WO2008065806A1

WO2008065806A1 - Spectrométrie de masse d'un échantillon biologique par immunoprécipitation

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Publication number: WO2008065806A1
Application number: PCT/JP2007/069643
Authority: WO
Inventors: Takashi Shimada; Atsuhiko Toyama; Taka-Aki Sato
Original assignee: Shimadzu Corporation
Priority date: 2006-11-29
Filing date: 2007-10-02
Publication date: 2008-06-05
Also published as: EP2088426B1; JP4983803B2; US20100086938A1; EP2088426A1; EP2088426A4; JPWO2008065806A1

Description

明細書降を用いた生体試料の質量分析法技術分野

本発明は、医学、応用ィヒ学、基礎生物学、構造生物学、臨床診断学などの分野に関する。具体的には、本発明は、免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法 (Method for Mass Sp ectrometry of Biological Sample Using Immunoprecipi taion) に関する。特に本発明は、臨床サンプルから、ノィ才マーカー分子の検出を目的とした質量分析法に関する。背景技術

チップ表面に抗体などの官鶴を固定化し、官肯特異的な結合によって特定の分子を捕捉し、余分な成分を水やバッファで洗浄除去した後、レーザーを照射し、捕捉された特定の分子を質量分析する方法 (S ELD Iプロテインチップ (R)システム）がサイフャ一ジェン社により開発されている（例えば国際公開第 1 996/036732号パンフレツ卜 (特許文献 1 )参照)。実際には、 Ίつのチップですべての分子を捕捉することはできないため、 ¾K性チップ、イオン交換性チップ、金属イオンァフィ二ティーチップなどの数種類のチップを用いてそれぞれに同じサンプルを添加し、チップごとに発禱析を行う。 —方、 Journal of Neurochemistry, 2003, 84, 602-609 (非特許文献 Ί ) には、 Protei n G-セファロ一スを用いてアミロイドについて免疫沈降を行い、得られた抗体—セファローススラリーを P B S及び H E PE Sを用いて洗浄し、洗浄された抗体ーセファローススラリーを直接 MALD Iターゲットプレー卜にアプライし、測定を行ったことが記載されている。さらに一方、 N. Lei h Anderson and Norman G. Anderson, Mo I. Cell. Proteomics, N ov 2002; 1: 845-867 (非特許文献 2) には、繊漏出タンパク質は、わずかな纖量であつても重大な症状が検出されること、スパイクテス卜の結果、その血中レベルは ng/ml才ーダ一であることが記載されている。また、臨床診断において、アミロイドペプチドの比、特に (1-40)/(1-42)比が非常に重要であることが、 NATURE NEUR0SCIENCE 7(9)， 954-960, 2004 (非特許文献 3)、 HUMAN MUTATION 27(7), 686-695, 2006 (非特許文献 4)、 Dement Geriatr Cogn Disord 2007;23 :316-320 (非特許文献 5) などに示唆されている。

具体的には、上記非特許文献 3には、 A)3が、遺伝性アミロイド症脳出血のマウスモデルの脈管構造を夕ーゲッ卜とすることが記載されておリ、上記非特許文献 4には、プレセ二リン変異による家族性アルツハイマー病の発症年齢の平均が、 Ab42の増加と Ab40の減少との両方と相関することが記載されており、上記非特許文献 5には、軽度認識障害の患者における脳脊 βの Α42/Α40比を使用するアルツハイマー病の予測について記載されている。特許文献 Ί ：国際公開第 1 996/036732号パンフレツ卜

非特許文献 1 ：「ジャーナノレ'才プ'ニューロケミストリ一（Journal of Neurochemi stry)丄 2003年、第 84巻、 p. 602-609

非特許文献 2： N ·レイ'アンダーソン（N. Leigh Anderson)及びノーマン · G ·ァンダーソン（Norman G. Anderson)著、「モレキュラー 'アンド'セルラ一 ·プロテ才ミクス（11«0|6(^13「 & じ6111^3「卩1?0丁5(^1じ5)」 2002年1 1月、第1巻、 p. 845-86 非特許文献 3 ： Γネイチヤー ·ニューロサイエンス（MATURE NEUR0SCIENCE)J 200 4年、第 7巻、第 9号、 ρ· 954-960 非特許文献 4：「ヒューマン■ミューテ一シヨン（HUMAN MUTATION) J, 2006年、第 27巻、第 7号、 p. 686-695

非特許文献 5：「ディメンシャ■アンド ·ジエリア卜リック 'コグニティブ ·ディス才一ダーズ (Dementia and Geriatric Cognitive Disorders) 2007年、第 23巻、 p . 31 6-320 発明の開示

発明の目的

SELD I法では、官肯 g»に捕捉される分子の同定を行うための決定的な手段がない。つまり、 S E L D I法で分子に変動があった場合（例えばイオン交換性チップで捕捉された分子が変動した場合)、その変動の原因を調べることができない。すなわち、分子の変動を追うことはできても、本方法では分子の同定を行うことができないため、変動の根本原因、特に分子の形まで調べることはできない。 Journal of Neurochemistry, 2003, 84, 602-609の方法では、免降により得られた抗体-セファロ一スの洗浄を、通常のバッファを用いて行っている。しかしながら、通常のバッファを用いることによる洗浄効果は、質量分析による目的分子の検出を行うという目的においては不+^である。このため、後の質量分析において目的分子の検出感は低い。上述のように、アミロイドペプチドの存在比、特に (1-40)/ (ト 42)比が非常に重要であることがいくつかの文献に示唆されている。アミロイド 0-40)及びアミロイド（1-42) の検出は、一般的に使用されている ELISA法によって同一抗体を用いることによって可能である。しかしながら、 EL ISA法ではそれらを互いに区別することはできない。つまリ、 EU SA法を用いる場合、アミロイド（1-40)及びアミロイド（1-42) を互いに区別するためには、それぞれに対する特異的抗体が必要となる。本発明の目的は、臨床的に意義のある分子及びそれからスプライシングなどによリ生じた断片を検出対象とすることを目的とした生体試料の解析法を提供することにある。また、本発明では、 SELDI 法の根本的解決を目的の 1つとして、検出すべき生体分子の絞リ込みを行うことに着目した。また、本発明では、従来の免疫沈降法で用いられる免疫沈降物の洗浄において、洗浄操作を厳格に行うことに着目した。従って、本発明の目的は、臨床 ΪΙίΙに応用することができる離のシンプルな系でぁリ、且つ、質量分析におけるイオン化を阻害する分子をキヤップすることができる、臨床的意義を有する生体試料の解析法を «することにある。

