WO2008093886A1 - Ｍｃｆ７由来細胞 - Google Patents

Ｍｃｆ７由来細胞 Download PDF

Info

Publication number
WO2008093886A1
WO2008093886A1 PCT/JP2008/051979 JP2008051979W WO2008093886A1 WO 2008093886 A1 WO2008093886 A1 WO 2008093886A1 JP 2008051979 W JP2008051979 W JP 2008051979W WO 2008093886 A1 WO2008093886 A1 WO 2008093886A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
mcf
gene
derived
mcf7
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/051979
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mika Imada
Hiroko Kojima
Masahiro Uchino
Takahiko Utsugi
Yasufumi Murakami
Original Assignee
Bio Matrix Research, Inc.
Tokyo University Of Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Matrix Research, Inc., Tokyo University Of Science filed Critical Bio Matrix Research, Inc.
Priority to JP2008556219A priority Critical patent/JP5527573B2/ja
Publication of WO2008093886A1 publication Critical patent/WO2008093886A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types

Definitions

  • the present invention relates to a highly invasive or highly metastatic M C F7-derived cell obtained by subculturing M C F7 cells, which are a low-metastatic human breast cancer-derived established cell line, under predetermined conditions.
  • metastasis and recurrence cannot be accurately predicted, it is necessary to carry out unnecessary anticancer drug treatment for a long time.
  • Many patients suffer from side effects.
  • prognostic markers such as the size of the tumor and the presence or absence of axillary lymph node metastasis, but the judgment accuracy is low and only about 30% of patients can predict the risk of recurrence of metastasis.
  • HER 2 discovered by the identification of drug-induced genes has been shown to be effective as a prognostic marker for breast cancer.
  • the monoclonal antibody tr a s t uz uma b against this receptor has the effect of reducing the risk of recurrence and prolonging life by administration to HER2-positive early breast cancer patients.
  • plasminogen activator and its inhibitory factor whose expression level increases when cancer invades, are also effective as prognostic markers, and have come to be clinically applied particularly as factors that regulate sensitivity to chemotherapy. .
  • metastasis occurs because distant metastasis or recurrence occurs in breast cancer patients that do not express these markers, and distant metastasis or recurrence occurs in breast cancer patients that are less sensitive to trastuzumab or chemotherapy.
  • a model for acquiring high metastatic potential of breast cancer-related cells was required.
  • Non-Patent Document 1 Lau a J. va n 't V e e r, Ho g y u e D a i, Mar k J. V a n e V i j v e r e a 1. (2002) Nat r e, Vo l 41 5, 530— 5 36 Disclosure of the Invention
  • cancer metastasis the steps of cancer cell adhesion, invasion, and migration are repeated. Cancer cells with high metastatic potential are highly adherent, invasive and mobile. In particular, since the first step of cancer metastasis is invasion from the basement membrane to surrounding tissues, cell invasiveness is deeply involved in the mechanism of metastasis generation and the early stage of acquiring metastatic potential. it is conceivable that.
  • an object of the present invention is to produce a model for acquiring high metastatic potential or high invasion ability of breast cancer-related cells.
  • the present inventors have seeded a low-metastatic human breast cancer-derived established cell line MCF 7 cell on Matrigel (trademark; the same shall apply hereinafter), and obtained cells having the ability to pass Matrigel.
  • the inventors succeeded in obtaining a novel cell line having high invasion and metastatic potential and different in morphology from MCF 7 cells, thereby completing the present invention.
  • MCF 7-derived cells which are cells derived from MCF 7 cells and have significantly higher invasion ability than MCF 7 cells;
  • the expression level of at least one gene selected from the group consisting of CD 44 gene, CXCL 12 gene, P LAU gene, and VEG is 1.5 times or more that of MCF 7 cells.
  • the MCF7-derived cell according to any one of [1] to [4] above;
  • At least one gene selected from the group consisting of a GFP gene, a YFP gene, a CFP gene, a ⁇ -galactosidase gene, a luciferase gene, and a pequolin gene has been introduced.
  • the MCF7-derived cell according to any one of
  • a screening system for cancer metastasis or recurrence-related factors or anticancer agents including the experimental animal according to [12] above;
  • a method for establishing a mutant cell line that has acquired high invasive ability or high metastatic ability from MCF 7 cells comprising seeding MCF 7 cells on a basement membrane preparation or the like, and then A method comprising collecting a cell having the ability to pass through a membrane preparation or an analogue thereof and then seeding the cells again on a basement membrane preparation or an analogue thereof at least 7 times.
  • Fig. 1 shows an outline of a method for establishing a highly invasive cell line using a Matrigel invension chamber.
  • Figure 2 shows an image of cells that have passed through the Matrigel invasion chamber fixed and stained with crystal violet.
  • Figure 3 shows an image obtained by microscopically observing the cells that have passed through Matrigel and moved downwards at a magnification of 100 times.
  • Figure 4 shows the average number of cells that have passed through Matrigel and migrated downward.
  • FIG. 5 shows the phase contrast images of MCF 7 cells (A) and MCF 7-14 cells (B).
  • FIG. 6 shows the growth curves of MCF 7 cells and MCF 7-14 cells.
  • FIG. 7 shows the results of Wo n d he a 1 in g assembly for MCF 7 cells and MCF 7-14 cells.
  • FIG. 8 shows the results of detecting the MMP activity by the zymogram method when cultured in a cell culture dish containing no matrigel.
  • FIG. 9 shows the results of detection of MMP activity by the zymogram method when cultured in a Matrigel invasion chamber.
  • FIG. 10 shows the results of examining the expression levels of the HER 2 gene and the ESTR gene by Western plot analysis.
  • FIG. 11 shows an overview of the cell transplantation method.
  • Figure 12 shows the anatomical results of mice 4 weeks after transplantation of MCF 7—GFP cells (A, C) and MCF 7-14—GFP cells (B, D).
  • a and B are anatomical images
  • C and D are the results of fluorescence observation of the behavior of GFP-expressing cells.
  • Figure 13 shows the results of observation of lungs removed 4 weeks after transplantation of MCF 7-GFP cells (A, C, E) and MCF 7-14-GFP P cells (B, D, F). Show. A and B are anatomical images of the lungs, C and D are fluorescence observation images, and E and F are the results of preparing frozen sections from the extracted lungs and immunostaining them with anti-GFP antibodies.
  • Figure 14 shows the results of observation of the transplantation site (A, C) and proximal lymph nodes (B, D) of the mammary gland removed 4 weeks after the mice transplanted with MCF 7-GFP cells.
  • Fig. 15 shows the results of observation of the transplantation site (A, C) and proximal lymph nodes (B, D) of the mammary gland excised 4 weeks after the mice transplanted with MCF 7-14-GFP cells.
  • Fig. 16 shows the results of excision of the peripheral part of the pancreas 4 weeks after transplantation from MCF7_14-GFP cells transplanted mice.
  • Figure 17 shows the results of bright field and fluorescence observations of a tumor of the pancreas excised from a mouse transplanted with MCF 7-14-GFP cells 4 weeks after transplantation, and frozen tissue sections prepared.
  • Figure 18 shows a frozen section of the mass of the MCF 7-GF P cell transplanted part and MCF 7-14-GF P cell transplanted part of the pancreas from the mouse 4 weeks after transplantation. The result of having performed immunostaining of a marker is shown.
  • Figure 19 shows the mouse abdomen (A, B), excised pancreatic region (C, D), and brain (E, F) 1 to 2 weeks after transplantation of MCF 7-14 GFP cells into mice. The result of having observed is shown.
  • a and B the arrow indicates the transplant site, and the circled area indicates the periphery of the pancreas.
  • the reference numerals indicate 1 ... Matrigel invasion chamber, 1O ... cell force-receptor, 1 2 ... constitutene, 1 3 ... matrigenore, 14 ... cell, 2 ... dish, respectively.
  • the MCF 7-derived cell according to the present invention is a mutant strain of MCF 7 cell that has acquired high invasiveness.
  • MCF 7 cells derived from human breast cancer are inherently poorly invasive and therefore low metastatic, and even when transplanted into nude mice, primary lesions form but do not metastasize.
  • the MCF7-derived cells of the present invention are mutant strains that have acquired significantly higher invasiveness than the original MCF7 cells.
  • “having significantly higher invasive ability” means that the invasive ability measured by any one of various methods for measuring invasiveness of cells is more statistically than the invasive ability of MC F 7 cells. Means significantly higher.
  • the invasiveness of cells can be evaluated by, for example, the ability to pass through Matrigel that provides an environment similar to the basement membrane in vivo. MCF 7-derived cells are seeded on Matrigel, and the ratio of the number of cells that passed Matrigel to the number of seeded cells is 50 times or more, preferably 1 compared to the same test with MCF 7 cells. It can be said that invasiveness is high when it is 00 times or more, more preferably 500 times or more.
  • the MCF 7-derived cells of the present invention have a significantly higher metastatic potential than the original MCF 7 cells.
  • MC F 7 cells have low metastasis, and even when transplanted to nude mice, primary foci are formed but metastasis is not caused.
  • the MCF 7-derived cells of the present invention Has a mutation that acquires high metastatic potential.
  • “having a significantly high metastatic ability” means that the metastatic ability obtained by any one of various methods for evaluating the metastatic ability of cells is statistically more significant than the metastatic ability of MCF 7 cells. Means high.
  • metastasis to adjacent lymph nodes is observed in at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more. It can be said that the performance is high.
  • the MCF7-derived cells of the present invention are characterized by being HER2-negative.
  • HER 2 negative means that the HER 2 protein is below the detection limit of the standard Western plotting method.
