WO2008047480A1

WO2008047480A1 - Procédé de régulation de la distribution de sites de mutation dans la région variable d'un gène d'anticorps

Info

Publication number: WO2008047480A1
Application number: PCT/JP2007/001139
Authority: WO
Inventors: Kunihiro Ohta; Waka Lin; Hidetaka Seo
Original assignee: Riken; Japan Science And Technology Agency; Saitama Small Enterprise Promotion Corporation; Chiome Bioscience Inc.
Priority date: 2006-10-19
Filing date: 2007-10-19
Publication date: 2008-04-24
Also published as: JP2008099602A

Description

明細書

抗体遺伝子の可変領域における変異部位の分布状況の調節法技術分野

[0001] 本発明は、抗体遺伝子領域に変異を導入する方法に関する。より詳細には

、抗体遺伝子領域に種々の変異を導入し、多様な抗体分子を取得する方法に関する。

背景技術

[0002] 体細胞相同組換えは、遺伝子の多様性を産み出す要因の一つとして、生体内において重要な役割を果たしている。特に、抗体遺伝子は、 VDJ組換により生じた可変領域が更に再編成され、非常に多くの異なる特異性を持つ抗体分子をコ一ドすることになる。このような細胞内における一連の現象を、特に、可変領域の再編成を自在に誘導することが可能になれば、所望の特性を持つ抗体を取得することが可能となる。

[0003] また、体細胞突然変異も抗体に多様性をもたらす現象の一つであり、 X R C C 2及び X RCC 3を欠失させた D T 40細胞株においては、体細胞突然変異の頻度が増加するとの報告があり（非特許文献 1 ) 、 XRCC2若しくは XRCC3をノックァゥ卜した D T 40細胞を用いた種々の特性を持つ抗体の取得が試みられている（特許文献 1、非特許文献 2) 。さらに、体細胞遺伝子変換と体細胞突然変異の双方に関与する A I D (A c t i V a t i o n I n d u c e d し y t i d i n e D e am i n a s e) 退伝十の発現を C r e— I o x Pシステムにより一時停止させ、抗体産生クローンを単離する技術も報告されている（特許文献 2、非特許文献 3) 。しかしながら、これらの技術により取得した抗体は、抗原認識上の特異性、親和性などの点において不十分な点が残されていた。

[0004] 一方、発明者らは、可変領域の再編成が相同組換え機構（特に、体細胞遺伝子変換）によって誘導される可能性に着目し、 i n V i t r oにおける、多様な抗体を取得する技術を開発した（特許文献 3、非特許文献 4) 。この技術は、ニヮトリ B細胞由来の培養細胞株 D T 40の抗体遺伝子座において、ヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤等（例えば、トリコスタチン Aなど）による処理で体細胞遺伝子変換を著しく促進させ、その結果として抗体の多様性を獲得する方法を提供する。本技術は、それまで報告されていた技術に比較して、多様な抗体分子の取得を可能にするもので、非常に有用性の高い技術であるが、本技術によると、抗体可変領域の一部（超可変領域 1 ) に選択的に遺伝子変換が誘導される傾向があった。そのため、取得される抗体の多様性を少なからず狭めてしまう可能性があつた。

[0005] 非特許文献 1 ： S a l eら， N a t u r e 4 1 2 : 92 1 —926, 200

1

非特許文献 2： C um b e r sら， N a t u r e B i o t e c h. 20 : 1 1 29- 1 1 34, 2002

非持許文献 J ： K a n a y ama , N u c l e i c A c i d s R e s. 34 : e 1 0. , 2006

非特許文献 4： S e oら， N a t u r e B i o t e c h. 23 : 73 1 —7 35, 2005

特許文献 1 ：特開 2003 _ 503750号公報

特許文献 2：特開 2004 _ 298072号公報

特許文献 3：国際公開公報 WO 2004/0 1 1 644

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明者らは、上記事情に鑑み、抗体遺伝子可変領域に導入される変異の分布範囲を調節する方法について鋭意研究を行った結果、ヒストン脱ァセチル化酵素 2 (H DAC 2) 遺伝子の機能を選択的に抑制することにより達成できることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。

