WO2008107501A1 - Composition para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por helicobacter - Google Patents

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WO2008107501A1
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Adrián VELAZQUEZ CAMPOY
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Universidad De Zaragoza
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    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
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    • C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D271/12—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems

Definitions

  • composition for the treatment of infectious diseases caused by Helicobacter Composition for the treatment of infectious diseases caused by Helicobacter
  • the present invention relates to a compound of general formula (I), capable of inhibiting flavodoxin, for use as a pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases, more specifically those caused by Helicobacter.
  • H. pylor ⁇ infection is one of the most frequent chronic diseases at present; In fact, this bacterium is colonizing the gastric mucosa of more than 50% of the human population.
  • H. pylori is a gram-negative bacillus that causes chronic gastritis, gastric and duodenal ulcers and is a risk factor in the development of MALT lymphoma and adenocarcinoma (one of the most frequent and lethal types of cancer).
  • the conventional treatment currently used to eradicate the infection by Helicobacter pylori consists of two broad-spectrum antibiotics and a proton pump inhibitor. Therefore, there is no specific treatment for this condition or especially effective since the number of patients treated successfully does not exceed 80%. In addition, its great mutational variability is producing a decline in the efficacy of conventional treatments due to an increasing increase in resistance to conventional antibiotics.
  • new compounds are described for use as pharmaceutical compositions.
  • these compositions for the treatment of infectious diseases, and more specifically diseases caused by H, pylori.
  • a first aspect of the present invention refers to compounds (hereinafter “compounds of the invention") whose general formula is (I) or any of its salts, for use as a pharmaceutical composition.
  • Ri and R 2 are selected from the atoms of oxygen (O), sulfur (S) or nitrogen (N) 1 and can be the same or different; preferably R 1 is N and
  • R 2 is O.
  • R 3 is selected from the sulfur atoms (S) or oxygen (O); preferably R3 is S.
  • R 4 is selected from a hydrogen atom (H) or an alkyl group
  • R 4 is an alkyl group
  • R 4 is a methyl group.
  • R 5 is a group selected from the radicals NO 2 , COOR 'or SO 3 R', where R 'is a hydrogen atom (H) or a (C 1 -C 6 ) alkyl group. Preferably it is a group NO 2 , COOH or SO 3 H; more preferably NO 2 .
  • n indicates the number of carbon atoms of the aliphatic chain that joins the radical R 3 with the carbon of the corresponding aromatic ring, taking values of between O to 3; preferably n is 1.
  • Alkyl refers to linear, branched or cyclic hydrocarbon radicals, which consist of carbon and hydrogen atoms, which have no saturation, which have one to six carbon atoms, preferably one to four, and which are attached to the rest of the molecule by a single bond, for example, methyl, ethyl, propyl, n-butyl, t-butyl, etc.
  • the compound of the invention has the following formula (II):
  • Another preferred embodiment of the present invention comprises the use of the compounds of general formula (I) for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • This composition is used in the treatment of infectious diseases.
  • Some infectious diseases are caused by gram-negative bacteria, as is the case with the Helicobacter bacteria.
  • flavodoxin is a redox protein, of structure ⁇ / ⁇ , whose function is the transfer of electrons in various Metabolic routes.
  • PFOR flavodoxin oxidoreductase
  • flavodoxin carries a non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) molecule.
  • FMN flavin mononucleotide
  • pylor ⁇ presents a very significant difference in the FMN binding site, where an alanine residue replaces the tryptophan residue characteristic of the other flavodoxins. For this reason, it has a groove adjacent to the cofactor junction site that constitutes a suitable site for the union of potentially inhibitory molecules of its biological activity, either because they alter the redox potential of the FMN preventing the transfer of electrons to PFOR, or simply because block the coupling of the two proteins. The blockage of the pyruvate oxidation route determines the death of the bacterium.
  • Flavodoxin is, therefore, essential for the survival of the bacterium and is absent in humans and, as described above, it constitutes a suitable therapeutic target for the eradication of diseases related to the infection.
  • a preferred embodiment of the present invention comprises the use of the compounds of general formula (I), for the treatment of infectious diseases caused by bacteria of the genus Helicobacter, preferably of the species Helicobacter pylor ⁇ .
  • These compounds can, therefore, be used for the preparation of a medicament or pharmaceutical composition for the treatment of these diseases.