  • the HER 2 gene and protein are often expressed in breast cancer-derived malignant tumors with high metastatic potential, and are often used as diagnostic markers for diagnosis and treatment.
  • the MCF7-derived cells of the present invention have high invasion ability and high metastasis ability, they are HER 2 negative related to metastasis ability. This suggests that it is likely to be used for this research.
  • the MCF7-derived cells of the present invention are E STR positive despite having high invasive ability or high metastatic ability.
  • ESTR is an estrogen receptor
  • ESTR positive means that a clear band can be detected by standard Western blotting.
  • the MCF7-derived cell of the present invention is metastasized as a breast cancer model with low sensitivity to hormonal treatment. This suggests that it is likely to be used in studies of relapse and recurrence.
  • the expression level of at least one gene selected from the group consisting of CD44 gene, CXCL12 gene, PLAU gene, and VEGF gene is 1 ⁇ !
  • ⁇ 7 in the MCF7-derived cell of the present invention 1.5 times more than cells. gene Although there are various methods for measuring the expression level of MCF7, it may be 1.5 times or more that of MCF7 cells when measured by any method.
  • the CD44 gene is preferably 2 times or more
  • the CXCL12 gene is preferably 5 times or more
  • the PLAAU gene is preferably 10 times or more
  • the VEGF gene is preferably 1.8 times or more. All of these genes are known to be expressed in large amounts in cells having metastatic potential.
  • the MCF 7-derived cell of the present invention forms a spheroid.
  • MCF 7 cells When MCF 7 cells are cultured, they usually become confluent in 4-5 days, and when they are detached from the container and die, the MCF 7-derived cells of the present invention formed spheroids and could be cultured for more than 10 days. This suggests that long-term culture and high-density culture are possible. Such a property is useful when a specific substance such as protein or nucleic acid is extracted from the MCF7-derived cells of the present invention for research.
  • the MCF 7-derived cells of the present invention have the ability to form a primary tumor nest at the transplanted site when transplanted into an experimental animal.
  • cancer cells such as MCF 7 cells are known to often detach in several days after transplantation due to increased expression of cancer-specific antigens. Is stably established in transplanted individuals.
  • stable establishment means, for example, a case where at least 50%, preferably 6.0%, more preferably 70%, more preferably 80% of the transplanted individuals do not peel for 28 days or more.
  • the MCF7-derived cells of the present invention have the ability to form metastatic foci in the proximal lymph nodes, distant lymph nodes, or brain when transplanted into experimental animals.
  • Such MCF 7-derived cells can be used, for example, by seeding MCF 7 cells on a basement membrane preparation having the same properties as the basement membrane or the like and passing through the basement membrane preparation or the like. It can be obtained by recovering cells in which a spontaneous mutation has occurred spontaneously.
  • the ability to pass through a basement membrane preparation or the like Cells having higher invasive ability or metastatic ability by repeating the process of seeding cells having the same again on the basement membrane preparation or the like and recovering cells having the ability to pass the basement membrane preparation or the like MC F 7-derived cell lines can be generated.
  • An example of a basement membrane preparation or the like can include, for example, Matrigel, which is a solubilized extract from EHS mouse tumor cells rich in extracellular matrix protein (EC M).
  • the step of seeding MCF 7 cells on Matrigel, then collecting the cells that pass Matrigel and seeding them again on Matrigel is at least 7 times, preferably 8 times, more preferably By repeating 9 times, most preferably 10 times, it is possible to obtain MCF 7-derived cells that have acquired a sufficiently high invasive ability or metastatic ability.
  • Examples of analogs of basement membrane preparations include agarose or collagen gel.
  • MCF 7-derived cell line is limited in its ability to migrate during culturing due to fiber components in the medium, and is considered to have low invasive and metastatic potential. It is also possible to obtain F7-derived cells.
  • MCF7-derived cells of the present invention examples include the MCF 7-14 cell line deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • F ERM B P-1 0 9 4 4 These cells are likely to provide useful information for cancer metastasis research, prognostic markers, drug discovery target searches, and the like.
  • analysis at the gene level such as DNA microarrays by subtraction
  • detailed analysis at the protein level such as two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry can be used to acquire high metastatic potential and high invasion ability. Factors that are considered specific are likely to be identified.
  • by capturing factors that mutate in the early stages of metastasis it becomes possible to predict the prognosis of whether the cancer is metastatic at the same time as the discovery of the initial cancer, which is a useful diagnostic criterion for formulating treatment strategies such as the administration method of anticancer drugs.
  • Probability is high. In addition to its potential as a new prognostic marker, the identified factors themselves may become target molecules for cancer treatment. If a factor that is expressed specifically in metastatic cells can be discovered, it will also contribute to drug discovery, such as the development of a drug delivery system that targets disseminated cancer cells floating in the blood before the formation of metastases and induces cell death Big. In addition, a lot of information obtained by comprehensive analysis of metastasis from various angles such as gene level and protein level provides many clues to elucidate the mechanism of metastasis. A deeper understanding of the molecular mechanism of metastasis formation will lead to the development of new cancer treatment strategies.
  • the present invention also provides an MCF7-derived cell into which at least one gene selected from the group consisting of a GFP gene, a YFP gene, a CFP gene, a ⁇ -galactosidase gene, a luciferase gene, and a equorin gene has been introduced.
  • Such cells can be prepared by a known gene transfer method or a method similar thereto, and the phenotype of each gene can be used for various studies and is useful.
  • the present invention also provides an experimental animal in which the aforementioned MCF 7-derived cells are transplanted. Such a laboratory animal can be produced by a known method or a method similar thereto.
  • the experimental animal is useful for studies of metastasis and recurrence as a breast cancer model. is there.
  • experimental animals that can be used include mice, rats, hamsters, gerbils, moss / lemots, usagis, dogs, cats, peta, monkeys, birds, fishes, amphibians, and the like.
  • the present invention also provides a screening system for cancer metastasis or recurrence-related factors or anticancer agents, comprising the above-described MCF7-derived cells.
  • a screening system containing cells can be produced by a known method or a method according to it.
  • This screening system includes MCF 7-derived cells that are less sensitive to conventional breast cancer treatment methods, so it is possible to screen for invasion inhibitors, discover new breast cancer metastasis or recurrence-related factors, and new breast cancer It is useful to contribute to the discovery of therapeutic / preventive drugs.
  • the present invention also provides a screening system for cancer metastasis or recurrence-related factors or anticancer agents, including experimental animals transplanted with the above-mentioned M C F7 -derived cells.
  • a screening system containing experimental animals can be prepared by a known method or a method equivalent thereto. This screening system is useful for screening metastasis inhibitors.
  • the present invention also provides a screening method for establishing a mutant cell line that has acquired high invasiveness or high metastatic ability from MCF 7 cells.
  • this method after seeding MCF 7 cells on a basement membrane preparation or an analogue thereof, the cells having the ability to pass through the basement membrane preparation or an analogue thereof are recovered, and then again the basement membrane preparation or an analogue thereof. It is characterized by repeating the seeding process on the material at least 7 times.
  • Invasion of cells derived from MCF 7 'As a method of improving metastasis, there are methods using artificial mutagens such as inducing point mutations, but there are mutation patterns that can be introduced. Therefore, the invasiveness cannot be made sufficiently high.
  • MC F 7 Itadatsuki 3 (Br ea sta d eno rc a c i n oma; Hu m a n) was cultured in a 10% FB S (Eq i tech h BIO company) -containing R PM I 1640 (S I GMA company) medium. Cells were generated every 3 days according to known methods.
  • MC F 7 cells 14 were treated with Matrigel invasion channel 1 (Becton Dickinson) The seeds were sown on the Norreyansat 10 according to a known method. Matrigel 13 is coated on the membrane 12 and the cell 14 having the ability to pass through the matrix migrates to the lower side of the membrane 12 at the bottom of the cell culture kinase 10. After 60 hours, cells (infiltrating cells) that migrated to the lower side of the membrane 12 were collected by trypsin-EDTA treatment. The recovered cells 14 were cultured in dish 2 until they became subconfluent, and were seeded again in the matrigel inversion chamber 1-1. The above operation was repeated 14 times. Also membrane 1 2 The cells that migrated to the lower side were stained with crystal violet and the whole image was observed. At the same time, 5 fields were selected under the microscope to count the number of migrated cells.
  • Figs. Fig. 2 shows a crystal violet stained image
  • Fig. 3 shows a microscopic image observed at a magnification of 100x
  • Fig. 4 shows the number of migrated cells.
  • c o n t r o 1 indicates MCF 7 cells, and the numbers indicate the number of passes through Matrigel.
  • MCF 7-14 cells a highly invasive cell group