本発明の目的は、シンカレな離系とすることにより、臨床でも使用可能で、疾患に応答するさまざまなバイオマ一カー検定への広い応用範囲を有する生体試料の解析法を提供す ·©しとにある。発明の概要

本発明者らは、鋭意検討の結果、免疫沈降によって検出すべき目的の生体分子の濃縮を行い、さらに、質量分析を助ける洗浄液を用いて当該免疫沈降物を洗净することによって、上記本発明の目的が gfiSされることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、以下の発明を含む。

( 1 ) 目的の生体分子を含む試料を用意する工程と、

前記試料中の前記生体分子を、抗体が結合した担体、又は抗体と特異的に結合することができる分子が結合した担体を用いて免疫沈降させることによリ濃縮する工程と、前記生体分子の免疫沈!^を、電荷中和剤を含む水溶液を洗净液として用いて洗净する工程と、洗浄された前記免疫沈^！を質量分析に供することによって、前記生体分子を検出する工程と、

を含む、免 5S¾降を用いた生体試料の質量分析法。

(2) 前記目的の生体分子を含む試料が、雌、尿、脳脊難、及び体分泌液からなる群から選ばれる体液中に前記目的の生体分子が含まれるものである、（"に記載の免 ¾¾ 降を用いた生体試料の質量分析法。

(3) 前記目的の生体分子を含む試料が、臨床試料である、（1 )又は（2) に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

(4) 前記生体分子が、バイオマ一カー、バイオマ一カー i 補生体分子、及び、前言ィ才マーカー又は前記候補生体分子からスプライシングによリ生成した断片からなる群から選ばれる、（1) 〜（3) のいずれかに記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

(5) 前ィ才マーカ-及び前記バイオマーカ-候補生体分子は、癌、脳疾患、免疫疾患、肝疾患、腎疾患、及び B跪からなる群から選ばれる疾患に応答するものである、 (4 ) に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。下記 (6) は、濃縮工程において使用される免疫沈降用担体に関する。

(6) 前記担体が、ァガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロ二卜リル、（メタ）アクリル酸エステゾ 1 1ポリマー、フッ素樹脂、金属樹脂、ガラス、金属、及ひ i生体からなる群から選ばれる、 (1) ~ (5)のいずれかに記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。下記 ( 7 ) は、洗浄工程に使用される電荷中和剤に関する。電荷中和剤を用いることによる効果としては、質量分析におけるイオン化を阻害する分子をキヤップすることができるということが挙げられる。洗浄工程においては、濃縮工程においてした免^; 賺の形態を保持する（すなわち免 ¾¾ 降物中の拭源抗体結合力の弱まることによる目的の生体分子の遊離が起こつて t、な t、觀を保持する）離の適切な p Hに保つ。

( 7 ) 前記電荷中和剤を含む水溶ァンモニァ水及びァンモニゥ厶塩水溶液からなる群から選ばれる、（" ~ ( 6 )のいずれかに記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

上記のような電荷中和剤を用いることによる効果として、電荷を中和することや適切な P Hを保持することができることに加え、適当な離であれば質量分析においてバックグラウンドとしての支障となることがないことなどが挙げられる。下記（8 )及び（9 ) は、質量分析工程に関する。

(8 ) 前記質量分析において、多段階タンデム質量分析を行う、（1 )〜（7 )のいずれかに記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

多段階タンデム質量分析によって、生体分子の同定を行うことや、スプライシング 1f¾ 、翻訳 ¾{彦飾を知るなどができる。 (9 ) 前記質量分析において、前記洗浄された免疫沈^！を内き 1¾票準物質の存在下で測定することによって、前記生体分子の定量を行う、（"〜（8 )のいずれかに記載の免疫沈降を用 t \た生体試料の質量分析法。下記（1 0)及び（1 1 ) は、界面活性剤の使用に関する。

( 1 0 )前記質量分析工程の前に、非イオン性界面活性剤を、前言胜体分子を含む試料又は前言胜体分子の免^,を洗浄するための争液に含ませることをさらに含む、上記の免降を用 L こ生体試料の質量分析法。

( 1 1 )上記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である、上記の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

上記界面活性剤は、性基として糖鎖を有することが好ましレ

上記界面活性剤は、界面活性基として炭素数 8〜 1 2の直鎖アルキル基を有することが好ましい。

上記（1 0 )及び（1 1 ) の方法において界面活性剤を用いることによリ、例えば、馳への非特異吸着を低減することや、溶液の均一性や安定化、目的物の回収を効率的にすることによつて免^:降の ¾ί牛を穏和なものにすることなどが可能になる。下記（1 2) は、複数の生体分子の混合試料の解析に関する。

( 1 2 )前記生体分子は、同一の抗体と結合することができる複数の異なる生体分子を含み；前言 Sj農縮する工程において、前記抗体は 1種の抗体であり；前記質量分析工程において、前記複数の異なる生体分子を区別して検出する、前言己の^ t降を用 t、た生体試料の質量分析法。上言 5 ( 1 2) の方法により、臨床診断において非常に重要な «タンパク質の混合比を、非常に簡便な方法で、かつ同一試ネ'斗、同 B ^祈において見出すことか可能になる。

