного соединения индоцианинового красителя, обладающего интенсивной окраской, что существенно облегчает контроль образования целевых соединений общей формулы (В), а также их выделение и очистку.
2. Реакцию получения соединений общей формулы (В) проводят при атмосферном давлении, при охлаждении до 0°С с последующим нагреванием до комнатной температуры, в растворителе, не требующем предварительную очистку, без использования инертного газа.
3. Реакцию получения соединений общей формулы (В) проводят в одну стадию («синтез в одном сосуде») без выделения промежуточных соединений.
4. Проведение реакции «в одном сосуде» без выделения промежуточных лабильных сульфохлоридов позволяет получать соединения общей формулы (В) при температуре 0-20°С, избегая осмоления реакционной массы, добиться выходов целевых продуктов в пределах 30%, при этом исходный цианиновый краситель выделяется в неизмененном виде и используется повторно.
Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами:
1. Способ позволяет проводить реакцию в «в одном сосуде» без выделения промежуточных продуктов.
2. Способ позволяет значительно уменьшить температуру (от 120°С до 0°С с последующим нагреванием до 20°С), время синтеза с нескольких дней и недели сократить до 16 ч, не требует использования специального оборудования (кроме колбы и магнитной мешалки) и инертного газа, тем самым позволяет существенно упростить синтез и снизить себестоимость целевого продукта.
3. Способ не требует использования аминокислот с защитной группой на карбоксильной функции.
4. Способ не требует предварительного получения солей индолениния с сульфамидным заместителем (длительный, трудоемкий синтез в агрессивной среде).
Полученный технический результат позволяет расширить ряд производных общей формулы (В) и тем самым номенклатуру флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов общей формулы (А). Таким образом, совокупность существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, позволяет достичь желаемого технического результата.
Были определены спектрально-люминесцентные характеристики красителей общей формулы (В) (m=2). Значения молярного коэффициента экстинкции красителей превышают 230000 (таблица 1). Квантовый выход флуоресценции красителей (В) в PBS превышает 25% (таблица 1). Предлагаемые красители структур (В) в зависимости от заместителей в гетероциклическом фрагменте различаются спектральным диапазоном возбуждения и флуоресценции, суммарным электрическим зарядом и растворимостью в воде (таблица 1).
Далее представлены результаты использования красителей для получения флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов общей формулы (А) с последующим их применением для маркирования ДНК в ходе ПЦР.
Все красители общей формулы (В) в виде их пара-нитрофениловых эфиров (R3=-pNP) с выходом 60-70% (в зависимости от структуры используемого красителя (В)) маркируют нуклеотиды, содержащие в С5-положении аминоаллильный заместитель. Реакцию можно проводить с последующей заменой анионов в соединениях по изобретению общей формулы (А), обработкой кислотами, солями кислот с иными противоионами (или без замены аниона). Варьирование перечисленных противоионов не оказывает влияния на спектрально-люминесцентные характеристики нуклеотидов общей формулы (А). Поэтому детальное описание свойств модифицированных нуклеотидов общих формул (А, М+=Na+) представлено на примере их натриевых солей.
Нуклеотиды общей формулы (А), модифицированные красителями с сульфамидоалкильными группами, характеризуются интенсивными полосами поглощения и флуоресценции (Фиг. 1) и значениями квантового выхода флуоресценции 30-34% в PBS (Таблица 2). Максимумы поглощения и флуоресценции модифицированных красителями нуклеотидов располагаются в области 650 и 665 нм соответственно.
Установлено, что результаты полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов общей формулы (А) зависят от структуры модифицированных нуклеотидов, используемых в качестве субстратов в ПЦР. Эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов общей формулы (А) в условиях ПЦР анализирована при использовании тест-системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия), предназначенной для определения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis (Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S., Roudinskii N., Donnikov M., 
S., Markova O., 
A., Chernousova L., Skotnikova O., Moroz A., Zasedatelev A., Mirzabekov A. //Clin. Microbiol. Infect. 2005. V. 11. P. 531-539).
Для оценки степени встраивания модифицированных нуклеотидов Taq-полимеразой в ДНК вычисляли средний флуоресцентный сигнал совершенных дуплексов в ячейках биочипа и затем нормировали его на значение, полученное для коммерчески-доступного продукта (AAdUTP-Cy5 - Jena Bioscience GmbH, Germany, NU-803-CY5-S). Флуоресцентный сигнал оказался максимальным для нуклеотидов (А1)-(А3), содержащих цианиновый краситель с алифатическим аминолинкером, минимальным для (А4, А5) и уменьшается в ряду: (А1)=(A3) больше (А2) больше (А6, А7) (линкер с N-метильным заместителем) больше (А4, А5) (линкер с заместителем при альфа-углеродном атоме) (Таблица 2, Фиг. 2). Флуоресцентные сигналы, полученные при использовании нуклеотидов общей формулы (А) (кроме нуклеотида А6), оказались выше сигнала, полученного при использовании коммерчески-доступного AAdUTP-Cy5.
Установлено, что все красители формул (В) в составе коньюгатов с нуклеотидами не ингибируют полимеразную цепную реакцию. Модифицированные нуклеотиды общей формулы (А) не влияют на стабильность всех остальных компонентов анализа. Установлено, что все соединения формулы (А) обладают стабильностью, достаточной для проведения полного цикла анализа без заметного разложения красителя. Использование флуоресцентно-меченных нуклеотидов общей формулы (А) в ПЦР позволяет получить флуоресцентный сигнал в 6 раз выше по сравнению с коммерчески-доступным продуктом AAdUTP-Cy5 на примере использования тест системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия).
По совокупности всех свойств соединения формулы (А) могут успешно использоваться для маркирования ДНК в ходе ПЦР, а также в качестве флуоресцентных меток при разработке диагностических тест-систем, основанных на проведении ПЦР.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Нормированные спектры поглощения и флуоресценции флуоресцентно-меченного дезоксиуридинтрифосфата.
Фиг. 2. Нормированный сигнал флуоресценции для различных модифицированных нуклеотидов общей формулы (А) при использовании диагностической тест- системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия).
Таблица 1. Спектральные характеристики индоцианиновых красителей общей формулы (В) в PBS (+25°С) (R3=H). Квантовые выходы флуоресценции определяли относительно коммерчески-доступного Су5 (Q=28% (PBS), Amersham, GE Healthcare).
Таблица 2. Спектральные характеристики флуоресцентно-меченных нуклеотидов общей формулы (А) в PBS (+25°С). Квантовые выходы флуоресценции определяли относительно коммерчески-доступного Cy5-dUTP (Amersham, GE Healthcare PA55022). M+-H+, Na+, Li+, K+, [CH3(CH2)x](4-y)NHy +(где x=0-5, y=0-4).