  • Figure 5 shows the phase contrast images of MCF 7 and MCF 7-14 cells. Comparing MCF 7 cells ( Figure 5A) and MCF 7-14 cells ( Figure 5 B), MCF 7-14 cells were more rounded. In addition, MCF 7 cells detached when confluent, but MCF 7-14 cells formed spheroids and continued to proliferate.
  • MC F 7 cells and MC F 7-14 cells were seeded on 96-well plates with 5x10 3 cells Z-wells, and the number of cells after 1, 2, 3 and 4 days was counted by MTT method. The result is shown in FIG.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the number of culture days. There was no significant difference in cell growth rate between MCF 7 cells and MCF 7-14 cells.
  • FIG. 7A Comparing MCF 7 cells (Fig. 7A) and MCF 7-14 cells (Fig. 7 B) at 0, 1, 2, 3, and 4 days after grooving, MCF 7-14 cells were grooved faster. Is buried.
  • Figure 7C shows the average (%) of the three fields of distance traveled by the cells.
  • FIG. 7D and FIG. 7E are magnified images of MCF 7 cells and MCF 7-14 cells after 3 days, respectively. In MCF 7-14 cells (Fig. 7E), the actin stress fibers were actively extended.
  • MMP matrix metaprotease
  • MC F 7 cells and MC F 7-14 cells were seeded at a concentration of 2.5 ⁇ 10 5 cells Z-well in a normal medium without Matrigel and a medium with Matrigel. The next day, the medium was replaced with a 500 ⁇ 1 serum-free medium, and the medium was collected after 1, 2, and 3 hours. The collected medium was centrifuged and concentrated using Microcon (registered trademark) YM30 (Millipore). Concentrated medium and sample buffer were mixed and electrophoresed at 25 mA for 2 hours at 4 ⁇ using a 10% polyacrylamide gel. 2.
  • Microcon registered trademark
  • the gel was placed in a vat filled with 5% triton X—100 containing buffer, and the SDS was removed twice while slowly permeating at room temperature for 30 minutes. Furthermore, the cells were incubated with gelatinase activating solution in 37 mouths for 24 hours. Thereafter, the cells were stained with CBB staining solution for 30 minutes, and further decolorized with a decolorizing solution for 30 minutes.
  • Fig. 8 shows the results when cultured in a cell culture dish containing no Matrigel
  • Fig. 9 shows the results when cultured in a Matrigel incubation chamber.
  • Each figure A is a stained image of the gel used in the zymogram method
  • each figure B and C are analyzed by image analysis software to show the activity of MMP 9 and MMP 2, respectively. It is the result of measurement.
  • MCF 7-14 cells expressed active MMP even when the medium was cultured without containing Matrigel or when the medium was cultured while infiltrating with Matrigel. The amount was' high.
  • RNA was extracted from MC F 7 cells and MC F 7-14 cells according to a known method, and Gene C hip (registered trademark) Human Genome U 1 3 3 P lus 2.0 Ar ray ( A ff yme tr
  • Tables 1-4 The results are shown in Tables 1-4. Among the 1495 genes that fluctuated more than twice, 13 genes (Table 1) were involved in can c cer, and 13 genes (Table 2) were involved in metastasis. Among 136 genes that fluctuated 0.5 times or less, 7 genes (Table 3) were involved in can ccer, and 0 genes were involved in metastasis. Further suggested to be involved in breast cancer
  • epidermal growth factor receptor erythroblastic leukemia viral
  • fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinoc te growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1,
  • Crouzon syndrome Pfeiffer syndrome, Jackson-Weiss syndrome
  • fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1,
  • CXCL12 chemokine C-X-C moti ⁇ ligand 12 (stromal cell-derived fector 1) integrin, beta 1 (fibronectin receptor, beta polypeptide, antigen
  • CD29 includes MDF2 ( MSK12)
  • tissue inhibitor of metalloproteinaae 1 erythroid potentiating
  • MCF 7 cells and established MCF 7-14 cells were transfected with a GFP expression plasmid vector according to a known method, and the GFP expression cells were screened for about 1 week. Cloning 30 clones using the cloning ring, and selection medium (4 00 g / m 1 G4 1 8 (manufactured by SI GMA) supplemented medium) and maintenance medium (50 / i gZml) for about 3 weeks. A GGFP-expressing stable strain was established by repeated cultivation in a G4 18 supplemented medium. Hereinafter, they are referred to as MCF 7-GF P cells and MC F 7-14 GFP cells, respectively.
  • MCF 7 cells MCF 7-14 cells, MCF 7—GFP cells, MCF 7
  • the protein was extracted from 14 GFP cells, and SDS polyacrylamide gel electrophoresis was performed according to a known method using a polyacrylamide gel having a concentration gradient of 2 to 15%.
  • the separated protein was transferred to PVDF membrane, blocked with 5% skim milk, and reacted with anti-HER 2 antibody or anti-estrogen receptor antibody. Further, it was reacted with an HRP-crosslinked secondary antibody and detected by ECL.
  • MC F 7— GFP cells (control) and established MC F 7— 1 4— GFP cells are grown to a final concentration of 8.6 ⁇ 10 7 cells Zml.
  • the transplanted cell solution was prepared by mixing 1: 1 with Tarreduce Tomato Trigenole (Becton Dickinson). As shown in FIG. 11, this transplanted cell solution 100 ⁇ 1 was transplanted into the fourth mammary gland of a female BALBZcAL c 1 -nu / nu strain mouse. After transplantation, the behavior of GFP-expressing cells was analyzed during dissection. The results of observation of mice 4 weeks after transplantation are shown in FIG.
  • Figure 1 2A and C are MCF7-GFP cells
  • B and D are mice transplanted with MCF7-14 GFP cells
  • a and B are the whole images
  • C and D are A and B, respectively.
  • This is a fluorescent observation image.
  • MC F7-GFP cells no metastasis was observed although tumors formed at the transplant site.
  • MCF7_14-GFP cells are localized to the GFP-expressing cells that have been disseminated in the peritoneum, and relatively large GFP-expressing cells in the abdomen. Cell clumps were observed. 10. Confirmation of metastasis by staining
  • the mammary gland was removed and frozen sections were prepared according to a known method. This section was subjected to HE staining and immunostaining with anti-GFP polyclonal antibody and anti-BRC A2 monoclonal antibody according to a known method.
  • Figure 13 shows the results of observing the whole lung region and tissue sections immunostained with anti-G F P antibody in mice transplanted with MC F 7 -GF P cells and MC F 7-14 G F P cells.
  • A, C and E are related to MC F 7—GFP cells
  • B, D and F are related to MC F 7—14—GFP cells.
  • Anatomical images C and D are fluorescence observation images
  • E and F are the results of immunostaining the frozen sections with anti-GFP antibody. As shown in the figure, tumors and GFP expressing cells were not observed in the mouse lung region.
  • FIG. 14 shows the results of observation of the transplantation site (A, C) and proximal lymph node (B, D) of the mammary gland extracted from a mouse 4 weeks after MCF 7-GFP cell transplantation.
  • a and B show the results of HE staining
  • C and D show the results of immunostaining with anti-GFP antibody.
  • M large number of GFP-expressing cells were observed at the transplantation site in mice transplanted with CF7-GFP cells, but no metastasis was observed in the mammary lymph nodes.
  • Fig. 15 shows the results of observation of transplanted sites (A, C) and proximal lymph nodes (B, D) of 3 ⁇ 4 gland excised from mice 4 weeks after MCF 7-14 transplantation of GFP cells .
  • a and B show HE staining
  • C and D show immunostaining results with anti-GFP antibody.
  • MCF 7-14 One GFP cell-transplanted mice showed GFP-expressing cells at both the transplant site and mammary lymph node, and it was observed that proximal lymph node metastasis, which is also a prognostic marker of metastasis, occurred. It was.
  • Figure 16 shows the results of excision and observation of the area around the pancreas for more detailed investigation of the metastatic foci of the MCF 7-14 GFP cell transplanted mice shown in Figure 12.
  • A is the whole mouse image
  • B is the anatomical image around the excised pancreas
  • C and D are the results of fluorescence observation of the sites corresponding to A and B, respectively. It was observed that the lymph nodes of the pancreas were enlarged and many GFP-expressing cells were localized.
  • Fig. 17A, B pancreatic tumor
  • Fig. 17D prepared frozen tissue sections (thickness, and HE-stained
  • Fig. 17 E fluorescence observation of GFP
  • transplanted part (AC) from MCF 7—GF P cell transplanted mice 4 weeks after transplantation transplanted from MCF 7-14 GF P cell transplanted mice 4 weeks after transplantation (D—F) and pancreatic mass (G—I) were removed, frozen sections were prepared, and cytokeratin 7 (RT 7; A, D, G), KRT 19 (B, E, H) and KRT 20 (C, F, I) were immunostained.
  • mouse anti-KRT 7 monoclonal antibody ZYMED Laboratories, 18 — 0234; dilution factor 50 ⁇ , mouse anti-KRT 19 monoclonal antibody (SANTA CRUZ, sc-6 278; 50 ⁇ ) and mouse anti-KRT 20 monoclonal antibody (SANTA CR UZ, sc—523 20; 50 times)
  • Histfine Mouse Stain Kit Naichirei
  • DAKO 3'-daminobenzidine tetrahydrochloride
  • MCF 7-GFP GFP-transfected strain of MCF 7 cells
  • FIG. 19 shows the result of observing mice 2 weeks after MCF 7-14 GFP cell transplantation 1.
  • the peripheral part of the pancreas (C, D) was removed from the abdomen (A, B) of the mouse, and the brain (E, F) was further removed.
  • A, C, and E are anatomical images
  • B ', D, and F are fluorescence observation images. From these results, metastatic tumors with a diameter of 1 cm or more were observed in the lymph nodes near the pancreas, and the localization of GFP-expressing cells was confirmed in the brain.
  • the MCF 7-derived cells according to the present invention have a high invasion ability or a high metastasis ability despite being derived from MCF 7 cells. Since such mutations are induced in a natural environment without using drugs or the like, the mechanism of metastasis generation and the MCF 7-derived cells according to the present invention are the first to acquire metastatic potential. It is suitable for research to detect prognostic markers such as metastasis and recurrence by capturing changes at the stage of life. It is a diagnostic kit for invasion / metastasis-specific factors and cancer metastasis and prognosis prediction. It can also be used for development.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本発明は、乳癌関連細胞の高転移能・高浸潤能獲得モデルを作製することを目的とする。本発明は、ＭＣＦ７細胞に由来する細胞であって、ＭＣＦ７細胞に比較して有意に高い浸潤能または転移能を有するＭＣＦ７由来細胞を提供する。本発明のＭＣＦ７由来細胞は、マトリゲル等の基底膜調製物又はその類似物通過能を獲得したＭＣＦ７細胞を回収することによって得ることができる。