  • the pharmaceutical composition in addition to said compounds may comprise pharmaceutically acceptable excipients, additives, etc. Therefore, these compounds capable of inhibiting flavodoxin constitute a very good alternative for the treatment of infectious diseases, particularly those caused by Helicobacter, more specifically by H. Pylori.
  • Infectious diseases caused by Helicobacter pylori are related to gastrointestinal diseases such as chronic gastritis, gastric and / or duodenal ulcers, lymphoma or gastric cancer. Therefore, an even more preferred embodiment comprises the use of the compounds of the invention for the treatment of infectious diseases such as chronic gastritis, gastric and / or duodenal ulcers, lymphoma or gastric cancer.
  • Fig. 1, - Shows a graph of comparison of product formation curves in the essential reaction of H pylori in the presence or absence of the compound of formula (II) at a concentration of 50 ⁇ M. Measure the absorbance (A) (au is absorbance unit) at 340nm versus time (t) in second (s).
  • Genomic H. pylori DNA was isolated from samples of antigen-positive patients using the QlAamp DNA Stool Mini Kit (Q / agen).
  • the DNA sequence encoding flavodoxin was amplified by PCR using the Neo primer (SEQ ID No.1) and the BamHI primer (SEQ ID No. 2) and Taq DNA polymerase (Madgen).
  • the fragments were purified and cloned into the Ncol-BamHI sites of the expression vector pET28a (Novagen) using standard techniques. The insertion of the gene, as well as its directionality and integrity were checked by sequencing the plasmid DNA from the phage promoter T7.
  • Competent E. coli BL21 cells were transformed with plasmid pET28a containing the insert and cultured in 10 ml of Luria-Bertani medium in the presence of kanamycin (30 ⁇ g / ml) at 37 0 C.
  • the culture was diluted 10 times under the same conditions and allowed to grow until the optical density was 0.8 to 600 nm. It was then induced with IPTG (final concentration of 1 mM) and the cells were allowed to grow 3-4 hours. After this time, the culture was centrifuged to obtain the cells which were cleaned with 0.15 M NaCl.
  • the cells were resuspended with 50 Mm Tris-HCI buffer, pH 8, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 1 mM EDTA and 1 mM PMSF.
  • the cell rupture was carried out with ultrasound cycles and the cell debris was removed by centrifugation (45 min at 18,000 rpm at 4 0 C).
  • the crude extract obtained was precipitated at 65% of the saturation concentration of ammonium sulfate and centrifuged.
  • the supernatant was loaded on a DEAE DE-52 cellulose column equilibrated with 50 mM Tris-HCI, pH 8, at 65% ammonium sulfate.
  • the protein eluted with a reverse gradient of 65 to 0% of (NhU) 2 SO 4 saturation.
  • the protein was eluted through a 0 to 1 M NaCI gradient.
  • the protein is obtained pure after this column, although to separate the apo form (without cofactor) and the holo form (with cofactor) of the protein it is necessary to pass the sample through a MonoQ-10 column in an FPLC system.
  • the protein was stored at -20 0 C.
  • Flavodoxin is an essential protein for the survival of Helicobacter pylor ⁇ since it participates in a fundamental reaction of obtaining energy from the oxidative decarboxylation of pyruvate. In that reaction, the flavodoxin transfers electrons between the PFOR enzyme and the FqrB enzyme, which yields them to NADP + .
  • the cDNA corresponding to the PFOR enzyme gene inserted in the pBS vector (KS) was used, as well as that of the FqrB enzyme gene inserted in the vector pET29b.
  • Both recombinant enzymes are expressed as soluble fraction, PFOR in competent JVQ2 E. coli cells that are deficient in reductases (nfsA and nfsB) and FqrB in competent BL21 cells (DE3).
  • the cells grow in LB medium at 37 0 C and selected for ampicillin resistance in the case of JVQ2 and kanamycin in the case of BL21.
  • the FqrB enzyme is expressed with a tail of 6 histidines in the N-terminal of the amino acid sequence to be purified through a nickel affinity chromatography.
  • the cells are resuspended in the rupture buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCI, pH 8 with 10 mM imidazole) and fractured through 10 second ultrasound cycles, resting 1 minute between each cycle.