Осуществление изобретения
Соединения по изобретению общей формулы (А) синтезировали, согласно схеме 1.
Схема 3
Для синтеза красителей общей формулы (В) нами предложен новый способ их получения. Для этого предварительно синтезирован симметричный индокарбоцианиновый краситель (4). Синтез симметричного индокарбоцианинового красителя (4) основан на реакции конденсации соли индолениния (2) и дианила (3) (схема 2) (В.Е. Кузнецова и др, Изв. АН, Сер. хим., 2007, №11, с. 2186-2190; В.Е. Кузнецова и др., Изв. АН, Сер. хим., 2007, №12, с. 2355-2359; V.E. Kuznetsova et al, Mend. Comm, 2008, №3, pp. 138-140). Проведение реакции с МЛЧдифенилформамидином (3, m=1), с гидрохлоридом дианила малонового диальдегида (3, m=2), с гидрохлоридом дианила глутаконового диальдегида (3, m=3) приводит к образованию красителей (4, m=1), (4, m=2) и (4, m=3) соответственно. Для полного протекания реакции достаточно нагревания при 118°С в течение 1-3 ч. Синтез промежуточных соединений, необходимых для получения красителей формул (В), представлен на схеме 3 (В.Е. Кузнецова и др., Изв. АН, Сер. хим. - 2008. - №3. - С. 595-598; В.Е. Кузнецова и др, Изв. АН, Сер. хим., 2007, №11, с. 2186-2190).
Конденсацией фенилгидразина (5) с метилизопропилкетоном (6) получали соответствующий индоленин (7) (схема 2). N-Алкильное производные получали действием этилового эфира n-толуолсульфокислоты на раствор индоленина (7) в бутиронитриле.
Краситель с карбоксильной группой в положении 5 индоленинового фрагмента, присоединенной через сульфамидоалкильную цепь, получали из натриевой соли дисульфированного красителя (4) действием PCl5 в триметилфосфате (схема 2). При этом всегда образовывалась смесь моно- и дисульфонилхлоридов. Варьированием условий проведения реакции удалось подобрать оптимальные параметры для получения моносульфонилхлорида. Сульфонилхлориды при действии влаги подвергаются реакции гидролиза, выделяющаяся при этом HCl разрушает хромофорную систему красителя. Поэтому активное производное, полученное в реакции с PCl5, без выделения обрабатывали при охлаждении и интенсивном перемешивании раствором аминокислоты (схема 2) в бикарбонатном буферном растворе, который нейтрализует образующиеся в ходе реакции кислоты. Целевой продукт общей формулы (В) выделяли обращено-фазовой хроматографией на колонке C18-RP в системе ацетонитрил-0.1М ТЕАА в линейном градиенте концентраций от 0 до 50% ацетонитрила. Выход продукта реакции, содержащего карбоксиалкилсульфамоил в положении 5, составляет 25-30% (в зависимости от структуры красителя (В)). Синтезированные красители отличаются повышенной водорастворимостью, за счет присутствия сульфамидного заместителя в структуре линкера, что позволит избежать агрегации и неспецифических взаимодействий при их использовании в составе нуклеотидов в биоанализе.
4-Нитрофениловые эфиры цианиновых красителей формулы (В) получали действием HBTU и pNP в DMF. Активированные эфиры выделяли обращенно-фазовой хроматографией. Реакцией аминогруппы AAdUTP (1) с 1.25 экв. 4-нитрофенилового эфира цианинового красителя в 0.1 М NaHCO3/Na2CO3 (рН 9.0) в DMF получали флуоресцентно-меченные нуклеозидтрифосфаты общей формулы (А) с выходом 60-70% в зависимости от структуры используемого красителя. Реакцию можно проводить с последующей заменой анионов в красителях (В), обработкой кислотами, солями кислот с иными противоионами (или без замены аниона).
Флуоресцентно-меченные нуклеотиды общей формулы (А) очищали в 2 этапа - анионная ионообменная хроматография на сорбенте DEAE-целлюлоза и обращенно-фазовая (C18-RP) хроматография. Строение промежуточных и целевых соединений подтверждено данными УФ-, 1Н-ЯМР спектроскопии, 31Р-спектроскопии и масс-спектрометрии. Использование на последней стадии выделения и очистки перхлората натрия позволило получить нуклеотиды формул А в виде их натриевых солей. Так же нуклеотиды формулы А можно получить в фосфорнокислой форме, в виде солей щелочных металлов и в виде различных аммониевых солей, используя на последнем этапе очистки вместо перхлората натрия соответствующие реагенты:
- 0.1М KCl - для получения калиевой соли нуклеотида;
- 0.1М LiCl - для получения литиевой соли нуклеотида;
- 0.1М ТЕАА - для получения триэтиламмониевой соли нуклеотида;
- 0.1М NH4HCO3 - для получения аммониевой соли нуклеотида.
Нуклеотиды общей формулы (А), модифицированные красителями с сульфамидными группами, характеризуются интенсивными полосами поглощения и флуоресценции и значениями квантового выхода флуоресценции 30-34% в PBS. Максимумы поглощения и флуоресценции модифицированных красителями нуклеотидов располагаются в области 650 и 665 нм соответственно.
Еще одним объектом изобретения является применение соединений по изобретению общей формулы (А) для маркирования ДНК в ходе ПЦР. Эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов (А) в условиях ПЦР анализирована при использовании коммерческой тест-системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия), предназначенной для определения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis.
Микрочип представляет собой расположенные на подложке ячейки из гидрогеля с иммобилизованными внутри ячеек олигонуклеотидными зондами. Диаметр ячеек приблизительно 100 микрон. В разных ячейках находятся олигонуклеотидные зонды различного строения. В ячейках, в которых строение зонда соответствует строению ампликона, происходит связывание ампликона в прочный комплекс, дуплекс. В тех ячейках в которых строение зонда не соответствует строению ампликона не происходит связывания ампликона. Результаты анализа оценивают по интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках биочипа. В ячейках, в которых произошло связывание флуоресцентно-меченого ампликона с зондом, наблюдается интенсивный сигнал флуоресценции. Для регистрации сигналов используют флуоресцентный микроскоп, снабженный компьютером со специальным программным обеспечением.
На величину сигналов влияют различные факторы: эффективность встраивания ДНК-полимеразой модифицированных нуклеотидов в амплифицированный продукт, специфическое связывание с образованием совершенных дуплексов с олигонуклеотидными зондами, находящимися в ячейках биочипа, неспецифическое связывание с компонентами ячейки биочипа, яркость флуоресценции флуоресцентной метки, связанной с амплифицированнм продуктом.