本発明によると、臨床的に意義のある分子及びそれからスプライシングなどにより生じた断片を検出対象とすることを目的とした生体試料の解析を行うことができる。本発明によると、臨床に応用することができる IMJ のシンプルな系であり、且つ、質量分析におけるイオン化を阻害する分子をキヤップすることができる、臨床的意義を有する生体試料の解析を行うことができる。本発明によると、シンカレな鍵系とすることにより、臨床でも使用可能で、疾患に応答するさまざまなバイオマ一カー検定への広い応用範囲を有する生体試料の解析を行うことができる。具体的に、例えば、魏の S E L D I法と比較すると、本発明では以下のような効 ¾Λ 得られる。例えば、 S E L D I法では、専用の S E L D Iチップが必要であるが、本発明の方法では、一般的な I Ρビーズ等をもちいることができ、汎用性に優れている。また、 S E L D I法では、分析に際し、 S E L D Iスキャナーが必要であるが、本発明の方法では、すべての M A L D I型質量分析によって分析が可能であり、汎用性に優れている。さらに、 S E L D I法では、 S E L D I周辺が必要となるが、本発明の方法では、さまざまな研究室及び検査室で行うことか可食^:免降法をベースに実験系が組まれているため、手法が簡素であり、汎用性に優れている。また、例えば、微の抗体を使用する E L I S Αゃェンザィ厶ィ厶ノアッセィ等の方法と比較すると、本発明の方法は、そのような従来法では検出できないようなレベルの分子の検出を検出でき、感度の点で優れている。具体的には、目的の生体分子が数 ng/ml才ーダー、例えば 1〜5 ng/ml オーダーの低レベルの^ tであっても、検出が可能である。このオーダーは、当該生体分子によって特定の疾患等の症状が現れはじめる際の、当該生体分子の血中に相当する。従って、本発明は、バイオマーカーとして機である ¾Jtに十分耐えうる感度を持った方法であるといえる。さらに、本発明の方法では、免疫沈降物として目的の生体分子を測定するため、目的の生体分子とともに免疫沈降する分子を検出することができる。すなわち、目的の生体分子との相互作用を調べることも可能である。そして、本発明の方法では、繼スケールのペプチド混勿を、質量分析によって質量差を有するイオンピークとして検出すること可能にするため、例えば、アミロイド (1- 40)/(1 - 42) 比のような、臨床診断において非常に重要なタンパク質の混合比を、非常に簡便な方法で見出すことを可能にする。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1において、アミロイドペプチド 1 0 pmo Iをバッファ中に含む試料について IP-MSを行って得られた免疫沈^)からのマススペクトル（IP) を、アミロイド（1-38) コントロールからのマススペクトル（AjS)、抗体混合直後の溶液からのマススぺクトル（Before IP)、及び免疫沈降後の上清からのマススペクトル（IP sup.)とともに示したものである。

図 2は、雄例 2において、アミロイドペプチド 1 00 pmo I、 1 pmo I、 1 0

0 f mo l、 1 0 f mo U 及び Ί f mo Iをバッファ中に含むそれぞれの試料について IP-MSを行って得られたマススペクトルを、実施例 1で得られたマススペクトル（試料中のアミロイドペプチド（卜 38) の量： 1 O pmo I ) とともに示したものである。

図 3は、 ^ ¾例 3において、アミロイドペプチド Ί 00 pmo I、 1 0 pmo U 1 pmo U 1 00 f mo l、 1 0 f mo K 及び 1 f mo Iを血清中に含むそれぞれの試料について IP-MSを行って得られたマススぺク卜ルである。

図 4は、離例 4において、アミロイドペプチド Ί pmo Iを、界面活性剤 (n-Octy 1-jS-D-thioglycoside及び n-Octy I - β -D-g lycoside)をそれぞれ添加した iftlif中に含む試料について、 IP- MSを行って得られたマススペクトルを、界面活性剤を添加しなかったコン卜ロールから得られたマススペクトル（None) とともに示したものである。

図 5は、 H ^例 5において、（a)：アミロイドペプチド混^ (アミロイドペプチド（卜 42) 500 f moしアミロイドペプチド（ト 40) 500 f mo I及びアミロイドペプチド（1 -40) 500 f mo Iの混合物） (Mixture)のマススぺクトルを、（b)：アミロイドペプチド（ 1-42) 500 f mo Iのマススペクトル、（c)：アミロイドペプチド（卜 40) 500 f mo I のマススぺク卜ル、及び（d)：アミロイドペプチド（卜 38) 500 f mo Iのマススぺク卜ルと共に示したものである。

図 6は、実施例 6において、（ a)：細胞溶解液中のアミロイド 500 f m 0 Iのマススぺク卜ル、（b)：血賠中のアミロイド 500 f mo Iのマススペクトル、（c) :血清中のアミ口イド 500 fmo Iのマススぺクトルを示したものである。

図 7は、例 7において、アミロイドぺプチド 1 p m 0 Iを、界面活性剤（（ a)：スクロースモノ力プレート（SMC)、（b)：スクロースモノラウリレー卜（SMし)、（c) :n-才クチノレ一 /3— D—マル卜シド（0M)、（d) :n-ドデシルー) 8— D—マル卜シド（DDM)、（e) :デ才キシ BIGCHAP (BIGCHAP), 及び（f)： π-ォクチルー 0— D—チ才グリコシド（0TG)) をそれぞれ添加した ifDiS中に含む試料について、 IP- MSを行って得られたマススぺクトルを示したものである。

発明をするための形態本発明の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法では、目的の生体分子を含む試料を用意する工程と；前記試料中の前記生体分子を、抗体が結合した担体、又は抗体と特異的に結合することができる分子が結合した担体を用いて免疫沈降させることによリ濃縮するェ程と；前記生体分子の免沈降物を、電荷中和剤を含む水溶液を洗浄液として用いて洗浄する工程と；洗浄された前記免を Kfi分析に供することによって、前記生体分子を検出する工程と、を含む。

Π. 目的の生体分子を含む試料を用意する工程]

本発明においては、目的の生体分子を含む試料は、通常、体液中に目的の生体を含むものである。体液としては特に限定されないが、雌、尿、脳脊髗夜、体分泌液などが挙げられる。また、体液には、当業者によって適宜、粗精製等の前処理や培養が行われて得られた処理済液や培鎌等も許容される。雌としては、全血、錄、雌が挙げられる。特に本発明では、目的の生体分子を含む試料が、臨床試料である場合に有用である。生体分子としては、ノ、'ィォマ一力一、ノィ才マーカ一候補生体分子や、それらからスプライシングなどにより生成した断片などが挙げられる。バイオマーカ一及びバイオマーカ一候補生体としては特に限定されず、本発明では広くさまざまなバイオマ一カーを検出対象とする。たとえば、癌、脳疾患（アルツハイマーなど)、免^患、肝疾患（肝硬変など)、腎疾患、嚇などの疾患に応答する生体分子が挙げられる。生体分子は、主としてタンパク質である。

