WO2008080495A1 - Verbessertes verfahren zur gewinnung von öl aus pflanzensamen - Google Patents

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WO2008080495A1
WO2008080495A1 PCT/EP2007/010562 EP2007010562W WO2008080495A1 WO 2008080495 A1 WO2008080495 A1 WO 2008080495A1 EP 2007010562 W EP2007010562 W EP 2007010562W WO 2008080495 A1 WO2008080495 A1 WO 2008080495A1
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enzyme
seed
pressing
extraction
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PCT/EP2007/010562
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Jörg KÖHLER
Volker Marschner
Bruno Winter
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Ab Enzymes Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/02—Pretreatment
    • C11B1/025—Pretreatment by enzymes or microorganisms, living or dead
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to an improved process for recovering oil from plant seeds using enzymes.
  • the invention relates to a process in which dry oilseeds are sprayed with enzymes without significantly increasing the moisture content of the oilseed and after which the oilseeds can subsequently be pressed immediately.
  • Oilseeds such as soybean, peanut, cottonseed, sunflower seed, corn germ and rape seed (including canola) are the major source of edible vegetable oils. They cover more than 70% of the world's fats and oils production from vegetable raw materials. Soybeans are represented with 20%. These oilseeds are not only the main oil suppliers, but are also very good sources of high-quality protein, which is often used for animal nutrition purposes.
  • rape in Germany In addition to its use as edible oil and as a raw material for edible fats, rape in Germany is mainly grown for the production of technical products. Of the Cultivation of winter rape in Germany for the 2004 harvest amounts to approximately 1, 23 million hectares, which corresponds to a rapeseed volume of approximately 3.5 million tons. Well over half of the vegetable oil produced in Germany is now rapeseed oil. Worldwide, the amount of oilseed rape harvested in 2004/5 was 46 million tonnes, with the main production areas of Europe, Canada, USA, Australia, China and India. The cultivation of oilseed rape was the third largest oilseed for soybean and palm oil and is cultivated on approx. 13% of the used arable land. The acreage used for rape cultivation continues to increase worldwide.
  • rapeseed oil methyl ester RME
  • biodiesel As a waste product hereby glycerol is recovered.
  • biodiesel particularly from rapeseed, having as a renewable resource favorable CO 2 balance than fossil fuels, biodegradable and stable than for example Finblumenmethylester (SME) and produced as a diesel fuel during combustion less carbon black, is economically strongly promoted its production worldwide.
  • SME Clarblumenmethylester
  • the extraction of oil from plant seeds can be carried out by various methods. Usually, the oil is squeezed out of the seed or extracted after comminution of the seeds with organic solvents. Combination processes are also used in which, after a pressing step, the oil fraction remaining in the press cake is extracted with organic solvents.
  • the method used depends strongly on the further use of the press cake. In order to be able to serve as feed, no organic solvent must be contained and the remaining oil content should be low, in order to have an optimal energetic value of the protein-rich pressed cake for the interference into the animal feed.
  • the extraction method has the disadvantage of high equipment costs and high running costs.
  • the solvents eg hexane
  • Another disadvantage of the extraction method is that the oil quality achieved is low.
  • the oil contains high levels of phospholipids (100-600 ppm P), which must be removed before further processing into either cooking oil or biodiesel.
  • the permissible limit values in the edible oil industry are below 10 ppm P, preferably below 5 ppm P, and in the fuel industry below 14 ppm P, calculated in each case as phosphorus.
  • the reduction of the phospholipids serves to increase the storage stability, since the phospholipids are hygroscopic and thus attract water, which leads to turbidity in the oil.
  • the liberated phosphoric acids are aggressive during combustion and lead to faster wear of the engines.
  • Another disadvantage of the extraction method for the application of the extracted oil in the food industry is the high color density of the extraction oil, which must be reduced by adsorption.
  • Enzymes have also been used for the digestion of vegetable material to improve the yield of oil from oilseeds (cf., for example, WO 1991/013956 A1 or EP 0 113 165 A1). All such processes are based on the steps of a) crushing the oilseed by milling or pressing, b) adding water and enzyme whereby the moisture content increases to 20% -35% or higher, c) incubating for 6-24 hours at elevated temperature, d ) Pressing or centrifuging off the oil or drying to less than 10% residual moisture and extraction of the oil or a combination of pressing and extraction (cf., for example, Dominguez et al., 1995, Food Chem. 54: 223-231, Dominguez et al. 1994, Food Chem.
  • the method should not have the disadvantages of the above prior art.
  • a process is to be provided which leads to high yields of oil and to a low phosphatide and moisture content in the oil.
  • the method should also be able to use energy and time-saving and should lead to high yields of oil.
  • the method should be universally applicable, ie, for example, both for the production of oil for example for the production of biodiesel and for the production of cooking oil are suitable.
  • the method should be simple and inexpensive to handle and suitable for a wide variety of oilseeds.
  • the invention thus relates to a process for the production of oil from plant seeds, which comprises a) an aqueous, one or more cellulolytic and / or lipolytic and / or pectinolytic and / or proteolytic enzyme (s) and / or phytase-containing Sprayed solution on the seed, b) the seed thus obtained directly in a conventional manner a single or multi-stage pressing optionally in coupling with an extraction, and c) the oil in a conventional manner wins and optionally further processed.
  • the invention further relates to the use of this process in the production of edible oil and in the recovery of oil, e.g. for the production of biodiesel.
  • the enzyme solution is applied directly to the seed or, in the case of larger oil seeds, to the crushed or ground seed applied without significantly increasing the natural water content of the oilseed.
  • the enzyme solution can be sprayed directly onto the dry seed without having to incubate the enzyme-sprayed seed in water.
  • the seed can be sprayed as such or after comminution with an enzyme solution.
  • an aqueous solution containing the selected enzyme or the selected enzymes sprayed in a conventional manner on the seed.
  • the aqueous enzyme solution can be an enzyme solution obtained in a known manner from the culture supernatant of microorganisms (for example consisting of the steps: separation of the biomass from the culture fluid, concentration of the solution obtained by ultrafiltration and sterilization filtration) Stabilizer may contain. But it can also be plant enzymes, such as papain, contained in the enzyme solution.
  • the typical amount of enzyme solution applied is on the order of 1000 ppm, based on the weight of the oilseed.
  • the water applied by spraying the enzyme solution increases the natural water content of the seeds (4-8% w / w) only by about 0.1 to max. 2% (w / w) based on the weight of the seed.
  • the seed prepared in this way can then be fed directly to the compression without further incubation period and without further addition of water, and the oil can thereby be obtained.
  • the methods known in the art which use high water contents, for example to prevent product inhibition of the enzymes or to improve the diffusion of the enzymes to the substrates
  • the enzymes lead to a change in the cell walls, which improves the outflow of the oil during pressing. For this purpose, no complete degradation of the cell walls by the cellulases, hemicellulases or pectinases is necessary. Proteases help destroy the proteinaceous membrane that surrounds the oil body.
  • Phytase helps, especially in phytic acid-rich seeds such as soybean, to reduce the interaction of proteins via phytic acid bridges and thus to improve the oil flow during pressing.
  • the low water content also favors the pressing process in that it contributes to the fact that the press cake continues to be pressed in the press. is promoted and it can not build up due to large amounts of water no pressure on the seed and the press cake.
  • thermostable enzymes should be used for the process.
  • mesophilic and / or thermotolerant enzymes is also possible.
  • one or more enzymes are used which are capable of dissolving or at least partially perforating the cell walls or cell membranes of plant cells or loosening the membrane of the oleosins.
  • cellulolytic, hemicellulolytic, lipolytic, pectinolytic and / or proteolytic enzymes are used.
  • proteases can be used individually or in combination, depending on the structure of the seed, for example, the addition of proteases to protein-rich seed such as soybean is useful.
  • the addition of hemi-cellulolytic and pectinolytic enzymes is more useful in seeds, which increasingly contains these storage materials in the cell walls and thus use of cellulases alone would not cause sufficient effect in loosening or perforation of the cell wall.
  • pectinases which attack the protoplectin of the middle lamellae, can lead to an improved paste formation for the pressing and thus to an easier oil release.
  • galactomannanases may be advantageous, for example with soybeans. Frequently, these enzyme activities are contained in commercially available pectinase products in various proportions.