Description

明細書
M C F 7由来細胞
技術分野
本発明は、 低転移性のヒ ト乳癌由来樹立細胞株である M C F 7細胞を所定 の条件で継代培養することによって得られる、 高浸潤性または高転移性 M C F 7由来細胞に関する。 背景技術
近年、 医療機器の進歩により極めて早期の癌診断が可能になり、 癌の治癒 率、 特に術後 5年生存率は徐々に上昇し、 癌の死亡率は 1 9 7 5年以降緩や かに減少してきている。 しかし乳癌をはじめとする転移性の高い上皮性癌は その範疇ではない。 現在国内の乳癌罹患者数は 4万人を超えており、 その数 は未だに増加傾向にある。 しかも初発乳癌の切除手術後の 5年生存率が 9 0 %以上であるにも関わらず、 乳癌罹患者の約 4 0 %は死に至るという統計 がある。 + ' . ' ' · ·—— · .
このような乳癌を含めた上皮性癌患者の主な死因は癌の遠隔転移や再発に よるが、 転移や再発を正確に予測できないために、 本来ならば不要な抗癌剤 治療を長期にわたつて行われ、 副作用で苦しんでいる患者も多く存在する。 例えば乳癌の場合、 腫瘍の大きさや腋窩リンパ節転移の有無等の予後マーカ 一はあるが、 判定精度が低く患者の約 3 0 %しか転移再発リスクを予測でき ない。 また癌の早期発見が可能になったため原発巣は小さく、 その時点で転 移巣が存在しても極微小であるか、 小さな播種性癌細胞として血中を漂って いる可能性が高く、 視覚的に転移を捕らえることが非常に困難であり、 上記 のような予後マーカーは有効ではなくなつてきている。 したがって癌細胞が 転移能を獲得する極めて初期に生じる変化を捕らえることが重要である。 バイオマーカーの探索は数 1 0億ドル市場として世界中の注目を浴びてお り、 多くの研究者と資金を投じて研究が行われているが、 疾患特異的マーカ 一の発見に至るには困難を極めている。 もちろん癌転移マー力一や予後予測 マーカーもその例外ではない。 最近 DNAマイクロアレイの解析により原発 巣と転移巣では遺伝子の発現プロファイルが異なるだけでなく、 予後不良な 癌は早い時期に遺伝子変異が入って転移形成能を獲得することが報告された。 また、 創傷と腫瘍の生理現象 (マ トリ ックスリモデリング、 細胞運動、 血管 形成の活性化) の類似を根拠に、 乳癌患者の創傷応答遺伝子の発現パターン を調べたところ、 これらの遺伝子が予後不良を予測できるマーカーとしての 可能性が示された。 このような DNAマイクロアレイによる解析結果から、 約 70個の遺伝子の発現プロファイルが癌転移とリンクすることが判明して きた （例えば、非特許文献 1を参照）。 しかし疾患の不均一さや個人差による 遺伝子発現への影響や解析方法の複雑さから判定精度が安定しておらず、 臨 床応用はされていない。
薬物誘導性遺伝子の同定により発見された HER 2は乳癌の予後マーカー として有効であることが示されてきている。 特にこのレセプターに対するモ ノクローナル抗体 t r a s t u z uma bは、 HER 2陽性早期乳癌患者へ の投与により再発リスクの軽減及ぴ延命効果があることが報告された。 また 癌浸潤時に発現量が増大するプラスミノーゲンァクチベーターとその阻害因 子なども予後マーカーとして有効であり、 特に化学療法への感受性を規定す る因子として臨床応用されるようになってきた。
しかしながら、 これらのマーカーを発現していない乳癌患者においても遠 隔転移や再発が生ずることや、 t r a s t u z uma bや化学療法に対する 感受性が低い乳癌患者においても遠隔転移や再発が生ずることから、 転移の 発生メカニズムを調べ、 転移能を獲得する初期ステージでの変化を捉え、 癌 転移、 再発等の予後予測マーカーを探索するために、 乳癌関連細胞の高転移 能獲得モデルが必要とされていた。
[非特許文献 1] L a u r a J . v a n' t V e e r , Ho n g y u e D a i , Ma r k J . v a n d e V i j v e r e t a 1. (2002) Na t u r e, Vo l 41 5, 530— 5 36 発明の開示
癌の転移においては、 癌細胞の接着、 浸潤、 移動のステップが繰り返され る。 転移能の高い癌細胞は接着性、 浸潤性、 移動性が高い。 特に、 癌転移の 最初のステップは、 基底膜から周辺組織への浸潤であるため、 転移の発生の メカニズムや、 転移能を獲得する初期のステージには細胞の浸潤性が深く関 与していると考えられる。
そこで、 本発明は、 乳癌関連細胞の高転移能獲得または高浸潤能獲得モデ ルを作製することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題に鑑みて研究を重ねた結果、 低転移性のヒト乳癌 由来樹立細胞株 MCF 7細胞をマトリゲル （商標。 以下同様） 上に播種し、 マトリゲル通過能を有する細胞を回収しては再びマトリゲル上に播種するェ 程を繰り返すことにより、 浸潤性、 転移能が高く、 MCF 7細胞とは形態も 異なる新規な細胞株を得ることに成功し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、
〔1〕 MCF 7細胞に由来する細胞であって、 MCF 7細胞に比較して有意 に高い浸潤能を有する MCF 7由来細胞.；
〔2〕 MCF 7細胞に由来する細胞であって、 MC F 7細胞に比較して有意 に高い転移能を有する MC F 7由来細胞；
〔3〕 HER 2陰性である、 上記 〔1〕 又は 〔2〕 に記載の MC F 7由来細 胞； 〔4〕 E STR陽性である、 上記 〔1〕 から 〔3〕 のいずれか 1項に記載の MC F 7由来細胞；
〔5〕 CD 44遺伝子、 CXCL 1 2遺伝子、 P LAU遺伝子、 及び VEG なる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量が、 MCF 7細胞の 1. 5倍以上
である、 上記 〔1〕 から 〔4〕 のいずれか 1項に記載の MC F 7由来細胞；
〔6〕 スフエロイ ドを形成することを特徴とする、 上記 〔1〕 から 〔5〕 の いずれか 1項
に記載の MC F 7由来細胞；
〔7〕 実験用動物に移植した場合、 移植部位に原発腫瘍巣を形成する能力を 有する、 上記 〔1] から 〔6〕 のいずれか 1項に記載の MC F 7由来細胞；
〔8〕 実験用動物に移植した場合、 近位リンパ節、 遠隔リンパ節、 又は脳に 転移巣を形成する能力を有する、 上記 〔1〕 から 〔7〕 のいずれか 1項に記 載の MCF 7由来細胞；
〔9〕 MCF 7細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種し、 該基底膜調 製物又はその類似物を通過するように変異した細胞を回収することによって 得られる、 上記〔1〕 から 〔8〕 のいずれか 1項に記載の MC F 7由来細胞；
〔1 0〕 MCF 7- 14細胞 （受領番号 FERM B P— 1 0944) であ る、 MC F 7由来細胞；
〔1 1〕 GF P遺伝子、 YFP遺伝子、 CFP遺伝子、 βガラク トシダーゼ 遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子、 及ぴェクオリン遺伝子からなる群より選択 される少なくとも一つの遺伝子が導入されている、 上記 〔1〕 から 〔1 0〕 のいずれか 1項に記載の MC F 7由来細胞；
〔1 2〕 上記 〔1〕 から 〔1 1〕 のいずれか 1項に記載の MCF 7由来細胞 が移植された実験用動物； 〔1 3〕 上記 〔1〕 から 〔1 1〕 のいずれか 1項に記載の MCF 7由来細胞 を含む、 癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーユング系；
〔14〕 上記 〔1 2〕 に記載の実験用動物を含む、 癌転移若しくは再発関連 因子又は抗癌剤のスクリーユング系；及び
[1 5] MCF 7細胞から、 高浸潤能または高転移能を獲得した変異細胞株 を樹立する方法であって、 MCF 7細胞を基底膜調製物又はその類似物上に 播種した後、 該基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を回収して は再び基底膜調製物又はその類似物上に播種する工程を少なくとも 7回繰り 返すことを特徴とする方法、 に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 マトリゲルインベンジョンチャンパ一を用いた高浸潤性細胞株榭 立方法の概要を示す。
図 2は、 マトリゲルインベージョンチャンパ一を通過した細胞を固定しク リスタルバイオレッ ト染色した像を示す。
図 3は、 マトリゲルを通過し下側に移動した細胞を 100倍の倍率で顕微 鏡観察した像を示す。
図 4は、 マトリゲルを通過し下側に移動した細胞数の平均を示す。
図 5は、 MCF 7細胞 （A) と MCF 7— 14細胞 （B) の位相差像を示 す。
図 6は、 MCF 7細胞及ぴ MCF 7- 14細胞の増殖曲線を示す。
図 7は、 MCF 7細胞及ぴ MCF 7— 14細胞の Wo u n d h e a 1 i n g アツセィの結果を示す。
図 8は、 マトリゲルを含まない細胞培養用ディッシュで培養したときの M MP活性をザィモグラム法で検出した結果を示す。 図 9は、 マトリゲルインベージョンチャンパ一で培養したときの MMP活 性をザィモグラム法で検出した結果を示す。
図 1 0は、 HER 2遺伝子及び E S TR遺伝子の発現量をウェスタンプロ ット解析により調べた結果を示す。
図 1 1は、 細胞の移植方法の概要を示す。
図 1 2は、 MC F 7— GF P細胞 （A、 C) と MCF 7— 14— GFP細 胞 （B、 D) を移植して 4週間後のマウスの解剖結果を示す。 Aと Bは解剖 像、 Cと Dは GF P発現細胞の挙動を蛍光観察した結果である。
図 1 3は、 MCF 7— GFP細胞 （A、 C、 E) と MCF 7- 14-GF P細胞 （B、 D、 F) を移植したマウスから 4週間後に摘出した肺を観察し た結果を示す。 Aと Bは肺の解剖像、 Cと Dは蛍光観察像、 Eと Fは摘出し た肺から凍結切片を作製し抗 GF P抗体により免疫染色した結果を示す。 図 14は、 MCF 7—GF P細胞を移植したマウスから 4週間後に摘出し た乳腺の移植部位 （A、 C) と近位リンパ節 （B、 D) を観察した結果を示 す。
図 1 5は、 MCF 7— 14—GF P細胞を移植したマウスから 4週間後に 摘出した乳腺の移植部位 （A、 C) と近位リンパ節 （B、 D) を観察した結 果を示す。
図 1 6は、 MC F 7 _ 14— GF P細胞移植マウスから移植 4週間後にす い臓周辺部位を摘出して観察した結果を示す。
図 1 7は、 移植 4週間後の MC F 7— 14—GF P細胞移植マウスからす い臓部分の腫瘤を摘出、 凍結組織切片を作成し、 明視野および蛍光観察した 結果を示す。
図 1 8は、 移植 4週間後のマウスから、 MCF 7— GF P細胞移植部、 M CF 7- 14-GF P細胞の移植部おょぴすい臓部分の腫瘤の凍結切片を作 成し、 上皮マーカーの免疫染色を行った結果を示す。 図 1 9は、 MCF 7- 14一 GF P細胞をマウスに移植してから 1 2週間 後のマウス腹部 （A、 B)、摘出したすい臓周辺部位 （C、 D) と脳 （E、 F) を観察した結果を示す。 Aと Bにおいて、 矢印は移植部位、 丸で囲んだ部分 はすい臓の周辺を示す。
符号は、 それぞれ 1…マトリゲルインベージョンチャンバ一、 1 0…セル 力ノレチヤーィンサート、 1 2…メンプレン、 1 3…マトリゲノレ、 14…細胞、 2…ディッシュを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について、 その好ましい態様を具体的に説明する。
本発明に係る MCF 7由来細胞は、 高い浸潤性を獲得した MCF 7細胞の 変異株である。 ヒ ト乳癌に由来する MCF 7細胞は本来浸潤性が低く、 従つ て低転移性であり、 ヌードマウス等に移植しても原発巣は形成するが転移し ない。 これに対し、 本発明の MC F 7由来細胞は、 もとの MCF 7細胞に比 較して、 有意に高い浸潤性を獲得した変異株である。