[ 2. 目的の生体分子を濃縮する工程]

この工程においては、当該生体分子を濃縮する目的で、免疫化学的手法により目的の生体分子を沈降させる。免疫化学的手法により目的の生体分子を沈降できる方法であれば、どのような方法でも許容される。本発明は、たいていの研究室、検査室で行うことが可能な免疫化学的手法を用いることができるため、操作が簡便でコスト' 14^'良く、非常に汎用性の高い方法である点で優れている。具体的には、免疫複合体が形成しうる条件下で、試料と、目的の生体分子に対する抗体と、沈降用の担体とを接触させる。これにより、目的の生体分子と、当該目的の生体分子に対する抗体とを反応させるとともに、沈降用の担体の共存により免疫沈降物を得る。沈降用の担体は、目的の生体分子に対する上記抗体が結合したものであっても良いし、目的の生体分子に対する上記抗体に対し免異的結合能を有する分子（例えば抗 IgG抗体、 P rote i nん Prote i n G等）力結合したものであっても良い。以下において、上記抗体や上記免鎌異的結合能を有する分子を、 Γ抗体等」と記載する場合がある。また、抗体等の担体への「結合」を、抗体等の「固定化」或いは Γ担持」と記載するがある。また、「反応」とは、免龄的反応のことをいい、免的分野において認識されうる免的な反応、主に抗体反応をいう。この反応により、担体に担持された抗体等と目的の生体分子とを少なくとも含む免疫複合体を免疫沈降物として得る。沈降用の担体として、目的の生体分子に対する抗体に対し免辦異的結合能を有する分子が結合したものを用いる場合、より具体的には、免疫複合体が形成しうる条件下で、試料と、目的の生体分子に対する抗体 Xとを接触させ、さらにこの抗体に対する二;^ [体 Υ を担持した沈降用の担体を接触させることができる。これにより、目的の生体分子と、抗体 Xと、二次抗体 Υとを反応させるとともに、目的の生体分子と、抗体 Xと、二次抗体 Υ を固定した担体との複合体を、免疫沈降物として得る。以下、試料と、目的の生体分子に対する抗体 Xと、この抗体に対する二次抗体 Υを ίΐ^ した担体とを用いる形態を挙げて、さらに説明する。抗体 Xとしては、目的の生体分子に免疫特異的に結合する分子であればどのようなものでも用いることができる。抗体は、ポリクローナ U¾t体、モノクローナ 4¾体、及び、分物学的技術により調製した抗体を含む。また抗体は、広く免疫特異的に結合する物質であればよく、抗体フラグメント等も用いられてよい。いずれの場合も、抗体の調製は、当業者に良く知られた方法によって行われる。本発明は、ポリクロ一ナソ W5t体の使用でも本発明の効果を良好に得ることか'できる点で好ましい。担体の形状としては、特に限定されない。例えば、球体、顆粒、破砕体などの粒子（ビーズ）状のものが挙げられる。粒子（ビーズ）状の担体は、操作性、例えば免疫沈降物の回収作業や洗乍業の簡便性、という観から特に好ましい。担体の材質としては、二次抗体 Yを結合させることができるものであれば特に限定されない。例えば、ァガロース、セファロースなどの多糖類や、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、フッ素樹脂、金属 ft:樹脂などのポリマーといった高分匕^)が挙げられる。さらに、ガラス、金属、磁性体等も挙げられる。これらの素材は、単独で又は組み合わせられて使用されうる。担体に担持させるべき二次抗体 Yとしては、目的の生体分子に免雜異的に結合する前記の抗体 Xに、免雜異的に結合する分子であれば特に限定されない。このような分子としては、抗 I gG抗体、 Protei n A、 Protei n G等が挙げられる。本発明においては、ァガロースビーズ（セファロース)、磁性ビース'等は、汎用性という点から特に好ましい。すなわちこれらの担体は、各メ一カーから市販されているものを使用することができる。しかも、これら市販品の多くは、既にセファロース、ァガロース、磁性ビース'等の担体に、 Protei n Aや Protei n G等が結合した權で提供されている。

—方、二次抗体 Yを担体に担持させる作業を行う場合は、公知の ίΐ ^法を用い、当業者によって適宜行われて良い。担持法としては、例えば、物理的吸着法、結合法、ィ才ン結合法等が挙げられ、これらの方法は、単独で又は組み合わせて行うことができる。以上、試料と、目的の生体分子に対する抗体 Xと、この抗体に対する二次抗体 Υを ilft した担体とを用いる形態を挙げて説明したが、既に述べたように、本発明は上記の形態に限定されることなく、当業者が適宜選択した方法によつて他のさまざまな形態で行われて良い。免鮮的反応の反応 ¾ί牛としては、当業者が適宜決定することができる。例えば、反応時間としては 1時間離〜難行うことができる。反応としては、例えば、 4〜1 0 °CiS とすることができる。本発明における標準的なプロトコルを挙げると、反応牛は、 4 °Cで 2時間程度である。

[ 3. 免疫沈降物の洗浄工程]