よって、本発明は、抗体遺伝子可変領域の全領域に対し、変異を導入する方法の提供を目的とする。

また、本発明は、抗体遺伝子可変領域の全領域に対し、変異を導入することにより、多様な特性を有する抗体分子の作製方法を提供する。

課題を解決するための手段

すなわち、本発明は以下の（1 ) 〜（1 2) に関する。

( 1 ) 本発明の第 1の態様は、「コード領域が、以下の（a) 又は（b) に示される塩基配列からなる遺伝子の機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子可変領域に多様な変異を導入する方法。

(a) 配列番号 1、配列番号 3又は配列番号 5

( b ) 配列番号 1、配列番号 3又は配列番号 5の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コ -ドするタンパク質がヒストン脱ァセチル化活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列」である。

(2) 本発明の第 2の態様は、「前記機能低下又は機能喪失が、前記（a) 又は（b) で示される塩基配列からなる遺伝子に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする上記（1 ) に記載の方法」である。

(3) 本発明の第 3の態様は、「前記機能低下又は機能喪失が、前記（a) 又は（b) で示される塩基配列からなる遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする上記（1 ) に記載の方法」である。

(4) 本発明の第 4の態様は、「以下の（a) 又は（b) に示されるタンパク質の活性若しくは機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子可変領域に多様な変異を導入する方法。

(a) 配列番号 2、配列番号 4又は配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質

(b) 配列番号 2、配列番号 4又は配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ヒストン脱ァセチル化活性を有するタンパク質」である。

(5) 本発明の第 5の態様は、「前記免疫細胞を、付加的に H D AC阻害剤にも接触させて処理することを特徴とする上記（1 ) 乃至（4) のいずれかに記載の方法」である。

(6) 本発明の第 6の態様は、「前記 H D AC阻害剤がトリコスタチン Aであることを特徴とする上記（5) に記載の方法」である。

(7) 本発明の第 7の態様は、「前記免疫細胞が DT 40細胞であることを特徴とする上記（6) に記載の方法」である。

(8) 本発明の第 8の態様は、「前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子であることを特徴とする上記（1 ) 乃至（7) のいずれかに記載の方法」である。

(9) 本発明の第 9の態様は、「前記抗体遺伝子が抗体軽鎖遺伝子であることを特徴とする上記（1 ) 乃至（7) のいずかに記載の方法」である。

(1 0) 本発明の第 1 0の態様は、「上記（1 ) 乃至（9) のいずれかに記載の方法により抗体遺伝子可変領域に変異を導入した免疫細胞」である。

(1 1 ) 本発明の第 1 1の態様は、「上記（1 ) 乃至（9) のいずれかに記載の方法により変異が導入された抗体遺伝子がコ一ドするポリべプチドを少なくとも 1つを含む抗体分子」である。

(1 2) 本発明の第 1 2の態様は、「前記抗体分子が I gMである上記（1 1 ) に記載の抗体分子」である。

発明の効果

[0008] 本発明の方法によれば、抗体遺伝子可変領域の全領域において変異を導入することができる。

[0009] 本発明の方法によれば、抗体遺伝子可変領域の全領域に対し、変異を導入することにより、多様な特性を有する抗体分子を作製することができる。図面の簡単な説明

[0010] [図 1] H D AC 2遺伝子ノックァゥトコンストラクトの模式図を示す。

[図 2] c H D AC 2遺伝子が破壊されたことを確認した RT_ PC Rの結果を示す。 WTは野生型株を、（ + /_) はへテロ接合遺伝子破壊株を、 -) はホモ接合遺伝子破壊株の結果である。

[図 3]野生型と c h HDAC2—/—細胞の遺伝子変換頻度の結果を示す。横軸は、培養の時間（日）を、縦軸は I gM+細胞の割合（％) を表す。 3回の培養結果の平均を示す。

[図 4] c h HDAC2—/— 2月齢細胞集団の抗体軽鎖可変領域の配列多様性の結果を示す。

[図 5]野生型 +トリコスタチン A (5 nM) 2月齢細胞集団の抗体軽鎖可変領域の配列多様性の結果を示す。

[図 6] c h HDAC2 、 c h H D AC 2 +TSA (トリコスタチン A) 、 TSA (トリコスタチン A) 細胞集団における配列多様化部位の各超可変領域での比率を示す。