本発明において、 「有意に高い浸潤能を有する」 とは、細胞の浸潤性を測定 する種々の方法のうちいずれかの方法で測定された浸潤能が、 MC F 7細胞 の浸潤能より統計的に有意に高いことを意味する。 また、 細胞の浸潤性は、 例えば、 生体内の基底膜と類似した環境を提供するマトリゲル通過能で評価 することができる。 マトリゲル上に、 MCF 7由来細胞を播種し、 播種した 細胞数に対するマトリゲルを通過した細胞数の割合が、 MC F 7細胞で同様 の試験を行った場合に比較して 50倍以上、 好ましくは 1 00倍以上、 さら に好ましくは 500倍以上高いことを、 浸潤性が高いということができる。 本発明の MCF 7由来細胞は、 もとの MCF 7細胞に比較して有意に高い 転移能を有する。 MC F 7細胞は低転移性であり、 ヌードマウス等に移植し ても原発巣は形成するが転移はしない。 しかし、 本発明の MCF 7由来細胞 は、 高い転移能を獲得する変異を有している。 本発明において 「有意に高い 転移能を有する」 とは、 細胞の転移能を評価する種々の方法のうちいずれか の方法によって求めた転移能が、 MCF 7細胞の転移能よりも統計的に有意 に高いことを意味する。また、例えば、細胞を実験用動物に移植した場合に、 少なくとも 50 %以上、 好ましくは 60 %以上、 さらに好ましくは 70 %以 上の個体において近接するリンパ節への転移が見られることを、 転移能が高 いということができる。
また、 本発明の MC F 7由来細胞は、 HER 2陰性であることを特徴とす る。 ここで、 「HER 2陰性」 とは HER 2タンパク質が標準的なウェスタン プロッティング法での検出限界以下であることを言う。 HER 2遺伝子及び タンパク質は高い転移能力を持つ乳癌由来の悪性腫瘍では高い発現が認めら れることが多く、 診断及び治療法の決定にしばしば用いられている腫瘍マー カーである。 本発明の MC F 7由来細胞は高浸潤能 ·高転移能を有するにも 関わらず、 転移能に関連する HER 2陰性であることから、 t r a s t u z ma に対する感受性の低い乳癌患モデルとして、 転移や再発の研究に利用 できる可能性が高いことが示唆される。
また、 本発明の MC F 7由来細胞は、 高浸潤能または高転移能を有するに も関わらず、 E STR陽性である。 ここで、 E S TRはエストロゲン受容体 のことであり、 「ESTR陽性」とは標準的なウェスタンブロッテイング法で 明確なバンドが検出可能であることを言う。 このように、 E STR陽性であ ることから、 ホルモン治療に対しても高い抵抗性を示すものと考えられ、 本 発明の MC F 7由来細胞が、 ホルモン治療に対する感受性の低い乳癌モデル として、 転移や再発の研究に利用できる可能性が高いことが示唆される。 また、 本発明の MC F 7由来細胞は、 CD 44遺伝子、 CXCL 1 2遺伝 子、 PLAU遺伝子、 及び VEGF遺伝子からなる群より選択される少なく とも一つの遺伝子の発現量が、 1^!〇 7細胞の1. 5倍以上である。 遺伝子 の発現量を測定する方法には種々のものがあるが、 いずれかの方法で測定し た場合に、 MC F 7細胞の 1. 5倍以上であればよい。 CD44遺伝子につ いては好ましくは 2倍以上、 CXCL 1 2遺伝子については好ましくは 5倍 以上、 P LAU遺伝子については好ましくは 1 0倍以上、 VEGF遺伝子に ついては好ましくは 1. 8倍以上である。 これらの遺伝子は、 いずれも転移 能を有する細胞で発現量が多いことが知られている。
また、 本発明の MC F 7由来細胞は、 MCF 7細胞と異なり、 スフヱロイ ドを形成する。 MC F 7細胞を培養すると、 通常 4〜 5日でコンフルェント になり、 容器から剥がれて死亡するところ、 本発明の MCF 7由来細胞は、 スフヱロイ ドを形成し、 1 0日以上培養可能であったことから、 長期培養 . 高密度培養が可能であるものと推測される。 このような性質は、 本発明の M CF 7由来細胞から、 タンパク質や核酸等、 特定の物質を抽出して研究する 場合に有用である。
また、 本発明の MCF 7由来細胞は、 実験用動物に移植した場合、 移植部 位に原発腫瘍巣を形成する能力を有する。 一般に、 MCF 7細胞等の癌細胞 は、 癌特異的抗原の発現の上昇等により、 移植しても数日で剥離することが 多いことが知られているところ、 本発明の MC F 7由来細胞は、 移植された 個体で安定に定着する。 ここで、 安定に定着するとは、 例えば、 移植した個 体のうち少なくとも 50 %、 好ましくは 6.0 %、 さらに好ましくは 70 %、 さらに好ましくは 80%の個体において、 28日以上剥離しない場合をいう。 また、 本発明の MCF 7由来細胞は、 実験用動物に移植した場合、 近位リ ンパ節、 遠隔リンパ節、 又は脳に転移巣を形成する能力を有する。
このような MC F 7由来細胞は、 例えば、 MCF 7細胞を基底膜と同等の 性質を有する基底膜調製物又はその類似物上に播種し、 該基底膜調製物又は その類似物を通過できるような変異が自然発生的に生じた細胞を回収するこ とによって得ることができる。 さらに、 基底膜調製物又はその類似物通過能 を有する細胞を、 再び基底膜調製物又はその類似物上に播種し、 基底膜調製 物又はその類似物通過能を有する細胞を回収する工程を繰り返すことにより、 より高い浸潤能または転移能を有する MC F 7由来細胞株を作製することが できる。 基底膜調製物又はその類似物の例としては、 例えば、 マトリゲルを 挙げることができるが、 ここでマトリゲルとは細胞外基質タンパク質 （EC M) が豊富な EH Sマウス腫瘍細胞から抽出された可溶化基底膜調製品であ り、 生体内の基底膜と類似した環境を提供するものである。 マトリゲルを使 用する場合には、 MC F 7細胞をマトリゲルに播種した後、 マトリゲルを通 過する細胞を回収して再びマトリゲル上に播種する工程を少なくとも 7回、 好ましくは 8回、 さらに好ましくは 9回、 最も好ましくは 1 0回繰り返すこ とにより、 十分に高い浸潤能または転移能を獲得した MCF 7由来細胞を得 ることができる。 また、 基底膜調製物の類似物の例としては、 ァガロース又 はコラーゲンゲルが挙げられる。 MCF 7由来細胞株は培養中に培地中の線 維成分により移動能が制限され、浸潤能や転移能が低くなると考えられる力 S、 このような線維成分を基底膜調製物の類似物として MC F 7由来細胞を得る ことも可能である。
このような本発明の MC F 7由来細胞としては、 独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センターに寄託した MCF 7- 14細胞株が挙げら れる。
[寄託された生物材料への言及]
1) 寄託機関の名称及びあて名
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305— 8 5 66)
2) 寄託日
平成 1 9年 1月 1 0日 （原寄託日） 3 ) 受託番号
F E RM B P - 1 0 9 4 4 この細胞は癌転移研究及び予後マーカー、 創薬ターゲット探索等を行うう えで有用な情報を与える可能性が高い。 たとえば D N Aマイクロアレイゃサ ブトラクション法などの遺伝子レベルでの解析に加えて、 二次元電気泳動一 質量分析といったタンパク質レベルでの詳細な解析を駆使することにより、 高転移能や高浸潤能の獲得に特異的だと考えられる因子が同定される可能性 が高い。 また転移初期に変異する因子を捕らえることで、 初発癌の発見と同 時にその癌が転移性なのか予後予測ができるようになり、 抗癌剤投与方法等 の治療方針を立てる上で役立つ診断基準になる可能性が高い。 新規予後マー カーとしての可能性だけではなく、 同定された因子そのものが癌治療の標的 分子になる可能性がある。 転移細胞特異的に発現する因子が発見できれば、 転移巣を形成する前の血中を漂っている播種性癌細胞をターゲッティングし、 細胞死を誘導するドラッグデリバリーシステムの開発など創薬への貢献も大 きい。 さらに遺伝子レベル、 タンパク質レベルなど様々な角度から転移現象 を網羅的に解析することにより得た多くの情報は、 転移のメカニズムを解明 する糸口をいくつも提供すると考えられる。 転移巣形成の分子メカニズムへ の理解が深まれば、 新しい癌治療戦略の発展にもつながる。
さらに、 本発明は、 G F P遺伝子、 Y F P遺伝子、 C F P遺伝子、 βガラ クトシダーゼ遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子、 及びェクオリン遺伝子からな る群より選択される少なくとも一つの遺伝子が導入されている M C F 7由来 細胞も提供する。 このような細胞は、 公知の遺伝子導入法又はそれに順ずる 方法によって作製することができ、 それぞれの遺伝子の表現型を種々の研究 に利用することができて有用である。 また、 本発明は、 上述の M C F 7由来細胞が移植された実験用動物をも提 供する。 このような実験用動物は、 公知の方法又はそれに順ずる方法によつ て作製することができる。 上述のように本発明に係る M C F 7由来細胞は、 高い浸潤能、転移能を有する上に移植能が高いことから、当該実験用動物は、 乳癌モデルとして、 転移や再発の研究等に有用である。 尚、 実験用動物とし ては、 マウス、 ラット、 ハムスター類、 スナネズミ、 モ /レモット、 ゥサギ、 ィヌ、ネコ、 プタ、 サル類、 トリ類、魚類、 両生類等を用いることができる。 また、 本発明は、 上述の M C F 7由来細胞を含む、 癌転移若しくは再発関 連因子又は抗癌剤のスクリーユング系を提供する。 細胞を含むスクリーユン グ系は、 公知の方法又はそれに順ずる方法で作製することができる。 このス クリーニング系は、 従来の乳癌の治療方法に感受性の低い M C F 7由来細胞 を含むので、 浸潤阻害物質をスクリーニングすることができ、 新規な乳癌の 転移若しくは再発関連因子の発見や、 新規な乳癌治療 ·予防薬の発見に寄与 する有用なものである。
また、 本発明は、 上述の M C F 7由来細胞を移植した実験用動物を含む、 癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系を提供する。 こ のような実験用動物を含むスクリ一ユング系は、 公知の方法又はそれに順ず る方法で作製することができる。 このスクリーニング系は、 転移阻害物質を スクリーニングすることができる有用なものである。
また、 本発明は、 M C F 7細胞から高浸潤性または高転移能を獲得した変 異細胞株を樹立するスクリーニング方法も提供する。 当該方法は、 M C F 7 細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種した後、 該基底膜調製物又はそ の類似物通過能を有する細胞を回収しては再び基底膜調製物又はその類似物 上に播種する工程を少なくとも 7回繰り返すことを特徴とする。 M C F 7由 来細胞の浸潤性 '転移性を向上させる方法としては、 点突然変異を誘発する など人工変異誘発剤を用いる方法もあるが、 導入できる変異のパターンが有 限であることから浸潤性が十分に高くすることができない。 また、 生体内で は生じない変異が生じる可能性があることから、 乳癌モデルとしては適さな い場合もある。 しかしながら、 本発明のスクリーニング方法によれば、 薬剤 等によつて変異を誘発しないで極めて高い浸潤性を有する M C F 7由来細胞 を得ることができ、 乳癌モデルとして転移の発生のメカニズムや、 転移能を 獲得する初期ステージでの変化を捉える研究に有用に用いられる。 基底膜調 製物又はその類似物としては、例えば、マトリゲルを使用することができる。 実施例
以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、 本発明の範囲はこ れに限定されるものではない。
1. 細胞培養
MC F 7糸田月3 (B r e a s t a d e n o c a r c i n oma ； H u m a n) は 1 0%FB S (E q u i t e c h B I O社製） 含有 R PM I 1 6 40 (S I GMA社製） 培地で培養した。 細胞は 3日毎に公知の方法に従つ て ¾代した。
2. i n V i t r o浸潤アツセィ及び低浸潤能細胞から高浸潤細胞の樹立 図 1に示すように、 MC F 7細胞 14をマトリゲルインベージョンチャン ノ ー 1 (B e c t o n D i c k i n s o n社製） のセノレ力ノレチヤーィンサ ト 1 0に公知の方法に従って播種した。 セルカルチャーィンサート 1 0の 底部は、 メンプレン 1 2上にマトリゲル 1 3がコーティングされており、 マ トリゲル通過能を有する細胞 14のみがメンプレン 1 2の下側に移動する。 60時間後にメンプレン 1 2の下側に移動した細胞 （浸潤細胞） をトリプシ ンー EDTA処理により回収した。 回収した細胞 14はディッシュ 2でサブ コンフルェントになるまで培養し、 再びマトリゲルインべ一ジョンチャンバ 一 1に播種した。 以上の操作を 14回繰り返し行った。 またメンブレン 1 2 の下側に移動した細胞はクリスタルバイオレツト染色し、 全体像を観察する とともに、 顕微鏡下で 5視野選択して、 移動した細胞数を数えた。
結果を図 2〜4に示す。 図 2はクリスタルバイオレッ ト染色像、 図 3は 1 00倍の倍率で観察した顕微鏡像、 図 4は移動した細胞数を示している。 c o n t r o 1は MC F 7細胞を、数字はマトリゲルを通過させた回数を示す。 マトリゲル 1 3を通過した細胞を再ぴマトリゲル上に播種して通過させると レヽぅサイクルを 14回繰り返した結果、 浸潤能の高い細胞群 （MCF 7— 1 4細胞） を得られた。