上記工程で得られた免疫沈降物は、本工程において、適宜回収され、下記の洗净液で洗浄される。回収方法は、当業者によって適宜選択される。

本工程で用いられる洗浄液は、電荷中和剤を含む水溶液である。上記工程で得られた免疫沈降物と雜する塩や分子等に由来するイオンの中には、後の質量分析工程において残存したに、質量分析のイオン化を阻害するものがある。そこで、電荷中和剤を用いて免疫沈降物を洗浄することによリ、このような質量分析におけるイオン化を阻害するィォンをキヤップし、中性化することができると考えられる。また、電荷中和剤は、免疫沈離の形態を保持することができる i¾Sの適切な p Hに保つものを用いる。免疫沈降物の形態が保持された状態とは、免疫沈降物中の抗原抗体結合力の弱まることによる目的の生体分子の遊離が起こっていない維をいう。このために適切な p Hとしては、通常、 1"1が«に酸性側によっていなければ特に限定されないが、好ましくは 7以上、例えば 7 ~ 9、さらには 7 ~ 8或いは 8〜 9である。さらに、電荷中和剤は、後の質量分析工程においてバックグラウンドとして解析に支障を与えないようなものを用いることが好ましい。本発明において用いられる電荷中和剤は、洗浄液（水溶液) 中でアンモこゥ厶イオンを発生するものである。アンモニゥ厶イオンは、例えば脂肪酸、驢などの電荷を弱くキヤップする性質があると考えられている。従って電荷中和剤を含む水溶液としては、希アンモニァ水やアンモニゥ厶塩水溶液が挙げられる。アンモニゥ厶塩の力ゥンターァニオンとしては、当業者によって適宜決定することができる。本発明において好ましいアンモニゥ厶塩の具体的な例としては、例えば炭酸アンモニゥ厶、炭酸水素アンモニゥ厶などが挙げられる。

上記電荷中和剤は、単独で又は組み合わせられて用いられる。電荷中和剤の洗浄液中の；としては、当業者によって適宜決定することができるが、例えば 0. l〜1 0 mM、例えば 0. 1 mM^J とすることができる。本工程では、上記電荷中和剤を含む水溶液を洗浄液として用いるとともに、バッファを洗浄液として併用することができる。バッファとしては特に限定されず、当業者によって適宜選択されて良い。後の質量分析工程への影響を考え、できるだけ塩が ¾リにくいものを選択することが好ましい。このような観から、特に好ましいバッファとしては、 T B S、 P B S、 H E P E S— s a I i n eなどが挙げられる。一般的に、 ί¾1抗体の結合、タンパク質間相互作用はある iU の！^ 存在下によつて最適化されることが知られている。この場合、この ¾¾、抗体結合をはがすことなく洗浄することを目的とするため、最適な塩の存在下、バッファを用いて洗浄することができる。当該最適な ϋ¾びそのは、当業者によって適宜決定される。例えば、 1 5 O mM N a C Iとすることができる。本発明の方法は、さらに引き続き、電荷中和剤水溶液を用いて洗浄するため、効率よく電荷を中和し、かつ抗体との結合漏を保ったまま質量分析のステップへと移行できるメリッ卜がある。洗浄液の量や洗浄回数などの具体的な牛は、当業者によって適宜決定される。一般的には担体容量の約 5倍量の洗浄液を用いて洗浄操作を行うことが »である。本発明では、担体容量こ対し、 100 Lバッファを用いた洗浄操作を 3回、 100 L電荷中和剤水溶液を用いた洗钟作を 1回行うことで分析を行い、支障のないことを確認している。電荷中和剤溶液での洗浄は出来る限り手早くすると良い。また溶液交換の際、応用例として、膜直径の細かいスピンカラ厶を作成し、このフィルター上にて洗^作を行うことができる。また磁性ビーズの使用も効果的である。これにより、樹脂そのものを吸い出してしまう危険性を回避することができ、洗浄効率、回収効率ともに向上が期待できる。

[4. 質量分析工程]

上記工程で洗浄された免疫沈難は、目的の生体分子を抗体より遊離させることなく複合体のまま直接質量分析する。本発明においては、 M A L D I (マ卜リックス支援レーザ一脱離イオン化）型質量分析装置を用いることができる。免¾¾降物は、例えばマトリツクス溶液と混合してから、質量分析サンプルプレートにスポットすることができる。マトリックスは、目的の生体分子に応じ、当業者が適宜決定することができる。目的の生体分子の同定を行う場合は、少なくとも M Sの 2乗の多段階タンデム質量分析が可肯よ装置を用いる。このような装置の例としては、 AXIMA-QIT (島津製作所製）が挙げられる。目的の生体分子の定量を行う場合は、目的の生体分子を内き票準とともに測定し、それぞれに由来するピークの積分比に基づ！ ^ゝて定量を行うことができる。内き! ¾1準としては特に限定されることなく、当業者によつて適宜選択されたものを目的の生体分子にさらに加えて用いることができる。また、濃縮工程において用いられた抗体が他の無関係な分子にク口スすることで非特異的吸着を伴つた免沈が得られた場合には、上記のように内音 1¾票準をさらに加えること以外に、当該非特異吸着分子を内き Ρί票準として有効活用しても良い。

—方で、当該非特異吸着分子を低減するための操作が、当業者によって適宜行われてもよい。この操作は任意に行われて良い。この操作を行う場合、具体的には、界面活性剤を用いることができるが、一般的に免疫沈降にて使用される NP-40は質量分析を阻害することが知られてぉリ、できるだけ後の質量分析にお tゝて支障とならないものを適宜選択する例えば、界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。具体的には、 n—才クチル一 /3— D—グリコシド（n—才クチル一 /3— D—グリコビラノシド)、 n —才クチリレー /3— D—チ才グリコシド（n—才クチル一 — D—チ才グリコビラノシド)、デォキシ B I GCHAP、 n-ドデシルー一 D—マル卜シド、 n -才クチルー j8— D—マル卜シド、スクロースモノラウリレー卜、スクロースモノ力プレー卜（全て同仁化学社より入手可能）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いられる非イオン性界面活性剤としては、 ίΐ7Μ生基として糖鎖を有する界面活性剤が好ましく、また、界面活性基として直鎖アルキを有する界面活性剤が好ましい。当該直鎖アルキル基の長さとしては、炭素数 8〜1 2 とすることができる。全般的に、糖鎖一 C8界面活性剤（すなわち ] |生基として糖鎖を有し且つ界面活性基として炭素数 8の直鎖アルキ USを有する界面活性剤）は、非常に良い効果を奏する。そのなかでも特に、 π—才クチルー β— D—チ才グリコシドゃ η—才クチルー β一 D—マルトシドが好ましい。界面活性剤は、例えば、免降による濃縮工程の前に試料中に加えたリ、洗浄工程において洗浄液に加えたりすることができる。界面活性剤を使用する場合、その使用量は、当業者が適宜決定することができる。免疫沈降による濃縮工程の前に試料中に加える場合は、例えば 0. 1〜2w/v%程度、特に 1w/v%程度を目安に用いることができる。