[図 7] c h HDAC2 { -/-) +トリコスタチン A (5 n M) 1月齢細胞集団の抗体軽鎖可変領域の配列多様性の結果を示す。

[図 8]ゥサギ I g Gに対して作成した抗体クローンのェライザの結果を示す。

[図 9] c h HDAC2 {-/-) 2月齢細胞集団の抗体重鎖可変領域の配列多様性の結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明の一実施形態は、ヒストン脱ァセチル化酵素（以下、 HDACとする） 2遺伝子の機能を選択的に低下又は喪失させ、或いは、 HDAC2タンパク質の活性若しくは機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子領域に多様な変異を導入する方法である。

「ヒストン脱ァセチル化酵素（HDAC) 」は、活性中心に亜鉛を含有する金属酵素でありァセチル化されたヒストンからァセチル基を脱離させる反応を触媒する。 HDACの細胞内における主な機能としては、クロマチン構造を制御し、転写等の活性化又は抑制のコントロールなどが知られている。 H D ACはいくつかのクラス、例えば、ヒトの場合、クラス I (HDAC 1 、 HDAC2、 HDAC3、 HDAC8) 、クラス I I (HDAC4、 H D AC5、 HDAC6、 HDAC7) に大別されている。これらのアイソフォ —ムは、他の多くのタンパク質と相互作用することにより巨大複合体を構成している。例えば、 HDAC 1 と HDAC2は S I N 3複合体や N U R D/ M i 2複合体中に存在している。

[0012] 本発明における「HDAC2遺伝子」とは、そのコード領域が、配列番号

1、 3又は 5で表される塩基配列からなる DN Aのみならず、コード領域が、配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列からなる DN Aと相補的な塩基配列からなる DNAと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒストン脱ァセチル化活性を有するタンパク質をコードする DN Aからなるものも含まれる。また、「遺伝子」には、 c DN A及びゲノム DN Aが含まれ、ゲノム DN Aの場合には、ェキソン、イントロンのみならず、プロモ一ター、ェンハンサ一などの転写調節領域も含まれる。

本発明における「抗体遺伝子」には、免疫グロブリン遺伝子と同義で、重鎖（H鎖）抗体遺伝子と軽鎖（L鎖）抗体遺伝子の両方が含まれる。

[0013] 配列番号 1、 3又は 5で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる D N Aとしては、配列番号 1、 3又は 5で表わされる塩基配列と好ましくは約 70%以上、より好ましくは約 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97 <½, 98%, 最も好ましくは約 99 %のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有する D N A等が挙げられる。

ここで、ストリンジェン卜な条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダィゼーシヨン条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な条件である。一般に、プローブが長くなると適切なァニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点に近いか、又はそれ以下の環境に存在する場合における変性 D N Aの再ァニールする能力に依存する。

具体的には、例えば、低ストリンジェン卜な条件として、ハイブリダィゼ —シヨン後のフィルタ一の洗浄段階において、 37°C〜42°Cの温度条件下、 0. 1 X SSC、 0. 1 %S D S溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェン卜な条件として、例えば、洗浄段階において、 6 5°C、 5 X SSCおよび 0. 1 %S D S中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェン卜な条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。

[0014] また、本発明における「HDAC2タンパク質」とは、配列番号 2、 4又は 6で表されるァミノ酸配列と同一又は実質的に同一のァミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリべプチド」とは、配列番号 2、 4又は 6で表わされるアミノ酸配列と約 60% 以上、好ましくは約 70 %以上、より好ましくは約 80 %, 81 %, 82 % , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 9 1 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 最も好ましくは約 99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヒストン脱ァセチル化活性を有するタンパク質である。

あるいは、配列番号 2、 4又は 6で表わされるアミノ酸配列と実質的に同 —のァミノ酸配列を含むポリベプチドとしては、配列番号 2、 4又は 6で表わされるアミノ酸配列中の 1又は数個（好ましくは、 1〜30個程度、より好ましくは 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒストン脱ァセチル化活性を有するタンパク質である。

なお、本明細書中において、特に断らない限り、「タンパク質」と「ポリペプチド」は同じ意味で用いるものとする。

[0015] 本発明における「免疫細胞」としては、抗体産生能を有する B細胞を指し、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒッジ、ニヮトリなどに由来する細胞を使用することができる。好ましくは、株化された細胞が使用され、特に好ましくは免疫細胞としては D T 40細胞が使用される。