  • the cell debris was removed by centrifugation at 10,000 rpm 30 min at 4 0 C and the supernatant was loaded on a nickel affinity column (Ni-NTA agarose, Qiagen) that was previously equilibrated with rupture buffer. Three washes are performed with 20, 40 and 60 mM midazole to eliminate nonspecific interactions of the matrix with other proteins and the FqrB enzyme is eluted from the column with a gradient of 250 mM imidazole.
  • the PFOR enzyme is inactive due to its exposure to air (it is inactivated by oxygen), so its purification was carried out in a system where it had been Previously a nitrogen flow was passed and the connections were hermetically sealed.
  • the cells are resuspended in 50 mM Tris-HCI, pH 7.4 with 1 mM MgCI, 1 mM DTT and 10% glycerol, sonicated by 10 second ultrasound cycles resting 1 minute between cycles and centrifuged at 8,000 rpm, 10 min at 4 0 C to remove cell debris. Subsequently, a higher speed centrifugation is performed (2h at 24,000 rpm) and the protein concentration is determined by the Bradford technique.
  • the crude extract was diluted with the previous buffer until 25 mg of protein was left for me.
  • the protein was partially purified by a DEAE DE-52 column with a 0-0.5 M gradient of sodium chloride.
  • the fractions containing the enzyme were located by means of a rapid aerobic test that consists of adding 25 ⁇ l of reaction buffer (500 mM pyruvate, 10 mM CoA and 100 mM benzyl viologen) to fractions of 50-100 ⁇ l of sample. and the fractions containing the enzyme change the color from transparent to blue.
  • the sequential electron transfer reaction between pyruvate, PFOR, flavodoxin, FqrB and NADP + was followed spectroscopically by the appearance of a signal at 340 nm when NADPH was formed.
  • the reaction mixture contained 100 mM potassium phosphate pH 7, 1OmM pyruvate, 0.18 mM CoA, 1mM MgCI, 0.3 mM NADP + , 0.09 mg / ml PFOR, 10 ⁇ M FId and 0.15 ⁇ M FqrB.
  • the reaction was initiated by the addition of 0.18mM of coenzyme A (CoA) that was in a compartment at part inside the same bucket.
  • CoA coenzyme A
  • the reaction was completed 15 minutes after adding the CoA reagent and the absence of any of the components of the reaction resulted in the absence of NADPH formation, indicating that all components were essential and irreplaceable for the transfer of electrons between pyruvate and NADP + .
  • the inhibition tests were carried out under the same conditions as the activity tests described above, also adding in the reaction vessel 50 ⁇ M of the compound of general formula (II) of the present invention.
  • the binding experiments were carried out in 50 mM EPPS buffer, pH 9 at 7% DMSO, the inhibitor being in the injection syringe at 300-500 ⁇ M concentration and the protein, around 20 ⁇ M, in the measuring cell.
  • the affinity constant of the inhibitors was around 1 ⁇ M, in accordance with the results obtained in the inhibition tests (completely inhibit, at micromolar concentrations, the decarboxylation of pyruvate).
  • the compound of general formula Il has an affinity for flavodoxin of 3.0 (+ 1.0) ⁇ M.

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Abstract

Compuesto de fórmula general (I) para su uso en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por Helicobacter pylori. R<SUB>1</SUB> y R<SUB>2 </SUB>son O, S ó N, y pueden ser iguales o diferentes; R<SUB>3</SUB> es O ó S; R<SUB>4 </SUB>es H ó un grupo alquilo (C<SUB>1</SUB>-C<SUB>6</SUB>); n toma valores de entre O a 3 y R<SUB>5</SUB> es un radical NO<SUB>2</SUB>, COOR' ó S<SUB>O</SUB>3R', donde R' es un átomo de hidrógeno (H) ó un grupo alquilo (C<SUB>1</SUB>-C<SUB>6</SUB>).

Description

Composición para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por Helicobacter
La presente invención se refiere al un compuesto de fórmula general (I), capaces de inhibir Ia flavodoxina, para su uso como composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas, más concretamente de aquellas causadas por Helicobacter.
Figure imgf000002_0001
(I)
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La infección por Helicobacter pylorí (H. pylori) es una de las enfermedades crónicas más frecuentes en Ia actualidad; de hecho, esta bacteria se encuentra colonizando Ia mucosa gástrica de más del 50% de la población humana.
H. pylori es un bacilo gram-negativo que causa gastritis crónica, úlceras gástricas y duodenales y es factor de riesgo en el desarrollo de linfoma MALT y adenocarcinoma (uno de los tipos de cáncer más frecuente y letal).