図 5に MCF 7細胞と MCF 7- 14細胞の位相差像を示す。 MCF 7細 胞 （図 5A) と MCF 7— 14細胞 （図 5 B) を比較すると、 MCF 7— 1 4細胞の方が丸みを帯ぴていた。 また、 MC F 7細胞はコンフルェントにす ると剥離してしまうが、 MCF 7— 14細胞はスフェロイドを形成し増殖し 続けた。
3. 細胞増殖曲線
MC F 7細胞と MC F 7 - 14細胞を 96ゥエルプレートに 5x 1 03細 胞 Zゥエルで播種し 1、 2、 3、 4日後の細胞数を MTT法により計測した。 結果を図 6に示す。 縦軸は細胞数、 横軸は培養日数を示す。 MCF 7細胞 と MC F 7— 14細胞では、 細胞増殖率には有意差はなかった。
4. Wo u n d h e a l i n g / ッセィ
細胞の移動能を比較するために、 Wo u n d h e a l i n g アツセィ を行った。 MC F 7細胞と MC F 7 - 14細胞を 1 0 c ディッシュでコン フルェントの状態まで培養し、マイク口ピぺッ トのチップで溝を作った。 1、
2、 3、 4日後の細胞の移動した様子 （それぞれ 3箇所の同一視野） を位相 差顕微鏡で観察し、 カメラで撮影した。 細胞の移動度を調べるために、 画像 解析ソフトを用いて解析し、 溝の幅を測定した。 結果を図 7に示す。 溝をつけてから 0、 1、 2、 3、 4日後の MCF 7細 胞 （図 7A) と MCF 7— 14細胞 （図 7 B) を比較すると、 MCF 7— 1 4細胞の方が早く溝が埋まった。 図 7 Cは、 細胞が移動した距離の 3視野の 平均 （％) を示す。 図 7 D及び図 7 Eは、 それぞれ、 3日後の MCF 7細胞 及び MC F 7— 14細胞の拡大像である。 MCF 7— 14細胞 （図 7 E) で は、 ァクチンストレスファイバーが活発に伸びていた。
5. ザィモグラムによる MMP活性の検証
次に、 MC F 7細胞及ぴ MC F 7— 14細胞における、 マトリックスメタ プロテアーゼ （MMP) 活性を測定した。 MMPは、 細胞外マトリックスを 基質として分解する酵素であり、 癌細胞の浸潤 ·転移形成に大きな役割を果 たす。
1 2.ゥエルプレートに、 MC F 7細胞と MC F 7— 14細胞を 2. 5x1 05細胞 Zゥエルの濃度で、 マトリゲルを含まない通常の培地と、 マトリゲ ルを含む培地に播種した。 翌日、 培地を 500 ^ 1の無血清培地に交換し、 1、 2、 3時間後に培地を回収した。 回収した培地は Mi c r o c o n (登 録商標） YM30 (ミリポア社製） を用いて遠心濃縮した。 濃縮した培地 とサンプルバッファーを混合し、 10 %ポリアクリルァミドゲルを用い、 4□ にて 25 mAで 2時間電気泳動した。 2. 5 % t r i t o n X— 1 00含有 緩衝液を満たしたバットにゲルを入れ、 室温で 30分間、 ゆっくりと浸透し ながら SDSを取り除く作業を 2回行なった。 さらにゼラチナーゼ活性化溶 液で 37口、 24時間インキュベーションした。 その後 CBB染色液で 30 分間染色し、 さらに 30分間脱色液で脱色した。
図 8にマトリゲルを含まない細胞培養用ディッシュで培養した場合の結果 を、 図 9にマトリゲルインベージョンチャンバ一で培養したときの結果を示 す。 各図 Aは、 ザィモグラム法で用いたゲルの染色像であり、 各図 B及ぴ C は、 それぞれ、 画像解析ソフトにより解析して MMP 9と MMP 2の活性を 測定した結果である。 図示されるとおり、 培地にマトリゲルを含まずに培養 した状態でも、 培地にマトリゲルを含み浸潤させながら培養した場合であつ ても、 MC F 7— 1 4細胞の方が、 活性型 MM Pの発現量が'高かった。
6. オリゴマイクロアレイ
MC F 7細胞と MC F 7 - 14細胞から公知の方法に従って R N Aを抽出 し、 公知の方法に従って G e n e C h i p (登録商標） Huma n G e n ome U 1 3 3 P l u s 2. 0 Ar r a y (A f f yme t r
1 x社製） よる解析を行なった。 その後、 2倍以上変動した遺伝子と 2倍以 下の変動した遺伝子について" c a n c e r "と"転移"に関与している遺伝子 を G e n e s p r i n gにより検索した。
結果を表 1〜4に示す。 2倍以上変動した 1495遺伝子中、 c a n c e rに関与している遺伝子は 1 3遺伝子（表 1)、転移に関与している遺伝子は 1 3遺伝子 （表 2) であった。 また、 0. 5倍以下に変動した 1 36 3遺伝 子中、 c a n c e rに関与している遺伝子は 7遺伝子 （表 3 )、転移に関与し ている遺伝子は 0遺伝子であった。 さらに乳癌に関与することが示唆された
23 1遺伝子 （非特許文献 1を参照） のうち 14遺伝子の変動が確認された (表 4)。
[表 1]
Systematic Gene bank Normalized Common Description
204032一 at .003567 2.747 BGAR3 breast cancer anti-estrogen resistance 3
157033¾_at BC015132 3.1 S D0C1 Dowuregulated in ovarian cancer 1
1554966_a_at AF329092 2.381 D0C1 do nregulated in ovarian cancer 1
epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral
156548 _x_at A 277897 4.704 EGFR
(verb-b) oncogene homolog, avian)
228948一 at T15545 21.999 EPHA4 EPH receptor A4
206114一 at NM_004438 6.906 EPHA4 EPH receptor A4
227449— at AI799018 6.795 EPHA4 EPH receptor A4
229374— at AI758962 2.166 EPHA4 EPH receptor A4
v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3
215638一 at U88358 2.521 ERBB3
(avian)
verb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4
214053一 at AW772192 4.354 ERBB4
(avian)
211234_x_at AF258449 2.097 BSE1 estrogen receptor 1
fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinoc te growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1,
203638一 s— at NWL022969 4.096 FGFR2
Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, Jackson-Weiss syndrome)
fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1,
208228— s— at M87771 2.501 FGFR2
Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, Jackaon-Weiss syndrome)
207178一 s— at MJJ02031 2.612 FRK fyn-telated kinase
208018一 s一 at NM.002110 2.013 HCK hemopoietic cell kinase
237377_at AA069425 2.172 IGF1R Insulin-like growth factor 1 receptor
205842_s一 at A 001362 3.015 JAK2 Janus kinase 2 (a protein tyrosine kinase)
217104一 at AL109714 2.114 LOC400410 similar to cervical cancer suppressor- 1
237737一 at AI359676 2.540 LOC401131 hypothetical LOC401131
233079_at ΛΚ026802 2.326 MERTK c-mer proto-oncogene tyrosine kinase
214525_x_at AB039667 2.292 MLH3 mutL homolog 3 (E. coli)
221795— AI346341 3.768 NTRK2 2
221796一 at AA707199 3.430 NTKK2 neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2
229463一 at R39159 2.829 TRK2 neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2
236095一 at BE858459 2.091 NTRK2 neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2
243531一 at AI677888 2.148 O AOV1 oral cancer overexpressed 1
1554743一 it一 at BC008410 2.651 PMS1 PMS1 postmeiotic segregation increased 1 (S, cerevisiae)
1554742— at BC008410 2.529 PMS1 PMS1 postmeiotic segregation increased 1 (S. cerevisiae)
204394一 at M.003627 2.408 SLC43A1 solute carrier family 43, member 1
207334 at M_003242 3.162 TGFBR2 transforming growth factor, beta receptor ΙΪ (70/80kDa)
[表 2 ] Systematic Genbank Fold Change Common Description
nac51fll.xl NCI_CGAP_Brn23 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:3406220 3' similar to contains Alu repetitive
213373一 s— at BF439983 2.375 CASP8
element½ontains element MER28 repetitive element；, mRNA sequence.
21201 s at AI493245 2.843 CD44 CD44 antigen (homing function and Indian blood group system)
212063— at BE903880 2.842 CD4 CD44 antigen (homing function and Indian blood group system)
209835一 x一 at BC004372 2.784 CD44 CD44 antigen (homing function and Indian blood group system)
1557905— s— at AL552534 2.766 CD44 CD44 antigen (homing function and Indian blood group system)
AV700298 GKC Homo sapiens cDNA clone GKCBVG05 3',
217523一 at AV700298 2.616 CD
mRNA sequence.
204489— a_at NK.000610 2.374 CD4 CD 44 antigen (homing function and Indian blood group system)
209687_at U19495 5.529 CXCL12 chemokine (C-X-C moti^ Ugand 12 (stromal cell-derived fector 1)
203666— at NML.000609 4.208 CXCL12 chemokine (C-X-C moti^ ligand 12 (stromal cell-derived fector 1) integrin, beta 1 (fibronectin receptor, beta polypeptide, antigen
216178_x„at AA215854 2.230 ITGB1