「DT40細胞」とは、ニヮトリ由来 B細胞の株化培養細胞であり、当該細胞の保有する染色体に何らかの修飾（例えば、特定の遺伝子の組換え、揷入、削除等）を加えられた、誘導体株、サブラインも含む。本発明で用いる細胞の培養条件は当該技術分野において周知の方法によつて行われるが、選択される免疫細胞に適した培地、培養条件（培養温度、 c

02濃度）下で行われることは言うまでもない。し力、して、選択される免疫細胞が D T 40細胞である場合、例えば、培地は I MDM ( I n v i t r o g e n社）を用い、培養温度は例えば 39. 5°C、 5 %の C O 2濃度条件下で行う。培養は、細胞濃度を一定に保ちながら行い、適当な期間毎（例えば、日毎、週毎）に目的の細胞の抗体遺伝子座における体細胞相同組換えの有無を確認する。

[0016] HD AC 2遺伝子の機能を低下又は機能喪失させるために、 HDAC2 遺伝子機能を改変することができる。遺伝子の機能を改変する方法としては、限定はしないが、例えば、細胞内に存在する HD AC 2遺伝子に突然変異を導入する方法、 HD AC 2遺伝子全体を破壊する方法、 HD AC 2遺伝子の転写プロモータ一を改変して発現量を制御する方法、 RNA干渉（RNA i ) を利用する方法、 HDAC2遺伝子に対するアンチセンスを細胞内に導入する方法等、当業者にとって周知の方法が使用可能である。好ましくは、 HDAC2遺伝子に突然変異を導入する方法、 H D A C 2遺伝子全体を破壊する方法又は RN A干渉（RNA i ) を利用する方法であり、 HDAC2遺伝子全体を破壊する方法である。

[0017] 遺伝子全体を破壊する方法にはクローン化した標的遺伝子（H DAC2遺伝子）の必須領域 DN A配列（破壊すべき領域）にマーカー遺伝子を挿入した DN Aを細胞に形質転換する方法がある。細胞内に導入された該 DN Aは、 HD AC 2遺伝子の両隣接配列を介した相同組換えを誘発するため、染色体上の H D A C 2遺伝子をマーカ一遺伝子で置換することができ、その結果、 H D AC 2遺伝子を破壊することができる。

また、遺伝子機能を喪失させるために、 RNA干渉（RNA i ) を利用することができる。この場合、 HDAC2遺伝子によってコードされるタンパク質の機能ドメインに関する塩基配列をもとに、短い R N A二本鎖もしくは該 RN Aを産生するべクタ一を細胞内に導入することで、 H D AC 2遺伝子の機能低下または機能喪失をもたらすことができる。

加えて、 H D A C 2遺伝子上流域に誘導可能な転写プロモーターを配置して条件的に H D A C 2遺伝子の発現を制御したり、 C r e _ I o X Pなどの部位特異的組換え酵素系を用いて H D A C 2遺伝子と転写プロモーターの相対位置を転換させて発現を制御したりする方法が存在する。

さらに、インビト口において突然変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異導入法などの当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。 H D A C 2遺伝子に突然変異を導入することで機能改変を行う場合、 H D A C 2タンパク質の活性を欠失させるように変異を導入すること、該タンパク質と他のタンパク質が相互作用を行うのに必要な部位に変異を導入し該相互作用を消失させるような変異を導入することなどが望ましい。

H D A C 2タンパク質の活性若しくは機能を低下又は喪失させるためには、上述の H D A C 2遺伝子の機能を低下又は喪失させるために使用可能な方法の他に、当業者において周知の方法を使用することができる。限定はしないが、例えば、 H D A C 2タンパク質の活性若しくは機能を低下又は喪失させる抗体を目的の細胞内へ導入する方法、 H D A C 2タンパク質の不活性型 (ドミナントネガティブ）を目的の細胞内へ導入するか又は目的の細胞内で発現させる方法、 H D A C 2タンパク質の活性を阻害する低分子のィンヒビターを目的の細胞内へ導入する方法などを挙げることができる。

抗体や H D A C 2タンパク質の不活性型を細胞内へ導入するためには、例えば、細胞膜透過性べプチドを抗体、 H D A C 2タンパク質の不活性型に連結して細胞内へ導入してもよく、又は市販のキットを使用することもできる