Для оценки степени встраивания модифицированных нуклеотидов Taq-полимеразой в ДНК вычисляли средний флуоресцентный сигнал совершенных дуплексов в ячейках биочипа (Kuznetsova V.Е., Spitsyn М.A., Shershov V.Е., Guseinov Т.О., Fesenko Е.Е., Lapa S.A., Ikonnikova A. Yu., Avdonina М.A., Nasedkina Т.V., Zasedatelev A.S., А.V. Chudinov. // Mend. Commun. 2016. V. 26. Р. 95-98) и затем нормировали его на значение, полученное для коммерчески-доступного продукта (AAdUTP-Cy5) (Jena Bioscience GmbH, Germany, NU-803-CY5-S). Флуоресцентный сигнал оказался выше для нуклеотидов А1-А3, содержащих цианиновый краситель с алифатическим аминолинкером, и изменяется в ряду: (А1)=(A3)>(А2)>(А6, А7) (линкер с N-метильным заместителем)>(А4, А5) (линкер с заместителем при альфа-углеродном атоме).
Так же было показано, что количество сульфогрупп в структуре красителя сильно влияет на эффективность конъюгата. Флуоресцентные сигналы, полученные для нуклеотида (А4), содержащего метилоксисульфенильную группу в составе линкера, оказались ниже сигнала, полученного при использовании коммерчески-доступного AAdUTP-Cy5, содержащего в своей структуре дисульфированный индодикарбоцианиновый краситель.
Использование флуоресцентно-меченных нуклеотидов общей формулы (А) в ПЦР позволяет получить флуоресцентный сигнал в 6 раз выше по сравнению с коммерчески-доступным продуктом AAdUTP-Cy5 при определении мутаций Mycobacterium tuberculosis при использовании тест систем «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия). Исходя из вышеизложенного следует, что заявляемые флуоресцентно-меченные нуклеозид трифосфаты общей формулы (А) могут успешно использоваться для маркирования ДНК в ходе ПЦР.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение.
Осуществление изобретения
Примеры соединений и их применение
В работе использовали реагенты и растворители марок "ОСЧ", "ХЧ" или "ЧДА" фирм Aldrich, Alfa Aesar, Fluka, Химмед.
DMF очищали перегонкой в вакууме в токе азота над фталевым ангидридом [т.кип. 46°С (10 Торр)]. Диизопропилэтиламин перегоняли над нингидрином, затем над КОН (т.кип. 126-127°С). Уксусный ангидрид кипятили с безводным ацетатом калия, а затем перегоняли (т.кип. 139-140°С).
1 М Триэтиламмоний-ацетатный буферный раствор (ТЕАА) получали следующим образом. К смеси деионизованной воды (700 мл) и триэтиламина (139 мл, 1 моль) при охлаждении на льду и интенсивном перемешивании добавляли по каплям под слой жидкости уксусную кислоту (57 мл, 1 моль) (до рН 7.0) и объем раствора доводили до 1 л.
1 М Триэтиламмоний-гидрокарбонатный буферный раствор (ТЕАНС) получали следующим образом. В смесь деионизованной воды (700 мл) и триэтиламина (139 мл, 1 моль) при охлаждении на льду, интенсивном перемешивании и контроле рН пропускали газообразный CO2 (до рН 7.5) и объем раствора доводили до 1 л.
0.1М Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), 0.15 М NaCl, рН 7.4 готовили следующим образом. Смесь калия фосфата двузамещенного (0.87 г, 0.005 моль), калия фосфата однозамещенного (0.68 г, 0.005 моль) и хлорида натрия (9.0 г, 0.15 моль) растворяли в деионизованной воде (700 мл). Подщелачивали 1М раствором калия фосфата однозамещенного до рН 7.4 и доводили объем полученного раствора до 1 л.
Буферный раствор Трис/ЭДТА («ТЕ-буфер», 10 мМ Трис (рН 8.0), 1 мМ ЭДТА) приобретали в фирме Aldrich.
Пример 1. Получение фенилгидразин-n-сульфокислоты (соединение 5)
Сульфаниловую кислоту (52.0 г, 0.3 моль) и углекислый натрий (16.5 г, 0.06 моль) растворяют при нагревании в воде (200 мл). Полученный раствор отфильтровывают и к нему добавляют по каплям концентрированную серную кислоту (35.0 г, 19.1 мл, 0.36 моль), при этом выпадает белый осадок. К суспензии при охлаждении на льду и перемешивании добавляют раствор нитрита натрия (21.0 г, 0.3 моль) в воде (50 мл) с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше 12°С. Дополнительное перемешивание продолжают еще в течение 15 мин. Выделившийся осадок диазосоединения собирают фильтрацией и промывают небольшим количеством ледяной воды.
К раствору сульфита натрия (85 г, 0.67 моль) в воде (250 мл) при перемешивании и охлаждении на льду с солью добавляют влажное диазосоединение порциями с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы была ниже +5°С. Дополнительно перемешивают 1 ч. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют по каплям концентрированную соляную кислоту (200 мл), при этом выпадает осадок. Для полного обесцвечивания смеси добавляют цинковую пыль (2.0 г). Реакционную массу выдерживают 12 ч при комнатной температуре. Осадок собирают фильтрацией, промывают холодной водой и сушат на воздухе. Получают фенилгидразин-n-сульфокислоту (соединение 5) с выходом 42 г (74%).
Пример 2. Получение калиевой соли 2,3,3-триметил-5-сульфоиндоленина (соединение 7)
Смесь фенилгидразин-n-сульфокислоты (соединение 5) (11.0 г, 0.06 моль), 3-метил-2-бутанона (7.7 мл, 0.072 моль) и ледяной уксусной кислоты (34 мл) кипятят в течение 3 ч, а затем выдерживают 12 ч при 0°С. Выпавший осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном и сушат в вакуум-эксикаторе над Р2О5. Получают 5.1 г (71%) индоленина.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д.): 1.28 (с, 6Н, 2С(3)H 3), 7.47-7.79 (3Н, м, ArH)
5-Сульфо-2,3,3-триметилиндоленин (4.8 г, 0.02 моль) растворяют при нагревании в метаноле (25 мл). К полученному раствору добавляют по каплям раствор гидроксида калия (1.4 г, 0.024 моль) в метаноле (16 мл). Затем добавляют изопропиловый спирт (50 мл). Осадок отфильтровывают, сушат в вакуум-эксикаторе над Р2О5. Получают 4.7 г (85%) индоленина (соединение 7) в виде блестящих пластинок светло-бежевого цвета. λmax 260 нм. Масс-спектр (MALDI) (C11H12NO3S-): найдено m/z 239.0, рассчитано m/z 238.28.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д.): 1.19 (6Н, с, 2С(3)Н 3), 2.19 (3Н, с, С(2)Н 3), 7.41-7.7 (3Н, м, ArH)
Пример 3. Получение 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-этилиндолениния (соединение 2)
Смесь калиевой соли 2,3,3-триметил-5-сульфоиндоленина (соединение 7) (2.4 г, 10 ммоль), триэтиламина (1.7 мл, 12 ммоль), этилового эфира n-толуолсульфокислоты (5.0 г, 25 ммоль) и бутиронитрила (10 мл) нагревают 20 ч при 118°С. По окончанию нагревания добавляют ацетон (30 мл). Образовавшиеся кристаллы отфильтровывают и сушат в вакуум-эксикаторе над Р2О5. Получают 2.32 г (86%) индолениниевой соли (соединение 2), т.пл. 240-242°С. λmax 228 нм. Масс-спектр (MALDI) (C13H17NO3S): найдено m/z 268.4, рассчитано m/z 267.35.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д., J/Гц): 1.43 (уш.с, 9Н, СН2СН 3, 2С(3)Н3), 4.36 (м, 2Н, СН 2СН3), 7.63 (д, 1Н, ArH, J=8.5), 7.75 (д, 1Н, ArH, J=8.5), 7.97 (с, 1Н, ArH)
Пример 4. Получение натриевой соли 3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение 4).