El tratamiento convencional utilizado actualmente para erradicar Ia infección por Helicobacter pylori consiste en dos antibióticos de amplio espectro y un inhibidor de Ia bomba de protones. Por tanto, no hay un tratamiento específico para esta afección ni especialmente efectivo ya que el número de pacientes tratados con éxito no supera el 80 %. Además, su gran variabilidad mutacional está produciendo un declive de Ia eficacia de los tratamientos convencionales debido a un aumento creciente de resistencias a antibióticos convencionales.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
En Ia presente invención se describen nuevos compuestos para su uso como composiciones farmacéuticas. Además del uso de estas composiciones para el tratamiento de enfermedades infecciosas, y más concretamente enfermedades causadas por H, pylorí.
Por Io tanto, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a compuestos (en adelante "compuestos de Ia invención") cuya fórmula general es (I) o cualquiera de sus sales, para su uso como una composición farmacéutica.
Figure imgf000003_0001
(I)
En Ia que R-i, R2, R3, R4, Rsy n se definen a continuación:
Ri y R2 se seleccionan de entre los átomos de oxígeno (O), azufre (S) ó nitrógeno (N)1 y pueden ser iguales o diferentes; preferiblemente R1 es N y
R2 es O.
R3 se selecciona de entre los átomos de azufre (S) ú oxígeno (O); preferiblemente R3 es S.
R4 se selecciona de entre un átomo de hidrogeno (H) ó un grupo alquilo
(C1-C6), lineal, ramificado ó cíclico. Preferiblemente R4 es un grupo alquilo
(C1-C3) y más preferiblemente R4 es un grupo metilo.
R5 es un grupo seleccionado de entre los radicales NO2, COOR' ó SO3R', donde R' es un átomo de hidrógeno (H) ó un grupo alquilo (C1-C6). Preferiblemente se trata de un grupo NO2, COOH ó SO3H; más preferentemente NO2.
n indica el número de átomos de carbonos de Ia cadena alifática que une el radical R3 con el carbono del anillo aromático correspondiente, tomando valores de entre O a 3; preferentemente n es 1.
"Alquilo" se refiere a radicales de hidrocarburos lineales, ramificadas ó cíclicos, que consisten en átomos de carbono e hidrógeno, que no tienen saturación, que tienen de uno a seis átomos de carbono, preferiblemente de uno a cuatro y que están unidos al resto de Ia molécula por un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, n-butilo, t-butilo, etc.
En una realización preferida, el compuesto de Ia invención tiene Ia siguiente fórmula (II):
Figure imgf000004_0001
Otra realización preferida de Ia presente invención, comprende el uso de los compuestos de fórmula general (I) para Ia elaboración de una composición farmacéutica. Esta composición se usa en el tratamiento de enfermedades infecciosas.
Algunas enfermedades infecciosas son causas por bacterias de tipo gram negativo, como es el caso de Ia bacteria Helicobacter.
Una diana terapéutica efectiva para el tratamiento de este tipo de enfermedades concretas es Ia flavodoxina, que es una proteína redox, de estructura α/β, cuya función es Ia transferencia de electrones en diversas rutas metabólicas. En Helicobacter pylorí acepta electrones de Ia enzima piruvato flavodoxina oxidoreductasa (PFOR) en Ia ruta de descarboxilación oxidativa del piruvato, para convertir el piruvato en acetil-CoA. Para realizar su función de mediador electrónico, Ia flavodoxina porta una molécula de flavin mononucleótido (FMN) unida de forma no covalente. Pese a su parecido estructural con flavodoxinas de otras especies, Ia de H. pylorí presenta una diferencia muy significativa en el sitio de unión de FMN, donde un residuo de alanina reemplaza al residuo de triptófano característico de las demás flavodoxinas. Por esta razón presenta una hendidura adyacente al sitio de unión del cofactor que constituye un sitio adecuado para Ia unión de moléculas potencialmente inhibidoras de su actividad biológica, bien porque alteren el potencial redox del FMN impidiendo Ia transferencia de electrones a PFOR, o bien sencillamente porque bloquee el acoplamiento de las dos proteínas. El bloqueo de Ia ruta de oxidación de piruvato determina Ia muerte de Ia bacteria.