以下に雄例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の «例に制限されるものではない。また、本発明によって行われる、免疫沈降物の質量分析を IP- MS (I讓 un oprecipitation- Mass Spectrometry) と記載することがある。

<¾ί¾例 1 ：アミロイドぺプチドを用いた I P-MS基礎 >

アミロイドペプチド（1-38) (Anaspec製） 1 0 pmo Iを TBSバッファ中に含む試料液 (50 と、アミロイドペプチド抗体 (Anti-amyloid b (ト 17)、品番 NE1003, 6E10、 Cal biochem製） 0.5AILを TBSバッファ中に含む抗体液 50 しを調製し、両者を混合した。抗体に関しては、アルツハイマー病などで診断にも用いられる、最も讓性のあるモノクローナル抗体である 6Ε10クローンを解析に用いた。

得られた混夜を、 4 °Cで 2時間インキュベートした。

さらに、混^ j夜に、 Protein G agarose plus (ピアス社製）を（TBSバッファ中 50 v/v %スラリー、 5AIL) 加え、 4 °Cで 2 B寺間インキュべ一卜した。得られた^ を違心分離によって回収し、 TBSおよび 0. I mM炭酸アンモニゥ厶水溶液を用いて、回収した免 ¾¾ 降物を洗浄した。洗浄操作としては、 1 Ο Ομ Iの TB S による洗浄を 3回、 1 00 μ Iの 0. 1 mM炭酸アンモニゥ厶水溶液による洗浄を 1回行った。洗浄した免疫沈離と、マトリックス溶液（ 0. 1 v/v%卜リフル才ロ酢酸— 50 v/v% ァセトニトリル水溶液を溶媒とし、 20mg/m Iのシナピン酸（和光鶴製）をマ卜リックスとして含む溶液）とを、同体衝昆合し、質量分析用サンプルとした。

調整された質量分析用サンカレを、 MALD Iターゲッ卜プレー卜に直接スポッティングした。

質量分析装置 (Axima CF plus, 島津製作所製）を用いて、 linear positive modeで測定を行うことによって MALD I— TOF MSを行った。図 1に、上記操作によって得られたマススぺク卜ル（横軸：質量 Z電荷 (Mass/ Charge) 、縦軸：相対イオン強度 (%lnt.))を示す。図 1では、免疫沈降物からのマススペクトル（ IP) を、アミロイド（1 - 38) コントロールからのマススぺク卜ゾレ（A/3)、抗体混合直後の溶液からのマススぺクトル（Before IP)、及び免降後の上清からのマススぺク卜ル（I P sup.) とともに示す。図 Ίが示すように、コントロールのデータ（Aj8) 及び抗体混合直後の溶液のデータ（B efore IP) からは、アミロイドペプチド由来のシグナルを |¾則できている一方、免沈降後の _ fのデータ（IP sup.)では当該シグナルが検出されていない。さらに、免のデータ（IP)からは、コントロールのデータ（Α ) における場合と同等のシグナルが検出できている。これらのことから、本発明の実験系はうまく働いていることが示されている。く離例 2 ： I P-MS感 Jgのテス卜〉

離例 1における、試料中のアミロイドペプチド（ト 38) の量を、 1 00 pm 0 I、 1 pmo l、 1 00 f mo U 1 0 f mo K 及び Ί fmo Iに変更し、それぞれの量のァミロイドペプチド（卜 38) を有する試料について、離例 1と同様の操作を行った。得られたマススぺク卜ルを、 HS¾例 1で得られたマススペクトル（試料中のアミロイドべプチド（1-38) の量： 1 O pmo I ) とともに図 2に示す。図 2が示すように、試料中のアミロイドペプチド（1—38) 量が 1 f mo Iのでも良好なシグナルを得ることができた。

<実施例 3 ： IP-MSの血清中での感度テス卜 >

バッファのかわりに、 lg分子を除去した ώΐ}"*を用いたこと以外は、離例 1及び雄例 2と同様の操作を行った。すなわち、 1 00 pmo l、 1 0 pmo l、 I pmoに 1 0 O f mo l、 1 0 fmo l、及び 1 f m o Iのそれぞれの量のアミロイドぺプチド（1-38 ) を、 lg分子を除去した Ifcf中に含む試料を調製し、それぞれの試料について、 IP- IMSを行った。血清中 lg分子の除去は、免 i ^沈降においては非常に重要である。なぜなら、 lg分子の除去を行わずに Protein Gにてプルダウンする場合、既存の lgが結合することでその免疫沈降効率が下がることや、また大 ϋ¾の抗体、 Protein G agarose樹脂を必要とすることなどが原因し、分析系の感度を著しく下げる虞があるためである。

lg分子が除去された lillifは、 50 いの血清を TBSで 5倍に希釈し、これに Protein G agarose plus (ピアス社製）を加えて、 4 °Cで 2時間振盪し、その後、違心分離を行い、上清を回収することによつて調製した。得られたマススペクトルを図 3に示す。図 3が示すように、 Ifct試料中のアミロイドべプチドの量が 1 f mo Iの場合でも良好なシグナルを得ることができた。 ifiU夜試料中 1 f mo Iの量の分子の検出が可肯ということは、に換算して数 ng/m Iの分子の検出が可能ということであリ、バイオマーカーとして意義を有するために必要な濃度の検出に十分耐えうる精度を有して tゝると考えられる。また、図 3が示すように、アミロイドペプチド抗体に特異的にクロスし非特異的結合する分子（Antibody-crossed non-specific binding component)と思われるものが検出されている。このような非特異的結合に対するアプローチとしては、当該非特異結合を低減する手法をとることと、当該非特異結合を利用する手法をとることとが可能となる。非特異結合を低減する手法としては特に限定されず、当業者によって適宜行われて良い。通常の免 ¾g¾降では、 NP— 40が用いられる。しかしながら、 NP— 40は質量分析を強く阻害し、分析計に大きな影響を与える傾向がある。この観、から、複数の界面活性剤を検討したところ、特に、生基として糖鎖と、界面活性基として炭素数 8の直鎖ァルキル基とを有する非イオン性界面活性剤が非常に有効であることが本発明者らによって見出された（下記例 4及び «例7)。具体的には、例えば上記例において、 IP- MS前（すなわち免疫沈降による濃縮工程の前）の錯中に界面活性剤を例えば 0. ·！〜 2 w/v%iUt, 特に 1 w/v%HJ^忝加する操作をさらに加えることができる。