CD29 includes MDF2( MSK12)
211579一 at U95204 5.000 ITGB3 integrin, beta 3 (platelet glycoprotein Ilia, antigen CD61)
201505— at ΝΜ_002291 3.002 LAMB1 laminin, beta 1
208166— at NM.022564 3.010 MMP16 matrix metalloproteinase 16 (membrane-inserted)
207847_s_at NM_002456 2.113 MUCl mucin 1， transmembrane
211G68_s_at K03226 12.290 PLAU plaaminogen activator, urokinase
phospha idylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent RAC
22492 &ー at AL445192 3.232 PREX1
exchanger 1
203083一 at N¾L_003247 2.453 THBS2 tkrom ospondin 2
tissue inhibitor of metalloproteinaae 1 (erythroid potentiating
201666— at 1WL003254 2.061 TIMP1
activity, collagenase inhibitor)
211527—^_at M27281 2.094 VEGF vascular endothelial growth factor
[表 3 ]
W
19
Figure imgf000021_0001
[表 4 ]
Systematic Gene bank Fold Change Common Description
202912— at M— 001124 7.605 ABM adrenomedullin
205047— s一 at N¾L001673 2.245 ASNS asparagine synthetase
201236_s_at NM— 006763 2.316 BTG2 BTG family, member 2
219010一 at NML.018265 9.9 Clorfl06 chromosome 1 open reading frame 106
225191— at AL565767 3.66 CIRBP cold inducible BNA binding protein
20342 一 at AW157548 5.652 IGFBP5 insulin-like growth factor binding protein 5
211959一 at AW007532 4.707 IGFBP5 inaulin-like growth factor binding protein 5
211958一 at R73554 3.895 IGFBP5 inaulin-like growth factor binding protein 5
1555997一 s— at B 128432 2.883 IGFBP5 insulin-like growt fector binding protein 5
203426一 s一 at M65062 2.421 IGFBP5 inaulin-like growth factor binding protein 5
242889— x— at AI820076 2,097 LOC645431 hypothetical protein LOC645431
203212_s_at ML016156 3.082 MTMR2 myotubularin related protein 2
1558365一 at AK055928 31.7 PGK1 Phosphoglycerate kinase 1
211527一 t M27281 2.094 VEGF vascular endothelial growth fiactor 7. GF P発現安定株の作製
MCF 7細胞と樹立した MC F 7 - 1 4細胞に、 公知の方法に従って GF P発現プラスミドベクターを遺伝子導入し、 約 1週間 GF P発現細胞をスク リ一二ングした。 クローニングリングを用いて 3 0クローンをクローニング し、 約 3週間、 選択培地 （4 0 0 g/m 1 の G4 1 8 (S I GMA社製） 添加培地） と維持培地 （5 0 /i gZm lの G4 1 8添加培地） で繰り返し培 養することで GF P発現安定株を樹立した。 以下、 それぞれ、 MCF 7— G F P細胞、 MC F 7— 1 4一 GF P細胞と称する。
8. ウェスタンブロット解析
MCF 7細胞、 MCF 7 - 1 4細胞、 MCF 7—GF P細胞、 MCF 7
1 4一 GF P細胞から蛋白質を抽出し、 2〜1 5%の濃度勾配のあるポリア クリルアミ ドゲルを用いて公知の方法に従って S D Sポリアクリルアミ ドゲ ル電気泳動を行った。 分離した蛋白質を PVDFメンプレンに転写し、 5% スキムミルクでブロッキング後に、 抗 H ER 2抗体、 あるいは抗エストロゲ ンレセプター抗体と反応させた。 さらに HRP架橋 2次抗体と反応させ、 E CLで検出した。
結果を図 1 0に示す。 MC F 7細胞 （レーン 1)、 MC F 7— 1 4細胞 （レ ーン 2)、 MC F 7— GF P細胞 （レーン 3)、 MC F 7— 1 4— G F P細胞 (レーン 4) から抽出した蛋白質を用い、 抗 HER 2抗体 （上段） と抗 E S TR抗体（下段）によるウェスタンブロッテイング解析を行った結果を示す。 一般に HER 2の発現量が增大すると転移性が高く、 E S TR発現量が増大 すると悪性度が増す （転移性が高い） ことが知られているが、 MCF 7— 1 4は逆の性質 （HER 2陰性、 E S TR陽性） を示した。
9. 細胞移植
MC F 7— GF P細胞 （c o n t r o l ) と樹立した MC F 7— 1 4— G F P細胞を最終濃度が 8. 6x1 07細胞 Zm lになるようにグロースファタ ターリデュース トマ ト リゲノレ （B e c t o n D i c k i n s o n社製） と 1 ： 1で混合し、 移植細胞液を調製した。 この移植細胞液 1 00 μ 1を、 図 1 1に示すように、 BALBZcAL c 1 - n u/n u系統マウスのメス の第 4乳腺に移植した。移植後、解剖時に GF P発現細胞の挙動を解析した。 移植 4週間後のマウスを観察した結果を図 1 2に示す。 図 1 2A及び Cは MC F 7 -G F P細胞、 B及び Dは MC F 7— 14一 GF P細胞を移植した マウスであり、 A及び Bはマウス全体像、 C及び Dはそれぞれ A及ぴ Bの蛍 光観察像である。 MC F 7— GF P細胞では、 移植部位に腫瘍を形成してい るものの転移巣は観察されなかった。 一方、 MCF 7 _ 14—GF P細胞は 移植部位の原発腫瘍巣の形成に加えて、 腹膜内へ播種している GFP発現細 胞の局在、 及ぴ腹部に比較的大きな GF P発現細胞の細胞塊が観察された。 10. 染色による転移の確認
移植 4週間後の？し腺を摘出し、 公知の方法に従って凍結切片を作製した。 この切片を公知の方法に従って、 HE染色及び抗 GF Pポリクローナル抗体、 抗 BRC A 2モノクローナル抗体による免疫染色を行なった。
MC F 7 -GF P細胞及ぴ MC F 7— 14一 G F P細胞移植マウスの肺部 位の全体像及ぴ抗 G F P抗体で免疫染色した組織切片を観察した結果を図 1 3に示す。 図 1 3中、 A、 C及ぴ Eは MC F 7—GF P細胞、 B、 D、 Fは MC F 7— 14— G F P細胞に関するものであり、 図 1 3中、 A、 Bは肺の 解剖像、 C、 Dは蛍光観察像、 E、 Fは凍結切片を抗 GF P抗体により免疫 染色した結果である。 図示されるように、 マウス肺部位に腫瘍及び GF P発 現細胞は観察されなかった。
図 14は、 MCF 7— GF P細胞移植 4週間後のマウスから摘出した乳腺 の移植部位 （A、 C) と近位リンパ節 （B、 D) を観察した結果を示す。 A と Bは HE染色、 Cと Dは抗 GF P抗体により免疫染色した結果を示す。 M CF 7— GF P細胞を移植したマウスの移植部位では GF P発現細胞が多数 観察されたが、乳腺リンパ節にはなく転移が起きていないことが観察された。 図 1 5は、 MCF 7— 1 4一 GFP細胞移植 4週間後のマウスから摘出し た ¾腺の移植部位 （A、 C) と近位リンパ節 （B、 D) を観察した結果を示 す。 Aと Bは HE染色、 Cと Dは抗 GF P抗体により免疫染色した結果を示 す。 MCF 7— 14一 GF P細胞移植マウスは移植部位、 乳腺リンパ節の両 方に GF P発現細胞が観察され、 転移の予後予測マーカーでもある近位リン パ節転移が生じていることが観察された。
図 1 2で示された MCF 7- 14一 GF P細胞移植マウスの転移巣に関し て、 さらに詳しく調べるため、 すい臓周辺部位を摘出して観察した結果を図 1 6に示す。 図 1 6中、 Aはマウス全体像、 Bは摘出したすい臓周辺の解剖 像、 Cと Dはそれぞれ Aと Bに相当する部位を蛍光観察した結果である。 す い臓のリンパ節が肥大しており、 GF P発現細胞が多数局在していることが 観察された。
さらに詳しく解析するために、 MC F 7— 14一 GF P細胞移植マウスか らすい臓部分の腫瘤 （図 1 7A, B) を摘出、 凍結組織切片 （厚さ を作製し、 HE染色 （図 1 7 C)、 メチルグリーンピロユン染色 （図 1 7D) による明視野観察、 および GF Pの蛍光観察 （図 1 7 E) を行った。 すい臓 部分の腫瘤に GF Pの発光が観察されたことから、 移植した MCF 7- 14 細胞の転移巣であると考えられた。
図 1 8に示したように、 移植 4週間後の MC F 7— GF P細胞移植マウス から移植部 （A— C) を、 移植 4週間後の MCF 7— 14一 GF P細胞移植 マウスから移植部 （D— F) およびすい臓部分の腫瘤 （G— I ) を摘出、 凍 結切片を作成し、上皮マーカーであるサイトケラチン 7 ( RT 7； A, D, G)、 KRT 1 9 (B, E， H)、 KRT 20 (C, F, I ) の免疫染色を行 つた。 一次抗体として、 マウス抗 KRT 7モノクローナル抗体 （ZYMED L a b o r a t o r i e s , 1 8— 0234 ; 希釈倍率 50倍）、 マウス抗 KRT 1 9モノクローナル抗体 （SANTA CRUZ, s c - 6 278 ； 50倍） およびマウス抗 KRT 20モノクローナル抗体 （SANTA CR UZ， s c— 523 20 ； 50倍） を用い、 プロッキングおよぴ増感試薬と してヒストファインマウススティンキット（ニチレイ）を、発色基質には 3, 3'—ジァミノベンジジンテトラヒ ドロクロライ ド (DAKO) を使用した。 すい臓に認められた腫瘤に含まれる細胞の多くは、 由来となる MCF 7細胞 の GFP導入株 （MCF 7— GFP) および移植した MC F 7— 14一 G F P細胞と、 同様の上皮マーカーの発現パターンを示したことから、 乳腺に移 植した MCF 7— 14— GFP細胞が転移し、 転移巣を形成していることが 確認された。
図 1 9は、 MC F 7— 14一 GF P細胞移植 1 2週間後のマウスを観察し た結果を示す。 マウス腹部 （A、 B) からすい臓周辺部位 （C、 D) を摘出 し、 さらには脳 （E、 F) を摘出した。 A、 C、 Eは解剖像、 B'、 D、 Fは 蛍光観察像である。 この結果からもすい臓付近リンパ節に直径 1 cm以上の 転移腫瘍巣が観察され、 脳においても GF P発現細胞の局在が確認できた。 産業上の利用可能性
本発明に係る MCF 7由来細胞は、 MCF 7細胞由来であるにもかかわら ず、 高い浸潤能を有し、 または、 高い転移能を有する。 このような変異は、 薬剤等を使用せず、 自然に近い環境で誘発されたものであるため、 転移の発 生のメカニズムや、 本発明に係る MCF 7由来細胞は、 転移能を獲得する初 期ステージでの変化を捉え、 転移や再発等の予後予測マーカーを探索する研 究に好適に利用されるものであり、 浸潤 ·転移特異的因子の探索や、 癌転移 性及び予後予測用診断キット開発にも利用されうるものである。 また、 従来の癌転移研究においては、 様々な人種や多様な疾患症状由来の 組織、 あるいはそれらの組織から派生した細胞株を対象としているため、 非 常に多くの原因因子を発見することはできたものの、 共通に存在しマーカー となりうる因子を同定することは困難であった。 しかしながら、 本発明の M C F 7由来細胞を用いれば、 同一の遺伝的背景をもつ細胞株から派生した亜 細胞株を比較することで、 精度の高いマーカーのスクリ一エングができる可 能性が高く、 マーカーだけではなく同定因子そのものが創薬ターゲットにな る可能性も高い。