La flavodoxina, es por tanto, esencial para Ia supervivencia de Ia bacteria y está ausente en humanos y, como se describió anteriormente, constituye una diana, terapéutica apropiada para Ia erradicación de las enfermedades relacionadas con Ia infección.
Se demuestra (ver ejemplos), que los compuestos de Ia invención inhiben completamente, en el rango micromolar, esta bacteria H. pylorí, mediante Ia oxidación de piruvato en Ia que interviene Ia flavodoxina de H. pylorí.
Por Io tanto, una realización preferida de Ia presente invención, comprende el uso de los compuestos de fórmula general (I), para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias del género Helicobacter, preferentemente de Ia especie Helicobacter pylorí.
Estos compuestos pueden, por tanto, ser utilizados para Ia elaboración de un medicamento ó composición farmacéutica para el tratamiento de estas enfermedades. La composición farmacéutica además de dichos compuestos, puede comprender excipientes, aditivos, etc., farmacéuticamente aceptables. Por tanto, estos compuestos capaces de inhibir Ia flavodoxina, constituyen una muy buena alternativa para el tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente las causadas por Helicobacter, más concretamente por H. Pylori.
El uso de los compuestos con fórmula general (I), descritos en Ia presente invención, suplirían Ia ausencia de tratamiento específico contra este patógeno al tratarse de compuestos inhibidores específicos de Ia proteína flavodoxina. Por otro lado, Ia ausencia de una proteína homologa en humanos hace que estos inhibidores representen una terapia molecular específica con nula o baja tasa de efectos secundarios en el organismo huésped.
Las enfermedades infecciosas causadas por Helicobacter pylori están relacionadas con patologías gastrointestinales como pueden ser, gastritis crónica, úlceras gástricas y/o duodenales, linfoma o cáncer gástrico. Por Io tanto, una realización aún más preferida, comprende el uso de los compuestos de Ia invención para el tratamiento de enfermedades infecciosas tales como gastritis crónica, úlceras gástricas y/o duodenales, linfoma o cáncer gástrico.
A Io largo de la descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA
Fig. 1,- Muestra una gráfica de comparación de curvas de formación de producto en Ia reacción esencial de H pylori en presencia o ausencia del compuesto de fórmula (II) a una concentración de 50 μM. Medida Ia absorbancia (A) (a.u. es unidad de absorbancia) a 340nm frente al tiempo (t) en segundo (s). EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto Ia especificidad y efectividad de los inhibidores de Ia flavodoxina
Ejemplo 1 : Clonaje del gen de Ia flavodoxina recombinante
El ADN genómico de H. pylori se aisló de muestras de pacientes antígeno- positivos usando el kit QlAamp DNA Stool Mini Kit (Q/agen).
La secuencia de ADN que codificó para Ia flavodoxina fue amplificado por PCR usando el cebador Neo (SEQ ID No.1 ) y el cebador BamHI (SEQ ID No. 2) y Taq DNA polimerasa (Madgen).
Tras Ia amplificación se detectaron fragmentos de unos 600 nucleótidos, correspondientes al fragmento del gen de Ia flavodoxina (613 nucleótidos).
Los fragmentos fueron purificados y clonados en los sitios Ncol-BamHI del vector de expresión pET28a (Novagen) usando técnicas estándar. La inserción del gen, así como su direccionalidad e integridad fueron comprobadas por secuenciación del ADN del plásmido a partir del promotor de fago T7.
Ejemplo 2: Expresión y purificación de flavodoxina de H. pylori recombinante
Se transformaron células de E. coli BL21 competentes con el plásmido pET28a que contiene el inserto y se cultivó en 10 mi de medio Luria-Bertani en presencia de kanamicina (30 μgr/ml) a 37 0C.
El cultivo fue diluido 10 veces en las mismas condiciones y dejado crecer hasta que Ia densidad óptica fue de 0.8 a 600nm. Se indujo entonces con IPTG (concentración final de 1 mM) y se dejaron crecer las células 3-4 horas. Tras este tiempo, se centrífugo el cultivo para obtener las células las cuales fueron limpiadas con 0.15 M de NaCI.
Después de Ia centrifugación se resuspendieron las células con tampón Tris-HCI 50 Mm, pH 8, 1 mM β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA y 1 mM PMSF.
La ruptura celular se llevó a cabo con ciclos de ultrasonidos y los restos celulares se eliminaron por centrifugación (45 min a 18000 rpm a 4 0C).