H D A C 2タンパク質の不活性型を細胞内で発現させるためには、当業者の通常の技術常識に従って容易に行うことができる。目的の細胞に応じて、発現ベクター（目的の細胞に応じたプロモーターなど、発現誘導に必要な構成要素を備えているもの）を選択して、適切な培養条件下にて H D A C 2タンパク質の不活性型を発現させることができる。 [0019] 本発明の他の実施形態は、 HD AC 2遺伝子の機能を低下又は喪失させ、或いは、 HD AC 2タンパク質の活性若しくは機能を、低下又は喪失させ、該 HD AC 2遺伝子、 HD AC 2タンパク質が存在する免疫細胞を、 HDA C阻害剤と接触させて処理し、該免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子領域に多様な変異を導入する方法である。

「HDAC阻害剤」には、 HD ACの活性を抑制する活性を持つ抗体などのタンパク質因子、トリコスタチン A、ブチル酸及びバルプロ酸など小分子化合物など、当業者に知られているものであれば如何なるものも使用可能であると思われるが、最も好適にはトリコスタチン A が使用される。 HDAC 阻害剤で免疫細胞を接触する場合、 H D A C阻害剤での処理濃度及び処理時間は、接触させる細胞が死に至らない範囲内であれば、使用可能である。具体的には、トリコスタチン Aの場合には、処理濃度は、 1〜20 nMが好ましく、処理時間としては、 2週間〜 4ヶ月が好ましい。

[0020] 以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例

[0021] 実施例 1 ： c h HDAC2_/_株の作製と、継続培養による抗体遺伝子（重鎖■軽鎖）可変領域の多様化

<方法 >

1. c h HDAC2—/—株（ホモ接合遺伝子破壊株）の作製

下記プライマ一セットを用いて、 D T 40ゲノミック D N Aを錶型として、 PCR法により c h HDAC2遺伝子の BamH I (6949) —S a c I (1 31 40) 、 6. 2 k b p断片を増幅し、制限酵素で切断後、 p B I u e s c r i p t S K (-) ベクタ一 B a mH I _S a c I部位に揷入してクロ一ニングを行った。このプラスミドから S t u I (7543) —S t u I (1 01 29) 、 2. 6 k b p断片（第 3ェキソンの一部と、第 4ェキソン及び第 5ェキソンを含む）を切り出し、そこに; S—ァクチンプロモータ ―で発現する I o X P f l a n k e d b l a s t i c i d i n R (¾■ しくは p u r omy c i n R) 選択マ一力一配列を揷入した（図 1 ) 。この後、 30 gの組換え体 D N Aを S a c Iで切断したのち、電気穿孔法（ B i o— R a d G e n e P u l s e r, 550V, 25 u FD) により 0丁40細胞の〇 1_ 1 8株に形質転換を行った。ブラストサイジン耐性コロ二一から、まずへテロ接合遺伝子破壊株（c h HDAC2+/_) を選別し、これらにさらにピューロマイシン耐性マ一力一を含む遺伝子破壊マ一力 _ を形質転換し、最終的に二系統のホモ接合形質転換体（c h HDAC2_/ -) を分離した。

これら 2系統の c h HDAC2遺伝子破壊株を WL 3. 1 と名付け、原株を凍結保存した。これらの株の確認は、 c h H D AC 2プライマ一を用いて RT— PCRにて実施した（図 2) 。 RT— PCR反応は "S u p e r s c r i p t l l l O n e—S t e p RT—PCR w i t h P l a t i n i u m T a q P o l yme r a s e" ( I n v i t r o g e n社) と、 200 n gの錶型 t o t a l R N Aを用い、 1 0 pmo lの c h HDA C2用、およびS—ァクチン（対照）用の PCRプライマ _■セットを加えて 50 I反応液中で実施した。反応条件は、 55°C30分、 94°C2分の前処理後、 94 °C 1 5秒/ 60 °C 30秒/ 68 °C 1分を 25サイクル実施し , 最後に 68 °Cで 5分反応させた。念のためゲノミック 'サザンハイプリダイゼ一シヨンによる遺伝子破壊の確認を行つた。

c h H D A C 2 PCRプライマ一セット：

上流： 5' -CCGCTCGAGGGACAAGGGCATCCAATGA AACCTCATAGG-3' (配列番号 7)

下流： 5' -CCATCGATGTAATACTACAGCACTGGGC TGGTACATCTCC-3' (配列番号 8)

RT— PCRプライマ一セット：

( c h HDAC2用）

上流： 5' -GCTGTCAACTGGAGGCTCTG-3' ( 配列番号 9 )