  • the enzyme is selected from natural or recombinantly produced cellulases, endoglucanases, cellobiohydroases, hemicellulases, peptidases, phospholipases, pectinases or phytases.
  • variants derived from the above enzymes may also be used, for example, recombinant enzymes prepared on the basis of the above enzymes, which contain parts of the above enzymes and are modified in their activity by addition or removal of substrate binding domains.
  • Corresponding enzymes are commercially available or can be prepared by a person skilled in the art. The enzymes can be used singly or in combination. The type and amount of enzyme used depends on the type and amount of seed to be treated.
  • the dosages are typically between 100 and 20,000 ppm (w / w), more preferably between 200 and 15,000 ppm (w / w), even more preferably between 500 and 10,000 ppm (w / w).
  • the dosage may be higher to account for the loss due to thermal inactivation or low residual activity at the higher temperatures during compression.
  • the pressure can be designed in one or more stages. In a multi-stage pressing the addition of the enzymes is also possible between the individual pressing stages.
  • the pressing can also be followed by an extraction step, without having to reduce the crushed material (shot) in its water content.
  • Methods for carrying out an oil pressing are well known to a person skilled in the art. After pressing, the oil is processed in a conventional manner.
  • the inventive method is characterized by an increased throughput of seed per unit time, as well as by an improved press capacity and press yield and a lower phospholipid or phosphatide content in the oil.
  • the increased yield and the increased pressing speed also reduce the energy requirement per ton of oil extracted. Since the water content by the application of the enzyme solution to the dry seed increases only slightly, the process comes with the use of extractants without a previous drying and thus has a significantly lower energy consumption in contrast to previously developed enzymatic processes, all the steps for reduction of the water content of> 25% to less than 10% in order not to reduce the yield in the extraction.
  • the inventive method has the advantage that the oil obtained is significantly reduced in phosphatide compared to conventional methods and thus, for example in multi-stage pressing process, degumming - ie the reduction of the phosphatide content - can be limited to small proportions of the recovered oil.
  • the process according to the invention is very suitable for the production of oil for the production of cooking oil or biodiesel.
  • Figure 1 shows the shortening of the pressing time by the use of Melanocarpus cellulase with a Trichoderma reesei CBH 1 cellulase binding domain (representation of 3-fold determinations).
  • the process according to the invention can be carried out with any of the abovementioned enzymes.
  • Preferred enzymes include cellulases, in particular endoglucanases, from Acremonium thermophilum belonging to the hydrolase family 45 (see http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/GHjntro.html for classification), cellulases, in particular endoglucanases, from Melanocarpus albomyces ( Hydrolase family 45) linked to a cellulase binding domain (CBD) of CBH 1 from Trichoderma reesei, or cellulases, especially cellobiohydrolases, from Thermoascus aurantiacus (Hydrolase family 7) bearing a cellulase binding domain (CBD) of CBF1 from Trichoderma reesei, endoglucanase II from Trichoderma reesei, and beta-glucosidase from Chaetomium thermophilum.
  • CBD cellulase binding domain
  • Preferred hemicellulases are Trichoderma reesei xylanase II, xylanases xlnA from Actinomadura flexuosa and Chaetomium thermophilum xylanase xylA.
  • Preferred pectinases are the pectinases from Aspergillus niger and Trichoderma reesei.
  • Preferred phospholipases are phospholipases of type C and / or phospholipases type A or B, such as, for example, the phospholipases from Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus or Thermomyces lanuginosus.
  • Preferred phytases are the phytase from Aspergillus niger, E. coli, Peniophora lysii or variants derived therefrom such as Nov9X or the Aspergillus consensus phytase.
  • the endo-1, 4-beta-glucanase activity is determined by hydrolysis of the substrate carbo- xymethyl-cellulose at pH 7, 50 0 C and an incubation time of 10 min.
  • the amount of reducing sugars released, based on glucose, after reaction with dinitrosalicylic acid is measured by photometric detection of the resulting color complex at 540 nm.
  • One unit of NCU is defined as the equivalent of the release of one nanomole of glucose per second.
  • the method is based on the method in Reference Example 1 and uses an incubation temperature of 60 0 C instead of 50 ° C.
  • the second deviation concerns the buffer.
  • the HEPES buffer is replaced with a 10 mM citrate buffer, pH 4.8.
  • the unit of enzyme activity is CMU g "1 .
  • Reference Example 3 Determination of cellobiohydrolase activity
  • CBHI Cellobiohydrolase
  • EGI endoglucanase
  • This reaction can be monitored photometrically by measuring the absorbance of 4-methylumbelliferone under alkaline conditions at 370 nm.
  • ⁇ -glucosidase activity in the sample is suppressed by 100 mM glucose in the reaction mixture.
  • the proportion of endoglucanase present can be measured individually by addition of 5 mM cellobiose in the reaction mixture, whereby the reaction of cellobihydrolase with 4-methylumbelliferyl-ß-D-lactoside is suppressed.
  • ⁇ -glucosidase hydrolyses the substrate 4-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside to 4-nitrophenol and glucose. The reaction is stopped by the addition of alkali and the yellow-colored 4-nitrophenol is detected photometrically.
  • One unit of BGU is defined as the equivalent of the release of one nanomole of 4-nitrophenol per second.
  • 1, 8 ml of substrate solution (1 mM 4-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside [Merck 6793] in 50 mM citrate buffer [Merck 6448], pH 4.8) are heated at 50 0 C for 5 min. Thereafter, 200 .mu.l of diluted enzyme solution are added and incubated at 50.degree. C. for 10 min. After 10 minutes, 1 ml of 1 M Na 2 CO 3 solution is added and the absorbance at 400 nm is measured against an identically treated reaction blank with water instead of enzyme solution.
  • the calibration curve is set up with 4-nitrophenol [Sigma 104-8].
  • the phosphatide content (also called phospholipid content) is expressed in ppm of phosphorus in the oil. It is determined by ashing at 85O 0 C with the addition of magnesium oxide as phosphomolybdate photometrically at 830 nm. For calibration K 2 HPO 4 is used.
  • the phosphatide content can also be determined by flame photometry using an AAS device directly in the oil.
  • the phosphatide content in the total oil of the rapeseed of Examples 1 to 3 extracted by the method according to Reference Example 6 with n-hexane was about 93 ppm P.
  • the rapeseed of Examples 1 to 3 contains 41% oil.
  • the oil obtained by pressing or by extraction from an oilseed is centrifuged at 12,000 x g for 5 minutes to separate suspended particles, and then the color is determined in a 1 cm cuvette at 508 nm against water in the photometer.
  • Example 1 Use of enzymes to increase the pressing speed
  • the press ran at a speed of 25 rpm and was equipped with a press head equipped with 12 mm opening and adjusted to a gap of 1, 5 mm.
  • the residence time of the rapeseed in the pressing head was about 1-2 minutes.
  • the press head was fitted with a thermosensor with a connected Roth measuring device to determine the temperature of the presshead.
  • the oil was collected in a glass bowl standing on a balance and the amount and the pressing speed and the temperature of the oil determined.
  • the press cake was placed in another shell standing on a separate balance and was then comminuted in a coffee grinder with impact mechanism for the determination of the residual oil content by extraction according to Reference Example 6.
  • the content of phosphatides in the extracted oil was very low at 6.5-8 ppm P, allowing direct further processing of the oil in the food industry and also for the production of biodiesel.
  • the values of the phosphatide content were 5% - 10% lower than those without enzyme addition. This was to be expected with the absolutely low Phosphatidiere.
  • the pressing head temperature without enzyme addition was in average over all three measure- ments at 77.0 0 C, whereas when using the endoglucanase, despite increased
  • the color of the pressed oil improved with enzyme addition from an average absorption of 0.801 AU to 0.776 AU. These values are significantly better than the color of the oil extracted from the rapeseed with only hexane of 1.2 AU and thus make it possible to reduce the use of bleaching agent / bleaching earth during processing to edible oil and to save costs.
  • thermoascus aurantiacus cellobiohydrolase carrying the T ⁇ choderma reesei CBH 1 cellulosic binding domain at the C-terminal end (for example prepared according to WO 2006/117432 A1) was used at a dosage of 180 PCU per kg rapeseed in the same experimental set-up.
  • the cellobiohydrolase has a molecular weight of about 46.2 kDa and the attached CBH1 linker and the CBH1 binding domain of about 6.8 kDa.