—方、非特異結合を利用する手法として、当該 Antibody-crossed non-specific bindin g component を内き票準として利用しても良い。これは、図 3が示すように、アミロイドペプチドの濃度を 1 00 pmo l〜1 f mo lという広い範囲にわたって濃度を振っているにもかかわらず、当該 Antibody - crossed non-specific binding componentのピ一ク強度がほとんど変わつていないという事実に基づく。く実施例 4 ： IP-MSにおける非特異的結合低減のための界面活性剤選定 >

本織例では、 «例 3で用いた lg分子を除去した雌中に、界面活性剤を添加して実験を行った。界面活性剤としては、 n-才クチルー — D—グリコシド（η-才クチル一 ;8— D—ダリコビラノシド）及び n-才クチルー8— D—チ才ダリコシド（n-才クチル一 β-D 一チ才グリコピラノシド）をそれぞれ検討した。具体的には、 lg を除去した ifct 50 iitLに、界面活性剤を終 ¾J が 1w/v%となるように加え、室温で 15分振盪した。例 3 における I g分子を除去した βのかわリに、このようにして得られた界面活性剤含有血清を用いた以外は、例 3と同様の操作を行った。なお、試料中のアミロイドペプチド（1 -38) の量は Ipmolとした。得られたマススぺク卜ルを図 4に示す。 l /v¾ n-才クチル一 /3— D—チォダリコシドを添加した場合のアミロイドペプチドのシグナル 5娘が最も強く得られた。 Jfil賣中に界面活性剤を入れなかったコントロールのスペクトル（None) と比較すると、アミロイドべプチドのシグナル、およびシグナル/ノィズ比の顕著な改善が見られた。く実施例 5： IP-MSによるアミロイドペプチド混合物の測定 >

臨床診断において、アミロイドペプチドの «比、特に 0-40)/ (卜 42)比は非常に重要である。

そこで、本雄例では、アミロイドペプチドの腦混^ Iを IP- MSに供した。

具体的には、実施例 4における、試料液中のアミロイドペプチド（1-38) 1 pmo Iを

、アミロイド（卜 38)、アミロイド（1-40)及びアミロイド（1—42)の各々 500 f mo I の混合物とし、 n—才クチルー β - D -チォダリコシドを Ί %含む溶麵牛として使用した以外は、例 1と同じ操作を行い、マススペクトルを得た。図 5に、（a)：アミロイドペプチド混^ #1 (Mixture)のマススぺクトルを、（b)：アミロイドペプチド（1—42) 500 f mo Iのマススペクトル、（c)：アミロイドペプチド（1 -40) 500 f mo 1のマススペクトル、及び（d)：アミロイドペプチド（1-38) 500 f mo！のマススぺクトルと共に示す（横軸：質量/電荷 (Mass/ Charge), 縦軸：相対ィ才ン 0¾1 .））。図 5の結果は、 IP-MSをプラットフォー厶として用いたことにより、同一の抗体にて上記混合物が同時に測定できたことを示している。ここで、各ペプチドのイオン化効率は固有であるため、そのピーク強度が異なる。そこで、当業者に知られる方法でピーク強度の補正（例えば図 5 ( b ) 〜 (d ) のような外き票準を用いることによる補正）を適宜行うことで、その存在比の定量が可能となる。既に述べたように、一般的に使用されている ELI SA法でも同一抗体にてアミロイド（卜 40)及びアミロイド（1-42) を検出できるが、それらを互いに区別することはできない。つまり、 EU SA法を用いる場合、アミロイド（1-40)及びアミロイド（1-42) を互いに区別するためには、それぞれに対する特異的抗体が必要となる。本発明の I P-MS法は、上記のような ¾Sスケールのぺプチド混^ Iを、質量分析によつて質量差を有するイオンピークとして検出することを初めて可能した、非常に画期的な方法である。また、本発明の I P-MS法は、上記アミロイド（1- 40)/(1- 42)比のような、臨床診断において非常に重要な ¾Sタンパク質の混合比を、非常に簡便な方法で見出すことを可能にするものである。く実施例 6： I P-MSによる血漿中及び細胞溶解液中のアミドロイドペプチドの測定 > 本難例では、雌中、血漿中、及び、培養が行われて得られた処理済液としての細胞溶解液中のアミロイドペプチドの測定を行った。血清としては、実施例 3と同じものを用いた。

血漿としては、コスモバイ才社（カタログ番号 1 2 2 5 0 1 1 0) より購入したものを用いた。

細胞溶解液としては、次のようにして得られたものを用いた。 H E K 2 9 3 T細胞を、 D M E ( 4. 5w/v%高グルコース） + 1 0 v/v% F B S中、 1 5 c mディッシュにて 3 日間培養した。培養した細胞をリン酸こて洗浄し、その後回収した。回収した培養細胞を 1 m Iの卜リス緩衝夜中 (プロテアーゼ阻害剤および 1 w/v% π—才クチルー j8 - D —チオダリコシドを含む）に懸濁し、 1 mm径ジルコニアビ一ズを用いて冷却槽中 5 0 0 0 r p mで 1 2 0秒混和することで破枠した。その後、 4°C、 2 0 0 0 0 gで 3 0分の遠、を行い、 _b¾を細胞溶解液として得た。上記， 5 0 μし、上記血漿 5 0 し、及び上記細胞溶解液 5 0 Lについて、それぞれ以下の工程を行った。 2 0 0 しの卜リス β夜（0. 5w/v π—才クチル一 ;8— D— チ才グリコシドを含む）中に希釈し、得られた希釈液に、 Protei n G agarose ビーズ（ピァス社製）を加え、 4 °Cで 2時間攪拌した。その後、遠心を行って _b»を回収した。アミロイドペプチド 5 0 0 f m o I及び抗体 0. 5 Lを、回収したに加え、 4 °C で 2時間、穏やかに攪拌を行った。撹拌後、さらに Prote i n G agaroseビーズを 5 /i L加え、 4 °Cで 2 B寺間攪拌し、アミロイドぺプチドを免疫沈降した。卜リス緩衝夜および 0 · 1 m M重炭酸アンモニゥ厶溶液を用いてビーズ（免疫沈!^) を洗浄し、上清を除去した