下流： 5' -CTGATTTTGCTCCTTTGGTGTCCG-3' ( 配列番号 1 0 )

(;S _ァクチン用）

上流： 5' -CCCCAAGCT TACT CCCACAGCCAGCCAT G G _ 3 ' (配列番号 1 1 )

下流： 5' -GGCT CTAGATAG T CCG T CAGG T CACGGC CA-3' (配列番号 1 2)

[0023] 2. c h H DAC 2_/_株の継代培養による抗体遺伝子（重鎖■軽鎖）可変領域の多様化

上記の WL 3. 1を、 CO ₂恒温槽にて 5%の CO ₂存在下で 39. 5°Cで標記の期間（3週間〜 2ヶ月）培養した。培地は、 I MDM培地（ I n V i t r o g e n社）を用い、 1 0 % F B S、 1 %ニヮトリ血清、ぺニシリン 1 00単位/ m I、ストレプトマイシン 1 00 g/m I , 2 _メルカプトェタノ一ル 55 Mを加えて使用した。また、トリコスタチン A (和光純薬 ) は、 DMSO 2mg/m I に溶解したものをストックとし、最終濃度が 2. 5, 5, 1 0 n Mとなるように、適宜培地で希釈して用いた。細胞濃度は 1 0⁵〜2 X 1 0⁶個/ I に保ちながら培養を続けた。

[0024] 3. 表面 I gM陽性クローンの蛍光セルソ一タ一（FACS) 解析による遺伝子変換頻度の推定

細胞密度〜 1 0⁶の細胞培養液を 1. 5m lチューブ中で 1 000 X g、 5 分遠心して細胞を回収したのち、染色バッファ一（リン酸バッファ一 P BS ： 1 OmM リン酸ナトリゥム、 0. 1 5M N a C I 、 p H 7. 4に 0 . 3%BS Aを添加したもの） 200 I に懸濁した。細胞を再び遠心により回収し、次に F I T Cラベルした抗ニヮトリ I gM抗体（B E T H Y L社 ) を染色バッファ一で 1 /250倍希釈したものを 200 Iで懸濁し、氷上で 1時間反応させた。細胞を遠心により回収し再び染色バッファ一 200 U I に懸濁■遠心し、細胞を洗浄した。この洗いのステップをもう一度繰りかえしたのち、細胞を 5 g/m Iのヨウ化プロビジゥム（ナカライ社）を含む染色バッファ一 1 00 I に懸濁した。 I gMを発現している細胞の割合は、 E P I C S E L I T E E S P (B e c km a n C o u l t e r 社）により、約 1 0, 000個程度の細胞を測定して算出した。その際、ョゥ化プロビジゥムにより染色される細胞は死細胞としてゲ一トァゥトした。

[0025] 4. ゲノム D N A/T o t a I R N Aの抽出

細胞約 1 0万個（ゲノム D N A用）若しくは 200万個（T o t a l R N A用）を 1 . 5m lチューブに遠心（ 1 000 g、 5分）により回収し、一 80°Cで細胞ペレットのサンプルを保存した。その後解凍して、 M a g E x t r a c t o r M F X— 2000 (T o y o b o社) と G e n o m e P u r i f i c a t i o n K i t、若しくは、 R N A P u r i f i c a t i o n K i tを用いて、ゲノム D N Aと T o t a l R N Aを精製し、 ^ 00 U \の滅菌水に溶解した。

[0026] 5. 抗体軽鎖遺伝子可変領域の配列の解析

抗体軽鎖および重鎖遺伝子の可変領域の増幅には、 P C R (P e r k i n E l m e r 9 600 ) を利用した。ゲノム D N A溶液 1 I (細胞 50 00個相当）を錶型とし、下記のプライマ一をそれぞれ 1 O p m o I使用した。

麵麵：

上流： 5' _CA CA C C T CAG G T A C T CG T T G CG_ 3' ( 配列番号 1 3 )

下流： 5' - T CAG CGA C T CA C C T AG GA CG G- 3' ( 配列番号 1 4 ) 上流： 5' -CG G GAG C T C CG T CAG CG C T C T C T G T C C- 3' (配列番号 1 5)

下流： 5' -G G G G T A C C CG GAG GAGA CGA T GA C T T CG G- 3' (配列番号 1 6)