  • the enzyme shows a temperature optimum of about 65 ° C.
  • an increase in the throughput and thus a 10.8% higher amount of oil per unit time could be achieved hereby.
  • Example 2 Mesophilere enzymes than that in the tests 1 and 2, and Example 2 th verwende- as the endoglucanase I from Trichoderma reesei (described for example in EP 0137280 A1) with a temperature optimum of about 50 0 C, higher dosages could in also contribute to a shortening of the relative pressing time and thus to an increase in throughput.
  • a dosage of 376,000 BU per kg rapeseed an increase of throughput by 2,1% and at a dosage of 752,000 BU per kg of rapeseed an increase of throughput by 6,3% could be achieved.
  • Example 2 Use of Enzyme Mixtures to Increase the Pressing Speed and Improve the Yield of Pressed Oil
  • Example 1 An enzyme other than that used in Example 1 was used for the experiments, namely a neutral cellulase of Melanocarpus albomyces produced recombinantly with Trichoderma reesei and containing a Trichoderma reesei CBH1 cellulose binding domain, as described in WO 2006/117432 A1, and the endoglucanase produced by recombinant with Trichoderma reesei from Acremonium from Example 1, Experiment 1.
  • the Melanoca ⁇ us cellulase has a molecular weight of about 20.2 kDa and the attached linker with the CBD of cellobiohydrolase 1 from Trichoderma reesei has a molecular weight of about 6 , 8 kDa.
  • the enzyme has a temperature optimum of about 75 ° C.
  • the dosages were 64,400 CMC per kg rapeseed for Acremonium endoglucanase and 130,000 NCU per kg rapeseed for neutral melanocytic cellulase.
  • the sprayed amounts of the enzyme solutions were each 0.1% (w / w) based on the mass of rapeseed.
  • the enzyme solutions were sterile filtered ultrafiltrates with a dry matter content of about 15% (w / w).
  • the experimental setup was as in Example 1 except that the nozzle opening was only 10 mm instead of 12 mm. This allows better press results to be achieved.
  • the same oilseed rape (same batch) as used in Example 1 was also used, so that the results are directly comparable. The results are shown in Table 1.
  • Table 1 Use of a cellulase or an endoglucanase to improve the yield of oil in the press of oilseed rape and reducing the pressing time to obtain the same amount of oil.
  • the water approach used the same amount of water (0.1% w / w based on the weight of rapeseed) as applied to the enzyme solutions.
  • the relative pressing time is the time needed to get the same mass of oil.
  • the oil yield indicates the absolute yield of oil from the rapeseed, regardless of the duration of the pressing process.
  • the yield of oil can be increased during the pressing with the aid of appropriate enzymes.
  • the advantage of this oil is the low phosphatide content, which allows direct further processing without desliming. This is also true, in spite of about 10 0 C higher lying pressing head temperature as compared to the conditions in Experimental Example 1. This temperature increase is caused by the narrowing of the gap opening of the press and the thus caused higher pressing pressure.
  • the phosphatide content in the pressed oil increased as expected from 8 to 14 ppm P compared to the conditions with a larger nozzle (Example 4) and is thus above the limit for edible oil and at Limit on the content permitted for biodiesel production.
  • the phosphatide levels in the enzyme-supplemented oil as well as in Example 4 were at a lower level of only 8-9 ppm P.
  • the addition of enzyme has therefore also a positive effect on the lowering of the phosphatide contents in the pressed oil compared to oil, which was obtained without enzyme addition, impacted. This allows the further processing of the oil thus obtained directly without degumming to cooking oil, as well as to biodiesel.
  • Table 2 Determination of the phosphatide content of the residual oil extracted from the presscake.
  • the use of enzymes greatly inhibits the liberation of the remaining phosphatides upon extraction of the residual oil still remaining in the press cake (total oil minus press oil, about 16-17% of the total oil).
  • total oil minus press oil about 16-17% of the total oil.
  • total amount of oil * phosphatide content of the oil obtained by extraction The press oil contains only 0.274 to 0.309 mg P (press oil * phosphatide content in the press oil) and the subsequently extracted residual oil again 0.474 to 0.492 mg P (residual oil * phosphatide content in the residual oil).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Pflanzensamen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine wässrige, ein oder mehrere cellulolytische und/oder lipolytische und/oder pektinolytische und/oder proteolytische Enzym(e) und/oder Phytase enthaltende Lösung auf das Saatgut aufsprüht, b) das so erhaltene Saatgut direkt in an sich bekannter Weise einer ein- oder mehrstufigen Pressung gegebenenfalls in Kopplung mit einer Extraktion, zuführt, und c) das Öl in an sich bekannter Weise gewinnt und gegebenenfalls weiterverarbeitet sowie die Verwendung des Verfahrens insbesondere bei der Herstellung von Speiseöl oder Biodiesel.

Description

Verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Pflanzensamen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von öl aus Pflanzensamen unter Verwendung von Enzymen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem trockene ölsaaten mit Enzymen aufgesprüht werden ohne dabei den Feuchtigkeitsgehalt der ölsaat signifikant zu erhöhen und wonach die ölsaaten anschließend sofort gepresst werden können.
ölsaaten wie Sojabohne, Erdnuss, Baumwollsamen, Sonnenblumensamen, Maiskeime und Rapssamen (einschließlich Canola) stellen die Hauptquelle für essbare Pflanzenöle dar. Sie decken mehr als 70% der Weltproduktion an Fetten und ölen aus pflanzlichen Rohstoffen ab. Sojabohnen sind dabei mit 20% vertreten. Diese ölsaaten sind nicht nur die Hauptöllieferanten, sondern sind auch sehr gute Quellen für hochwertiges Protein, das häufig auch für Tierernährungszwecke eingesetzt wird.
In den letzten Jahren stieg der Bedarf an pflanzlichen ölen als Ersatz für fossile Brennstoffe. Besondere Bedeutung haben dabei Sojaöl in Nord- und Südamerika sowie Rapsöl (Doppelnullsorten; 00-Raps, bei dem Erucasäure und Glucosinolate züchterisch entfernt worden sind) in Europa und Kanada gewonnen. Die in Kana- da entwickelten und in ganz Nordamerika kultivierten Doppelnull-Rapssorten wurden ursprünglich aus Vermarktungsgründen als Canola (Canadian oil, low acid) bezeichnet. Mittlerweile wird Canola in weiten Teilen Amerikas und Australiens allgemein als Bezeichnung für Raps (eigentlich Rapeseed) verstanden. Tatsächlich unterscheidet sich Canola-Raps oder „kanadischer Raps" von den in Europa verbreiteten OO-Sorten. Viele der heutigen Canola-Sorten sind zudem transgen.
Neben seiner Nutzung als Speiseöl und als Rohstoff für Speisefette wird Raps in Deutschland hauptsächlich zur Herstellung technischer Produkte angebaut. Der Anbau von Winterraps in Deutschland zur Ernte 2004 beläuft sich auf rund 1 ,23 Millionen Hektar, was einer Rapssamenmenge von ca. 3,5 Millionen Tonnen entspricht. Weit über die Hälfte des in Deutschland produzierten Pflanzenöls ist mittlerweile Rapsöl. Weltweit lag die geerntete Menge an Raps in 2004/5 bei 46 MiIIi- onen Tonnen mit den Hauptanbaugebieten Europa, Kanada, USA, Australien, China und Indien. Der Anbau von Raps war danach die drittgrößte ölsaat nach Soja und Palmöl und wird auf ca. 13% der genutzten Ackerfläche angebaut. Die für den Rapsanbau genutzte Anbaufläche steigt weltweit weiter an.
Der Hauptteil des Rapses wird zur Produktion von Rapsölmethylester (RME) eingesetzt, der auch unter dem Begriff Biodiesel bekannt ist. Als Abfallprodukt wird hierbei Glycerin gewonnen.
Da Biodiesel, speziell aus Raps, als nachwachsender Rohstoff eine günstigere CO2-Bilanz als fossile Brennstoffe aufweist, biologisch abbaubar und stabiler ist als z.B. Sonnenblumenmethylester (SME) und bei der Verbrennung weniger Ruß als Dieselkraftstoff erzeugt, wird seine Produktion weltweit wirtschaftlich stark gefördert. In Europa lag in 2005 die hergestellte Menge an Biodiesel bei 4 Mio t, wovon 50% in Deutschland hergestellt wurden. Weltweit wurden in 2005 ca. 10 Mio t Biodiesel hergestellt. Die jährlichen Anbaumengen an Raps steigen weiter an.