Смесь 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-этилиндолениния (соединение 2) (210 мг, 0.8 ммоль), гидрохлорида дианила малонового диальдегида (соединение 3) (130 мг, 0.5 ммоль), уксусного ангидрида (8 мл) и диизопропилэтиламина (800 мкл) нагревают 4 ч при +70°С. Продукт реакции выделяют обращенно-фазовой хроматографией на колонке RP-18 в системе ацетонитрил - 0.1 М ТЕАА градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляют, а остаток разбавляют водой, вновь наносят на колонку RP-18, промывают 0.1М раствором NaCl, водой, затем выделяют в системе вода - ацетонитрил градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворитель удаляют в вакууме, остаток сушат в вакуум-эксикаторе над Р2О5. Получают 190 мг (86%) соединения 4. Найдено: m/z 572.4 [М]+. C29H33N2O6S2 -. Вычислено: М=569.71.
ЯМР 1Н (DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 1.21 (т, 6Н, CH2CH 3, J=7.0), 1.68 (с, 12Н, С(3,3)Н 3, С(3',3')H 3), 4.12 (м, 4Н, СН 2СН3), 6.29 (д, 1Н, α'-СН, J=13.5), 6.54 (д, 1Н, α-СН, J=13.5), 6.59 (т, 1Н, γ-СН, J=12.0), 7.21-7.55 (уш.м, 6Н, ArH), 8.28 (м, 2Н, β,β'-СН)
Пример 5. Получение 5-(N-карбоксиметил)аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение В1).
Смесь натриевой соли 3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение 4) (19 мг, 31 мкмоль), пентахлорида фосфора (88 мг, 0.42 ммоль) и триэтилфосфата (2.8 мл) перемешивают 1 ч при ~20°С. По окончанию перемешивания к охлажденной до 0°С реакционной массе по каплям добавляют раствор аминоуксусной кислоты (38 мг, 0.5 ммоль) в 1М растворе Na2CO3 (5 мл). Смесь перемешивают 4 ч при 0°С и дополнительно 12 ч при ~20°С. Реакционную массу разбавляют водой, подкисляют уксусной кислотой до рН~7. Выделение красителя проводят аналогично выделению соединения 4. Получают 8 мг (39%) соединения В1. Найдено: m/z 629.2 [М]+. C31H37N3O7S2. Вычислено: М=627.77.
ЯМР 1Н (DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 1.30 (м, 6Н, СН2СН 3, J=7.0), 1.71 (с, 12Н, С(3,3)Н 3, С(3',3')Н 3), 3.35 (с, 2Н, NHCH 2COOH), 4.22, 4.08 (2 м, 4Н, СН 2СН3), 6.26 (д, 1Н, α'-СН, J=13.5), 6.48 (д, 1Н, α-СН, J=13.5), 6.63 (т, 1Н, γ-СН, J=12.5), 8.0, 7.89, 7.78, 7.68, 7.44 (2с, 2д, т, 6Н, ArH), 8.39 (м, 2Н, β,β'-СН).
Пример 6. Получение 5-[N-(2-карбоксиэтил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение В2).
5-[N-(2-Карбоксиэтил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель (соединение В2) получают аналогично соединению В1 при следующих соотношениях реагентов: краситель 4 (20 мг, 34 мкмоль), пентахлорид фосфора (96 мг, 0.46 ммоль), триэтилфосфат (3 мл), 2-аминопропионовая кислота (72 мг, 0.81 ммоль), 1М раствор Na2CO3 (4.5 мл). Получают 7 мг (34%) соединения В2. Найдено: m/z 643.4 [М]+. C32H39N3O7S2. Вычислено: М=641.80.
ЯМР 1Н (DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 1.31 (м, 6Н, CH2CH 3, J=7.0), 1.71 (с, 12Н, С(3,3)Н 3, С(3',3')Н 3), 2.33 (м, 2Н, NHCH2CH 2COOH), 2.96 (м, 2Н, NHCH 2CH2COOH), 4.21, 4.08 (2 м, 4Н, CH 2CH3), 6.22 (д, 1H, α'-СН, J=13.5), 6.53 (д, 1Н, α-СН, J=13.5), 6.61 (т, 1Н, γ-СН, J=12.5), 7.98, 7.9, 7.77, 7.68, 7.45 (2с, 2д, т, 6Н, ArH), 8.40 (м, 2Н, β,β'-СН).
Пример 7. Получение 5-[N-(5-карбоксипентил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение В3).
5-[N-(5-Карбоксипентил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель (соединение В3) получают аналогично соединению В1 при следующих соотношениях реагентов: краситель 4 (22 мг, 37 мкмоль), пентахлорид фосфора (103 мг, 0.5 ммоль), триэтилфосфат (3.3 мл), 5-аминокапроновая кислота (158 мг, 1.2 ммоль), 1М раствор Na2CO3 (6 мл). Получают 7 мг (28%) соединения В3. Найдено: m/z 685.2 [М]+. C35H45N3O7S2. Вычислено: М=683.88.
ЯМР 1Н (DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 1.21, 1.31, 1.85, 2.75 (4 м, 16Н, NHCH 2CH 2CH 2CH 2CH 2COOH, СН2СН 3), 1.21 (м, 6Н,), 1.71 (с, 12Н, C(3,3)H 3, С(3',3')Н 3), 4.24 (2 уш.с, 4Н, СН 2СН3), 6.25 (м, 1H, α'-СН), 6.52 (м, 1Н, α-СН), 6.61 (м, 1H, γ-СН), 7.32-7.99 (уш.м, 6Н, ArH), 8.37 (м, 2Н, β,β'-СН).