El extracto crudo obtenido se precipitó al 65% de Ia concentración de saturación de sulfato amónico y se centrifugó. El sobrenadante se cargó en una columna de celulosa DEAE DE-52 equilibrada con Tris-HCI 50 mM, pH 8, al 65% de sulfato amónico.
La proteína eluyó con un gradiente reverso de 65 a 0% de (NhU)2SO4 de saturación.
Tras Ia diálisis de Ia proteína con tampón Tris-HCI 50 mM, pH 8, se cargó en otra columna de celulosa DEAE DE-52 equilibrada en el mismo tampón.
La proteína fue eluída a través de u gradiente de 0 a 1 M de NaCI. La proteína se obtiene pura tras esta columna, aunque para separar Ia forma apo (sin cofactor) y Ia forma holo (con cofactor) de Ia proteína es necesario pasar Ia muestra por una columna MonoQ-10 en un sistema FPLC.
La proteína se guardó a -20 0C.
Ejemplo 3: Ensayos de inhibición
La flavodoxina es una proteína esencial para Ia supervivencia de Helicobacter pylorí ya que participa en una reacción fundamental de obtención de energía a partir de Ia descarboxilación oxidativa del piruvato. En esa reacción, Ia flavodoxina transfiere electrones entre Ia enzima PFOR y Ia enzima FqrB, Ia cual los cede al NADP+. En el siguiente ejemplo se utilizaron el cDNA correspondiente al gen de Ia enzima PFOR insertado en el vector pBS(KS), así como el del gen de Ia enzima FqrB insertado en el vector pET29b.
Ambas enzimas recombinantes son expresadas como fracción soluble, PFOR en células competentes JVQ2 de E. coli que son deficientes en reductasas (nfsA y nfsB) y FqrB en células competentes BL21 (DE3).
Las células crecen en medio LB a 37 0C y seleccionadas por su resistencia a ampicilina en el caso de JVQ2 y kanamicina en el caso de BL21.
Posteriormente se inducen con IPTG y tras 3 horas de inducción (Ia densidad óptica es en torno a 0.8), son guardadas a -80 0C.
La enzima FqrB es expresada con una cola de 6 histidinas en el N-terminal de Ia secuencia de aminiácidos para ser purificada a través de una cromatografía de afinidad por níquel. Así, las células son resuspendidas en el tampón de rotura (fosfato sódico 50 mM, 300 mM NaCI, pH 8 con 10 mM de imidazol) y fracturadas a través de ciclos de ultrasonidos de 10 segundos, descansando 1 minuto entre cada ciclo.
Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 10.000 rpm 30 min a 4 0C y el sobrenadante se cargó en una columna de afinidad por níquel (Ni- NTA agarosa, Qiagen) que fue previamente equilibrada con tampón de rotura. Se realizan tres lavados con 20, 40 y 60 mM de ¡midazol para eliminar interacciones inespecíficas de Ia matriz con otras proteínas y Ia enzima FqrB es eluída de Ia columna con un gradiente de 250 mM de imidazol.
Por último, Ia enzima se dializó en el tampón de almacenamiento PBS con 10 % de glicerol. Para los ensayos enzimáticos Ia cola de histidina no se elimino ya que se vio que no influye.
La enzima PFOR se inactivo por su exposición al aire (se inactiva por el oxígeno), así que su purificación se realizó en un sistema donde se había pasado previamente un flujo de nitrógeno y las conexiones estaban herméticamente selladas.
Las células son resuspendidas en 50 mM Tris-HCI, pH 7.4 con 1 mM MgCI, 1 mM DTT y 10 % glicerol, sonicadas mediante ciclos de ultrasonidos de 10 segundos descansando 1 minuto entre ciclos y centrifugadas a 8.000 rpm, 10 min a 4 0C para eliminar los restos celulares. Posteriormente se realiza una centrifugación a mayor velocidad (2h a 24,000 rpm) y se determina Ia concentración de proteína mediante Ia técnica de Bradford.
Se diluyó el extracto crudo con el tampón anterior hasta quedar 25 mg de proteína por mi. La proteína fue parcialmente purificada mediante una columna de DEAE DE-52 con un gradiente 0-0.5 M de cloruro sódico. Las fracciones que contenían Ia enzima se localizaron mediante un ensayo rápido en aerobiosis que consiste en que a fracciones de 50-100 μl de muestra se Ie añade 25 μl de tampón de reacción (500 mM piruvato, 10 mM CoA y 100 mM benzil viologeno) y las fracciones que contienen Ia enzima cambian el color de transparente a azul.