Die Gewinnung von öl aus Pflanzensaaten kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Üblicherweise wird das Öl aus der Saat gepresst oder nach Zerkleinerung der Saat mit organischen Lösungsmitteln extrahiert. Es werden auch Kombinationsverfahren verwandt, bei denen nach einem Pressschritt der im Presskuchen verbliebene Ölanteil mit organischen Lösungsmitteln extrahiert wird. Das angewendete Verfahren hängt stark von der weiteren Verwendung des Presskuchens ab. Um als Futtermittel dienen zu können, darf kein organisches Lösungsmittel enthalten sein und der Restölgehalt sollte niedrig sein, um einen optimalen energetischen Wert des eiweißreichen Presskuchens für die Einmischung ins Tierfutter aufzuweisen. Die Extraktionsmethode hat den Nachteil hoher Anschaffungskosten für die Ausrüstung und hoher laufender Kosten. Zusätzlich stellen die Lösungsmittel (z.B. Hexan) Risiken dar sowohl in der Handhabung, wie auch in gesundheitlicher Hinsicht auf die im Trester enthaltenen Reste. Ein weiterer Nachteil der Extraktions- methode besteht darin, dass die erzielte Ölqualität nur gering ist. Das öl enthält hohe Gehalte an Phospholipiden (100 - 600 ppm P), die vor der weiteren Verarbeitung zu entweder Speiseöl oder auch zu Biodiesel entfernt werden müssen. Die zulässigen Grenzwerte liegen in der Speiseölindustrie unter 10 ppm P, bevorzugt unter 5 ppm P, und in der Kraftstoffindustrie unter 14 ppm P, jeweils berech- net als Phosphor. In der Speiseölindustrie dient die Reduktion der Phospholipide der Erhöhung der Lagerstabilität, da die Phospholipide hygroskopisch sind und somit Wasser anziehen, was zu Trübungen im öl führt. In der Kraftstoffindustrie sind die freigesetzten Phosphorsäuren bei der Verbrennung aggressiv und führen zu schnellerem Verschleiß der Motoren. Ein weiterer Nachteil der Extraktionsme- thode für die Anwendung des extrahierten Öls in der Lebensmittelindustrie ist die hohe Farbdichte des Extraktionsöls, die über Adsorptionsverfahren reduziert werden muss.
Ferner wurden auch Enzyme zum Aufschluss von pflanzlichem Material zur Ver- besserung der Ausbeute an öl aus ölsaaten eingesetzt (vgl. z.B. WO 1991/013956 A1 oder EP 0 113 165 A1). Alle derartigen Verfahren basieren auf den Schritten a) Zerkleinern der Ölsaat durch Mahlen oder Pressen, b) Zugabe von Wasser und Enzym wodurch der Feuchtigkeitsgehalt auf 20%-35% oder höher ansteigt, c) Inkubation über 6-24 h bei erhöhter Temperatur, d) Abpressen oder Abzentrifugieren des Öls oder Trocknen auf unter 10% Restfeuchtigkeit und Extraktion des Öls bzw. eine Kombination aus Pressen und Extrahieren (vgl. z.B. Dominguez et al., 1995, Food Chem. 54: 223-231 ; Dominguez et al., 1994, Food Chem. 49, 271-286). Insbesondere ist hier auf die Arbeiten von Dominguez et al., 1995, hinzuweisen, die an Soja durchgeführt wurden. Darin wird auf die Wichtig- keit des höheren Wassergehaltes in der Stufe der Enzymreaktion sowie auf den reduzierten Wassergehalt für die anschließende Extraktion verwiesen. Die Druckschrift „J Am OiI Chem Soc 1993, 70 (9), 825-829" beschreibt übersichtsartig die Verwendung einer Enzymbehandlung vor dem Auspressen von Öl- saaten sowie den Einfluss dieser Enzymbehandlung auf die Qualität des so erhaltenen Öls sowie die Energiebilanz des Verfahrens. Die Enzymbehandlung erfolgt dabei bei einem Feuchtigkeitsgehalt von 30% und 500C für sechs Stunden. Das so behandelte Saatgut wird vor dem Auspressen auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 6% getrocknet.
Nur unter Verwendung eines hohen Wassergehaltes während der Enzymreaktion haben sich als Enzyme, je nach ölsaat Cellulasen, Hemicellulasen, Proteasen oder Enzymmischungen aus Cellulasen, Pektinasen und Proteasen als wirkungsvoll erwiesen. Das Ziel der enzymatischen Behandlung ist die Schwächung und der partielle Abbau der Zellwände (primäre und sekundäre Zellwand) sowie die Zerstörung der Membranhülle, die das Öl umgibt. Für ersteres ist der Einsatz von Cellulasen, Hemicellulasen und Pektinasen möglich, für letzteres der Einsatz von Proteasen zur Hydrolyse der Oleosine. Das Ziel der enzymatischen Behandlung ist die Schwächung der Zellwände und Membranen, die das öl einschließen, um eine erleichterte Gewinnung zu ermöglichen.
Diese Verfahren sind sehr zeitaufwendig und energieintensiv, insbesondere um den für die Enzymreaktion erforderlichen hohen Wassergehalt vor den Press- o- der Extraktionsschritten zu verringern. Auch der für die Inkubation zur Verfügung zu stellende Platz ist sehr groß, wenn man den durchschnittlichen Tagesdurchsatz einer Ölmühle von 200-1000 1 gewonnenem öl pro Tag zu Grunde legt.
Es besteht somit ein Bedarf nach verbesserten Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Pflanzensamen, bei denen die vorstehenden Nachteile des Stands der Technik nicht auftreten.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Pflanzensamen bereitzustellen. Das Verfahren soll nicht die Nachteile des vorstehenden Stands der Technik aufweisen. Ins- besondere soll erfindungsgemäß ein Verfahren bereitgestellt werden, das zu hohen Ausbeuten an Öl sowie zu einem geringen Phosphatid- und Feuchtigkeitsgehalt in dem Öl führt. Das Verfahren soll sich ferner energie- und zeitsparend einsetzen lassen und soll zu hohen Ausbeuten an öl führen. Ferner soll das Verfah- ren universell einsetzbar sein, d.h. sich beispielsweise sowohl zur Gewinnung für Öl z.B. zur Erzeugung von Biodiesel als auch zur Gewinnung von Speiseöl eignen. Ferner soll das Verfahren einfach und kostengünstig handhabbar sein und sich für eine breite Vielzahl von ölsaaten eignen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch Besprühen der trockenen ölsaaten mit Enzymen ein Verfahren zur Gewinnung von öl aus Pflanzensamen erhalten werden kann, das mit erhöhten Ausbeuten an öl, einer verringerten Pressdauer und einem verringerten Phosphatidgehalt im öl, verglichen mit Ölen aus konventionellen Pressungen, einhergeht. Ferner wird durch das erfindungs- gemäße Verfahren der Feuchtigkeitsgehalt der ölsaat in keinem Schritt der Verarbeitung signifikant erhöht.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Gewinnung von öl aus Pflanzensamen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) eine wässrige, ein oder mehrere cellulolytische und/oder lipolytische und/oder pektinolytische und/oder proteolytische Enzym(e) und/oder Phytase enthaltende Lösung auf das Saatgut aufsprüht, b) das so erhaltene Saatgut direkt in an sich bekannter Weise einer ein- oder mehrstufigen Pressung gegebenenfalls in Kopplung mit einer Extraktion zuführt, und c) das öl in an sich bekannter Weise gewinnt und gegebenenfalls weiterverarbeitet.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieses Verfahrens bei der Herstellung von Speiseöl und bei der Gewinnung von öl z.B. für die Herstellung von Biodiesel.