。歹餘のビーズ（免疫沈降物）を、 1で用いられたマ卜リックス溶液と同じ 2 0 m g/mしのシナピン液 5 n Lと混合し、ビーズ懸濁液を得た。ビーズ懸濁液を直接 M A L D Iプレー卜にスポットし、乾燥後、質量分析に供した。図 6に、（a)：細胞溶解液中のアミロイドのマススぺク卜ル、（b ) :血漿中のアミロイドのマススぺク卜ル、（c )：血清中のアミロイドのマススぺクトルを示す（横軸：質量/ 電荷 (Mass/ Charge) , 縦軸：相対イオン ¾iK(%l nt. ))。図 6が示すように、血賓中、謹中、及び細胞溶解液中のいずれにおいても、感度よくアミロイドの検出が可能であった。： IP - MSにおける非特異的結合低減のための界面活性剤のスクリーニング > 本^ s例では、 m 4で用いた界面活性剤以外の界面活性剤の isも行った。

具体的には、界面活性剤として、 n-ォクチル一 /3— D—チ才グリコシド（0TG)、デ才キシ B I GCHAP (B I GCHAP) , n-ドデシル一 /3— D—マルトシド（DDM)、 n-才クチル— /3— D— マルトシド（0M)、スク口ースモノラウリレー卜（SML)、及びスク口ースモノ力プレー卜（SMC) (全て同仁化学社製）のそれぞれを用いた。実施例 4における界面活性剤を、上言己のそれぞれの界面 ¾1生剤に置き換えた以外は、魏例 4と同じ操作を行い、マススペクトルを得た。得られたマススぺク卜ルを図 7に示す（横軸：質量 Z電荷 (Mass/ Charge) , 縦軸：相対イオン ¾i (%l nt. ) )。具体的には、（a )：スクロースモノ力プレー卜（SMC)、（b ) :スクロースモノラウリレー卜（SMし)、 ( c ) : n-ォクチル一 j8— D—マル卜シド（0M)、 ( d )： n- ドデシルー j8— D—マル卜シド（DDM)、（ e )：デ才キシ B I GCHAP (B I GCHAP)、及び（ f )： n-ォクチルー β - D一チ才グリコシド (0TG)をそれぞれ界面活性剤として使用した場合に、 I P-MSを行うことによって得られたマススぺク卜ルを示す。それぞれのスぺクトルは、 m/z 300-2000の範囲と m/z 2000- 10000の範囲とで分けて示される。 m/z 300-2000の範囲においては界面活性剤のピークを、 m/z 2000-10000の範囲においてはアミロイドぺプチドのピークを見るために、適宜、ピークの相対 5娘を ft®ィ匕して表示した。図 7が示すように、全般的に、 ίΐ7性基として糖鎖と、界面活性基として炭素数 8の直鎖アルキル基とをもつ非イオン性界面活性剤が、非常に良い結果を示した。この中でも、例えば、 0TGは、非特異的吸着ピークの少ない界面活性剤として好ましく選択することができ、 0Μは、非特異的吸着は多いものの目的物を効率よく回収できる、つまり穏和な条件にて I P-MSを可能とする界面活性剤として好ましく選択することができることが示された。

上記雞例においては、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他のいろいろな形態で実施することができる。このため、上記例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に賺してはならない。さらに、請求の範囲の均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。

Claims

請求の範囲

1 . 目的の生体分子を含む試料を用意する工程と、

前記試料中の前記生体分子を、抗体が結合した担体、又は抗体と特異的に結合することができる分子が結合した担体を用いて免疫沈降させることにより濃縮する工程と、前記生体分子の免疫沈降物を、電荷中和剤を含む水溶液を洗浄液として用いて洗浄する工程と、

洗净された前記免疫沈降物を質量分析に供することによって、前記生体分子を検出する工程と、

を含む、免 ¾降を用いた生体試料の質量分析法。

2. 前記目的の生体分子を含む試料が、雄、尿、脳観液、及び体分泌液からなる群から選ばれる体液に前記目的の生体分子が含まれるものである、請求の範囲第 1項に記載の免 ¾δ·沈降を用いた生体試料の質量分析法。

3. 前記目的の生体分子を含む試料が、臨床試料である、請求の範囲第 Ί項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

4. 前記生体分子が'、ノィ才マーカー、バ'ィ才マ一カー il矣補生体分子、及び、前記バイ才マーカ一又は前記候補生体分子からスプライシングにより生成した断片からなる群から選ばれる、請求の範囲第 1項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

5. 黼己バイオマ-カー及び前記バイオマ-カー候補生体分子は、癌、脳疾患、免患、肝疾患、腎疾患、及び瞧からなる群から選ばれる疾患に応答するものである、請求の範囲第 4項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

6. 前記担体が、ァガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、及び磁性体からなる群から選ばれる、請求の範囲第¹項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

7. ΙΪΙΪΒ電荷中和剤を含む水溶液が、アンモニア水及びアンモニゥム塩水溶液からなる群から選ばれる、請求の範囲第 1項に記載の免疫沈降を用いた生体！ ¾'4の質量分析法。

8. Ϊ己質量分析において、多段階タンデム質量分析を行う、請求の範囲第 Ί〜 7項のいずれか 1項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。

9. 前記質量分析において、前記洗浄された免疫沈降物を内部標準物質の存在下で測定することによって、前記生体分子の定量を行う、請求の範囲第 1項に記載の免疫沈降を用いた生体試料の質量分析法。