Пример 8. Получение 5-[N-(1-карбокси-3-метилоксисульфенил-проп-1-ил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение В4).
5-[N-(1-Карбокси-3-метилоксисульфенил-пропан-1-ил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель (соединение В4) получают аналогично соединению В1 при следующих соотношениях реагентов: краситель 4 (30 мг, 50 мкмоль), пентахлорид фосфора (140 мг, 0.68 ммоль), триэтилфосфат (4.5 мл), метионин сульфоксид (271 мг, 1.64 ммоль), 1М раствор Na2CO3 (8 мл). Получают 10 мг (29%) соединения В4. Найдено: m/z 719.4 [М]+. C34H43N3O8S3. Вычислено: М=717.92.
ЯМР 1Н (DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 1.27 (м, 6Н, CH2CH 3), 1.72 (с, 12Н, С(3,3)H 3, С(3',3')H 3), 1.95 (уш.м., 2Н, NHCH(CH 2CH2S(O)CH3)COOH), 2.47 (д, 3Н, NHCH(CH2CH2S(O)CH 3)COOH), 2.87 (м, 2Н, NHCH(CH2CH 2S(O)CH3)COOH), 3.45 (м, 1Н, NHCH(CH2CH2S(O)CH3)COOH), 4.22, 4.07 (2 м, 4Н, СН 2СН3), 6.25 (д, 1Н, α'-СН, J=13.5), 6.52 (д, 1H, α-СН, J=13.5), 6.63 (т, 1Н, γ-СН, J=12.0), 7.99, 7.9, 7.74, 7.67, 7.42 (2 с, 2д, м, 6Н, ArH), 8.44 (м, 2Н, β,β'-СН).
Пример 9. Получение 5-[N-метил-N-(1-карбокси-2-гидроксиэтил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение В5).
5-[N-Метил-N-(1-карбокси-2-гидроксиэтил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель (соединение В5) получают аналогично соединению В1 при следующих соотношениях реагентов: краситель 4 (30 мг, 50 мкмоль), пентахлорид фосфора (140 мг, 0.68 ммоль), триэтилфосфат (4.5 мл), N-метил-L-серин (196 мг, 1.64 ммоль), 1М раствор Na2CO3 (8 мл). Получают 7 мг (21%) соединения В5. Найдено: m/z 673.5 [М]+. C33H41N3O8S2. Вычислено: М=671.83.
ЯМР 1Н (DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 1.30 (м, 6Н, CH2CH 3), 1.7 (с, 12Н, С(3,3)Н 3, C(3',3')H 3), 3.34 (м, 2Н, NHCH(CH 2OH)COOH), 3.58 (с, 1Н, NHCH(CH2OH)COOH), 4.10, 4.22 (2 м, 4Н, СН2СН 3), 6.26 (д, 1Н, α'-СН, J=13.5), 6.52 (д, 1Н, α-СН, J=13.5), 6.63 (т, 1Н, γ-СН, J=12.0), 7.44, 7.68, 7.79, 7.89, 8.03 (м, 2дд, 2 с, 6Н, ArH), 8.45 (м, 2Н, β,β'-СН).
Пример 10. Получение 5-[N-метил-N-карбоксиметил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение В6).
5-[N-Метил-N-карбоксиметил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель (соединение В5) получают аналогично соединению В1 при следующих соотношениях реагентов: краситель 4 (40 мг, 67 мкмоль), пентахлорид фосфора (188 мг, 0.91 ммоль), триэтилфосфат (6 мл), метиламиноуксусная кислота (196 мг, 2.2 ммоль), 1М раствор Na2CO3 (11 мл). Получают 8 мг (34%) соединения В6. Найдено: m/z 644.2 [М]+. C32H39N3O7S2. Вычислено: М=641.80.
ЯМР 1Н (DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 1.39 (м, 6Н, СН2СН 3), 1.60 (с, 12Н, С(3,3)Н 3, С(3',3')H 3), 3.23 (уш.с, 5Н, N(CH 3)CH 2COOH), 4.12 (м, 4Н, СН 2СН3), 6.18 (м, 2Н, α,α'-СН), 6.49 (т, 1Н, γ-СН, J=12.0), 7.41 (м, 2Н, β,β'-СН), 7.79-8.02 (уш.м., 6Н, ArH).
Пример 11. Получение 5-[N-метил-N-(3-карбоксипроп-1-ил)]аминосульфонил-3,3,3'3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианинового красителя (соединение В7).
5-[N-метил-N-(3-карбоксипропан-1-ил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель (соединение В6) получают аналогично соединению В1 при следующих соотношениях реагентов: краситель 4 (40 мг, 67 мкмоль), пентахлорид фосфора (188 мг, 0.91 ммоль), триэтилфосфат (6 мл), N-метиламинобутановая кислота (258 мг, 2.2 ммоль), 1М раствор Na2CO3 (11 мл). Получают 12 мг (27%) соединения В7. Найдено: m/z 671.2 [М]+. C34H43N3O7S2. Вычислено: М=669.85.
ЯМР 1Н (DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 1.31 (уш.м, 6Н, CH2CH 3), 1.66 (м, 2Н, N(СН3)СН2СH 2СН2СООН), 1.72 (с, 12Н, С(3,3)Н 3, С(3',3')Н3), 2.24 (т, 2Н, N(CH3)CH2CH2CH 2COOH, J=7.0 Hz), 2.67 (с, 3Н, N(CH 3)CH2CH2CH2COOH), 2.98 (т, 2Н, N(CH3)CH 2CH2CH2COOH, J=7.0 Hz), 4.10, 4.26 (2 м, 4Н, CH 2CH3), 6.25 (д, 1Н, α'-СН, J=13.5), 6.6 (м, 2Н, γ-СН, α-СН), 7.45, 7.72, 7.9, 7.98 (т, м, 2 с, 6Н, ArH), 8.41 (м, 2Н, β,β'-СН).
Пример 12. p-Нитрофениловые эфиры красителей общей формулы (В).
Смесь красителя (7.5 мкмоль), HBTU (8.5 мг, 22.5 мкмоль) и p-нитрофенола (5 мг, 37.5 мкмоль) растворяли в DMF (0.6 мл) и перемешивали 1.5 ч при комнатной температуре. Затем реакционную массу разбавляли водой (10 мл). Фильтрат очищали при помощи обращенно-фазовой хроматографии (C18-RP) с использованием в качестве элюента смеси ацетонитрил - вода. Получали активированные эфиры красителей с количественным выходом (около 90%).