Claims

請求の範囲
1. MC F 7細胞に由来する細胞であって、 MC F 7細胞に比較して有意 に高い浸潤能を有する MC F 7由来細胞。
2. MC F 7細胞に由来する細胞であって、 MC F 7細胞に比較して有意 に高い転移能を有する MC F 7由来細胞。
3. HER 2陰性である、 請求項 1又は 2に記載の MC F 7由来細胞。
4. E STR陽性である、 請求項 1から 3のいずれか 1項に記載の MCF 7由来細胞。
5. CD44遺伝子、 CXCL 1 2遺伝子、 P L AU遺伝子、 及び V E G F遺伝子からなる群より選択される少なくとも一^ 3の遺伝子の発現量が、 M 〇 7細胞の1. 5倍以上である、 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の MC F 7由来細胞。
6. スフヱロイドを形成することを特徴とする、 請求項 1から 5のいずれ か 1項に記載の MCF 7由来細胞。
7. 実験用動物に移植した場合、 移植部位に原発腫瘍巣を形成する能力を 有する、 請求項 1から 6のいずれか 1項に記載の MCF 7由来細胞。
8. 実験用動物に移植した場合、 近位リンパ節、 遠隔リンパ節、 又は脳に 転移巣を形成する能力を有する、 請求項 1から 7のいずれか 1項に記載の M CF 7由来細胞。
9. MCF 7細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種し、 該基底膜調 製物又はその類似物を通過するように変異した細胞を回収することによって 得られる、 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載の MCF 7由来細胞。
10. MC F 7— 14細胞 （受領番号 F ERM BP— 1 0944) であ る、 MC F 7由来細胞。
1 1. GFP遺伝子、 YFP遺伝子、 CFP遺伝子、 ]3ガラクトシダーゼ 遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子、 及びェクオリン遺伝子からなる群より選択 される少なくとも一つの遺伝子が導入されている、 請求項 1から 10のいず れか 1項に記載の MC F 7由来細胞。
1 2. 請求項 1から 1 1のいずれか 1項に記載の MCF 7由来細胞が移植 された実験用動物。
1 3. 請求項 1から 1 1のいずれか 1項に記載の MC F 7由来細胞を含む、 癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーユング系。
14. 請求項 1 2に記載の実験用動物を含む、 癌転移若しくは再発関連因 子又は抗癌剤のスクリーニング系。
1 5. MC F 7細胞から、 高浸潤能または高転移能を獲得した変異細胞株 を樹立する方法であって、 MCF 7細胞を基底膜調製物又はその類似物上に 播種した後、 該基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を回収して は再び基底膜調製物又はその類似物上に播種する工程を少なくとも 7回繰り 返すことを特徴とする、 方法。
PCT/JP2008/051979 2007-01-30 2008-01-30 Ｍｃｆ７由来細胞 WO2008093886A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008556219A JP5527573B2 (ja) 2007-01-30 2008-01-30 Ｍｃｆ７由来細胞

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007020101 2007-01-30
JP2007-020101 2007-01-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008093886A1 true WO2008093886A1 (ja) 2008-08-07

Family

ID=39674184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2008/051979 WO2008093886A1 (ja) 2007-01-30 2008-01-30 Ｍｃｆ７由来細胞

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5527573B2 (ja)
WO (1) WO2008093886A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010067722A1 (ja) * 2008-12-08 2010-06-17 株式会社バイオマトリックス研究所 乳癌の悪性度の評価方法および評価用キット
WO2010098471A1 (ja) 2009-02-27 2010-09-02 株式会社バイオマトリックス研究所 がん細胞を用いた免疫方法
WO2012026615A1 (ja) 2010-08-25 2012-03-01 株式会社バイオマトリックス研究所 がん細胞を用いた抗体の製造方法
WO2012028958A2 (ja) 2010-09-01 2012-03-08 株式会社バイオマトリックス研究所 大腸がんマーカーに対する抗体

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENG G.Z. ET AL.: "Twist transcriptionally up-regulates AKT2 in breast cancer cells leading to increased migration, invasion, and resistance to paclitaxel", CANCER RES., vol. 67, no. 5, 1 March 2007 (2007-03-01), pages 1979 - 1987 *
KOJIMA H. ET AL.: "Koten'isei Saibokabu MCF7-14 Juritsu Oyobi Kaiseki - Gan Shinjun.Gan Ten'i Kanren nshi no Tansaku -", DAI 80 KAI NIPPON SEIKAGAKU TAIKAI KOEN YOSHISHU, 25 November 2007 (2007-11-25), pages ABSTR. NO. 4P-0927 *
LE MARER N. ET AL.: "Comparison of in vitro invasiveness of human breast carcinoma in early or late stage with their malignancy in vivo", ANTICANCER RES., vol. 16, no. 5A, 1996, pages 2767 - 2772 *
PLATET N. ET AL.: "Breast cancer cell invasiveness: correlation with protein kinase C activity and differential regulation by phorbol ester in estrogen receptor-positive and -negative cells", INT. J. CANCER, vol. 75, no. 5, 1998, pages 750 - 756 *
SHINDO-OKADA N. ET AL.: "Establishment of cell lines with high- and low-metastatic potential from PC-14 human lung adenocarcinoma", JPN. J. CANCER RES., vol. 92, no. 2, 2001, pages 174 - 183 *
THOMPSON E.W. ET AL.: "The invasive and metastatic properties of hormone-independent but hormone-responsive variations of MCF-7 human breast cancer cells", CLIN. EXP. METASTASIS, vol. 11, no. 1, 1993, pages 15 - 26 *
TOH Y. ET AL.: "Analysis of the complete sequence of the novel metastasis-associated candidate gene, metal, differentially expressed in mammary adenocarcinoma and breast cancer cell lines", GENE, vol. 159, no. 1, 1995, pages 97 - 104 *
WANG M. ET AL.: "Isolation and characterization of PC-3 human prostatic tumor sublines which preferentially metastasize to select organs in S.C.I.D. mice", DIFFERENTIATION, vol. 48, no. 2, 1991, pages 115 - 125 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010067722A1 (ja) * 2008-12-08 2010-06-17 株式会社バイオマトリックス研究所 乳癌の悪性度の評価方法および評価用キット
JP2010130993A (ja) * 2008-12-08 2010-06-17 Bio Matrix Research Inc 乳癌の悪性度の評価方法ならびに該評価方法に用いるアレイおよびキット
WO2010098471A1 (ja) 2009-02-27 2010-09-02 株式会社バイオマトリックス研究所 がん細胞を用いた免疫方法
WO2012026615A1 (ja) 2010-08-25 2012-03-01 株式会社バイオマトリックス研究所 がん細胞を用いた抗体の製造方法
WO2012028958A2 (ja) 2010-09-01 2012-03-08 株式会社バイオマトリックス研究所 大腸がんマーカーに対する抗体

Also Published As

Publication number Publication date
JP5527573B2 (ja) 2014-06-18
JPWO2008093886A1 (ja) 2010-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Boo et al. MiRNA transcriptome profiling of spheroid-enriched cells with cancer stem cell properties in human breast MCF-7 cell line
Zoni et al. miR-25 modulates invasiveness and dissemination of human prostate cancer cells via regulation of αv-and α6-integrin expression
Gao et al. Isolation and phenotypic characterization of colorectal cancer stem cells with organ-specific metastatic potential
CN106434870A (zh) ncRNA及其用途
CN111979290B (zh) Spp1基因在制备增强卵巢癌患者对parp抑制剂敏感性的药物中的应用
CN104080924A (zh) 用于治疗和诊断乳腺癌的方法和组合物
Xiao et al. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro
CN106834486A (zh) 骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用
Wu et al. B-cell lymphoma/leukemia 10 promotes oral cancer progression through STAT1/ATF4/S100P signaling pathway
JP6284147B2 (ja) 乳癌の骨髄高転移性マウス乳癌細胞株の樹立方法
WO2008093886A1 (ja) Ｍｃｆ７由来細胞
EP3318632B1 (en) Marker for heterogeneity of cancer tissue, and use thereof
Zhang et al. The study of the tumor stem cell properties of CD133+ CD44+ cells in the human lung adenocarcinoma cell line A549
CN116287249A (zh) 一种肝细胞癌诊断和预后标志物及其应用
CN111424082A (zh) lncRNA-SNHG6基因在制备治疗骨肉瘤的药物中的用途
CN113832226B (zh) 研究gnl3与肝癌发展的相关性的方法及gnl3作为肝肿瘤干细胞、肝癌标志物的用途
CN114712392A (zh) 来自自体血液分离的免疫细胞制剂及其应用
CN107881240B (zh) 骨肉瘤的诊治标志物
CN113293208B (zh) 与肺癌增殖和转移相关的分子标志物及其应用
CN103800918B (zh) 一种微小rna在制备抗肿瘤的药物中的应用
CN107893119B (zh) Zcchc12在骨肉瘤中的应用
KR102226485B1 (ko) 유방암 환자 종양 유래 이종이식 모델의 제조방법
CN111534587A (zh) 分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用
CN113699240B (zh) Nrk在肺癌治疗和预后诊断中的医药用途
CN108165624A (zh) 生物标志物在骨肉瘤诊治中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08710875

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2008556219

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08710875

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)