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Enzymlösung direkt auf das Saatgut oder bei größeren Ölsaaten auf das zerquetschte oder gemahlene Saatgut aufgetragen, ohne dass der natürliche Wassergehalt der ölsaat dadurch signifikant zunimmt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Enzymlösung direkt auf das trockene Saatgut aufgesprüht werden kann, ohne dass eine Inkubation des mit Enzym besprühten Saatguts in Wasser erfolgen muss. Das Saatgut kann als solches oder nach Zerkleinerung mit einer Enzymlösung besprüht werden. Dabei wird eine wässrige Lösung, die das gewählte Enzym bzw. die gewählten Enzyme enthält, in an sich bekannter Weise auf das Saatgut aufgesprüht. Bei der wässrigen Enzymlösung kann es sich um eine auf bekannte Art und Weise aus dem Kulturüberstand von Mikroorganismen gewonnene Enzymlösung han- dein (z.B. bestehend aus den Schritten: Abtrennen der Biomasse von der Kulturflüssigkeit, Aufkonzentrieren der gewonnenen Lösung durch Ultrafiltration und Entkeimungsfiltration), die auch Stabilisierungsmittel enthalten kann. Es können aber auch pflanzliche Enzyme, wie z.B. Papain, in der Enzymlösung enthalten sein. Die typische Menge an aufgetragener Enzymlösung liegt in der Größenord- nung von 1.000 ppm bezogen auf das Gewicht der ölsaat. Das durch das Aufsprühen der Enzymlösung aufgebrachte Wasser erhöht den natürlichen Wassergehalt der Saaten (4-8% w/w) nur um ca. 0,1 bis max. 2% (w/w) bezogen auf die Masse des Saatguts. Das so vorbereitete Saatgut kann dann ohne weitere Inkubationsperiode und ohne weitere Wasserzugabe direkt der Pressung zugeführt werden und das öl dabei gewonnen werden. Im Gegensatz zu den im Stand der Technik bekannten Verfahren, die hohe Wassergehalte nutzen, um z.B. Produktinhibition der Enzyme zu verhindern oder die Diffusion der Enzyme an die Substrate zu verbessern, ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ausreichend, den natürlichen Wassergehalt der ölsaat zu benutzen. Die Enzyme führen zu ei- ner Veränderung der Zellwände, wodurch das Ausfließen des Öls bei der Pressung verbessert wird. Hierzu ist kein vollständiger Abbau der Zellwände durch die Cellulasen, Hemicellulasen oder Pektinasen nötig. Proteasen helfen die protein- haltige Membran, die den Ölkörper umgibt, zu zerstören. Phytase hilft, insbesondere bei Phytinsäure reichen Saaten wie Soja, die Wechselwirkung der Proteine über Phytinsäurebrücken zu vermindern und damit den ölfluss bei der Pressung zu verbessern. Durch den geringen Wassergehalt wird auch das Pressverfahren begünstigt in dem er dazu beiträgt, dass der Presskuchen in der Presse weiterbe- fördert wird und es sich nicht aufgrund großer Wassermengen kein Pressdruck auf das Saatgut und den Presskuchen aufbauen kann.
Da bei der Pressung, je nach Pressdruck, die Temperatur stark ansteigen kann, zum Teil bis über 1000C im Presskuchen, sollten für das Verfahren bevorzugt thermostabile Enzyme zum Einsatz kommen. Der Einsatz mesophiler und/oder thermotoleranter Enzyme ist jedoch auch möglich. Erfindungsgemäß werden ein oder mehrere Enzyme verwendet, die in der Lage sind, die Zellwände bzw. Zellmembranen von pflanzlichen Zellen aufzulösen bzw. zumindest partiell zu perfo- rieren, bzw. die Membran der Oleosine zu lockern. Insbesondere werden celluloly- tische, hemicellulolytische, lipolytische, pektinolytische und/oder proteolytische Enzyme eingesetzt. Diese Enzyme können einzeln oder auch in Kombination eingesetzt werden, je nach dem Aufbau des Saatgutes, z.B. ist der Zusatz von Proteasen zu proteinreichem Saatgut wie Sojabohnen sinnvoll. Der Zusatz von hemi- cellulolytischen und pektinolytischen Enzymen ist sinnvoller bei Saatgut, das vermehrt diese Speicherstoffe in den Zellwänden enthält und somit ein Einsatz von Cellulasen alleine keine ausreichende Wirkung in der Lockerung oder Perforierung der Zellwand hervorrufen würde. Der Einsatz von Pektinasen, die das Proto- pektin der Mittellamellen angreifen, kann zu einer verbesserten Pastenbildung für die Pressung und damit zu einer erleichterten ölfreisetzung führen. Der Einsatz von Galactomannanasen kann z.B. bei Sojabohnen von Vorteil sein. Häufig sind diese Enzymaktivitäten in handelsüblichen Pektinaseprodukten in verschieden hohen Anteilen enthalten. Insbesondere ist das Enzym ausgewählt aus natürlichen oder rekombinant hergestellten Cellulasen, Endoglucanasen, Cellobiohydro- lasen, Hemicellulasen, Peptidasen, Phospholipasen, Pektinasen oder Phytasen. Ferner können auch aus den vorstehenden Enzymen abgeleitete Varianten verwendet werden, beispielsweise auf der Grundlage der vorstehenden Enzyme hergestellte rekombinante Enzyme, die Teile der vorstehenden Enzyme enthalten und durch Anfügen bzw. Entfernen von Substratbindungsdomänen in ihrer Aktivi- tat modifiziert sind. Entsprechende Enzyme sind im Handel erhältlich bzw. können von einem Fachmann hergestellt werden. Die Enzyme können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Die Art und die Menge des eingesetzten Enzyms hängt dabei von der Art und der Menge des zu behandelnden Saatguts ab. Bezogen auf die vorliegenden Enzymprodukte betragen die Dosagen in der Regel zwischen 100 und 20.000 ppm (w/w), bevorzugter zwischen 200 und 15.000 ppm (w/w), noch bevorzugter zwischen 500 und 10.000 ppm (w/w). Bei mesophilen Enzymen kann die Dosage höher liegen, um dem Verlust durch die thermische Inaktivierung, bzw. die geringe Restaktivität bei den höheren Temperaturen während der Pressung Rechnung zu tragen.
Die Pressung kann einstufig oder mehrstufig gestaltet sein. Bei einer mehrstufigen Pressung ist der Zusatz der Enzyme auch zwischen den einzelnen Pressstufen möglich. Der Pressung kann sich auch ein Extraktionsschritt anschließen, ohne dass das Pressgut (Schrot) in seinem Wassergehalt reduziert werden muss. Verfahren zur Durchführung einer ölpressung sind einem Fachmann gut bekannt. Nach der Pressung wird das Öl in an sich bekannter Weise weiterverarbeitet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch einen erhöhten Durchsatz an Saatgut pro Zeiteinheit, wie auch durch eine verbesserte Pressleistung und Pressausbeute sowie einen geringeren Phospholipid- bzw. Phosphatidgehalt im öl aus. Durch die erhöhte Ausbeute und die erhöhte Pressgeschwindigkeit sinkt auch der Energiebedarf pro t gewonnenem öl. Da der Wassergehalt durch das Aufbringen der Enzymlösung auf das trockene Saatgut nur geringfügig zunimmt, kommt das Verfahren bei Einsatz von Extraktionsmitteln auch ohne eine vorhergehende Trocknung aus und weist damit einen deutlich geringeren Energiebedarf im Gegensatz zu bisher entwickelten enzymatischen Verfahren auf, die alle Schritte zur Reduktion des Wassergehaltes von >25% bis unter 10% enthielten, um die Ausbeute bei der Extraktion nicht zu verringern.
Ferner besitzt das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass das gewonnene öl gegenüber herkömmlichen Verfahren deutlich im Phosphatidgehalt reduziert ist und sich damit, z.B. bei mehrstufigen Pressverfahren, die Entschleimung - also die Reduktion des Phosphatidgehaltes - auf kleine Anteile des gewonnenen Öls beschränken lässt.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sehr gut bei der Gewinnung von öl für die Herstellung von Speiseöl oder Biodiesel.
Die beigefügte Figur erläutert die Erfindung näher:
Figur 1 zeigt die Verkürzung der Presszeit durch den Einsatz von Melanocarpus Cellulase mit einer Trichoderma reesei CBH 1 Cellulase-Bindungsdomäne (Darstellung von 3-fach-Bestimmungen).
Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren mit beliebigen der vorstehend genannten Enzyme durchgeführt werden.