Пример 13. Синтез флуоресцентно-меченных 5-(3-аминоаллил)-2'-деоксиуридин-5'-трифосфатов общей формулы (А).
К раствору тетранатриевой соли 5-(3-аминоаллил)-2'-деоксиуридин-5'-трифосфата (AAdUTP) (1) (1 мг, 1.6 мкмоль) в NaHCO3/Na2CO3 буферном растворе (0.2 мл, 0.1 М, рН 8.5) добавили р-нитрофениловый эфир красителя общей формулы (В) (2 мкмоль) в DMF (0.2 мл) и смесь перемешивали 12 ч при +5°С. Конъюгаты общей формулы (А) очищали от избытка красителя (В) осаждением при помощи 2% раствора NaClO4 в ацетоне (1.6 мл). Осадок собирали центрифугированием при 13000 rpm в течение 1 мин, промывали ацетоном (0.2 мл) и растворяли в 1 мл смеси 30% ацетонитрила в воде.
Раствор модифицированного нуклеотида общей формулы (А) в 1 мл смеси 30% ацетонитрила в воде наносили на колонку (2×8 см), заполненную DEAE-целлюлозой (DE-52, Whatman), и элюировали в линейном градиенте концентраций от 0.025М до 0.3М ТЕАНС (триэтиламмоний гидрокарбонатный буферный раствор) (рН 7.5) в 30% ацетонитриле со скоростью 58 мл/час. Целевое вещество собирали с колонки в диапазоне концентраций ТЕАНС от 0.2 до 0.3М.
Далее получали натриевую соль нуклеотида общей формулы (А). Для этого фракцию, содержащую модифицированный нуклеотид общей формулы (А) собирали, разбавляли до объема 50 мл 0.1М ТЕАНС буферным раствором (рН 8.5) и наносили на хроматографическую колонку (2×8 cm) (Analtech, Newark, DE), заполненную С18-RP (40-63 мкм), промывали 0.1М NaC104, 0.1М EDTA (рН 8.0) и деионизованной водой, и элюировали смесью ацетонитрил - вода.
Модифицированные нуклеотиды общей формулы (А) получали в разных солевых формах. Для этого выполняли процедуру, представленную выше, но на этапе использования 0.1М NaClO4 применяли следующие реагенты:
- 0.1М KCl - для получения калиевой соли нуклеотида;
- 0.1М LiCl - для получения литиевой соли нуклеотида;
- 0.1М ТЕАА - для получения триэтиламмониевой соли нуклеотида;
- 0.1М NH4HCO3 - для получения аммониевой соли нуклеотида.
Фракции, содержащие целевое соединение общей формулы (А), объединяли и разбавляли до объема 50 мл деионизованной водой. Концентрацию модифицированного нуклеотида общей формулы (А) определяли, исходя из молярного коэффициента экстинкции цианиновых красителей (В). Поглощение определяли в трех повторах путем разбавления стокового раствора в MQ, таким образом, чтобы оптическая плотность не превышала значение 0.1.
Растворители удаляли в вакууме, полученный осадок растворяли в «ТЕ-буфере» (рН 8.0), получая раствор флуоресцентно-меченого нуклеотида общей формулы (А) с концентрацией 1 мкмоль/мл. Полученный раствор хранили при температуре -20°С.
Пример 14. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А1).
Получают 0.64 мкмоль (64%) соединения А1. Найдено: m/z 1134.1 [М]+. C43H51N6O20P3S2 4-. Вычислено: М=1128.95.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д., J/Гц): 1.31 (т, 6Н, CH2CH 3, J=7.0), 1.55 (с, 12Н, краситель С(3,3)Н 3, С(3',3')Н 3), 2.26 (м, 2Н, С(2')H 2, 3.45 (с, 2Н, краситель С(6)H 2), 3.75 (м, 2Н, краситель С(3)Н 2), 4.08 (уш.м, 8Н, С(3')Н, С(4')Н, С(5')Н 2, СН 2СН3), 6.27 (м, 5Н, С(1')Н, краситель С(1)Н, С(2)Н, α,α'-СН), 6.42 (м, 1Н, краситель γ-СН), 7.32 (м, 2Н, краситель β,β'-СН), 7.75-7.94 (уш.м., 7Н, С(6)Н, ArH).
ЯМР 31Р (D2O, δ, м.д.): -21.34 (т, βР), -11.36 (д, αР), -7.11 (д, γР)
Пример 15. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-7-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А2).
Получают 0.53 мкмоль (53%) соединения А2. Найдено: m/z 1148.1 [М]+. C44H53N6O20P3S2 4-. Вычислено: М=1142.97.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д., J/Гц): 1.31 (т, 6Н, СН2СН 3, J=7.0), 1.53 (с, 12Н, краситель С(3,3)Н 3, C(3',3')H 3), 2.21 (м, 4Н, С(2')H 2, краситель С(6)H 2), 3.02 (м, 2Н, краситель С(7)Н 2), 3.72 (м, 2Н, краситель С(3)Н 2), 4.13 (уш.м, 8Н, С(3')Н, С(4')Н, С(5')Н 2, CH 2CH3), 6.11 (м, 2Н, краситель α,α'-СН,), 6.35 (м, 3Н, С(1')Н, краситель С(1)Н, С(2)Н), 6.42 (м, 1Н, краситель γ-СН), 7.33 (м, 2Н, краситель β,β'-СН), 7.63-7.95 (уш.м., 7Н, С(6)Н, ArH)
ЯМР 31Р (D2O, δ, м.д.): -21.84 (т, βР), -11.94 (д, αР), -7.71 (д, γP)
Пример 16. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-10-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидодек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение A3).
Получают 0.79 мкмоль (79%) соединения A3. Найдено: m/z 1187.4 [М]+. C47H59N6O20P3S2 4-. Вычислено: М=1185.05.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д., J/Гц): 1.07, 1.29, 1.95, 2.2 (4 м, 16Н, С(2')Н 2, краситель C(6)Н 2, С(7)Н 2, С(8)Н 2, С(9)Н 2, СН2СН 3), 1.51 (с, 12Н, краситель С(3,3)H 3, С(3',3')Н 3), 2.77 (м, 2Н, краситель С(10)H 2), 3.75 (м, 2Н, краситель С(3)Н 2), 4.08 (уш.м, 8Н, С(3')H, С(4')Н, С(5')H 2, CH 2CH3), 6.09 (м, 3Н, краситель α,α'-СН, С(1')Н), 6.40 (м, 3Н, краситель γ-СН, С(1)Н, С(2)Н), 7.32, 7.73, 7.87 (3 м., 9Н, С(6)Н, ArH, краситель β,β'-СН)
ЯМР 31Р (D2O, δ, м.д.): -23.11 (т, βР), -12.16 (д, αР), -7.96 (д, γР)
Пример 17. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-8-метилоксисульфенил-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А4).