P C R反応は P y r o b e s t D N A P o l y m e r a s e (宝酉造 ) を用いて、 50 I反応液中で実施した。反応条件は、 9 8°C2分の後、 9 8 °C 30秒、 57 °C 30秒、 7 2 °C 1分を 2 7サイクル行い、最後に 7 2 °C 5分反応させた。その後、 E x T a q D N A P o l y m e r a s e ( 宝酒造）を 1 I加え、 7 2°C 1 5分反応させた後、全反応液の 20 I分をァガロースゲル電気泳動で分離した。軽鎖遺伝子可変領域に相当するバントを切り出し、 G e l t x t r a c t i o n k i t (Q i a g e n社) により D N Aを回収後、 T O P O— T A C l o n i n g k i t ( I n v i t r o g e n社）にて p C R 2. 1 _ T O P Oベクタ一に組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションした。その後プラスミドを抽出し、 A B I P R I SM 3 7 7 D N A S e q u e n c e r (P e r k i n E l m e r社）若しくは A B I 3 7 30 x l (A p p l i e d B i o s y s t e m s社）により配列を解析した。

[0027] 6. ゥサギ I gG磁気ビーズの作製：

兹気ビ一ズは D y n a b e a d s M— 2 80 T o s y l a c t i v a t e d (D y n a I社）を、また磁気スタンドは D y n a I M P C (D y n a I社）を用いた。ビーズ 200 U I を 500 Iのバッファ一 A (0. 1 M N a - P h o s p h a t e p H 7. 4 ) で 3回洗った後、バッファ _A、 200 I 中で 1 20 gのゥサギ I g G (S I GMA社）と 3 7 °C で一晚、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズをバッファ一 C ( P B S + 0. 1 % B S A) 200 Iで 2回洗浄した。その後バッファ一 D (0. 2 M T r i s - H C I p H 8. 5, 0. 1 % B S A) 200 U I を加え、 3 7°Cで 4時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後 500 Iのバッファ一 Cで 2回洗浄した後、 0. 0 2<½アジ化ナトリウムを含むバッファ _C、 200 I に懸濁した。

[0028] 7. ゥサギ I g G磁気ビーズによる抗体産生クローンの選択

トリコスタチン A、 2. 5 n g/m Iで週間処理した野生型 D T 40細胞約 5 X 1 07個を、洗浄バッファ一（1 %83八を含む 83) 1 0m Iで 1 回、さらに 1 m Iで一回洗浄したのち、 1 m Iの洗浄バッファ一中でストレブトアビジン磁気ビーズ（ゥサギ I g G磁気ビーズによるセレクションの場合はゥサギ I gG磁気ビーズ） 5 X 1 0⁶個と混合

し、 4 °Cで 30分間、穩やかに回転させつつインキュベートした。その後 1 m Iの洗浄バッファ一で 5回洗浄した。最後に、磁気ビーズに結合した細胞を 500 I に懸濁し、これを 3 Om Iの培地に加えたのち、 96穴プレー卜に 300 Iずつ分注し、 39. 5°Cで培養した。

[0029] <結果 >

1. c h HDAC2—/—株における抗体遺伝子軽鎖可変領域の多様化 c h HDAC2—/—株（C L 1 8系統、表面 I gM陰性クローン）を、 5 n Mトリコスタチン A存在下（ 1 4日目以降） /非存在下で 0、 1 4、 2 1、 28、 35、 42日間培養し、 F ACSで I gM陽性細胞数を測定したその結果、 c h HDAC2— /—株はトリコスタチン A非存在下では、 2 8日後に 28%の細胞が表面 I gM陽性を示したが、その後表面 I gM陽性細胞の比率は定常状態からやや下降気味に推移することが明らかになった。これに対し、 5 nMトリコスタチン A存在下では、野生型細胞と同様に表面 I gM陽性細胞の比率が著しく上昇し、 35日後には 70%近くの細胞が陽性を示した。ただ、野生型ではその後も陽性率が上昇するのに対し、 c h HDAC2—/—株では 70 %程度で定常状態に移行することが明らかになつた（図 3) 。

[0030] 次に、軽鎖可変領域の C D R 1〜 3を含む約 400 b pの領域のゲノム D N A配列を解析した。その結果、野生型をトリコスタチン A処理した場合に比べ、遺伝子変換が起きる箇所が可変領域全体に分散し、 CDR2や CDR 3部分にも相当数の変異が導入されることが示された（図 4) 。