Als bevorzugte Enzyme haben sich Cellulasen, insbesondere Endoglucanasen, aus Acremonium thermophilum, die der Hydrolasefamilie 45 angehören (Einteilung siehe http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/GHjntro.html), Cellulasen, insbesondere Endoglucanasen, aus Melanocarpus albomyces (Hydrolasefamilie 45), die mit ei- ner Cellulase-Bindungsdomäne (CBD) von CBH 1 aus Trichoderma reesei verbunden wurden, oder Cellulasen, insbesondere Cellobiohydrolasen, aus Thermoas- cus aurantiacus (Hydrolasefamilie 7), die mit einer Cellulase-Bindungsdomäne (CBD) von CBH1 aus Trichoderma reesei verbunden wurden, die Endoglucanase Il aus Trichoderma reesei und die Beta-Glucosidase aus Chaetomium thermophi- lum herausgestellt. Bevorzugte Hemicellulasen sind die Trichoderma reesei XyIa- nase II, die Xylanasen xlnA aus Actinomadura flexuosa und die Chaetomium thermophilum Xylanase xylA. Bevorzugte Pektinasen sind die Pektinasen aus Aspergillus niger und Trichoderma reesei. Bevorzugte Phospholipasen sind Phospholipasen vom Typ C und/oder Phospholipasen Typ A oder B, wie z.B. die Phospholipasen aus Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus oder Thermomy- ces lanuginosus. Bevorzugte Phytasen sind die Phytase aus Aspergillus niger, E. coli, Peniophora lysii oder daraus abgeleitete Varianten wie Nov9X oder die Aspergillus Consensus Phytase.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
Referenzbeispiel 1 : Bestimmung der Aktivität der neutralen Cellulase
Die Endo-1 ,4-ß-glucanase-Aktivität wird durch Hydrolyse des Substrates Carbo- xymethyl-Cellulose bei pH 7, 500C und einer Inkubationszeit von 10 min bestimmt. Gemessen wird die freigesetzte Menge an reduzierenden Zuckern, bezogen auf Glucose, nach Reaktion mit Dinitrosalicylsäure durch photometrische Detektion des entstandenen Farbkomplexes bei 540 nm. Eine Einheit NCU ist definiert als das Äquivalent, dass der Freisetzung von einem Nanomol Glucose pro Sekunde entspricht.
1 ,8 ml Substratlösung (3% CMC [Sigma C-56778, low viscosity] in 10 mM HEPES Puffer pH 7,0 [Sigma H-3375] werden für 5 min bei 50°C temperiert und dann mit 200 μl verdünnter Enzymlösung versetzt und für 10 min inkubiert. Danach werden 3 ml DNS Reagenzlösung (10 g I"1 Dinatriumsalicylsäure [Sigma D-0550], 16 g I"1 NaOH, 300 g I"1 K-Na-Tartrat [Merck 8087]) zugegeben und für 5 min im kochenden Wasserbad inkubiert. Die Messungen der Absorption werden gegen einen gleichbehandelten Reaktionsblindwert mit Wasser statt Enzymlösung durchgeführt.
Referenzbeispiel 2: Bestimmung der Aktivität thermostabiler saurer
Cellulasen
Die Methode ist an die Methode in Referenzbeispiel 1 angelehnt und nutzt eine Inkubationstemperatur von 600C anstatt 50°C. Die zweite Abweichung betrifft den Puffer. Der HEPES Puffer wird durch einen 10 mM Citratpuffer, pH 4,8 ersetzt. Die Einheit der Enzymaktivität ist CMU g"1. Referenzbeispiel 3: Bestimmung der Cellobiohydrolaseaktivität
Cellobiohydrolase (CBHI) und Endoglucanase (EGI) hydrolysieren das Substrat 4- Methylumbelliferyl-ß-D-lactosid, und setzen dabei 4-Methylumbelliferon (7- Hydroxy-4-methylcumarin) frei. Diese Reaktion kann photometrisch verfolgt werden durch Messung der Absorption von 4-Methylumbelliferon unter alkalischen Bedingungen bei 370 nm. ß-Glucosidase Aktivität in der Probe wird unterdrückt durch 100 mM Glucose in der Reaktionsmischung. Eine PCU Einheit ist definiert als die Menge Enzymaktivität, die ein nmol 4-Methylumbelliferon aus 4- Methylumbelliferyl-ß-D-lactosid unter den Versuchsbedingungen (pH 5,0, 500C, 10 min Inkubationszeit) pro Sekunde freisetzt (1 PCU=I nkat).
Der Anteil anwesender Endoglucanase kann einzeln gemessen werden durch Zusatz von 5 mM Cellobiose im Reaktionsansatz, wodurch die Reaktion der Cellobi- ohydrolase mit 4-Methylumbelliferyl-ß-D-lactosid unterbunden wird.
250 μl Substratlösung (1 mM 4-Methylumbelliferyl-ß-D-lactosid [Sigma M-2405] in 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 und 50 μl 1 M Glucoselösung in 50 mM Natri- umacetatpuffer werden für 10 min bei 500C temperiert. Nach Zugabe von 200 μl verdünnter Enzymlösung wird gemischt und für 10 min bei 500C inkubiert. Dann wird 1 ml 1M Natriumcarbonatlösung zum Abstoppen der Enzymreaktion zugegeben und die Absorption gegen einen gleichbehandelten Blindwert mit Wasser anstatt Enzymlösung bei 370 nm gemessen.
Zur Kalibrierung wird 7-Hydroxy-4-methylcumarin [Aldrich 12,872-4] gelöst in 1 M Natriumcarbonat verwendet.
Referenzbeispiel 4: Bestimmung der ß-Glucosidaseaktivität
ß-Glucosidase hydrolysiert das Substrat 4-Nitrophenyl-ß-D-Glucopyranosid zu 4- Nitrophenol und Glucose. Die Reaktion wird durch Zugabe von Alkali gestoppt und das sich dabei gelb färbende 4-Nitrophenol wird photometrisch detektiert. Eine Einheit BGU ist definiert als das Äquivalent, das der Freisetzung von einem Nanomol 4-Nitrophenol pro Sekunde entspricht.
1 ,8 ml Substratlösung (1 mM 4-Nitrophenyl-ß-D-Glucopyranosid [Merck 6793] in 50 mM Citratpuffer [Merck 6448], pH 4,8) werden bei 500C für 5 min temperiert. Danach werden 200 μl verdünnte Enzymlösung zugegeben und für 10 min bei 50°C inkubiert. Nach 10 min wird 1 ml 1 M Na2CO3 Lösung zugegeben und die Absorption bei 400 nm gegen einen gleichbehandelten Reaktionsblindwert mit Wasser anstatt Enzymlösung gemessen.
Die Kalibrierkurve wird mit 4-Nitrophenol [Sigma 104-8] aufgestellt.
Referenzbeispiel 5: Bestimmung des Phosphatidgehalts im Öl
Der Phosphatidgehalt (oder auch Phospholipidgehalt genannt) wird ausgedrückt in ppm Phosphor im Öl. Er wird nach Veraschung bei 85O0C unter Zugabe von Magnesiumoxid als Phosphomolybdatkomplex photometrisch bei 830 nm bestimmt. Zur Kalibrierung wird K2HPO4 benutzt.
Der Phosphatidgehalt kann auch flammenphotometrisch mit Hilfe eines AAS- Gerätes direkt im Öl bestimmt werden.
Der Phosphatidgehalt im mit nach dem Verfahren nach Referenzbeispiel 6 mit n- Hexan extrahierten Gesamtöl des Rapssamens der Beispiele 1 bis 3 betrug ca. 93 ppm P.
Referenzbeispiel 6: Bestimmung des Ölgehalts mittels Soxhletverfahrens
15 g gemahlene Rapssamen oder 20-25 g zerkleinertes Extraktionsschrot werden in eine Extraktionshülse [Sartorius Best Nr. FT-1210-033080] gegeben und in einer Soxhlet Apparatur über 4 h mit n-Hexan reinst (Merck) extrahiert. Die Menge an gewonnenem Öl wird nach Verdunsten des Lösungsmittels im Vakuum ausgewogen.
Der Rapssamen der Beispiele 1 bis 3 enthält 41% Öl.
Referenzbeispiel 7: Bestimmung der Farbe von Öl
Das durch Pressung oder durch Extraktion aus einer ölsaat gewonnene öl wird bei 12.000 x g für 5 min zur Abtrennung von Schwebeteilchen zentrifugiert und dann die Farbe in einer 1 cm Küvette bei 508 nm gegen Wasser im Photometer bestimmt.