Получают 0.77 мкмоль (77%) соединения А4. Найдено: m/z 1224.3 [М]+. C46H57N6O21P3S3 4-. Вычислено: М=1219.09.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д., J/Гц): 1.32 (т, 6Н, СН2СН 3, J=7.0), 1.57 (с, 12Н, краситель С(3,3)Н 3, С(3',3')Н 3), 2.03 (м, 2Н, краситель С(7)Н 2), 2.27 (м, 2Н, С(2')Н 2), 2.63 (д, 3Н, S(O)CH 3), 2.80 (м, 2Н, краситель С(8)Н 2), 3.65 (м, 3Н, краситель С(3)Н 2, С(6)Н), 4.08 (уш.м, 8Н, С(3')Н, С(4')Н, С(5')Н 2, CH 2CH3), 6.15 (м, 3Н, краситель α,α'-СН, С(1')Н). 6.35 (м, 2Н, краситель С(1)Н, С(2)Н). 6.45 (м, 1Н, краситель γ-СН), 7.33 (м., 2Н, краситель β,β'-СН), 7.6-7.98 (уш.м., 7Н, С(6)Н, ArH)
ЯМР 31Р (D2O, δ, м.д.): -22.16 (т, βР), -11.23 (д, αР), -7.98 (д, γP)
Пример 18. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-7-гидрокси-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А5).
Получают 0.46 мкмоль (46%) соединения А5. Найдено: m/z 1174.3 [М]+. C45H55N6O21P3S2 4-. Вычислено: М=1173.00.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д., J/Гц): 1.27 (т, 6Н, СН2СН 3, J=7.0), 1.52 (с, 12Н, краситель С(3,3)Н 3, С(3',3')Н 3), 2.27 (м, 2Н, С(2')H 2), 3.65 (м, 6Н, краситель С(6)Н, С(7)Н 2, С(3)H 2), 4.08 (уш.м, 8Н, С(3')Н, С(4')Н, С(5')Н 2, СН 2СН3), 6.12 (м, 3Н, краситель α,α'-СН, С(1')Н), 6.37 (м, 3Н, краситель γ-СН, С(1)Н, С(2)Н), 7.27, 7.72, 7.84 (3 м., 9Н, С(6)Н, ArH, краситель β,β'-СН)
ЯМР 31Р (D2O, δ, м.д.): -22.56 (т, βР), -11.96 (д, αР), -7.13 (д, γP)
Пример 19. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А6).
Получают 0.84 мкмоль (84%) соединения А6. Найдено: m/z 1147.3 [М]+. C44H53N6O20P3S2 4-. Вычислено: М=1142.97.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д., J/Гц): 1.26 (т, 6Н, CH2CH 3, J=7.0), 1.63 (с, 12Н, краситель С(3,3)Н 3, С(3',3')Н 3), 2.27 (м, 2Н, С(2')H 2), 2.58 [с, 3Н, N(CH 3)], 3.61 (с, 2Н, краситель С(6)Н 2), 3.72 (м, 2Н, краситель С(3)H 2), 4.13 (уш.м, 8Н, С(3')Н, С(4')Н, С(5')Н 2, CH 2CH3), 6.34 (м, 3Н, краситель α,α'-СН, С(1')Н), 6.39 (м, 2Н, краситель С(1)Н, С(2)Н), 6.48 (м, 1H, краситель γ-СН), 7.15, 7.34, 7.86, 7.98 (4 м., 9Н, С(6)Н, ArH, краситель β,β'-СН)
ЯМР 31Р (D2O, δ, м.д.): -21.88 (т, βР), -11.05 (д, αР), -7.96 (д, γР)
Пример 20. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А7).
Получают 0.8 мкмоль (80%) соединения А7. Найдено: m/z 1176.2 [М]+. C46H57N6O20P3S2 4-. Вычислено: М=1171.03.
ЯМР 1Н (D2O, δ, м.д., J/Гц): 1.23 (т, 6Н, СН2СН 3, J=7.0), 1.41 (с, 12Н, краситель С(3,3)Н 3, С(3',3')Н 3), 1.61 (м, 2Н, краситель С(7)H 2), 2.05 (м, 2Н, краситель С(6)H 2), 2.25 (м, 4Н, С(2')Н 2), 2.50 [с, 3Н, N(CH 3)], 2.84 (м, 2Н, краситель С(8)Н 2), 3.72 (м, 2Н, краситель С(3)H 2), 4.08 (уш.м, 8Н, С(3')H, С(4')Н, С(5')Н 2, СН 2СН3), 6.01 (м, 3Н, краситель α,α'-СН, С(1')Н), 6.35 (м, 3Н, краситель С(1)Н, С(2)Н, γ-СН), 7.27 (м., 2Н, краситель β,β'-СН), 7.61-7.83 (уш.м., 7Н, С(6)Н, ArH).
ЯМР 31Р (D2O, δ, м.д.): -24.28 (т, βР), -11.96 (д, αР), -7.12 (д, γР)
Пример 21. Использование флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов общей формулы (А) на примере тест-системы «ТБ-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия).
ДНК образцы анализировали в соответствии с рекомендациями производителя (Биочип-ИМБ, Москва, Россия). Амплификацию ДНК образца осуществляли методом мультиплексной двухраундовой ПЦР. Обнаружение продуктов ПЦР после каждой стадии подтверждали при помощи агарозного гель электрофореза. На первой стадии мультиплексной ПЦР проводили амплификацию геномной ДНК (3 μl) в конечном объеме 30 мкл. Реакционная смесь (конечный объем 30 мкл) содержала 3 мкл Taq буфера, 2.5 ед. Taq полимеразы, по 0.2 мкМ каждого дезоксинуклеозид трифосфата, праймеры, и 3 мкл ДНК образца. Температурный режим был следующим: денатурация 95°С - 4 мин, затем 36 циклов амплификации (95°С - 30 сек, 67°С - 30 сек, 72°С - 30 сек), заключительная стадия инкубации 72°С - 5 мин. В качестве матрицы для проведения 2 стадии использовали 1 мкл реакционной смеси, полученной на 1 стадии. Вторую стадию проводили методом асимметричной мультиплексной ПЦР для получения преимущественного флуоресцентно-меченого продукта, необходимого для гибридизации с олигонуклеотидными зондами. Реакционная смесь 2-ой стадии содержала 8 мкмоль флуоресцентно-меченого нуклеотида общей формулы (А) и избыток одного праймера. Температурный режим был следующим: денатурация 95°С - 5 мин, затем 37 циклов амплификации (95°С - 20 сек, 65°С - 30 сек, 72°С - 30 сек), заключительная стадия инкубации 72°С - 5 мин. К 12 мкл реакционной смеси, полученной на 2 стадии мультиплексной ПЦР и содержащей преимущественно одноцепочечную флуоресцентно-меченую ДНК, добавляли 24 мкл концентрированного раствора гибридизационного буфера. Полученную смесь помещали в гибридизационную камеру биочипа. Гибридизацию проводили при 37°С в течение 18 ч. По окончании гибридизации микрочип отмывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов гибридизации выполняли на портативном анализаторе флуоресценции «Чипдетектор» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия) с использованием специализированного программного обеспечения Imageware.