Posteriormente, las fracciones que contienen Ia enzima se dializaron en el tampón de almacenamiento (el mismo que se utiliza para resuspender las células). Posteriores pasos de purificación bajaron el rendimiento considerablemente y, ya que para los ensayos enzimáticos se vio que Ia actividad específica de la enzima no se ve alterada por las impurezas, para estos ensayos Ia enzima fue parcialmente purificada como se ha explicado.
La reacción secuencial de transferencia de electrones entre piruvato, PFOR, flavodoxina, FqrB y NADP+ (ensayo de actividad) se siguió espectroscópicamente mediante Ia aparición de señal a 340 nm al formarse NADPH. La mezcla de reacción contenía 100 mM fosfato potásico pH 7, 1OmM piruvato, 0.18 mM CoA, 1mM MgCI, 0.3 mM NADP+, 0.09 mg/ml PFOR, 10 μM FId y 0.15 μM FqrB. La mezcla, excepto el CoA, se colocó en una cubeta especialmente diseñada para anaerobiosis. Así, Ia eliminación de oxígeno se consiguió mediante ciclos de 5 minutos con flujo de vacío y argón alternativamente. La reacción se inició mediante la adición de 0.18mM de coenzima A (CoA) que se encontraba en un compartimento a parte dentro de Ia misma cubeta. La reacción se finalizó a los 15 minutos de añadir el reactivo CoA y Ia ausencia de alguno de los componentes de Ia reacción dio lugar a Ia ausencia de formación de NADPH, indicando que todos los componentes eran esenciales e insustituibles para Ia transferencia de electrones entre piruvato y NADP+.
Los ensayos de inhibición se llevaron a cabo en las mismas condiciones que los ensayos de actividad anteriormente descritos añadiendo además en Ia cubeta de reacción 50 μM del compuesto de fórmula general (II) de Ia presente invención.
Tal y como se demuestra en Ia Fig. 1 se detectó una inhibición prácticamente total a esta concentración.
Ejemplo 4: Energética de unión de los inhibidores
La unión específica de los inhibidores de Ia presente invención a Ia flavodoxina de H. pylorí fue confirmada mediante calorimetría de titulación isoterma (ITC). Esta técnica no sólo mide Ia afinidad de cada compuesto por Ia proteína diana, sino que determina Ia contribución de las componentes entálpica y entrópica de Ia unión.
Los experimentos de unión se llevaron a cabo en tampón EPPS 50 mM, pH 9 al 7 % DMSO, estando el inhibidor en Ia jeringa de inyección en concentración 300-500 μM y Ia proteína, entorno 20 μM, en Ia celda de medida.
La constante de afinidad de los inhibidores resultó entorno 1 μM, en concordancia con los resultados obtenidos en los ensayos de inhibición (inhiben completamente, a concentraciones micromolares, Ia descarboxilación de piruvato).
En particular, el compuesto de fórmula general Il presenta una afinidad por Ia flavodoxina de 3.0 (+ 1.0) μM.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula general (I), o cualquiera de sus sales, para su uso como composición farmacéutica,
Figure imgf000012_0001
(I) donde:
Ri y R2 son O, S ó N, y pueden ser iguales o diferentes; R3 es 0 ó S;
R4 es H ó un grupo alquilo (CrC6);
R5 es NO2, COOR' ó SO3R'; R' es un átomo de hidrógeno (H) ó un alquilo (Ci-C6); y n toma valores de entre O a 3.
2. Compuesto según Ia reivindicación 1 , donde R4 es un grupo alquilo (Cr C3).
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde R4 es metilo.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Ri es nitrógeno y R2 es oxígeno.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R5 es NO2, COOH ó SO3H.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicación 5, donde R5 es NO2
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde n es 1.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de fórmula (II):
Figure imgf000013_0001
(M)
9. Composición farmacéutica que comprende un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para Ia elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas.
10. Composición según Ia reivindicación 9, donde las enfermedades infecciosas son causadas por Helicobacter.
11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, donde las enfermedades infecciosas son causadas por Helicobacter pylorí.
12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , donde las enfermedades infecciosas son gastritis, úlcera gastroduodenal, linfoma o cáncer gástrico.
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