Das mit Hexan extrahierte Gesamtöl nach Referenzbeispiel 6 des mit einer Schlagmühle zerkleinerten Rapssamens der Beispiele 1 bis 3 hatte eine Absorpti- on von 1 ,2 AU und damit eine sehr starke Eigenfarbe.
Beispiel 1: Einsatz von Enzymen zur Erhöhung der Pressgeschwindigkeit
Versuch 1 :
Für den folgenden Versuch wurde eine rekombinant mit Trichoderma reesei hergestellte Acremonium thermophilum-Endog\ucanase mit einem Molekulargewicht von ca. 28,6 kDa und einem Temperaturoptimum von ca. 75°-80°C verwendet, wie z.B. in Fl 20051318 beschrieben. Auf dunklen Rapssamen der Firma DKSH, Niederlande, Ernte 2005, mit einem Wassergehalt von 6,5% (w/w) wurde die En- zymlösung (Endoglucanase), ein steril filtriertes Ultrafiltrationskonzentrat mit einer Trockenmasse von ca. 15%, mittels einer Kolbenhubspritze fein vernebelt aufgesprüht (0,1 % w/w) und der Rapssamen anschließend für 30 s gut durchgemischt. Die Dosage der Endoglucanase lag bei 64.400 CMC je kg Rapssamen. Der so vorbereitete Raps wurde einer einstufigen Pressung in einer Ölpresse, z.B. vom Typ Ölprinz, der Firma Kernkraft (www.oelpresse.de), Deutschland, unterzogen. Die Presse lief dabei mit einer Drehzahl von 25 upm und war mit einem Presskopf mit 12 mm Öffnung bestückt und auf ein Spaltmaß von 1 ,5 mm eingestellt. Die Aufenthaltszeit des Rapses im Presskopf betrug ca. 1-2 min. Im Presskopf steckte ein Thermosensor mit einem angeschlossenen Messgerät der Firma Roth zur Bestimmung der Presskopftemperatur. Das Öl wurde in einer auf einer Waage stehenden Glasschale aufgefangen und die Menge und die Pressgeschwindigkeit sowie die Temperatur des Öls bestimmt. Der Presskuchen gelangte in eine weitere auf einer separaten Waage stehende Schale und wurde anschließend in einer Kaffeemühle mit Schlagwerk für die Bestimmung des Restölgehaltes durch Extraktion nach Referenzbeispiel 6 zerkleinert.
Die Auswirkung von Äcremon/uAn-Endoglucanase auf die Pressgeschwindigkeit ist in Figur 1 dargestellt. Es wurden drei Wiederholungen des Versuchs mit und ohne Enzymzusatz durchgeführt. Es wurde immer die gleiche Menge an Rapssamen eingesetzt, so dass die erzielte ausgepresste ölmenge jeweils ca. 600 g betrug. Wie Figur 1 zeigt, ist eine sehr hohe Wiederholbarkeit über die verwendete Presszeit von ca. 22 min gegeben. Zwischen den einzelnen Wiederholungsmessungen ergeben sich keine signifikanten Abweichungen. Die Erhöhung des Durchsatzes an Raps durch die Ölmühle und damit eine Verkürzung der Presszeit zur Erzielung einer konstanten Ausbeute an öl wurde in allen drei Durchgängen erreicht. Die Verbesserung der Pressleistung der Ölmühle führte zu einer Steigerung des erhaltenen Öls pro Stunde um 6,6%.
Die Phosphatidgehalte im ausgepressten Öl waren mit 6,5-8 ppm P sehr gering und ermöglichen eine direkte Weiterverarbeitung des Öls in der Speiseindustrie und auch für die Herstellung von Biodiesel. Die Werte des Phosphatidgehaltes lagen 5% - 10% unter denen der Pressungen ohne Enzymzusatz. Dies ist bei den absolut geringen Phosphatidgehalten zu erwarten gewesen.
Die Presskopftemperatur ohne Enzymzusatz lag im Mittelwert über alle drei Mes- sungen bei 77,00C, wohingegen bei Einsatz der Endoglucanase, trotz erhöhtem
Rapsdurchsatz pro Zeiteinheit und damit einer potentiell höheren Reibung im
Presskopf, die Temperatur im Mittelwert über alle drei Messungen nur auf Werte von 75,4°C anstieg. Dies zeigt deutlich, dass mit Enzymzusatz eine effizientere und für das Öl schonendere Pressung vorlag.
Die Farbe des gepressten Öls verbesserte sich mit Enzymzusatz von einer Ab- sorption im Mittel von 0,801 AU auf 0,776 AU. Diese Werte sind deutlich besser als die Farbe des nur mit Hexan extrahierten Öls aus dem Rapssamen von 1 ,2 AU und ermöglichen so den Einsatz von Bleichmittel/Bleicherde bei der Weiterverarbeitung zu Speiseöl zu vermindern und Kosten zu sparen.
Versuch 2:
In diesem Versuch wurde bei gleichem Versuchsaufbau eine Cellobiohydrolase aus Thermoascus aurantiacus, die die Tήchoderma reesei CBH 1 Cellulosebin- dungsdomäne am C-terminalen Ende trägt, (z.B. hergestellt gemäß WO 2006/117432 A1) in einer Dosage von 180 PCU je kg Rapssamen eingesetzt. Die Cellobiohydrolase hat ein Molekulargewicht von ca. 46,2 kDa und der angehängte CBH1 Linker und die CBH1 Bindungsdomäne von ca. 6,8 kDa. Das Enzym zeigt ein Temperaturoptimum von ca. 65°C. Wie auch bei der Cellulase aus Versuch 1 , konnte hiermit eine Erhöhung des Durchsatzes und damit eine um 10,8% höhere ölmenge je Zeiteinheit erzielt werden.
Versuch 3:
Mesophilere Enzyme als die in den Versuchen 1 und 2, bzw. Beispiel 2 verwende- ten, wie die Endoglucanase I aus Tήchoderma reesei mit einem Temperaturoptimum von ca. 500C (z.B. beschrieben in EP 0 137 280 A1), konnten in höheren Dosagen ebenfalls zu einer Verkürzung der relativen Presszeit und damit zu einer Durchsatzerhöhung beitragen. In einer Dosage von 376.000 BU je kg Rapssamen konnte eine Erhöhung des Durchsatzes um 2,1% und bei einer Dosage von 752.000 BU je kg Rapssamen eine Erhöhung des Durchsatzes um 6,3% erzielt werden. Beispiel 2: Einsatz von Enzymmischungen zur Erhöhung der Pressgeschwindigkeit und Verbesserung der Ausbeute an gepresstem Öl
Für die Versuche wurde ein anderes Enzym als in Beispiel 1 verwendet, nämlich eine rekombinant mit Trichoderma reesei hergestellte neutrale Cellulase aus Me- lanocarpus albomyces, die eine Trichoderma reesei CBH1 Cellulosebindungsdo- mäne enthält, wie es in der WO 2006/117432 A1 beschrieben ist, sowie die rekombinant mit Trichoderma reesei hergestellte Endoglucanase aus Acremonium aus Beispiel 1 , Versuch 1. Die Melanocaφus Cellulase hat ein Molekulargewicht von ca. 20,2 kDa und der angehängte Linker mit der CBD der Cellobiohydrolase 1 aus Trichoderma reesei hat ein Molekulargewicht von ca. 6,8 kDa. Das Enzym hat ein Temperaturoptimum von ca. 75°C. Die Dosagen lagen bei 64.400 CMC je kg Rapssamen für die Endoglucanase aus Acremonium und 130.000 NCU je kg Rapssamen für die neutrale Cellulase aus Melanocaφus. Die aufgesprühten Mengen der Enzymlösungen betrugen jeweils 0,1% (w/w) bezogen auf die Masse des Rapssamens. Die Enzymlösungen waren steril filtrierte Ultrafiltrate mit einer Trockenmasse von ca. 15% (w/w). Der experimentelle Aufbau war wie in Beispiel 1 mit Ausnahme, dass die Düsenöffnung statt 12 mm nur 10 mm betrug. Damit lassen sich bessere Pressergebnisse erzielen. Es wurde auch der gleiche Raps (gleiche Charge) wie in Beispiel 1 verwendet, so dass die Ergebnisse direkt vergleichbar sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1 : Einsatz einer Cellulase bzw. einer Endoglucanase zur Verbesserung der Ausbeute an Öl bei der Pressung von Raps und Verringerung der Presszeit zum Erzielen der gleichen ölmenge. Bei dem Ansatz Wasser wurde die gleiche Menge Wasser (0,1% (w/w) bezogen auf die Masse Rapssamen) wie sie bei den Enzymlösungen aufgetragen wird, eingesetzt.