Claims (64)
1. Соединения общей формулы
где R1 представляет собой -Н, -СН3;
R2 представляет собой -Н; -СН2ОН; -(CH2)2S(O)CH3;
n=0-5;
m=1-3;
М+ представляет собой Na+, Li+, K+, (C2H5)(4-y)NHy + (где у=1,4).
2. Соединения по п. 1, представляющие собой
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-10-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидодек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-10-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидодек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-10-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидодек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата,
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-10-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидодек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-10-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидодек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетранатриевую соль 5-[4-аза-8-метилоксисульфенил-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракалиевую соль 5-[4-аза-8-метилоксисульфенил-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетралитиевую соль 5-[4-аза-8-метилоксисульфенил-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-8-метилоксисульфенил-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-8-метилоксисульфенил-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфонамидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетранатриевую соль 5-[4-аза-7-гидрокси-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракалиевую соль 5-[4-аза-7-гидрокси-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетралитиевую соль 5-[4-аза-7-гидрокси-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-7-гидрокси-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-7-гидрокси-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3'3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидогекс-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракалиевую соль 5 -[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата;
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)сульфон-N-метиламидоокт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата.
3. Соединения общей формулы
где R1 представляет собой -Н, -СН3;
R2 представляет собой –Н, -СН2ОН, -(CH2)2S(O)CH3;
R3 представляет собой -Н, pNP, NHS;
n=0-5;
m=1-3.
4. Соединения по п. 3, представляющие собой
5-(N-карбоксиметил)аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель;
5-[N-(2-карбоксиэтил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель;
5-[N-(5-карбоксипентил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель;
5-[N-(1-карбокси-3-метилоксисульфенил-проп-1-ил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель;
5-[N-метил-N-(1-карбокси-2-гидроксиэтил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель;
5-[N-метил-N-карбоксиметил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель;
5-[N-метил-N-(3-карбоксипроп-1-ил)]аминосульфонил-3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-N,N'-диэтилиндодикарбоцианиновый краситель.
5. Способ получения соединений по пп. 3 и 4, заключающийся в непосредственной модификации натриевой соли индоцианинового красителя, содержащей две сульфогруппы, путем превращения одной из сульфогрупп в положении 5 индоленинового фрагмента в карбоксиалкилсульфамидную группу.
6. Способ получения по п. 5, включающий следующие стадии:
а) реакцию образования моносульфохлорида посредством взаимодействия сульфогруппы натриевой соли индоцианинового красителя с PCl5 в триметилфосфате;
б) взаимодействие моносульфохлорида цианинового красителя с аминокомпонентом в бикарбонатном буферном растворе при +20°С и атмосферном давлении;
в) выделение продукта по пп. 3 и 4 обращенно-фазовой хроматографией на колонке RP-18 в системе ацетонитрил-вода.
7. Применение соединений по пп. 1 и 2 в качестве флуоресцентных меток для маркирования ДНК в ходе ПЦР.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017133058A RU2667070C1 (ru) | 2017-09-22 | 2017-09-22 | Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017133058A RU2667070C1 (ru) | 2017-09-22 | 2017-09-22 | Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2667070C1 true RU2667070C1 (ru) | 2018-09-14 |
Family
ID=63580190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017133058A RU2667070C1 (ru) | 2017-09-22 | 2017-09-22 | Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2667070C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008127139A1 (fr) * | 2007-04-11 | 2008-10-23 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Colorants d'indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l'analyse de macromolécules biologiques |
| US20100041901A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Nicholas Cairns | Sulfonyl Cyanine Dyes and Derivatives |
-
2017
- 2017-09-22 RU RU2017133058A patent/RU2667070C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008127139A1 (fr) * | 2007-04-11 | 2008-10-23 | Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Colorants d'indocyanine fluorescents et leurs dérivés destinés à l'analyse de macromolécules biologiques |
| US20100041901A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Nicholas Cairns | Sulfonyl Cyanine Dyes and Derivatives |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Shershov, Valeriy E. et al., Mendeleev сommunications, 2017, 27(4), 360-362. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11530439B2 (en) | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels | |
| CA3060885C (en) | Secondary amine-substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels | |
| US10239909B2 (en) | Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels | |
| IL279660B1 (en) | Tertiary amine modified coumarin materials and their use as fluorescent tags | |
| CA3103900A1 (en) | Exocyclic amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels | |
| US10144967B2 (en) | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels | |
| JP2000187036A (ja) | 長いスト―クスシフトを有するエネルギ―転移色素 | |
| US20120004391A2 (en) | Cyanine-type compounds having an alkynyl linker arm | |
| JP2003532745A (ja) | エネルギー伝達アッセイ法および試薬 | |
| US8809551B1 (en) | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels | |
| EP1110088B1 (en) | Energy transfer dyes | |
| Spitsyn et al. | Synthetic route to novel zwitterionic pentamethine indocyanine fluorophores with various substitutions | |
| CN101631796B (zh) | 具有由单核苷或单核苷酸衍生的结构的化合物、核酸、标记物以及核酸检测方法和试剂盒 | |
| RU2667070C1 (ru) | Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР | |
| RU2725884C2 (ru) | Дезоксиуридинтрифосфаты, маркированные цвитерионными индоцианиновыми красителями | |
| RU2637310C1 (ru) | Флуоресцентно-меченые дезоксиуридинтрифосфаты | |
| JP2006500065A (ja) | エネルギー移動色素、ダイターミネーター及びその使用 | |
| JP2011088892A (ja) | 新規な蛍光クエンチャー分子とこれを利用する方法及び使用 | |
| KR20200128105A (ko) | 새로운 소광제 및 리포터 염료 조합물 | |
| US6967250B1 (en) | Energy transfer dyes | |
| Spitsyn et al. | Infrared fluorescent markers for microarray DNA analysis | |
| Kuba | Novel fluorescent nucleotides for metabolic labelling and for the construction of DNA probes | |
| JP2023520536A (ja) | 架橋ベンゾピリリウム塩に基づく高ストークスシフトを有する蛍光色素 |