また、多様化のパターンも野生型 +トリコスタチン A (31クローンで 1 6種類、図 5) に比べ複雑化しており、計 43クローンで 38種類、もしくは 30クローンで 22種類が、それぞれ全く異なる配列を有していた。

[0031] 図 6に示す通り、 c h HDAC2—/—株では、 C D R 1部位に変異が認められるものが全クローンの 30-45%、 C D R 2および 3領域を含む C D R 1以外の領域に変異が認められるものが 30-45%程度となっている c h HDAC2—/—株にトリコスタチン Aを添加して培養した場合は、 CDR 1領域での遺伝子変換がより顕著に認められるのに加え、 C D R 2や CD R3部分を含む CD R 1以外の領域にも相当数の変異が導入され、 c h H D AC 2—/—株の効果とトリコスタチン A処理の効果が相加的なものであることが判明した（図 7) 。

[0032] 2. 上記多様化処理細胞群からゥサギ I gGを固定した磁気ビーズを用いての抗体産生クローンの分離

c h HDAC2—/—株にトリコスタチン Aを添加して 60日間以上培養して得られた細胞集団に、ゥサギ I gGを結合させた磁気ビーズを添加した。強固に結合する細胞を磁石で回収し、 96穴プレートで培養したところ、多数のクローンが増殖した。図 8にゥサギ I gGに対する抗体作製例（クロ —ン H 1 1が特異抗体）のェライザ（E L I SA) データを示す。

[0033] 3. c h HDAC2— /—株における抗体遺伝子重鎖可変領域の多様化上記、抗体軽鎖遺伝子領域で確認された結果は、抗体重鎖遺伝子領域においても、同様に確認された（図 9) 。

産業上の利用可能性

[0034] 本発明は、抗体遺伝子の可変領域に変異を導入する方法を提供する。さらに、本方法を用いると種々の特性（抗原への特異性、抗原への親和性など）を備えた所望の抗体を作製することができる。従って、これまで、作製が困難であった所望の抗体を本発明の方法により取得することが可能となり、医療分野における治療、創薬などの有効な手段として活用することができる。

Claims

請求の範囲

[1 ] コード領域が、以下の（_a ) 又は（b ) に示される塩基配列からなる遺伝子の機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子可変領域に多様な変異を導入する方法。

( a ) 配列番号 1、配列番号 3又は配列番号 5

( b ) 配列番号 1、配列番号 3又は配列番号 5の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、コ -ドするタンパク質がヒストン脱ァセチル化活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列

[2] 前記機能低下又は機能喪失が、前記（a ) 又は（b ) で示される塩基配列からなる遺伝子に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする請求項 1に記載の方法。

[3] 前記機能低下又は機能喪失が、前記（a ) 又は（b ) で示される塩基配列からなる遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項

1に記載の方法。

[4] 以下の（a ) 又は（b ) に示されるタンパク質の活性若しくは機能を、選択的に低下又は喪失させ、免疫細胞の染色体上に存在する抗体遺伝子可変領域に多様な変異を導入する方法。

( a ) 配列番号 2、配列番号 4又は配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質

( b ) 配列番号 2、配列番号 4又は配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ヒストン脱ァセチル化活性を有するタンパク質

[5] 前記免疫細胞を、付加的に H D A C阻害剤にも接触させて処理することを特徴とする請求項 1乃至 4のいずれかに記載の方法

[6] 前記 H D A C阻害剤がトリコスタチン Aであることを特徴とする請求項 5 に記載の方法。

[7] 前記免疫細胞が D T 4 0細胞であることを特徴とする請求項 1乃至 6のいずれかに記載の方法。

[8] 前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子であることを特徴とする請求項 1乃至 7 のいずれかに記載の方法。

[9] 前記抗体遺伝子が抗体軽鎖遺伝子であることを特徴とする請求項 1乃至 7 のいずかに記載の方法。

[10] 請求項 1乃至 9のいずれかに記載の方法により抗体遺伝子可変領域に変異を導入した免疫細胞。

[1 1 ] 請求項 1乃至 9のいずれかに記載の方法により変異が導入された抗体遺伝子がコ一ドするポリべプチドを少なくとも 1つを含む抗体分子。

[12] 前記抗体分子が I g Mである請求項 1 1に記載の抗体分子。