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* Die relative Presszeit ist die Zeit, die benötigt wird um die gleiche Masse an öl zu erhalten.
**Die ölausbeute gibt die absolut erhaltene Ausbeute an Öl aus dem Rapssamen an, unabhängig von der Laufzeit des Pressvorganges.
Wie die Ergebnisse zeigen, kann bei korrekt gewählten Pressparametern, insbesondere der Wahl der Düsenöffnung der Presse, mit Hilfe entsprechender Enzyme die Ausbeute an Öl bei der Pressung erhöht werden. Der Vorteil dieses Öls ist der niedrige Phosphatidgehalt, der eine direkte Weiterverarbeitung ohne Ent- schleimung ermöglicht. Dies gilt auch, trotz der um ca. 100C höher liegenden Presskopftemperatur im Vergleich zu den Bedingungen in Versuch Beispiel 1. Diese Temperaturerhöhung ist durch die Verengung der Spaltöffnung der Presse und dem hierdurch hervorgerufenen höheren Pressdruck bedingt.
Im Blindwert und dem zu Vergleichszwecken durchgeführten Versuch mit Wasser ohne Enzym stieg der Phosphatidgehalt im gepressten öl gegenüber den Bedingungen mit größerer Düse (Beispiel 4) erwartungsgemäß von 8 auf bis zu 14 ppm P an und liegt damit über dem für Speiseöl geltenden Grenzwert und an der Grenze für das für die Biodieselherstellung zulässigen Gehaltes. Jedoch lagen die Phosphatidgehalte im mit Enzymzusatz gepressten öl wie auch in Beispiel 4 auf niedrigerem Niveau von nur 8-9 ppm P. Der Enzymzusatz hat sich also auch positiv auf die Erniedrigung der Phosphatidgehalte im gepressten öl im Vergleich zu öl, das ohne Enzymzusatz erhalten wurde, ausgewirkt. Dies ermöglicht die Weiterverarbeitung des so gewonnenen Öls direkt ohne Entschleimung zu Speiseöl, wie auch zu Biodiesel.
Weiterhin konnte die Zeit, die benötigt wird um die gleiche Menge an gepresstem öl zu erhalten (relative Presszeit), nochmals deutlich verkürzt werden und somit der Durchsatz der Ölmühlen gesteigert werden. Die relativen Laufzeiten bzw. Presszeiten waren nicht nur um 6% kürzer, sondern verkürzten sich sogar um bis zu 14,6%.
Ähnliche Ergebnisse ließen sich auch mit einer rekombinant mit T. reesei hergestellten beta-Glucanase aus Chaetomium thermophilum mit einem Molekulargewicht on ca. 76,4 kDa und einem Temperaturoptimum von 65°C, hergestellt zum Beispiel wie in FI20051318 beschrieben, erreichen. Die Dosage lag hierbei bei 17.840 BGU je kg Rapssamen. Sowohl die Raumzeitausbeute (Erhaltenes öl je Gerät, kg Rapssamen und Zeiteinheit) stieg um 3% wie auch die absolute ölaus- beute durch Pressung insgesamt um 2%.
Beispiel 3: Auswirkung des Enzymeinsatzes auf den Phosphatidgehalt im Restölextrakt
In den Versuchen der Beispiele 1 und 2 wurde der gesammelte Presskuchen homogenisiert und zerkleinert. Aus aliquoten Anteilen des zerkleinerten Presskuchens wurde das noch im Presskuchen enthaltene Öl, auch Restöl genannt, nach Referenzbeispiel 6 extrahiert und darin der Phosphatidgehalt nach Referenzbeispiel 5 bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 2: Bestimmung des Phosphatidgehalts des aus dem Presskuchen extrahierten Restöls.
Figure imgf000020_0001
* Bei diesem Ansatz wurde der Rapssamen nur zerkleinert und dann direkt mit n-Hexan extrahiert ohne eine vorgeschaltete Pressung. ** In diesem Ansatz wurde kein Enzym zugesetzt und der Rapssamen direkt gepresst.
*** Pressöl: durch Pressung erhaltenes öl
**** Gesamtöl: durch Extraktion des zerkleinerten Rapssamen erhaltene Ölmenge. n.a. nicht anwendbar
Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, wird durch den Einsatz von Enzymen die Freisetzung der restlichen Phosphatide bei Extraktion des noch im Presskuchen verbliebenen Restöls (Gesamtöl minus Pressöl; ca. 16-17% des Gesamtöls) stark verhindert. Wenn das gesamte öl extrahiert wird, so werden ca. 3,5 bis 4,0 mg P an Phospholipiden mitextrahiert (Gesamtmenge öl * Phosphatidgehalt des durch Extraktion erhaltenen Öls). Das Pressöl enthält nur 0,274 bis 0,309 mg P (Pressöl * Phosphatidgehalt im Pressöl) und das anschließend extrahierte Restöl nochmals 0,474 bis 0,492 mg P (Restöl * Phosphatidgehalt im Restöl). Dadurch verbleiben durch den Enzymeinsatz im Presskuchen auch nach auf die Pressung folgender Extraktion 2,7 bis 3,3 mg P an Phospholipiden, was mehr als 3A bis 4I5 der gesamt durch reine Extraktion zu erhaltender Phospholipide im Raps entspricht. Der Enzymeinsatz führt also auch hier zu einer Verbesserung des extrahierten Restöls durch Verminderung des Phospholipidgehaltes im Vergleich zur reinen Extraktion und damit zu einer Verringerung des anschließend durchzuführenden Entschleimungsaufwands.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Pflanzensamen, dadurch gekennzeich net, dass man
5 a) eine wässrige, ein oder mehrere cellulolytische und/oder lipolytische und/oder pektinolytische und/oder proteolytische Enzym(e) und/oder Phytase enthaltende Lösung auf das Saatgut aufsprüht, b) das so erhaltene Saatgut direkt in an sich bekannter Weise einer ein- oder mehrstufigen Pressung, gegebenenfalls in Kopplung mit einer Extraktion, zu-o führt, und c) das öl in an sich bekannter Weise gewinnt und gegebenenfalls weiterverarbeitet.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch geken nzeichnet, dass das5 Enzym aus natürlichen oder rekombinanten Cellulasen, Endoglucanasen, Cellobi- ohydrolasen, Hemicellulasen, Pektinasen, Phospholipasen, Proteasen oder Phytasen ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass daso Enzym aus Acremonium thermophilium-Endog\ucanasen, Melanocarpus albomy- ces-Endoglucanasen, gegebenenfalls verbunden mit einer Cellulase- Bindungsdomäne von CBH 1 aus Trichoderma reesei, Cellobiohydrolasen aus Thermoascus aurantiacus, gegebenenfalls verbunden mit einer Cellulase- Bindungsdomäne aus CBH1 aus Trichoderma reesei, Endoglucanase Il aus Th-5 choderma reesei und Beta-Glucosidase aus Chaetomium thermophilum, Trichoderma reese/-Xylanase II, Xylanase xlnA aus Actinomadura flexuosa, Xylanase xylA aus Chaetomium thermophilum, Pektinasen aus Aspergillus niger und Trichoderma reesei, Typ A-, B- oder C-Phospholipasen aus Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus oder Thermomyces lanuginosus ausgewählt ist. 0
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch geken nzeichnet, dass das Saatgut vor dem Aufsprühen des Enzyms geschält und/oder zerkleinert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch geke n nzeichnet, dass das Enzym zusätzlich zwischen den einzelnen Pressungen auf das bereits gepresste Saatgut aufgesprüht wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn- ze ich net, dass nach der Pressung ein Extraktionsschritt durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzensamen aus ölhaltigen Saaten ausgewählt sind.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch geke n nzeich net, dass die ölhaltigen Saaten aus Sojabohnen, Erdnuss, Baumwollsamen, Sonnenblumensamen, Maiskeimen und Rapssamen ausgewählt sind.
9. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei der Herstellung von Speiseöl.
10. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei der Herstellung von Biodiesel.
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